JPH01288766A - 低濃度のジオキシン類の免疫診断検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は、モノクローナル抗体を用いる。ジオキシン
類およびジベンゾフラン類の改良検出方法ならびにひど
く汚染された試料中の、免疫検定法によるジオキシン類
の検出法を最適化する試料の調製法に関する。

（従来の技術） ポリ塩素化ジベンゾジオキシン類（ｐｃｏ口）とジベン
ゾフラン類（ＰＣＤＦ）は、広く生物圏のみならずヒト
の健康に脅威をもたらす持続性の有毒汚染物物質である
。これらの化合物は、ポリハロゲン化平面構造多環式芳
香族化合物と呼ばれているが。

エージェント・オレンジ（Ａｇｅｎｔ　Ｏｒａｎｇｅ）
のような除草剤の不純物であり、種々の工業化学のプロ
セスおよびプラスチックとポリ塩素化ビフェニルｍ　（
ＰＣＢ　）のような他のポリ塩素化有機化合物の燃焼も
しくは灰化の過程で副生成物として生成する。上記のプ
ロセスが広範に利用されるかまたは発生すると、ジオキ
シン類とジベンゾフラン類が環境に広範囲にひろがる。

これらの物質の有害な性質が現在充分認識されるように
なったので、これら化合物検出の問題を処理することが
、最優先事項になっている。重要で容易でない第一の問
題は、汚染場所を同定することであり、それには。

工業工程、土壌、ヒトまたは動物の組織からのみならず
食料から採取した試料中にこれら化合物が存在するのを
検出する簡単で、経済的かつ迅速な試験法が必要である
。

燃焼および工業上の工程中に生成するポリ塩素化ジベン
ゾジオキシン類とジベンゾフラン類などの化学薬剤は、
極めて有毒であり、その上に環境中では安定である。こ
れら化合物の生成と分布を監視する努力が、ガスクロマ
トグラフィとＷＭ分光法とによって主として行われてい
るが、試料の調製に苦心を要し、高価で複雑な工業設備
を使用する。比較的高価な方法である。上記物質、特に
これら物質の検定を妨害する他の物質を含有する工業試
料中に見出される前記物質の、より簡単でより経済的な
分析法が必要である。

所望の試験法の重要な点は特異性である。　ＰＣＤＤ類
とＰＣＤＰｔｉおよびＰＣＢ類には多数の異性体があり
。

非常に高い毒性からより低い毒性まで毒性が変化するが
、他の比較的無害の化合物と化学的には類似している。

第２の問題点は、これらの化合物の中、環境内で最も有
毒な異性体、すなわち２，３，７゜８−テトラクロロジ
ベンゾ−ｐ−ジオキシンが。

ごく少量でも有害であり９食物連鎖を通過するにつれて
濃縮されることがある。したがって、所望の試験法は、
工業プロセス試料、環境試料、ヒトもしくは動物の組織
および食料中に、これらの有害物質が、極めて低い濃度
で存在するのを検出できなければならない。

土壌試料の汚染の化学分析法も１次のようないくつかの
他の要因によって妨害される。すなわち。

（１）ジオキシン類が、土壌と強固に結合し、水には無
視できる程度の溶解性しか示さない、および（２）多数
の異性体と、関連の化学的汚染物とによって。

通常のガスクロマトグラフィ法と質量分光法による定量
検定法が、高価でかつ時間がかかるようになっている。

検定法の経費と所要時間のために。

汚染の程度を測定すべき領域の詳細なサンプリングがで
きなくなり、精巧な集中化された実験室を使用する必要
が生じ、危険なポリ塩素化ジベンゾジオキシン類とジベ
ンゾフラン類の野外監視に不適になっている。

この発明は、免疫診断法による検定に通ずるようにジオ
キシン類および関連化合物を含有する試料の調製法なら
びにこの方法を行うのに有用な試験キットに関する。平
面構造を有する。ボリノ１０ゲン化多環式芳香族化合物
に属する重要な化合物としては、ジベンゾジオキシン類
、ジベンゾフラン類およびいくつかのポリハロゲン化ビ
フェニル類が挙げられる。簡略化するために、引用され
た種類の物質は、以下の説明では、ジオキシン画分のよ
うに、形容詞として用いる場合はジオキシン類もしくは
ジオキシンと呼ぶものとする。

Ｍ遺孜五勿に皿 免疫検定法が通常の分析法を凌駕する有力な利点は、以
前から認識されているが、特に免疫検定法が、ガスクロ
マトグラフィーおよび／または質量分光法と同等に敏感
で、他方、これらの分析法より高速でかつ費用が少ない
ことである。

環境中のジオキシン類の検出に以前用いていた方法は、
１−アミノ３．７．８−　）ジクロロジベンゾ−ｐ−ジ
オキシンでラビットを免疫感作することによって生成さ
せたポリクローナル抗血清に基づいたラジオイムノアッ
セイを用いる方法である。

この方法は、ビー・ダブリュ・アルプロら（Ｐ、Ｗ。

Ａｌｂｒｏ　ｅｔ　ａｌ）の、論文：　Ｍｅｔｈｏｄｓ
　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ８４巻、　６１９−６３
９頁（１９８２年）および米国特許第４、２３８．４７
２号に記載されている。この検定法は。

再々ｌ２ｓＩ−ＴＣＤＤ基質を合成する必要があり、し
かも完了するのに３日間を要し、また、この検定法は、
最も有毒なジオキシン類似体の２．３，７．８−ＴＣＯ
Ｄ（以下ＴＣＤＤと呼ぶ）に対して充分特異的でない。

非特異的ラビット抗血清を用いるから、広くは利用され
なかった。

ジオキシン類の他の試験法が、ステフェン・ジエイ・ケ
ネール（Ｓｔｅｐｈｅｎ　Ｊ、　Ｋｅｎｎｅｌ）の論文
：Ｔｏｘｉ−ｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　
Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、　８２巻、２５６〜２６３
頁（１９８６年）に報告されているが。

マウスをチログロブリン−２−アジパミドで免疫感作す
ることによって生じさせたモノクローナル抗体による方
法であり、３．７．８−）ジクロロジベンゾ−ｐ−ジオ
キシンが、有毒ジオキシン化合物に対して特異的である
ということは証明されなかった。この化合物に免疫感作
され動物の肺臓細胞を骨髄腫細胞と融合させることによ
って調製したハイブリドーマは、非タンパク質で抱合さ
れた溶解状態の２．３．７．８−テトラクロコシベンゾ
−ｐ　−ジオキシン、最も毒性の強いこのジオキシンの
異性体および他のジオキシン異性体に対する選択性が不
充分な抗体を分泌するが、他方このハイブリドーマは、
有毒ジオキシン類ではない化合物と反応する。この試験
法も、ラジオイムノアッセイ法を用いるという欠点を伴
う。

最近の刊行物で論じられたジオキシン類の検出法には、
有毒ジオキシン類と特異的に結合するモノクローナル抗
体を利用する免疫検定法が記載されている。これらの刊
行物は次のとおりである。

スタンカー・エル、ワトキンズ・ビー、ロジャース・エ
ヌおよびバンダーラーン・エム（Ｓｔａｎｋｅｒ。

Ｌ、、　Ｗａｔｋｉｎｓ、　ＢｌＲｏｇｅｒｓ、　Ｎ、
　ａｎｄ　Ｖａｎｄｅｒｌａａｎ。

門、）、“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ
ｓ　ｔｏ　Ｄｉｏｘｉｎ、　ＡｎｔｉｂｏｄｙＣｈａｒ
ａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ａｓ５ａｙ　Ｄｅ
ｖｅｌｏｐｍｅｎｔ”　、　Ｊ。

Ｔｏｘｉｃｏｌ、＋　４５巻、　２２９〜２４３頁（１
９８７年）；およびスタンカー・エル、ワトキンズ・ビ
ー、バンダーラーン・エムおよびブデ・ダブリュ（Ｂｕ
ｄｄｅ　。

