CN117024566A - 阿米卡星完全抗原及其制备方法和应用 - Google Patents
阿米卡星完全抗原及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117024566A CN117024566A CN202310375096.9A CN202310375096A CN117024566A CN 117024566 A CN117024566 A CN 117024566A CN 202310375096 A CN202310375096 A CN 202310375096A CN 117024566 A CN117024566 A CN 117024566A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- amikacin
- detection
- monoclonal antibody
- complete antigen
- antigen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 229960004821 amikacin Drugs 0.000 title claims abstract description 172
- LKCWBDHBTVXHDL-RMDFUYIESA-N amikacin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](N)C[C@H]([C@@H]([C@H]1O)O[C@@H]1[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)NC(=O)[C@@H](O)CCN)[C@H]1O[C@H](CN)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O LKCWBDHBTVXHDL-RMDFUYIESA-N 0.000 title claims abstract description 167
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 66
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 66
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 66
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 125
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 claims abstract description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 29
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims abstract description 20
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 28
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 28
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 28
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 27
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 claims description 24
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 claims description 24
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 13
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 claims description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 10
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims description 7
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 6
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 2
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 claims 1
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 claims 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 abstract description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 12
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 11
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 9
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 8
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 7
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 6
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 6
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 6
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 6
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 6
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 6
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 5
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 4
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 3
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 3
- GSDSWSVVBLHKDQ-JTQLQIEISA-N Levofloxacin Chemical compound C([C@@H](N1C2=C(C(C(C(O)=O)=C1)=O)C=C1F)C)OC2=C1N1CCN(C)CC1 GSDSWSVVBLHKDQ-JTQLQIEISA-N 0.000 description 3
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- GCFBRXLSHGKWDP-XCGNWRKASA-N cefoperazone Chemical compound O=C1C(=O)N(CC)CCN1C(=O)N[C@H](C=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2C(C(O)=O)=C(CSC=3N(N=NN=3)C)CS[C@@H]21 GCFBRXLSHGKWDP-XCGNWRKASA-N 0.000 description 3
- 229960004682 cefoperazone Drugs 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 3
- 229960003376 levofloxacin Drugs 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 229960002260 meropenem Drugs 0.000 description 3
- DMJNNHOOLUXYBV-PQTSNVLCSA-N meropenem Chemical compound C=1([C@H](C)[C@@H]2[C@H](C(N2C=1C(O)=O)=O)[C@H](O)C)S[C@@H]1CN[C@H](C(=O)N(C)C)C1 DMJNNHOOLUXYBV-PQTSNVLCSA-N 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- IVBHGBMCVLDMKU-GXNBUGAJSA-N piperacillin Chemical compound O=C1C(=O)N(CC)CCN1C(=O)N[C@H](C=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2[C@@H](C(O)=O)C(C)(C)S[C@@H]21 IVBHGBMCVLDMKU-GXNBUGAJSA-N 0.000 description 3
- 229960002292 piperacillin Drugs 0.000 description 3
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- BCEHBSKCWLPMDN-MGPLVRAMSA-N voriconazole Chemical compound C1([C@H](C)[C@](O)(CN2N=CN=C2)C=2C(=CC(F)=CC=2)F)=NC=NC=C1F BCEHBSKCWLPMDN-MGPLVRAMSA-N 0.000 description 3
- 229960004740 voriconazole Drugs 0.000 description 3
- 239000012114 Alexa Fluor 647 Substances 0.000 description 2
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 229940126574 aminoglycoside antibiotic Drugs 0.000 description 2
- 239000002647 aminoglycoside antibiotic agent Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 2
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- FKENQMMABCRJMK-RITPCOANSA-N sulbactam Chemical compound O=S1(=O)C(C)(C)[C@H](C(O)=O)N2C(=O)C[C@H]21 FKENQMMABCRJMK-RITPCOANSA-N 0.000 description 2
- 229960005256 sulbactam Drugs 0.000 description 2
- ZFXYFBGIUFBOJW-UHFFFAOYSA-N theophylline Chemical group O=C1N(C)C(=O)N(C)C2=C1NC=N2 ZFXYFBGIUFBOJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010002199 Anaphylactic shock Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010011703 Cyanosis Diseases 0.000 description 1
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 208000001953 Hypotension Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 206010029155 Nephropathy toxic Diseases 0.000 description 1
- 206010033109 Ototoxicity Diseases 0.000 description 1
