CN101622537A

CN101622537A - 基于人类胚泡来源的干细胞和祖细胞的新型毒性分析方法

Info

Publication number: CN101622537A
Application number: CN200780043757A
Authority: CN
Inventors: 萨拉·阿德勒; 雷蒙德·施特雷尔
Original assignee: Cellartis AB
Current assignee: Takara Bio Europe AB
Priority date: 2006-10-02
Filing date: 2007-10-02
Publication date: 2010-01-06

Abstract

本发明涉及用于在人种中检测毒性的，基于人类胚泡来源的干细胞的体外毒性分析方法，该方法能够在体外对物质对人类的毒性进行新型检测，和/或与非人类分析方法相比能够更有效地检测对人类的毒性。本发明还可以对已知表现出种间差异，以及毒性效应不能通过小鼠中的毒理学测试检测到的物质进行毒性检测。

Description

基于人类胚泡来源的干细胞和祖细胞的新型毒性分析方法

发明背景

人类胚泡来源的干(hBS)细胞具有分化成所有三种胚层的衍生物的独特能力。这种特点使得它们在毒理学领域中成为特殊的工具，因为它们可以作为功能性细胞的“细胞工厂”(Moon SY等，Mol Ther13(1)：5-14，2006)。此外，在hBS细胞分化过程中相互作用的化合物的效应可以被检测，使得它们在发育毒理学领域中特别具有价值。

由于新的欧洲化学品政策(European Chemicals Policy)(REACH)将在2007年生效，对于每年生产量或进口量超过1吨的3万种以上的化学物质来说，需要它们的毒理学信息(Anon，2007)。因此，将可能额外使用大约390万只试验动物，对工业界来说，花费估计为大约15亿欧元，其中仅用于发育毒性研究的就占32％(RPA，2002)。因此，对于体外发育毒性测试有紧迫的需求。此外，制药工业面临着高通量体外毒性测试的需求，因为在开发阶段，新型药物候选物的可靠毒理学数据必须尽可能早地产生。由于引入早期体外毒性筛选而使高的损耗率降低，将在经济方面减少相关的花费。此外，已知有大量物质表现出显著的种间差异，在人类中导致严重的畸变，但是在大鼠或小鼠中不明显，例如用于治疗严重痤疮的13-顺式视黄酸(异维甲酸)(Accutane，Roche)以及镇静剂和抗炎性药物沙利度胺(Contergan)(Gilbert，2003)。因此，需要人类相关的发育毒性测试。

到目前为止，最有希望的体外胚胎毒性测试之一是被批准的胚胎干细胞测试(EST)，它使用了鼠类胚胎干(mES)细胞来评估化学物质的胚胎毒性潜力。EST考虑到了mES细胞和鼠类成纤维细胞对胚胎毒性物质的不同敏感性。此外，mES细胞分化成功能性心肌细胞用作毒理学终点(Genschow，2004)。但是，EST的目的仍然在于在动物系统中预测人类毒性。

在发育毒性测试中使用人类胚胎干细胞可以提供可靠的，与人类相关的数据，增加了现有的毒性测试的价值，可用于药物和化学物质的安全性评估。但是，在毒性测试中使用hBS细胞是一种挑战，因为这些细胞需要复杂的操作技术。例如，hBS细胞需要以细胞聚集物而不是单一种细胞的形式接种以确保生长，并显示出可变的与表面结合的能力，从而导致了高的差异。此外，hBS细胞的群体倍增时间是36小时，明显长于mES细胞的12小时。小鼠和人类BS细胞的另一个重要的差别是它们的培养条件。为了将mES细胞维持在未分化状态，在培养基中加入白血病抑制因子(LIF)就足够了。但是对于hBSC细胞株来说，将它们培养在小鼠或人类饲养层上，显示出是将细胞稳定地维持在未分化状态的最可靠的方法。正在进行大量的工作以发现不需饲养细胞的培养系统，但这些研究都处于开发的早期阶段(Stacey等，2006)。

本发明阐述了基于hBS细胞的毒性分析方法，用于预测人类毒性，例如发育毒性和细胞毒性。本发明显示出了明显超过mES的优点，能够提供与人类相关的数据，有助于鉴定人类致畸原，这些致畸原中的一些已知显示出种间差异，例如13-顺式视黄酸。这样的毒性测试具有成为检测与人类相关的发育毒性物质的测试策略的一部分的潜力。

发明描述

定义与缩写

“分析方法”或“多个分析方法”用于描述所进行的在基因，蛋白或功能水平上测量细胞毒性和/或发育毒性的体外测试。

本文中使用的术语“胚泡来源的干细胞”是指BS细胞，其人类形式被称为“hBS细胞”或“hBSC”。

本文中使用的术语“祖细胞”或“祖细胞类型的细胞”是指任何源自于hBS细胞的，处于未分化的hBS细胞和完全分化的细胞之间任何分化阶段的细胞。

术语“饲养细胞”或“饲养物”是指一种类型的细胞，它与另一种类型的细胞共培养，以提供使第二种类型的细胞能够生长的环境。饲养细胞任选地可以来自与它们支持的细胞不同的物种。典型情况下，饲养细胞在与其它细胞共培养时，可以通过辐照或用抗有丝分裂剂例如丝裂霉素c处理进行失活，以防止它们长得比它们所支持的细胞快。不受上面描述的限制，这样的饲养细胞的一种具体类型可以是人类饲养细胞，例如人类皮肤成纤维细胞，在本文中称为hFF。在本发明的上下中，hFF也是成体(adult)细胞类型的例子。另一种饲养细胞类型可以是小鼠胚胎成纤维细胞(mEF)。

对术语“物质”的解释不打算限于治疗药剂(或潜在的治疗药剂)，或被证明具有毒性效应的试剂例如神经毒素，肝脏毒素，造血细胞毒素，肌肉毒素，致癌物，致畸物或针对一种或多种生殖器官的毒素。术语物质还可以是化学组合物，例如农业化学物例如农药，杀真菌剂，肥料，或者也可以是在化妆品中使用的成分。

