JPS62272972A - イムノアツセイ法におけるハプテンの検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 〔産業上の利用分野〕 この発明は、モノクローナル抗体およびイムノアッセイ
に関するものである。さらに具体的に述べると、この発
明は、予期されない性質を有するモノクローナル抗体を
用いたハプテン検出法、およびこのような抗体お製法に
関するものである。

〔背景技術〕

診断検査法におけるイムノアッセイ技術の使用は近年極
めて広範化し、特殊なものでないと思われる研究情況お
よび臨床状況下では今や極めてひんばんに用いられてい
る。この方法が成功した背景をなす原理は、を椎動物の
免疫応答産生物である抗体が、その産生を刺激した抗原
に対して有する相対的特異性である。抗原抗体反応の特
異性は、沈降反応、免疫拡散法、凝集アッセイ、免疫電
気泳動、ラジオイムノアッセイ（ＲＩ　Ａ）、および固
相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を含めたエンザイムイ
ムノアッセイ（Ｅ　Ｉ　Ａ）のような周知の免疫診断法
に用いられる。イムノアッセイ法であるＲＩＡおよびＥ
ＲＡは、一般的にすぐれた感度とＥＩＡにみられる大き
な安全性のため、特に一般化されるに至った。イムノア
ッセイの原理は、環境汚染物の検出のような他の分野に
まで使用が拡大されている。

ハイブリドーマ／モノクローナル技術における極めて最
近の進歩により、イムノアッセイの全領域に著しい改善
がもたらされた。今まで用いられていたポリクローナル
抗血清が広範囲の親和性を有する抗体を含むのに対して
、不死性セルラインと単一分泌性ひ臓細胞のクローン化
ハイブリッドが産生ずるモノクローナル抗体は極度に限
定された親和性、すなわちポリクローナル抗血清より大
きな特異性を有するものを選択できる。

上述したイムノアッセイは種々の形で使用できる。最ら
一般的なものの中に競合的結合アッセイ、があり、そこ
では関心の対象となる分子（抗原がハプテン）に対する
特異的抗体を限定的な量で、未知量の被検物質を含む溶
液の特定量と合わせるが、溶液は検出可能な標識をもつ
被検分子またはその類似体の既知量をも含んでいる。標
識および非標識分子は抗体上の利用可能な結合部位に対
して競合する。遊離および抗体結合分子を相分離するこ
とにより各相内にある標識量の測定が可能となり、これ
により被検試料中の抗原またはハプテンの量が明らかと
なる。この一般的競合結合アッセイに対する多数の変法
が現在存在している。このタイプのアッセイは関心の対
象である分子を放射能標識または酵素標識することによ
り容易に用いることができる。

サンドイツチ法あるいは「２部位」法は別の競合的結合
アッセイであるが、結合アッセイにともなう問題点のう
ちのあるものを回避し得る。代表的なサンドイッチアッ
セイでは、試料中の被検分子が２種の特異的結合パート
ナ−間でリガンドとして作用する。例えば、特定の抗原
の存在を検出する場合、２種の結合パートナ−は特定の
抗原分子に特異的な複数の抗体である。固相サンドイッ
チ・イムノアッセイを例にとると、代表的には一方の抗
体が固定されている。抗原を含む疑のある試料をこの抗
体に加え、試料中に抗原が存在すれば抗体に結合する。

第２の、抗原に対して特異的であり、検出可能な標識を
有する抗体を第１抗原抗体複合物に加えて抗体・抗原・
抗体「サンドイッチ」を形成させる。これは後で加えた
抗体の標識により検出可−であ企。このタイプのアッセ
イは当分野で周知であり、例えば米国特許第３８６７５
１７号に記載がある。

しかし、被検分子がハプテンの場合には特別な問題が生
ずる。ハプテンは、それ自体抗原となるには小さすぎる
が、免疫前に大きな担体分子とコンジュゲートすると免
疫反応を起こす分子であると定義される。それ故、ハプ
テン検出系に用いる抗体を産生ずるには、血清またはひ
臓細胞原として用いる動物はハプテンのみでは免疫する
こと４＜できず、ハプテン・コンジュゲートの組合わせ
が一般的に必要となる。得られる免疫応答は担体（通常
蛋白質）に結合したハプテンに対するものであるため、
生成する抗血清は目的とするハプテンに特異性をもたず
担体に種々の特異性をもつ抗体を有し得る。さらに、コ
ンジュゲーシヨン法がしばしばハプテンの構造を変える
ことがあり、その結果生物学的活性が影響され、生成す
る抗体の性質に影響が出る。これらは何れも、アッセイ
の特異性と正確さを大なり小なり減少させる。

特にハプテンサンドイツチ法について、別の難点が存在
する。ハプテン検出法にサンドイッチアッセイを用いる
試みは不成功に終わることが多いが、それは主として分
子の大きさが小さいためである。

ハプテン分子はサイズの大きなＩｇＧまたはＩｇＭ抗体
分子に「どぶ漬け」され、そのためサンドイッチの形成
に必要な第２抗体の結合が妨げられる。

それ故、サンドイッチアッセイは多価抗原分子の検出に
極めて有用であるが、小さく、官能的に１価であるハプ
テン分子には効果的に適用されるに至っていない。この
適用の不成功は、被検分子のサイズが小さいことと、抗
体の固有の性質の両方に基づくものである。サンドイッ
チアッセイに代わるものとして、競合的結合タイプのハ
プテンイムノアッセイがある。しかし、これは通常目的
とするより感度が低い。また、これはハプテン模倣物、
すなわち、ハプテン自体と同様のサイズ、対称性および
立体配置で、毒性の高いハプテンの場合同様に毒性のあ
る小形分子を必要とし、そのため試験方法に固有の危険
性を増す。すなわち、今まで安全かつ高感度のハプテン
アッセイとして真に満足できる方法はなかった。

〔発明の記載〕

しかし、驚くべきことに、ハプテンをサンドイッチアッ
セイによる高感度試験法で検出でききる方法が見出され
た。、このアッセイの成功は、従来未知の性質を有し１
．そのうち少なからぬものはハプテンサンドイツチア、
ツセイを成功させる上で独特　　　　　・の能力となる
、＝連の抗体の使用に負うものであり。これらの抗体は
、さらに、単に特定のハプテンあろいは小分子に対して
特異性を有するのみならす、分子の一部分または特定の
官能基を特異的に認識することができる。この発明の別
の特徴は、これら特殊な抗体を得る方法にある。免疫源
として非コンジュゲート化ハプテンを用いる特別なイン
ビトロ免疫法は、現在のところ、このような高度に特異
的な抗体を産生じ得るハイブリドーマを作ることが可能
なものとして知られる唯一の方法である。ハプテン用サ
ンドイッチアッセイに用いるこの特殊なモノクローナル
抗体は、検体中のハプテンをｔｐｍ（非分率）のような
極微量の存在量でも検出できることがわかった。さらに
、この方法は水性および非水性媒質の両者に適用できる
ことがわかった。勿論、この発明のモノクローナル抗体
は、通常モノクローナル抗体が用いられるあらゆるタイ
プのイムノアッセイに使用することができる。

第１の態様として、この発明はハプテンサンドイッチア
ッセイに用い得るモノクローナル抗体に関するものであ
る。

第２の態様として、この発明は、これらモノクローナル
抗体を採取可能な量で産生じ得る／％イブリドーマの製
造法にも関するものであり、この方法は、有効量のマイ
トジェンの存在下に非コンジュゲート化ハプテンまたは
ハプテン模倣物で培地中にあるＢ細胞を免疫化し、細胞
融合条件下で、免疫化Ｂ細胞と不死性セルラインを融合
させることを含むものである。

この発明の別の特徴は、アナライトまたはその一部分を
認識できる抗体少なくとも１種をアナライト含有の疑の
ある試料と接触させることを含むアナライトの検出用イ
ムノアッセイ技術の改良であって、抗体としてこの発明
のモノクローナル抗体としてこの発明のモノクローナル
抗体を使用することを含む改良法である。「アナライト
」の語は抗原またはハプテンを意味する。さらに具体的
かつ望ましい適用例において、アッセイは、ハプテンを
含有する疑のある流体試料をサンドイッチアッセイに参
画しうる第１および第２抗体と接触させ、これら抗体は
ハプテン分子の官能基の一部分を認識できるものであり
、抗体の一方は検出可能なシグナルを発生できるレポー
ター分子と結合しており、抗体・ハプテン・抗体−複合
体の形成に充分な時間放置し、レポーター分子の検出に
よりハプテンの存在を測定することからなる、ハプテン
サンドイッチアッセイである。上記アッセイのさらに具
体的な態様において、ハプテン試料を構成する流体媒質
は非水性のもの、例えば空気または土壌、植物もしくは
動物組織の有機溶媒抽出物とすることができる。

ここで用いるハプテンの語は、前述した代表的ハプテン
および他の低分子景（一般に約５０００以下）の分子を
包含する。

この発明はまた、流体試料中のハプテンの検出用診断キ
ットであって、キットは、 （ａ）ハプテン分子の官能基の一部分を認識できる第１
モノクローナル抗体が結合している固体支持体を含む第
１容器と、 （ｂ）ハプテン分子の官能基の一部分を認識できろ第２
モノクローナル抗体であってレポーター分子に結合して
いる第２抗体を含む第２容器とを受容すべく区分された
ものである、キットに関するものである。

鱈ニヤ小Ｉ−二ｌ−−＾春叩小マい、セノル喰功六斗る
には、被検ハプテン分子の種々の部分に対するモノクロ
ーナル抗体を分泌できるハイブリドーマを作る必要があ
る。このような特異性、特にこのような小分子の小部分
に対する特異性を有するモノクローナル抗体の製造は従
来未知であり、この抗体の堅実な産生の成功は特異的な
インビトロ免疫技術の使用に負うものである。代表的な
ハイブリドーマ技術は、実験動物に対して、動物が抗体
を産生ずべき抗原または担体・ハプテンによりインビボ
免疫化を行うものであった。ついで、通常動物のひ臓細
胞を摘出し、不死性セルラインと融合させ、得られるハ
イブリドーマを適当な抗体の産生についてスクリーニン
グする。この技術は通常種々の抗原に対して有効ではあ
るが、一般にかなり大量の抗原を必要とし、しばしばブ
ースター（追加）免疫が必要となる。これは、高価また
は大量入手が困難な抗原（またはハプテンコンジュゲー
ト）を用いる場合明白な欠点となる。また、関心の対象
となる抗原が高毒性の場合にも問題が起こる。これらの
難点は、培養リンパ球を選択した抗原またはハプテンに
さらすインビトロ免疫化法ではほとんど回避される。よ
り直接的な刺激法は少量の免疫原の使用を可能とし、イ
ンビボでは致死的な抗原の使用をも可能とする。インビ
トロ免疫法について広範な技術が既知である。このよう
なものの例は、下記文献にみられる。ルーベン等、サイ
エンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２１８巻８８７−８８９頁（
１９８２年）、トレンフナ−、ジャーナル・オブ・イム
ノロジー（Ｊ　、　　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ、　）　１１３
巻９１Ｂ−９２４頁（１９７４年）、ボラベン、スカン
ジナビアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｓｃａ
ｎｄ、Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　）１８巻９−１２頁
（１９８３年）、リーディング、ジャーナル・オブ・イ
ムノロジカル・メソッズ（Ｊ　、　　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ
、　Ｍｅｔｈ、　）５３巻２６＋−２９１頁（１９８２
年）。しかし、このような免疫化法の進歩にもかかわら
ず、非コンジュゲートハプテンに対するモノクローナル
抗体は従来作り得なかった。前述のように、ハプテンの
構造と生物活性に害を及ぼすだけでなく、ハプテン単独
に対する特異性をもつ抗体の生成能力を著しく減弱させ
る。しかし、従来技術では、非コンジュゲートハプテン
に対する応答としてモノクローナル抗体を産生させるこ
とができず、現在のところ実質的に全てのタイプの免疫
化法でハプテンをコンジュゲートさせるべき状態が続い
ていた。

前掲のトレンフナ−は非コンジュゲートハプテンと称さ
れるものに対するインビトロ免疫応答を報告しているが
、使用した物質であるグリセロホスホリルコリンは、そ
の化学的性質上、大多数のハプテンと異なって、培地中
に存在する蛋白室と直ちにコンジュゲート化して抗原性
リポ蛋白コンジュゲートを生ずるものであった。しかし
、生成した抗体は必ずしもハプテン分子単独に特異性を
もつものてはない。さらに、トレンフナ−はモノクロー
ナル抗体を作っていない。ところが、予期に反して、疑
問の余地のない非コンジュゲートハプテンを用いてイン
ビトロで抗体産生を誘発することだけでなく、ハプテン
の一部分またはその単一の官能基に対してさえ高度に特
異性をもつモノクローナル抗体を得ることが実際に可能
であると判明した。このような小分子の特定部分を認識
できるモノクローナル抗体を産生ずることは従来全く知
られなかったことである。

