JP2002517205A - 新規なパーオキシダーゼ基質およびその触媒型レポーター付着における使用 - Google Patents

新規なパーオキシダーゼ基質およびその触媒型レポーター付着における使用

Info

Publication number
JP2002517205A
JP2002517205A JP2000552300A JP2000552300A JP2002517205A JP 2002517205 A JP2002517205 A JP 2002517205A JP 2000552300 A JP2000552300 A JP 2000552300A JP 2000552300 A JP2000552300 A JP 2000552300A JP 2002517205 A JP2002517205 A JP 2002517205A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
analyte
conjugate
enzyme
assay
group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2000552300A
Other languages
English (en)
Other versions
JP4162858B2 (ja
Inventor
マーク ノーマン ボブロウ
Original Assignee
エヌ・イー・エヌ・ライフ・サイエンス・プロダクツ・インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by エヌ・イー・エヌ・ライフ・サイエンス・プロダクツ・インコーポレイテッド filed Critical エヌ・イー・エヌ・ライフ・サイエンス・プロダクツ・インコーポレイテッド
Publication of JP2002517205A publication Critical patent/JP2002517205A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP4162858B2 publication Critical patent/JP4162858B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C235/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms
    • C07C235/02—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton
    • C07C235/32—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton the carbon skeleton containing six-membered aromatic rings
    • C07C235/34—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton the carbon skeleton containing six-membered aromatic rings having the nitrogen atoms of the carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D207/46—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with hetero atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
    • C07D493/02—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D493/10—Spiro-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D495/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D495/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D495/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase

Abstract

(57)【要約】 本発明は、触媒型レポーター付着において使用し、ディテクターシグナルを増幅させアッセイ検出限界を改善することのできる新規なp-ヒドロキシシンナモイル含有基質に関する。図面は、触媒型レポーター付着を用いてディテクターシグナルを増幅させたサイトメガロウィルス早期抗原の検出を示す。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、新規なパーオキシダーゼ基質に関し、さらに詳細には、触媒型レポ
ーター付着(Catalyzed reporter deposition)のような種々の用途において使用
し得るシンナモイル含有基質に関する。
【０００２】 （背景技術） パーオキシダーゼは、その高交換率、良好な安定性と入手性故に、酵素系分析
方法において広く使用されている。例えば、セイヨウワサビパーオキシダーゼ(H
RP)(EC 1.11.1.7)は、多種の水素供与性基質の過酸化水素による酸化を触媒する
。また、HRPは、触媒型レポーター付着用の好ましい酵素の1つである。
【０００３】 触媒型レポーター付着は、米国特許第5,196,306号および第5,583,001号の要旨
を構成する新規なシグナル増幅方法である。この方法は、Bobrow et al. Journa
l of Immunological Methods, 125: 279-285 (1989)、およびBobrow et al. Jou
rnal of Immunological Methods, 137: 103-112 (1991)においても記載されてい
る。
【０００４】 この方法は、分析物依存性酵素活性化系 ("ADEAS") を用いて追加のレポータ
ー酵素の固相への付着を触媒し、シグナル増幅と改良されたアッセイ検出限界を
与える。好ましい実施態様においては、HRPがADEASである。
【０００５】 ADEASは、ADEASに特異性の検出可能な標識化基質からなるコンジュゲートと反
応する。ADEASと上記コンジュゲートが反応するとき、活性化コンジュゲートが
形成されて、活性化コンジュゲートのレセプターを固定した場所に付着する。こ
のレセプターは、上記分析物依存性酵素活性化系とは反応性でない。
【０００６】 コンジュゲート類は、通常のカップリングおよび標識化方法を用いて合成し得
る。基質の選択は、使用するADEASによる。即ち、有用な合成基質と必要に応じ
てのレセプターを適切に設計するためには、各特異性酵素の触媒特性についての
詳細な知識が要求される。開示されているコンジュゲートの例には、ビオチンチ
ラミン、フルオレセインチラミン、NADP、ホスホリル化ビオチン等の置換フェノ
ール類がある。
【０００７】 しかしながら、パーオキシダーゼ介在アッセイに適する基質を設計するに当っ
ては、注意をもって行わなければならない。Guilbault et al., Analytical Che
mistry, Vol.40, No.8, pages 1256-1263 (1968)は、パーオキシダーゼ、ガラク
トースオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼおよびインバーターゼのような酸
化性酵素の蛍光測定用の広範囲の基質を研究している。これらの研究者等は、側
鎖に二重結合を含有する3,4-ジヒドロキシケイ皮酸は、酵素との反応を停止させ
るので、酸化性酵素の蛍光測定用の有用な基質ではなかったと報告している。
【０００８】 (発明の開示) 本発明は、下記の構造を有するp-ヒドロキシシンナモイル含有化合物に関する
：
【０００９】
【化６】
【００１０】 （式中、Xはp-ヒドロキシシンナモイル成分にAを結合し得るリンカー基であり、
Aは検出可能な標識である）。
【００１１】 もう1つの実施態様においては、本発明は、触媒型レポーター付着を用いてレ
ポーターシグナルを増幅させるサンプル中の分析物の存在または不存在を検出ま
たは定量するアッセイ法における、そのようなシンナモイル含有化合物の使用に
関する。
【００１２】 (発明を実施するための最良の形態) 用語“分析物依存性酵素活性化系(ADEAS)”は、(i) 少なくとも1種の酵素を、
当業者において公知の任意の方法で、特異性結合対の1員にカップリングさせた
酵素系、或いは (ii) 特異性結合対の1員にカップリングさせる必要のない分析
物である場合の酵素を称する。この酵素は、それ自体または第2の酵素と一緒に
、活性化コンジュゲートの生成を触媒し、次いで、この活性化コンジュゲートが
活性化コンジュゲートのレセプターが存在する場所に付着する。
【００１３】 本明細書で使用する用語“増幅”は、ADEASにより活性化されたコンジュゲー
トの付着に基づくレポーターシグナルの増幅を意味する。 本明細書で使用する用語“コンジュゲート”は、後述するような単一酵素ADEA
