JPS6314691A - モノクロ−ナル抗体，およびそれを用いたダイオキシンおよびジベンゾフランの検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ダイオキシン：ｌ；　、及びジベンゾフラン
の検出方法、その検出および定量分析に有用な新規のモ
ノクローナル抗体、そして該抗体を生産し得るハイブリ
ドーマに関する。

アメリカ合衆国政府は、ローレンスリバーモア国立研究
所が本発明を行使する権利を有する。これはアメリカ合
衆国エネルギー省とカリフォルニア大学の間で交わされ
た契約（Ｎｏ、　Ｗ−７４０５−ＥＮＧ−４８）に準す
るものである。

（従来の技術） ポリハロゲン化ジベンゾダイオキシン（ＰＣＤＤ　）お
よびポリハロゲン化ジベンゾフラン（ＰＣＤＦ）は。

一般に生物圏のみならず人類の健康に対しても脅威を与
える。持続性の有毒汚染物質である。これらの化合物は
、オレンジ剤（Ａｇｅｎｔ　Ｏｒａｎｇｅ）のよう′な
除草剤の不純物であるが、各種の工業上の化学的プロセ
ス、およびプラスチックやポリクロル化ビフェニール（
ＰＣＢ）のような他のポリクロル化有機化合物の燃焼過
程または灰化過程における副産物としても発生する。こ
のようなプロセスが大規模に使用されたり、あるいは存
在することを考慮すれば、ダイオキシンおよびジベンゾ
フランは環境中に広範囲に拡がっている。これらの物質
の有害な性質が十分に認識されつつあるので、その発生
源をつきとめることが非常に重要なことになっている。

重要であり、かつ重大な第１のステップは、汚染箇所を
同定することである。これには。

食料品のみならず土壌や大または動物の組織から採取し
た試料における。これらの化合物の存在を検出する。簡
単かつ経済的な、そして迅速な試験方法が必要である。

望ましい試験方法の重要な点は特異性に関することであ
る。ＰＣＩと同様に、　、ＰＣＤＤおよびＰＣ叶には非
常に多数の異性体が存在する。これらの異性体には、毒
性が非常に高いものからそれほど毒性を有さないものま
で存在するが、他の比較的無害である化合物と化学的に
類似している。第２の問題点は、これらの化合物のうち
、環境中で最も毒性の高い異性体、すなわち２，３，７
．８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシンが非常
に少量で毒性を有し、そして食物連鎖の中を移動するに
つれて。

濃縮され得るということである。従って、望ましい試験
方法としては、これらの有毒物質の存在を非常に低濃度
で検出することが可能でなければならない。土壌試料の
汚染に対する化学分析は、さらにいくつかの他の要因に
よって妨害される＝（１）ダイオキシンは土壌に堅固に
結合し、水への溶解度は無視し得る程度であること、そ
して（２）多数の異性体および関連する化学的汚染物質
の従来のガスクロマトグラフィーおよび質量分析法によ
る定量分析は、費用と時間を要すること。費用と分析時
間を考慮すると、ある領域における汚染範囲を決定する
ために、サンプリングを詳細に行うことができず、また
複雑な設備を有する集中的に管理された実験室を必要と
するが、これらは上記のような健康に対する害毒を現場
で、モニターするには適していない。

従来の分析法を凌駕する免疫分析法の潜在的な利点は、
以前より認識されている。特に免疫分析法は、ガスクロ
マトグラフィーおよび／または質量分析法と同程度の感
度を有しながら９分析がより迅速であって、費用も高価
ではない方法を提供する。

環境中のダイオキシンを検出する際の上記問題を解決す
る。従来のあるアプローチがＰ、帽＾ｌ　ｂｒ。

らによる論文（“クロル化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシン
のラジオイムノアッセイ”、酵素化学における方法、　
−８４：　６１９−６３９．１９８２）および、八Ｉｂ
ｒ−ｏらによる米国特許第４，２３８，４７２号（クロ
ル化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシン）のラジオイムノアッ
セイ。

１９８０年１２月９［１出願）に考察されている。八ｌ
ｂｒ。

らによって述べられた分析法はラジオイムノアッセイで
あって、１−アミノ−３，７，８−”　）リクロロジベ
ンゾーｐ−ダイオキシンによって免疫を与えたウサギに
よって産生されたポリクローナル抗血清に基づくもので
ある。