本文文本中的术语“IC50”表示测试物质在体外导致50％的实验细胞死亡时的浓度。

“效率”或“有效的”，如果没有特别定义，在本文的分析方法的语境中是指与现有技术中描述的方法或分析方法，例如基于小鼠胚胎干细胞或小鼠癌细胞的分析方法相比，所述分析方法更可能检测到在人类中有毒性的物质，和/或毒性浓度，例如可用时，所分析的相应的IC50值更接近已知人类体内数据。

发明简述

本发明涉及用于在人种中检测和/或预测毒性的，基于人类胚泡米源的干细胞的体外毒性分析方法，其中该分析方法能够对物质的毒性进行新型检测，和/或与非人类分析方法或基于成体人类细胞类型的分析方法相比能够更有效地检测毒性。

本发明还涉及用于在人种中检测和/或预测毒性的，基于人类胚泡来源的干细胞衍生的人类祖细胞的体外毒性分析方法，其中该分析方法能够对物质的毒性进行新型检测，和/或与非人类分析方法或基于成体人类细胞类型的分析方法相比能够更有效地检测毒性。

本发明的另一方面是用于在人种中检测和/或预测毒性的，包含了选自人类胚泡来源的干细胞，人类祖细胞和人类成体类细胞中的至少两种人类细胞类型，例如至少三种，至少四种，至少五种人类细胞类型的体外毒性分析方法，其中该分析方法能够对物质的毒性进行新型检测，和/或与非人类分析方法或基于成体人类细胞类型的分析方法相比，能够更有效地检测毒性。具体来说，本发明的分析方法可以预测分化毒性：例如，对胚胎细胞比对成体细胞更高程度的毒性。

本发明的另一方面是用于在人种中检测毒性的，基于人类胚泡来源的干细胞的体外毒性分析方法，该分析方法与非人类分析方法相比，更有效地预测人类毒性，例如13-顺式视黄酸(13CRA)的胚胎毒性。

本发明的另一方面是用于在人种中检测毒性的，基于从人类胚泡来源的干细胞衍生的人类祖细胞，例如人类胚泡干细胞衍生的间充质祖细胞(hBS-MPs)的体外毒性分析方法，该分析方法与成体人类细胞例如hEF相比，更有效地预测全反式视黄酸(ATRA)的人类毒性。

本发明还涉及通过将人类胚泡来源的干细胞的一个或多个群暴露于物质，在人种中检测和/或预测该物质的体外毒性的方法/分析方法，该方法包括下列步骤：

(i)将细胞接种在多孔板中

(ii)将接种的细胞暴露于一种或多种浓度的一种/或多种物质

(iii)分析细胞毒性和/或胚胎毒性终点。

(iv)任选地，与已知的体内毒性数据相关联。

本发明还涉及通过将一个或多个人类祖细胞群暴露于物质，在人种中检测和/或预测该物质的体外毒性的其它的方法，该方法包括下列步骤：

(i)将细胞接种在多孔板中

(ii)将接种的细胞暴露于一种或多种浓度的一种/或多种物质

(iii)分析细胞毒性和/或胚胎毒性终点。

(iv)任选地，与已知的体内毒性数据相关联。

(i)将人类胚泡来源的干细胞接种到一个或多个多孔板的一个或多个孔中

(ii)将成熟的人类细胞类型接种到(i)中多孔板的不同的孔中或接种到一个或多个不同板的一个或多个孔中

(iii)任选地，将一个或多个从人类胚泡来源的干细胞衍生的祖细胞群接种到(i)和/或(ii)中的多孔板的不同的孔中，和/或接种到一个或多个不同的多孔板的一个或多个孔中，

条件是接种的密度使得细胞基本上维持其增殖能力，直到对暴露于细胞的一种或多种物质的一种或多种效应进行测量的时间点。

本发明还涉及通过将人类胚泡来源的干细胞的一个或多个群暴露于物质，在人种中检测和/或预测该物质的体外毒性的方法/分析方法，该方法包括下列步骤

(i)将从人类胚泡来源的干细胞衍生的一个或多个祖细胞群各接种到一个或多个多孔板中

(ii)将成熟的人类细胞类型接种到(i)中多孔板的不同的孔中或接种到一个或多个不同的板中

条件是接种的密度使得细胞能够基本上维持其增殖能力，直到对暴露于细胞的一种或多种物质的一种或多种效应进行测量的时间点。

(ii)将从人类胚泡来源的干细胞衍生的一个或多个祖细胞群各接种到(i)中的一个或多个多孔板中，或接种到一个或多个不同的板中

发明详述

人类胚泡干细胞为发育毒性测试提供了独一无二的工具，因此，按照本发明，我们开发了基于hBS细胞的发育毒性测试，例如发育毒性分析方法和细胞毒性分析方法。作为概念的验证，使用了代表三种不同的发育成熟程度的多能hBS细胞，hBS细胞来源的间充质祖细胞(hBS MPs)和人类包皮成纤维细胞(hFFs)，开发了带有终点存活性的毒性分析方法。使用两种不同的存活性分析方法，即ATP含量和刃天青(resazurin)(RES)还原，测试了一组具有众所周知的体内数据的发育毒性物质，即全反式视黄酸(ATRA)和13-顺式视黄酸(13CRA)。此外，5-氟尿嘧啶(5-FU)被用作阳性对照，邻磺酰苯酰亚胺(Saccharin)(糖精)被用作阴性对照。

类视色素例如ATRA和13CRA主要用于治疗癌症和皮肤病例如痤疮或牛皮癣。类视色素诱导的畸形的特征性形式包括颅面结构，包括中枢神经系统，肢体，胸腺和中轴骨骼的缺陷(Ross等，2000)。尽管ATRA和13CRA在人类中都是强致畸物，但它们在鼠类系统中的致畸能力是不同的(Nau等，2001)。与ATRA相比，13CRA在小鼠体内显示出低得多的致畸能力，在鼠类畸胎癌(P19)细胞中显示出较低的体外分化诱导能力(Adler等，2005；Soprano和Soprano 1995)。因此，这些结构相关的物质被选择用于挑战我们的测试系统。抗癌症药物5-FU在体内和体外都是发育毒性物质(Jacob等，1986)，关于人类中5-FU相关的出生缺陷也有独立的报道(Stephens等，1980)。