- 239000005662 Paraffin oil Substances 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 238000004026 adhesive bonding Methods 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- -1 and after 7 days Substances 0.000 description 1
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N carbonic acid Chemical compound OC(O)=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 210000003027 ear inner Anatomy 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 238000012872 hydroxylapatite chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000036543 hypotension Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 231100000417 nephrotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007694 nephrotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000262 ototoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007310 pathophysiology Effects 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229940057838 polyethylene glycol 4000 Drugs 0.000 description 1
- 230000001374 post-anti-biotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000002636 symptomatic treatment Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 229960000278 theophylline Drugs 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/76—Albumins
- C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/76—Albumins
- C07K14/77—Ovalbumin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
- G01N33/54386—Analytical elements
- G01N33/54387—Immunochromatographic test strips
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
- G01N33/9446—Antibacterials
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了阿米卡星完全抗原及其在阿米卡星抗体制备和免疫法检测中的应用。所述阿米卡星完全抗原的结构如下式所示。本发明还公开了用该完全抗原制备的抗阿米卡星单克隆抗体,产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞以及用于检测阿米卡星的检测卡和检测试剂盒。本发明公开了检测阿米卡星的ELISA法和荧光免疫层析法,其中荧光免疫层析法操作简单、检测时间短、成本低、特异性高、重复性好。
Description
技术领域
本发明涉及抗生素的检测。具体地说,本发明涉及阿米卡星完全抗原、利用该完全抗原获得阿米卡星单克隆抗体及其在荧光免疫层析法检测阿米卡星中的应用。
背景技术
阿米卡星(Amikacin,AMK)是半合成的氨基糖苷类抗生素,因其具有较强的抗革兰氏阴性菌活性、耐酶特性及明显的抗生素后效应(Post-antibiotis effect,PAE),特别是在同类抗生素中较低的耳肾毒性,在医学临床上得到广泛应用。
阿米卡星为氨基糖苷类抗生素,肌内注射后迅速被吸收,主要分布于细胞外液,部分药物可分布到各种组织,并可在肾脏皮质细胞和内耳液中积蓄,因此主要不良反应为耳毒性和肾毒性。临床主要表现为过敏性休克、呼吸困难、低血压、紫绀、脉弱等;多数不良反应在停药或对症治疗处理后恢复正常,严重不良反应可致死亡。
患者的年龄、身体状况、用药方式、剂量等多种因素都会对阿米卡星的药代动力学参数造成影响,导致阿米卡星的血药浓度在个体间差异大。成人血消除半衰期为2-2.5小时,无尿患者中T1/2可长达30小时,烧伤患者为1-1.5小时;胎儿为3.7小时,新生儿为4-8小时(与出生时体重和年龄成反比),且可被血液透析和腹膜透析清除。
综上所述,为了进一步优化和规范阿米卡星在不同人群中的使用,根据患者的病理生理情况调整给药方案,有必要对使用阿米卡星的患者进行血药浓度监测(therapeuticdrug monitoring,TDM)。《抗菌药物监测实验室指南》建议阿米卡星的治疗范围则以峰浓度治疗范围25-35μg/mL,中毒范围为大于35μg/mL,谷浓度治疗范围1-8μg/mL,中毒范围为大于10μg/mL,对于指导临床合理用药,保证用药安全,挽救生命具有重要意义。
目前阿米卡星的检测主要为液相色谱法为主,仪器昂贵,操作复杂且耗时,市场上并无阿米卡星浓度检测试剂盒的销售。荧光定量免疫层析技术,是结合免疫荧光技术和传统免疫层析技术相优点的新型定量检测技术。该技术操作灵活简便、成本较低、反应时间短,能做到及时定量检测。能及时为医师对病人调整用药提高数据支撑,达到个体化给药的目的,确保疗效的同时保证了用药安全性。
发明内容
本发明的目的是提供一种阿米卡星的完全抗原,利用该完全抗原可以获得阿米卡星的特异性抗体。
本发明的另一目的是提供包含本发明的阿米卡星特异性抗体的检测试剂或检测试剂盒,以及利用该抗体或检测试剂或检测试剂盒来定量测定阿米卡星的方法。
在本发明的第一方面,提供了一种阿米卡星完全抗原,所述完全抗原具有