Ｗ、）　、　　”Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｎ
　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ｆｏｒ　Ｃｈｌｏｒｉ−ｎ
ａｔｅｄ　Ｄｉｏｘｉｎｓ　Ｂａ５ｅｄ　ｏｎ　ａ　Ｍ
ｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙａｎｄ　　ａｎ
　　Ｅｎｚｙｍｅ　　Ｌｆｎｋｅｄ　　ｌｍ１ｕｎｏｓ
ｏｒｂｅｎｃｙ　　Ａｓ５ａｙ　　　（ＥＬＩＳＡ　）
”、　Ｃｈｅｍｏｓｐｈｅｒｅ　、　１６巻、　１６３
５〜１６３９頁（１９８７年）である。化学的に純粋な
ジオキシン類。

またはジオキシンを容易に単離できる試料は、これらの
方法で容易に分析できるが、この検定法に作用する他の
物質を含有する工業プロセスからの試料は試験されなか
った。この発明がなされるまでは、工業試料と環境試料
の分析法は得られていなかったのである。なぜならば、
ジオキシン画分を部分的に精製し１次に特異的抗体を検
出するために上記ジオキシン画分を水溶液に溶解する必
要があるという困難な問題に、試料調製中、遭遇するか
らである。本願に記載の方法は、化学的処理工程および
環境の試料の、妨害汚染物を含有する試料中のジオキシ
ン類の免疫診断検定法を利用することができる。

従来の研究者らは、ジオキシン汚染を評価すべき試料に
対し２分離するための抽出技術とクロマトグラフィの技
術を種々利用してきた。これらの技術は、ガスクロマト
グラフィ／質量分光法によって分析する試料の調製には
適切なものである。

このようにして調製された試料は、免疫検定法を妨害す
る成分を依然として含有している。分離法には、　ＧＣ
／ＬＲＭＳ分析する試料の多回クロマトグラフィ処理、
危険な廃棄物の保管場所で見つかった物質からジオキシ
ン類を分割するためのアルミナカラムおよびジオキシン
類をフェノールもしくはトルエンで抽出するソックスレ
ー抽出法が含まれるが、いずれも分析結果が変動し、ま
たその方法はフライアッシュには不適当であった。多回
抽出法が、　ＧＣ／ＭＳ分析法、およびＩＩＲＧｃ／Ｍ
Ｓ分析法のための逐次溶媒抽出法によってごく微量のジ
オキシン汚染を同定するのに利用されてきた。これらの
方法はすべて、　ＧＣ／ＭＳＣ／法用試料を調製するの
に用いられた。これらの試料が水性環境で起こる抗体反
応を妨害する物質を含有しているかいないかについては
測定されなかった。すでに発表された非イオン界面活性
剤を用いる方法は、トリトンＸ−３０５とカットスカム
（Ｃｕｔｓｃｕｎ＋　）　　（いずれも登録商標）だけ
がラジオイムノアッセイに適しており、その理由は他の
界面活性剤がＴＣＯＤを可溶化しないからであることを
示した。これらの界面活性剤は、　ＴＣＯＤを抗体から
“遮蔽し７た”か、または抗血清タンパク質と相互に作
用したのである。これらの界面活性剤は、ジオキシン特
異性モノクローナル抗体を用いる反応を妨害するか否か
は識別されなかった。

実験室間の試験の信転性と感度の比較を行った結果、工
業銘柄の製品を用いて調製した試料についてのＧＭ／Ｍ
Ｓ法による試料検出の実用上の限界は約１０ｐｐｂで再
現性は±１００％であった。本願に記載した。試料調製
法およびモノクローナル抗体を用いる分析法を用いれば
、上記したのと同等もしくはそれ以上の良好な検出度と
再現性が得られる。

（発明の目的） 上記のことから、有毒なジオキシン類のを効かつ実用的
な検出試験法に対する要求が続いていることは明らかで
ある。

したがって、この発明の主な目的は、ジオキシン類の免
疫検定法が、数ｐＰｂの濃度（試料当り数ナノグラム）
のジオキシン類の存在を最終的に示すのに必要な選択性
と感度を有するように、この検定法用に工業もしくは化
学の工程からの試料を調製するにある。

他の目的は、野外環境で容易に実施できる。ジオキシン
類の簡単な抽出法と検出試験法を提供することである。

さらに他の目的は、最も毒性の強いジオキシン類を最終
的に識別できる免疫検定法を提供するにある。

他の目的は、ジオキシン検出の感度を上昇させて数ｐｐ
ｔ　　（ｐａｒｔｓ　ｐｅｒ　ｔｒＨｌｉｏｎ）の濃度
の検出を実施できる方法を決定することである。

他の目的は、土壌を含めた。粗の工業試料と環境試料中
のジオキシン類と呼ばれる。平面構造のポリハロゲン化
多環式芳香族化合物の定性および定量分析法を提供する
にある。

この発明のさらに別の目的、利点および新規な特徴は、
一部は以下の説明で述べられ、一部は下記の試験によっ
て当業者には明らかになり、またはこの発明を実施する
ことにより熟知することができるであろう。この発明の
目的と利点は、特許請求の範囲で特に指摘した手段と組
合せによって認識することができる。

（発明の要約） この発明は、試料の分解反応と、以下の工程：ａ、粗抽
出物の調製工程；ｂ、ジオキシンの両分として知られる
。平面構造を存するポリハロゲン化多環式芳香族化合物
の両分の分離工程；およびＣ０前記ジオキシン画分の水
性緩衝溶液への溶解工程；を包含する予備工程とにより
妨害物質を除去した後、特異的抗体との反応によって、
ジオキシン類およびジベンゾフラン類と呼称される。平
面構造のポリハロゲン化多環式芳香族化合物を定性およ
び定量分析する方法である。

この発明はまた。工業試料もしくは環境毒物由来の有機
残渣を含有する試料中のジオキシン類と呼称される平面
構造のポリハロゲン化多環式芳香族化合物を定量的に免
疫検出する方法であって２下記工程：ａ、粗抽出物の製
造工程；ｂ、ジオキシン画分の分離工程；Ｃ９前記ジオ
キシン画分を水性緩衝溶液へ溶解する工程；およびｄ、
前記ジオキシン画分をジオキシン特異性モノクローナル
抗体と反応させる工程；を包含する方法である。

この発明はまた。下記工程：ａ、粗抽出物の製造工程；
ｂ、ジオキシン画分の分離工程；ｃ、前記ジオキシン画
分を水性緩衝液に溶解する工程；ｄ、前記ジオキシン画
分と、それぞれのＡＴＣＣ寄託番号が（ＨＢ９７４１）
　、　　（ＨＢ９７４２）　、　　（ＨＢ９７４３）　
、　　（１１８９７４４　）および（ＨＢ９７４５）で
ある、　ＤＤ−１，０Ｄ〜３゜Ｄロー４．　ＤＤ−５お
よびＤＤ−６からなる群のハイブリドーマから選択され
た。平面構造のポリハロゲン化多環式芳香族化合物に対
し特異的なモノクローナル抗体とを反応させる工程；お
よびＣ１結合した抗体の量を測定する工程を包含する。

工業試料もしくは環境試料中のジオキシン類を検出する
方法である。

この発明はまた。ａ、ジオキシン画分を試料から分離す
るユニット；ｂ、ジオキシン化合物類を。

ジオキシン特異性抗体で測定するユニット；を有する。

妨害物質を含有する試料中のジオキシン類測定用試験キ
ットである。

この発明は、ハイブリドーマ細胞系から得られるモノク
ローナル抗体を用いる。ポリ塩素化ジオキシン類と特に
２，３，７．８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシ
ン（ＴＣＤＤ）の存在を測定する試料の調製方法である
。この細胞系の産生とこの細胞系由来の抗体の特性決定
は、バンダーラーンらによる欧州特許願公開公報第２５
１，６３５号に、より詳細に記載されている。これらの
抗体は、　ＴＣＤＤに対する高い親和性と選択性を特徴
としている。これらの抗体を改良ＥＬＩＳＡ試験法（Ｅ
ｎｚｙｍｅ−１ｔｎｋｅｄ−１ｍｍｕｎｏ−ｓｏｒｂｅ
ｎｔ−Ａｓｓａｙ　）で用いることによって、試験試料
中数ｐｐｂおよびそれより少ない濃度のジオキシン類の
存在を測定することができる。試験は何日もかからず数
時間で完了することができる。放射能で標識した化合物
を使用する必要はない。ＴＣＯＤに対する抗体の試験は
、水性媒体中で、界面活性剤および／または音波処理に
よって有機の試験化合物の溶解化を増進させて行なうこ
とができる。