八１ｂｒｏらの分析法は、多くの制限があるために広く
適用されてはいない。

この方法は、　”５４−ＴＣＯＤをしばしば合成する必
要があり１分析を完了するのに３日を必要とし。

そして非特異的なウサギ抗血清を使用するため。

２．３，７．８−ＴＣＯＤに対して必ずしも十分に特異
的ではない。

別のアプローチが５ｔｅｐｈｅｎ　Ｊ、　Ｋｅｎｎｅｌ
らによる論文（“クロル化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシン
に対するモノクローナル抗体°゛、毒物学および応用薬
物学２羽、　２５６−２６３．１９８６）のなかに報告
されている。ダイオキシンに対するこの試験方法は、ダ
イオキシンのサイログロブリン複合体、すなわちサイロ
グロブリン−２−アジプアミド、３，７．８−トリクロ
ロジベンゾ−ｐ−ダイオキシンによって免疫を与えたＢ
ＡＬＢ／ｃマウスによって産生されたモノクローナル抗
体に基づいている。免疫脾臓細胞。

および５Ｐ２１０．　Ｐ３またはＮＳＩと呼ばれる骨髄
腫細胞の細胞融合によってハイブリドーマが産生された
。しかしながら、　Ｋｅｎｎｅｌらによって開発された
方法は２選択性が不適当であるという欠点が問題になる
。この問題点は、抗体が同定すべき標的ではない化合物
と反応する一方、溶液中のタンパク非融合２，３，７．
８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン、すなわ
ちダイオキシ異性体の中で最も毒性の高いダイオキシン
、および他のダイオキシン異性体と反応しないというこ
とである。他の問題点は、この試験方法が欠点を伴うラ
ジオイムノアッセイ法を利用することである。

（本発明の目的） 上述から明らかなように、有毒なダイオキシンを検出す
る有効的かつ実用的な試験方法が依然として必要とされ
ている。

従って１本発明の主要な目的は、ダイオキシンに対する
免疫分析法を提供することであり、この方法は必要な選
択性およびダイオキシンの存在を数ｐｐＢ　（試料当た
りナノグラム）、の濃度で決定的に示し得る選択性を有
する。

本発明の他の目的は、迅速に実施することが可能であり
、また容易に移動ができ、野外で実施し得る試験方法を
提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、最も有毒なポリクロル化ダ
イオキシンおよびポリクロル化ジベンゾフランを決定的
に感知し、得る抗体を提供することにある。

本発明のさらに他の１°１的は、毒素の検出感度を１兆
分の１　（ｐａｒｔ　ｐｅｒ　ｔｒｉｌｌｉｏｎ、　ｐ
ｐｔ）のレベルにまで高め得る方法を明確にすることに
ある。

本発明のさらに別の目的、利点および新規の特徴は、一
部分は以下の記述に示されており、一部分は以下の実施
例により当業者に明らかとなるか。

あるいは本発明を実施することによって学び得る。

本発明の目的および利点は、特に付加された特許請求の
範囲に指摘されている方法および組み合わせによって実
現し、そして達成し得る。

（発明の要旨） 本発明は酵素連結免疫吸着分析（Ｅｎｚｙｎ＋ｅ−Ｌｉ
ｎｋｅｄ−１［ｍｎ＋ｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ−Ａｓｓａ
ｙ）　ＥＬＩＳＡ法に関する。この方法では、特異的な
モノクローナル抗体を用いて試料を検査することにより
、ポリクロル化ダイオキシン、特に２．３，７．８−テ
トラクロロジベンゾ−ｐ　−ダイオキシン（ＴＣＯＤ）
の存在を決定し得る。特異的なモノクローナル抗体は、
特異的なハイブリドーマ細胞系（以後、　ＤＤ−１，Ｄ
Ｄ−３，ＤＤ−４，ＤＤ−５およびＤＤ−６と呼ぶ）か
ら得られる。細胞系およびこれらの細胞系に由来の抗体
の生産は、以下により詳細に述べられている。これらの
抗体は、　ＴＣＯＤに対する高い親和力および１５ｆｔ
Ｊ＜性によって特徴付けられる。提案されたｌ１ＬＩＳ
Ａ試験のプロトコル（ｐｒｏｔｏｃｏｌ）にこれらの抗
体を用いるごとにより、検査試料中のダイオキシンの７
？在を数１１　Ｉｔ’ｌｌ以下のレベルで決定し得る。