Sまたは多成分酵素ADEASコンジュゲートのいずれであれ、パーオキシダーゼ介在
ADEASに特異性の検出可能な標識化シンナモイル含有基質を意味する。
【００１４】 用語“検出可能な標識化”は、基質をレポーターにカップリングさせるか、或
いはレポーターが基質に後述するような異なる成分を導入する場合には特異性結
合対の未標識第1員にカップリングさせ得ることを意味する。基質を特異性結合
対の未標識1員に結合させる場合、レセプターに結合させた後、基質-特異性結合
対複合体を結合対の第2員と反応させ、これをレポーターにカップリングさせる
。また、基質-特異性結合対複合体を、付着させる前の特異性結合対の検出可能
に標識した他の1員と前以て反応させてもよい。
【００１５】 用語“付着”は、後述するような特異性結合対の相互作用の形成によって生ず
る活性化コンジュゲートのレセプターへの直接結合を意味する。 用語“レセプター”は、後述するような特異性結合対相互作用の形成により活
性化コンジュゲートに結合する部位を意味する。 用語“活性化コンジュゲート”は、コンジュゲートがADEASに触発されてレセ
プターと結合することを意味する。
【００１６】 ADEASは、コンジュゲート(即ち、ADEASに特異性の検出可能に標識化した基質)
の付着を、コンジュゲートの基質部分を活性化形(レセプターの存在する場所に
共有結合する)に変えることによって触媒する。ADEASは、増幅を行うのに酵素カ
スケード反応または酵素循環によらない。むしろ、ADEASは、単一酵素または酵
素混合物によりコンジュゲートを活性化する。コンジュゲートの付着は、分析物
とADEASが反応しレセプターが活性化コンジュゲートに結合するのに利用できる
場合にのみ生ずる。即ち、ADEAS、コンジュゲートおよびレセプターは、作動3要
素を構成するよう選択される。分析物とADEASは、分析物が酵素(例えば、パーオ
キシダーゼ)である場合には同じものであり得、或いは異なるものであってもよ
い。
【００１７】 本発明は、新規なシンナモイル含有基質に関するが、従来、この基質は、その
ようなシンナモイル含有基質が酵素との反応を抑制するものと予想されていたた
めに、パーオキシダーゼ介在反応においては不適当な基質であると考えられてい
た。
【００１８】 本発明のシンナモイル含有基質と共に使用するのに適するADEASには、オキシ
ドリダクターゼ類がある。さらに詳細には、パーオキシダーゼ類を挙げることが
できる。本発明の新規な基質において適し得る好ましいADEASは、セイヨウワサ
ビパーオキシダーゼである。
【００１９】 驚くべきことに、また予想に反して、構造内にp-ヒドロキシシンナモイル成分
を有する新規なコンジュゲートが、非シンナモイル含有コンジュゲートを用いて
通常得られていた値の少なくとも10倍のレベルで触媒型レポーター付着の感度を
著しく改善することを見出した。 本発明の新規なp-ヒドロキシシンナモイル含有化合物は、下記の構造を有する
：
【００２０】
【化７】
【００２１】 （式中、Xはp-ヒドロキシシンナモイル成分にAを結合し得るリンカー基であり、
Aは検出可能な標識である）。
【００２２】 上記リンカー基は、p-ヒドロキシシンナモイル成分に検出可能な標識を結合さ
せ得る実質的任意のリンカー基であり得る。検出可能な標識に結合させた多くの
リンカー基が、商業的に入手可能である。検出可能な標識に結合していないリン
カー基の例には、下記のものがある：
【００２３】
【化８】
【００２４】 検出可能な標識に結合させたリンカー基の例には、下記のものがある：
【００２５】
【化９】
【００２６】
【化１０】
【００２７】 広範囲のレポーターを、基質にカップリングさせてコンジュゲートを生成させ
るのに、或いは特異性結合対の1員にカップリングさせるのに利用できる。レセ
プターは、125Iのような放射活性アイトソープ、酵素類、蛍光原性物質、化学発
光体、または電気化学物質であり得る。
【００２８】 本発明を実施するのに使用できるレポーター酵素の例には、ヒドロラーゼ類、
リアーゼ類、オキシドリダクターゼ類、トランスフェラーゼ類、イソメラーゼ類
およびリガーゼ類がある。幾つかの好ましい例は、ホスファターゼ類、エステラ
ーゼ類、グルコシダーゼ類およびパーオキシダーゼ類である。特定の例には、ア
ルカリホスファターゼ、リパーゼ類、ベータ-ガラクトシダーゼおよびセイヨウ
ワサビパーオキシダーゼがある。上述したように、酵素をレポーターとして使用
する場合、その酵素は、ADEASにおいて使用する酵素または酵素類と同じものま
たは異なるものであってもよい。本発明は、ラジオアイソトープ標識コンジュゲ
ートまたは酵素標識コンジュゲート等の付着を触媒するのに使用できる。
【００２９】 レポーターは、特異性結合対の1員である場合、免疫タイプまたは非免疫タイ
プであり得る。免疫特異性対の例は、抗原/抗体系またはハプテン/抗ハプテン系
である。抗体成分は、ポリクローナル、モノクローナルまたはこれらの免疫反応