この発明の方法では、ひ臓細胞（８９２６球）を若令動
物から得るが、動物の選択はリンパ球と融合し得る不死
性セルラインの入手可能性に支配される。動物の令は２
−約８迎合であり得るが、約２−４週令が好ましい。ね
ずみ（すなわちマウスおよびラット）のリンパ球がハイ
ブリドーマ技術で最も一般的に使われるが、この方法で
も使用に好適である。特に有用なのは、若令（２−４週
令）Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃマウスから得たひ臓細胞である
。８９２６球の成育と成熟は胸腺細胞（サイモサイトま
たはＴ細胞）の刺激作用に直接的゛または間接的にさら
すことにより増強される。これは、免疫化の前にＢ細胞
とＴ細胞を同じ培地中で共培養することにより直接達成
できる。この方法は実施可能ではあるが、非分泌Ｔ細胞
と抗体産生Ｂ細胞を分離する必要を招き、したがって選
択段階が複雑化する。より好ましい方法は、短時間、通
常数時間以下の間、培地を胸腺細胞で予め条件づけして
おき、胸腺細胞を除き、条件づけされた培地をＢ細胞の
培養に用いることである。培養に用いる基礎培地はイン
ビトロ免疫化に一般に用いられている任意の培地であり
得る〔リーディング、ジャーナル・オブ・イムノロジカ
ル・メソッズ（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、　）
５３巻２６１−２９１頁（１９８２年に記載）〕。この
発明で用いる好ましいものはＲＰＭＩ培地（ギブコ）ま
たはダルベツコ・ボーブト改良イーグル培地（ＤＭＥ、
シグマ）である。基本的要件は、培地に対して血清（通
常うし拍子血清）を一般に約１０−２５％の量で加える
ことである。Ｂ細胞含有培地には、また、少量（通常的
０．０５−１．Ｏｔ９／肩のの、Ｂ細胞の分化を特異的
に促進し得るマイトジェンを加える。この目的には、細
菌リポ多糖類が特に有効であり、アメリカヤマゴボウの
花粉も有効である。非特異的マイトツエンも用い得るが
、効果は、構造によって異なり、このようなマイトジェ
ンは好ましいものではない。選択したハプテンも加える
が、その量は数１００１９／ＩＩＱにも及ぶことができ
、一般に５−５０ｎ９／Ｉ（２（培地）にすぎず、僅か
０．０３−５ｎ９／ｚＱでもあり得る。使用量はハプテ
ン自体の特性と毒性により著しく異なる。代表的なイン
キュベーション法には、インキュベーションを３５−４
０℃、好ましくは３７℃で短時間、一般に約３−５日間
行う完全培養が必要である。この方法は広範囲の異なる
ハプテンに有効である。しかし、ダイオキシン分子の１
種のように生活細胞に有害または有毒と通常考えられる
ハプテンを免疫原として用いる場合、最後に分化Ｂ細胞
となるプラズマ芽球のすぐれた産生が、免疫原の量とイ
ンキュベーション期間の両者を減少させたときにみられ
ることがわかった。例えば、２，３，７．８−テトラク
ロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン（ＴＣＤＤ）のような高
毒性の免疫原の場合、極めて少量、すなわち０．０３ｎ
ｆの微量から約５ｎｆ／ｆｆ１ｅ（培地）の免疫原で免
疫化を行うことが可能であり、また実際上好ましい。最
適の芽球細胞産生を達成するためには、インキュベージ
コン期間は最大約４８時間まで制限されるべきである。

毒性免疫原の高用量および／またはインキュベーション
の長期間は、多数の細胞の死滅と、プラズマ芽球数の著
しい減少を招く。免疫原として用いるダイオキシン量に
対する芽球細胞生成パターンの要約を第１表に示す。

ばく置時間の減少は、ある種の非毒性免疫原に対しても
同様に有効である。

第１表 芽球細胞の生成 ダイオキシン　　　　　時　　間 （ｎｇ／村）　　　２４　　４８　　７２　　９６６．
０　　　　−　　　−　　　−　　　−３．０　　　　
−　　　−　　　−　　　−０．６　　　　−　　　　
＋　　　　＋　　　　−０，３−＋＋　　　　＋　　　
　− ０，０６−＋＋　　　　＋　　　　＋ 免疫原とのインキュベーションは、最も普通には、イン
キュベーター中、２酸化炭素７．０％の条件下、ｐＨを
約６．９−７．４に維持して行なわれる。しかし、別法
として、２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−２−エ
テンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ４１衝液）で緩衝した培地
を用いることも可能である。ＨＥＰＥＳａ！衝培地の使
用は、大気圧下において培地ｐＨを必要な範囲に維持す
ることを可能にし、それによりＣＯｔインキュベーショ
ンの必要性を回避できる。インキュベーション期間後、
培養物を遠心し、融合に備えて血清不含有培地で洗浄す
る。不死性セルラインと免疫原製品に対して感作したリ
ンパ球の融合によるハイブリドーマセルラインの製造は
、当業界で周知の方法によって実施できる。〔例えば、
コンペンジウム・オブｅイムノロジー（Ｃｏａ＋ｐｅｎ
ｄｉｕｍ　ｏｆ’　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

°ｇｙ）■巻（シュバルツ）中の「ペイシック・フアツ
ジ・アバウド・ハイブリドーマズ（Ｂａｓｉｃ　Ｆａｃ
ｔｓＡｂｏｕｔ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ）Ｊ（１９８１
年）、コーラ−およびミルスタイン、ネイチャー　（Ｎ
　ａｔｕｒｅ）　２５６巻４９５−４９７頁（１９７５
年）、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー
（Ｅ　ｕｒｏｐｅａｎＪ　、　ｏｆ　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ
、　）６巻５１１−５１９頁（１９７６年）、コブロフ
スキー等、米国特許第４１７２１２４号、同第４１９６
２６５号およびワンズ、米国特許第４２７１１４５号、
これらをすべて引用文献として記載に含ませる〕。

多数の融合に適する不死性セルラインが開発されており
、ハイブリッド化方法における特定のラインの選択は種
々の要件、例えば成長特性の速度、均一性、培地に対す
る代謝不全および良好な融合能力等の任意のものによる
ことができる。

稚内ハイブリッド化、特に株間におけるものか、種間に
おけるものより良好な結果をもたらす。数種のセルライ
ンが入手できるが、゛その中にはミエローマイムノグロ
ブリン分泌能力の欠如について選別した変異が含まれる
。これらの中には、下記ミエローマラインが含まれてい
る。ＭＰＣ１１−Ｘ４５−５ＴＧ、Ｐ３−ＮＳＩ−１−
Ａｇ４−ＬＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８、またはその変異、例
えば、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＳＰ２−０−Ａ
ｇ１４（何れもＢＡＬＢ／ｃ由来）、Ｙ３−Ａｇ１．２
゜３（ラット）、およびＵ２６６（ひと）。好ましいラ
インはｐ３−Ｘ６３−Ａｇ−８，６５３およびＳＰ２−
０−Ａｇ１４であり、これらは共にねずみ形質細胞腫セ
ルラインである。

細胞融合の基本技術は、コーラ−およびミルスタインの
前掲文献に記載されている。原報に対する多数の変法が
公知であり、個々のセルラインで得られる結果を最適化
するために公知方法を改良することは当業者の技術範囲
内に含まれる。細胞融合は、エプスタイン・バール（Ｅ
ｐｓｔｅｉｎ　−Ｂａｒｒ）またはセンダイウィルス（
ｓｅｎｄａｉ　ｖｉｒｕｓ）のようなライスル、または
ポリエチレングリコールにより誘発し得る。ポリエチレ
ングリコール（ＰＥＧ）は哺乳類の体細胞の融合に最も
有効である。ＰＥＧそれ自体は細胞に対して有毒であり
、融合実施前に生存率に対する種々の濃度の作用を試験
すべきである。下記方法が代表的な融合方法の一例とし
て挙げられる。ＰＥＧの分子量範囲はｔｏｏｏ−６００
０の範囲で変化し得る。ＰＥＧは、一般に食塩水または
血清欠乏培地で３０−５０％に希釈される。ねずみの細
胞を用いる方法の場合、３７℃で５−ｔＯ分間ＰＥＧに
さらすのが好ましい。

最初のばく露は通常１分間であり、ついで血清欠乏培地
で希釈、遠心し、総ばく露が１０分間を越えないように
する。極端な温度は避けるべきであり、融合前に３７℃
で融合系の各成分を予備インキュベーションすると最適
の結果が得られる。リンパ球と悪性細胞の比率は、ひ臓
細胞間の融合を回避するに最適なものとする。ミエロー
マ／リンパ球比が１：ｌ（好ましくは１：３）−１：１
０のとき、良好な結果が得られる。

成功裡に融合された細胞は常套手段によりメラノーマラ
インからこれを分離することが出来る。

最も普通のかつ好ましい方法はヒボキサンチン−グアニ
ン−ホスホリポシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）
欠乏悪性腫ようラインを選択することである。当該ライ
ンはチミジンおよびヒボキサンチンからプリン類を合成
することが出来ないため、ヒボキサンチン−アミノプテ
リン−チミジン含有培地において生育しない。バイブリ
ドのみを生育させるのに使用されるこの選択培地は一般
にヒボキサンチン（ｌ　ｘ　１０−’Ｍ）、アミノプテ
リン（ｌｘ　１０−’Ｍ）およびチミジン（３ｘ　１０
−’Ｍ）を含んでおり、ＨＡＴ培地として知られている
。融合混合物はＨＡＴ培地において２週間にわたり融合
または維持し、ヒボキサンチン−チミジン含有培地で培
養した後ＨＡＴ含有培養培地で生育せしめることが出来
る。

生育コロニーは免疫原イムノゲンの生産または免疫原上
の特別の部分または官能基を認識する抗体の存在につい
て試験される。ハイブリドーマ抗体の検出は、ハプテン
またはハプテン模写体が固体支持体に結合し、推定的抗
体を含むハイブリドーマ上澄液と反応せしめられる検定
法を用いてこれを行うことが出来る。抗体の存在は種々
の指示薬を使用するサンドイッチまたは抗グロブリン技
術により検出されてもよい。通常の方法の多くは１、／
　−／　＋＋　Ｌ’−−＾ｄ目へβ１１−６９η七個１
檜ｌ會＾守の範囲で使用して充分な感受性を有する。

ハイブリドーマのクローニングは典型的には選択された
培地におけるセル成長の２１〜２８日後に実施すること
が出来る。クローニングは流体層中のセル限定希釈によ
りまたは半固体アガロース中で生育する単一セルを直接
選択することによって行うことが出来る。限定希釈のた
めには、セル懸蜀液をミクロタイタープレート中で連続
的に希釈して、ウェル当たりただ１個のセルが存在する
ような統計的確率とする。アガロース法の場合は、バイ
ブリドをフィーダーセル含有下層上の半固体上層中に種
付けする。上層からのコロニーはこれを拾いあげ、最終
的にウェルに移す。

抗体分泌ハイブリドーマは種々の組織培養フラスコ中で
生育し、種々の抗体濃度を持った上澄液を生産する。よ
り高濃度を得るためにはハイブリドーマを炎症性腹水を
持った動物中に移せばよい。

抗体自得腹水は腹腔的接種後、８〜１２日間で採取する
。腹水は高濃度の抗体を含むが、同時に炎症性腹水から
のモノクローナルおよびイムノグロプリンを含有する。

上記の技術はハプテンの部分や官能基に特異的な抗体を
分泌するハイブリドーマを産生ずる点において非常に有
効であることが証明された。それに対して非常に特異的
な抗体が作られ得る種々の非結合性ハプテン分子として
は、低分子量ペプチド、フラベノイド、ヌクレオチド、
小さな炭化水素類（たとえばベンゼン）、炭化水素誘導
体（たとえばエチレンジブロミド）などがある。このよ
うにして製造されたモノクローナル抗体は非常に特異的
なハプテン模写体との反応によって特異性を試験する。

モノクローナル抗体の生産に使用し得るハプテンの種類
については本質的にいかなる限定も存在しない。モノク
ローナルはこの方法によって確実かつ再現的に分子の部
分やエチレンジブロミド分子の一〇Ｈｔ−Ｂｒ部分に変
換された。この方法において有利に使用出来るハプテン
としては分析データが必要とされる小さな分子の実質的
に全部、たとえば正常または異常な生理学的方法のいず
れかの代謝生産物である小さな分子を含み、プリン代謝
を示す尿酸、ある種の病気状態において濃度を増加する
クレアチンなどが例示される。

メルク・インデックス第１０版、医家用参考文献および
分析参考書および補充データのＥＰＡリスト（Ｅ　Ｐ　
Ａ　６００／４−８４−０８２）は総てこのような化合
物のリストを提供する。たとえば、体液中の種々の医薬
の少量をテストするために使用し得る、単純かつ迅速で
あってしかも非常に正確な検定法に対する要求が非常に
高い。興味のある医薬について非常に選択的なモノクロ
ーナル抗体の製造は、このような検定法に対する基礎を
与えるものであり、一般に適当に選択された抗体の高度
の選択性は、このようなテストをしばしば災いする偽陽
性を低下さけるのに貢献することが出来る。本明細書に
おける免疫原として使用し得る医薬であって、それに対
する抗体が分子の部分や官能基対してに作られることが
出来るものとしては、アミカシン、フェニトイン（シラ
ンチン）、フエノバルビタール、プリミドン、ネチルミ
シン、パルプロ酸、カルバマゼピン、ジゴキシン、キニ
ジン、ブロカインアミド、ナッパ、リドカイン、テオフ
ィリン、バンドマイシン、フリー・パルプロエート、カ
フェイン、ジベカシン、ストレプトマイシン、カナマイ
シン、メトトレキセート、プロプラノロール、エトスク
シミド、シソピラミド、フリー・フェニトイン、ジギト
キシン、チロキシン、アセトアミノフェン、サリチレー
ト、トータルＴ３、グルコース、パン、コレステロール
、尿酸、アミラーゼ、クレアチニン、チボ、乳酸、エス
トリオール、コルチゾール、ロー、フリー・リドカイン
、フリー・キニジンなどの治療薬や代謝産物が挙げられ
る。

