CN104870633A - 用于体外测试发育毒性的方法和系统 - Google Patents

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Abstract

体外测试发育毒性的方法和系统，其包括以下步骤：微图案化细胞外基质；在存在中内胚层诱导培养基的情况下，使胚胎干细胞在微图案化细胞外基质上生长；以及在存在或不存在测试化合物的情况下，测试出几何形状的中内胚层结构的变化，其中，与缺少测试药物的细胞相比，在存在测试化合物的情况下，(1)中内胚层细胞分化的减少和/或(2)几何形状的中内胚层结构的形态学变化表明测试化合物是发育毒性剂。

Description

用于体外测试发育毒性的方法和系统
相关申请的交叉引用
本申请要求于2012年9月28日提交的新加坡专利申请第201207242-7号的权益，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及用于发育毒性测试的方法和系统。
背景技术
以下关于本发明背景技术的论述意在帮助对本发明的理解。但是，应当理解，在任何司法管辖权中，在本申请的优先权日，此论述不确认或不承认所涉及的任何材料是已发表的、已知的、或者作为公知常识的一部分。
先天缺陷是全世界新生儿死亡的主要原因之一1、2、3，其还会导致长期的残疾和疾病。胎儿发育期畸形可以归因于遗传条件或怀孕期间，特别是前三个月时的环境暴露。因此，监管部门，例如美国环境保护署(EPA)，已经要求评价环境因素，例如药物、化学品和杀虫剂的发育毒性4。
在动物上测试发育毒性受成本和伦理问题的限制。因此，开发出一些替代性的基于动物胚胎或细胞的体外发育模型，其包括青蛙胚胎畸形生长测定(FETAX)5，鸡胚胎毒性筛选测定(CHEST)6，使用小鼠胚胎间充质细胞的微团(MM)测定7，小鼠或大鼠全胚胎培养(WEC)测定8，斑马鱼胚胎幼体发育毒性测定9，以及小鼠胚胎干细胞测试(EST)10。
根据欧洲替代方法验证中心(ECVAM)，只有用于胚胎毒性测试的MM测定、WEC以及小鼠EST是经过科学验证的，并可以考虑用于监管性接受和可施用11-13。然而，物种间的差异导致无法充分解释人类和动物胚胎发育在分子调控上的差别，或者当用于生殖毒性测试时，产生带来灾难性后果的假阴性结果。例如，被召回的药物，沙利度胺，在人类中引起发育畸形而在小鼠中不会14。本技术的目的在于提供用于发育毒性研究和筛选应用的基于人类细胞的发育模型。
虽然还未成功的开发出人类EST，但已经开始尝试使用人胚胎干细胞(hESC)代替用于EST检测的小鼠ESC16、17。小鼠EST的核心标准是基于对小鼠胚胎干细胞(mESC)分化成跳动的心肌细胞的影响评价化合物的毒性10。使用小鼠ES细胞系D3和小鼠胚胎成纤维细胞系3T3，它们尝试测量两个细胞系的细胞毒性抑制值(IC50)以及mESC的分化抑制值(ID50)。进一步使用经验证的预测模型将药物化合物分成三类，“无胚胎毒性”，“弱胚胎毒性”和“强胚胎毒性”。整个过程持续10天，用传统的在显微镜下的跳动的心肌细胞监测，或者持续7天使用FACS检测心肌组织的基因表达。一个主要的原因是hESCs以缓慢的速率在体外分化成心肌细胞，较mESCs更耗时(30天后达10-25％)18，这使得不可能在第10天对跳动的心肌细胞计数。使用RT-PCR或免疫染色法，研究人员可以获取描述发育毒素作用的数据。然而，缺少合适的评分系统使其在药物测试应用中仍不令人满意。
2010年，Cezar的团队使用代谢组学和随机森林模型，首次成功将药物分类为发育毒素和非发育毒素19。然而，他们仅在hESC多潜能维持培养基(例如mTeSR1培养基)中测试了那些药物而没有在实际分化的hESC中测试，并且由于仅在实验中使用流传的浓度的药物，他们未能将那些发育毒素进一步分类为弱或强发育毒性化合物。