性画分であれ、当業者において周知の慣用的方法によって調製できる。用語“免
疫反応性抗体画分”または“免疫反応性画分”とは、抗体の結合領域を含有する
画分を意味する。そのような画分は、Fc部分を除いた画分として定義されるFab
タイプ画分、例えば、Fab、Fab'およびF(ab')2画分であり得、或いはインタクト
抗体の長鎖成分を結合しているジスルフィド結合の還元性開裂によって得られる
いわゆる“ハーフ分子”画分であり得る。特異性結合対の抗原成分が免疫原性で
ない、例えば、ハプテンである場合、その成分は、担体部分に共有結合させて免
疫原性を付与させ得る。
【００３０】 非免疫性結合対には、その2つの成分が互いに対して本質的な親和性を有する
ものの、抗体ではない系がある。非免疫性結合対には、ビオチン-アビチン、ま
たはビオチン-ストレプトアビチン、葉酸-葉酸塩結合性タンパク質、相補性プロ
ーブ核酸等がある。
【００３１】 本発明の化合物は、後述の実施例において例示するような通常のカップリング
および標識化方法を用いて合成できる。1つの方法は、下記の反応式に従ってp-
ヒドロキシケイ皮酸を反応させることであり得る：
【００３２】
【化１１】
【００３３】 次いで、得られたアミンをN-ヒドロキシスクシンイミドまたはイソシアネート
成分と反応させて、最終のp-ヒドロキシシンナモイル含有化合物を調製する。 上述したように、検出可能な標識を結合させた多くのリンカー基が商業的に入
手可能である。これらの商業的に入手可能なリンカー基は、当業者において周知
の通常のプロトコールを用いてp-ヒドロキシケイ皮酸と反応させ得る。
【００３４】 本発明の検出可能に標識したp-ヒドロキシシンナモイル含有化合物(コンジュ
ゲート)を活性化させると、レセプターが存在する場所に結合する。活性化コン
ジュゲートは、特異性結合対の相互作用(この場合、共有結合である)によりレセ
プターに結合する。外因性レセプターは、アッセイ内において起源のないレセプ
ターを意味する。このレセプターは、本発明のコンジュゲートを反応混合物に加
える前に支持体表面に固定し得る。内因性レセプターは、アッセイ内で起源する
レセプターを意味する。本発明のコンジュゲートは、活性化させたとき、電子リ
ッチ成分のような活性化フェノール成分に適するレセプターに結合するものと信
じている。
【００３５】 もう1つの実施態様においては、本発明は、触媒型レポーター付着を用いてレ
ポーターシグナルを増幅させる、サンプル中の分析物の存在または不存在を検出
または定量するアッセイにおける上記検出可能に標識したシンナモイル含有化合
物の使用に関する。イムノアッセイまたは核酸ハイブリダイゼーションアッセイ
のような実質的に任意のアッセイフォーマットを使用できる。 多くの変形が可能であり、これらの変形は本発明の範囲内に属するものである
ことは、当業者にとって自明であろう。
【００３６】 (実施例) 以下の実施例は、本発明の例示を目的とするものであり、それに限定するもの
と解釈すべきではない。
【００３７】 実施例1 4-ヒドロキシケイ皮酸、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル
【００３８】
【化１２】
【００３９】 p-ヒドロキシケイ皮酸(5.0 g、30.5ミリモル)を暖めながらアセトニトリル(15
0 mL)に溶解し、次いでN-ヒドロキシスクシンイミド(4.0 g、35ミリモル)と1,3-
ジシクロヘキシルカルボジイミド(ジクロロメタン中1M、35 mL、35ミリモル)を
加えた。得られた薄黄色溶液を１夜室温で攪拌し、濾過し、濾液を蒸発させ、シ
リカゲルクロマトグラフィーで精製し、1:1酢酸エチル：ヘキサンで溶出させた
。薄層クロマトグラフィーによる生成物含有画分をプールし、蒸発させて白色固
形物(3.31 g、42％)を得た。1H NMR (DMSO-d6)δ7.9 (d、1H、ビニル)、7.7 (d
、2H、フェニル3,5)、6.9 (d、2H、フェニル2,6)、6.7 (d、1H、ビニル)、2.8 (
s、4H、スクシンイミドメチレン)。
【００４０】 実施例2 N-1-ビオチニル-N-2-(4-ヒドロキシシンナモイル)-エタンジアミン
【００４１】
【化１３】
【００４２】 N-(2-アミノエチル)ビオチンアミドヒドロブロマイド(25 mg、0.068ミリモル)
、トリエチルアミン(10μL、0.072ミリモル)および4-ヒドロキシケイ皮酸、スク
シンイミジルエステル(18 mg、0.068ミリモル)をジメチルホルムアミド(DMF)(1
mL)に溶解し、室温で1夜攪拌した。反応混合物を、水中0〜100％メタノール直線
勾配で30分に亘って溶出させるC18逆相クロマトグラフィーで精製した。22分で
の溶出ピークを集め、蒸発させて白色固形物22 mg (0.051ミリモル、75％)を得