本発明の実施に際しイムノゲンとして使用することが出
来る汎用典型的医薬としては、ベンドパルビトール（ネ
ンブトール）、セコバルビトール（セコナール）、アモ
バルビトール、ブタルビタール（フィオリナール）、フ
ェノバルビトールなどのヒプトニックスおよびバルピチ
ュレート類；クロールジアゼポキシド（リブリウム）、
ジアゼパム（バリウム）、オキサゼパム（セラックス）
、フルラゼバム（ダルマン）、メタクアロン（クアルー
ド）、エスクロルビノール（ブラシジル）、グルテチミ
ド（ドリブン）のようなベンゾジアゼピン類：アミトリ
ブチリン（エラプシル）、ノルトリブチリン（アベンチ
ル）、イミブラミン（トフラニル）、デシプラミン（ノ
ルプラミン）、ドキャビン（シネファン）、アモキサピ
ン（アセンジン）、ルジオミルのような抗抑うつ剤：フ
ェノチアジン、クロロプロマシン（ドラジン）、チオリ
ダジン（メラリル）、トリメパジン（テマリル）、トリ
フルプロマシン（ベスブリン）、トリフルベラジン（ス
テラジン）のようなトランキライザー類；カリソプロド
ール（ツマ）、メプロバメートのようなカーバメート類
：モルフイン、コディン、メタトン、プロポキシフェン
（ダルボン）、ペンタゾシン（タルウィン）、メペリジ
ン（デメロール）、サリチレート（アスピリン）、アセ
タミノフェン（チレノール）、ツェナセチンのような鎮
痛剤；シンパソミメチブクアミン、アンフェタミン、メ
タンフェタミン、フェンチラミン、エフェドリン、シュ
ウドフェトリン、フェニルプロパツールアミン、コカイ
ン、ニコチン、カフェインのような刺激剤；キニン、ス
トリキニン、フェンサイクリジン（ｐｃｐ）、シメチジ
ン（タガメット）、クロラールハイドレートのような種
々の医薬等が挙げられる。

本発明の実施に際し使用される環境汚染物としては、ト
リクロロエチレン、テトラクロロエチレン、四塩化炭素
、ビニルクロライド、１，２．２−トリクロロエタン、
ｌ、２−ジクロロエタン；ベンゼンおよびエチレンジブ
ロミドのような揮発性有機化合物ニアクロレイン、アク
リロニトリル、ブロモクロロメタン、２−クロロエチル
ビニルエーテル、クロロホルム、クロロメタン、ジブロ
モクロロメタン、ジクロロジフルオロメタン、■。

！−ジクロロエタン、１．２−ジクロロプロパン、シス
−１，３−ジクロロプロパン、エチルベンゼン、メチレ
ンクロライド、１，１．２−）ジクロロエタン、トリク
ロロフルオロメタン、トルエン、キシレン、スチレン、
ジクロロベンゼン、ｌ、２−ジブロモ−３−クロロプロ
パンおよび１．１，２゜２−テトラクロロエタンのよう
な有機汚染物；アルドリン、ａ−ＢＨＣ，ｂ−ＧＨｇ−
ＢＨＣｌｄ−ＢＨＣ，クロールダン、４．４°−ＤＤＤ
、４，４°−ＤＤＴ、ジエルドリン、エンドスルファン
１１エンドスルフアン■、エンドスルファンサルフェー
ト、ニチオン、トリチオン、ｏ、ｐ　　ＤＤＴ％　ｏ＋
ｐ−ＤＤＥｌｏ、ｐ−ＤＤＤ、テジオン、エンドリンア
ルデヒド、ヘプタクロール、ヘプタクロールエポキシド
、トキサフェン、ＰＣＢ−１０１６、ｐｃＢ−１２２１
、ＰＣＢ−１２３２、ＰＣＢ−１２４８、ＰＣＢ−１２
４８、ＰＣＢ−１２５４、ＰＣＢ−１２６０、アルトリ
カーブ（非抽出物）、ジアジノン、マラチオン、パラチ
オン、グチオン、ケルタン（ジコファール）；のような
殺虫剤；アセナフテン、アセナフチレン、アンスラセン
、ベンツ（ａ）アンスラセン、ベンゾ（ｂ）フルオロエ
タン、ベンゾｋ）−フルオロエタン、ベンゾ（ａ）ピレ
ン、ベンゾ（ｇ、ｈ、ｉ）ピレン、ベンジジン、ビス（
２−クロロエチル）エーテル、ビス（２−クロロエトキ
シ）メタン、ビス（２−エチルヘキシル）フタレート、
ビス（２−クロロイソプロピル）エーテル、４−ブロモ
フェニルフヱニルエーテル、ブチルベンジルフタレート
、２−クロロナフタレン、４−クロロフェニルフェニル
エーテル、クリセン、ジベンゾ（ａ、ｈ）アンスラセン
、ジ−ｎ−ブチルフタレート、１．３−ジクロロベンゼ
ン、１．４−ジクロロベンゼン、ｌ、２−ジクロロベン
ゼン、３．３−ジクロロベンジジン、ジエチルフタレー
ト、ジメチルフタレート、２，４−ジニトロトルエン、
２．６−ジニトロトルエン、ジエチルフタレート、１．
２−ジフェニルヒドラジン、フルオロエタン、フルオレ
ン、ヘキサクロロベンゼン、ヘキサクロロブタジェン、
ヘキサクロロエタン、ヘキサクロロシクロペンタジェン
、インデノ（１’、２．３−ｃｄ）ピレン、イソホロン
、ナフタレン、ニトロベンゼン、Ｎ−二トロッジメチル
アミン、Ｎ−ニトロソジ−１＝プロピルアミン、フェナ
ンスレン、ピレン、２゜３．７．８−テトラクロロジベ
ンゾ−ｐ−ジオキシン（ダイオキシン）、１，２．４−
）ジクロロベンゼンのような塩基性、中性抽出可能物；
２−クロロ７ずノー１１ノ　９　ｌ−ジニロフェノール
−２４−ジメチルフェノール、２．４−ジニトロフェノ
ール、２−メチル−４，６−ジニトロフェノール、４−
ニトロフェノール、ペンタクロロフェノール、フェノー
ル、２，４．６−トリクロロフエノールのような酸抽出
可能物が含まれる。

第１のカテゴリーの汚染物、すなわち、いわゆる揮発性
有機化合物の汚染物は、日常的な培養条件下（３７℃）
で揮発性をもっという固有の性質があるため、そのまま
免疫原として本性に使用することが出来ない。このよう
な場合には、抗原決定基を含む模写体がそのハプテン類
似体と寸法、対称性および立体配置に関する性質で類似
するならば、通常模写体を化学的に不安定または揮発性
の化合物の代わりに抗原として用いられる。たとえば、
ＥＤＨに対する好便な模写体はブロモエチルアミンであ
る。

本発明の免疫化法により産生されるモノクローナル抗体
は多数の独特の性質を有しており、それにより、モノク
ローナル抗体の効果的な使用が従来知られていなかった
イムノアッセイにおいて極めて有用なものとなっている
。既述の性質の一つはサンドイッチアッセイで使用すべ
き抗体の能力である。そのほか、有用な性質の中には、
得られる抗体が示す高度の選択性がある。前述のプロト
コルは、単に特定のハプテン分子を認識するのではなく
、分子の特定部分、さらには分子の単一の官能基をさえ
認識する抗体分子をもたらすことができる。−例として
この方法が、ｐ−アミノ安息香酸を０−および閘−異性
体から識別できるモノクローナル抗体の産生に使用され
た。従って、一群または一団の分子の検出に一括使用で
きる抗体の「ライブラリー」を開発できる可能性がある
。この原理の適用例として特に興味があるのは、ダイオ
キシン類すなわち塩素化ジベンゾｐ−ジオキシン類とし
て知られる一連の環境毒素に見られる。ダイオキシン分
子の基本構造は下記の通りである。

この分子の多数のポリ塩素化誘導体が高４性環境汚染物
として存在する。これらの化合物の構造は基本的ジオキ
シン分子のモノ−オクト塩素化誘導体にわたっている。

原則的に個々の分子のそれぞれで免疫化を行う要なく種
々の組み合わせとして実質的に全部のダイオキシン誘導
体を認識する一連の抗体を製造することが可能である。

たとえば、１、ｇ、３．４−テトラクロロジベンゾ−ｐ
−ジオキシン（１，２，３，４−ＴＣＤＤ、下式Ｉ）を
用いる免疫化を、全分子または分子フラグメントに対す
る抗体を産生ずる一連のクローンの生産に用いることが
できる。式■および■で示される特定の構造的特徴を認
識する抗体を選択すると、グイオキシンアッセイ抗体の
ライブラリーに２種の抗体をつけ加えることができる。

２，３，７．８テトラクロロベンゾ−ｐ−ジオキシンを
用いた同様な免疫化により、とりわけ、式■で示される
置換ジクロロベンゼン分子フラグメントおよび分子の他
端から生じる対応ジクロロベンゼン（■°）を認識する
抗体を産生ずるクローンを作ることができる。テトラク
ロロベンゼン分子フラグメント■に対する抗体をポリマ
ー表面上に結合し、ジクロロベンゼン分子フラグメント
■に対する抗体を蛍光団または酵素のような適当なレポ
ーター分子に結合すると、この系をポリクロロジベンゾ
−ｐ−ジオキシン類の他の同属体に対して使用すること
ができる。

（１）　　　　　　　　　（ＩＩ）　　　　　（ＩＩＩ
）（ｆｆ）　　　　　　　　　　　（Ｖ）Ｑ たとえば、第２表は単に上記フラグメント■、■および
■に対する抗体を用いるだけで検出できる他のダイオキ
シン化合物のリストを示す。

化合物　　　　　　　　　　　抗　体 １、ジベンゾジオキシン　　　　（ｎ）、（Ｉ［［）２
．２，３，７，８　　ＴＣＤＤ　　　　（ｆｆ）、（■
°）３．１，２，３，４　　ＴＣＤＤ　　　　（ＩＩ）
、（ＩＩＩ）４．２．３　　ＤＣＤＤまたは　　（ＩＩ
／）、（ｍ）７．８　　ＤＣＤＤ （ジクロロジベンゾジオキシン） ５、２，３，６．７，８，９　ＨＣＤＤ　　　　（ｎ）
、（■）または１，２．：（，４，７，８ＨＣＤ　Ｄ（
ヘキサクロロジベンゾジオキシン） ６．０ＣＤＤ　　　　　　　　　　（Ｉｆ）、（ＩＩ）
（オクタクロロジベンゾジオキシン） 従って、少なくとも６種の異なるタイプのダイオキシン
分子を僅か２種の免疫化による抗体で検出することがで
きる。

この「抗体ライブラリー」概念はまた、アミノ基、スル
フヒドリル基、ベンゼン核等の種々の官能基に対して特
異的なモノクローナル抗体で分子を「多角的検討」する
ことにより未知分子を同定できる手段を提供することが
できる。このような官能基および分子の複数部分の多様
化アセンブリを含む抗体コレクションは、テトラヒド口
カンビノール（ＴＨＣ）で免疫化することにより得られ
た。下記の群に対して明白な特異性を有する抗体を産生
ずるクローンが単離された。エタノール、ジメチル、ベ
ンゼン、カンナビジオール、トルエン、Δ８−ＴＨＣ，
およびΔ”−ＴＨＣ（２種結合の位置のみが異なる異性
体）。また、明らかに総括ＴＨＣモノクローナル抗体も
産生された。この抗体セットは種々のカンナピノイド類
間の識別に使用できると共に、無関係な分子の官能基の
検出にも使用できる。

本発明の抗体は、反応の実施に抗体を必要とするあらゆ
るタイプのイムノアッセイに、定性的か定量的かを問わ
ず使用することができる。その中には、勿論、単一部位
法、２部位法または非競合タイプのサンドイッチアッセ
イと共に従来の競合的結合アッセイが含まれる。本発明
の抗体の独特な利点は、前述のようにポリクローナルか
モノクローナルかを問わず公知の抗体では可能でなかっ
たタイプのアッセイであるハプテンサンドイッチアッセ
イで使用するに特に適する。サンドイッチアッセイにつ
いて多数の変法が存在するが、これらは何れも本発明に
含まれる。これらについて略述すると、代表的な正（フ
ォワード）アッセイでは、非標識抗体を固体基質上に固
定し、被検試料を結合分子に接触させる。適当なインキ
ュベーション時間後、すなわち抗体・ハプテン２元複合
体を形成させるに充分な時間置く。この時点でレポータ
ー分子で標識し、検出可能なシグナルを発生しうる第２
抗体を加えて、抗体・ハプテン・標識抗体３テン合体の
形成に充分な時間インキュベートする。未反応物質を洗
去し、ハプテンの存在を、レポーター分子のシグナル発
生を観察することにより測定する。結果は、単に可視シ
グナルを観察して定性的に得るか、既知量のハプテンを
含む対照試料との比較により定量的に得ることができる
。

正アッセイの変法には、試料と標識抗体を同時に結合抗
体に加える同時アッセイ、またはまず標識抗体と被検試
料を合わせてインキュベートした後非標識の表面結合抗
体を加える逆アッセイが含まれろ。これらの技術は当業
者に周知であり、僅かの修正を行い得る可能も明白であ
る。ここにいう「サンドイッチアッセイ」には、基本的
２部位法のあらゆる変法が含まれるものとする。