式1所示的结构:
其中,protein为蛋白质载体。
在另一优选例中,所述蛋白质载体为选自下组中的任何一种蛋白质:牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚赖氨酸(PLL)等。
在另一优选例中,所述蛋白质载体是牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)。
在本发明的第二方面,提供了一种制备如本发明第一方面所述的阿米卡星完全抗原的方法,所述方法包括步骤:
将阿米卡星半抗原与蛋白质载体连接,以制得本发明第一方面所述的完全抗原。
在另一优选例中,将阿米卡星半抗原与蛋白质载体通过连接试剂连接,优选地,所述的连接试剂为戊二醛。
在另一优选例中,阿米卡星半抗原与蛋白质载体连接反应的温度条件为20-28℃,优选23-28℃,更优选25℃。
在另一优选例中,阿米卡星半抗原与蛋白质载体连接反应的PH条件为4.0-9.0,优选7.2-7.6,更优选7.5。
在另一优选例中,阿米卡星半抗原与蛋白质载体连接反应的反应时间为4-9小时,优选7-9小时,更优选8小时。
在另一优选例中,所述蛋白质载体为选自下组中的任何一种蛋白质:牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚赖氨酸(PLL)等。
在另一优选例中,更佳地,所述蛋白质载体是牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)。
在本发明的第三方面,提供了一种本发明第一方面所述的阿米卡星完全抗原的用途,其用于制备阿米卡星的特异性单克隆抗体。
在本发明的第四方面,提供了一种单克隆抗体,所述单克隆抗体特异性结合阿米卡星。
在另一优选例中,所述单克隆抗体由小鼠杂交瘤细胞系产生,所述杂交瘤细胞系由中国典型培养物保藏中心(CCTCC,中国,武汉,武汉大学)保藏,保藏号为CCTCC NO:C2020224;分类命名为:杂交瘤细胞株C214240。
在另一优选例中,所述单克隆抗体检测阿米卡星的灵敏度不高于10ng/mL;优选地,不高于8ng/mL、或不高于6ng/mL、或不高于5ng/mL、或不高于4ng/mL;最优选约为3ng/mL。
在另一优选例中,所述单克隆抗体不结合除阿米卡星外的抗生素。
在另一优选例中,所述其它抗生素为哌拉西林舒巴坦、头孢哌酮、美罗培南、左氧氟沙星、伏立康唑。
在本发明的第五方面,提供了一种产生如本发明第四方面所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞系,所述杂交瘤细胞系由中国典型培养物保藏中心(CCTCC,中国,武汉,武汉大学)保藏,保藏号为CCTCC NO:C2020224;分类命名为:杂交瘤细胞株C214240。
在本发明的第六方面,提供了如本发明第四方面所述的单克隆抗体的用途,其用于制备检测样品中阿米卡星的试剂、检测卡或试剂盒。
在本发明的第七方面,提供了一种检测生物样品中阿米卡星是否存在的方法,所述方法包括步骤:
(a)将所述生物样品与如本发明第四方面所述的单克隆抗体接触;
(b)检测是否形成抗原-抗体复合物,其中形成复合物就表示样品中存在阿米卡星。
在另一优选例中,所述的方法为检测阿米卡星浓度的方法,其进一步包括步骤:
(c)统计抗原-抗体复合物的数量,根据所述复合物数量计算阿米卡星浓度。
在另一优选例中,所述复合物的数量与样品中阿米卡星的浓度成反比。
在另一优选例中,所述单克隆抗体带有可检测标记物。
在另一优选例中,所述的可检测标记物选自下组:胶体金标记物、有色标记物或荧光标记物。
在另一优选例中,所述检测方法为荧光检测法。
在本发明的第八方面,提供了一种检测阿米卡星的荧光免疫层析检测卡,所述检测卡包括基片、吸液部件、检测部件、加样部件,检测部件固定在基片上,在检测部件中部设置质控带和检测带,在检测部件的两端以部分重叠的方式固定吸液部件和加样部件,其中,检测带上包被有本发明第一方面所述的阿米卡星完全抗原,质控带上包被有兔抗原IgG。
在另一优选例中,所述阿米卡星荧光免疫层析检测卡还包括卡盒,所述卡盒由下盖和上盖组成,上盖设有加样窗口和检测窗口,所述阿米卡星荧光免疫层析检测卡完全设置于下盖中,所述检测窗口和加样窗口分别对应与所述阿米卡星荧光免疫层析检测卡上的加样部件和质控带及检测带。
在另一优选例中,所述上盖上还设有产品编号区;条形码识别区。
在另一优选例中,所述基片是深色硬质基片;优选黑色PVC基片。
在另一优选例中,所述检测部件是硝酸纤维素膜。
在另一优选例中,所述加样部件是玻璃纤维。
在另一优选例中,所述吸液部件是吸水纸。
在本发明的第九方面,提供了一种检测阿米卡星的检测试剂盒,所述试剂盒的内容物包括:
(a)本发明第八方面所述的阿米卡星荧光免疫层析检测卡;
(b)与本发明第八方面所述的阿米卡星荧光免疫层析检测卡配套的阿米卡星检测分析液;
(c)所述阿米卡星检测试剂盒检测阿米卡星的使用说明书;
其中,所述检测分析液为包含有荧光标记的如本发明第四方面所述的单克隆抗体和抗兔IgG抗体的检测分析液。
在另一优选例中,所述检测分析液中的标记用荧光染料包括但不限于:AlexaFluor 647或CFTM647。
在另一优选例中,所述检测分析液的溶剂是含有BSA的磷酸缓冲液。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了阿米卡星免疫原和包被原的紫外扫描图谱。
图2显示了阿米卡星荧光免疫层析检测卡的结构的示意图;其中:
图2A显示了未装塑料卡的检测卡结构;1:黑色PVC基片;2:吸水纸:3:硝酸纤维素膜;4:玻璃纤维;5:质控线带(C线);6:检测线带(T线)。
图2B显示了带有塑料卡盒的阿米卡星检测卡结构;1’:下盖;2’:上盖;3’:加样窗口;4’:玻璃纤维;5’:检测窗口;6’:质控线带(C线);7’:检测线带(T线);8’:硝酸纤维素膜;9’:阿米卡星项目标志;10’:条形码识别区域。
图3显示了阿米卡星荧光免疫层析检测的标准曲线图谱。
图4显示了阿米卡星ELISA检测的标准曲线图谱。
具体实施方式
本发明人经过长期而深入的研究合成了阿米卡星完全抗原,以此为免疫原免疫Balb/C小鼠,将其脾细胞与小鼠骨髓瘤SP20细胞融合,获得特异性分泌抗阿米卡星单克隆抗体的杂交瘤细胞株,进而制备并纯化得到了阿米卡星单克隆抗体,随后利用所述完全抗原和阿米卡星抗体制备了灵敏度高和特异性好的阿米卡星免疫检测卡。在此基础上,完成了本发明。
完全抗原