た。1H NMR (CD3OD)δ7.5 (d、1H、ビニル)、7.4 (d、2H、芳香族3,5)、6.8 (d
、2H、芳香族2,6)、6.4 (d、1H、ビニル)、4.4 (m、1H、ビオチンメチン-NH)、4
.2 (m、1H、ビオチンメチン-NH)、3.4 (m、4H、エタンジアミド)、3.1 (m、1H、
ビオチンメチン-S)、2.8 (1H、ビオチンメチン-S)、2.6 (1H、ビオチンメチン-S
)、2.2 (2H、ビオチンCH2-CO)、1.3〜1.7 (m、6H、ビオチン脂肪族)。
【００４３】 実施例3 N-ε-(2,4-ジニトロフェニル)-N-α-(4-ヒドロキシシンナモイル)-L-リジン
【化１４】 N-ε-(2,4-ジニトロフェニル)-L-リジン(32 mg、0.09ミリモル)を0.2Mのホウ酸
ナトリウム(3 mL) pH = 8中に懸濁させ、DMF(0.5 mL)中の4-ヒドロキシケイ皮酸
、スクシンイミジルエステル(35 mg、0.13ミリモル)溶液を攪拌しながら小分割
で加えた。得られた黄色懸濁液を室温で1夜攪拌し、粗反応混合物を、50 mMリン
酸ナトリウム、pH = 3中の50〜100％メタノール直線勾配で15分に亘って溶出さ
せるC18逆相クロマトグラフィーで精製した。約11分で溶出する主要ピークを数
本の注射器からプールし、C8 sep-pakカートリッジ上で脱塩し、蒸発させて黄色
固形物10 mg (0.02ミリモル、25％)を得た。1H NMR (CD3OD)δ8.9 (s、1H、DNP
H-3)、8.2 (d、1H、DNP H-5)、7.4 (d、1H、ビニル)、7.3 (d、2H)、7.2 (d、1H
、DNP H-6)、6.8 (d、2H、芳香族2,6)、6.4 (d、1H、ビニル)、4.5 (m、1H、リ
ジンメチン)、3.5 (t、2H、CH2-NH)、2.1〜1.5 (m、6H、CH2)。
【００４４】 実施例4 DAPM-シンナメート
【００４５】
【化１５】
【００４６】 N-(3-(2,4-ジニトロフェニル)アミノ)プロピル)-N-(3-アミノプロピル)メチル
アミン、ジヒドロクロリド(DAMP)(45 mg、0.12ミリモル)、トリエチルアミン(35
μL、0.25ミリモル)、および4-ヒドロキシケイ皮酸、スクシンイミジルエステル
(35 mg、0.13ミリモル)をジメチルホルムアミド(DMF)(1 mL)に溶解し、室温で1
夜攪拌した。反応混合物を真空蒸発させ、少量のメタノール/水に溶解し、水中0
〜100％メタノール直線勾配で30分に亘って溶出させるC8逆相クロマトグラフィ
ーで精製した。第1の主要ピークを集め、蒸発させて黄色固形物27 mg(0.06ミリ
モル、49％)を得た。1H NMR (CD3OD)δ8.9 (s、1H、DNP H-3)、8.2 (d、1H、DNP
H-5)、7.4 (d、1H、ビニル)、7.3 (d、2H)、7.2 (d、1H、DNP H-6)、6.8 (d、2
H、芳香族2,6)、6.4 (l、1H、ビニル)、3.6 (t、2H、CH2-NH)、3.4 (t、2H、CH2 -NH)、3.3 (t、2H、CH2-NH)、3.2 (t、2H、CH2-NH)、2.9 (s、3H、メチル)、2.2
〜1.9 (m、4H、CH2)。
【００４７】 実施例5 N-α-(4-ヒドロキシシンナモイル)-L-リジン
【００４８】
【化１６】
【００４９】 N-ε-BOC-L-リジンヒドロクロリド(78 mg、0.32ミリモル)を0.2Mのホウ酸ナト
リウム pH = 8中に懸濁させ、DMF(3 mL)中の4-ヒドロキシケイ皮酸、スクシンイ
ミジルエステル(130 mg、0.50ミリモル)溶液を攪拌しながら小分割で加えた。得
られた淡黄色溶液を室温で1夜攪拌し、粗反応混合物を、50 mMリン酸ナトリウム
、pH = 3.5中の50〜100％メタノール直線勾配で30分に亘って溶出させるC18逆相
クロマトグラフィーで精製した。約25分で溶出する主要ピークを数本の注射器か
らプールし、蒸発させてガラス状固形物を得、これをトリフルオロ酢酸：水(７:
３)(10 mL)で２４時間攪拌しながら脱保護した。溶液を真空蒸発させ、トルエン
(３x10 mL)からストリッピングし、エーテルで粉末化して純白でないガラス状固
形物97 mg (0.24ミリモル、75％)を得た。
【００５０】 実施例6 N-ε-(5-(および-6)-カルボキシフルオレセイニル)-N-α-(4-ヒドロキシシン
ナモイル)-L-リジン
【００５１】
【化１７】
【００５２】 N-α-(4-ヒドロキシシンナモイル)-L-リジン(24 mg、0，06ミリモル)を水(1 m
L)に溶解し、pHを1N NaOHにより9〜10に調整した。5-(および-6)カルボキシフル
オレセイン、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(39 mg、0.08ミリモル)を数