さらに具体的な例として、代表的正サンドイッチアッセ
イでは、ハプテン分子の一部分に対して特異性を有する
第１抗体を、固体表面上に共有結合または受動結合させ
る。固体表面は通常ガラスまたはポリマーであり、最も
普通に使用されるポリマーはセルロース、ポリアクリル
アミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまた
はポリプロピレンである。固体支持体は、チューブ、ビ
ーズ、ディスク、マイクロプレートまたは他のイムノア
ッセイ実施に適する任意の形状とすることができる。結
合方法は当技術で公知である。結合後、ポリマー・抗体
複合体を洗浄して被検試料に備える。次いで、被検試料
のアリコートを固相複合体に加え、存在しうるハプテン
が抗体に結合するに充分な時間２５℃でインキュベート
する。インキュベージジン時間は変化し得るが、一般に
約２０〜４０分の範囲である。インキュベーション後、
抗体・ハプテンの固相を洗浄、乾燥し、ハプテンの一部
分に特異的な第２抗体とインキュベートする。第２抗体
は、ハプテンに対する第２抗体の結合を指示するのに用
いるレポーター分子に結合している。ここで用いる「レ
ポーター分子」の語は、その化学的性質により、ハプテ
ン結合抗体の検出を可能にする分析的指示可能なシグナ
ルをもたらす分子を意味する。検出は定性的でも定量的
でもよい。このタイプのアッセイで最も普通に用いられ
るレポーター分子は、酵素、蛍光分子または放射性核含
有分子である。酵素イムノアッセイの場合、酵素を一般
にゲルタールアルデヒドまたはベルアイオデートにより
第２抗体にコンジュゲートさ仕る。しかし、勿論、広範
囲の異なるコンジュゲート法が存在し、これらは当業者
が容易に使用できる。広く用いられる酵素には、西洋わ
さびペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベー
タガラクトシダーゼおよびアルカリフォスファターゼが
含まれる。個々の酵素と共に用いるべき基質は、一般に
対応する酵素による加水分解で検出可能な色の変化を生
じるように選ぶ。例えばアルカリホスファターゼコンジ
ュゲートと共に用いるにはｐ−ニトロフェニルホスフェ
ートが適当である。ペルオキシダーゼコンジュゲートに
は１゜２−フェニレンジアミン、５−アミノサリチル酸
またはトルイジンが一般に用いられる。また上述のクロ
モゲン性基質ではなく蛍光を生ずるフルオ′ロゲン性基
質を用いることも可能である。何れの場合にも、酵素標
識抗体を、第１抗体・ハプテン・複合体に加え結合させ
、その後過剰の試薬を洗いさる。適当な基質を含む溶液
を抗体・ハプテン・抗体の３元複合体に加える。基質は
第２抗体に結合した酵素と反応し、定性的に視覚可能な
シグナルを生成するが、これは通常分光光学的に定量し
て、試料中に存在するハプテン量の指標を与える。

別法として、フルオレスセインおよびローダミンのよう
な蛍光化合物を、抗体の結合能力を変化することなくこ
れに化学的にカップルさせることができる。特定の波長
の光による照明により、活性化するとフルオロクローム
標識抗体は光エネルギーを吸収し、分子中に励起状態を
誘発し、その後特徴的な波長の長波長光を放射する。こ
の放射は光学顕微鏡で視覚的に検出可能な特性光を表す
。

ＥＩＡにおけると同様に蛍光標識抗体を第１抗体・ハプ
テン複合体に結合させる。非結合試薬を洗いさった後、
残っている３元複合体を適当な波長の光にさらし、観察
される蛍光が関心の対象であるハプテンの存在を示す。

免疫蛍光およびＥＩＡ法は共に当業界で極めて完成され
たものである。

この方法に特に好ましい。しかし、他のレポーター分子
例えば放射性同位元素、化学発光剤または生物発光剤分
子もまた使用できる。当業者には目的に応じて方法を修
正する手段が明らかである。

ハプテンサンドイッチアッセイを実施する能力は従来法
に比べて多数の利点をもたらすが、その中で最も重要な
のは感度の増加である。ハプテンに対する通常の競合的
結合アッセイの検出限界は、前述のように、一般に１０
億分の１より悪い。これは検出限界が、通常１０１モル
／ａの範囲にあるハプテン模写体・抗体複合体の親和性
定数によって決定されるからであり、この数値はハプテ
ン模写体濃度が固相系の一部であるため、定義されてい
ない点を除いてはハプテン自体の数値と基本的に同じで
ある。得られる結果は、イムノアッセイでシグナルの増
幅に用いた方法と無関係である。

抗体と、固相表面上にある十分な数のハプテン模写体と
のインキュベーションは、ハプテン模写体と抗体の濃度
がほぼ等モルであると仮定すると、抗体濃度をｌＯ″″
″のファクターだけ減少させる。

実際上検出限界はハプテン・抗体複合体の親和性定数よ
り通常１−２オーダーの大きさだけ大きい。

分析法が多数の平衡に（友存しているためただ１つの平
衡に関する計算だけでは、平衡時における溶液中の濃度
の正確な像を与えない。抗体の現実の濃度について言う
と、抗体とハプテン模写体の相互作用は溶液中の抗体濃
度を充分低い値に下げ、その結果ハプテン対ハプテン・
抗体複合体の比率がｔｏ−’モル／Ｑ濃度に対するアッ
セイを無効にする程高くなければならないようにする。

）＼ブテン試料濃度ｔｏ−”モル／１２．抗体濃度１０
″″′モル／Ｑ、ハプテン模写体等モル量の場合、溶液
中の抗体濃度はＩＱ−１０モル／ｅ以下である。この抗
体濃度では、溶解ハプテン対ハプテン・抗体複合体の比
率は、概略１０”であり、これは試料中のハプテンの大
部分が結合せず試験が失敗することを意味する。同様の
意味で、従来のアッセイ系で１つ以上の平衡を達成する
ことの必要性はアッセイの感度を下げるという一般的な
効果を有する。

特異的モノクローナル抗体に対する２座間位リガンドと
してアッセイされるべきハプテンを用いる本発明システ
ムは、アッセイの各段階で単一の平衡を利用する。この
タイプのアッセイの基本的検出限界は、レポート抗体お
よび化学的統計量に対する増倍係数によって決定されろ
。このことはイムノアッセイの検出限界を１兆分の１の
範囲にまで広げる。極めて微量の物質の存在でさえ、ひ
との健康に害がある環境毒性分子の検出の場合には、こ
れは極めて重要である。本悪性のすぐれた感度に加えて
、アッセイが危険な有毒ハプテン模写体の使用を必要と
しないという点で、別の利点がもたらされる。

本アプセイは、任意のタイプの流体試料中にある生物分
子および非生物分子の任意の種類のハプテンの検出に用
いることができる。臨床診断上の目的には、一般に用い
られる血清に加えて、試験される臨床試料としては、全
血、だ液、鼻汁、精液、胸膜液、腹膜液、血しよう、脳
せき髄液、中耳液、関節液、ガストリックアスピレート
、尿またはふん便が含まれる。この方法は、生理学的液
体中の薬剤試験および特定のハプテンの存在または不存
在によって立証される生理学的症状または疾病の診断に
特に有用である。

前述のように、この抗体およびアッセイは任意の流体試
料中のハプテンの存在検出に使用できる。

このようなアッセイは従来水溶液中で実施されたが、本
発明によると非水性試料、すなわち空気または有機溶媒
抽出液中のハプテンのアッセイに用い得ることがわかっ
た。この新たに得られる多様性は、低濃度の気体化学物
質および低濃度の非水溶液中の疎水性化合物を容易に検
出できる別法を提供するものである。気体化学物質の検
出法は、反応性フィルムバッジの形で存在するが（例え
ば、米国特許第４２７２４８０号、３１１１８４２号お
よび４２０５０４３号）、これらは、主として有毒ガス
の検出用色感受性ガス指示薬に依存している。このタイ
プのアッセイの検出レベルは、高いこともあるが試験の
感受性と特異性は通常極めて低い。抗体の使用、特に本
発明の選択性抗体の使用は、このタイプの試験の感度と
選択性の向上に役立つ。

同様に、水軍用性化合物の免疫化学的検出は、通常環境
から有機溶媒により化合物を抽出し、次いで濃縮し、洗
浄剤で処理して溶媒を除き、化合物を水性媒質に溶かし
て実施される。洗浄剤処理は溶媒除去と可溶化に完全に
有効なことはめったになく、従って、しばしば回収率が
悪く、ガラス性試験器具の表面に付着した少量の有機物
質の妨害のため、再現性が悪い。

この発明によると、これらの欠点のいくつかはイムノア
ッセイを非水媒質中で行うことにより回避できることが
わかった。非水系を用いることによりおこり得る妨害は
、抗体安定化条件下に関心の対象である抗体と非水試料
を接触させることにより、回避できる。好ましい態様で
は、安定化条件として表面結合抗体に対する２極性マト
リツクス適用、半透膜中における抗体の分離または表面
結合抗体マトリックスとしての非水極性溶媒の使用が含
まれる。前述のように、水性試料以外のイムノアッセイ
の実施可能性は従来者えられなかったが、これは主とし
て、ハプテンまたは抗原に結合するに際し、抗体がコン
フオーメイション上の変化を必要とするためである。し
かし、容易にわかるように抗体の周囲に、水性環境の中
で結合できるように分子を適当に安定化するような条件
を設定することは可能である。この方法は、表面結合抗
体を用いる任意のタイプのイムノアッセイに適応するこ
とができる。以下の検討においては、通常正サンドイッ
チアッセイを例にとって述べる。

これを実施する第１の方法は、ハプテンまたは抗原を含
む疑いのある試料を加えるべき抗体に対して２極性ポリ
マーの水溶液を予め適用することである。表面結合乾燥
抗体を単に少量の２極性マトリツクス水溶液で湿らせ、
次いでハプテンまたは抗原含有試料にさらす。この方法
は、空気または有機溶媒中にあるハプテンまたは抗原の
検出に実際に適用できる。定性的空気試験の場合、フィ
ルムバッジは抗体がポリマーまたは他の構造体の固体表
面に結合するように構成される。別法として、定量分析
の場合、標準的９６穴ＥＬＡＳＡプレートに完全に適合
する。ＴＶＣディスクに抗体に結合している空気露出板
が通常用いられる。これに任意の適当な２極性マトリツ
クスが加えられるが、これは２極性ポリマー、例えばポ
リエチレングリコール、ポリエチレングリコールモノメ
チルエーテル、ポリエチレングリコールジメチルエーテ
ル、非イオン性洗浄剤、例えばポリエチレングリコール
ベース洗浄剤のトウィーン物質、ポリビニルピロリドン
、ポリーＬ−バリンまたは水溶性で好ましくは有機非水
性液相と相容性がある任意の他のポリマーの水溶液であ
る。アッセイの感度は抗体の濃度、マトリックス自体お
よび汚染大気に対する露出量によって調節される。感度
を最大にするには、高濃度の抗体を最小のマトリックス
と組み合わせるべきである。試験大気は空気露出板を用
いる場合、ポンプにより表面結合抗体を通して吸引して
もよく、単にフィルムバッジにさらしてもよい。大気に
露出（一定量の空気または特定時間）した後、生成し得
る抗体・アナライト複合体をアナライトに特異的な第２
抗体を含む溶液で処理するが、この第２抗体は酵素また
は蛍光分子のようなレポーター分子で標識されたもので
ある抗体・アナライト・抗体の３テン合体はレポーター
分子がもたらす検出可能なシグナルによって指示される
。このシグナルは酵素基質標識系の場合、発色であり、
蛍光分子の場合、ＵＶ照射の際の蛍光発生である。

実質的に同様の方法を、土壌抽出物のような有機溶媒試
料の試験に使用できる。この場合も表面結合抗体を同じ
タイプの２極性マトリツクスで処理し、次いで有機溶液
を処理した抗体に加える。

この方法で用い得る有機溶媒は基本的に疎水性分子の抽
出に日常用いられる任意のもの、例えばヘキサン・ベン
ゼン・トルエンまたはジメチルスルホキシドであり得る
。次いでアナライト含有溶液を普通の水性アッセイと同
じようにマトリックス中の結合抗体に適用する。第２標
識抗体の添加は前述の水性アッセイと同じように行う。

安定化の別法として、結合抗体を、２極性ポリマーマト
リツクスについて前述したのと同じように、２極性の非
プロトン溶媒で処理することができる。表面結合抗体を
例えばジメチルスルホキシド、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルム
アミド、ヘキサメチルホスホリックトリアミド、スルホ
ランまたはテトラヒドロフランのような過当な非プロト
ン溶媒で湿らせてマトリックスを形成する。気体汚染物
を試験する方法では、前述のように抗体をさらに半透膜
中に分離しなければならない。しかし、アナライト含有
有機溶液の試験では、イムノアッセイは２極性マトリツ
クスを用いる場合について、前に概説したように行うこ
とができる。

半透膜の使用は、非水性試験用表面結合抗体の安定化に
も役立つ。この実施態様の場合、まず抗体を水、水溶液
または前述の非プロトン非水溶液で湿らせる。この目的
に用いるフィルムは、検出するアナライトに対して透過
性であるが、抗体のツルベート化に用いた流体マトリッ
クスに対して不透過性でなければならない。この目的に
適する物質は、ジメチルシロキサンポリマー類、非極性
有機物質に対して透過性のポリエチレンおよびポリプロ
ピレンまたは極性分子に対して選択的なペルフルオロス
ルホニツク膜であるナフィオンなどである。安定剤とし
て膜を用いる場合、結合抗体は前述のように試験サンプ
ルにさらされる。しかし、露出後の展開には抗体への接
近が必要である。