本发明的一个实施方案涉及基于hBS细胞，hBS细胞衍生的祖细胞和/或人类包皮成纤维细胞的细胞毒性测试，这些细胞代表了来自不同分化水平的细胞或其组合。该基于细胞毒性作为终点的测试有效检测某些人类发育毒性物质，包括全反式视黄酸(ATRA)和13-顺式视黄酸(13CRA)。这些物质在未分化的胚泡来源的干细胞和祖细胞中显示出较低的IC50值，相比而言在成体人类细胞中该值较高。

本发明还涉及用于在人种中检测和/或预测毒性的基于人类胚泡来源的干细胞的体外毒性分析方法。该分析方法能够对物质的毒性，特别是物质对胚胎细胞或正在发育的细胞的毒性进行新型检测，和/或与非人类分析方法或基于成体人类细胞类型的分析方法相比，更有效地在人类中检测和/或预测毒性。

本发明还涉及用于在人种中检测和/或预测毒性的，基于从胚泡来源的干细胞衍生的人类祖细胞的体外毒性分析方法，其中该分析方法能够对物质的毒性进行新型检测，和/或与非人类分析方法或基于成体人类细胞类型的分析方法相比，能够更有效地检测和/或预测在人类中的毒性。本发明的祖细胞可以是介于hBS细胞和完全分化的细胞之间的任一祖细胞。本发明中的适合的祖细胞可以是中胚层，内胚层或外胚层细胞类型。祖细胞还可以是间充质祖细胞，成纤维细胞类祖细胞，心脏祖细胞，肝祖细胞，胰祖细胞或神经祖细胞。

在本发明的具体实施方案中，祖细胞是人类胚泡干细胞来源的间充质祖细胞(hBS-MPs)。

IC50值的比较显示出，hBS细胞和hBS来源的祖细胞与成体的成熟细胞类型例如hFF细胞相比，对毒性物质例如5-FU，ATRA和13CRA更敏感(参见图3和4)。祖细胞代表了容易被培养的hBS来源的细胞类型，能够通过酶法传代进行较大规模的培养，同时仍然维持对有毒物质的较高的敏感性。

本发明还涉及含有至少两种人类细胞类型，例如至少三种，至少四种，至少五种人类细胞类型的分析方法。这些人类细胞类型可以选自hBS细胞，祖细胞和成体类细胞。成体类细胞可以源自于不同的人类组织，例如皮肤和肌肉。成体类细胞也可以源自于不同的发育阶段，例如新生儿或成人。在本发明的具体实施方案中，所用的成体类细胞是来自新生男婴的人类包皮成纤维细胞。

本发明还涉及体外毒性分析方法，其中非人种的分析可以是任何非人类哺乳动物来源的分析，例如小鼠，大鼠或猪的分析。小鼠分析又可以举例如基于小鼠胚胎干细胞的分析或基于小鼠畸胎瘤细胞的分析。

作为本申请的参考系统的非人类分析方法，也可以是体内分析方法。这样的体内分析方法可以是例如小鼠，大鼠，兔，猪或狗的动物模型。

更具体来说，本发明涉及用于在人种中检测和/或预测毒性的，基于人类胚泡来源的干细胞的体外毒性分析方法，其中分析方法能够对物质的毒性进行新型检测，和/或与非人类分析方法相比，能够更有效地检测毒性，例如效率高至少50％，至少75％以上，或至少2倍，至少5倍，至少10倍，至少30倍，至少50倍，至少75倍，至少100倍。

在本发明的具体实施方案中，体外毒性分析方法与基于小鼠畸胎瘤细胞的非人类分析方法相比，检测毒性的效率高123倍。

同样地，本发明涉及用于在人种中检测和/或预测毒性的，基于人类胚泡来源的干细胞的体外毒性分析方法，其中分析方法能够对物质的毒性进行新型检测，和/或更有效地检测毒性，例如当比较hBS细胞和祖细胞时，检测毒性，特别是对胚胎细胞的毒性的效率高至少1.5倍，至少4倍，至少10倍，当比较hBS细胞和成体类成纤维细胞时，检测毒性的效率高至少2倍，例如至少4倍，至少10倍，当比较祖细胞和成体类成纤维细胞时，检测毒性的效率高至少1.5倍，至少2倍，至少5倍，至少10倍。

此外，本发明的分析方法可以基于细胞毒性终点，例如测量存活率。用于这些终点的适合的检测技术可以选自测量代谢活性包括ATP含量分析，MTT盐分析和刃天青转化。

本发明的其它适合的终点可以选自胚胎毒性终点。可以在基因水平或蛋白水平上对生物分子的表达水平进行分析，例如RNA的基因组和蛋白质组测量，酶和抗体水平。也可以分析微型RNA水平。即测量细胞毒性又测量胚胎毒性的适合的方法可以是比色法(可见光颜色的可定量的变化)或荧光测定法(荧光的可定量的变化)。测量可以在多孔板读出器中进行，其中几个孔的内含物可以同时被分析。试验被设计成可以扩大以用于中到高通量应用。用于检测和定量测定毒性效应的另一种适合的方案可以在高含量读出器(High Content Reader)中进行。

在本发明的一个实施方案中，使用了有力的筛选技术高含量筛选(HCS)。HCS以一种允许对物质进行快速筛选的方式，扩展了鉴定和定量化合物对多种细胞事件的效应的能力。HCS允许在单一筛选平台上同时进行多个测量。它可以多孔板样品制备的通量自动执行与微观研究有关的任务，例如数据捕获和分析，同时能够对特定的细胞事件进行定量。

根据本发明，在发育毒性测试中，HSC能够平行检测对分化成所有三种胚层的影响，同时在相关的生物学系统中检测同一个测试板中的细胞毒性。也可以使用HCS为研究毒性动力学和受影响的途径提供有价值的工具，检测物质对活细胞的时间依赖性的影响。

在本发明的一个实施方案中，当在毒物学测试中使用hBSC时，细胞可能需要以小的聚集体形式接种，以便维持在增殖阶段。这一般在毒性测试中将引起干扰，因为可能发生一个孔与另一个孔中细胞数量的高度变化。使用HCS技术，有可能将测量的信号归一化(normalize)到每个测试孔的细胞数量。