回分割して固形物として加え、反応混合物を室温で1夜攪拌し、50 mMリン酸ナト
リウム、pH = 3.5中の50〜100％メタノール直線勾配で30分に亘って溶出させるC
18逆相クロマトグラフィーで精製した。主要ピークを数本の注射器からプールし
て、0.06ミリモル(100％)の所望生成物を含有する黄色溶液を得た。
【００５３】 実施例7 サイトメガルウィルス(CMV)早期抗原の検出 スライド上のCMV感染細胞(CMV感染させたMRC-5細胞を含む8ウェルスライド、H
emagen Diagnostics社)を、リン酸緩衝液(PBS)で2分間水和させた。抗CMV-セイ
ヨウワサビパーオキシダーゼコンジュゲート(Ishikawa, E. et al., J. Immuuno
assay, 4, 209-237, 1983の方法の変形法により調製)を、0.1Mトリス、0.15M Na
Cl、0.5％ミルクタンパク質、pH7.5中で希釈し、上記スライド上で37℃、30分間
インキュベートした。次いで、スライドを0.1Mトリス、0.15M NaCl、0.05％ twe
en 20、pH7.5 (TNT) 緩衝液で2分間洗浄した。ビオチニル-チラミド(NEN Life S
cience Products社、NEL-700)を増幅希釈液(Amplification Diluent) (NEN Life
Science Products社、NEL-700)中で2μg/mlに希釈し、スライドのウェルの１つ
に入れ、室温で10分間インキューベートした。N-1-ビオチニル-N-2-(4-ヒドロキ
シシンナモイル)-エタンジアミンを増幅希釈液中で0.2μg/mlに希釈し、スライ
ドの第2のウェルに入れ、室温で10分間インキュベートした。スライドをTNT緩衝
液で2回各2分間洗浄した。ストレプタビジン-フルオレセイン(NEN Life Science
Products社、NEL-720)をTNT緩衝液中で1:500に希釈し、室温で30分間インキュ
ベートした。スライドをTNT緩衝液で3回各5分間洗浄した。エバンスブルー(0.00
1％)をスライド上で1分間インキュベートし、スライドを脱イオン水で2回洗浄し
、風乾させた。フェージング防止取りつけ媒体(anti-fade mounting media) (Ve
ctashield)とスリップカバーを取り付けたのち、スライドを、Zeiss蛍光顕微鏡
で200倍で画像化した。
【００５４】 結果：図2は、ビオチニル-チラミドよりも10倍低い濃度で本発明の基質、N-1-
ビオチニル-N-2-(4-ヒドロキシシンナモイル)-エタンジアミンを用いることによ
り、明るいCMV感染核によって示されるようにはるかに優れた感度が得られるこ
とを示唆している。その感度は、ビオチニル-チラミド増幅によっては検出され
なかった内因性パーオキシダーゼ活性がN-1-ビオチニル-N-2-(4-ヒドロキシシン
ナモイル)-エタンジアミンの使用により明白に検出される程である。日常の実施
においては、内因性パーオキシダーゼ不活化工程を用いるが、この工程を、本実
施例においては、N-1-ビオチニル-N-2-(4-ヒドロキシシンナモイル)-エタンジア
ミンを使用して得られる優れた効果をさらに具体的に示すために用いなかった。
【図面の簡単な説明】
【図1】 触媒型レポーター付着を用いてディテクターシグナルを増幅させたサイトメガ
ロウィルス早期抗原の検出を示す。HRPがADEASであり、ビオチンチラミンがコン
ジュゲートであった。
【図2】 触媒型レポーター付着を用いてディテクターシグナルを増幅させたサイトメガ
ロウィルス早期抗原の検出を示す。HRPがADEASであり、N-1-ビオチニル-N-2-(4-
ヒドロキシシンナモイル)-エタンジアミンがコンジュゲートであった。このコン
ジュゲートは、ビオチンチラミンの10倍低い濃度で用いた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０９Ｂ 11/28 Ｃ０９Ｂ 11/28 Ｊ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 下記の構造を有するp-ヒドロキシシンナモイル含有化合物： 【化１】 （式中、Xはp-ヒドロキシシンナモイル成分にAを結合し得るリンカー基であり、
    Aは検出可能な標識である）。
  2. 【請求項２】 Xが、下記からなる群から選ばれる請求の範囲第1項記載の化
    合物： 【化２】
  3. 【請求項３】 Aがビオチン、ジニトロフェニル、フルオレセインおよびテ
    トラメチルローダミンからなる群から選ばれる請求の範囲第1項または第2項記載
    の化合物。
  4. 【請求項４】 少なくとも1種の酵素を含む分析物依存性酵素活性化系を用
    い、請求の範囲第1項記載の構造を有する検出可能な標識化基質を含むコンジュ