従って、標徽抗体の添加前に膜を除く必要がある。

その後、アッセイを前述のように進める。上に述べた通
常の方法は、すべて標識抗体を水溶液中で加えるもので
あったが、これは絶対必要ではなく、抗体を非水溶液中
で加え得ることがわかった。こノ方法では、蛍光団結合
イムノソルベントアッセイ（ＦＬＩＳＡ）を用いるのが
好ましい。この場合、抗体を結合抗体・アナライト複合
体に有機溶媒、例えばＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド、
ジメチルスルホキシド、スルホラン、ヘキサメチルホス
ホリックトリアミドまたは他の非プロトン溶媒中で加え
、適当なインキュベーション時間後、溶媒を洗いさり、
蛍光の存在または不存在を観察する。

酵素を松島、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカ
ル・リサーチ・コミュニケイションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ
、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｎｅｓ、　）１
２１巻２６１ページ（１９８４年）または松島、エフ・
イー・ビー・ニス（ＦＥＢＳ）１７８巻２７５ページ（
１９８４年）に従って、修飾するならば、このような酵
素標識を用いる完全非水アッセイを実施することができ
る。この場合にも前に述べた２極性溶媒が好ましい。

分析法において水素イオン濃度を注意深くモニターする
ことは前記アッセイいおいてまた制限される。これは、
一般に該システムの酸性またはアルカリ性に基づき適当
な有機緩衝剤を添加して６゜Ｏ−Ｓ、Ｏ範囲内のｐ）（
に制御することで達成される。この目的に適当な緩衝剤
のうち、ＨＥＰＥＳおよび他の関連分子が挙げられる。

前記方法は本発明のモノクローナル抗体を用いるアッセ
イを行うのに有用であるが、それらは制限されない。非
水性アッセイはモノクローナル抗体ならびにポリクロー
ナル抗体を用いて行うことができる。また、該アッセイ
はハプテンの検出に制限されず、抗原の検出に使用して
もよい。記載のシステムは土壌中のごく低いレベル（ｐ
ｐｂ以下）の検出に有用であることが示されており、そ
の結果、５分間はどの短時間で測定可能である。この方
法の代表的な例は以下のようになされる。

１０ｐｐｔ以上のレベルの２．３．７．８−ＴＣＤで汚
染された土壌をパスツールピペットに入れ、最少量のヘ
キサンで抽出した。次いで、ヘキサン抽出物を、水およ
びポリエチレングリコールのマトリックス中ＴＣＤＤ分
子の一部に対し特異性を有する抗体を結合した表面に直
接適用する。インキュベーション後、ヘキサンを毛管作
用またはピペットで除去し、ホースラディシュ・ペルオ
キシダーゼまたは任意の他の適当なレポーター分子に共
有結合された第２抗体の水溶液の適用により該アッセイ
をつづける。未結合酵素ラベル抗体を、その後除去し、
この場合には過酸化水素および０−フェニレンアミンで
ある基質を水溶液に加える。テスト法における発色はサ
ンプル中のＴＣＤＤの存在を示す。

本発明の最終具体例は流体サンプル中のハプテン検出用
のキットである。本発明のキットはその必す成分として
ハプテンまたはその一部に対する第１モノクローナル抗
体が結合する固体支持体：および検出させるハプテンの
一部に特異性を示す第２モノクローナル抗体からなる。

固体支持体はテストサンプルを注入可能なチューブまた
はウェル形の、好ましくはポリマーまたはガラスである
。

レポーター分子が酵素である場合、キットは、また該酵
素の基質を含む。抗体の固定は、もちろんテストされる
ハプテンに依存する。対称性ハプテン様ＥＤＨの場合、
両抗体は同じとできる。しかし、一般に抗体は別異のも
ので、ハプテン分子の異なる部分に特異性を示す。

次ぎに実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが
、これらに限定されるものではない。

実施例１ 本発明の実施例はハプテンが非毒性である場合の抗−ハ
プテン抗体の生産に使用される免疫およびクローニング
法について記載する。

イン・ビトロ免疫法は脚線細胞条件付培地（ＴＣＭ　）
、未熟マウスのひ臓細胞、バクテリア性−リポ多糖類（
ＬＰＳ）およびハプテンからなる。

１、ＴＣＭの調製 ２〜４週令のＢａ１ｂ／ｃのマウスから採取した胸腺を
処理して無菌単一細胞懸濁液を製造する。１０７細胞／
ＲＯ，ａ度の胸腺細胞を４８時間、３７℃にて１２％胎
児ウシ血清、２ｍＭＬ−グルタミン、１ｍＭピルベート
および５０μＭ２−メルカプトエタノール含有ＲＰＭＴ
　　１６４０またはＤＭＥ培地中、７％Ｇｏ／大気の雰
囲気下に培養する。

胸腺細胞を遠心分離機で採取し、上澄液をミリポアフィ
ルタ−に通してろ過することによりＴＣＭを得た。

２、イン・ビトロ免疫化 ひ臓を、２匹の４週令のＢａ１ｂ／ｃから無菌条下で採
取し、引き裂いて単一細胞の懸濁液を製造した。これら
の細胞を、２４％胎児ウシ血清、２ＩＩＩＭＬ−グルタ
ミン、１ａＭピルベート、５０μＭ２−メルカプトエタ
ノールおよび１ｙｔｇバクテリア性ＬＰＳを含む新鮮な
ＲＰＭＩ　　１６４０またはＤＭＥ培地１０１７２％Ｔ
ＣＭＩ　Ｏｗ（ｌからなる培地中に懸濁する。この培地
に約ｌＯＯ〜２００１９の選択したハプテンを加える。

免疫化は３７℃で７％ＣＯ！中にて４〜５日間行う。

前記方法を実質的に同じやり方で行って以下の分子に対
する抗体を生産する。

５−メチルシチジン ２．３，７．８−ＴＣＤＤ ＭＳ　Ｏ ベンゼン バクテリア性ＬＰＳ ６−メチルグアニン サッカリンナトリウム ｐ−アミノ安息香酸 アブシジン酸 黄体形成ホルモン／放出ホルモン （ＬＨ／ＲＨｍｖｌ　２００） シーウルチン（ｓｅａ　　ｕｒｃｈｉｎ）　（タックス
オール・アステルス（Ｔａｘｏｌ　ａｓｔｅｒｓ　　）
）チューブライン （ｍｗ５５０００および２０００００）ラビット・イム
ノグロブリンＧ（＋＋＋ｗｌ　５０００Ｌ）Ｉ／ＲＨの
阻害剤 免疫化細胞を融合して／’％イブリドマを生産する方法
は以下のとおりである。

Ａ、融合法 ９０％以上の生存度を有するマウスメラノーマ細胞（Ｐ
３−Ｘ６３−ＡＣＩｌｌ、６５３）を生産して使用する
。融合およびクローニング技術（よ、一般ニオイおよび
ヘルゼンベルグ（Ｏｉ　ａｎｄ　Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ
）〔細胞免疫の選択した方法、ビイ・ビイ。ミツシェル
およびニス・エム・シーシイ（Ｂ、Ｂ、Ｍｉｃｈｅｌｌ
　ａｎｄ　Ｓ、　Ｍ、　ＳｈｉｉｇｉＸｉ：ｉ者）３５
１頁１９８０年〕記載のものである。前記免疫法のひ臓
細胞懸濁液をメラノーマ細胞懸濁液と混合して３：１〜
１：１の細胞比（ひ臓細胞：メラノーマ細胞）を得る。

混合物をＲＰＭＩ　　１６４０培地中で洗浄し、遠心分
離した（５００ｇＸ　５分）。細胞ペレットに０，５１
ぐの加温（３７℃）ＰＥＧ溶液（３５％ＰＥＧおよび５
％ＤＭＳＯ／リン酸塩緩衝生理的食塩水）を加えた。凝
集物を保持しうる細胞懸濁液をピペットの先端でＰＥＧ
の初期の添加から１分間が過ぎるまでゆるやかに撹はん
した。この時点で、融合混合物をＲＰＭＩ　　１６４０
またはＤＭＥ培地のゆっくりした添加（速度１　ｘＱ１
分、３分間）により希釈した。この希釈段階後、さらに
１０ＲＱの培地を、５分間を要し、しばしばゆるやかに
撹はんしながら加えた。ついで、細胞を５００ｇで５分
間遠心分離し、２０ｘＱの培地中に懸濁した。細胞懸濁
液を２５ｃｍ″のフラスコに注ぎ、ＣＯ″インキュベー
ターに入れた。インキュベーター中で３時間後、細胞を
ＨＡＴ（ヒボキサンチン、アミノペクチン、チミン）培
地に懸濁した。

容量を計算すると、２〜４Ｘ１０５のメラノーマ細胞Ｉ
ＲＱが得られた。ＨＡＴ培地は４ＸｌＯ’の腹膜洗浄細
胞／村をシイグー細胞として含む。融合細胞を２４個の
ウェル培養プレート中に、各ウェル当り細胞懸濁液１ｘ
１２の添加によって入れた。

ついで、プレートを湿潤７％ＣＯ，インキュベーターに
３７℃で入れた。

Ｂ　クローンの単離 インキュベートしたプレートを７日間静置する培地が７
日前に酸性を示した場合、培地は交換しなければならな
い。そうでない場合、細胞は新鮮な融合細胞の生存度に
悪影響を及ぼすので動かすべきではない。７日後、培地
を無菌ピペットで採取し、ＨＴ（ヒポキサチン、チミン
）培地と交換する。ＨＴ培地を４日ごとに培養が２１〜
２８日令倒立顕微鏡の使用により各ウェル中で増殖する
のがわかる。

常法に従い、クローンを増殖して１０７〜ｔｏ”の細胞
にする。ついで、抗体を生産するクローンの選別を標準
的ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法により市販のヤギ抗−マウスまたは
ウサギ抗−マウスＩｇＭ抗体を用し１て行う。

望ましい特性を有するイムノグロブリン生産クローンの
選別ら、２−ブロモエチルアミンのような合成ハプテン
模擬物、ＥＤＢの模擬物をポリビニルクロライドプレー
トに付着したグルタルアルデヒド処理ウシ血清アルブミ
ンのような表面に共有結合させる標準法で行なう。つい
で、各クローンの培養液を共有結合ノ＼ブテン模擬物含
有つェル中でインキュベートする。完全な洗浄後、この
ウェルでヤギ抗−マウスをインキュベーター、これにホ
ースラデイシ：Ｌ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキ
シダーゼを結合する。インキュベート後に完全に洗浄し
、ついで酵素の基質、過酸化水素および０−フェニレン
ジアミンをインキュベートすると、グローンのイムノグ
ロブリンがハプテン模擬物に結合する場合には色の発現
が生じる。

実施例２ 以下の実施例は毒性ハプテンを免疫源として用いるハイ
ブリドマ生産の別法を示す。

ひ臓を２匹のＢａ１ｂ／ｃマウス（チャールズ・リバー
・ラボラトリイ社、６〜８週令、ウィルス非含有）から
採取し、ステンレススチール製ふるいに通し、１５肩Ｍ
ＨＥＰＥＳ１１０００００単位のペニシリン／Ｌおよび
１００１９のストレプトマイシン／Ｌ含有・血清非含有
ＤＭＥ培地（シグマ（Ｓｉｇｍａ）Ｄ　５５２３）１０
ｙｚＱ中に集めた。細胞を３回、血清非含有ＤＭＥ中に
て臨床遠心機（ｔｏｏｏｇ）による遠心分離により洗浄
し、１０％胎児ウシ血清含有ＤＭＥ１０ｍ１２に懸濁し
た。ひ細胞を、１１９のイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）
リポ多糖、（ソーネシグマ（Ｓｏｎｎｅ　　Ｓｉｇｍａ
））１０慶１２の胸腺細胞条件付培地（以下に記載の方
法で製造）および５０＊ｇのジメチルスルホキシド（Ｄ
ＭＳＯ）中２．３，７．８　テトラクロロジベンゾ−ｐ
−ジオキシン（ＴＣＤＤ）を含む７５ｃｊ＋”の培養フ
ラスコに加えた。ひ細胞を対流式イキュベーター中で４
８時間インキュベートした。胸腺細胞条件付培地を、胸
腺を１〜２のＢａ１ｂ／ｃマウス（チャールズ・リバー
・ラボラトリイ社、６〜８週令、ウィルス非含有）から
採取し、それらをステンレススチール製フルイに通して
１５肩ＭのＨＥＰＥＳ、１０００００単位のペニシリン
／Ｌおよびｌｏｎｇのストレプトマイシン／Ｌを含むＬ
ＯｘＱの血清非含有ＤＭＥ中に入れることにより製造し
た。胸腺細胞を、臨床用遠心機で遠心分離（５００９）
することにより血清非含有ＤＭＥ中で３回洗浄し、ｌＯ
％胎児ウシつ清含有ＤＭＥ中に再懸濁した。胸腺の濃度
を約５ＸＩＯ”細胞／村に調整し、３７℃の対流式イキ
ュベーターにより４８時間、１０％ＦＢＳを用いＨＥＰ
ＥＳ緩衝ＤＭＥ中でインキュベートした。胸腺細胞条件
付培地を５００９Ｘ５分の遠心分離で採取し、０．２ミ
クロンの膜を介してろ過し、１０ＩＱのアリコート中に
冷凍貯蔵した。

前記の免疫化法を繰り返した。ただし、３．４または５
日の対流式イキュベーター中インキュベーンヨンに置換
した。実施例３の融合法を各インキュベーション期間に
ついて繰り返した。ハイブリドマ−化の結果を第２表に
示す。免疫化を２日以上に延長した場合、陽性クローン
の数は著しく減少した。

