JPS6374494A - モノクロナル抗体及びその製造使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、塩素化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシン類（ｃｈ
ｌｏｒｉｎａｔｅｄ　ｄｉｂｅｎｚｏ−ｐ−ｄｉｏｘｉ
ｎｓ）と反応するモノクロナル（ｍｏｎｏｃｈｌｏｎａ
ｌ；単一分枝系）抗体、特に有毒な化学品である２、３
，７゜８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン（
以下、２，３，７．８−　Ｔ　ＣＤ　Ｄと略記する）と
反応するモノクロナル抗体に関する。本発明は抗体、抗
体の製造方法、抗体を用いる分析法、診断法、研究法、
分離法その他の方法、及び上記の各用途に用いる抗体を
含有する組成物に関する。

塩素化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシン類（以下「塩素化ダ
イオキシン類」という）は、環境汚染物として一般的で
ある。塩素化ダイオキシン類は、市販のクロロフェノー
ル類及びクロロフェノキシ酸類中の夾雑物（汚染不純物
）として存在する。塩素化ダイオキシン類の１種である
２、３，７．８−　Ｔ　ＣＤ　Ｄは、人類が創り出した
既知の化学物質のうちでも最も毒性の強いものの１つで
ある。その他の毒性の強い塩素化ダイオキシン類として
は、１，２，３゜７．８−ペンタクロロ異性体、１，２
，３，６，７．８−へキサクロロ異性体及び１，２，３
，７，８．９−へキサクロロ異性体を挙げることができ
る。考えられる多くの塩素化ダイオキシン類のうちの数
種のみが毒性試験を受けているに過ぎない。

２．３，７．８−　Ｔ　ＣＤ　Ｄは、多くの化学工程に
おいて望ましくない副産物として生成される。この化学
化合物は実用性はないが、極めて強い毒性のために既知
の化学物質のうちでも最も重要なものの１つである。２
，３，７．８−ＴＣＤＤの構造を第１図に示す。２，３
，７．８−ＴＣＤＤは多種の異性体類の１つに過ぎない
が、人及び動物に対する異常な毒性を持つので、「ダイ
オキシン」という語は１種類の異性体である２、３，７
．８−　Ｔ　ＣＤ　Ｄの作用を説明するために用いられ
ることが多かった。

低レベルの２．３，７．８−　Ｔ　ＣＤ　Ｄに長時間曝
された場合の人の健康に及ぼす影響については様々の議
論があるけれども、環境及び公衆の健康に関与する諸官
庁は、その猛烈な毒性の故に、この種の化学物質へ人間
が曝される危険に対して極めて大籾な関心を寄せている
。２，３，７．８−　Ｔ　ＣＤ　Ｄは、米国環境保護局
（ＥＰＡ、　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｐｒｏｔｅ
ｃｔｉｏｎ　Ａｇｅｎｃｙ）によって重点汚染物質とし
て厳しく規制されている。土壌、空気又は水中に１兆分
の１（１ｐｐｔ）程度の低レベルで検出された場合でも
、汚染除去及び清浄化に充分に値するものとされる。−
例を挙げると、ニューヨーク州、ラブ・カナル（Ｌｏｖ
ｅ　Ｃａｎａｌ）及びミズリー州、タイムズ・ビーチ（
Ｔｉｍｅｓ　Ｂｅａｃｈ）地区で２．３，７，８．−Ｔ
　ＣＤ　Ｄが検出されたときには、人々を立ち退かせ、
広い区域を隔離遮断し、１０年間を要するかとも思われ
る大規模で費用の嵩む浄化を行なう必要があるものとさ
れた。毒性化学物質としての２．３，７，８　−Ｔ　Ｃ
ＤＤの重大性に関しては短大かの著者が論評を加えてい
る。ヤング等（Ｙｏｕｎｇ　ｅｔ　ａｔ、）による環境
科学技術（Ｅｎｖｉｒｏｎ、’Ｓｃｉ、　Ｔｅｃｈｎｏ
ｌ、）の第１７巻、５３０Ａ〜５４０Ａ　（１９８３年
）；カーター等（Ｃａｒｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）による
サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）の第１８８巻、７３８〜
７４０頁（１９７５年）；及びファイアストン（Ｆｉｒ
ｅｓｔｏｎｅ）によるエコロジカル・プリテン（Ｅｃｏ
ｌ、　Ｂｕｌｌ、’）　（ストックホルム）の第２７巻
、３９〜５２頁（１９７８年）を参照されたい。

２．３，７．８−　Ｔ　ＣＤ　Ｄは、極めて低濃度でも
環境上問題及び医療上の問題となるので、その検出のた
めに非常に鋭敏な分析法が必要になる。現時点では、Ｅ
ＰＡの承認した２、３，７゜８−ＴＣＤＤの分析方法は
、各試料の大規模な抽出・浄化工程と、それに続く特定
イオンのモニタリングを伴なうガス・クロマトグラフィ
ーと高度の質量解析スペクトル分析の組合せ（ＧＣ−Ｍ
Ｓ）とを含む方法である。この分析法は、ザ・ナショナ
ル・ダイオキシン・スタディ（Ｅ　ｐ　Ａ　／８００／
３−８５１０１９．１９　ａ５年４月）と題するＥＰＡ
刊行物に記載されている。

ＧＣ−ＭＳ法には幾つかの欠点がある。即ち、費用が嵩
み、時間を要し、労働集約的である。設備は複雑で高価
であり、高度に訓練されたオペレータが必要である。１
つの試料の分析に約３日間を要する。更に、この方法の
感度は約１　ｐｉｎｔであるが、この感度よりもかなり
低濃度の２．３，７．８−　Ｔ　ＣＤ　Ｄを検知できる
ことが望まれている。

２．３，７．８−　Ｔ　ＣＤ　Ｄの検知のための少なく
とも２種の他の方法が報告されている。その１つは２，
３，７．８−Ｔ　ＣＤ　Ｄによるラット肝癌細胞ライン
中におけるアリル・ハイドロカーボン・ハイドロカ−ボ
ン体類Ｈ）活性の誘起を利用する方法である［ブラッド
ロー及びキャスターライン（Ｂｒａｄｌａｗ　ａｎｃ！
　Ｃａ５ｔｅｒｌｆｎｅ）。

Ｊ、＾５ｓｏｃ、　Ｏｆｆ、　Ａｎａｌ、　Ｃｈｅｍ、
、第６２巻、９０４〜９１６頁（１９７９年）］。２，
３．７．８−ＴＣＤＤ又はその他のポリ塩素化された平
板状有機物質を含有するのではないかと思われる試料に
よるＡＨＨ活性の誘起百分率を既知濃度の２．３，７．
８−　Ｔ　ＣＤ　ＤによるＡＨＨ活性の誘起百分率の標
準曲線を比較した。この方法は、ＧＣ−ＭＳ法よりも迅
速、安価、且つ容易な方法ではあるが、特定性が欠如し
ているのが重大な欠点である。この方法では、２．３，
７．８−　Ｔ　ＣＤ　Ｄを他のダイオキシン異性体類と
区別できないのみならず、他の多くのポリ塩素化された
平板状有機化合物類とも区別できない。

第二の方法は、放射能免疫分析における塩素化ジベンゾ
−ｐ−ダイオキシン類に対してポリクロナル（ｐｏｌｙ
ｃｈｌｏｎａｌ；複雑分枝系）抗体類を使用する方法で
ある。［アルボ等（Ａｌｂｏ　　ｅｔ　　ａｌ、）　　
、　Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ　　ａｎｄ　　八ｐｐｌｉｅ
ｄＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙの第５０巻、１３７〜１４
６頁（１９７９年）及びアルボ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ
ｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙの第８４巻、６１９〜６２８頁
（１９８２年）参照。）この方法もＧＣ−ＭＳ法よりも
迅速、安価、且つ容易で叶、ＡＨＨ誘起法よりも遥かに
特定性の高い方法である。しかしながら、この方法には
重大な欠点がある。この方法では、塩素化ダイオキシン
類及びジベンゾフラン類の各種異性体類の区別ができな
い。加えて、蛋白質と結合した塩素化ダイオキシン類は
うさぎの場合には良好な抗体レスポンスを示すが、動物
が異なる毎に結合特定性が大きく変動する。血清毎に膨
大な特性表示（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）が
必要となり、これは骨の折れる工程である。

アルボ等の方法のその他の幾つかの欠点は、放射性物質
を使用する結果として起こるものである。分析で用いる
放射性試薬類の調製、使用及び廃棄には、入念な安全上
の注意を怠ってはならない。放射性試薬類により、分析
コストが加算されることになる。最後に、放射性物質は
不安定であり、従って使用寿命が限られている。