具有免疫原性与免疫反应性的物质,称为完全抗原(complete antigen),如大多数蛋白质、细菌、病毒、细菌外毒素、动物血清等。完全抗原既能刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞,还能与其在体内、体外发生特异性结合反应。
通常,半抗原需要和大分子如牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)或血蓝蛋白(KLH)或以共价键方式偶联,成为既具有免疫反应性,又具有免疫原性的完全抗原。
本文所用的术语,“完全抗原”是指本发明的阿米卡星半抗原与适当的蛋白质载体结合后的产物。本文所用的术语,“蛋白质载体”是指任何在免疫学上可接受的用于形成完全抗原的蛋白质,包括但不限于:牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚赖氨酸(PLL)等,优选牛血清白蛋白(BSA)、或卵清蛋白(OVA)。
本发明的阿米卡星完全抗原的结构如式1所示:
其中,Protein为蛋白质载体,本发明中优选为牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)。
在优选的实施方式中,利用戊二醛作为连接试剂将茶碱与适当的蛋白质载体结合。
将阿米卡星半抗原与蛋白质载体连接的条件如下:反应温度为20-28℃,优选23-28℃,更优选25℃;反应pH为4.0-9.0,优选7.2-7.6,更优选7.5;反应时间为4-9小时,优选7-9小时,更优选8小时。
单克隆抗体的制备
本文所用的术语“单克隆抗体”是指获自基本上同源的抗体群的抗体,即,除了可能存在少量可能的自发突变,组成该群体的抗体个体都相同。因此,修饰语“单克隆”是指该抗体的性质不是离散抗体的混合物。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如,本发明完全抗原,可被施用于动物以诱导单克隆抗体的产生。对于单克隆抗体,可利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人,Nature 256;495,1975;Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:511,1976;Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:292,1976;Hammerling等人,In MonoclonalAntibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)或可用重组DNA法(美国专利号4,816,567)制备。
代表性的骨髓瘤细胞是有效融合、通过选择的抗体产生细胞支持抗体的稳定高水平产生、且对培养基(HAT培养基基质)敏感的那些骨髓瘤细胞,包括骨髓瘤细胞系,例如鼠类的骨髓瘤细胞系,包括衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的骨髓瘤细胞系(可购自SalkInstitute Cell Distribution Center,圣地亚哥,加利福尼亚,美国)以及SP-2、NZ0或X63-Ag8-653细胞(可购自American Type CμLture Collection,洛克维尔,马里兰,美国)。人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系也已被描述用于产生人单克隆抗体[Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeur等,单克隆抗体的生产技术和应用(MonoclonalAntibodies Production Techniques and Applications),51-63页(Marcel Dekker,Inc.,纽约,1987)]。
对杂交瘤细胞生长于其中的培养基进行分析以检测具有所需特异性的单克隆抗体的产生,如,通过体外结合分析例如,酶联免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA)。表达抗体的细胞的位置可用FACS进行检测。然后,可将杂交瘤克隆通过有限稀释步骤形成亚克隆(subcloned),并通过标准方法生长(Goding,单克隆抗体(MonoclonalAntibodies):原则和实践(Principles and Practice),Academic Press(1986)59-103页)。为了达到这一目的而使用的适合的培养基包括,例如,DMEM或RPMI-1640培养基。此外,杂交瘤细胞可在动物体内作为腹水瘤生长。
由亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清中通过常规的免疫球蛋白纯化工艺适当地得到分离,这些纯化工艺为例如,蛋白A-琼脂糖法(protein A-Sepharose)、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析。
本发明的单克隆抗体由小鼠杂交瘤细胞系产生,所述杂交瘤细胞系已于2020年11月21日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC,中国,武汉,武汉大学),保藏号为CCTCCNO:C2020224;分类命名为:杂交瘤细胞株C214240。
在具体的实施方式中,本发明的单克隆抗体带有可检测标记物。更佳地,所述的标记物选自下组:胶体金标记物、有色标记物或荧光标记物。
在具体的实施方式中,本发明的单克隆抗体检测阿米卡星的灵敏度为3ng/mL。本发明的单克隆抗体与阿米卡星完全抗原的载体蛋白,例如BSA或OVA没有交叉反应。进一步地,本发明的单克隆抗体也不结合其它抗生素,包括但不限于哌拉西林舒巴坦、头孢哌酮、美罗培南、左氧氟沙星、伏立康唑等。
检测试剂盒
本发明的检测试剂盒是指含有本发明的单克隆抗体并可用于阿米卡星检测的试剂盒。所述的试剂盒可根据需要包括容器、使用说明书、缓冲剂、免疫助剂等。
本发明的检测试剂盒可采用多种形式,例如检测卡、含有各种测试所需试剂的测试盒等。实施例中采用检测卡为例对本发明的试剂盒进行说明,但不应理解为本发明的试剂盒仅限于检测卡。
在具体的实施方式中,本发明的检测阿米卡星的荧光免疫层析检测卡包括基片;吸液部件;检测部件;和加样部件;其中,检测部件固定在基片上,在检测部件中部设置质控带和检测带,在检测部件的两端以部分重叠的方式固定吸液部件和加样部件,其中,检测带上包被有本发明的完全抗原,质控带上包被有兔抗原IgG。