第２表 免疫化−ハイブリドマ−化 免疫源　　　　　　　　　決定因子　　　　　時間　用
景　陽性（日）　　　　　　　　　　第１λクリーニン
グ ビオチン　　　　　　　　ビオチン　　　　　４−５　
１．５ｍｇ　　１４ビオチン　　　　　　　　ビオチン
＊＊　　　　　、　　４　５００μ９９４メタロチオニ
ン　　　　　メタロチオニン＊　　４−５　１．５μｇ
　　４Ｇメタロチオニン　　　　　メタロチオニン　　
　　４５００μｇ　１０８ペンツルーグリシン　　　ベ
ンゼン　　　　　　　２　５０＊ｇ　　１３３トリクロ
ロアセトアミド　ＴＣＥ　　　　　　　　　２　　５０
＊ｇ　　６７ＴＣＤＤ　　　　　　　　　ＴＣＤＤ　　
　　　　　　２　５Ｑｎｇ　　１３５ＴＣＤＤ　　　　
　　　　　ＴＣＤＤ　　　　　　　　３　　５０＊ｇ　
　　７ＴＣＤＤ　　　　　　　　　ＴＣＤＤ　　　　　
　　　４　　５０＊ｇ　　　４ＨＣＤＤ　　　　　　　
　　ＨＣＤＤ　　　　　　　　２　　５０＊ｇ　　３２
ＨＣＤＤ　　　　　　　　　ＨＣＤＤ　　　　　　　　
５　　５０＊ｇ　　　００−トルイジン　　　　　　ト
ルエン　　　　　　　２　　１Ｑｎｇ　　１３３ブロモ
エタノール　　　　ＥＴＯ１１＋／またはＥＤＢ　　　
　２　　５０＊ｇ　　８７＊　分子量＝５，８００ ＊＊イン・ビトロ ２．３．７．８−ＴＣＤＤの代わりに以下の免疫源を用
いて免疫化法を繰り返した。

灸ｉ蛛　　　　　　アナライト ７’（ＩｔＸチル７ミ７（ＢＥＡ）　　　　　　工ｆレ
ンジ゛フ１マイビ（ＥＤＢ）７’（Ｉｔ工９）−ル　　
　　　　　　　　　エチレンジ゛フ゛αマイト（ＥＤＢ
）へ゛ン′ノ゛イルク゛リシン　　　　　　　　へ′ン
セ゛ンＤ−フＸニル７ラニン　　　　　　　　　　ヘ゛
ンセ゛ン毒性および非毒性の両方の他のハプテンのうち
、以下のものを用いた。

ベンジルアミン、１．．２，３，６，７．８−ＨＣＤＤ
Ｏ−トルイジン、トリクロロアセトアミドセファレキシ
ン、ベンチロマイド アセチルーコエンザイムＡ１グリセロール１．２，３．
４−ＴＣＤＤ、ＴＨＣ ペニシリン、 前記リストの免疫源を本発明の方法に用いてその右に掲
げたアナライトに対するイン・ビトロの細胞集団を有効
に増感させることができた。揮発性のアナライトは、標
準的インキュベーション条件下でのその相対的な揮発性
のために細胞集団を増感させるの１こ直接使用すること
はできなかった。

Ａ、ＴＣＤＤ感作細胞の融合 細胞融合について以下に示すように変形したケラ−およ
びミルスティン（Ｋｏｈｅｒ　　ａｎｄ　　Ｍｉｌｓｔ
ｅｉｎ）の方法を使用した。２．３．７．８−ＴＣＤＤ
感作ひ臓細胞を採取し、１０００９Ｘ５分間の遠心分離
により３回、血清非含有ＤＭＥで洗浄し、計数し、１ｘ
ｌＯ”ｃ７）細胞を、ＩＸＩＱ’の洗浄メラノーマ細胞
（ＧＭ　３５７０Ｂ：Ｐ３Ｘ６３Ａｇ、５ｅ５３）（Ｎ
、ｔ、Ｂ、Ｍ、Ｓ、ヒユーマン・ゲネチック・ミュータ
ント・セル・レポシトリイ（ＨｕｍａｎＧｅｎｅｔｉｃ
　　Ｍｕ１種ｎｔ　　Ｃｅ１ｌ　　Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒ
ｙ）から入手）を含む１０１１Ｑの血清非含有ＤＭＥ中
に再懸濁した。これらのメラノーマ細胞はＨＰＲＴ欠乏
で、非−イムノグロブリン生産性で、ラジャブスキイ（
Ｒａｊｅｖｓｋｙ）によるＰ３から得たものである。

細胞をゆるやかに遠心分離しく５００ｇｘＳ分間）、室
温で０．５１１２の３５％ポリエチレングリコール（分
子量１３００〜１６００．シグマ・ケミカル社、Ｃａｔ
、　Ｎｏ、　Ｐ　７７７７）中に融合した。ポリエチレ
ングリコールを血清非含肴ＤＭＥで３５％に希釈し、Ｉ
）Ｈを７．４に、重炭酸ナトリウムで調整した。融合後
、細胞を５００９Ｘ５分間の遠心分離により血清非含有
ＤＭＥで洗浄し、ｌＯ％ＦＢＳ含有２０ｚ（！のＤＭＥ
に再懸濁し、当初からひ臓細胞を含む７５ｃａ＋１のフ
ラスコに戻し、対流式イキュベーターにより３７℃で２
４時間インキュベートした。細胞を２つの９６ウエル培
養プレート（１，１ｘ、／ウェル）内に入れ、ｌＯ％Ｆ
ＢＳ含有ＤＭＥ０．１ｘＱを各ウェルに加えた。対流式
イキュベーター中、３７℃で２４時間後、培地の半分を
ＨＡＴ培地（ＤＭＥ＋１０％胎児ウシ血清と共にヒポキ
サチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む）に置き
換えた。５日後、培地の半分を再び新鮮なＨＡＴ培地に
置き換えた。７日後、バイブリド細胞の存在について顕
微鏡でウェルを調べた。その後、培地をそれが酸性にな
るように変化させた。２週間後、バイブリド細胞を含む
各ウェルの上澄みを抗体分泌について、（ｇＭまたはｒ
ｇＧ検出のサンドウィチＥＬ　Ｉ　ＳＡ法を用いて調べ
た。抗体分子を分泌するバイブリドのすべてをＩｇＭの
陽性についてテストした。ついで、バイブリドを特異的
抗体分泌についてテストし、これらをソフトアガー（以
下に記載）中でサブクローニングした。特異的クローン
のバイブリド細胞を３箇月令のＢａ１ｂ／ｃｒウス内に
ｌＸｌ０”〜ｌＸｌ０’の細胞（ｌ　ｚ（ｌ中）の濃度
で腹腔的注入して腹水症を誘発させた。これらのマウス
にまず０゜５１の７０リステン（ｐｒｉｓｔｅｎｅ）、
２，６，１０．１４−テトラメチルペンタデカン（シグ
マケミカル社、Ｃａｔ、　Ｎｏ、　Ｔ　７６４０）をバ
イブリド細胞の注入前１週間投与した。腹水症流体を集
め、抗体をＤＥＡＥクロマトグラフィで精製し、凍結乾
燥した。

Ｂ　抗体精製 抗体を腹水症流体から、ハイパーホーマンス液体クロマ
トグラフィで精製した。イオン交換クロマトグラフィは
ＤＥＡＥ−ＴＳＫカラム（ＥＭサイエンス）によりウオ
ター６８０傾斜システムを用い２つのＭ４５ポンプで行
った。ろ過、脱ガス緩衝液は以下のものである。

緩衝液Ａ−１０＋肩のトリスペース、ｐＨ８，５（シグ
マ） 緩衝液Ｂ−５００ｇｍの塩化ナトリウムを含有するｌＯ
貢ｌのトリスペース 緩衝液Ａ中のカラム平行の初期条件および１５分の緩衝
液臼への傾斜により、腹水症流体中の蛋白質が溶解した
。ＩｇＭ−陽性抗体含有フラクションを水での透析後に
凍結乾燥することにより濃縮した。

Ｃ，ＥＤＢ感作細胞の融合 前記Ａの融合法繰り返した。ただし、ＥＤＢ感作リンパ
球を２．３，７．８−ＴＣＤＤ感作リンパ球に代えて用
いた。バイブリドを特異的抗体分泌についてテストし、
これらをソフトアガー中で以下のようにサブクローニン
グした。抗体を、′以下の方法によるマウス内への注入
および腹水症流体の採取により生産した。抗体の精製は
、また前記Ｂの方法で続けた。

Ｄ、ベンゼン感作細胞の融合 Ｃにおいて記載した融合法を繰り返した。ただし、ベン
ゼン感作リンパ球を２．３，７．８−ＴＣＤＤの代わり
に用いた。バイブリドを特異的抗体分泌についてテスト
し、これらをソフトアガー中でサブクローニングした。

抗体をＣ記載の方法でマウス内への注入および腹水症流
体あ採取により生産した。抗体の精製は、またＣの方法
で続けた。

Ｅ、ソフトアガーのクローニング 陽性クローンを、３５ｍｍの組織培養皿内のソフトアカ
−中の単一の細胞または個々のコロニーの増殖によりサ
ブクローニングした。・フィーダ一層の３〜５Ｘ１０”
のひ臓細胞をハイ・ブリドマー化セクションで記載のよ
うに生産した。ひ臓細胞をｌＪ！σの培地（ＤＭＥと共
に抗生物質１．１０％胎児ウシ血清、１．３７ｇのＮ　
ａ　ＨＣ０３１および培＃１１１００ｘＱ当たり０．５
９６９のＨＥＰＥＳ含有）中で、クローニング前−夜イ
ンキユベートした。培地を採取し、付加的な培地および
２％バク）　（Ｂ　ａｃｔｏ）アガーと混合して最終容
量２．５ｍＱで、最終濃度０．５％のアガーを得た。ア
ガー璃、４５分間の沸騰および４１’Ｃ水浴に入れるこ
とによる冷却によって滅菌蒸留水中２％溶液として製造
した。この方法で製造したバクトアガーはバイブリド細
胞の増殖を支持し、より精製されたアガーは不要である
。０．５％アガー溶液を、室温で１５分間放置すること
により固化した。約１０’〜１０’のバイブリド細胞を
０．２５％アガーおよび２０％胎児ウシ血清を含むｌｘ
Ｑの媒体と混合した。このｌｚＱ容量を０．５％アガー
フィダ一層上に慎重にのせ、室温で固化させた。

培養皿をＣＯｔイキュベーター中に１〜２週間入れた。

敗ｊ１１１の寸法の単離したクローンを９６ウ工ル組織
培養皿の各ウェル中に入れる。クローンは滅菌パスツー
ルピペットで低倍率の解剖用顕微鏡によりいれた。各ク
ローンの細胞をウェルに満たした後、上澄みをテストし
、特異的クローンをひ臓フィダ一層を有する２４−ウェ
ルプレートに移してさらに増殖させた。２５ｃｉ”のフ
ラスコ内の第１移動の後、ひ臓フィダ一層は、通常バイ
ブリド細胞の増殖のために、もはや必要てはない。

Ｆ、抗体分泌のスクリーニング イン・ビトロ免疫化を２．３，７．８−ＴＣＤＤおよび
１．２．３．４−ＴＣＤＤて前記Ａ記載の方法により行
った。ＩｇＭ様生産の抗体分泌クローンを選択して非分
泌異物を除去した。ついで、ＩｇＭを分泌するクローン
を、２，３，７．８−ＴＣＤＤ。

１．２．３．４−ＴＣＤＤまたは親分子ジベンゾーｐ−
ジオキシンのいずれかに特異的な抗体についてスクリー
ニングした。このスクリーニング法は毒性構造を模倣し
た種々の類似分子を用いて達成した。

化合物２，３，７．８−ＴＣＤＤは対称的な構造である
が、３つの明瞭な免疫化学的対称軸を示す。

以下の２つの類似化合物を用いて抗体が２．３゜７．８
−ＴＣＤＤへ結合する能力についてスクリーニングした
。

ジクロロベンジルアミン（１）を、該分子上のアミンの
、キトサン−処理マイクロタイタープレートのアミン基
へのグタルアルデヒド架橋により固定化した。この方法
は前記の導入部において抗体に対し示された類似のもの
から由来する。ジクロロフェノキシベンジルアルデヒド
をキトサンの遊離のアミンと、架橋材を用いずに直接反
応させる。

クロロベンジル類似体に結合した抗体は抗−マウスＩｇ
Ｍ−酵素コンジュゲートを使用して検出することができ
る。まず、１５０ｉ１２の培養上澄みをピペットで９６
ウエルマイクロタイタープレート（グイナテック（Ｄ　
ｙｎａｔｅｃｈ））の各ウェル内に入れ、該プレートに
一夜４°Ｃで結合させた。ついで、プレートのウェルを
、リン酸塩緩衝食塩水−トリドン（ＰＢＳ−Ｔ、　ｐＨ
７，２，０，１％トリトン−×）を３回換えて洗浄した
。プレート上の非−特異的部位を、０．１＊（７の１０
巧／ｚＱＰ　Ｂ　Ｓ−Ｔ中つシ血清アルブミン（ＢＳＡ
、シグマ）溶液を各ウェルに室温で１時間添加して遮断
した。このプレートのウェルを再び、リン酸塩緩衝食塩
水−トリドン溶液を３回換えてもういちど洗浄した。