アルボ等の分析法の更に別の欠点は、塩素化ジベンゾ−
ｐ−ダイオキシン類に対する抗体源として、うさぎの抗
血清を使用することに起因する。このような抗血清は、
多種の特異性（特定性）及び抗原との親和性を持つ複数
の抗体の複合混合物を含有する。その結果、このような
抗体類即ちポリクロナル抗体を使用する分析は検出しよ
うとするダイオキシンの特定の異性体、たとえば２，３
，７．８−ＴＣＤＤに対して充分な特異性を持たないも
のとなる可能性がある。加えて、抗体類の製造に用いる
方法により、即ち抗体類が想定される抗原による動物の
免疫を行なう方法をとるために、製造される抗体類はバ
ッチ毎に変動する可能性があり、結果にばらつ鮒が出る
可能性がある。又、生きている動物は、不確実な抗体源
である。

従って、ポリクロナル抗体類の異質性と多様性、抗原刺
激に対する抗体反応の予知不可能性及び一定不変な抗体
源がないという要因により、上記のポリクロナル抗体類
を２．３．７゜８−ＴＣＤＤの検出及び定量を含む臨床
的及び科学的な目的への実用が大きな制約を受けること
になる。

ポリクロナル抗体とは異なり、モノクロナル抗体は単一
のＢリンパ球クローンに由来するものであり、無条件に
特定的であり同一性を持つ。１９７５年にコラ−及びミ
ルシュタイン（Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉ
ｎ）によってＮａｔｕｒｅ″の２６５　：４９５に初め
て報告された方法は、特定の抗体製造Ｂリンパ球を腫瘍
細胞と融合させることにより羊赤血球に対するモノクロ
ナル抗体類を調製し、試験管内（Ｉｎｖｉｔｒｏ）又は
動物内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）で単一の千ノクロナル抗体を
合成できる不死の自己再生産性混成りローン［即ち、ｈ
ｙｂｒｉｄｏｍａ　（混成種）］をつくる方法である。

このような混成種は、単一の予め特定された特定性を持
つ抗体の潜在的には無制限な供給源となる可能性を持つ
自己再生産型細胞工場になる。

２．３，７．８−　Ｔ　ＣＤ　Ｄに対する千ノクロナル
抗体をつくる１つのこころみが文献に報告されている［
ケネル等（Ｋｅｎｎｅｌ　ｅｔ　ａｌ、）　、Ｔｏｘｉ
ｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｐｈａｒｍａ
ｃｏｌｏｇｙの第８２巻、２５６〜２６３頁（１９８６
年）］。ダイオキシンの甲状腺グロブリン複合体［サイ
ログロブリン−２アジパアミド、３，７．８−　）−ジ
クロロベンゾ−ｐ−ダイオキシン（ＴＧ−ＴＣＤＤ）］
がマウスの免疫に使用された。

免疫脾臓細胞とマウスの骨髄腫との細胞融合によって混
成種が生成した。上記文献の著者は、ダイオキシンの牛
血清アルブミン（ＢＳＡ）複合体［ＢＳＡ−２−アジパ
アミド、３゜７．８−トリクロロベンゾ−ｐ−ダイオキ
シン（ＢＳＡ−ＴＣＤＤ）］と結合した幾つかのモノク
ロナル抗体類を固定しているが、２，３゜７．８−ＴＣ
ＤＤのみに対するモノクロナル抗体類を見い出したこと
を示すデータは報告してはいない。実際のところ、上記
の報文は全般的には、蛋白質担体に連結したダイオキシ
ン類と結合したモノクロナル抗体類を同定しその特性を
知るための迅速な固体相分新法の開発を報告することが
その要旨である。遊離のダイオキシン類ではなく、担体
蛋白質類に連結したダイオキシン類と結合するモノクロ
ナル抗体類は、ダイオキシン類の定量分析には利用出来
ない。担体蛋白質と配位結合した小さな化学化合物類に
対するモノクロナル抗体類は化学物質の構造のみならず
、化学物質と蛋白質との間の連結物の構造、更には連結
物の結合している部分に隣接する蛋白質の構造をも認知
する傾向があることは当事者には知られた事実である。

このような付随的な構造を認知する結果として、遊離化
学物質ヘモノクロナル抗体が結合出来ないかもしくは、
遊離化学物質への結合能力が著しく低い。モノクロナル
抗体類の化学物質への結合を定量分析に用いるためには
、上記の問題を克服しなければならない。

何らかの方法で遊離の塩素化ダイオキシン類、特に遊離
の２．３，７．８−　Ｔ　ＣＤ　Ｄと反応するモノクロ
ナル抗体類を合成する新規な自己再生産型細胞ラインの
製造が企てられている。その理由は、このような抗体類
は、もし製造することができれば、既存のポリクロナル
抗体技術によっては充足されなかった多数の必須条件を
満足するからである。２，３，７．８−ＴＣＤＤに対す
るポリクロナル抗体類と同様に、上記の如きモノクロナ
ル抗体類は２，３゜７．８−ＴＣＤＤと結合して、各種
の迅速、簡単、且つ費用効率の高い免疫分析技術により
極めて毒性の強い化学物質（２，３，７，８−Ｔ　ＣＯ
Ｄ）の検出を可能にする。しかしながら、モノクロナル
抗体類は、鋭敏な特定性を持つので、検出試薬としては
ポリクロナル抗体類よりも有用性が大きい。同様に、こ
の特定性（特異性）のために、モノクロナル抗体類は、
２．３，７．８−　Ｔ　ＣＤ　Ｄの免疫学的研究及び生
科学的研究にも有用であり、２，３，７．８−　Ｔ　Ｃ
ＤＤの親和高純度化（ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｐｕｒｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎ）にも有用であり、Ｈ，Ｏその他の２．３
，７．８−ＴＣＤＤ含有物から２．３，７．８−　Ｔ　
ＣＤ　Ｄを中和乃至除去するためにも有用である。更に
、従来法のポリクロナル抗体類とは異なり、２，３゜７
．８−ＴＣＤＤと反応するモノクロナル抗体類は、潜在
的には無制限で同質の供給物の形で製造することができ
、２，３，７．８−　Ｔ　ＣＤ　Ｄ／蛋白質配合物の低
免疫原性（ｌｏｗ　ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉ　ｃ　ｉ　ｔ
ｙ）による問題、ポリクロナル抗体反応のばらつき、並
びにその結果生じる環境上その他の応用分野への抗２，
３，７．８−　Ｔ　ＣＤ　Ｄ抗体類の利用又は供給にお
ける制約を回避できる。［発明が解決しようとする問題
点及びその解決手段］ 従フて本発明は、塩素化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシンと
反応するモノクロナル抗体及びこのような抗体を生成す
る混成種に関する。

好ましくは、モノクロナル抗体は２，３，７．８−ＴＣ
ＤＤと反応する。

本発明は更に、塩素化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシンと反
応するモノクロナル抗体類の製造方法であって、前記の
塩素化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシンと巨大分子担体との
免疫原複合体を生成させ、動物を前記複合体に対して免
疫にし、前記動物から抗体製造細胞を得、前記細胞を腫
瘍細胞と融合させて複数のハイブリドマ（混成種）を生
成させ、前記の複数のハイブリドマがら前記の塩素化ジ
ベンゾ−ｐ−ダイオキシンと反応する抗体類を製造する
少なくとも１種のハイブリドマを選択し、前記の選択さ
れたハイブリドマから製造された抗体類を回収すること
を特徴とする方法を含む。

本発明は又、塩素化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシンと反応
するモノクロナル抗体類の生体内製造方法であって、前
記抗体類を製造するハイブリドマを組織競合性ないし免
疫抑制ホストの腹腔内に入れ、前記ホストの腹水から製
造された抗体類を回収することを特徴とする方法を提供
するものである。

本発明は更に、塩素化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシンに対
するモノクロナル抗体類を生成する連続細胞ラインの製
造方法であって、前記の塩素化ジベンゾ−ｐ−ダイオキ
シンと巨大分子担体との免疫原複合体を生成させ、動物
を前記複合体に対して免疫にし、前記動物から抗体製造
細胞を得、前記抗体製造細胞と腫瘍細胞とを融合させて
複数のハイブリドマを生成させ、前記の複数のハイブリ
ドマから前記の塩素化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシンと反
応する抗体類を製造するハイブリドマを選択し、選択さ
れた前記ハイブリドマを無性生Ｎ 殖的に市やして細胞ラインにすることを特徴とする方法
を提供するものである。

本発明は更に、試料中の２．３，７．８−　Ｔ　ＣＤＤ
の存在又は濃度を検出する方法であって、前記試料に前
記の２．３，７．８−　Ｔ　ＣＤ　Ｄと反応するモノク
ロナル抗体を添加し、前記のモノクロナル抗体を試薬と
して使用する免疫分析法により前記の２．３，７．８−
　Ｔ　ＣＤ　Ｄの存在又は濃度を測定することを特徴と
する方法を提供するものである。