在本发明的具体实施方案中，细胞毒性通过刃天青转化来测量。

在本发明的另一个实施方案中，细胞毒性通过ATP含量分析来测量。

本发明的另一个具体实施方案涉及用于在人种中检测毒性的，基于人类胚泡来源的干细胞的体外毒性分析方法，与非人类分析方法相比，能够更有效地检测13CRA的人类毒性。

在本发明的另一个实施方案中，可以使用遗传工程化的细胞株，例如未分化的hBS细胞株，hBS衍生的祖细胞类型或体细胞类hBS细胞，衍生的类型。这样的工程化的细胞株可以是在发育相关启动子控制之下表达荧光或其它标记物的报告物细胞株。

此外，本发明涉及通过将一个或多个人类胚泡来源的干细胞群暴露于物质，在人种中检测和/或预测该物质的体外毒性的方法，该方法包括下列步骤：

(i)将细胞接种在多孔板中

(ii)将接种的细胞暴露于一种或多种浓度的一种/或多种物质中

(iii)分析细胞毒性和/或胚胎毒性终点。

(iv)任选地，与已知的体内毒性数据相关联。

本发明还涉及通过将一个或多个人类胚泡来源的干细胞群暴露于物质，在人种中检测和/或预测该物质的体外毒性的方法/分析方法，该方法包括下列步骤

(ii)将成熟的人类细胞类型接种到(i)中多孔板的不同的孔中或接种到一个或多个不同板的一个或多个孔中。

(iii)任选地，将一个或多个从人类胚泡来源的干细胞衍生的祖细胞群分别接种到(i)和/或(ii)中的多孔板的不同的孔中，或接种到一个或多个不同的多孔板的一个或多个孔中，

此外，本发明涉及通过将人类胚泡来源的干细胞的一个或多个群暴露于物质，在人种中检测和/或预测该物质的体外毒性的方法，该方法包括下列步骤

在该时间过程中，可以观察到被接种的hBS来源的细胞分化成例如，来自所有胚层的祖细胞类型，例如心脏前体细胞，肝细胞类祖细胞和神经元祖细胞。

本发明的另一个实施方案还涉及通过将一个或多个人类祖细胞群暴露于物质，在人种中检测和/或预测该物质的体外毒性的方法，该方法包括下列步骤：

(i)将细胞接种在多孔板中

(iii)分析细胞毒性和/或胚胎毒性终点。

(iv)任选地，与已知的体内毒性数据相关联。

分析可以在1536，384，96，48，24，12，6孔的多孔板中进行。在96孔板的情况下，在步骤(i)中接种的细胞的数量范围为每个孔一个细胞到一百万(M)个细胞，优选为1,000-100,000个细胞，更优选为10,000-30,000个细胞。任何步骤(i)中的板的孔还可以用蛋白，肽或细胞外基质成分预先/在后包被。

步骤(ii)中细胞的暴露可以进行1分钟到60天，优选为5分钟到30天，1天到20天，更优选为5-15天。

步骤(iii)中的毒性分析可以通过本文描述的任何适合的终点来进行。

在步骤(iv)中，获得的体外数据可以进一步与体内数据通过数学预测模型或算法进行比较。

本发明的一个具体实施方案涉及通过将一个或多个人类胚泡来源的干细胞群暴露于物质，在人种中检测和/或预测该物质的体外毒性的方法，该方法包括下列步骤：

(i)将细胞接种在未包被的或包被的多孔组织培养皿中

(ii)将接种的细胞暴露于几种浓度的物质中10天

(iii)通过测量ATP含量或刃天青转化进行分析。

另一方面，本发明涉及将本文描述的分析方法用于药物开发和/或用于安全性评估研究。

另一方面，本发明涉及将本文描述的分析方法用于胚胎毒性，致畸性研究，和/或用于评估通过欧洲REACH法规鉴定的物质。

本发明还涉及用于如本文所述在人类中检测毒性的试剂盒或使用本文描述的方法的试剂盒，该试剂盒包含：

(i)人类胚泡来源的干细胞

(ii)(任选的)阳性和阴性对照物质

(iii)用户手册。

本发明的试剂盒还可以包含选自祖细胞和成体类成纤维细胞的至少一种其它类型的人类细胞。

本发明还涉及用于如上所述在人类中检测毒性的试剂盒或使用如上所述的方法的试剂盒，该试剂盒包含：

(i)从人类胚泡来源的干细胞衍生的祖细胞

(ii)(任选的)阳性和阴性对照物质

(iii)用户手册。

本发明的一个实施方案是试剂盒，其中含有hBS或hBS细胞来源的细胞类型，该细胞类型任选地被遗传工程化或任选地与胚层特异性抗体组合，并连同算法，例如用于定量检测一组发育毒性相关终点以及常见细胞毒性终点的高含量筛选算法。

附图说明

图1.通过在第10天测量直接与活细胞数量成比例的细胞内ATP含量而确定的hBS细胞(A)，hBS MPs(B)和hFFs(C)的增殖曲线。对于hFFs和hBS MPs来说，进行了四个独立的增殖试验(n＝4)，对于hBS细胞来说进行了两个独立的试验(n＝2)。误差棒描述了平均值的标准误差。

图2.在(a)第1天，(b)第4天，(c)第7天和(d)第10天监测到的96孔板中hBS细胞生长和分化的相差显微镜照片。在第0天时接种密度为60,000个细胞/孔。

图3.使用三种细胞类型hFFs，hBS MPs和hBS细胞获得的阴性对照物质糖精(A，B)和阳性对照物质5-FU(C，D)的浓度响应曲线。数据通过测量每个孔的RES还原(A，C)和细胞内ATP含量(B，D)，并按照未处理的/溶剂对照进行归一而获得。所有实验独立进行三次(n＝3)。误差棒描述了平均值的标准误差。误差棒描述了平均值的标准误差。所有实验独立进行三次。