ついで、マイクロタイタープレートに結合した抗体の存
在を約０．０５ｉ１２のヤギ抗−マウスＩｇＭ−ホース
ラデッシュペルオキシダーゼコンジュゲー）［釈液（ボ
ヘリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　　Ｍ
ａｎｎｈｅｉｍ））の使用により検出した。未結合酵素
コンジュゲートをＰ　Ｂ　Ｓ−Ｔでの３回の洗浄により
除去し、０．２ｍ（ｌの酵素基質溶液を各ウェルに添加
した（基質：０．１ｇ４−アミノ−アンチピレン、０．
０９９）工）−Ａｔ、５００ａ＋１２（７）ＰＢＳ。

全ての化学品はシグマから入手）。３０分の室温でのイ
ンキュベーション後、ＩｇＭ抗体の存在または不存在を
、陽性ウェル中の深紅色顔料の観察によって決定した。

抗体分子に陽性のクローンはさらにジオキシン類似体に
対する特異性について分析した。

Ｇ、特異性のテスト この方法には、キトサンを用い、前記したと同じ方法で
マイクロタイタープレートの表面を変形した。該文献に
記載され方法は、該プレート表面に結合したポリーＬ−
リシンを使用している。本発明の方法のスクリーニング
法の進行において、キトサンが表面修飾剤として非常に
優れていることが判明した。キトサンは、クラブ・シェ
ル・チンチン（ｃｒａｂ　　５ｈｅｌｌ　　ｃｈｉｎｔ
ｉｎ）のアルカリ性加水分解によりグルコサミンとガラ
クトサミンのコポリマーの製造によって生成する。水性
形で、この分子はしっかりとマイクロタイタープレート
に、静電相互作用により結合し、遊離のアミノ基はさら
に誘導して公知のオリエンテーションの固定化ジオキシ
ン類似体を製造することができる。以下の２つの類似特
異性方法は、類似体のキトサンとの反応においてのみ異
なる。キトサンマイクロタイタープレートの製造および
その後の抗体のテストは両方の類似体について同じであ
る。

キトサンマイクロタイタープレートを、まず０゜５ｇの
キトサン（シグマ・ケミカル）を２５Ｒ１２の水に１！
！局し、ブリンクマン（Ｂ　ｒｉｎｋｍａｎ）ホモゲナ
イザー／ソニケーターで１０分間分散させて製造した。

これを酢酸塩に、氷酢酸５０ｉ９中に再懸濁して変換し
た。この溶液のアリコートを最終濃度０゜０５９／３０
ｙＱＰＢＳに希釈して貯蔵溶液を製造した。５０のマイ
クロタイターの貯蔵溶液をピペットでマイクロタイター
プレートの各ウェル中に入れ、４°Ｃで一夜インキユベ
ーンヨンした。キトサン溶液をウェルから吸引したが、
ウェルは洗浄しなかった。

マイクロタイタープレートのウェル内でのキトサンの誘
導化は、ジクロロベンジルアミン（ＤＣＢＡ）またはジ
クロロフェノキシベンズアルデヒド（ＤＣＰＢ）のいず
れかとの反応で行う。ＤＣＢＡ誘導化は、連続的グルタ
ルアルデヒド架橋で達成される。グルタルアルデヒドを
キトサンーブレ−トに加えてた場合、それは、この類似
体を固定化するキトサンのアミノ基と直接的に反応する
こともできるＤＣＰＢの遊離のアルデヒドを残すキトサ
ンのアミノ基に結合する。以下の連続工程はキトサンの
ＤＣＰＢｉ導化、およびサンドイッチＥＬ　Ｉ　ＳＨＡ
使用のジオキシン特異的クローンの同定について記載す
る。

要約すれば、この方法は、水性０．５％グルタルアルデ
ヒド溶液（０，０５ｊｌ１２／ウエル）の、室温での最
小２０分間のキトサン処理マイクロタイタープレートへ
の第１接触を包含する。グルタルアルデヒドを０．１％
水溶液の３．４−ジクロロフェニルアミン（アルドリッ
チ（Ａ　１ｄｒｉｃｈ））と置き換える。室温で１時間
後、プレートをＰＢＳで洗浄する。濃度ＬＯｖ／ｘＱの
ウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）を、濃度０．１ｆｆ
１２／ウエルでプレートに加えてプレート上の全ての非
特異的結合性部位を遮断した。

ＢＳＡを、ＰＢＳトリト：／Ｘ（ＰＢＳ−Ｔ）を３回換
えこれにより除去した。上澄みを加え（０，１ｘ＆／ウ
エル）、３７℃で１時間インキュベートしていずれの相
補的抗体もジオキシンに結合させた。

全ての未結合物質を、ついでプレートからＰＢＳ−Ｔに
よる３回のプレート洗浄で除去した。類似体に結合した
ＩｇＭ抗体を抗−１ｇＭ−ホースラディシュ・ペルオキ
シダーゼ・コンジュゲート（０゜０５ｚ（！／ウェル）
で、３７℃での１時間のインキュベーション後に検出し
た。過剰のコンジュゲートを、Ｉ’ＢＳ−Ｔでの３回の
プレート洗浄により除去した。ペルオキシダーゼ基質（
０，１ｘｅ）を各ウェルに加えた。３０分後、ジオキシ
ン特異的抗体含有ウェルを、類似体にまた結合する［ｇ
Ｍ抗体に結合したフンシュゲートの酵素活性を示す明赤
白によって固定した。

しかし、毒素１，２，３．４−ＴＣＤＤは、２つの異な
る抗体をイン・ビトロ免疫化から生産する。

分子の末端のいずれかに対し特異的である抗体を分泌す
るクローンを選別するには、以下の類似体が必要である
： Ｈｔ 両方の類似体はアルドリッチ・ケミカル（Ａ　１ｄｒｉ
ｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）から入手したもので、前記し
た連続的グルタルアルデヒド架橋反応によりキトサンに
結合することができる遊離アミノ基を有する。

２．３，４．５−テトラニクロロアニリン（ＴＣＡ）ら
対し２つの抗体を用いる場合、サンドイッチＥＬＩＳＡ
はオクトクロロジオキノンを検出することができる。２
，３．４．５−ＴＣＡによって選別された一つの抗体が
２．３，７，８．−ＴＣＤＤのために選別された一つに
結合した場合、ヘキサクロロ形のジオキシン、１，２．
３，４．７．８．−ＨＣＤＤをサンドインチ法で検出す
ることができろ。親構造ジベンゾジオキンンはヘンジノ
オキサンによりて選別された２つの抗体で検出すること
ができる。

ジクロロジオキシン、２．３−ＤＣＤＤはペンジノオキ
サンに対する一つの抗体を半一２．３，７゜８、−ＴＣ
ＤＤに対する一つの抗体に結合させることによって分析
することができる。

Ｉｌ、モノスペシフィック抗体のコンジュゲートの調製 ペルオキシダーゼ・コンツユゲート抗体はタイジェセン
およびクルスタック（Ｔ　１ｊｓｓｅｎ　ａｎｄ　Ｋｕ
ｒｓ１種ｋ）（１９８４）の方法を用い、存在する抗体
の高分子量および高い原子価に基づく変法により生産さ
れる。ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ（ングマＰ
８１２５）はＤＥＡＥクロマトグラフィで再精製し、凍
結乾燥する。ペルオキシダーゼ（■ａｇ）を０．５ｘＱ
の新鮮な溶液のＯ，１ＭＮａＨＣＯａ中に再懸濁し、０
　、５　ｍ（ｌの蒸留水中の１６ｍＭＮａ１０、を用い
室温て２時間、暗くした密閉チューブ中でインキュベー
トし、０．１〜Ｉ　Ｎ　ａ　ＣＯ２（ｐ　［４９２）、
次いて０５９の乾燥セファデックス（Ｇ−２５、極微粒
子）をペルオキシダーゼ混合物に加え、暗くし室温で３
時間インキュベートする。

コンジュゲートした結合性分子をセファデックスから０
．１ＭＮａｔＣＯｓ、ｐＨ９，２で溶離させて溶離容量
的４Ｊ１１２とする。コンジュゲートを０　、２　ｘＱ
の５ｔ９／１ＱＮａＢＨ４（Ｑ、　ｌ　Ｘ　１０−’Ｍ
　ＮａＯＨ中で新たに製造）の添加により安定化し、１
時間暗くして室温でインキュベートする。コンジュゲー
トをトリス−ＨＣ＆緩衝液、ｐＨ８，５で一夜透析し、
ＤＥＡＥクロマトグラフィで精製し、０．ＯＯ１％チメ
ロソルを用いコハク色のバイアル中４℃で貯蔵する。

■、ジオキシン・アッセイ ２．３，７，８．−ＴＣＤＤのイムノメトリック・アッ
セイは既知濃度の当該アナライトならびに異なる免疫化
学的特性を有することが知られている池のジオキシン異
性体を含む対照溶液について行った。このアッセイのた
めに選択された方法は米国特許第３．７１９，９３２号
およびＲＥ　３１００６記載の連続的ヘテロジェナス・
サンドイッチ・アッセイ法である（その総ての記載を本
明細書に含める）。

Ａのジオキシン特異的モノクローナル抗体を、まず固体
層に、該分子のジクロロベンゼン部分に特異的な精製モ
ノクローナル２．３．７．８．−ＴＣＤＤ抗体の溶液１
０　ｗＱ（ｌ　ｙｘｑ／ｙ１２）をパル・ビオシン（Ｐ
ａｌｌ　Ｂｉｏｄｙｎ）ナイロン６６膜の一連の６ｍｇ
ディスクに加えることで、固定化する。ディスクを室温
で５分間インキュベートし、次いで凍結乾燥する。凍結
乾燥後、ディスクを密封アルミ処理バッグ中に乾燥窒素
雰囲気下でデシカントを用い貯蔵する。

テスト時において、ディスクの各々を、まず３分間、Ｐ
ＢＳ中脱脂乳の１％溶液、ｐＨ７，２で処理する。ディ
スクを短時間、ＰＢＳ−０，５％ツイーン２０で洗浄し
、テストチューブ（ｔＱｘ７５　ａｍ）中に含まれた対
照サンプルに浸漬する。ディスクをサンプルと共に１０
分間インキュベートし、０．５％ツイーン２０および０
．１％ゼラチン含有ＰＢＳで洗浄し、吸い取る。次いで
、ディスクを抗−２，３，７，８，−ＴＣＤＤ−ＨＰＰ
コンジュゲート含有溶液で１０分間インキュベートする
。ディスクをコンジュゲート溶液中でインキュベートし
た後、それらを吸い取り、基質溶液と接触させる。

基’Ｊｔ溶液ハ２５　ｍＭノ０　、１　Ｍ　！Ｊ　ンＦ
ＩＲ＠衡液、ｐ）（７，３中に溶解した０、１＋Ｍ４−
アミノアンチピリンおよび２５ｍＭフェノールを含む。

使用の直前に２５μｇの３％過酸化水素を２５ｚＩ２の
基質溶液に加える。基質に対するコンジュゲートの反応
は、１５分間の室温でのインキュベーション後に赤変す
る。陽性反応は明るいピンク色から赤色への変化によっ
て示され、陰性反応はディスクに対し全く変化しないこ
とを示す。このアッセイは２゜３．７，８．−ＴＣＤＤ
と他のジオキシン異性体の間を有効に区別し、アナライ
トの半定量的指示を提供する。

生物学的に純粋な培養の以下のハイブリドマ（特異性を
カッコ内に示す）は、アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔ　ｙｐｅＣｕｌ
ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）、１２３０１、パー
クローン・ドライブ・ロックビル、ＭＤに寄託した。

・ナンバーがつけられている。

セルライン　　　　　　　　　アセッションＮｏ。

ＲＭ１５１０１６　ＴＨＣ１３Ｇ−１２８８９３３８（
△”−Ｔ　ＨＣ） ＲＭ　Ｉ　０３２０８６　ＣＥ　Ｐ　２−７　　　ＨＢ
　９３３９（ベンゼン） ＦＢ−０８８６−ＢＥＮ−０５０６７１１ＨＢ９２５１
（ｐ−アミノ安息香酸） Ｆ　Ｉ３１−４０７−Ｅ　Ｄ　Ｂ　−３０−２−９ＨＢ
　９０４８（エチレンジブロマイド） ＲＭＩ−４０９−３０−２３７８−Ｄｊ−Ａ４　　　Ｈ
Ｂ９０４９（２，３，７，８，−ＴＣＤＤ） 該培養株の入手は３７　Ｃ，Ｆ、Ｒ１，１４および３５
　Ｕ、Ｓ。

Ｃ，１２２の下にそこに称仕られるコミッショナーによ
って決定されるものに対し、特許出願の継続中に行うこ
とができる。該培養株は寄託後少なくとも３年または常
備サンプルの最後の要求後少なくと乙５年の期間、常に
そのまま維持される。培養株が利用できなくなるか、ま
たは不注意でこわれｔ−ｍ合一そわけ闇１゛昼精受μの
理粕の斤育面婚か培養株と置き換えることができる。

実施例３ この実施例はハプテンサンドイッチ・アッセイを非水性
培地中で行う方法を示す。

グラスウールプラグ含有パスツールピペット内に、ＴＣ
ＤＤ含有の疑いのある泥約０．５９を入れる。該泥を、
ピペットによるヘキサンｌ　、　０　＊Ｑの通過により
抽出する。ヘキサン抽出物５０μＱをＨＢ　９０４９に
より生産された抗体（この抗体は２゜３．７，８．−Ｔ
ＤＣＣ分子のジクロロベンゼン部分を認識可能である）
に適用する。この抗体はグラスファイバーフィルターに
結合し、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミドで湿潤されたも
のである。インキュベーションを約１分間行い、過剰な
試薬を除去する。ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ
がコンジュゲートした同じ抗体５０μｇを添加し、１分
間インキュベーションし、過剰な試薬を再び除去する。