好ましい仕方では２約０、ｃ１〜２゜θ重■％の範囲の
濃度の界面活性剤を添加することによって試料物質を可
溶化させて、免疫検定法の感度を上昇させることができ
る。限定された濃度のコーティング抗原を使用し、ペル
オキシダーゼ酵素系の終点をアビジン／ビオチン増幅系
で増幅させることによって、数ｐｐｔの範囲内の濃度の
ＴＣＯＤが検出可能になる。また免疫原として所望のジ
オキシン類を用いて得られる他の抗体製剤も使用できる
。

本願に記載の試料調製法を用いれば９反応混合物、蒸留
残渣、化学薬品、フライアッシュ、フィルターダスト変
圧器液（ＰＣＢ油）またはモーター油を含む工業試料の
分析を、より高感度の検出法で行うことができる。その
上、この方法は、環境の、空気、水および土壌の試料、
ヒトおよび動物の組織、ならびに食料を含む他の起源の
試料の試験に採用することができる。この試料調製法に
は、関心のあるジオキシン化合物を含有する両分をまず
抽出分離し、得られた百分を界面活性剤で可溶化してジ
オキシン化合物を免疫検定法用反応試薬の水溶液に暴露
する方法が含まれる。反応容器の適切な抗原コーティン
グ濃度の選択と、　ＥＬＩＳＡ法用の酵素増幅系の選択
によって、検定の感度がさらに大きくなる。この方法は
、ポリ塩素化ジベンゾジオキシン類とジベンゾフラン類
の分析に特に好適なものであり、特異的な検出が数ｐｐ
ｔの範囲内で行われる。

以下に本発明を詳述する。

第１Ａ図、ＩＢ図およびＩＣ図は、カーボンカラムだけ
（白四角印）または、カーボンカラムと次いで発煙硫酸
シリカカラムで（黒四角印）で精製して調製した試料抽
出物の阻害ＥＬＩＳＡデータを示すグラフである。発煙
硫酸シリカカラムによる抽出を追加した場合は、　ＰＣ
Ｂ油（第１Ａ図）もしくはトリクロロフェノール（第１
Ｂ図）の試料についてはＩ、。は変化しなかったが、か
ま残渣試料＃１．すなわちクロロニトロベンゼン蒸留器
の蒸留残渣（第１Ｃ図）については低下した。このこと
は二番目の抽出処理で、非ジオキシンの免疫学的に交差
反応性物質を除去できなかったことを示している。

第２図は、ジオキシン免疫検定法の感度が界面活性剤、
カットスカムによるＴＣＯＤ標準品の可溶化によって改
善されたことを示すグラフである。最適の検定法感度（
ｒｓ。）は、　０．２５％（白菱形印）と０．１２５％
（十字印）のカットスカムで得られているが、高濃度の
界面活性剤、０．５％（黒四角印）、１、ｃ％（黒菱形
印）および２、ｃ％（白四角印）の界面活性剤は、拮抗
を漸増的に阻害した。０．１％より低い濃度の界面活性
剤ではジオキシンを可溶化できなかった。

（以下余白） 抗体の起源 この発明の試料調製法によって、ポリ塩素化ジベンゾフ
ラン類（ＰＣＤＤ）とジベンゾフラン類（ＰＣＯＦ）に
対して特異的なモノクローナル抗体でジオキシン類を有
効に分析できる試料が作製される。

ジオキシン分子の官能基を識別するために提供される抗
体は９本願で述べる検定法において適切な特異性をもっ
ている。

ジオキシン特異的抗体と呼ばれる。平面構造のポリハロ
ゲン化多環式芳香族化合物に特異的な抗体を産生ずるハ
イブリドーマを使用する。ハイブリドーマの例としては
、バンダーラーンらの米国特許願第８７７、９０９号に
記載の命名されたハイブリドーマ、　ＤＯ−１，ＤＯ−
３，ＤＯ−４，Ｄロー５およびＤＯ−６が挙げられる。

これらのハイブリドーマは、米国、メリーランド州、ロ
ックビルのｔｂｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌ
ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）の寄託機
関で公に人手可能であり、以下の寄託番号：　００−１
．　　（ＨＢ９７４１）　；ＤＯ−３，（ＨＢ９７４２
）；　ＤＯ−４，（ＨＢ９７４３）；　００５．　　（
ＨＢ９７４４）；およびＤＯ−６，（ＨＢ９７４５）で
区別されている。これらの細胞は、　ＴＣＤＤ類似体の
１−アミノ−３，７，８，−トリクロロジベンゾ−ｐ−
ジオキシン（Ａ−トリＣ０Ｄ）で免疫感作されたマウス
から得た膵臓細胞を。

骨髄腫細胞と融合させることによって調製した。

上記の化合物を合成し１次いでチログロブリン担体タン
パク質に抱合させた。ペプテンタンパク質複合体で免疫
感作させた後、免疫反応性のＰＡ臓細胞を集めて骨髄細
胞と融合させ、得られたハイブリドーマを、　ＴＣＤＯ
を認識する性能を有するもの。

すなわちタンパク質と遊離の懸濁ＴＣＤＤとに結合され
たものを選別した。このような選別の結果、５種のハイ
ブリドーマ（ＤＯ−ｉ、　ＤＯ−３，ＤＯ−４，ＤＯ−
５およびＤＯ−６と呼ぶ）が、これらの特異性をさらに
研究するために選択された。これらの抗体の、各種ジオ
キシン類、ジベンゾフ、ラン類、　ＰＣＢ類などの塩素
化炭化水素に対する特異性は、バンダーラーンらの欧州
特許願公開公報第２５１６３５号に報告されている。こ
れらの抗体の結合特異性は、これら抗体が最も毒性の高
いジオキシンおよびジベンゾフランの異性体に選択的に
結合するので、非常に望ましいものである。

試料の調製 最初に、有毒ジオキシン類を部分的に精製して抽出し次
いで水溶液に溶解して免疫検定するという、現実の世界
での試料分析法を克服するために。

工業試料と環境試料に適した分析法が開発された。

この試料調製法によれば１反応混合物、蒸留残渣などの
著しく汚染した試料の工業試料中のジオキシン化合物の
定性および定量分析を行なうことができる。ジオキシン
類と特異的に反応するモノクローナル抗体はすでに述べ
た〔スタンカーら、Ｊ２Ｔｏｘｉｃｏｌ、　４５巻、　
２２９−２４３頁（１９８７年）〕。個々の抗体は、一
定の化合物または一定の化合物群と１反応するので、い
くつかの調製法の結果は。

標準試料中の濃度既知の標準化合物と比較するのが最も
よい。

工業試料を抽出および／または調製してから。

免疫検定反応を行わせてジオキシン類を測定することが
得策である。この方法は次の連続工程によって行なうの
が好ましい。すなわち。

ａ、粗抽出物の調製工程； ｂ、ジオキシン画分と呼ぶ、平面構造を有するポリハロ
ゲン化多環式芳香族化合物を含有する両分の分離工程；
および Ｃ３得られたジオキシン画分の水性緩衝溶液への移管工
程である。

フライアッシュ、フィルターダストおよび無機化学薬品
のような本来無機の試料は分析する前に酸抽出を行なう
のが最もよい。種々の酸がこの目的に適しているが、特
に濃塩酸と濃硫酸が好ましい。酸処理に続いて、得られ
た混合物を、単一の有機溶媒もしくは溶媒の混合物で抽
出する。種々の有機溶媒がこの目的に適している。好ま
しい溶媒には、ＣＣ１，、ＣＨＣｌ３．ＣＨ２Ｃｌ２．
ベンゼン、トルエン。