目前基于细胞的MM和EST测定可以潜在地包括人胚胎的细胞或者多潜能的细胞，但是在这些模型中，发育过程(例如细胞分化成3个胚层)是自发且无序的。因此，它们没有提供灵敏并可靠的分类发育毒素的方式，所述发育毒素包括胚胎毒素和致畸物，因为所述测定测量一般的细胞毒性7或心肌组织形成的抑制程度10，其太粗糙以致无法获取发育毒性的重要方面-分化图案的干扰。目前的EST模型依靠外源物作为发育毒性指示剂测量心肌细胞形成的抑制。因此它无法与hESC的固有性质相兼容，因为hESC无法像小鼠ES细胞一样容易地形成心肌细胞。
本发明的目的是改善此处提到的至少一个问题。
发明内容
在整个文件中，除非有另外相反的陈述，术语“包含”、“包括”等表述理解为非穷尽性列举，或换句话说，是指“包括但不限于”。
本技术包括一种体外测试发育毒性的方法，其包括以下步骤：
a.微图案化细胞外基质；
b.在存在中内胚层诱导培养基的情况下，使胚胎干细胞在微图案化细胞外基质上生长，以形成几何形状的中内胚层结构；以及
c.在存在或不存在测试化合物的情况下，测试几何形状的中内胚层结构的变化，其中，与不存在测试化合物的细胞相比，在存在测试化合物的情况下，(1)中内胚层细胞分化减少和/或(2)几何形状的中内胚层结构的形态学变化表明测试化合物是发育毒性剂。
中内胚层诱导剂用于模拟一种早期胚胎发育过程(原条形成)。这种方法的优点可能是有多于一个发育毒性作用的定量描述符。
参考以下提及的优选实施方式的说明性附图，回顾后面的说明书，本领域技术人员清楚本发明的其他方面和优点。
附图说明
本发明的优选实施方式将参考下述附图，仅以说明性实例的方式描述：
图1：用聚二甲基硅氧烷(PDMS)模板使细胞图案化。
图2：分化3天后形成与hESC集落形状相同的几何形状的中内胚层结构。(a)、(b)、(e)、(f)是面积为785000μm2的hESC集落；(c)、(d)是面积为196250μm2hESC集落。红色：中内胚层标记物Brachyury的免疫荧光染色；比例尺：200μm。
图3：共焦扫描hESC集落的边缘(圆形)。红色：Brachyury，蓝色：DAPI。(a)3-D重建显示Brachyury阳性细胞位于hESC集落的边缘，形成闪亮的“环形物”；(b)Z堆叠表明Brachyury阳性细胞仅位于细胞片层的顶层，并且在闪亮的“环形物”下方有“管状”结构。比例尺：30μm。
图4：在药物处理/无药物处理的条件下，分化3天后Brachyury的表达情况。用5-氟尿嘧啶(5-FU)(b)，丙戊酸(VPA)(c)或沙利度胺(d)处理后，T表达错误定位。比例尺：100μm。
图5：非对称比例计算。首先使用未处理的hESC集落获得环(a)&b)中的红色)的半径，然后用这个环作为经致畸剂处理的hESC集落的遮盖物(c)，分别计算两种非对称比例并比较相对变化。
图6：相对于未处理的对照，致畸剂诱导发生的非对称比例变化。a)致畸剂处理或无致畸剂处理的非对称比例值。b)与未处理对照组相比，致畸剂处理后的相对非对称比例变化。0.05μg/ml 5-FU的非对称比例下降了46.7％，从3降至1.6；0.1mM丙戊酸和0.8mM沙利度胺的不对称比例下降了70％，从3降至～0.9。
图7：微图案化的不同hESC细胞系形成的几何形状的中内胚层结构的图像。(A)：分化3天后微图案化的H9hESC。(B)分化3天后微图案化的H1hESC。