この試験は数１１ではなく、数時間で完了し得る。また
、放射椋識化合物を使用する必要もない。本発明０月Ｊ
′を体を用いれば、　ＴＣＩｌＩＩに対する試験は、水
性媒体中で音波処理することによって実施し得る。好７
＋−シい実施様式では２本試験方法の感度は、　０．０
５体積％稈度の濃度の洗浄剤を添加することによっ°（
増大さ・ｌるごとが可能であり。

ｔｐｐｔ程度以［このし・＼ルのＴ　Ｃ１１１１を検出
し得る。

（本発明の実施様式） ハイブリー１−ニマお、Ｌび一抗体の一牛産２本発明の
ハイプリトーマ１１＋１−１．　ＤＤ−２，ＤＤ−３，
ＤＤ−４゜ＤＤ−５およびＤＤ−６は、　Ｓｌ’２／（
＋マウス骨髄腫細胞を。

免疫化された１１　Ａ　Ｌ　１１　／　ｃマウスおよび
ビオチイーマウスから得た脾臓細胞と融合させることに
よって生産された。動物が小さな有機分子に対して免疫
応答を行うためには、ハプテン（またはその類似体）が
担体タンパクに結合しなければならない。従って、抗体
を生産する第１ステツプは、タンパクに結合し得る官能
基を有する類似体を合成することである。このような免
疫化に対して選択されたＴＣＯＤ類似体は、１−アミノ
−３，７，８−トリクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン
（Ａ−ｔｒｉＣＤＤ）である。この化合物は、　Ｃｈａ
ｅら（“パブテン化合物としての１−アミノ−３，７，
８−）ジクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシンおよび１−
アミノ−２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−
ダイオキシンの合成゛。

Ａｇｒ、　Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍ、、　　２５．１２０７
−１２０９　（１９７７））によって公表されている方
法に従って合成した。従って、　Ａ−ｔｒｉｃＤＤは、
サイログロブリン、ウサギ血清アルブミン（ＢＳＡ）、
　　キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）など
のような担体タンパクに結合し得る。本実験においては
、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いた。′そして、
以下の表に示すようにＢＡＬＢ八マウへおよびビオチイ
ーマウスに注射した。

、表−り 坑ｌ／〕］野Ｇ仁−久ローン 抹　　　　　口１　　　イソタイプ ビオチイー　　　　　ＤＤ−Ｉ　　　　　　ＩｇＧ１カ
ッパーＢＡＬＢ／ｃ　　　　　　　　ＤＤ−３１ｇＧ１
力・ンパービオチイ−ＤＤ−５１ｇＧ２ａカッパーＢＡ
ＬＢ／ｃ　　　　　　　　ＤＤ−４ＩｇＧ２ａカツパー
ビオチイＤＤ−６１ｇＧ２ａカッパー （以下余白） それに続く免疫化プロトコルは、典型的には。

１０ケ月間にわたりマウス−匹につき１ケ月あたり１０
μｇ（アジュバント中）を注射することを包含し、最終
の注射は、その動物の肺臓を取り出す数日前に行った。

注射プロトコルを完了後、脾臓細胞を取り出し。

それらを骨髄腫細胞と融合させることにより培地中で生
育することを誘発させた。本件の場合においては、脾臓
細胞は５Ｐ２１０マウス骨髄腫細胞に融合された。これ
らの融合細胞またはハイブリドーマは培地中で生育し、
モノクローナル抗体を分泌する。各細胞クローンはただ
１種の抗体のみを分泌するが、脾臓細胞の任意の融合に
より、典型的には１０，０００のハイブリドーマが得ら
れる。それゆえ、スクリーニング方法は、極めて重要で
ある。