在优选的实施方式中,本发明的阿米卡星荧光免疫层析检测卡还包括卡盒,所述卡盒由下盖和上盖组成,上盖设有加样窗口和检测窗口,所述阿米卡星荧光免疫层析检测卡完全设置于下盖中,所述检测窗口和加样窗口分别对应与所述阿米卡星荧光免疫层析检测卡上的加样部件和质控带及检测带。在上盖上还可设有产品编号区;条形码识别区。所述基片可以是深色硬质基片;优选黑色PVC基片。所述检测部件可以是硝酸纤维素膜。所述加样部件可以是玻璃纤维。所述吸液部件可以是吸水纸。
本文所述的“部分重叠的方式固定”表示相邻的两个部件形成一定的重叠区域,而非一个部件完全包含在另一部件中的完全重叠,并且该两部件通过该重叠区域而固定。固定的方式可由本领域技术人员自主选择,例如通过粘合等方式。
在上述检测卡的基础上,本发明还提供一种检测阿米卡星的检测试剂盒,其装有:
(a)上述阿米卡星荧光免疫层析检测卡;
(b)与所述阿米卡星荧光免疫层析检测卡配套的阿米卡星检测分析液;
(c)利用所述阿米卡星检测试剂盒检测阿米卡星的使用说明书;
其中,所述检测分析液为包含有荧光标记的本发明的单克隆抗体和抗兔IgG抗体的检测分析液。
本领域技术人员可根据需要自主选择荧光标记,包括Alexa Fluor 647、CFTM647。
在优选的实施方式中,所述检测分析液的溶剂部分是含有BSA的磷酸缓冲液。
阿米卡星完全抗原的免疫检测应用
本发明的阿米卡星完全抗原应用于抗体制备,所述抗体应为单克隆抗体或者多克隆抗体;本发明的阿米卡星完全抗原制备相应抗体应用于各种检测阿米卡星含量的免疫学检测领域,包括但不限于ELISA、化学发光法、胶体金法和荧光免疫层析法等免疫学检测领域。
上述所述的“阿米卡星完全抗原应用于抗体制备”是指利用本发明的阿米卡星完全抗原,利用完全抗原去免疫实验动物,制备抗阿米卡星多克隆抗体和单克隆抗体;所述实验动物不应该理解为具体实施方式中单纯的小鼠,应该包括但不限于:小鼠、大鼠、兔子、山羊、绵羊、马、驴、鸡、狗等实验动物。
上述所述的“阿米卡星完全抗原应用于测定阿米卡星免疫检测领域”是指利用阿米卡星完全抗原制备得到的相应抗体作免疫检测原料建立各种检测阿米卡星含量的免疫检测方法。所述免疫检测领域包括但不限于ELISA、化学发光法、胶体金法和荧光免疫层析法等免疫学检测方法;所述检测阿米卡星免疫检测方法不仅仅指定量检测,还包括半定量以及各种基于免疫学检测的定性检测方法。
在具体实施方式中,本发明以免疫小鼠制备特异性单克隆抗体为例,以及以ELISA和荧光免疫层析法为具体实例阐述了阿米卡星完全抗原在阿米卡星免疫学检测中的应用。
本发明的优点:
1.本发明首次公开了一种阿米卡星完全(人工)抗原的结构以及其制备方法;
2.本发明首次公开了阿米卡星完全抗原在阿米卡星抗体制备和免疫学检测领域的应用,为推进临床上阿米卡星血药浓度检测提供了可靠的方法;
3.本发明的单克隆抗体可高灵敏度地检测阿米卡星,且不与其它抗生素发生结合;
4.本发明的阿米卡星检测试剂盒可简单、快捷地现场检测阿米卡星。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例
实施例1阿米卡星完全抗原(免疫原和包被原)的制备
将阿米卡星(半抗原)分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)通过戊二醛法偶联。具体偶联方法如下:
称取50mg阿米卡星,溶解于5mL超纯水中,形成10mg/mL的阿米卡星溶液,向阿米卡星溶液中加入8.5mg/mL的OVA或BSA,然后再缓慢加入10μl 50%戊二醛,室温避光反应8h。用磷酸缓冲液透析4次,12h换一次液。收集透析液,得到的阿米卡星人工抗原(免疫原和包被原)结构式如下所示,其中“Protein”为BSA(牛血清蛋白)或OVA(卵清蛋白)
阿米卡星人工抗原(免疫原和包被原)用紫外扫描波峰结果比较如图1所示,偶联物的波峰与BSA以及OVA波峰有区别说明偶联成功。
实施例2利用阿米卡星完全抗原制备单克隆抗体
1.免疫动物
将实施例1得到的阿米卡星免疫原稀释成0.2mg/mL,取500μL免疫原与等体积的弗氏完全佐剂混合后,乳化完全,免疫BALB/c小鼠(上海斯莱克实验动物有限责任公司),在小鼠背部皮下及足部进行注射免疫。第一次免疫用完全弗氏佐剂,之后用不完全弗氏佐剂。第四次免疫后一周眼眶取血,分离血清,测抗阿米卡星抗体的效价。经ELISA检测,小鼠四次免疫后的抗体效价为1:256,000。
2.细胞融合和筛选
四次免疫后的小鼠经腹腔注射约100μg免疫原再次加强免疫,3天后,取该小鼠脾脏用于融合。
取SP2/0细胞(南京军事医学科学院)与脾细胞混合,加入无血清培养液(HycloneSH30022.018 DMEM(High Glucose)),离心(1500rpm,3min),取沉淀细胞,逐滴加入1mL50%聚乙二醇4000,静置90秒。然后逐滴加入37℃预温的无血清培养液10mL,静置5min。融合后细胞悬液离心(1000rpm,3min),用完全培养液,接种于加有饲养层细胞的96孔板内,每孔2×104/mL骨髓瘤细胞。置37℃,5%CO2培养箱内培养两天,加入2×HAT的完全培养液,使孔内终浓度为1×HAT。待杂交瘤细胞集落长至孔底1/10-1/5面积的时候,即用ELISA方法筛选融合细胞抗体阳性孔。
3.腹水制备和抗体纯化
取BALB/c小鼠,于腹腔注射0.5mL石蜡油,7天后,腹腔注射0.5mL 1×106阳性杂交瘤细胞。观察小鼠生长情况,7天左右可见腹部隆起,及时采集腹水。利用亲和层析技术(Protein G Resin亲和纯化)纯化得到高纯度的单克隆抗体,蛋白量为6mg/只小鼠。
实施例3利用阿米卡星完全抗原进行免疫检测
1.荧光免疫层析检测
1)检测分析液制备
a.分别荧光标记实施例2得到的单克隆抗体以及抗兔IgG抗体(杭州启泰生物技术有限公司);
b.用含有BSA的磷酸缓冲液将荧光标记后的抗体稀释配制成检测分析液。
2)阿米卡星荧光免疫层析试纸卡的制备
a.用包被缓冲液(磷酸缓冲液)分别将制备得到的阿米卡星包被原(AMK-OVA)和兔抗原IgG稀释到适当浓度(0.4-3.0mg/mL)。在25±5℃的温度下,将稀释后的AMK-OVA和兔抗原IgG均匀喷于硝酸纤维膜上(分别形成检测线和质控线),在12%-30%的湿度条件下烘干1.5-2小时左右,干燥保存备用;
b.在黑色PVC基片上分别依次粘贴步骤a所得到的包被硝酸纤维素膜、玻璃纤维纸和吸水纸形成检测卡(如图2A所示),视需要切割成适当宽度。
c.将步骤b所得到的检测卡装入卡盒的下盖中,盖上上盖,形成完整的带卡盒检测卡(如图2B所示)。
3)检测