图8：通过空间图案化分化然后协调的形态发生性细胞运动形成几何形状的中内胚层结构。(A)第1天至第3天(D1-D3)微图案化的hESC(μp-hESC)集落的相位和荧光图像。中内胚层(T+)细胞第1天在集落边缘空间图案化，然后在第3天从展示为距集落边缘～150-200μm。(B)分化3天后其他中内胚层标记物的空间图案化。Wnt3a、Fgf8、Cripto1(绿色)与T(红色)共定位于μP-hESC集落中。(C)上皮细胞-间充质转化(EMT)标记物在μP-hESC集落的边缘和中心周围的转录水平。与集落中心的细胞相比，μP-hESC集落边缘附近的细胞具有更高的诸如Snail和波形蛋白的EMT标记物表达水平。Brachyury(T)、Wnt3a、Fgf8和Cripto1全部是中内胚层标记物。(D)在10X物镜下的μP-hESC集落3天活体成像的拼集的照片显示3天分化过程中细胞运动。(E)在3天活体成像窗口中沿着图1D上的集落的黄线进行的波动曲线记录图分析。集落边缘附近的细胞显示在第2天出现随机细胞迁移，但是在第3天经历了定向的集合性细胞运动。
图9：发育毒性药物影响μP-hESC模型中中内胚层结构的物理形态学/位置。(A)：药物处理的μP-hESC集落的波动曲线记录图。发育毒性药物处理(沙利度胺&VPA)下的集合性细胞迁移轨迹在第2-3天受到干扰，而在非发育毒性药物处理(青霉素G)下的集合性细胞迁移未受影响。(B)：有/没有药物处理的情况下，中内胚层标记物T在第3天的位置。当使用沙利度胺或VPA处理时，中内胚层图形(T+区域)的位置发生错位，然而使用阴性对照药物青霉素G时保持不变。比例尺：100μm。
图10：发育毒性药物引起的剂量依赖性发育毒性应答的PCA结果。(A-C)：当使用视黄酸(RA，＞＝0.0036μg/ml)、沙利度胺(＞＝300μM)或VPA(＞＝0.8mM)处理时，显著干扰μP-hESC集落内的中内胚层图形的空间分布。(D)：即使浓度达到1000μg/ml时，青霉素G药物处理也不能显著干扰μP-hESC集落内的中内胚层图形的空间分布。
图11：基于PCA和细胞毒性测试(MTS)结果的药物分类结果。(A)RA的有效浓度(能显著干扰μP-hESC模型中的中内胚层图形的空间位置的最低药物浓度)(ECRA)是～0.0036μg/ml，该浓度对hESC细胞系H9或成年人皮肤成纤维细胞(aHDF)无毒性。因此RA是一种致畸的发育毒性药物。(B)EC沙利度胺是～300μM，该浓度对aHDF无毒但对H9细胞有毒(＞50％存活)。因此沙利度胺是致畸和胚胎毒性的发育毒性药物。(C)ECVPA是～0.8μM，该浓度对aHDF有轻度毒性但对H9细胞具有很强毒性(20％存活)。因此VPA是具有很强胚胎毒性的发育毒性药物(意味着对hESC具有很强毒性)。(D)EC青 霉素G在1000μg/ml(大多数发育毒性测试平台的最高测试浓度)以上。因此青霉素G是非发育毒性药物。
发明详述
一种体外测试发育毒性的方法，其描述为包括以下步骤：
微图案化细胞外基质；
在存在中内胚层诱导培养基的情况下，使胚胎干细胞在微图案化的细胞外基质上生长以形成几何形状的中内胚层结构；以及
在存在或不存在测试化合物的情况下，测试几何形状的中内胚层结构的变化，其中，与不存在测试化合物的细胞相比，在存在测试化合物的情况下，(1)中内胚层细胞分化的减少和/或(2)几何形状中的内胚层结构的形态学变化表明测试化合物是发育毒性剂。
优选地，几何形状的中内胚层结构的形态学变化包括所述几何形状的中内胚层结构形状和/或位置的变化。
优选地，所述中内胚层诱导培养基包含激活素氨基酸、骨形态形成蛋白和成纤维细胞生长因子2的混合物。然而，任何本领域已知的引发中内胚层分化的培养基均适用。所述混合物可进一步包含血管内皮细胞生长因子。
激活素可以是本领域已知的任何分离的、再生的或合成的激活素蛋白。在哺乳动物中，描述了激活素的四种β亚基，称作激活素βA、激活素βB、激活素βC和激活素βE。优选地，包含激活素βA二聚体的激活素A用于中内胚层诱导培养基。优选地，激活素βA链具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列：