图4.使用三种细胞类型hFFs，hBS MPs和hBS细胞获得的物质ATRA(A，B)和13-CRA(C，D)的浓度响应曲线。数据通过测量每个孔的RES还原(A，C)和细胞内ATP含量(B，D)，并按照未处理的/溶剂对照进行归一而获得。所有实验至少独立进行三次(nX3)。误差棒描述了平均值的标准误差。对于ATRA和13-CRA来说，hBS细胞和祖细胞显示出了比hEF更高的对毒性物质的敏感性。hBS和祖细胞之间的IC50比率是10000∶1(ATRA)和4000∶1(13-CRA)。在hBS细胞和hFF之间，IC50值超过1∶4(ATRA)和超过1∶6(13-CRA)。

图5a)显示了使用ATP分析获得的在暴露10天后未分化的hBS细胞中ATRA和13CRA的浓度响应曲线。ATRA和13CRA的IC50值分别为30.38μM和15.85μM。图5b)显示了使用ATP分析获得的在暴露10天后hFFs中ATRA和13CRA(13-顺式视黄酸)的剂量响应曲线。ATRA和13CRA的IC50值分别为244.3μM和301.6μM。

实施例

实施例1.hBS细胞，祖细胞和hFF细胞的培养

hBS细胞株SA002和SA002.5按照以前的描述确立和表征(Heins等，2004，WO03055992)，并在NIH(http://stemcells.nih.gov/research/registry/cellartis.asp)和英国干细胞库(http://www.mrc.ac.uk/Utilities/Documentrecord/index.htm？ d＝MRC003259)登记。细胞株被维持在丝裂霉素C失活的小鼠胚胎成纤维细胞(mEF)上，在添加有4ng/ml人类重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(Invitrogen，Carlsbad，California)的VitroHES^TM培养基中(Vitrolife，Kungsbacka，Sweden)。使用Swemed干细胞工具(SwemedLab International AB，Billdal，Sweden)通过机械解离每4-5天对未分化的hBS细胞进行传代。

通过将hBS细胞集落切成200×200μm的块，并将块放置在培养皿中，以在基于KO-DMEM，20％FCS，1％Glutamax，1％NEAA，1％PEST和0.1mM β-巯基乙醇(都来自Gibco Initrogen)的培养基中聚集，来产生成纤维细胞类的祖细胞。经过4天的时间，漂浮的聚集物形成，然后以每个孔大约10个聚集体的高密度铺于用明胶包被的组织培养皿中。观察到细胞的生长，并在第5-14天进一步将细胞解离，并在第一次传代时按1∶1拆分进行传代。当培养物达到铺满时，一般将拆分比率设置为1∶2。在聚集体铺板后用于传代培养的培养基包含不带有丙酮酸钠+glutamax的DMEM高葡萄糖培养基，10％FCS，4ng/ml bFBF和1％PEST。

人类胚泡干细胞来源的间充质祖细胞(hBS-MPs)通过使用下列方法从hBS细胞株SA002.5衍生来获得，该方法包括下列步骤：

i)将未分化的hBS细胞铺在表面上；

ii)温育2到21天，例如3到10天，优选7天，以允许分化；

iii)酶法传代到新型表面上；

iv)重复步骤(iii)，直到获得均匀的间充质形态；

v)培养获得的hBS-MP细胞。

在毒性测试前，将hBS-MPs培养在Dulbecco′s修改的Eagle′s培养基中，其中添加有10％FCS(二者都来自Gibco Invitrogen Corporation，Paisley，Scotland)和4ng/ml bFGF，每4天以1∶10的拆分比率传代培养。培养在T-25组织培养瓶上进行，使用胰蛋白酶(Invitorgen)进行传代。

具体来说，可扩增的hBS MPs从hBS细胞株SA002.5衍生而来。因此，使用Tryple Select^TM将hBS细胞酶法解离，并在含有添加了10％胎牛血清(FBS)和10ng/ml bFGF的DMEM培养基(都来自Invitrogen)中，以每平方厘米1.5×10⁵个细胞的浓度铺在用0.1％明胶包被的细胞培养皿上(BD Falcon/BD Biosciences，Bedford，MA，USA)。分化7天后，将hBS细胞作为单个细胞酶法传代培养到新的明胶包被的培养皿中。该过程每7天重复一次，直到细胞群在形态上变得均匀。该细胞群的全部表征作为另一项显示出hBS MPs在形态学和标记物表达方面类似胚胎间充质(投送的稿件)细胞的研究的一部分进行。将hBS MPs培养在未包被的组织培养瓶中(BD Falcon^TM，BD Biosciences)添加有10％FBS，50U/ml青霉素/链霉素和4ng/ml bFGF的DMEM中(都来自Invitrogen)，每4天以1∶10的拆分比率进行传代培养。

人类包皮成纤维细胞(hFF)从美国典型培养物保藏中心(CRL-2429 ATCC，Manassas，VA)获得，培养在添加有10％FBS的Dulbecco′s修改过的Eagle′s培养基中，每4天以1∶5的拆分比率进行传代培养。培养在T-25组织培养瓶上进行，使用胰蛋白酶(Invitorgen)进行传代。

实施例2.增殖

为了确定在10天的毒性试验中每个孔中接种的最适细胞数量，进行了一组增殖试验。接种的最适细胞数量必须在接种的细胞数量与在试验的读数天时的信号成比例的范围内。将各三份hFFs，hBS MPs和hBS细胞以两倍的连续稀释率接种在明胶(Sigma)包被的96孔板中添加有10％FBS和50U/ml青霉素/链霉素的DMEM中(都来自Invitrogen)，对于以单细胞悬浮液接种的hFF和hBS MPs来说，最高细胞密度为16,000个细胞/孔，对于以50到100个细胞的聚集体接种的hBS细胞来说，最高细胞密度为60,000个细胞/孔。在细胞接种后将带有hBSC的板立即在400g离心5分钟，以支持hBS细胞聚集体的可繁殖的附着。在第4天和第7天更换培养基。在第10天，使用CellTiterGlo试剂盒(Promega)按照制造商的说明书测量每个孔中的细胞内ATP含量。对于hFF和hBS MPs来说进行4次独立的试验，对于hBS细胞来说进行两次独立的试验。此外，使用倒置显微镜(Nikon，Düsseldorf，Germany)每天监测hBS细胞的生长，直到第10天。在第1，4，7和10天使用数码相机(Nikon)照相。