クロロベンゼン、クロロトルエン、ヘキサン、シクロヘ
キサン、クロロシクロヘキサン類、メタノールおよびエ
タノールが含まれる。特に好ましいのは、Ｃ［１２Ｃ１
２とシクロヘキサンであり、特にこれら２溶媒の混合物
が好ましい。

反応残渣と蒸留残渣のように、事実上。本来有機の難溶
性の試料は、これを、好ましくはＳＯｌで飽和させた濃
硫酸のような酸中に懸濁させ１次に固体（例えばシリカ
ゲル）と混合して、好ましくは混合物が流動性になまる
で混合することによって調製するのが好ましい。次にこ
の混合物を、適切な装置中で、好ましくは前記溶媒の１
種もしくは対応する混合物とともに沸騰加熱して抽出す
る。

モーター油、　ＰＣＢ油および有機化学薬品のように、
事実上１本来有機の易溶性試料は、酸による前処理なし
で、前記溶媒の１種または２種以上で慎重に抽出される
。好ましいのは、当の溶媒を沸騰加熱して抽出する方法
（例えばソックスレー抽出器を使用する）である。

ジオキシンの両分は、得られた抽出物から種々の方法で
分離することができる。好ましいのは。

米国環境保護子（［Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ　Ｐｒｏ
ｔｅｃｔｉｏｎ　Ａｇｅｎｃｙ）が、　’　Ｐｏｌｙｈ
ａｌｏｇｅｎａｔｅｄ　Ｄｉｂｅｎｚｏ−ｐ−Ｄｉｏｘ
ｉｎｓ／Ｄｉｂｅｎｚｏｆｕｒａｎｓ；Ｔｅｓｔｉｎｇ
　　ａｎｄ　　Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ　　Ｒｅｑｕｉｒｅ
ｍｅｎｔｓ　　”官報、　５２　：　１０８　、１９８
７年６月５日２１４１２−２１４５２頁。

４０ＣＦＲ７０７および７６６号に発表したのと類似の
クロマトグラフィー法によって行なう分離である。

特に好ましいのは９例えば、活性炭と均質に混合したガ
ラス繊維からなる固相を用いる固液クロマトグラフィー
による分離法である。ガラス繊維と活性炭は、必要に応
じて溶媒を添加して慎重に混合される（例えば逆転羽根
を備えた装置またはミルを用いる）、活性炭の含量は約
５〜１５重量％で。

好ましくは約８〜１２重量％、特に好ましいのは約ｌＯ
％である。

ジオキシン画分は、カラム法の後者の方法で分離するの
が最もよい。この目的のため、ジオキシン両分は、活性
炭で被覆したガラス繊維の固相を有するカラムに注入さ
れる。ジオキシン抽出物を注入した後、カラムを、必要
に応じて、好ましくはＣＨ，Ｃ１，とヘキサンからなる
混合物で洗浄する。

両者の混合物比率は約０．８〜１．２：０．８〜１，２
が特に好ましい。他の溶媒による別の洗浄を、ジクロロ
メタン、メタノールおよびトルエンの混合物を用いて続
けて行ってもよい。この場合の混合比率は約６５〜８５
　：　１５〜２５：０〜１０が好ましい。他の多くの溶
媒およびその混合物も上記の洗浄工程に適している。好
ましい溶媒は、抽出物の製造法についてずでに記載した
溶媒である。洗浄液の最適の組成は、特定の抽出物の組
成物について経験的に決定しなければならない。

ジオキシン画分は、カラムを１８０°逆転した後溶離す
るのが好ましく１種々の溶媒もしくはその混合物がこの
プロセスで用いられる。このプロセスで用いられる。こ
の場合、トルエン、ベンゼン。

キシレン類およびこれらの塩素化誘導体を利用するのが
好ましい。トルエンが特に好ましい。洗浄液と溶離液の
適切な組成の決定は、マーカー染料をジオキシン抽出物
に加える実験によって簡単に行なうことができる。マー
カー染料〔例えばファツトブルーＢ　（ｆａｔ　ｂｌｕ
ｅ　Ｂ）（ヘキスト・アーゲー。

フランクフルト／マインで製造されたｐ−アントラキノ
ン誘導体）〕は１１問とするジオキシン画分に類似した
しかたで吸着され溶離される。またこのようなマーカー
染料は、溶離工程の個々の洗浄段階の効力を監視するの
にも適切なものである。

ジオキシン画分が、−回のクロマトグラフィーによる洗
浄ではまだ妨害成分を含有している例外的な場合には、
追加の洗浄工程を利用してもよい。

この工程は、別の固液クロ°７トグラフイーによる抽出
法であり１例えば固相として酸を含浸させたシリカゲル
を充填したカラムを用いるクロマトグラフィーが特に好
適であることが分かった。このカラムは、約８〜１２部
の９発煙硫酸で飽和したシリカゲルに、Ｓ０３で飽和し
たＨ２ＳＯ４約１部を添加しこの混合物を約１０〜２０
分間、約７０〜９０℃に加熱することによって製造する
ことができる。この活性化されたシリカゲルの一郭に、
まだ不純のジオキシン画分を添加し、この混合物をカラ
ムに注入して最上層とする。約５〜１５％ΔｇＮＯｓ含
有のシリカゲルからなる層（ＡｇＮ０３水溶液をシリカ
ゲルと混合して水を実質的に蒸発させることによって得
られる）および発煙硫酸シリカゲルの層を追加して注入
してもよい。これらの層は、シリカゲルもしくは活性化
シリカゲルによって互いに分離すべきである。ジオキシ
ンは、上記のようにして作製されたカラムから、ヘキサ
ン、シクロへキサニノ。

ベンゼンおよびトルエンのような非極性有機溶媒。

好ましくはへキサンで溶離することによって得られる。

第１図のＢＬＩＳＡ検定のデータは１発煙硫酸−シリカ
カラムによる二番目の抽出をした場合は。

ＰＣＢ変圧器油（第１Ａ図）もしくはトリクロロフェノ
ール（第１Ｂ図）中のジオキシン類似体の１回の炭素カ
ラムによる抽出をした場合の免疫検定法の結果と変わら
なかったが、蒸留残渣試料＃ｌからは、非ジオキシンの
免疫化学的に交差反応性の物質を除去したこと（第１ｃ
図）を示している。

上記の方法によって得られたジオキシン画分を。

モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体と反応
させることによってジオキシン類検出の検定を行なう。

この免疫検定法は３種々のしかたで利用できる。例えば
、ビイ・ティエラセン（Ｐ、　Ｔｉｊｓｓｅｎ）　　Ｐ
ｒａｃｔｉｃ　　ａｎｄ　　Ｔｈｅｏｒｙ　　ｏｆ　　
Ｅｎｚｙｍｅ　　Ｉｍｍｕｎ。

ａｓｓａｙｓ″゛　〔アール・エイチ・バートンおよび
ピーエイチ・パン・ニラベンバーク（Ｒ，ＨｏＢｕｒｄ
ｏｎ　ａｎｄＰ、Ｈ，ＶａｎＫｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ）
　ｍ：］　Ｂ１５ｅｖｉｅｒ、　　アムステルダム（１
９８５年）に記載されている方法がある。

免疫検定法は、コンペティティアッセイとして用いるの
が好ましい。このため、Ｓ縮したジオキシン画分を有機
溶媒もしくは溶媒混合物で溶解するのが最もよく、溶媒
としてはヘキサンとシクロヘキサンのような非極性の有
機溶媒がこの目的に特に適している。得られた溶液に、
好ましくは以下のような非イオン界面活性剤の１種また
は２種以上のアルコール溶液を添加する。すなわち９カ
ツトスカム（イソオクチルフェノキシ−ポリエトキシエ
タノール、　Ｆｉｓｃｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　
Ｃｏｍｐａｎｙ、米国、ノースカロライナ州、ローリ−
）；ポリオキシエチレンステアリルエーテルもしくはポ
リオキシエチレンラウリルエーテルのようなポリオキシ
エチレンエーテル類：Ｎ−才クチルグルコピラノシド類
；Ｎ−へブチルグルコピラノシド類；ノナノイル−Ｎ−
メチルグルカミド；ヘプタノイル−Ｎ−メチルグルカミ
ド：ポリオキシエチレンソルビタンモノラウｌノート；
オクチルフェノールエトキシレート；３−（３−コラミ
ドプロピル）−ジメチルアンモニオ−２−ヒドロキシ−
１−プロパンスルホネート；３−（３−コラミドプロピ
ル）−ジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホネート
；またはオクタノイル−Ｎ−メチルグルカミドである。