本発明は更に、試料中の２．３，７．８−　Ｔ　ＣＤＤ
の存在又は濃度の測定組成物であって、有効量の２．３
，７．８−　Ｔ　ＣＤ　Ｄと反応するモノクロナル抗体
が許容できる担体に担持された組成物から成ることを特
徴とする測定組成物を提供するものである。

本発明は更に、モノクロナル抗体を使用することを特徴
とする２、３．７．８−　Ｔ　ＣＤ　Ｄに対する特異的
抗体との選択的免疫学的反応に基づいた混合物からの２
．３，７．８−　Ｔ　ＣＤ　Ｄの単離又は除去を行なう
免疫学的手法を提供するものである。

本発明は更に、２，３，７．８−　Ｔ　ＣＤ　Ｄを含有
する混合物から２．３，７．８−　Ｔ　ＣＤ　Ｄを単離
又は除去するための組成物であって、２，３，７．８−
ＴＣＤＤと反応するモノクロナル抗体の有効量を含有し
、前記モノクロナル抗体が許容できる母材に固定されて
いるか又は許容できる担体との混合物であることを特徴
とする組成物を提供するものである。

特に好ましい実施例においては、本発明のモノクロナル
抗体は、ハイブリドマ細胞ラインＡＴＣＣＨＢ　　９１
８３及びＡＴＣＣＨＢ　　９１８４、又はこれらの突然
変異種もしくは変種によって製造されるモノクロナル抗
体の特性を持つ。ＡＴＣＣＨＢ　　９１８３及びＡＴＣ
ＣＨＢ　　９１８４は、米国、メリーランド州、ロック
ビル、パークローン・ドライブ、１２３０１（ジップコ
ード：２０８５２）のアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション（ＡＴＣＣ）の永久コレクションから入
手できる微生物学的に純粋な培養菌であり、１９８６年
８月２１日に寄託されたものである。これらのハイブリ
ドマによって製造（生産）される免疫グロブリン（抗体
）は、免疫学的に純化された抗免疫グロブリンの鋼及び
原調特定試薬を用いたダブル秦ゲル免疫拡散［ｄｏｕｂ
ｌｅ　ｇｅｌ　ｉｍ＋ｎｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ；オ
ークテルロニイ（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）　］によっ
て示されるＩｇＧ１複基準及び原調に属する。ＡＴＣＣ
１（Ｂ　　９１８３及びＡＴＣＣＨＢ　　９１８４のモ
ノクロナル性（ｍｏｎｏ−ｃｌｏｎａｌｉｔｙ；単−分
校性）は、これらを生産するハイブリドマの再単性生殖
（ｒｅ−ｃｌｏｎｉｎｇ）によって確認された。

本発明は更に、塩素化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシン類に
対する抗体類を製造乃至生産するハイブリドマ及び連続
細胞ライン（ｃｏｎｔｉ−ｎｕｏｕｓ　ｃｅｌｌ　１ｉ
ｎｅ）をも含む。好ましくは、本発明のハイブリドマ及
び細胞ラインは、第１ａ図に化学構造を示す２，３，７
．８−　Ｔ　ＣＤ　Ｄに対するモノクロナル抗体を生産
する。最も好ましくは、本発明の連続細胞ラインは、Ａ
Ｔｃｃ寄託番号ＨＢ　　９１８３及びＨＢ　　９１８４
のハイブリドマ細胞ライン又はこれらの細胞ラインの突
然変異種もしくは変種の特性を持つ。本発明のモノクロ
ナル抗体を生産する細胞ライン又は連続細胞ラインの個
々の細胞も本発明の技術的範囲に含まれる。

−以下余白− 当業者は、ＡＴＣＣＨＢ　　９１８３又はＡＴＣＣＨＢ
　　９１８４の突然変異種もしくは変種をつくる既知の
疲術を用いることができる。このような突然変異種もし
くは変種は、２，３，７．８−　Ｔ　ＣＤ　Ｉ）と反応
するモノクロナル抗体を生産するものであれば、本発明
の技術的範囲に包含される。又、当業者は当該技術分野
で公知の技法及び本明細書に開示された教示を利用して
、ＡＴＣＣＨＢ　　９１８３もしくはＡＴＣＣＨＢ　　
９１８４又はこれらの細胞ラインによって生産される抗
体類とは異なる特性を持つ２，３，７．８−　Ｔ　ＣＤ
　Ｄと反応するモノクロナル抗体類並びにモノクロナル
抗体生産細胞ラインをつくり出すことができる。しかし
ながら、上記の如きモノクロナル抗体類及びこれらの抗
体類を生産するハイブリドマ又は細胞ラインは本発明の
技術的範囲に含まれる。ＡＴＣＣＨＢ　　９１８３もし
くはＡＴＣＣＨＢ　　９１８４によって生産されるモノ
クロナル抗体類は、他のハイブリドマ類によって生産さ
れ２，３，７．８−ＴＣＯＤと反応する可能性を持つ多
種のモノクロナル抗体類が２．３，７．８−　Ｔ　ＣＤ
　Ｄと反応するのを妨げる。上記の他種のモノクロナル
抗体類も、発明の技術的範囲に包含される。

本発明のハイブリドマ類及び連続細胞ラインは、以下の
方法によって製造することができる。

（ａ）巨大分子担体と、モノクロナル抗体の対象物質で
ある塩素化ジベンゾ−Ｐ−ダイオキシンの特定の異性体
との免疫原配合体を生成させ； （ｂ）！ｌｌ物を前記配合体に対して免疫にし；（Ｃ）
免疫になった動物から抗体生産細胞な得； （ｄ）抗体生産細胞と腫瘍細胞と融合させて複数のハイ
ブリドマを生成させ； （ｅ）上記の複数のハイブリドマから塩素化ジベンゾ−
ｐ−ダイオキシンの異性体と反応する抗体類を生産する
ハイブリドマを選択する。

上記のようにして選択された単−又は複数のハイブリド
マを単性生殖させて細胞ラインをつくる。単性生殖によ
りふやして連続細胞ラインにをつくった後に、選択され
た単−又は複数のハイブリドマから本発明のモノクロナ
ル抗体類を回収することができる。既に述べたように、
本発明の好ましい実施例においては、塩素化ジベンゾ−
ｐ−ダイオキシンは２゜３．７．８−ＴＣＤＤである。

従って、好ましいモノクロナル抗体類は、２，３，７．
８−　Ｔ　ＣＤ　Ｄに対するモノクロナル抗体類である
。

変形実施例においては、塩素化ジベンゾ−ｐ−ダイオキ
シンに対する抗体を生産する細胞と腫瘍細胞との融合に
よって本発明のハイブリドマ類を製造することができる
。この実施例で製造されるハイブリドマ類は、適当な培
地中で培養し、培地から抗体類を回収することにより、
本発明のモノクロナルの製造に利用することができる。

分子量約１０００又はそれ未満の物質、たとえば２，３
，７．８−　Ｔ　ＣＤＤ（分子量４５５）は、通常は抗
体類の生成を誘起しない、即ち非免疫原である。しかし
ながら、この種の物質に小さな物質に対する抗体類の生
産を誘起するために、炭水化物又は蛋白質のような大き
な抗体原担体分子を化学的に付着させることができる。

このような抗体類は、担体と複合した物質のみと結合す
る場合が多いけれども、適当な複合法及び選択法を用い
ることにより、遊離即ち未結合状態の物質と結合するモ
ノクロナル抗体類を調製することができる。

塩素化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシンと巨大分子担体との
抗体原複合物を製造する一般的な技術は、本技術分野モ
公知である。これについては、たとえば、１９８４年６
月２６日付で付与された米国特許第４，４５６，６９１
号［出願人：スターク（Ｓｔａｒｋ）］明細書、及びＡ
ｌｂｒｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｔｏｘｉｃｏｌ、　Ａｐｐ
ｌ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ。

の第５０巻、１３７〜１４６頁（１９７９年）を参照さ
れたい。

分子中の置換又は未置換炭素のどの位置の炭素において
も、巨大分子を塩素化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシンに付
着させることができる。免疫原複合体が生成されると、
本技術分野で公知の技術により、免疫原複合体を用いて
ホスト（宿主）動物を免疫にすることができる。公知の
技術は、通常は接種によって行なわれるが、その他の投
与法によってもよい。ホスト動物に免疫原反応を起こす
に充分な量の複合体を投与する。

複合体に対する抗体類をつくり出すホストであれば、何
を用いてもよい。従来法で用いられている動物は、うさ
ぎ類並びにラット又はマウスのようなねずみ類動物であ
る。本発明の場合に好ましい動物はマウスである。