酵素の基質、４−アミノアンチピレンを含む過酸化水素
を２回、５０μＱ添加する。２分間の発現期間後、酸化
４−アミノアンチピレンのピンク色を、２，３，７，８
．−ＴＣＤＤが存在するなら見ることができる。ＴＣＤ
Ｄｌｏｐｐｔを含むことがわかっているサンプルは陽性
のままであるが、ＴＣＤＤＩＰｐｔだけを含むサンプル
はテストの約５０％においてレポーターであるピンク色
の弱い指示が得られる。

Claims (78)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）有効量のマイトジエンの存在下で、非コン
   ジュゲート化ハプテンまたはハプテン模倣物により培地
   中にあるＢ細胞を免疫化し、 （ｂ）細胞融合条件下で、免疫化したＢ細胞を不死性セ
   ルラインと融合させることを含む、 ハプテンのサンドイッチアッセイに使用可能なモノクロ
   ーナル抗体を分泌できるハイブリドーマの製造方法。
2. （２）培地が、Ｔ細胞とのインキュベーションにより予
   め条件づけしたものである、特許請求の範囲第１項記載
   の方法。
3. （３）マイトジエンがＢ細胞に特異的なものである、特
   許請求の範囲第１項記載の方法。
4. （４）マイトジエンが細菌リポ多糖類またはアメリカヤ
   マゴボウの花粉である、特許請求の範囲第３項記載の方
   法。
5. （５）Ｂ細胞と不死性セルラインがねずみ類のものであ
   る、特許請求の範囲第１項記載の方法。
6. （６）不死性セルラインが、Ｐ３−ｘ６３Ａｇ８、６５
   ３、ＳＰ２−Ｏ−Ａｇ１４、ＭＰＣ＿１＿１−Ｘ４５−
   ５ｔＧおよびＰ３−ＮＳ１−Ａｇ４−１からなる群から
   選ばれたものである、特許請求の範囲第１項記載の方法
   。
7. （７）融合をポリエチレングリコールの存在下に行う、
   特許請求の範囲第１項記載の方法。
8. （８）ハプテンが非毒性のものである、特許請求の範囲
   第１項記載の方法。
9. （９）免疫化を約４−５日間行う、特許請求の範囲第８
   項記載の方法。
10. （１０）ハプテンが毒性のものである、特許請求の範囲
    第１項記載の方法。
11. （１１）免疫化を約２日間行う、特許請求の範囲第１０
    項記載の方法。
12. （１２）培地がＨＥＰＥＳ緩衝培地である、特許請求の
    範囲第１項記載の方法。
13. （１３）ハプテンがエチレンジブロミドである、特許請
    求の範囲第１０項記載の方法。
14. （１４）ハプテンがダイオキシン分子である、特許請求
    の範囲第１０項記載の方法。
15. （１５）ハプテンが２，３，７，８−ＴＣＤＤまたは１
    ，２，３，４−ＴＣＤＤである、特許請求の範囲第１４
    項記載の方法。
16. （１６）ハプテン分子の官能基の一部分を認識できるモ
    ノクローナル抗体の採取可能量を分泌する連続ハイブリ
    ドーマセルライン。
17. （１７）ハプテンがエチレンジブロミドである、特許請
    求の範囲第１６項記載のハイブリドーマ。
18. （１８）ＡＴＣＣ−ＨＢ９０４８の同定特性を有する、
    特許請求の範囲第１７項記載のハイブリドーマ。
19. （１９）ハプテンがダイオキシン分子である、特許請求
    の範囲第１６項記載のハイブリドーマ。
20. （２０）ハプテンが２，３，７，８−ＴＣＤＤである、
    特許請求の範囲第１９項記載のハイブリドーマ。
21. （２１）ＡＴＣＣ−ＨＢ９０４９の同定特性を有する、
    特許請求の範囲第２０項記載のハイブリドーマ。
22. （２２）ハプテンがＴＨＣである、特許請求の範囲第１
    ６項記載のハイブリドーマ。
23. （２３）ＡＴＣＣ−ＨＢ９３３８の同定特性を有する、
    特許請求の範囲第２２項記載のハイブリドーマ。
24. （２４）ハプテンがベンゼンである、特許請求の範囲第
    １６項記載のハイブリドーマ。
25. （２５）ＡＴＣＣ−ＨＢ９３３９の同定特性を有する、
    特許請求の範囲第２３項記載のハイブリドーマ。
26. （２６）ハプテンがｐ−アミノ安息香酸である、特許請
    求の範囲第１６項記載のハイブリドーマ。
27. （２７）ＡＴＣＣ−ＨＢ９２５１の同定特性を有する、
    特許請求の範囲第２６項記載のハイブリドーマ。
28. （２８）（ａ）有効量のマイトジエンの存在下で、非コ
    ンジュゲート化ハプテンまたはハプテン模倣物により培
    地中にあるＢ細胞を免疫化し、 （ｂ）細胞融合条件下で、免疫化したＢ細胞を不死性セ
    ルラインと融合させ、 （ｃ）採取可能量のモノクローナル抗体を産生する融合
    細胞を単離することを含む、 ハプテン分子の官能基の一部分を認識できるモノクロー
    ナル抗体を得る方法。
29. （２９）さらに、（ｄ）産生されたモノクローナル抗体
    を採取すること、を含む、特許請求の範囲第２８項記載
    の方法。
30. （３０）培地が、Ｔ細胞とのインキュベーションにより
    予め条件づけしたものである、特許請求の範囲第２９項
    記載の方法。
31. （３１）マイトジエンがＢ細胞に特異的なものである、
    特許請求の範囲第３０項記載の方法。
32. （３２）マイトジエンが細菌リポ多糖類またはアメリカ
    ヤマゴボウの花粉である、特許請求の範囲第３１項記載
    の方法。
33. （３３）Ｂ細胞と不死性セルラインがねずみ類のもので
    ある、特許請求の範囲第２９項記載の方法。
34. （３４）不死性セルラインが、Ｐ３−ｘ６３Ａｇ８６５
    ３、ＳＰ２−Ｏ−Ａｇ１４、ＭＰＣ＿１＿１−Ｘ４５−
    ５ＴＧおよびＰ３−ＮＳＩ−Ａｇ４−１からなる群から
    選ばれたものである、特許請求の範囲第２９項記載の方
    法。
35. （３５）融合をポリエチレングリコールの存在下に行う
    、特許請求の範囲第２９項記載の方法。
36. （３６）ハプテンが非毒性のものである、特許請求の範
    囲第３０項記載の方法。
37. （３７）免疫化を約４−５日間行う、特許請求の範囲第
    ３６項記載の方法。
38. （３８）ハプテンが毒性のものである、特許請求の範囲
    第２９項記載の方法。
39. （３９）免疫化を約２日間行う、特許請求の範囲第３８
    項記載の方法。
40. （４０）培地がＨＥＰＥＳ緩衝培地である、特許請求の
    範囲第３０項記載の方法。
41. （４１）特許請求の範囲第２９項記載の方法で産生され
    たモノクローナル抗体。
42. （４２）ハプテンのサンドイッチアッセイに使用可能な
    モノクローナル抗体。
43. （４３）さらに、ハプテン分子の官能基の一部分を認識
    できることを特徴とする、特許請求の範囲第４２項記載
    のモノクローナル抗体。
44. （４４）ハプテンがエチレンジブロミドである、特許請
    求の範囲第４３項記載の抗体。
45. （４５）ＡＴＣＣ−ＨＢ９０４８が産生したものである
    、特許請求の範囲第４４項記載の抗体。
46. （４６）ハプテンがダイオキシン分子である、特許請求
    の範囲第４３項記載の抗体。
47. （４７）ダイオキシン分子が２，３，７，８−ＴＣＤＤ
    である、特許請求の範囲第４６項記載の抗体。
48. （４８）ＡＴＣＣ−ＨＢ９０４９が産生したものである
    、特許請求の範囲第４７項記載の抗体。
49. （４９）ハプテンがＴＨＣである、特許請求の範囲第４
    ３項記載の抗体。
50. （５０）ＡＴＣＣ−ＨＢ９３３８が産生したものである
    、特許請求の範囲第４９項記載の抗体。
51. （５１）ハプテンがｐ−アミノ安息香酸である、特許請
    求の範囲第４３項記載の抗体。
52. （５２）ＡＴＣＣ−ＨＢ９２５１が産生したものである
    、特許請求の範囲第５１項記載の抗体。
53. （５３）ハプテンがベンゼンである、特許請求の範囲第
    ４３項記載の抗体。
54. （５４）ＡＴＣＣ−ＨＢ９３３９が産生したものである
    、特許請求の範囲第５３項記載の抗体。
55. （５５）ハプテンを含有する疑のある流体試料を第１お
    よび第２抗体と接触させ、これら抗体はハプテン分子の
    官能基の一部分を認識できるものであり、抗体の一方は
    検出可能なシグナルを発生できるレポーター分子と結合
    しており、抗体・ハプテン・抗体−複合体の形成に十分
    な時間放置し、レポーター分子のシグナルを観察するこ
    とによりハプテンの存在を検出することからなる、ハプ
    テン検出用イムノアッセイ。
56. （５６）レポーター分子が、酵素、蛍光団、放射性同位
    元素、化学発行性分子または生物発行性分子である、特
    許請求の範囲第５５項記載のイムノアッセイ。
57. （５７）レポーター分子が酵素である、特許請求の範囲
    第５６項記載のイムノアッセイ。
58. （５８）正、逆または同時２部位イムノアッセイである
    、特許請求の範囲第５５項記載のイムノアッセイ。
59. （５９）一方の抗体が固定されている、特許請求の範囲
    第５５項記載のイムノアッセイ。
60. （６０）流体媒質が非水性である、特許請求の範囲第５
    ６項記載のイムノアッセイ。
61. （６１）試料を、アナライトを認識できる固定化第１抗
    体と安定化条件下に接触させて第１抗体・アナライト複
    合体を形成させ、複合体を、アナライトを認識できる第
    ２抗体と接触させ、第２抗体は検出可能なシグナルをも
    つレポーター分子で標識されたものであり、レポーター
    分子のシグナルを観察することによりアナライトの存在
    を測定することからなる、非水性流体試料中のアナライ
    トの検出用イムノアッセイ。
62. （６２）安定化条件が、水性２極性ポリマー、非プロト
    ン性溶媒での処理、または半透膜中への固定である、特
    許請求の範囲第６１項記載のイムノアッセイ。
63. （６３）レポーター分子が、酵素、蛍光団、放射性同位
    元素、化学発光性分子または生物発光性分子である、特
    許請求の範囲第６１項記載のイムノアッセイ。
64. （６４）両抗体がモノクローナル抗体である、特許請求
    の範囲第６１項記載のイムノアッセイ。
65. （６５）両抗体が、ハプテン分子の官能基の一部分を認
    識できるモノクローナル抗体である、特許請求の範囲第
    ６４項記載のイムノアッセイ。
66. （６６）アナライトがハプテンである、特許請求の範囲
    第６５項記載のイムノアッセイ。
67. （６７）２極性ポリマーが、ポリエチレングリコール、
    ポリエチレングリコールジメチルエーテル、ポリビニル
    ピロリドン、ポリ−Ｌ−バリンまたは非イオン性ポリエ
    チレングリコールベースデタージェントである、特許請
    求の範囲第６２項記載のイムノアッセイ。
68. （６８）非プロトン性溶媒が、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルム
    アミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルりん酸ト
    リアミド、スルホランもしくはテトラヒドロフラン、ま
    たはそれらの混合物である、特許請求の範囲第６２項記
    載のイムノアッセイ。
69. （６９）半透膜が、ポリエチレン、ポリプロピレンまた
    はポリジメチルシロキサンで作られたものである、特許
    請求の範囲第６２項記載のイムノアッセイ。
70. （７０）流体媒質が空気または有機溶媒である、特許請
    求の範囲第６１項記載のイムノアッセイ。
71. （７１）有機溶媒がジメチルスルホキシド、トルエン、
    ベンゼンまたはヘキサンである、特許請求の範囲第７０
    項記載のイムノアッセイ。
72. （７２）アナライトまたはその一部分を認識できる抗体
    少なくとも１種を接触させることを含むアナライトの検
    出用イムノアッセイにおいて、抗体として特許請求の範
    囲第２８項記載の方法で生成したモノクローナル抗体を
    使用することを含む改良法。
73. （７３）ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッ
    セイ、エンザイムリンクドイムノソルベントアッセイま
    たはフルオロホールリンクドイムノソルベントアッセイ
    である、特許請求の範囲第７２項記載のイムノアッセイ
    。
74. （７４）流体試料中のハプテンの検出用診断キットであ
    って、キットは、 （ａ）ハプテン分子の官能基の一部分を認識できる第１
    モノクローナル抗体が結合している、流体試料の受容が
    可能な固体支持体を含む第１容器と、（ｂ）ハプテン分
    子の官能基の一部分を認識できる第２モノクローナル抗
    体であってレポーター分子に結合している第２抗体を含
    む第２容器 とを受容すべく区分されたものである、キット。
75. （７５）固体支持体がポリマーまたはガラスである、特
    許請求の範囲第７４項記載のキット。
76. （７６）レポーター分子が酵素である、特許請求の範囲
    第７４項記載のキット。
77. （７７）キットがさらに酵素の基質を含む容器を含んで
    いる、特許請求の範囲第７６項記載のキット。
78. （７８）酵素が西洋わさびペルオキシダーゼであり、基
    質が過酸化水素とｏ−フェニレンジアミンである、特許
    請求の範囲第７７項記載のキット。