これらのうち、ポリオキシエチレンステアリルエーテル
とポリオキシエチレンラウリルエーテルのようなポリオ
キシエチレンエーテル類；ツイーン（Ｔｗｅｅｎ、登録
商標）で知られているポリオキシエチレンソルビタンモ
ノラウレート；オクチルエノールエトキシレート；およ
びカットスカムが好ましく、カットスカムが特に好まし
い。

上記の界面活性剤は、約０、ｃ１〜約２重量％の濃度で
用いるのが好ましく、また１重量％より低い濃度が好ま
しく、特に約０．１〜０．４重量％が好ましい。免疫検
定法の感度に対する界面活性剤の濃度の効果を第２図に
示す。界面活性剤の濃度的０．１〜０．４重量％の場合
、最大の効果があった。界面活性剤の濃度が高すぎると
、ジオキシンはよく溶解するが、もはや抗体によって″
認識”されず。

その結果、免疫検定法の感度が低下する。またこの界面
活性剤水溶液は、ピペットで容易に採取できるようにア
七トンもしくはメタノールのような有機溶媒を含有して
いてもよい。

溶液を合せ２例えば窒素もしくは温かい空気の流れによ
って慎重に乾燥する。単クローン性抗体（水性緩衝溶液
に溶解されている）を次に添加する。

ジオキシン画分を懸濁させるだめの水性緩衝溶液は種々
の物質で構成されている。次のようなもので構成されて
いるものが好ましい。すなわち。

特に好ましくはトリス（ヒドロキシメチル）−丁ミノエ
タンもしくはリン酸塩の緩衝剤に基づいた緩衝剤を用い
て、ＰＨ７〜８の範囲に緩衝する単一化合物もしくは化
合物の混合物を約０，０５〜０，１５モル／ｌ；好まし
くは、卵アルブミン、ラビット血清アルブミンもしくは
ウシ血清アルブミン、特に好ましくはウシ血清アルブミ
ンのタンパク質を約０．１〜５重量％、特に約０．２〜
１％；好ましくはＮａｃｌのようなハロゲン化アルキル
を約０．１〜０．３モル／β；好ましくは前記の界面活
性剤のうちの１種、特にポリオキシエチレンソルビタン
モノラウレートのような界面活性剤を約０、ｃ０５〜０
．５容量％、特に好ましくはｏ、　ｏｏｓ〜０，０１２
容量％、を含有している。

免疫検定法 コンペティティブ免疫検定法を実施するのに好ましい容
器は、抗原で被覆された試験管であり。

好ましくはポリスチレン製でマイクロタイタープレート
の形態のものである。コーティング抗原は。

種々の方法で用いられ１例えば、アール・ティエラセン
の前記研究論文に記載されている方法がある。平面構造
を有するポリハロゲン化多環式芳香族化合物の好ましく
はジベンゾジオキシンもしくはジベンゾフランに、哺乳
動物の血清アルブミンの好ましくはラビットもしくはウ
シの血清アルブミンを反応させて生成させたジオキシン
−タンパク質抱合体の溶液で１反応容器を処理する方法
が好ましい。

コートした容器を、抗体−ジオキシン混合物とともに培
養した後、未結合の物質を洗い流し、結合された抗体物
質が、公知のしかた１例えば抗体の標識を測定すること
によって検出される。酵素触媒反応において、化学発光
もしくは螢光を発光する放射性同位元素もしくは化合物
が標識化に用いられる。コンペティティブ検定中の検出
信号が大きい程、試験試料中のジオキシンの濃度は低い
。

先に述べた検定法の操作では、使用されるタンパク質−
ハブテン抱合体の量を５０ｎｇ／ウェルに限定した場合
ハブテンの検出が実際に限定されることを示した。

しかし、コンペティティブ免疫検定法を実施するのに好
ましい方法には、免疫活性ウェルを限定された量の抗原
で被覆することが含まれるが、これはより少量のａｎａ
ｌｙｅｔｅが結合されたハブテンから抗体を引出すのに
必要だからである。この検出系の最適の感度は２ブレー
テイング抗原の好ましい濃度を、１ウエル当たりのコー
ティング抗原の１１００ｎから約０．５ｎｇに、特に好
ましくは約０．２０ｇ〜１、ｃｎｇに低下させる場合に
得られる。しかし。

コーティング抗原のこのような制限された量を検出する
ためには、信号は、さらに増幅しなければならない。酵
素で触媒された光学的に検出される信号の好ましい増幅
方法は、プレートされた抗原の低いバックグランド濃度
で行なう場合の免疫検定法の感度を改善する。アビジン
−ペルオキシダーゼ／ビオチン−抗−マウス免疫グロブ
リン系による方法である。アビジン−ペルオキシダーゼ
／ビオチン−抗−マウス免疫グロブリン系は、ビオチン
が、活性を損失することなく、抗体もしくは酵素に容易
に結合されるのでＢＬＩＳＡ法の効力改善に用いること
ができる。アビジンのビオチンに対する例外的に高い親
和性（１０１５Ｍ　）によって、ビオチニル化された分
子間の橋かけ複合体が形成される。特異的に結合するモ
ノクロナール抗体とペルオキシダーゼ酵素インジケータ
ー系はビオチン結合される。ビオチン分子とアビジンと
の結合によって、インジケーター分子の複合反応が起こ
り。

スペクトル的に検出可能な信号の感度が増大する。

ジオキシンに特異性の抗体は、前記ピー・ティエラセン
の論文の第３章に記載されている方法によって、ビオチ
ンに抱合される。ビオチニル−Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミド（ＢＮＨ３）エステルは。

ジオキシン特異性抗体と反応してビオチニル化された免
疫試薬を作製することができる。好ましい方法では、ジ
オキシン特異性抗体は、ビオチニル化された抗−マウス
ＩｇＧ免疫グロブリンを抗体に結合させることによって
固定することができる。

ビオチニル化されたベルオキダーゼとして、ベクタスタ
イン（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ）　（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

米国、カルフォルニヤ州、バーリンゲーム）を。

アビジン−ビオチン増幅複合体に橋かけを行った後、検
出信号として用いることができる。

試料のジオキシンによる汚染の提示は、この発明に述べ
る方法を用いる単一の分析法で行なうことができる。定
量的な提示を高度に確実に行なうには、試験中の試料の
希釈シリーズを、好ましくは、平行して公知のジオキシ
ン含量の標章試料とともに測定するのが最もよい。検定
水溶液にジオキシンを懸濁させるのに用いた種々の方法
の効力を測定するのに、放射能で標識したジオキシンを
用いた。試料の回収効率は一般に約９０％で、少なくと
も７０％の回収率であった。

試験キットは、この発明による反応を実施するのに組立
てることができ、クロマトグラフィーの材料、溶媒およ
び溶離剤のような必要なすべての化学薬品、試験管、界
面活性剤、抗体および検出反応用の化学薬品が入ってい
る。これらの試験キットは、好ましくは、螢光反応また
は酵素触媒反応による終点測定法に基づいたものであっ
た方がよい。なぜならば、上記のようにすれば、試験反
応キットの器具の経費が経済的になり、はとんどの研究
室で使用するため好都合に入手することができる。

（以下余白） 実施例１−抽出方法 塩素化芳香族化合物の蒸留残渣のジオキシン含量は、抽
出と分画をした後、特異的なモノクローナル抗体を用い
て試験される。５ｇの蒸留残渣試料を、Ｓ０３で飽和さ
せてシリカゲルと混合した硫酸２〇−中に懸濁させて流
動可能な混合物を得た。