動物が免疫になり、複合体に対する抗体の生産を開始す
るに充分な時間が経過した後に、抗体生産細胞を回収な
いし採取する。各種の抗体生産細胞を使用することがで
きるが、動物の脾臓から得たＢリンパ球細胞が好ましい
。

抗体生産細胞を腫瘍細胞と融合させてハイブリドマをつ
くる。本明細書で使用する「腫瘍細胞」なる語句は、抗
体生産細胞と融合して混成「不死」細胞即ち、試験管内
（ｉｎｖｉｔｒｏ）で成長を続けることができる細胞を
つくりだすことができる細胞を意味する。好ましい腫瘍
細胞は、変態して免疫グロブリンを生産する能力を失う
抗体生産細胞類である。

この種の細胞の例としては、骨髄腫細胞及びマウスの形
質細胞腫細胞を挙げることができる。特に好ましいもの
は、ハイポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンな
含有する培地上で成長させたときに融合していない抗体
生産細胞又は形質細胞腫細胞からハイポキサンチン−グ
アニン・ホスホリボシル・トランセラーゼ（ｈｙｐｏｘ
ａｎｔｈｉｎｅ−ｑｕａｎｉｎｅ　ｐｈｏｓ−ｐｈｏｒ
ｉｂｏｓｙｌ　ｔｒａｎｓｅｒａｓｅ；　１（ＧＰＲＴ
）の欠如したマウスの形質細胞腫細胞である。

抗体生産細胞との融合に使用できる種々の腫瘍細胞は、
当業者には公知であり容易に人手できる。この種の細胞
の一例は、ケルニー（Ｋｅａｌｎｅｙ）によりＪ、　Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙの第１２３巻、１５４８頁（１９７
９年）に掲載されたマウスの形質細胞腫細胞ラインＰ３
−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３であり、上記の文献をここに
引用する。上記の細胞ラインは、メリーランド州、ロッ
クビルのアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクショ
ン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　［：ｕｌｔｕｒｅ　
［：ｏｌｌｅｃ−ｔｉｏｎ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　
Ｍａｒｙｌａｎｄ）から入手でき、同所ではＡＴＣＣＣ
ＲＬ−１５８０で分類されている。

ここで、抗体生産細胞と腫瘍細胞とは異なる動物種から
得られることに注意されたい。

これについては、たとえばノウインスキー等（Ｎｏｗｉ
ｎｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ、）の５ｃｉｅｎｃｅ、２１０　
：　５３７（１９８０年）収載の報文を参照された。

既述の如く、細胞融合後に、ハイブリドマを融合しなか
った細胞から分離する必要がある。抗体生産細胞は一般
に数日間培養中に死んでしまうが、腫瘍細胞は「不死」
である。

しかしながら、ＨＧＰＲＴが欠如し、ハイポキサンチン
、アミノプテリン及びチミジンを含有する培地上の融合
細胞を成長させている腫瘍細胞を用いることにより、腫
瘍細胞は上記のような培地上では生き残ることができな
いので、当然の結果としてハイブリドマを選択すること
ができる。しかしながら、その他の既知の選択技術を用
いてもよい。

ハイブリドマを選択した後に、評価を行なって塩素化ジ
ベンゾ−ｐ−ダイオキシンに対する抗体を生産するハイ
ブリドマを特定する。ハイブリドマの培養上澄み液の評
価のためには、当業者には公知の種々の免疫分析法を使
用することができる。ダイオキシン・巨大分子担体に対
する抗体類ではなく塩素化ダイオキシンのみに対するモ
ノクロナル抗体類を生産するハイブリドマ類を特定する
ように注意しなければならない。即ち、所望する有用な
本発明によるモノクロナル抗体類は遊離状態即ち複合体
を形成していない未結合の塩素化ダイオキシン類と反応
するモノクロナル抗体類なのである。

好ましい選択技法は、２，３，７．８−　Ｔ　ＣＤ　Ｄ
等の遊離状態の塩素化ダイオキシンがモノクロナル抗体
類のダイオキシン／蛋白質担体への結合を阻害する能力
の評価を行なう競合阻害酵素免疫分析法である。この技
法は、ハンター等（Ｈｕｎｔｅｒ　ａｔ　ａｌ、）によ
りＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、。

１４９：１４７〜１５１（１９８２年）に開示された方
法の修正法である。修正は、免疫複合体をつくるために
用いた位置と異なる位置に巨大分子と複合したダイオキ
シン分子をスクリーニング複合させたことである。この
ような異種スクリーニング複合体（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎ
ｅｏｕｓｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｃｏｎＪｕｇａｔｅ）を
もちいることにより免疫複合体に高められたモノクロナ
ル抗体の異種スクリーニング複合体への結合の強さが弱
くなり、塩素化ダイオキシンを競合可能な状Ｈにする。

以下の実施例においては、マウスな免疫にするためにＧ
ＩｇＧ　　２−アジパミドイル、３，７．８−　トリク
ロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシンを用い、スクリーニン
グのだめにＢＳＡ−１−アジパミドイル、３，７．８−
トリクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシンを用　　　　　
　□いた。（第１ｂ図及び第１ｃ図参照。）モノクロナ
ル抗体生産ハイブリドマを選択した後、公知の技法でハ
イブリドマから抗体を回収することができる。一般に、
１種又はそれ以上のモノクロナル抗体生産ハイブリドマ
を単性生殖させて多量のモノクロナル抗体の生産に使用
できる連続細胞ラインに展開するのがよい。

本発明のモノクロナル抗体製造のための既述の方法は、
試験管内（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）方法である。本発明は、
塩素化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシンを製造する生体内（
ｉｎ　ｖｉｖｏ）方法を含む。抗体を生産するハイブリ
ドマを組織適合性を持ツ（ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂ
ｌｅ）ホスト又は免疫抑制ホストの腹腔内に投与するこ
とにょフて抗体類を製造する。この結果、ポストは腹水
腫瘍を起こし、ハイブリドマによって生産されたモノク
ロナル抗体を含有する腹水がつくられる。充分な量の抗
体類が生産される時間が経過した後に、公知の技法によ
って抗体類を回収する。この方法は、市販できるに充分
な量のモノクロナル抗体類の製造に特に適した方法であ
る。

塩素化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシン類と反応するモノク
ロナル抗体類の製造に利用できるシステム及び方法も多
種多様であるから、下記の実施例に示したものとは異な
る多種多様なモノクロナル抗体類が得られる。しかしな
がら、本明細書の教示によって製造が可能であるこれら
のモノクロナル抗体類が本発明の技術的範囲に含まれる
ことは明らかである。本発明の目的に合致する上記の如
き抗体類の顕著な特徴は、モノクロナル抗体（ｍｏｎｏ
ｃｈｌｏｎａｌｉｔｙ）だけでなく製造に用いられたハ
イブリドマの系統、複基準、分子特定性、親和性、製造
方法及び特定の型の如何にかかわらず、塩素化ジベンゾ
−ｐ−ダイオキシン類との反応性を持つことである。

本発明のモノクロナル抗体類は、試料中に含有されてい
る塩素化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシン類、特に２，３，
７．８−　Ｔ　ＣＤ　Ｄの同定のために用いることがで
き、試料中の塩素化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシン類の濃
度測定に用いることができる。対象試料としては、土壌
、水、体液等を挙げることができる。２．３゜７．８−
ＴＣＤＤの存在又は濃度を測定するための種々の免疫分
析法における試薬として用いた場合、本発明のモノクロ
ナル抗体類の使用により分析法は改善される。検出はよ
り便利に、また迅速、鋭敏になると共に、特定性が高く
なる。本発明のモノクロナル抗体類を使用できる免疫分
析法としては、放射線免疫分析、競合免疫沈殿分析、酵
素連鎖免疫吸収分析及び免疫蛍光分析を挙げることがで
きるが、これらの免疫分析法のみに限定されるものでは
ない。

アル物質（試料）　中１７）２，３，７．８−　Ｔ　Ｃ
Ｄ　Ｄの存在又は濃度を検定ないし測定する本発明によ
る組成物は、化学物質の存在を検出するために有効な濃
度の抗体又は化学物質量の定量をするために有効な濃度
の抗体を含有している。ラテックス粒子又はプラスチッ
ク・マイクロタイター・プレートのような適当な担体と
抗体とを混合又は抗体をこれらの担体に付着させておい
てもよい。用いる免疫学的方法に応じて、抗体に酵素も
しくは色素を配合することもでき、放射能標識を付すこ
ともでキル。従ッテ、２，３，７．８−　Ｔ　ＣＤ　Ｄ
　ヲ含む塩素化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシン類と反応す
るモノクロナル抗体類を用いる分析法は全て本発明の技
術的範囲に包含される。

本発明のモノクロナル抗体類は、選択的免疫反応に基づ
いて、複雑な混合物又は溶液から塩素化ダイオキシン類
を単離、純化、中和及び／又は、除去するために使用で
きる。塩素化ダイオキシンと反応するモノクロナル抗体
の使用により、従来法は著しく改良される。これらのモ
ノクロナル抗体類を上記の応用に用いて有用性が発揮さ
れる特性は、ポリクロナル抗体類と比較した場合に認め
られる顕著な特定性と、大規模な工業的ないし商業的な
規模での使用を可能にする実際上量的に制限なく入手で
きることである。

たとえば、２，３，７．８−　Ｔ　ＣＤ　Ｄに対するモ
ノクロナル抗体を用いて、その他の塩素化ダイオキシン
類又は類似有機化合物類の混合物から２．３，７．８−
　Ｔ　ＣＤ　Ｄを分離し純化することができる。混合物
を固定化された２、３，７．８−ＴＣＤＤに対するモノ
クロナル抗体と接触させると、抗体と結合した２、３，
７．８−　Ｔ　ＣＤＤの固定複合体が形成されて２，３
，７．８−　Ｔ　ＣＤＤが混合物から分離されて、混合
物を除去した後、２，３，７．８−　Ｔ　ＣＤ　Ｄを抗
体から分離し、公知の技術により高純度のものを回収す
る。

複雑な混合物から塩素化ダイオキシンを純化ないし回収
するために用いる本発明による組成物は、許容できる基
質上に固定するか或いは許容できる担体と混合させて、
塩素化ダイオキシンとの反応及び結合が可能な状態の有
効量の本発明のモノクロナル抗体を含有する。

本発明のモノクロナル抗体類は、塩素化ダイオキシン類
、特に２，３，７．８−　Ｔ　ＣＤ　Ｄの構造及び作用
機能に関係した研究のための有用な試薬でもある。本発
明の抗体類の持つ鋭敏な特定性のために、上記の化学物
質（塩素化ダイオキシン類、特に２，３，７．８−　Ｔ
　ＣＤ　Ｄ　）の免疫化学的分析及び構造活性分析に使
用することが可能になり、特定性に乏しい従来法のポリ
クロナル抗体類と比較して上記の如き応用により適した
ものとなる。

研究試薬として使用する本発明による組成物は、塩素化
ダイオキシンとの混合及びそれに続く分析によって情報
を提供する効果を発揮する量の抗体を含有する。特定の
研究目的の達成に必要な抗体量は、特定の研究の型式に
よって定まり、これは研究を行なう研究者の技術的常識
の範囲内で容易に決定できることである。

免疫性を持つスクリーニング複合体は以下のようにして
調製された。

免疫蛋白質／ダイオキシン複合体の製造下記の免疫蛋白
質／ダイオキシンの製造方法は、アルプロ等（Ａｌｂｒ
ｏ　ｅｔ　ａｔ、）によりＴｏｘｉｃａｌ、　Ａｐｐｌ
、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、の第５０巻、１３７〜１４６
頁（１９７９年）に掲載された方法の修正法である。

２−ニトロ−３，７，８−１−ジクロロジベンゾ−ｐ−
ダイオキシン（化合物ＩＩ）を還元することにより、２
−アミノ−３，７，８−トリクロ０ジベンゾ−ｐ−ダイ
オキシン（化合物Ｉ）を製造した。木炭に担持させたパ
ラジウム８０ｍｇを含有する９５％エタノール１０＋ｎ
ｌ中に５　ｍｌの無水ヒドラジンを溶解した還流混合物
に化合物ＩＩのエタノール溶液（６ｍｇ／ｍｌ）を加え
た。原料物質を２時間還流し、濃縮し、蛍光指示薬を含
むシリカ・ゲルを用いた薄層クロマトグラム法によって
試験した。

０．１Ｍ塩化第二鉄及び０．１Ｍフェリシアン化カリウ
ムを同量（同容量）混合することにより新しく調製した
溶液を噴霧して視認観察したところ、出発原料物質であ
る化合物（ＩＩ）も還元生成物である化合物（Ｉ）も、
ともに青色のスポットを与えた。

エーテル−水（ｐＨ１１）で３回分画することにより、
生成物の純度を高めた。エーテル抽出物を処理して水を
除去し、乾燥状態になるまで濃縮した。溶剤としてクロ
ロホルム−メタノール（容積比３：１）を用い、ゲルか
らの抽出流をエーテルベスクレーピング（ｓｃｒａｐｉ
ｎｇ）シて集めることにより、調製薄層クロマトグラム
法を用いて最終的に高純度化した。

の反応 ダーハム等（Ｄｕｒｈａｍ　ｅｔ　ａｌ、）によるＯｒ
ｇａ−ｎｉｃ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、第４巻、５５６頁
（１９６３年）（この文献を参考文献として本明細書中
に引用する）に掲載の方法によって塩化メチルアジポイ
ルを調製し、真空蒸留した。化合物Ｉのエーテル溶液を
反応フラスコに加え、窒素気流下で乾固させた。５　ｍ
ｌの乾燥ピリジンを加え、消耗しながらフラスコを氷の
温度に冷却した。０．５　　ｍｌの塩化メチルアジポイ
ルを添加し、フラスコに乾燥チューブをとりつけ、１時
間反応させた。次いで、−晩、フラスコを冷蔵庫に入れ
た。

反応混合物に２０ｍ１のジエチルエーテルを加えて、炉
渦した。ろ液をＩＮ塩酸、０．４Ｍ”Ｎａ２ＣＯ３及び
飽和ＮａＣ１で抽出し、乾燥した。溶剤としてベンゼン
を用いてシリカ・ゲル上でエーテル溶液の薄層クロマト
グラフを行なった結果、残留化合物Ｉはないことがわか
った。生成物である２−メチルアジパミドイル−３，７
，８−トリクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン（化合物
ＩＩＩ）は、Ｒｆ値が高く、塩化第二鉄／フェリシアン
化カリウムの噴霧によっても反応しない。

化合物１１１のエーテル溶液を還流コンデンサを備えた
フラスコに加え、窒素雰囲気下で乾固させた。１０　ｍ
ｌの９５％エタノールで採取して、還流させた。４．７
　ｍｌのｏ、３ｐｒ＊酸化ナトリウムを加えた。混合物
を９０分間還流させ、その後酸性にしてエーテルで抽出
した。エーテル抽出物を水で洗滌し乾固させた。

加水分解生成物である２−アジパミドイル−３，７，８
−１−ジクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシンを反応フラ
スコに加え、乾固させ、過酸化物を含有しないジオキサ
ン２．４　ｍｌ中に溶解した。１５マイクロリツトルの
トリーｎ−ブチルアミンを添加した。溶液を室温で５分
間攪拌し、１０ｍ１の新しいイソブチルクロロホルメー
トを添加した。更に２０〜３０分間、攪拌を続けた。

山羊の免疫グロブリンＧとの複合 ５０ｍｇの山羊の免疫グロブリンＧを５．４５ｍ１の０
．０３７Ｎ水酸化ナトリウム溶液に溶解し、水浴で冷却
した。この溶液に４．２５〜５　ｍｌの乾燥した過酸化
物を含有しないジオキサンを加え、混合無水物溶液を滴
下添加した。１時間攪拌を続けた。更に０．１　ｍｌの
水酸化ナトリウムを追加し、反応の進行に伴なうｐＨ値
の低下を補償した。更に３時間攪拌を続行した。

時間の経過に伴なってｐＨが９〜１０から７〜８に変わ
ることにより、反応を確かめた。

４フ 免疫原の構造を第１ｂ図に示す。図かられかるように、
ＴＣＤＤ分子の２位に蛋白質が付いている。同様の化学
的手法により、ＴＣＤＤ分子の１位においてＴＣＤＤ分
子を蛋白質に付着ないし結合させることもでき、実際上
ＴＣＤＤのどの位置にも付着ないし結合させることが可
能である。蛋白質１モルに結合している２、３，７．８
−　Ｔ　ＣＤ　Ｄのモル数［エピトープ密度（ｅｐｉｔ
ｏｐｅ　ｄｅｎｓｉｔｙ）　］を算出するために、差ス
ペクトル分析を行なった。同モル容量のＧＩｇＧ　２−
アジパミドイル、３゜７．８−トリクロロジベンゾ−ｐ
−ダイオキシンと正常なＧＩｇＧ（０，ＩＮのＮａＯＨ
液）とをＵＶ（紫外線）分光光度計の試料容器及び対照
容器に入れた。２−アジパミドイル、３，７．８−　）
−リクロロジベンゾーＰ−ダイオキシンの光学濃度の差
に起因する波長である３０２ｎｍでの差向線を描いた。

以下の式から、２−アジパミドイル、３．．７．８−　
）ジクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシンの３０２ｎｍに
おける吸光係数（ξ）は３．８３　ｘｌＯ３Ｌ　−ｃｍ
−’である。

出発原料物質が１−二トロー３．７．８−１−ジクロロ
ジベンゾ−ｐ−ダイオキシンであり、複合させる蛋白質
が牛の血清アルブミン（ＢＳＡ）であること以外は、免
疫原複合体の調製方法と同じ手順でスクリーニング複合
体をつくった。スクリーニング複合体の構造を第１Ｃ図
に示しである。

２．３．７．８−　Ｔ　ＣＤ　Ｄと反応するモノクロナ
ル抗体を生産するパイブリドマの製造方法、ハイブリド
マ細胞のクーロン類（ｃｌｏｎｅｓ）を大規模に再生産
する方法及び上記クーロン類からモノクロナル抗体類を
得る方法について説明する以下の実施例を挙げて本発明
を説明する。より詳細には、以下の各実施例は、予めＧ
ＩｇＧ−２−アジパミドイル、３，７．８−トリクロロ
ジベンゾ−ｐ−ダイオキシンで免疫にしたマウスから得
た脾臓細胞（Ｂリンパ球）をマウスの形質細胞腫（ｐｌ
ａｓ、ｍａ　ｃｙｔｏｍａ）細胞と融合させる方法、そ
の結果生じるハイブリドマ、並びに２．３．７．８−　
Ｔ　ＣＤ　Ｄに対する抗体類を分泌する上記ハイブリド
マから得られる細胞を単性生殖させる方法を記載するも
のである。又、下記の各実施例には、試験管内及び生体
内技法を利用して、各々のハイブリドマ・クーロンを大
規模に製造する方法と、これらのハイブリドマから多量
の使用可能な量の２．３，７．８−　Ｔ　ＣＤ　Ｄと反
応するモノクロナル抗体類を得る方法とが記載されて６
週齢の雌性ＢＡＬＢ／Ｃマウスに、０．１５ＭＮａＣ１
に懸濁させた高純度のＧＩｇＧ−２−アジパミドイル、
３，７．８−トリクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン５
０ミクロダラムを４週間間隔で皮下注射した。最終免疫
操作の３日後に頚部脱臼により受胎（ｄｏｎｏｒ）マウ
スを殺し、無菌操作で脾臓を取り出して、冷却した５Ｉ
１１１のダルベツコの最小必須培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ
’ｓ　Ｍｉｎｉｍａｌ　Ｅｓ５ｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉ
ｕｍ；ＤＭＥＭ）を入れた径３５ｍＩＩ＋のプラスチッ
クス製ベト９皿に入れた。脾臓を解離して単一細胞懸濁
液にし、冷たいＤＭＥＭで細胞を２回洗滌し、同一培地
に再び懸濁させた。ケルニー（Ｋｅａｒｎｅｙ）により
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙの１２３
：１５４Ｂ　（１９７９年）［この文献を本明細書中に
引用するコに開示された酵素−ハイボキサンチン−グア
ニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（１（ＧＰ
ＲＴ−。

Ｅ　Ｃ２，４，２，８）の欠如した免疫グロブリンネ分
泌マウスのリンパ球細胞ライン（Ｐ３−Ｘ６３−八ｇ８
．６５３）を融合の相手として使用した。上記の細胞ラ
インは、メリーランド州、ロックビルのアメリカン・タ
イプ・カルチュア・コレクションから入手でき、当所で
はＡＴＣＣＣＲＬ−１５８０の分類番号が付されている
。１０％の牛胎児血清を含有するＤＭＥＭ中に形質細胞
腫細胞ラインを保持し、２　ｍＭのし一グルタミンと、
１％のピルビン酸ナトリウムと、１％の非必須アミノ酸
と、１００ＩＵ／ｍｌペニシリンと、１　　ｍｌ当たり
１００マイクログラムのストレプトマイシンとを補充し
た。融合前の３日間、存在する可能性のあるＨ　Ｇ　Ｐ
　ＲＴ”リバータント（ｒｅｖｅｒｔａｎｔ）を殺すた
めに、形質細胞腫細胞に０．１ｍＭの８−アザグアニン
を添加した。融合日に７５０ｍ２の培養フラスコから形
質細胞腫細胞を採取し、−回洗滌し、血清を含有しない
ＤＭＥＭ中に再懸濁させた。形質細胞腫と予め採取して
おいた脾臓細胞とを数えて、トリパン・ブルー染料空買
法（Ｔｒｙｐａｎ　ｂｌｕｅ　ｄｙｅ　ｅｘｃｌｕ−ｓ
ｉｏｎ）によって、これらの細胞の生存能力を評価した
。

用いた融合法は、ゲッター等（Ｇｅｆｔｅｒ　ｅｔａｌ
、）によりＳｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ、３　：　２３１　（１９７７年）［この文献を本明
細書中に引用する］に記載された方法の修正法である。

以下に記載するのは、ＡＴＣＣＨＢ９１８３を製造した
融合実験であり、同様の方法によって行なった他の幾つ
かの融合実験によってＡＴＣＣＨＢ　　９１８４を含む
他の幾つかのハイブリドマ・クーロン類を製造した。

５０ｍ１容の殺菌した円錐形プラスチックス・チューブ
に、Ｏｘ　１０’個の脾臓細胞と、１、Ｏｘ　１０８個
の形質細胞腫細胞とを加えた。

形質細胞腫−脾臓細胞懸濁液を室温で１０分間２５０ｇ
　（重力の２５０倍）で遠心分離し、培地を傾斜除去に
より、はぼ乾燥状態にした。指先で打って（ｆｌｉｃｋ
ｉｎｇ）細胞ベレットを穏やかに緩め、血清を含有しな
い５０％ポリエチレングリコール（分子量：１４００）
のＤＭＥＭ溶液１　　ｍｌを加えた。この工程中、チュ
ーブを緩やかに攪拌した。１分後に、更に２　ｍｌのＤ
ＭＥＭを２分間かけて添加した。次の２分間の間に、更
に２０ｍ１のＤＭＥＭを追加し、室温で１０分間２５０
ｇで遠心分離して、細胞をベレットにした。

流体を傾斜除去し、４０ｍ１の富化選択培地（ｅｎｒｉ
ｃｈｅｄ　５ｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ）を添加
した。添加した培地は、１０％の牛胎児血清を含有する
ＤＭＥＭであり、２　ｍＭのし一グルタミンと、１％の
ピルビン酸ナトリウムと、１％の非必須アミノ酸類と、
１００工Ｕ／ｌｌ１ｌのペニシリンと、１　　ｍｌ当た
り１００マイクログラムのストレプトマイシンと、ＩＩ
ＩＩＭのオキサール錯酸と、１０％のＮＣＴＣ１０９と
、１　　ｍｌ当たり０．２マイクログラムの牛パンクレ
アチン・インシュリン（ｂｏｖｉｎｅ　ｐａｎｃｒｅａ
ｔｉｃ　１ｎｓｕｌｉｎ）　とを補充したＤＭＥＭであ
る。この培地は更に、、Ｏｘ　１０−’Ｍのハイポキサ
ンチンと、　４．Ｏｘ　１０−’Ｍのアミノプテリンと
、、６　ｘ　１０−’Ｍのチミジン（ＨＡＴ）とを含有
するものであった。アミノプテリンは酵素ＨＧＰＲＴの
欠如した細胞に対する毒性を示し、従って融合しなかっ
た形質細胞腫細胞全部を殺す。融合した細胞（即ち、ハ
イブリドマ）は、融合相手であるＢリンパ球（脾臓細胞
）からＨＧＰＲＴを取得しているから、ＨＴ中でも生き
のびる。

５、Ｏｘ　１０’個の細胞を含有する０、２ｍｌずつの
容積を実施例１で製造した混合物から数枚の殺菌した平
底マイクロタイター・プレートの各穴に移した。００２
６％、空気９４％から成る湿った雰囲気中で、３７℃で
各プレートに接種した。これに続く１１日間の間、１日
おきに、新しい選択培地を添加した。

１１日目間、以下に記載する酵素免疫分析法（ＥＩＡ）
により、微小培養上澄み液について、２，３，７．８−
　Ｔ　ＣＤ　Ｄと反応する抗体類試験を行なった。高純
度のＢＳＡ−１−アジパミドイル、３，７．８−１−ジ
クロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン複合体（第１Ｃ図参
照）を塗布緩衝液（燐酸塩緩衝剤を含有する塩液（ＰＢ
Ｓ）、ｐＨ７，４）中に１　　ｍｌ当たり５マイクログ
ラムの濃度になるよう溶解し、９６大のポリ塩化ビニル
製マイクロタイター・プレート［バージニア州、チャン
テイリーのダイナチク・ラボラトリ−社（Ｄｙｎａｔｅ
ｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｃｈ
ａｎｔｉｌｌｙ、　ＶＡ　）コに５０マイクロリツトル
ずつ配分した。４℃で１晩培養した後、複合体溶液を取
り出し、各穴をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ　（０，５ｍｌ／ｌ
のＴｗｅｅｎ−２０を含有）で５回洗滌した６５０マイ
クロリツトルの試験試料を各穴に添加し、プレートを４
℃で３０分間培養し、次いでＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで５回
洗滌した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ洗滌によって分割される
最後の２工程は以下のようにして行なった。酵素アルカ
リ・ホスホラーゼ［モンタナ州、セント・ルイスのシグ
マ・ケミカル社（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、
、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）］と複合した山羊抗マ
ウスＩｇＧ／ＩｇＭの１：５００稀釈物５０マイクロリ
ツトルを加えて４℃で３０分間培養し、１０％ジェタノ
ールアミン中に１　　ｍｇ／ｍｌの濃度の溶解したｐ）
（９，８のｐ−ニトロフェニル・ホスフェート（Ｓｉｇ
ｍａ−１０４）を５０マイクロリツトル添加し、２５℃
で３０分間培養した。バイオ・チクのマイクロＥＩＡ　
（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ　ｍ１ｃｒｏ−ＥＩＡ）分光光度計［
バーモント州、ウイノスキーのバイオ・チク・インスツ
ルメンツ社（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ
。

Ｉｎｃ、、　Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、　ＶＴ）］を用い、４
０５　ｎｌ１１での吸収を読み取った。

更に、抗体類がＢＳＡ−２−アジパミドイル、３，７．
８−１−ジクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン複合体ば
かりでなく　２，３，７．８−　Ｔ　ＣＤＤと反応する
ものであることを確認するために、培養上澄み液を、Ｏ
ｘ　１０−’Ｍの２．３，７゜８−ＴＣＤＤと予め培養
した。この所謂競合阻害酵素免疫分析（ｃｏｍｐｌｅｔ
ｉｔｉｖｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅ　ｉｍ
ｍｕｎｏａｓｓａｙ；　ＣＩＥＩＡ）の結果、流体相の
２．３，７．８−　Ｔ　ＣＤ　Ｄにより抗体の固相結合
複合体への結合が阻害された。３８４の培養個所のうち
５８個所にＥＩＡが位置した（１５％Ｆ）のに対し、僅
かに６個所だけにＣＩＥＩＡが位置した（、５％、即ち
、４　ｘ　１０−’Ｍの２゜３．７．８−ＴＣＤＤによ
り少なくとも５０％の阻害が認められた）。陽性培養物
を展開して多数にして、３５　　ｃｍ’容のフラスコに
移した。これらの培養物から得た培地を再試験し、抗体
分泌性を維持しているものを冷凍保存し、液体窒素蒸気
相中で一１７９℃で貯蔵した。

実施例２に記載の陽性ハイブリドマ培養物の１つを選択
して、制限稀釈（ｌｉｍｉｔｉｎｇ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ
）により単性生殖（ｃｌｏｎｉｎｇ）させた。０〜１個
の細胞を含む１００マイクロリツトルずつの部分標本を
、ハイブリドマの「フィーダ４　（ｆｅｅｄｅｒ）細胞
として働くマウス脚線細胞を予め接種しておいた殺菌し
た平底マイクロタイター・プレートの数百の各穴に移し
た。

１４日後に、ＥＩＡ及びＣＩＥＩＡを用いて単性生殖さ
せた培養物の２．３，７．８−　Ｔ　ＣＤ　Ｄに対する
抗体反応性を再試験し、更に研究を進めるために陽性ク
ローンの１つを選択した。アメリカン・タイプ・カルチ
ュア・コレクションに受付番号ＡＴＣＣＨＢ　　９１８
３で寄託されている単性生殖又は単性培養ハイブリドマ
の数を増やして、冷凍保存し、このハイブリドマを誕導
したもとの親細胞ラインと同様にして貯蔵した。

実施例２に記載したＥＩＡ及びＣＩＥＩＡによるＡＴＣ
ＣＨＢ　　９１８３の試験を行なった。］ｊＡにおいて
、　　１　　ｍｌ当たり５マイクログラムのＢＳＡ−１
−アジパミドイル、３，７．８−トリクロロジベンゾ−
ｐ−ダイオキシン複合体をマイクロタイター・プレート
に塗布した。培養上澄み液から得たＡＴＣＣ１（Ｂ　　
９１８３抗体類についての滴定曲線を第２図に示す。

抗体類が遊離のＴＣＤＤと反応することを確認するため
に、ＣＩＥＩＡを行なった。この分析は、異なる濃度の
２．３．７．８−　Ｔ　ＣＤ　Ｄを用いて１時間抗体類
の予備培養を行なったこと以外は、実施例２に記載の純
粋（ｓｔｒａｉｇｈｔ）ＥＩＡと同様である。溶液中で
の抗体類と２．３，７．８−　Ｔ　ＣＤ　Ｄとの相互反
応により、固体相の複合体との結合が阻止されて、最終
発色反応が減る。濃度を変化させたＴＣＤＤのベンゼン
溶液をガラス管に加えた後、窒素吹付けにより乾燥させ
る。培養上澄み液から得たＡＴＣＣＨＢ　　９１８３の
１：５稀釈物をＰＢＳに添加し、室温で１時間培養し、
混合物を塗布後のマイクロタイター・プレートに添加し
た。第３図の直線状の線は抗体が直接に遊ｌ！１ｔＴｃ
ＤＤと結合することを示しており、この線は未知試料中
のＴＣＤＤの濃度を定量するために上記の抗体が有用で
あることを示すものである。

実施例１に記載の補充物を加えたＤＭＥＭを入れた７５
ｃｍ２容の培養フラスコ中でＡＴＣＣＨＢ　　９１８３
を静置培養した。６％ＣＯ２存在下、３７℃で５〜７日
間培養した後、１　　ｍｌ当たり約１０マイクログラム
の抗２．３，７．８−　Ｔ　ＣＤ　Ｄ抗体を含有する培
養流体１〜２リツトルを得た。

多量のモノクロナル抗体類を得るための生体内法は、Ａ
ＴＣＣＨＢ９１８３を腹水腫（ａｓｃｉｔｅｓ　ｔｕｍ
ｏｒ）　として生長させる適応化を含む方法である。Ｑ
、５　ｍｌのブリスタン（２゜６．１０．１４−テトラ
メチルペンタデカン）を腹腔内に注入することにより、
雌性Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃマウスをプライム化（ｐｒｉｍ
ｅｄ）　Ｌ／た。ブリスタンは、マウスの腹腔内で生長
培地として作用する漿水の分泌（腹水腫）を誘起する殺
菌刺激剤である。ブリスタン注入後約７〜１０日後に、
実施例４で記載した生体内培養物から取得した１、Ｏｘ
　１０’個の生長活性を持つハイブリドマ細胞を含有す
る部分標本をプライム化されたマウスの腹腔に接種した
。ハイブリドマ細胞を１〜２週間間隔で新たにプライム
化したマウスに次々と継代接種した。３〜４回の継代接
種後に、ＡＴＣＣＨＢ　　ｃｉｔａ３ハイブリドマは腹
水腫に良く適応するようになり、マウスの腹腔内の流体
マイクロ７囲気中で迅速に成長するようになり、多量（
たとえば２〜１０　　ｍｇ／ｍｌ）の２．３，７．８−
　Ｔ　ＣＤＤと反応するモノクロナル抗体類を分泌する
ようになる。吸引により、各マウスから５〜１０ｍ１の
腹水流体を毎日採取した。抗体含有流体相から抗体分泌
腫瘍細胞を分離して、他のプライム化マウスに再注入し
、この工程を繰り返した。

【図面の簡単な説明】

第１ａ図は、２，３，７．８−テトラクロロジベンゾ−
ｐ−ダイオキシンの構造式を示す図である。 第１ｂ図及び第１Ｃ図は、２，３，７．８−トリクロロ
ジベンゾ−ｐ−ダイオキシンと蛋白質との複合体の構造
式を示す図である。 第２図は、ＡＴＣＣＨＢ　　９１８３抗体類に関する滴
定曲線である。 第３図は、ＴＣＤＤのモル濃度と溶液の４０５ｎｍにお
ける光学濃度との関係を示すグラフである。 ２．３，７．８−＋トラフ　ｏ　ａ　”／”Ａ”ゾニＰ
−Ｖ（ＪＴｙンＩ ２−７シ）＼９ミドイ化、う、７．？−ト１１７０す゛
べ′ンゾー？−ダ硝キレンソ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、塩素化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシンと反応するモノ
   クロナル抗体類の製造方法であって、前記の塩素化ジベ
   ンゾ−ｐ−ダイオキシンと巨大分子担体との免疫原複合
   体を生成させ、動物を前記複合体に対して免疫にし、前
   記動物から抗体製造細胞を得、前記細胞を腫瘍細胞と融
   合させて複数のハイブリドマ（混成種）を生成させ、前
   記の複数のハイブリドマから前記の塩素化ジベンゾ−ｐ
   −ダイオキシンと反応する抗体類を製造する少なくとも
   １種のハイブリドマを選択し、前記の選択されたハイブ
   リドマから製造された抗体類を回収することを特徴とす
   る方法。 ２、塩素化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシンが２，３，７，
   ８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシンであるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３、免疫にする動物がねずみ類動物であることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の方法。 ４、腫瘍細胞がマウスの形質細胞腫細胞であることを特
   徴とする特許請求の範囲第１項、第２項又は第３項に記
   載の方法。 ５、ハイブリドマがＡＴＣＣ　ＨＢ　９１８３、又はＡ
   ＴＣＣ　ＨＢ　９１８４、又はこれらの突然変異種もし
   くは変種の特性を持つことを特徴とする特許請求の範囲
   第１項、第２項、第３項又は第４項に記載の方法。 ６、２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイ
   オキシン（２，３，７，８−ＴＣＤＤ）と反応するモノ
   クロナル抗体類の製造方法であって、前記の２，３，７
   ，８−ＴＣＤＤと蛋白質との免疫原複合体を生成させ、
   マウスを前記複合体に対して免疫にし、前記マウスの脾
   臓から抗体製造細胞を回収し、前記の抗体製造細胞を酵
   素ハイポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トラ
   ンスフェラーゼの欠如したマウスの形成細胞腫細胞と融
   合させて複数のハイブリドマを形成させ、ハイポキサン
   チンとアミノプテリンとチミジンとから成る培地中で成
   長させることにより前記の複数のハイブリドマから少な
   くとも１種のハイブリドマを選択し、遊離の状態即ち複
   合体を形成していない状態の２，３，７，８−ＴＣＤＤ
   に対する抗体を生成する前記の少なくとも１種のハイブ
   リドマを同定し、同定された前記ハイブリドマを培養し
   て回収可能な量の前記抗体を製造し、培養された前記ハ
   イブリドマによって製造された抗体類を回収することを
   特徴とする方法。 ７、２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイ
   オキシンに対するモノクロナル抗体類の製造方法であっ
   て、ＡＴＣＣ　ＨＢ　９１８３又はＡＴＣＣ　ＨＢ　９
   １８４又はこれ らの突然変異種もしくは変種の特性を持つハイブリドマ
   を培地中で培養し、前記培地から前記抗体類を回収する
   ことを特徴とする 方法。 ８、塩素化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシンと反応するモノ
   クロナル抗体類の生体内製造方法であって、前記抗体類
   を製造するハイブリドマを組織競合性ないし免疫抑制ホ
   ストの腹腔内に入れ、前記ホストの腹水から製造された
   抗体類を回収することを特徴とする方法。 ９、塩素化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシンが２，３，７，
   ８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシンであるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第８項に記載の方法。 １０、ホストがねずみ類動物であることを特徴とする特
   許請求の範囲第８項又は第９項に記載の方法。 １１、ハイブリドマがＡＴＣＣ　ＨＢ　９１８３又はＡ
   ＣＴＴ　ＨＢ　９１８４又はこれらの突然変異種もしく
   は変種の特性を持つことを特徴とする特許請求の範囲第
   ８項、第９項又は第１０項に記載の方法。 １２、塩素化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシンに対するモノ
   クロナル抗体類を生成する連続細胞ラインの製造方法で
   あって、前記の塩素化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシンと巨
   大分子担体との免疫原複合体を生成させ、動物を前記複
   合体に対して免疫にし、前記動物から抗体製造細胞を得
   、前記抗体製造細胞と腫瘍細胞とを融合させて複数のハ
   イブリドマを生成さ せ、前記の複数のハイブリドマから前記の塩素化ジベン
   ゾ−ｐ−ダイオキシンと反応する抗体類を製造するハイ
   ブリドマを選択し、選択された前記ハイブリドマを無性
   生殖的にふやして細胞ラインにすることを特徴とする 方法。 １３、塩素化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシンが２，３，７
   ，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシンである
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１２項に記載の方法
   。 １４、前記抗体が塩素化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシンと
   反応することを特徴とするモノクロナル抗体製造ハイブ
   リドマ。 １５、塩素化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシンが２，３，７
   ，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシンである
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１４項に記載のハイ
   ブリドマ。 １６、前記ハイブリドマが、ＡＴＣＣ　ＨＢ９１８３又
   はＡＴＣＣ　ＨＢ　９１８４又 はこれらの突然変異種もしくは変種の特性を持つことを
   特徴とする特許請求の範囲第１４項又は第１５項に記載
   のハイブリドマ。 １７、塩素化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシンと反応するこ
   とを特徴とするモノクロナル 抗体。 １８、塩素化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシンが２，３，７
   ，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシンである
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１７項に記載の抗体
   。 １９、前記抗体が、特許請求の範囲第１２項又は第１３
   項に記載の方法によって製造された細胞ラインから回収
   されたものであることを特徴とするモノクロナル抗体。 ２０、前記抗体がハイブリドマから回収されたものであ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１７項又は第１８
   項に記載の抗体。 ２１、ハイブリドマが、ＡＴＣＣ　ＨＢ　９１８３、又
   はＡＴＣＣ　ＨＢ　９１８４、又はこれらの突然変異体
   もしくは変種の特性を持つことを特徴とする特許請求の
   範囲第２０項に記載の抗体。 ２２、免疫分析法により試料中の２，３，７，８−テト
   ラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン （２，３，７，８−ＴＣＤＤ）の存在又は濃度を測定す
   る方法であって、前記免疫分析法で用いる試薬として、
   前記の２，３，７，８−ダイオキシンと反応するモノク
   ロナル抗体を使用することを特徴とする方法。 ２３、試料中の２，３，７，８−ＴＣＤＤの存在又は濃
   度を検出する方法であって、前記試料に前記の２，３，
   ７，８−ＴＣＤＤと反応するモノクロナル抗体を添加し
   、前記のモノクロナル抗体を試薬として使用する免疫分
   析法により前記の２，３，７，８−ＴＣＤＤの存在又は
   濃度を測定することを特徴とする方法。 ２４、モノクロナル抗体を使用することを特徴とする２
   ，３，７，８−ＴＣＤＤに対する特異的抗体との選択的
   免疫学的反応に基づいた混合物からの２，３，７，８−
   ＴＣＤＤの単離又は除去を行なう免疫学的手法。 ２５、２，３，７，８−ＴＣＤＤを含有する物質を前記
   の２，３，７，８−ＴＣＤＤと反応する固定モノクロナ
   ル抗体類と接触させることにより、前記抗体と前記の２
   ，３，７，８−ＴＣＤＤとの固定複合体を形成させて前
   記物質から固定モノクロナル固体類を分離し、前記の固
   定抗体類から前記の２，３，７，８−ＴＣＤＤを分離し
   て２，３，７，８−ＴＣＤＤを高純度の状態で回収する
   ことを特徴とする２，３，７，８−ＴＣＤＤの高純度化
   方法。 ２６、２，３，７，８−ＴＣＤＤの生化学的、免疫学的
   、機能的又はその他の研究分析法であって、２，３，７
   ，８−ＴＣＤＤと反応するモノクロナル抗体を前記分析
   に有効な量使用することを特徴とする分析法。 ２７、試料中の２，３，７，８−ＴＣＤＤの存在又は濃
   度の測定組成物であって、有効量の２，３，７，８−Ｔ
   ＣＤＤと反応するモノクロナル抗体が許容できる担体に
   担持された組成物から成ることを特徴とする測定組成物
   。 ２８、２，３，７，８−ＴＣＤＤを含有する混合物から
   ２，３，７，８−ＴＣＤＤを単離又は除去するための組
   成物であって、２，３，７，８−ＴＣＤＤと反応するモ
   ノクロナル抗体の有効量を含有し、前記モノクロナル抗
   体が許容できる母材に固定されているか又は許容できる
   担体との混合物であることを特徴とする組成物。 ２９、２，３，７，８−ＴＣＤＤの高純度化に用いる組
   成物であって、２，３，７，８−ＴＣＤＤと反応するモ
   ノクロナル抗体が許容できる支持体又は担体上に固定さ
   れて成ることを特徴とする組成物。 ３０、２，３，７，８−ＴＣＤＤの生化学的、免疫学的
   、機能的、又はその他の研究分析法で用いる組成物であ
   って、有効量の２，３，７，８−ＴＣＤＤと反応するモ
   ノクロナル抗体が許容できる担体に担持されていること
   を特徴とする組成物。