取60μl稀释后的样本与60μl的检测分析液均匀混合,取100μL加入检测卡的加样窗口,反应15~20min后,用FCR荧光免疫分析仪(苏州和迈精密仪器有限公司)检测,根据样本的T线信号值与C线信号比值(T/C值)与内置的标准曲线比对显示检测结果。
4)阿米卡星荧光免疫层析检测试纸卡检测原理
采用竞争法检测,样品中的阿米卡星抗原和检测线(T线)上的阿米卡星抗原(包被原)竞争结合检测分析液中的荧光标记的抗阿米卡星抗体。当样本中抗原浓度很低时,检测线上结合的荧光抗体增多,进而检测线上的荧光信号就强,因此,检测线(T线)荧光信号与质控线(C线)上荧光信号的比值(T/C值)就大;反之,样本中阿米卡星抗原浓度较高时,T/C值就很小。所以,样本中阿米卡星含量越高,T/C值越低。根据T/C值与内置标准曲线比较并显示检测结果。
5)荧光免疫层析法检测阿米卡星的灵敏度以及标准曲线
将空白血清中添加阿米卡星标准品,配置成15、10、7.5、3.75、1.88、0.94、0.47、0μg/mL 8个浓度梯度,再分别用0.9%NaCl稀释100倍。将上述系列浓度样品按照上述检测的步骤进行检测,每个样品重复3次,检测的实验结果如表1所示,根据表1数据以浓度为横坐标,T/C值为纵坐标绘制标准曲线(四参数)如图3所示。图3中曲线对应的方程如表2所示,计算得体系IC50=1.04μg/mL,真实IC50=10.4ng/mL。
表1.荧光免疫层析法检测不同浓度阿米卡星样本
表2.抑制曲线所对应的方程(四参数)
将0μg/mL样品重复检测10次,分别计算其T/C值的平均值(X)、标准偏差(SD)以及精密度(CV值)。灵敏度的计算方式为,X-2*SD的T/C值在图3的标准曲线里所对应的阿米卡星浓度值。
表3.荧光免疫层析法重复检测0μg/mL阿米卡星样本结果
将表3数据中的X-2*SD的T/C值作为y值代入图3标准曲线对应的方程中的到的浓度值为0.24μg/mL,即体系灵敏度为0.24μg/mL,真实灵敏度为2.4ng/mL。
6)荧光免疫层析法检测阿米卡星的精密度偏差
分别利用已经建立的阿米卡星检测体系检测浓度为0.50μg/mL、1.00μg/mL和10.00μg/mL的阿米卡星标准品,各重复检测10次,计算检测低中高浓度阿米卡星的精密度(CV)。表4是检测阿米卡星高低浓度的精密度结果。
表4.荧光免疫层析法重复检测0.50、1.00、10.00μg/mL阿米卡星标准品结果
7)荧光免疫层析法检测阿米卡星的准确度偏差
用缓存液将标准品(5mg/mL)稀释至100、50、10μg/mL后,各取10μL不同浓度标准品加入100μL低浓度企业内部参参考品中,按照上述检测的步骤进行检测,每个样品重复5次。表5是准确性结果:
表5.荧光免疫层析法重复检测阿米卡星标准品结果
8)阿米卡星荧光免疫层析检测体系的交叉反应
将8种常见的临床用相关药物分别用空白混合血清配置成不同梯度浓度样本,进行荧光免疫层析检测,计算其IC50与阿米卡星的IC50值比较计算交叉反应率。计算公式:交叉反应率=(IC50阿米卡星/IC50临床用相关药物)%,交叉反应率结果如表6所示:
表6.荧光免疫层析检测临床用相关药物的交叉反应结果
临床用相关药物 | 交叉反应率 |
哌拉西林 | ≦0.1% |
头孢哌酮 | ≦0.1% |
美罗培南 | ≦0.1% |
左氧氟沙星 | ≦0.1% |
伏立康唑 | ≦0.1% |
2.ELISA定量检测阿米卡星
1)ELISA检测标准曲线建立
将制备好的阿米卡星包被原(AMK-OVA)用碳酸缓冲液(0.05M,pH9.6)稀释到1-2μg/mL,包被96孔板,100μL/孔,4℃过夜,5%脱脂奶粉封闭3h,200μL/孔。洗涤3次,5min/次;将空白血浆中添加阿米卡星标准品,配置成0.00μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL、2.00μg/mL、4.00μg/mL、5.00μg/mL、8.00μg/mL、10.00μg/mL系列浓度样品,稀释100倍。分别将不同浓度的阿米卡星50μL与阿米卡星抗体50μL混合加入微孔中,37℃孵育1h;洗涤3次后,加入HRP标记的二抗孵育1h(100μL/孔)后,洗涤3次,加入显色液,室温避光反应15min,加终止液读数(450nm)。表7显示了ELISA检测的标准曲线吸光值结果。图4中曲线对应的方程如表8所示,计算得体系IC50=0.63μg/mL,真实IC50=6.3ng/mL。
表7.ELISA法检测不同浓度阿米卡星
表8.抑制曲线所对应的方程(四参数)
2)ELISA检测阿米卡星的灵敏度
将阴性血浆样品重复检测10次,分别计算其ELISA吸光值的平均值(X)、标准偏差(SD)以及精密度(CV值)。灵敏度的计算方式为,X-2*SD的T/C值在图4的标准曲线里所对应的阿米卡星浓度值。
表9.ELISA法重复检测0μg/mL阿米卡星样本结果
将表9数据中的X-2*SD的吸光值作为y值代入图4标准曲线对应的方程中的到的浓度值为0.06μg/mL,即体系灵敏度为0.06μg/mL,真实灵敏度为0.6ng/mL。
3)ELISA法检测阿米卡星的精密度以及准确度偏差
分别利用已经建立的ELISA检测体系检测浓度为1μg/mL和8μg/mL的阿米卡星标准品,各重复检测15次,计算检测高低浓度阿米卡星的精密度(CV)以及检测的准确度偏差。表10是检测阿米卡星高低浓度的精密度以及准确性结果,其结果显示高低浓度精密度均小于15%,准确度偏差均小于15%。
表10.ELISA法重复检测1、8μg/mL阿米卡星标准品的结果
4)ELISA法检测阿米卡星的交叉反应
交叉反应结果与荧光免疫层析法检测阿米卡星的结果一致。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (11)
1.一种阿米卡星完全抗原,其特征在于,所述完全抗原具有式1所示的结构:
其中,protein为蛋白质载体。
2.如权利要求1所述的霉酚酸完全抗原,其特征在于,所述蛋白质载体是牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)。
3.一种制备权利要求1或2所述阿米卡星完全抗原的方法,其特征在于,所述方法包括步骤:
将阿米卡星半抗原与蛋白质载体连接,以制得权利要求1所述的完全抗原。
4.一种权利要求1或2所述的阿米卡星完全抗原的用途,其特征在于,其用于制备阿米卡星的特异性单克隆抗体。
5.一种单克隆抗体,其特征在于,所述单克隆抗体特异性结合阿米卡星。
6.如权利要求5所述的单克隆抗体,其特征在于,所述单克隆抗体由小鼠杂交瘤细胞系产生,所述杂交瘤细胞系由中国典型培养物保藏中心(CCTCC,中国,武汉,武汉大学)保藏,保藏号为C2020224;分类命名为:杂交瘤细胞株C214240。