得られた混合物を、約２００　ｒｄ！、の沸騰トルエン
を用いソックスレー抽出器で抽出した。回転蒸発器で蒸
発させた抽出物とファツトブルーＢとを５０ｍ７’のジ
クロロメタン／シクロヘキサン（５０：　５０）に溶解
し、これをガラス繊維（６３−２００μｍの太さ）に１
０％の活性炭を混合したもの１ｇを充填したカラムに注
入した。なおこの充填物は、１３０℃で数時間乾燥して
活性化しである。このカラムを、５〇−のジクロロメタ
ン／シクロヘキサン（５０：　５０）および７５ｍＩ！
のジクロロメタン／メタノール／トルエン（７５：２０
：５）で洗浄した。次いでカラムを逆転させて５０ｒｎ
ｌのトルエンで逆方向に溶離した。トルエン溶出液は“
ジオキシン画分”を含有して青色に染色した。トルエン
を回転蒸発によって除去し、残渣を１ｍのｎ−ヘキサン
に溶解した。得られたヘキサン溶液を、２ｇの発煙硫酸
／シリカゲル（１：１０）　　（１３０℃に加熱して予
め活性化しである）に注入し９回転蒸発器で１５分間８
０℃で混合した。シリカゲルに吸着された試料を、１ｇ
の発煙硫酸／シリカゲル（１：ＩＯ）、１ｇの硝酸銀／
シリカゲル（１：１０）および各層間に０．５ｇのシリ
カゲルをすでに充填したカラムに注入した。このカラム
を５０ｒｄのｎ−ヘキサンで溶離した。“ジオキシン両
分”を含有する溶出液を１回転蒸発器で蒸発させ、残渣
をｎ−ヘキサンに溶解し、ジオキシン含量をコンペテノ
ティブ免疫検定法で測定した。コンペティティブ免疫検
定法によって、評価された試料は、　２５ｐｐｂの２．
　３．　７．　８７ＣＯＤ相当の含量であった。

実施例２−免疫検定法の手順 ジオキシン類のコンペティション試験の手順は。

スタンカーらのＣｈｅｍｏｓｐｈｅｒｅ、　１６巻、　
１６３５〜１６３９頁（１９８７年）に詳細に検討され
ている。本願発明の方法は、特徴的な結合特異性を有す
るモノクロ−ナル抗体を使用するが、その成果の大きな
ものは、信頼性の高いコンペティションＩＥＬＩＳＡ法
の開発に寄与したことである。マイクロタイタープレー
トを、）Ｕ−ＣＯＤ−アルブミン（抗原）溶液で覆い、
アルブミンの阻止溶液に暴露し１次いで可溶化試料もし
くはジオキシン標準の希釈シリーズに付した。抗体溶液
を添加すると、抗体は、プレートに結合したトリーＣ０
Ｄ−アルブミン（抗原）と溶液中のジオキシンに結合し
た同じ抗原とに分配される。反応後、試料溶液を除き、
プレートを再び洗浄し、酵素で！識した識別分子ととも
に培養した。酵素抗体ど適切な基質との抱合体が生成し
て、プレートに固定されたトＩＪ−ＣＯＤ−アルブミン
に結合されたモノクローナル抗体が見えるようになった
。次いで得られた結果をコンペチター・のないウェルの
反応の分数値として示した。かようなデータから、抗体
の結合を５０％まで阻害するのに要する濃度（［、。）
を測定することができる。

スタンカーらの１９８７年の文献に記載された免疫検定
に対しては、“ジオキシン画分”を、１００μβづつの
５つの等置部に分けた。二つの部分はそのままにしてお
いて、一つの部分を１＝２の比率で６回希釈し、二つの
部分には１もしくは１０ｎＨの２゜３、７．８−ＴＣＤ
Ｏ標準品を添加した。界面活性溶液（０，５％カットス
カムのアセトン溶液４０μｉりを、各試料に添加し１次
に、窒素流中で溶媒を除去した。

残渣を、１００μｌのジオキシン特異性抗体（１００ｎ
ｇ／−）で、トリス−ヒドロキシメチル（アミノメタン
）緩衝液に再懸濁させ、トリクロロジベンゾジオキシン
（トリーＣＯＤ　）−ラビット血清アルブミン抱合体で
被覆したポリスチレンマイクロタイタープ１ノートに塗
布した。残った抗体を、染料反応中のヤキ抗マウスＩｇ
ＧペルオキシダーゼとＯ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ
　）基質と、　４９２ｎｍの波長の吸光度によって定量
的に測定した。

免疫検定法の好ましい方法には、アビジン−ペルオキシ
ダーゼ／ビオチン−抗−マウス免疫グロブリン複合体に
結合することによってペルオキシダーゼ酵Ｓ終点を増幅
することが含まれる。最適の酵素感度は、最少量のニー
ティング抗原（トリーＣＯＤ　−ＢＳＡ　）を用いた時
に得られる。プレートの全タンパク質の結合容量は大き
いので、余分の未抱合の担体タンパク質は結合を分解し
ない。好ましい方法では、マイクロタイタープレートは
。

約０．２〜１．　０ｎｇ／ウェル、より好ましくは０．
５ｎｇ／ウェルのトリーＣ０Ｄ−ＢＳＡを添加した。ト
リー〇〇ローＢ５０Ａ溶液でコートされる。このコート
されたプレートは乾燥して、必要時まで貯蔵する。

試料抽出液を、バイアルびんから、抗原で被覆したマイ
クロタイタープレートにヘキサンを用いて移し、０．５
％カットスカム界面活性剤／アセトンの４０μ！で可溶
化した。試料を室温で一夜乾燥するか４５℃の熱風で乾
燥する。免疫検定を、試料を、検定緩衝液中１１００ｎ
／μｌ濃度のジオキシン特異性抗体とともに、１時間３
７℃で培養する。マイクロタイタープレートを、０．５
％の界面活性剤（ポリオキシエチレンソルビタンモノラ
ウレ−１−）の洗浄溶液で２回洗浄する。

プレート壁の結合したジオキシン抗原と、抽出試料の結
合していないジオキシン間に分配された抗原は、ビオチ
ニル化された抗マウスＩｇＧ免疫グロブリン（約１．５
μｇ／ウェル）と結合することによってプレート壁の抗
原に結合されると眼に見えるようになる。４５分間の培
養の後、アビジン−ペルオキシダーゼ複合体とビオチニ
ル化された抗マウス免疫グロブリンを添加して３０分間
反応させる。

０．５％の界面活性剤（ポリオキシエチレンソルビタン
モノラウレート）溶液で５回洗浄後、過酸化物とオルト
−フェニレンジアミン（ＯＰＤ　’）基質を添加し、最
初のファーストＢＬＴＳＡ　（Ｆａｓｔ　ＢＬＳ＾）匂
配の読み取りを４５０ｎ＋ｒ＋で行い、濃硫酸で停止し
てから最終の７アース）８ＬＩＳＡの読み取りを４９２
ｎｏ＋で行う。

試料の数値を、各マイクロタイタープレート上で得た標
準曲線と比較する。標準曲線は、０．１と０．３ｎｇの
ＴＣＯＤ間の５０％阻害値を示す。正規化したデータを
、ウェル当りの出発物質のダラム当量の関数として報告
する。同時に各マイクロタイタープレート上に、標準の
２．３．７．８−Ｔ［：００を１：２の比率で連続的に
希釈して、０．１〜５００ｐｐｂの範囲のものを作製し
た。

実施例３−評価 試料濃度は、　２．３．７．８−ＴＣＤＤ標準品の連続
希釈によって作製された標準曲線によるＴＣＤＯ相当値
で報告できる。希釈されていない試料の２倍の値が。

希釈されたシリーズの値に相当するはずである。

除去されていなかったマトリックス成分によって起こる
妨害は、希釈された試料における不一致で示される。希
釈された試料に確認された濃度が。

希釈された試料の値に１もしくは１０ｐｐｂを加えた試
料の値に一致しない場合、その試料の測定は無効である
。

実施例４−工業プロセスの試料 実験室および工業プロセス由来の各種の工業の化学試料
のジオキシン類とジベンゾフラン類の汚染を、上記の方
法で評価した（明細書の詳細な、説明の欄の最後部の第
１表参照）、 例示された検定例には９種々の蒸留残渣試料（かま残渣
）、２，４．６−ドリクロロフエノール（ＴＣＤ）　。