本件の場合においては、上記ハイブリドーマは次に、　
　ＢＳ＾およびＲ５八からＡ−）すＣＤＩＩ−ＢＳＡお
よび＾−１−ＩＪ　ＣＤＤ−ＢＳＡを区別する能力がス
クリーニングされる。最初のスクリーニングをもとにし
て、安定した抗体産生コロニー２５個が単離され、これ
はサブクローン化され、凍結された。残りのクローンは
、懸濁液中の遊離ＴＣＯＤを認識する能力について、再
びスクリーニングされた。実験的には、　ＴＣＤＤを１
０〜１１００ｎのオーダーで含むヘキサンを乾燥させ、
　　ＢＳＡを含む生理食塩水（Ｉｍｇ／１ｆｆｉ）　　
０．５ｍｌを加え、２分間音波処理した。”　Ｃ−ＴＣ
ＯＤを用いた実験によれば、約半量のＴＣｒｌｌ）が水
相に懸濁するようになり、これは約１００ｐｐｂの濃度
に相当する。次いで、他のダイオキシン異性体について
も同一の工程を実施した。次にマイクロタイタープレー
トのウェルに入れられた種々の割合の希釈物が懸濁ＴＣ
ＯＤによって調製され、抗体を加えて競合１１３Ａ測定
を行った。競合１ｊ１．ｌｓＡ測定のｆ−法は次の文献
に詳細に述べられている：　ｆｌｕｔｅ、　Ｗ、　Ｉｌ
、　（１９８４）“Ｐｒａｃｔｉ−ｃａｌ　　Ｉｍｍｕ
ｎｏａｓｓａｙ：　　Ｔ１１＋！　　５ＬａＬ（！　ｏ
ｒ　　Ｌｈｅ　　Ａｒｔ”、　　ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋ
ｅｒ、　Ｉｎｃ、、　Ｎ、Ｙ、、　Ｎ、Ｙ、。

モノクローナル抗体ｃ体の結合１，１異性を特徴づける
ことについて成功したのは、主として、信頼できる競合
ＥＬＩＳ＾測定プ１−＋１−コルを開発したことによる
。好ましい測定法によれば、まず１表Ｉに挙げられる種
々の化合物をヘキサンに１０μｌｍの割合で添加した貯
蔵溶液を調製する。ヘキサン溶液の１０μｌを小バイア
ルに入れ、窒素ガス気流下でエバボレートし、リン酸緩
衝化食導水を用いたｌｌｌ１ｇ／ｍｌ　ＢＳＡ溶液（Ｂ
Ｓ八へ、１％が添゛加されている）５００μｆｆｉを加
える。そのバイアルに栓をし、超音波洗浄水槽中に２時
間入れる。２時間音波処理を行うと１時間行った場合よ
りも再現性がよい。音波処理の間にヘキサンは完全にエ
バポレートされるようであり、ダイオキシンを含む水性
溶液が残留する。

Ａ−トリＣ０Ｄ−Ｒ５＾で被覆されたマイクロタイター
は。

オボアルブミンの３％溶液で阻害され、そして音波処理
されたダイオキシン−ＢＳＡの各種２倍希釈液（１００
ｐｐｂ−０，１ｐｐｂの範囲にわたる）が調製される。

上記プレートの各ウェルの音波処理ダイオキシン−ＢＳ
Ａ溶液１００μｌは２等容量の抗体と混合される。

この抗体は、　　ＢＳ八に吸着されたダイオキシン、お
よびプレート上のＡ−）すＣＤＤ−ＢＳＡの間で分配さ
れる。

第１図のグラフは、モノクローナル抗体ＤＤ−１を用い
た競合ＩＥＬＩｓＡ測定の結果を示す。このグラフには
、他の抗体を使用した不法の結果も示されている。＾−
トすＣ１）＋１−１１ｓ＾はマイクロタイタープレート
のウェル表面Ｉ−に吸着された。表に示される種々の競
合物：は、ウシ胎児血清−Ｉ′ルブミン（ｎｓＡ　）を
含有する生理食塩水中に懸ｉ’！ｌＴｈされた。これら
の溶液は、ダイオキシンのへ−１−リン溶液１０μｌと
生理食塩水−ＢＳＡ　５００７１１．とを音波処理する
ことにより調製された。これらのダイオキシン−ＢＳＡ
溶液の各種の希釈物は３次に、　　１００〜０．２ｐｐ
ｂの範囲とされ、マイクロタイターウェルに入れられた
。次に。

等量のＤＤ−１モノク「ｌ−ナル抗体を添加し、そして
１時間反応させた。この抗体は、プレート」二の八−ト
リＣ０Ｄ−ＢＳＡ　、または溶液中のダイオキシンに結
合する。１時間の反応後に、溶液相を除去し、プレート
を洗浄し、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスイムノグ
ロブリンとともに、再び１時間インキュベートする。二
度目の洗浄を行い、そして。