hBS细胞增殖试验的结果(图1A)显示，在接种密度达到15,000个hBS细胞/孔的情况下，第10天时每个孔的细胞数量与第0天时接种的细胞数量成正比。在更高的接种密度时，曲线变平。hBS MPs细胞增殖试验的结果(图1B)表明，在接种密度达到500个hBS MPs/孔的情况下，第10天时每个孔的细胞数量与接种的细胞数量成正比。在更高的接种密度时，曲线变平，甚至从4000个细胞/孔向上，曲线开始下降。hFFs的曲线(图1C)也显示出在接种密度达到500个hFFs/孔的情况下，第10天时的细胞数量与接种的细胞数量之间成正比，在更高的接种密度下曲线变平。但是，当接种密度从4000个细胞/孔向上时，曲线保持在平台。在比较了这些结果之后，我们从图的对数期中选择了合适的接种细胞数，用于随后的毒性测试，即hFFs为500个细胞/孔，hBS MPs为500个细胞/孔，hBS细胞为5000个细胞/孔。此外，使用相差显微镜对hBS细胞的生长进行了10天的监测(图2)。照片证实了接种的hBS细胞在10天的时间内生长和分化成了各种不同的组织类结构。

实施例3.细胞毒性测试

将hBS细胞群落分解成大约50到100个细胞的小聚集体，并以5000个细胞/孔的密度接种到明胶包被的96孔板(Nunc，Kamstrupvej，Denmark)中的100mL含有敲除DMEM培养基的测试培养基中，该培养基中添加了20％FBS，1％青霉素-链霉素，1％Glutamax，0.5mmol/lN-巯基乙醇和1％非必需氨基酸(都来自Invitrogen)。hBS MPs和hFF细胞被解离成单细胞，以500个细胞/孔的密度接种到明胶包被的96孔板(Nunc)中的100mL测试培养基中。接种后直接将含有hBSC的板在400g离心5分钟。

祖细胞和hFF细胞被解离成单细胞，并接种到96孔板中的100μl测试培养基中。

24小时后，通过在测试孔中加入100μl具有两倍所需终浓度的浓度的毒性溶液，开始细胞毒性测试(第0天)。在分析的第4天和第7天更换毒性培养基，并在第10天对板进行分析，测量不同的检测方法的细胞毒性，即，使用Promega的CellTiterGlo试剂盒(Promega，Mannheim，Germany)按照制造商的说明书测量ATP含量，以及按照以前的描述(Evans等，2001)测量刃天青(Sigma，Stockholm，Sweden，CAS62758-13-8)还原成发荧光的Resofurin。两个终点都使用多重检测读出器(Fluostar Optima，BMG Labtech，Offenburg，Germany)进行分析，测量CellTiter Glo试剂盒的发光，以及对于刃天青分析来说在波长530nm(激发)和590nm(发射)处测量荧光。

实施例4.化学物质的测试和统计学分析

测试了下面的物质：5-FU(Invivogen，Toulouse，France，CAS51-21-8)作为阳性对照，糖精钠(Sigma，CAS 128-44-9)作为阴性对照，ATRA(Sigma，CAS 302-79-4)，13CRA(Sigma，CAS 4759-48-2)。将糖精在PBS中稀释到浓度为1g/ml，并分成等份试样储存在4℃。将ATRA和13CRA溶解在DMSO中，浓度为0.1M，分成等份试样储存在-20℃。将5-FU溶液(Invivogen)和DMSO直接稀释在测试培养基中。所有化学物质都以3倍的连续稀释度进行测试，最高浓度为：5-FU为27MM，糖精为1mg/ml，ATRA和13CRA为100MM。对于ATRA和13CRA来说，连续稀释在DMSO中进行，然后将稀释液加入到测试培养基中以获得最终测试浓度。这样做是为了将所有被测试的ATRA和13CRA测试中的DMSO浓度维持在相等的0.1％。所有的实验至少独立地进行三次。

IC50值通过将四参数的山丘函数(hill function)拟合于数据而获得。所有细胞类型都与5-FU显示出毒性反应，与糖精不显示毒性反应(参见图3)。IC50值的比较显示出hBS细胞和祖细胞比hFF细胞对物质5-FU，ATRA和13CRA要敏感得多。祖细胞代表了容易培养的hBS细胞类型，能够使用酶法传代进行较大规模的培养，同时维持对毒性物质的较高敏感性。

更重要的是，在未分化的hBS细胞上，ATRA的IC50值高于13CRA的IC50值，在ATP分析中分别为25.76μM和15.85μM(参见图4)，在刃天青分析中分别为17.31μM和14.51μM。对于祖细胞来说，发现了同样的结果，其中IC50值与hFF和hBS细胞相比急剧降低，ATRA为0.0027μM，13CRAS为0.0004μM，在刃天青分析中分别为0.0009μM和0.00002μM。

以前报道的在基于多能畸胎瘤P19细胞的小鼠系统中相应的IC50值(Adler等，2005，The detection of differentiation-inducing chemicals byusing green fluorescent protein expression in genetically engineeredteratocarcinoma cells(使用在遗传工程化的畸胎瘤细胞中表达的绿色荧光蛋白检测诱导分化的化学物质)，Altern Lab Anim.2005 Apr；33(2)：91-103；Adler的论文(http://w3.ub.uni-konstanz.de/v13/volltexte/2005/1619//pdf/Adler.pdf)分别为0.005μM和0.38μM，即小鼠系统不能以123的倍率检测13CRA，[(IC50小鼠(13CRA)/(IC50小鼠(ATRA))等于76，即0.38/0.005，而(IC50人类(13CRA)/(IC50人类(ATRA))等于0.62，即15.85/25.76)。分别比较人类和小鼠的比率，0.62∶76等于123倍)。

表1：使用存活率作为人类胚胎干(hBS)细胞，hBS MP和人类包皮成纤维细胞(hFFs)的终点获得的测试化学物质的平均IC50值。测量的参数是ATP含量和刃天青还原成resofurin。所有的实验至少独立地进行三次(n＞3)。