    ゲートと反応させて活性化コンジュゲートを生成させ、この活性化コンジュゲー
    トはこの活性化コンジュゲートの少なくとも1種のレセプターが存在する場所へ
    実質的に共有的に付着しており、そのレセプターは上記分析物依存性酵素活性化
    系と反応性でなく、付着させた検出可能な標識が検出または定量可能なシグナル
    を直接または間接的に発生させることを特徴とするアッセイにおける分析物の検
    出または定量方法。
  5. 【請求項５】 Xが、下記からなる群から選ばれる請求の範囲第4項記載の方
    法： 【化３】
  6. 【請求項６】 Aがビオチン、ジニトロフェニル、フルオレセインおよびテ
    トラメチルローダミンからなる群から選ばれる請求の範囲第4項または第5項記載
    の方法。
  7. 【請求項７】 分析物依存性酵素活性化系がパーオキシダーゼである請求の
    範囲第4項、第5項または第6項記載の方法。
  8. 【請求項８】 a) 固相上に分析物を固定させること； b) 工程a)の生成物を分析物依存性酵素活性化系と反応させること、この分析物
    依存性酵素活性化系が酵素にカップリングさせた特異性結合対の1員であるか或
    いは酵素であること； c) 工程b)の生成物を請求の範囲第1項記載の構造を有するコンジュゲートと反応
    させて特異性結合対の第1員である活性化コンジュゲートを生成させること、こ
    の活性化コンジュゲートが、上記分析物依存性酵素活性化系と反応性でない固相
    表面上の特異性結合対の第2員に結合させることによって上記固相上に共有的に
    付着していること、付着させた検出可能な標識が検出または定量可能なシグナル
    を直接または間接的に発生させること；および d) サンプル中の分析物の存在または不存在を工程c)で発生させたシグナルから
    検出または定量すること； を特徴とするサンプル中の分析物の存在または不存在を検出または定量するアッ
    セイ法。
  9. 【請求項９】 Xが、下記からなる群から選ばれる請求の範囲第8項記載のア
    ッセイ法： 【化４】
  10. 【請求項１０】 Aがビオチン、ジニトロフェニル、フルオレセインおよび
    テトラメチルローダミンからなる群から選ばれる請求の範囲第8項または第9項記
    載のアッセイ法。
  11. 【請求項１１】 分析物依存性酵素活性化系がパーオキシダーゼである請求
    の範囲第8〜10項のいずれか一項に記載のアッセイ法。
  12. 【請求項１２】 a)分析物依存性酵素活性化系の少なくとも1成分である分
    析物(この分析物依存性酵素活性化系は、酵素にカップリングさせた特異性結合
    対の1員であるか或いは酵素である)を請求の範囲第1項記載の構造を有するコン
    ジュゲートと反応させて特異性結合対の第1員である活性化コンジュゲートを生
    成させること、この活性化コンジュゲートが、上記分析物依存性酵素活性化系と
    反応性でない固相表面上の特異性結合対の第2員に結合させることによって上記
    固相上に付着していること、付着した検出可能な標識が検出または定量可能なシ
    グナルを直接または間接的に発生させること；および b) サンプル中の上記分析物の存在または不存在を工程a)で発生させたシグナル
    から検出または定量すること； を特徴とするサンプル中の分析物の存在または不存在を検出または定量するアッ
    セイ法。
  13. 【請求項１３】 Xが、下記からなる群から選ばれる請求の範囲第12項記載
    のアッセイ法： 【化５】
  14. 【請求項１４】 Aがビオチン、ジニトロフェニル、フルオレセインおよび
    テトラメチルローダミンからなる群から選ばれる請求の範囲第12項または第13項
    記載のアッセイ法。
  15. 【請求項１５】 分析物依存性酵素活性化系がパーオキシダーゼである請求
    の範囲第12〜14項のいずれか一項に記載のアッセイ法。
  16. 【請求項１６】 パーオキシダーゼ酵素を検出可能な標識化フェノールと反
    応させることを含み、活性化させたコンジュゲートが請求の範囲第1項記載の構
    造を有することを特徴とする活性化コンジュゲートの生成方法。
JP2000552300A 1998-06-04 1998-06-04 新規なパーオキシダーゼ基質およびその触媒型レポーター付着における使用 Expired - Lifetime JP4162858B2 (ja)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/US1998/011477 WO1999063108A1 (en) 1998-06-04 1998-06-04 Novel peroxidase substrates and their use in catalyzed reporter deposition