基質（ＩＩＢＴｓ）を上記ペルオキシダーゼに加えた。

上記酵素−抗体結合物およびノ１（質は「現像剤」とし
て機能し、プレート上でＡ−１−リＣＤＤ−Ｒ３Ａに結
合したＤＤ−１を可視化する。結果は、競合物が存在し
ない場合のウェル内の応答に比較した割合として表され
る。この例において、　ＤＤ−１はオクタクロロジベン
ゾダイオキシンと反応しない。約２０ｐｐｂの２゜３．
７．８−ＴＣＯＤにおいて、比較Ｉ！ＬＩＳ＾応答は、
対照の半分である。このことは、　００−１抗体の半分
が溶液相のダイオキシンに結合し、そして、半分はプレ
ート上の八−トリＣ０Ｄ−１？ＳＡに結合したことを示
す。

１．２，３．７．　（８）−ＴＣＯＤについては、　５
０％阻害は約４　ｐｐｂにおいて起こり、このことは、
　ＤＤ−１が２．３．７．８−ＴＣＤＤよりも選択的に
１．２，３．７（８）−ＴＣＯＤと結合することを示す
。

この試験をもとにし、さらに研究を進めるために５つの
ハイブリドーマ（００−１，ＤＤ−２，ＤＤ−４，ＤＤ
−５およびＤＤ−６と命名される）が選抜された。表■
はこの分析を２種々のダイオキシン、ジベンゾフラン、
　ＰＣＢおよび他のクロル化炭化水素に用いたときの、
これらの抗体の特異性を示す。

第１図のグラフおよび表■は、競合物としていくつかの
クロル化化合物を用いた典型的な競合データを示す。そ
のようなデータから、抗体の結合を５０％（Ｉ５゜）だ
け阻害するのに必要な濃度を決定することができる。表
Ｈには抗体を用いて試験したすべての化合物に対するＩ
、。が挙げられている。

これらの値を報告する際には、２つの要素が非常に中Ｉ
ｙ１である。６つの抗体すべてがテトラクロロジ・＼メ
ゾダイオキシン類に対して高い親和性を有し、　１，３
，７．８異性体混合物に対して最も高い親和性を有する
。それらは、　２，３，７．８−ＴＣＤＤおよび２，３
゜７．８　ＴＣＩＩＩＩＦに対してはやや低い親和性を
有する。

＋１１１．／ｌは１．２’、３，６．７．８−ヘキサ−
ＣＩＩＤとある程度の反応性を１．１つ。試験を行った
最も高い濃度（１００ｐｐｂ）までの範囲において、す
べての抗体はへキサクロロ−ＤＩｌｌ’　、オクタクロ
ロ−ＤＢＦ、オクタクロロ−〇〇およびｐｃｒｔ　類に
反応しないか、あるいはかろうじて反応する程度である
。これらの抗体の結合特異性はＪｌ：常に望ましい。な
ぜなら、それらは、ダイオキシンおよびジベンゾフラン
異性体のうちの最も毒性のあるものに、１、す’Ｍ　Ｊ
Ｊ＜的に結合するからである。

我々の経験からｌ：１．１％　１．１″るマウスは異な
る結合特異性および親和１−１のり１：Ｉ−ンを生産す
る。各マうスはひとつのＩＫ　ｌ＋にに対し゛Ｃ応答す
るという点において、はぼ’１．’＋有である。同一・
のマウスからの複数のクローンは、しばしば非常に類似
している。

それゆえ、我々は、異なるマウスから一組のモノクロー
ナル抗体を誘導することに興味をもった。

我々は同一の基本的プロトコルを用いて、異なったマウ
スから５つのハイブリドーマを選択した。

すべてが２．３，７．８−ＴＣＤｌｌを認識する。これ
らの分析は高度に再現性があり、　ＴＣＤＤについて繰
り返して測定を行うと、　Ｉｓ。値の変動は２０％未満
であった。

これらの細胞系は寄託することが予定されており、　、
ＡＴＣＣ受託機関で維持される。

試１１−ｇ′）−分４屋 ダイオキシンおよびジベンゾフランの存在を決定する試
験方法としては、ノに本市には１本明細書中で述べた」
こ記ｌｆＬ体を使用した競合１’ｉｔ、Ｉｓ＾測定がま
た。採用される。これらのシ１（利は、土壌試料。