两种类型的测试细胞(hBS细胞和hFF)的IC50值的比较，显示出hBS细胞比hFF细胞对物质5-FU，ATRA和13CRA敏感得多(对于ATRA和13CRA参见图4-5)。多能hBS细胞比hFFs对ATRA和13CRA敏感得多。这些发现以前的结果相一致，这些结果通过测量存活性证实鼠类多能细胞比成纤维细胞培养物对已知的致畸物具有更高的敏感性(Laschinski等，1991)。此外，在我们的测试系统中，对于所有测试的细胞类型来说，13-CRA的IC50值总是比ATRA的低。在以前的基于多能鼠类细胞的体外致畸性测试分析中，13CRA显示出比ATRA明显低的细胞毒性和致畸性能力(Adler等，2005)。尽管在鼠类系统中13CRA没有被分类成致畸物，但它在人类中是强的致畸物。因此，我们的结果表明基于人类细胞的测试系统具有超过基于动物细胞的分析方法的检测人类发育毒性物质的优势。

对于两种类型的细胞hBS细胞和hFF进行的ATRA和13CRA的ATP测量之间的比较也可以参见图4。表2和3显示分别使用ATP分析和刃天青分析测量到的IC50值之间的比率。

表2：使用ATP分析方法测量到的IC50值之间的比率

	hBS细胞	祖细胞	hFF
	hBS细胞	祖细胞	hFF	5-FU	1	2	7
ATRA	1	0.0001	＞4	5-FU	1	2	7

13CRA

1

0.000025

＞6

表3：使用刃天青分析方法测量到的IC50值之间的比率

	hBS细胞	祖细胞	hFF
	hBS细胞	祖细胞	hFF	5-FU	1	1	2.5
ATRA	1	0.0005	＞6	5-FU	1	1	2.5
ATRA	1	0.0005	＞6	13CRA	1	0.000001	＞7

两种不同的终点存活率检测方法，ATP分析方法和刃天青分析方法的统计学比较显示在表4中。

表4：两种不同的终点存活率检测方法的统计学比较。测量的参数是在人类包皮成纤维细胞(hFFs)，hBS MPs和人类胚胎干(hBS)细胞中用化学物质处理后，每个孔中的细胞内ATP含量和刃天青还原。使用双向ANOVA检验(^***p＜0.001；^**p＜0.01；^*p＜0.05)对浓度响应曲线之间的差异进行了统计学比较。实验至少独立进行三次(n23)。

在hBS细胞中使用两种检测方法获得的结果的相似性可能是由于它们与hFFs和hBS MPs相比较低的增殖速度。此外，与其它类型的细胞相比，未分化的hBS细胞含有较少的线粒体，而在它们分化过程中线粒体的数量增加(Cho等，2006)。因此，较低的增殖速度以及较低的线粒体数量，为hBS细胞中ATP和RES分析之间差异不显著，而这种差异在增殖速度高并含有更多线粒体的hFFs和hBS MPs中被扩大，提供了解释。但是，两种检测技术提供的IC50值在同样的浓度范围内，因此都适合于测量存活率。

实施例4.筛选一组物质以确定胚胎毒性

在多孔板形式的系统中使用hBS细胞或祖细胞或其组合对选定数量的测试化合物进行了测试。作为参比系统，选择并分析了一组具有不同胚胎潜在影响能力的物质，例如6到10种物质。该组中含有的化学物质从无胚胎毒性，中等胚胎毒性到强胚胎毒性。此外，选择了一种阴性(例如糖精)和一种阳性对照化合物(例如5-氟尿嘧啶)。

使用测试方案对参比和测试物质进行了分析，该方案中包含针对参与早期分化和分化成中胚层，内胚层和外胚层的蛋白的抗体，或在遗传工程化的hBSC中由胚层特异性启动子驱动的荧光蛋白的表达。正确的时间点对于分析来说是关键的，因此建立了选定的发育毒性终点的时间依赖性的表达。为了定量测试板中的荧光信号，使用了高含量读出器(High Content Reader)。

对于细胞毒性终点来说，评估描述了导致50％细胞死亡的化合物浓度的IC50值。从发育毒性终点计算出ID50值，它给出了导致所选标记物被下调50％时的物质的浓度。对这些值进行比较和评估。通过评估每种物质的IC50和ID50值之间的差异来评估化学物质的体外胚胎毒性。对于胚胎毒性物质来说，IC50值明显高于ID50值。使用这些结果，对参比物质和测试物质的排序可用于与已知的体内数据进行比较。

参考文献

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Claims

1.用于在人种中检测和/或预测毒性的基于人类胚泡来源的干细胞的体外毒性分析方法，其中该分析方法能够对物质的毒性进行新型检测，和/或与非人类分析方法或基于成体人类细胞类型的分析方法相比更有效地检测毒性。

2.用于在人种中检测和/或预测毒性的基于从人类胚泡来源的干细胞衍生的人类祖细胞的体外毒性分析方法，其中该分析方法能够对物质的毒性进行新型检测，和/或与非人类分析方法或基于成体人类细胞类型的分析方法相比更有效地检测毒性。

3.体外毒性分析方法，包括

4.体外毒性分析方法，包括

(i)将从人类胚泡来源的干细胞衍生的一个或多个祖细胞群分别接种到一个或多个多孔板中

5.体外毒性分析方法，包括

(ii)将从人类胚泡来源的干细胞衍生的一个或多个祖细胞群分别接种到(i)中的一个或多个多孔板中，或接种到一个或多个不同的板中

6.体外毒性分析方法，其特征为

(i)在多孔板中3,000-20,000个细胞/孔，更优选10,000-15,000个细胞/孔的人类胚泡来源的干细胞，以及每个单独的孔100-500个细胞，更优选每个单独的孔大约250个细胞的从胚泡来源的干细胞衍生的人类祖细胞

(ii)将细胞暴露于一种或多种浓度的一种或多种物质

(iii)从细胞毒性和/或胚胎毒性终点来分析效应。

7.权利要求2-6的体外毒性分析方法，基于从胚泡来源的干细胞衍生的人类祖细胞，诸如中胚层，内胚层或外胚层细胞类型，例如成纤维细胞，心肌细胞类祖细胞，肝和胰祖细胞，以及神经祖细胞。