ニトロジフェニルエーテル、フライアッシュ試料。

および火災を受けた変圧器からのポリ塩素化ビフェニル
（ＰＣ：Ｂ　）油の試料が含まれている。これらの試料
は、存在する汚染物の種類と含量がかなり異なっている
。免疫検定用に調製された試料で測定されたジオキシン
類の汚染濃度を、ビイ・ボブドール博士によって提供さ
れた。ガスタロマドグラフィ／質量分光分析法で分析さ
れた平行試料のジオキシン汚染度［アンダース・エイチ
多エイ・バールマンおよびビイ・ボブドール（Ａｎｄｅ
ｒｓ、　Ｈ，。

Ａ、　Ｂｕｈｌｍａｎｎ　ａｒ＋ｒｌ　Ｂｏｇｄｏｌｌ
−未発表試験結果）］と比較した。ＧＣ／ＭＳデータは
、テトラ−およびペンタ−クロロ類似体の合計含量およ
び４種の最も有毒な類似体（２，３，７，８−テトラＣ
ＯＤ　、　２．３．７．８−ＴテトラＣＯＰ、　　１，
２．３．７．８−ペンタＣＯＤおよび２．３．４．７゜
８−ペンタＣＯＰ　）の合計汚染度として報告された。

はとんどの試料が、　ＰＣＯＦ類とＰＣＤＤ類の混合物
を含有していたが、いくつかの試料はこれらのグループ
の一方しか含有していなかった。ＰＣｒｌＤとＰＣＯＦ
の汚染を示唆する経歴のない試料は含まれていない。

これらの試料には、抗体順と交差反応する可能性がある
と考えられる工業銘柄の３，４−ジクロロニトロベンゼ
ン（ｄＣＮＢｚ　）　　；　ＧＣ／ＭＳ分析法では容易
に評価されないペラフィン；およびＰＣＤＤについて分
析される共通マトリックスの）Ｉｎ−３０マシン油を入
れた。

化学プロセス試料のＢＬＩＳＡ分析法には、異なる量の
検定材料が必要であった。ＥＬＩＳＡ法の５０％阻害点
の測定に必要な出発物質の量は、かま残渣試料＃１に対
しては１ｍｇ、ＰＣＢとＴＣＰの各試料に対しては１０
ｍｇ、およびフライアッシュ試料に対しては０．４ｇで
あった。これらの試料は、　ＴＣＤＤＣ光Ｄで示した場
合、それぞれ、　５，０００．５００．５００および２
５ｐｐｂのレベルの汚染濃度を示した。これら試料を、
翌日に免疫検定法によって再分析した時、　ＴＣＣＤ汚
染度について同一の評価がなされた。

ＥＬＩＳＡ検定法を検出可能に阻害する成分を含有して
いなかった４試料、すなわち。二つのｄＣＮＢｚ試料、
ペラフィンおよびマシン油は、これらのマトリックスが
ジオキシン検出検定法を妨害するか否かを決定するため
に評価した。１．３もしくは１０ｎｇのテトラＣロロを
添加した試料は、ヘキサンに同量のジオキシンを添加す
ることによって起こるのと同様にＥＬＩＳＡ法を阻害し
た。

実施例５−土壌の試料 土壌試料は、高回収率でジオキシン類かえられる最少の
処理時間を決定するためにいくつかの抽出法で評価した
。大容量のへキサンで一夜抽出する方法。また二つのヘ
キサン洗浄液による短時間の抽出法を用いる方法を比較
したところ。各々。

添加ｌ、た。放射能で標識したＴＣＤＤが９０％以上の
回収率で得られた。土壌−硫酸す）　＋Ｊウム試料を。

１０−づつのヘキサンで二回続けて洗浄するだけで。

−夜の混合をしない高速抽出法を評価した。抽出法そし
てアセトニトリル：塩化メチレン（１：１）を用いた場
合、放射能で標識したトレーサーの回収率が低く、変動
が大きいことが観察された。

土壌試料の代表的な抽出法では、１０ｇの湿った土壌を
、　１０ｇの硫酸ナトリウムとともに１時間振盪して乾
燥した。試料を、　１０１７１ｊ！のヘキサンと５１ｎ
ｌのエタノールで抽出し、遠心分離し、ヘキサンの層を
ピペットで除去した。得られた混合物に１０ｍｊ！のヘ
キサンを加えて混合し１５分間振盪して再抽出した。相
分離する前に、商業用のペイントシェーカーではげしく
振盪したところ抽出の効力が改善された。ヘキサン層を
合して９回転蒸発器で容積を減少させた。溶媒を乾煙窒
素気流下で除去し。

残渣を、１：１のジクロロヘキサン：シクロヘキサンの
１ｍＩ！に再懸濁させ。フラットブルーＢを添加した。

試料を、活性炭／ガラス繊維（１：９）のカラムに注入
し、カラムをジクロメタン／メタノール／トルエン（１
５：　４　：　１）で洗浄し１次にトルエンで逆溶離す
ることによってジオキシン類を回収した。ＰＣＤＤ類（
ポリ塩素化ジベンゾジオキシン類）とＰＣＰＤ類（ポリ
塩素化ジベンゾフラン類）は９着色したファツトブルー
Ｂマーカーと共溶用した。

次いで試料を１発煙硫酸を含浸させたシリカゲル／硝酸
銀を含浸させたシリカゲルのカラムに注入し、ヘキサン
で溶離して蒸発させた。試料を前記と同様に可溶化して
、免疫検定法で分析した。

０゜１〜１０１１１］ｂのテトラクロロジベンゾジオキ
シン（ＴＣＤＤ）を添加した土壌試料は、抽出洗浄水中
に、　ｒｃｏｔｉ添加量の９５％回収率を一般に示した
。０．１ｇと１．Ｏｇの土壌から採取した複合土壌の抽
出物は、緩衝液中のＴＣＯＤ標準曲線を妨害しなかった
。

添加された土壌試料を前記の方法で抽出し、０．２ｇ相
当量の土壌／ウェルに対応する検定法で分析したところ
、その免疫法の結果は、０．１〜１０１１ｐｂの範囲の
ジオキシンで汚染した土壌に対する期待値とよく一致し
た。１、ｃｇ相当量の土壌の抽出物／ウェルを検定した
時、免疫検定法の結果と添加された試料の量とに大きな
相関関係があった。１０ＰＩ）ｂの試料の抽出物の検定
結果は９曲線の直線領域からはずれたが、上記の関係か
ら０．１〜１、ｃｐｐｂの範囲では直線関係が得られた
。

分析を数ケ月間にわたって繰返したところ、土壌試料の
多重分析結果はばらつきが少なかった。

有機物の含量が１％より少なく砂の含量が８０％の選択
した土壌試料を、−夜へキサンで抽出し２次いで一夜硫
酸で抽出した。硫酸処理は、免疫検定法を妨害しなかっ
た。土壌抽出物と、土壌抽出物の添加された試料に得ら
れた阻害曲線は、検出可能な濃度のジオキシン類が土壌
抽出物中に含有されていることを示した。

種々の土壌の残留マ）　ＩＪフックス質は検定法を妨害
するかもしれない。抽出後でもいくつかの土壌は、ジオ
キシンを封鎖し続けたので、ジオキシン特異性抗体に利
用できなかった。いくつかの土壌は、ヘキサンに溶解性
の有機物質を大量に含有し、ジオキシンは、免疫検定法
に用いられる溶媒に分配される代わりに前記有機物質と
結合する。

ある試料では、予備的なアルミナもしくはシリカのカラ
ムクロマトグラフィによって、検定法の感度は改善され
なかった。土壌の全有機物の含量と土壌の物理的性質は
、その土壌が、免疫化学手段によってジオキシンを適切
に分析可能か否の良い指標ではなかった。有機物含量の
低いある土壌では、ヘキサンでの簡単な抽出を硫酸処理
によって。