組織試料または食物試料であり得る。これらの試料は、
まず、ダイオキシンまたはジベンゾフランを抽出してそ
れらが定量的に媒質（免疫分析の方法に適する）中に移
行するように前処理される。

土壌試料は１例えば９次のプロトコルに従って処理され
る。まず、ダイオキシンまたはジベンゾフランが、標準
ＥＰＡ法６１３に従い、ヘキサン中に抽出される。この
時点において、その抽出物は。

１もしくはそれ以上の清浄工程を経て妨害物質が除去さ
れる。これについては、詳細に後述する。

その後、その試料はほぼ乾固するまで濃縮される。

この時点において、試料残渣は生理食塩水溶液中に再懸
濁される。その生理食塩水溶液を約２時間音波処理する
ことにより、再現性があり信頼しうる結果が得られる。

このことにより、毒物の存在をｐｐｂの範囲で同定する
ことが可能な満足すべき測定が達成される。制御された
量の洗浄剤を添加することにより感度が劇的に改善され
る。好ましい洗浄剤は、　　ＣｕｔｓｃｕｍＴＩ４およ
びトウィーン２０である。これらの洗浄剤の濃度を約０
．０５体積％に減少させることにより、ダイオキシンま
たはジベンゾフランを検出する分Ｊｊ１においてその感
度を著しく改善することができることをＩＱ　）ンは見
い出した。

ダイオキシンまたはジベンゾフランは数Ｐｌ）ｈという
低濃度で検出される。

上記試料り、１２次に、マイク１．１タイタープレート
に入れられ、抗体が添加され、競合ＥＬＩＳ＾測定が行
われる。この試料は１次に２回収され、マイクロコンピ
ュータ−で分析される。この方法は、さらに、以下の実
施例により述べられる。

（実施例） 本発明を実施例につき記載する。

尖旌炭上 湿土壌１０ｇを５ＱＯｍｅの褐色の容器に計量し、硫酸
ナトリウム２０ｇと充分に混合する。メタノール２０ｍ
１ｌおよびヘキサン１５０ｍｆｆ１を加え、混合物を少
なくとも３時間振盪する。その混合物からヘキサン層を
デカントし、濾過し、ロータリーエバボレートで容量を
１　ｍｌ、に減らず。その残渣を短いディスポーザブル
　りｌＩ７トグラフイーカラム（シリカゲルまたはアル
ミナ、１ｇ）にかけ、ヘキサンまたは２０％メチレンク
ロリド／ヘキサンでそれぞれ溶出する。その溶媒を乾燥
窒素ガス気流下で除去し、残渣を免疫分析法に適したも
のとする。

上記クロマトグラフィーカラムにかける目的は。

分析を妨害する土壌中のいかなる余分な物質をも除去す
ることである。土壌は、ヘキサンに可溶な有機物を多量
に含有し、ダイオキシンは、免疫分析に使用される溶媒
に優先して、該有機物中に分配される。その結果、ダイ
オキシンは抗体と結合しなくなる。ある種の土壌のタイ
プについては。

クロマトグラフィー処理を行わないと免疫分析がうまく
行われない。上記２つの条件においては。

分析が同様にうまく達成され、さらに他の条件下におい
ても達成され得る。この方法により組織および食物の試
料についても同様に分析がなされ得る。

実施例２ ヘキサンに溶解させた土壌抽出物または試料化合物を乾
燥させ、洗浄剤（例えばＣｕ　ｔｓｃｕｍ”　）の５％
（ｖ／ｖ）メタノール溶液５μｉを添加する。次に、こ
のメタノールをＮ２気流下でエバボレートする。リン酸
塩緩衝化食塩水５００ｔｔ　ｌ　（０，０１Ｍリン酸塩
、　０．ＩＭ　ＮａＣｌ、　ｐＨ７，２）　　（ＰＨ１
−７）　５００／７１が加えられ２反応バイアノ囚Ｊ密
栓される。このバイアルを次に、　１ｌｒａｎｓｏｎｉ
ｃ　２２０超音波洗浄器に入れ。