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2002517205A true JP2002517205A (ja) 2002-06-18
JP4162858B2 JP4162858B2 (ja) 2008-10-08

Family

ID=22267232

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000552300A Expired - Lifetime JP4162858B2 (ja) 1998-06-04 1998-06-04 新規なパーオキシダーゼ基質およびその触媒型レポーター付着における使用

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP1084269B1 (ja)
JP (1) JP4162858B2 (ja)
AT (1) ATE360704T1 (ja)
AU (1) AU750640B2 (ja)
CA (1) CA2334010C (ja)
DE (1) DE69837683T2 (ja)
ES (1) ES2285777T3 (ja)
IL (1) IL140052A0 (ja)
WO (1) WO1999063108A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6355443B1 (en) * 1999-03-17 2002-03-12 Mark Norman Bobrow 4-(4-hydroxystyryl) pyridine-containing substrates for an analyte dependent enzyme activation system

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2528037A1 (fr) * 1982-06-08 1983-12-09 Centre Nat Rech Scient Procede de preparation de phenolamides
GB2141626B (en) * 1983-04-25 1987-01-28 Kao Corp Cinnamic acid derivatives for lightening melanin pigmentation of skin
US4876084A (en) * 1986-08-04 1989-10-24 Kao Corporation P-hydroxycinnamamide derivatives and melanin inhibitor comprising the same
US5196306A (en) * 1989-03-29 1993-03-23 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for the detection or quantitation of an analyte using an analyte dependent enzyme activation system

Also Published As

Publication number Publication date
IL140052A0 (en) 2002-02-10
CA2334010A1 (en) 1999-12-09
EP1084269B1 (en) 2007-04-25
JP4162858B2 (ja) 2008-10-08
DE69837683T2 (de) 2008-01-10
EP1084269A1 (en) 2001-03-21
EP1084269A4 (en) 2005-02-09
CA2334010C (en) 2009-09-08
WO1999063108A1 (en) 1999-12-09
DE69837683D1 (de) 2007-06-06
ES2285777T3 (es) 2007-11-16
AU8057498A (en) 1999-12-20
ATE360704T1 (de) 2007-05-15
AU750640B2 (en) 2002-07-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5998593A (en) Fluorescent enzyme substrates
EP0138357B1 (en) Labeled DNA
US4150033A (en) Reagent suitable for enzyme immuno assay
US4810638A (en) Enzyme-labeled antibody reagent with polyalkyleneglycol linking group
US5863748A (en) p-Hydroxycinnamoyl-containing substrates for an analyte dependent enzyme activation system
JP3172522B2 (ja) 改良された化学ルミネセントエステル，チオエステルおよびアミドを用いるアッセイ法
AU768695B2 (en) Enhanced catalyzed reporter deposition
CA2421552A1 (en) Labeling reagents and labeled targets, target labeling processes and other processes for using same in nucleic acid determinations and analyses
CA2058220A1 (en) Fluorescent compound, complex, reagent, and specific binding assay employing said reagent
JP2604993B2 (ja) 新規なビオチン化試薬
CA2129444A1 (en) Amplification of assay reporters by nucleic acid replication
US6180844B1 (en) Composition containing fluorescence-generating substrate
US4895955A (en) Non-radioactive carbodiimide precursor to nucleic acid probes
JP4251984B2 (ja) 触媒リポーター付着促進用組成物
US6355443B1 (en) 4-(4-hydroxystyryl) pyridine-containing substrates for an analyte dependent enzyme activation system
JP4162858B2 (ja) 新規なパーオキシダーゼ基質およびその触媒型レポーター付着における使用
US5304479A (en) Phencyclidine compounds and assays for its determination
US7291474B2 (en) Hydrolytic substrates for an analyte-dependent enzyme activation system
EP0915832B1 (en) Boronic compound complexing reagents and highly stable complexes
JPH0692968A (ja) ビオチン導入試薬
CN116930478A (zh) 一种甲状腺素荧光偶联物及其制备方法和应用
JPH0376423B2 (ja)

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20050527

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20080225

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20080526

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20080630

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20080723

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110801

Year of fee payment: 3

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110801

Year of fee payment: 3

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120801

Year of fee payment: 4

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130801

Year of fee payment: 5

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

EXPY Cancellation because of completion of term