妨害物質を有効に除去され、その結果、免疫検定法によ
って１１）Ｉ）ｂの範囲のジオキシン汚染を検出するこ
とができる。上記の調製条件は９組織もしくは食料の試
料にも同様に適していると考えられる。

この発明の好ましい実施例の上記の説明は１例示と説明
を目的として提供されたものであり、この発明を、開示
された正確な形態に限定することを目的とするものでは
なく９上記の教示事項からみて、明らかに多くの改変が
可能である。実施例は、この発明の原理とその実際の応
用を最高に説明するために選んで記載したもので、その
結果。

当業者は９種々の実施例と、予想される特別な使用に適
した種々な改変例によって、この発明を最高に利用する
ことができる。なおこの発明の範囲は１本願の特許請求
の範囲によって定義される。

（以下余白） 本願は、　１９８８年８月２９日付けで出願された米国
特許願第２３７．１９２号の一部継続出願であり、　１
９８８年１月２６日付でドイツ連邦共和国で出願され現
在係属中の西独特許願第Ｐ３８０２１５７．９号の優先
権を主張する出願である。

ローレンス・リバーモアー・ナショナル・ラボラトリ−
（Ｌａｗｒｅｎｃｅ　Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ　Ｎａｔｉｏ
ｎａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の業務としての、米国
エネルギー省とカリフォルニヤ大学間の契約第Ｗ−７４
０５−ＢＮＧ−４８号にしたがって、米国政府がこの発
明の権利を有する。

【図面の簡単な説明】

第１Ａ図、第１Ｂ図、および第１Ｃ図はそれぞｈＰ（：
Ｂ油、）リクロロフェノール、およびクロロニトロベン
ゼン蒸留残渣をカーボンカラム（白画角印）およびカー
ボンカラムと発煙硫酸シリカラム（黒画角印）で処理し
てＢＬＩＳＡ検定にかけたときの免疫化学的な交差反応
性物質の除去効果を示すグラフである。 第２図は、免疫検定法の感度に対する界面活性剤の濃度
の効果を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、試料の分解反応と、以下の工程： ａ、粗抽出物の調製工程； ｂ、ジオキシンの画分として知られる、平面構造を有す
   るポリハロゲン化多環式芳香族化合物の画分の分離工程
   ；および ｃ、前記ジオキシン画分の水性緩衝溶液への溶解工程； を包含する予備工程とにより妨害物質を除去した後、特
   異的抗体との反応によって、ジオキシン類およびジベン
   ゾフラン類と呼称される、平面構造のポリハロゲン化多
   環式芳香族化合物を定性および定量分析する方法。 ２、前記粗抽出物の調製工程が、本来無機性の試料およ
   び本来主として有機性の可溶性の試料については、酸処
   理による分解反応とこれに続く有機溶媒による抽出が行
   われ、本来主として有機性の易溶性の試料については、
   有機溶媒による抽出が行われることを包含する請求項１
   記載の方法。 ３、前記ジオキシン画分が、クロマトグラフィーによっ
   て分離される請求項１記載の方法。 ４、前記クロマトグラフィーの工程が、炭素−ガラス、
   活性化シリカ、発煙硫酸−シリカ、硝酸銀シリカおよび
   酸アルミナから主としてなる群から選択される単一マト
   リックスもしくは複数のマトリックスを使用する請求項
   ３記載の方法。 ５、被測定物質と類似の、吸着および溶出の挙動を有す
   る１種もしくは２種以上の染料が、前記クロマトグラフ
   ィーの分離工程を監視するのに使用される請求項３記載
   の方法。 ６、前記ジオキシン画分を、１種もしくは２種以上の界
   面活性剤を添加することによって水性緩衝溶液に溶解さ
   せる請求項１記載の方法。 ７、前記測定反応が、コンペティティブ法で行われる請
   求項１記載の方法。 ８、前記測定反応が、放射性同位元素の放射、化学発光
   の放射、蛍光の放射および酵素−結合信号を含む群から
   選択される信号によって指示される請求項７記載の方法
   。 ９、前記コンペティション法が、約１〜１０ｎｇ／反応
   ウェルの被覆抗原濃度で行われる請求項７記載の方法。 １０、前記測定反応が、アビジン−ビオチン結合により
   増幅された酵素−結合信号によって指示される請求項８
   記載の方法。 １１、工業試料もしくは環境毒物由来の有機残渣を含有
   する試料中のジオキシン類と呼称される平面構造のポリ
   ハロゲン化多環式芳香族化合物を定量的に免疫検出する
   方法であって、下記工程：ａ、粗抽出物の製造工程； ｂ、ジオキシン画分の分離工程； ｃ、前記ジオキシン画分を水性緩衝溶液へ溶解する工程
   ；および ｄ、前記ジオキシン画分をジオキシン特異性モノクロー
   ナル抗体と反応させる工程； を包含する方法。 １２、前記粗抽出物が有機溶媒による処理で製造される
   請求項１１記載の方法。 １３、前記粗抽出物が酸で前処理される請求項１２記載
   の方法。 １４、前記ジオキシン画分が固液クロマトグラフィーに
   よって分離される請求項１１記載の方法。 １５、前記ジオキシン画分の水性緩衝液への溶解が界面
   活性剤の添加によって促進される請求項１１記載の方法
   。 １６、前記界面活性剤の濃度が、約０．０１〜２重量％
   である請求項１５記載の方法。 １７、前記ジオキシン画分の水溶液への溶解が超音波混
   合によって行われる請求項１１記載の方法。 １８、前記ジオキシン画分と前記ジオキシン特異性モノ
   クローナル抗体との反応がコンペティティブＥＬＩＳＡ
   法で行われる請求項１１記載の方法。 １９、結合される抗原コーティングの濃度が、約０．２
   〜１．０ｎｇ／ウェルである請求項１８記載の方法。 ２０、前記コンペティションＥＬＩＳＡ試験法の感度が
   アビジン−ビオチン結合で増幅される請求項１９記載の
   方法。 ２１、土壌中の、平面構造のポリハロゲン化多環式芳香
   族化合物を検出する請求項１１記載の方法。 ２２、下記工程： ａ、粗抽出物の製造工程； ｂ、ジオキシン画分の分離工程； ｃ、前記ジオキシン画分を水性緩衝液に溶解する工程； ｄ、前記ジオキシン画分と、それぞれのＡＴＣＣ寄託番
   号が（ＨＢ９７４１）、（ＨＢ９７４２）、（ＨＢ９７
   ４３）、（ＨＢ９７４４）および（ＨＢ９７４５）であ
   る、ＤＤ−１、ＤＤ−３、ＤＤ−４、ＤＤ−５およびＤ
   Ｄ−６からなる群のハイブリドーマから選択された、平
   面構造のポリハロゲン化多環式芳香族化合物に対し特異
   的なモノクローナル抗体とを反応させる工程；および ｅ、結合した抗体の量を測定する工程 を包含する、工業試料もしくは環境試料中のジオキシン
   類を検出する方法。 ２３、ｃ工程の水性緩衝液が界面活性剤を含有し、界面
   活性剤の濃度が、約０．０１〜２％の範囲であるとさら
   に定義される請求項２２記載の方法。 ２４、前記界面活性剤が、約０．０１〜２重量％のカッ
   トスカムを含有するとさらに定義される請求項２３記載
   の方法。 ２５、前記の結合した抗体が、コンペティションＥＬＩ
   ＳＡ試験法を用いて測定されるとさらに定義される請求
   項２２記載の方法。 ２６、前記コンペティションＥＬＩＳＡ試験法の結合し
   たコーティング抗原の濃度が、約０．２〜１．０ｎｇ／
   ウェルである請求項２５記載の方法。 ２７、前記コンペティションＥＬＩＳＡ試験法の感度が
   、アビジン−ビオチン結合によって増幅される請求項２
   ６記載の方法。 ２８、ａ、ジオキシン画分を試料から分離するユニット
   ； ｂ、ジオキシン化合物類を、ジオキシン特異性抗体で測
   定するユニット； を有する、妨害物質を含有する試料中のジオキシン類測
   定用試験キット。