３０分間音波処理を１１・う。次に、この検体のダイオ
キシン含量を競合ｒｉ１．Ｉｓ＾測定法により滴定して
測定する。

本発明の好適な実施態様についての前記記載は。

例示および説明のために行われζいる。それは完全な記
載を意図しだらのではなく、また２本発明を詳細な形で
開示して限定するものでもない。そして、上記教示を考
慮すると、明らかに、多くの修飾および改変が可能であ
る。その実施態様は。

本発明およびその実際的適用の原理を最もよく説明する
ために選ＩＲされ、記載された。それゆえ。

当業者が１種々の実施態様および種々の修飾により１本
発明を特徴とする特定の使用に最も適した形として使用
するのを可能にする。本発明の権利範囲は、ここに添付
される特許請求の範囲により示される。

（発明の要約） 本発明は、ダイオキシンおよびジベンゾフランと反応す
る５つのモノクローナル抗体、およびこれらのモノクロ
ーナル抗体を生産する５つのハイプリドーマを開示する
。

さらに本発明は、ダイオキシンおよびジベンゾフランに
対して鋭敏な免疫分析に、これらの抗体を用いる方法を
提供する。この方法によれば、試料中に数１）ｐｂの範
囲の濃度で存在する。これらの汚染物質を検出し得る。

【図面の簡単な説明】

第１図は１本発明の方法を実施したときの競合物の濃度
に対するＥＬＩＳＡ応答の割合を示すグラフである。 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマまた
   はその子孫であって、 該モノクローナル抗体がポリハロゲン化ジベンゾ−ｐ−
   ダイオキシンおよびポリハロゲン化ジベンゾフランの１
   またはそれ以上の有毒な異性体に特異的であり、かつ他
   の芳香族化合物との反応性を有さない、 ハイブリドーマまたはその子孫。 ２、前記有毒な異性体が以下の化合物である、特許請求
   の範囲第１項に記載のハイブリドーマ：２，３，７，８
   −テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン、 １，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキ
   シン、 １，２，３，７−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキ
   シン。 １，２，３，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキ
   シン。 １，２，３，７，８−ペンタクロロジベンゾ−ｐ−ダイ
   オキシン、 ２，３，７，８−テトラブロモジベンゾ−ｐ−ダイオキ
   シン、そして ２，３，７，８−テトラクロロジベンゾフラン。 ３、前記有毒なダイオキシンの異性類似体により免疫化
   されたマウスの脾臓細胞に由来し、該有毒なダイオキシ
   ン異性体に特異的な結合親和力によって選別される、 特許請求の範囲第１項に記載のハイブリドーマ。 ４、ポリハロゲン化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシンおよび
   ポリハロゲン化ジベンゾフランの有毒な異性体に対して
   特異的な親和力を有する、 モノクローナル抗体。 ５、前記有毒な異性体が以下の化合物である、特許請求
   の範囲第４項に記載のモノクローナル抗体： ２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキ
   シン、 １，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキ
   シン、 １，２，３，７−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキ
   シン、 １，２，３，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキ
   シン、 １，２，３，７，８−ペンタクロロジベンゾ−ｐ−ダイ
   オキシン、 ２，３，７，８−テトラブロモジベンゾ−ｐ−ダイオキ
   シン、そして ２，３，７，８−テトラクロロジペンゾフラン。 ６、表IIに与えられるような、おおよその親和力によっ
   て特徴付けられる、 特許請求の範囲第４項に記載のモノクローナル抗体。 ７、ダイオキシンまたはジベンゾフランの有毒な異性体
   を検出する方法であって、 ａ）該異性体をハイブリドーマから得られたモノクロー
   ナル抗体と接触させること、およびｂ）結合抗体の量を
   測定すること、を包含する方法であり、 該ハイブリドーマが、ポリハロゲン化ジベンゾ−ｐ−ダ
   イオキシンおよびポリハロゲン化ジベンゾフランの１ま
   たはそれ以上の有毒な異性体に特異的であり、かつ他の
   芳香族化合物との反応性を有さないモノクローナル抗体
   を分泌する、 検出方法。 ８、前記異性体が試料から抽出され、音波処理によって
   、洗剤を含有する生理食塩水中に再懸濁される、 特許請求の範囲第７項に記載の方法。 ９、前記結合抗体が競合ＥＬＩＳＡ試験法によって測定
   される、 特許請求の範囲第７項に記載の方法。