8.权利要求2-7的体外毒性分析方法，其中毒性是人类分化毒性(在发育中的人类细胞上测量的)，诸如人类胚胎毒性。

9.用于在人种中检测和/或预测毒性的，包含选自人类胚泡来源的干细胞，人类祖细胞和人类成体类细胞中的至少两种人类细胞类型，诸如至少三种，诸如至少四种，诸如至少五种人类细胞类型的体外毒性分析方法，其中该分析方法能够对物质的毒性进行新型检测，和/或与非人类分析方法或基于成体人类细胞类型的分析方法相比，更有效地检测毒性。

10.权利要求3-9的体外毒性分析方法，其中人类祖细胞是hBS-MPs。

11.前述权利要求任一项的体外毒性分析方法，其中在1539，384，96，48，24，12或6孔板中所用细胞的数量范围为每孔1到1,000,000个细胞，优选为1,000-100,000个细胞，优选为10,000-30,000个细胞，更优选为10,000-20,000个细胞。

12.前述权利要求任一项的体外毒性分析方法，其中细胞与物质温育的时间为1分钟到60天，优选为1分钟到30天，更优选为5-15天。

13.前述权利要求任一项的体外毒性分析方法，其中细胞与物质温育的时间为10天。

14.前述权利要求任一项的体外毒性分析方法，其中非人类分析方法是体外分析方法，诸如使用选自小鼠胚胎干细胞和小鼠畸胎瘤细胞的基于小鼠细胞的分析方法。

15.权利要求1的体外分析方法，其中非人类分析方法是体内分析方法，诸如小鼠，大鼠或猪的体内分析方方。

16.前述权利要求任一项的体外毒性分析方法，与非人类分析方法相比，检测人类胚胎毒性的效率高至少两倍。

17.前述权利要求任一项的体外毒性分析方法，与非人类分析方法相比，检测人类胚胎毒性的效率高至少100倍。

18.前述权利要求任一项的体外毒性分析方法，与非人类分析方法相比，检测人类胚胎毒性的效率高至少123倍。

19.前述权利要求任一项的体外毒性分析方法，与人类成体类分析方法相比，检测人类毒性的效率高至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少7倍，至少10倍。

20.前述权利要求任一项的体外毒性分析方法，其中终点是细胞毒性。

21.权利要求1-20的体外毒性分析方法，其中终点是胚胎毒性特异性的，诸如分析基因和/或蛋白表达。

22.前述权利要求任一项的体外毒性分析方法，其中终点通过比色法或荧光测定法测量。

23.前述权利要求任一项的体外毒性分析方法，其中毒性通过刃天青转化目测。

24.前述权利要求任一项的体外毒性分析方法，其中毒性通过ATP含量分析目测。

25.用于在人种中检测毒性的，基于人类胚泡来源的干细胞的体外毒性分析方法，与非人类分析方法相比，更有效地检测13CRA的人类毒性。

26.通过将人类胚泡来源的干细胞的一个或多个群暴露于物质，在人种中检测和/或预测该物质的体外毒性的方法，该方法包括下列步骤

(i)将细胞接种在多孔板中

(ii)将接种的细胞暴露于一种或多种浓度的物质

(iii)分析细胞毒性和/或胚胎毒性终点

(iv)任选地，与已知的体内毒性数据相关联。

27.通过将一个或多个从胚泡来源的干细胞衍生的人类祖细胞的群暴露于物质，在人种中检测和/或预测该物质的体外毒性的方法，该方法包括下列步骤

(i)将细胞接种在多孔板中

(ii)将接种的细胞暴露于一种或多种浓度的物质

(iii)分析细胞毒性和/或胚胎毒性终点

(iv)任选地，与已知的体内毒性数据相关联。

28.通过将人类胚泡来源的干细胞的一个或多个群暴露于物质，在人种中检测和/或预测该物质的体外毒性的方法，该方法包括下列步骤

(i)将细胞接种在多孔板中

(ii)将接种的细胞暴露于几种浓度的物质

(iii)通过测量ATP含量或刃天青转化进行分析。

29.筛选物质的方法，包括

(a)获得下列细胞的组合物：(i)接种到一个或多个多孔板的一个或多个孔中的人类胚泡来源的干细胞，和(ii)接种到(i)中的多孔板的不同的孔中，或接种到一个或多个不同的板的一个或多个孔中的成熟的人类细胞类型，以及任选的(iii)接种到(i)和/或(ii)中的多孔板的不同的孔中，或接种到一个或多个不同的多孔板的一个或多个孔中的从人类胚泡来源的干细胞衍生的祖细胞群；以及

(b)任选地使或允许细胞进行分化；

(c)然后将细胞与一种和多种物质合并；以及

(d)任选地使或允许细胞进行分化；

(e)测定物质对细胞的任一效应。

30.筛选物质的方法，包括：i)获得包含3,000-20,000个细胞/孔，更优选10,000-15,000个细胞/孔的人类胚泡来源的干细胞的组合物；ii)任选地使或允许细胞进行分化；然后iii)将细胞与物质合并；以及iv)测定物质对细胞的任一效应。

31.筛选物质的方法，包括：a)获得100-5,000个细胞更优选100-500个细胞/孔的从人类胚泡来源的干细胞衍生的祖细胞的组合物；b)任选地使或允许细胞进行分化；然后iii)将细胞与物质合并；以及iv)测定物质对细胞的任一效应。

32.权利要求1-25中描述的分析方法在药物发现和/或安全性评估研究中的应用。

33.权利要求1-25中描述的分析方法在胚胎毒性和/或致畸性研究中的应用。

34.权利要求1-25中描述的分析方法在评估由欧洲REACH法规鉴定的物质中的应用。

35.用于按照权利要求1-25检测人类毒性或用于权利要求26-31描述的方法的试剂盒，该试剂盒含有：

(i)人类胚泡来源的干细胞

(ii)(任选的)阳性和阴性对照物质

(iii)用户手册

(iv)(任选的)培养基。

36.权利要求35的试剂盒，该试剂盒还含有选自祖细胞和成体类细胞的至少一种其他的人类细胞类型。

37.用于按照权利要求1-25检测人类中的毒性或用于权利要求22-26描述的方法的试剂盒，该试剂盒含有：

(i)从人类胚泡来源的干细胞衍生的祖细胞

(ii)(任选的)阳性和阴性对照物质

(iii)用户手册

(iv)(任选的)培养基。