7.一种产生权利要求5或6所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞系,其特征在于,所述杂交瘤细胞系由中国典型培养物保藏中心(CCTCC,中国,武汉,武汉大学)保藏,保藏号为C2020224;分类命名为:杂交瘤细胞株C214240。
8.如权利要求5或6所述的单克隆抗体的用途,其特征在于,其用于制备检测样品中阿米卡星的试剂、检测卡或试剂盒。
9.一种检测生物样品中阿米卡星是否存在的方法,其特征在于,所述方法包括步骤:
(a)将所述生物样品与权利要求5或6所述的单克隆抗体接触;
(b)检测是否形成抗原-抗体复合物,其中形成复合物就表示样品中存在阿米卡星。
10.一种检测阿米卡星的荧光免疫层析检测卡,其特征在于,所述检测卡包括基片、吸液部件、检测部件、加样部件,检测部件固定在基片上,在检测部件中部设置质控带和检测带,在检测部件的两端以部分重叠的方式固定吸液部件和加样部件,其中,检测带上包被有权利要求1或2所述的阿米卡星完全抗原,质控带上包被有兔抗原IgG。
11.一种检测阿米卡星的检测试剂盒,所述试剂盒的内容物包括:
(a)权利要求10所述的阿米卡星荧光免疫层析检测卡;
(b)与权利要求10所述的阿米卡星荧光免疫层析检测卡配套的阿米卡星检测分析液;
(c)所述阿米卡星检测试剂盒检测阿米卡星的使用说明书;
其中,所述检测分析液为包含有荧光标记的权利要求4或5所述的单克隆抗体和抗兔IgG抗体的检测分析液。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310375096.9A CN117024566A (zh) | 2023-04-10 | 2023-04-10 | 阿米卡星完全抗原及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310375096.9A CN117024566A (zh) | 2023-04-10 | 2023-04-10 | 阿米卡星完全抗原及其制备方法和应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117024566A true CN117024566A (zh) | 2023-11-10 |
Family
ID=88639943
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202310375096.9A Pending CN117024566A (zh) | 2023-04-10 | 2023-04-10 | 阿米卡星完全抗原及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN117024566A (zh) |
-
2023
- 2023-04-10 CN CN202310375096.9A patent/CN117024566A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0462376B1 (en) | Conjugate recovery binding assays | |
US11162959B2 (en) | Time-resolved fluorescent immunochromatographic test strip for detecting vancomycin as well as preparation method and application thereof | |
CN110938072A (zh) | 一种利培酮人工抗原及其制备方法 | |
BRPI0612666B1 (pt) | anticorpo monoclonal, suporte sólido, composição, linhagem de células de hibridoma, imunoensaios e kits para sua detecção e quantificação | |
CN110938082A (zh) | 一种奥氮平人工抗原及其制备方法 | |
JPH09506260A (ja) | メトトレキサートを検出するための試薬および方法 | |
CN116120430A (zh) | 一种叶酸完全抗原和抗体及其制备方法和应用 | |
CN112500496B (zh) | 万古霉素完全抗原及其制备方法和应用 | |
CN110357886B (zh) | 甲氨蝶呤半抗原和完全抗原及其制备方法和应用 | |
CN110713986B (zh) | 一株维生素b1单克隆抗体杂交瘤细胞株cbdd及其应用 | |
CN110922357A (zh) | 一种阿立哌唑人工抗原及其制备方法 | |
FI78787B (fi) | Immunometrisk metod foer bestaemning av en hapten. | |
CN114685649B (zh) | 霉酚酸完全抗原及其制备方法和应用 | |
CN117024566A (zh) | 阿米卡星完全抗原及其制备方法和应用 | |
CN114685648B (zh) | 茶碱完全抗原及其制备方法和应用 | |
CA2093521C (en) | Detection of diarrheogenic shellfish toxins | |
CN114752568B (zh) | 呋塞米单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用 | |
CN116143920A (zh) | 胃泌素17的单克隆抗体及其细胞株的制备方法和应用 | |
CN116444647B (zh) | 氯氮平完全抗原和抗体及其制备方法和应用 | |
CN115166239A (zh) | 牛布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条 | |
CN116375845A (zh) | 拉莫三嗪完全抗原和抗体及其制备方法和应用 | |
CN116813745A (zh) | 奥氮平完全抗原和抗体及其制备方法和应用 | |
CN107226795B (zh) | 利奈唑胺半抗原和完全抗原及其制备方法和应用 | |
CN117645662A (zh) | 一种安眠酮完全抗原及其制备方法和应用 | |
CN116396401A (zh) | 替考拉宁完全抗原和抗体及其制备方法和应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |