JPH01227960A - 固相法によるアンジオテンシン１の酵素免疫化学的測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明はアンジオテンシンｌの測定方法に関するもので
ある。 更に詳しく述べれば、本発明は固相法によるアンジオテ
ンシンＩの酵素免疫化学的測定方法（Ｂｎｚｙｍｅ　Ｉ
ｍｍｕｎｏ　Ａｓ５ａｙ、　　以下ＥＩＡという）に関
するものである。 〔従来の技術〕 アンジオテンシン１は蛋白分解酵素の一つてあるレニン
によってアンジオテンシノーゲンから生成するデカペプ
チドであり、アンジオテンシン変換酵素によって分解さ
れ、血圧上昇物質の一つであるアンジオテンシンＨに変
換する。 このレニン−アンジオテンシン系に作用する高血圧治療
剤は現在多くの注目を集め、種々の化合物が検討されて
いる。 このような薬物の効果判定において血中のアンジオテン
シンＩの生成量を測定することは極めて重要であり、す
でにいくつかの測定方法が考案されている。しかしなが
ら、これまで行われ−Ｃいる測定方法は１２５１などの
ような放射性同位元素で標識したアンジオテンシン■を
用いる、いわゆる放射免疫化学的測定方法（Ｒａｄｉｏ
　Ｉｍｍｕｎｏ　Ａｓ５ａｙ。 以下ＲＩＡという）がほとんどである。 ＲＩＡは放射性同位元素を用いるため、その測定におい
て特殊な装置や施設を要し、しかも取り扱いに充分な注
意を払う必要がある。また、これまで行われている方法
は感度が低く、微量のアンジオテンシンＩを測定するに
は不適当なものであった。 本発明のようにＥＩＡによるアンジオテンシンＩの測定
方法も報告されている。しかしながら、この方法は標識
化アンジオテンシンＩと非標識アンジオテンシンＩを競
合的に抗体と反応させた後、別の抗体を加えて結合体の
アンジオテンシン■と結合させ、沈殿させた後酵素活性
を測定するいわゆる第二抗体法と呼ばれる方法である。 この方法はＲＩＡによる難点をある程度解決しているも
のの、なお操作が煩雑であるなどの欠点を有するもので
ある。 〔発明が解決しようとする課題〕 従来知られている゛ｒアンジオテンシンの測定方法はＲ
ＩＡあるいは第二抗体法によるＥＩＡなどである。前者
は測定に特殊な装置や施設を要し、取り扱い上の安全性
に問題があり、測定感度も低いなどの欠点を有しており
、後者は結合体と遊離体の分離（以下Ｂ／Ｆ分離という
）の操作が煩雑で手間を要し、−度に大量の試料を測定
することが出来ないなどの問題点をもつものである。 このため簡便に、−度に多くの試料を測定でき、しかも
安全で、感度の高い測定方法の開発が望まれていた。 〔課題を解決するための手段および作用〕本発明者らは
先に述べた問題点を解決すべく検討した結果、抗アンジ
オテンシンＩ抗体を固相化したマイクロプレートに、ア
ンジオテンシンＩを含む試料およびβ−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼで標識化したアンジオテンシンＩの溶液をのせ、
競合的に抗体と結合したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼーア
ンジオテンシンＩの酵素活性を蛍光的に測定することに
より試料中のアンジオテンシンＩの含量をきわめて感度
よく、簡便に、しかも−度に多数の試料について測定で
きることを見出し、本発明を成すに至った。 すなわち、本発明は固相法によるアンジオテンシンＩの
酵素免疫化学的測定方法を提供するものである。 本発明において使用されるマイクロプレートは通常のＥ
ＩＡに使用されるマイクロプレートであればどのような
材質のものであっても用いることができる。ただし、抗
体を固相化する際に各人への抗体の固相化が常に一定量
ずつ均等に行われる必要があるので、各人の径、深さ、
表面積が均一のものを使用しなければならない。 固相化に使用する抗体は通常の抗体作製方法に従って調
製される。例えば、アンジオテンンンＩ−牛血清アルブ
ミン複合体を抗原として免疫した家兎血清より得ること
ができる。 抗体を固相化したマイクロプレートは保存可能であり、
あらかじめ大量に作成しておくことにより、常に測定に
必要な抗体を確保しておくことができる。また、大量の
試料にも対応することができる。 β−〇−ガラクトシダーゼーアンジオテンシン■は通常
知られているＮ−（ｍ−マレイミドベンゾイルオキシ）
サクンンイミド法（以下ＭＢＳ法という）に従い、Ｎ−
（ｍ−マレイミドベンゾイルオキシ）アンジオテンシン
Ｉを作製し、これとβ−Ｄ−ガラクト／ダーセを反応さ
せ°ることにより製造することができる。 このβ−Ｄ〜ガラクトシダーセーｒンジオテンシン１の
酵素の反応効率は測定感度に直接影響を与えるため、で
きるだけ高い反応効率をも一つ方が好ましい。 従来知られている方法によって製造されるβ−Ｄ−ガラ
クトシダーゼーアンジオテンシンＩは全酵素活性の３６
％が抗体反応性を有し、これを用いた場合の測定感度は
低く、微量のアンジオテンシン１を含む試料の測定には
不充分であった。 本発明者らはこの反応効率を一トげるべく検討した結果
、Ｎ−（ｍ−マレイミドベンゾイルオキン）アンジオテ
ンシンＩとβ−Ｄ−ガラクトシダーゼをモル比１４：ｌ
の割合で反応した時に最も反応効率の高いものが得られ
ることを見出した。 このようにして製造されるβ−Ｄ−ガラクトシダーセー
アンジオテンシンＩの反応効率は４４．８％と高く、こ
れを用いることにより感度の高い測定をすることができ
る。 標識酵素の基質としては、ＥＩＡで通常用いられるβ−
Ｄ−ガラクトシダーゼの蛍光基質であればよく、例えば
、４７チルウンベリフエリルーβ−Ｄ−ガラクトシドな
どをあげることができる。 本発明の測定方法を好適に実施するには、例えばアンジ
オテン／ンＩ−牛血清アルブミンで免疫した家兎血清よ
り採取した抗°ｒンジオテンシンＩ抗体をマイクロプレ
ートの各人に等量ずつのせて吸着させた後、緩衝液で遊
離の抗体を洗浄する。 試料溶液およびβ−Ｄ−ガラクト／ダーゼーアンジオテ
ンンンＩ溶液を一定量ずつ加え４℃で−・夜装置して競
合的に結合させる。遊離のアンジオテンシンＩを緩衝液
で洗浄した後、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−
ガラクトンド溶液を加え、１時間後反応停止液を加えて
反応を停止し、分解した４−メチルウンベリフェロンを
蛍光的に測定する。あらかじめ作成した標１９曲線によ
り試料中の−ｒアンジオテンシン含量を換算する。 〔発明の効果〕 本発明の固相法によるアンジオテンシンＩのＥ　Ｉ　Ａ
　ハｇ度カＪ、　＜　、絶対Ｑテ０．２３　ｐｇ〜５０
０　ｐｇの範囲であれば測定可能である。 また、本発明の固相化抗体は保存可能であるので、あら
かじめ大量に作成しておくことにより、いつでも必要時
に使用に供することができ、大量の試料に対しても対応
することができる。 さらに、測定においてＲＩＡのような特殊な装置、設備
も不要であり、第二抗体法によるＥＩＡのような煩雑な
り／Ｆ分離操作をすることもないので、きわめて安全で
簡便な方法である。 〔実施例〕 本発明の内容を以下の実施例により更に詳細に説明する
。 抗アンジオテンシンＩ抗体の作成 アンジオテンシン１７．５ｍｇと牛血清アルブミン３０
ｍｇを蒸留水ｌＯ−に溶解し、ゆっくりかきまぜながら
、その中に６０ｍｇ／！の１−エチル−３−（３−ジメ
チルアミノプロピル）カルボジイミド溶液０．５−を滴
下し、さらに室温で１晩ゆっくりかきまぜてカップリン
グ反応を行った。反応液を蒸留水に対し４℃で４８時間
透析を行った後、凍結乾燥して抗アンジオテンシンｌ−
４＋血清アルブミン複合体を得、４℃にて保存した。 得られたアンジオテンシンＩ　牛血清アルブミン複合体
１　ｍｇを生理食塩水１献に溶解した後、等量のコンプ
リート　フ■】イド　アジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ
　Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　ａｄＪｕｖａｎｔ）と充分に混和
し、ウサギの背部皮下に数ｉ゛ケ所分けて皮ド注射を行
った。２週間後、同量を背部皮ドに注射した後、さらに
２週問おきに３回同量を大腿部分に注射して追加免疫を
行った。抗体の力価が充分高まったところで頚動脈から
全採血を行い、血清を分取した。 得られた抗アンジオテンンンＩ抗血清は、農林希釈倍率
１１３５０圓で、′２５１で標識したアンジオテンシン
Ｉの５０％が結合した。 β−Ｄ−ガラクトンダーセーアンジオテンシン１の調製 アンジオテンシンＩ　　２　ｍｇ　（１，５μｍｏｌｅ
）　　を１１ＴＬｉ２の０．１　Ｍ−ＩＪン酸す）　Ｉ
Ｊウム緩衝液（ｐｌ＋　７．０）に溶解し、これに５　
ｍｇ／　ｍｌ）のＮ−（ｍ−マレイミドベンゾイルオキ
／）スクンンイミドのデトラヒド１１フラン溶液０．４
−を加え、３０℃で３０分間反↓ａ１させた。反応液に
エタノール２献上エーテル２０〜２５ｍｊ２を加えてか
きまぜ、析出する白色沈、殿をイ）取、エーテルで２回
洗浄後乾燥して、Ｎ−（ｍ−マレイミドベンゾイルオキ
シ）アンジオテンシンＩを得た。得られた標品を少量の
２５％エタノールに溶解し、メルカプトエタノールと反
応させ、残存したＳｌ＋基を定量することにより、この
標品のマレイミド残基ｔを測定した結果、５０通当たり
２８　ｎｍｏｌｅであった。 Ｅ、　［：ｏｌｉ由来、β−，Ｄ−ガラクトノダーセ（
Ｂｏｅｒ　ｉｎｇｅｒ社製品）０．５ｍｇ（約ｌ　ｎｍ
ｏｌｅ）をｌ　ｍｅの０．１Ｍ−リン酸ナリトウム緩衝
液（ｐ＋＋　７．０）に溶かし、この溶液を激しくかき
まぜながら、１２．５Ｊ、２５通、５０ｄおよび１００
　ｄ　（それぞれマレイミド残基量にして７．１４．２
８および５６　ｎｍｏｌｅ）の＼−（ｍ−マレイミドベ
ンゾイルオキシ）７ンンオテンンンｌの２５％エタノー
ル溶液を少量ずつ滴下した。３０℃で２０分間反応させ
た後、直しにセントリフ、］　−ＣＦ３０＾（アミニ］
ン社製品）により遠心濾過を行い、未反応のＮ−（ｍ−
マレイミドベンゾイルオキシ）アンジ」テンシンＩを除
去した。次いで、セファロース４Ｂ　（Ｓｃｐｈａｒｏ
ｓｅ　４Ｂ）カラ１８りｌＪ７トグラフイーによりｆＡ
ｆｆして、β−Ｄ−ガラクトシダーゼの酵素活性画分と
アンジオテンシンＩの免疫活性画分が一致するβ−Ｄ−
ガラクトンダーセーアンジオテン／ンＩの両分を集め濃
縮した。 相用らの方法〔エンドクリノロジー（Ｅｎｄｏｃｒｉ−
ｎｏｌｏｇｙ）　　、１０５　巻、１　号、１〜６ペー
ジ、１９７９年〕に従って抗体反応性を有する酵素活性
場を測定したことろ、１４：ｌと２８，１のモル比で反
応させた場合の標品が高い値を示し、それぞれ全酵素活
性の４４．８％と３１．２％が抗体反応性を有していた
。 以後のＥｌΔには、上記で得た標識アンジオテンシン１
のうち、ｌ　ｎｍｏｌｅのβ−Ｄ−ガラクトシダーゼに
対し、マレイミド残基にして１４　ｎｍｏｌｅのＮ−（
ｍ−マレイミドベンゾイルオキシ）アンジオテンシンＩ
を反応させて得られたβ−Ｄ−ガラクトシダーゼーアン
ジオテンシンＩを用いた。 なお、図１にはセファロース４［）　カラトによるβ−
Ｄ　−カラクトンダーゼーアンジオテンンンＩの精製パ
ターンを示した。 マイクロプレートによるト′、ＩΔ随作１、　抗体の固
相化 ０．１Ｍ−塩化ナトリウム、ｌ　ｍＭ−塩化マグネシウ
ム、０．１％−アジ化ナトリウムを含む２０　ｍＬ　）
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）を用いて抗アンジオデ
ンシンＩ抗血清を１０．０００倍に希釈した抗体溶液１
００通を、ＥＩＡ用９用穴６六マイクロプレートＮｕｎ
ｃ−１ｍｍｕｎｏ　Ｐｌａｔｅ　ｌ）　　の各人に入れ
、３７℃で１時間保温して抗体を物理的に吸着さげた。 次に０．５％−牛血清アルブミン、０．１％−アジ化ナ
トリウムを含む０．１Ｍ−）リス−塩酸緩衝液１００成
を加え３７℃で３０分保温後、内容物をアスピレータ−
により除去し、０．０５％家兎血清アルブミン、ｌ　ｍ
Ｍ−塩化マグネシウム、０．１Ｍ−塩化ナトリウｌ８．
０．１％　アジ化ナトリウムを含む２０　ｍＭ−＋）ン
酸ナトリウノ、緩衝液（ｐ）１７．０）（以下緩衝液入
という）２００通で２回洗浄を行った後、ＣＩＡに使用
した。保存する場合は緩衝液入を２００　ｄ入れて使用
時まで４℃で保管した。 ２、　抗原抗体反応 標準曲線作製用のアンジオテンシンＩ溶液（５ｎｇ／ｆ
ｆｌ７！〜２．３　ｐｇ　／−のアンジオテンシン１を
含む緩衝液への溶液）、または試料溶液１００通を抗体
固←目化マイクロプレートに加え、５分以上放置した後
、緩衝液Ａで原液を５Ｘ１０５　倍に希釈した５０〜６
０μｕｎ口のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼーアンジオテン
ンンＩ溶液１００Ｊを追加して室温で３０分間放置し、
さらに４℃で一晩反応させた。反応後′ｒスピレークー
で内容物を除去し、さらに緩衝液Ａ２００ｉで１回洗浄
した。 ３、　β−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性の測定洗浄後のマ
イクロプレートに０．１ｍＭの４−メチルウンベリフェ
リル−β−Ｄ−ガラクトシドを含む緩衝液Ａを２００１
加え、３０℃で１時間反応させた。 ０．１！ｌ−グリシン−水酸化ナトリウｌ、　４１衝液
（ｐＨ１０、３）　　を２００Ｊ加えて反応を停止させ
、生成した４−メチルウンベリフェロンの蛍光を励起波
長３６０ｎｍ、蛍光波長４５０　ｎｍて測定した。 なお、蛍光強度の標

【９物質として４−メチルウンベリ
フエ【１ン溶液を用い、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ−ア
ンジオテンシンＩの量は、−ｔ−記の条）′１で１　μ
ｍｏｌｅの４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄガラク
トシドを氷解する酵素活性を１ユ；−ントとして表示し
た。 標準曲線の作製 上記の標準曲線作製用アンジオテンシンＩ溶液を用いて
、ＥＩＡによる標１φ曲線を作製した。結果は図２に示
す通りであった。本発明のＥＩＡ法での最小検出感度は
０．２３　ｐｇ　（Ｂ／Ｂｏ％９５％Ｉｎｔ［！ｒ−ｃ
ｅｐｔ値）であり、０．２３〜５００　ｐｇ／１ｕｂｅ
　の間で安定した標準曲線が得られた。 ＥＩＡ用試料の１ 採血は、血液１ｄに対し０．０３！、１−フェナンスＩ
】リン、０．１！、１−エチレンノアミン四酢酸（［１
ＤＴＡ）および２　ｇ／β不コマインンを含むプロテア
ーゼ阻害剤溶液２５扉を入れたポリスチレンチューブ中
にて行い、採血後直しに４℃で遠心分離してプラズマを
得た。 得られたプラズマよりＮｕｓｓｂｅｒｇｅｒらの方法〔
ハイバーテンンヨン　サブリメントＩ　（ＨＹＰＥＲＴ
ＥＮＳＩＯＮＳｕｐｐｌ、ｌ）　、７巻、３　け、１〜
７ページ、１９８５年〕に従ってアンジオテンシン１の
抽出を行った。まず、ボンドエル−）　（Ｂｏｎ＋Ｊ　
Ｅｌｕｔ）　ｐｔｌカートリッジカラム（＾ｎａｌｙｔ
＋ｃｈｅｍ社製品）をメタノールおよび蒸留水器１ｍ７
！を順次流して活性化した後、プラズマ　０，５ｉをカ
ラムにかけ、蒸留水１薇で洗浄した。メタノール０．５
　ａ　ヲ辿してアンジオテンシンＩを溶出し、溶出液を
ポリプロピレンチューブ中に集め、窒素ガスあるいは遠
心エバポレーターを用いて蒸発乾固した。残留物を１５
０　ｔｔｌの蒸留水に溶解し、４０扉をＥ　ＩΔ試料さ
して用いた。 再現性試験 上記の方法に従い、大プラズマよりアンジオテンシンＩ
を抽出後、ＥＩＡを行うことにより、その同時再現性、
経時再現性および添加回収率を調べた。 〔同時再現性〕　：ａ度の異なる４種類の犬プラズマを
用い各々１０ないし１２回測定した。結果はＦ表に示す
通りであった。 Ａ　　　１０　　　　５．２　　　０．９７　　１８．
７Ｂ　　　１２　　　１６．４　　　０．９１　　　５
．５ＣＩ２　　　７７．７　　　６，３８　　　８．２
Ｄ　　　１０　　　１０４．９　　１０．４７　　１０
．０〔経時再現性〕　：濃度の異なる３種類の大プラズ
マを用いて５回測定した。結果はＦ表に示す通りであっ
た。 Δ　　　　　５　　　　　２７，２　　　　　４．８０
　　　　１７．６Ｂ　　　　　　５　　　　　６７．３
　　　　１１．２５　　　　１６．７Ｃ５２５１１１６
，１４６，４ 〔添加回収率〕：抽出萌の大プラズマに既知のアンジオ
テンノンＩを添加し抽出操作およびＥ＝：　Ｉ　Ａを経
てその回収率を求めた。結果は下表に示す通りであ−う
た。 １２．１：ｊ２．７ １５．６　　　　２８．５−Ｉ：０．３　　　１６．４
　　１０５３＋、　３　　　　４３．６鼾４．２　　　
３１．５　　１０１１２５　　　　１３２、３±１８．
５　　１２０２　　　９６２５０　　　　２６３．０±
１３．４　　２５０．９　　１００アンジＡデン／ン変
換酵、！Ｌ：阻害薬であるカブトプリルをピーグル大６
頭に各々体？Ｉｊ　ｌ　ｋｇ当たり１０ｍｇずつ経口投
与した後、経時的に採血をｆｉい、プラズマ中のアンジ
オテンシンＩを抽出後、その濃度を本発明のＥＩＡによ
り測定した。結果は図３に示す通りであった。

【図面の簡単な説明】

図１はセファロース４Ｂカラムクロマトクラフイーによ
るβ−Ｄ−ガラクトシダーゼー′ｒンジオテンンン１の
精製パターン図である。横軸はフラクション番号、縦軸
はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの酵素活性（蛍光強度）お
よびアンジオテンシン１の免疫活性をそれぞれ左と右に
［」盛ったものである。 図２は標準曲線作製用゛ｒアンジオテンシン溶液を用い
た、本発明のＥＩＡによる標準曲線図である。横軸は非
標識アンジオテンシンＩの晴（ｐｇ／１ｕｂｅ）であり
、縦軸は標識アンジオテンシンＩの結合率（Ｂ／Ｂｏ％
）を示す。 図３はカプトプリル投与前後のプラズマアンジＡデンン
ン１の交切を示ずクラ７である。横軸は投Ｉｊ後の経過
時間（採血時、時間）であり、縦軸はプラズマｌｄ中の
アンジオテンノンＩの測定量（ｐｇ／　ｄ　）を示す。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）抗アンジオテンシン I 抗体を固相化したマイク
   ロプレートにアンジオテンシン I を含む試料およびβ
   −Ｄ−ガラクトシダーゼで標識化したアンジオテンシン
   I の溶液をのせ、競合的に抗体と結合したβ−Ｄ−ガ
   ラクトシダーゼ−アンジオテンシン I の酵素活性を蛍
   光的に測定することにより試料中のアンジオテンシン
   I の含量を換算することを特徴とする、固相法によるア
   ンジオテンシン I の酵素免疫化学的測定方法。
2. （２）抗体としてアンジオテンシン I −牛血清アルブ
   ミン複合体で免疫した家兎血清より作製した抗アンジオ
   テンシン I 抗体を用い、標識化酵素の基質として４−
   メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドを用い
   ることを特徴とする請求項第１項の固相法によるアンジ
   オテンシン I の酵素免疫化学的測定方法。
3. （３）Ｎ（ｍ−マレイミドベンゾイルオキシ）アンジオ
   テンシン I とβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを、モル比１
   ４：１の割合で反応させて得られるβ−Ｄ−ガラクトシ
   ダーゼ−アンジオテンシン I 。
4. （４）Ｎ（ｍ−マレイミドベンゾイルオキシ）アンジオ
   テンシン I とβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを、モル比１
   ４：１の割合で反応させることを特徴とする、β−Ｄ−
   ガラクトシダーゼ−アンジオテンシン I の製造方法。