MPLLWLRGFLLASCWIIVRSSPTPGSEGHSAAPDCPSCALAALPKDVPNSQPEMVEAVKKHILNMLHLKKRPDVTQPVPKAALLNAIRKLHVGKVGENGYVEIEDDIGRRAEMNELMEQTSEIITFAESGTARKTLHFEISKEGSDLSVVERAEVWLFLKVPKANRTRTKVTIRLFQQQKHPQGSLDTGEEAEEVGLKGERSELLLSEKVVDARKSTWHVFPVSSSIQRLLDQGKSSLDVRIACEQCQESGASLVLLGKKKKKEEEGEGKKKGGGEGGAGADEEKEQSHRPFLMLQARQSEDHPHRRRRRGLECDGKVNICCKKQFFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANYCEGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
成骨蛋白(BMP)是一组生长因子，也称为细胞因子或metabologen。有20种已知的BMP。任何分离的、再生的或合成的BMP均适用。优选将BMP4用于所述中内胚层诱导培养基。优选地，人BMP4具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列：
MIPGNRMLMVVLLCQVLLGGASHASLIPETGKKKVAEIQGHAGGRRSGQSHELLRDFEATLLQMFGLRRRPQPSKSAVIPDYMRDLYRLQSGEEEEEQIHSTGLEYPERPASRANTVRSFHHEEHLENIPGTSENSAFRFLFNLSSIPENEVISSAELRLFREQVDQGPDWERGFHRINIYEVMKPPAEVVPGHLITRLLDTRLVHHNVTRWETFDVSPAVLRWTREKQPNYGLAIEVTHLHQTRTHQGQHVRISRSLPQGSGNWAQLRPLLVTFGHDGRGHALTRRRRAKRSPKHHSQRARKKNKNCRRHSLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYQAFYCHGDCPFPLADHLNSTNHAIVQTLVNSVNSSIPKACCVPTELSAISMLYLDEYDKVVLKNYQEMVVEGCGCR
成纤维细胞生长因子(FGF)是一组生长因子。在人类中已知22种FGF，它们结构上都相关，但是只有那些与肝素结合的FGF，例如FGF2将适用于所述中内胚层诱导培养基。优选地，人FGF2具有SEQ ID NO.3的氨基酸序列：
MVGVGGGDVEDVTPRPGGCQISGRGARGCNGIPGAAAWEAALPRRRPRRHPSVNPRSRAAGSPRTRGRRTEERPSGSRLGDRGRGRALPGGRLGGRGRGRAPERVGGRGRGRGTAAPRAAPAARGSRPGPAGTMAAGSITTLPALPEDGGSGAFPPGHFKDPKRLYCKNGGFFLRIHPDGRVDGVREKSDPHIKLQLQAEERGVVSIKGVCANRYLAMKEDGRLLASKCVTDECFFFERLESNNYNTYRSRKYTSWYVALKRTGQYKLGSKTGPGQKAILFLPMSAKS
在一个具体实施方式中，所述中内胚层诱导培养基进一步包含血管内皮细胞生长因子(VEGF)。血管内皮细胞生长因子(VEGF)是由细胞产生的信号蛋白，其刺激脉管发生或血管发生。广义的术语‘VEGF’覆盖了本领域已知的大量蛋白。VEGF可用于中内胚层诱导培养基。优选地，人VEGF具有SEQ ID NO.4的氨基酸序列：
MNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQAAPMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQEKKSVRGKGKGQKRKRKKSRYKSWSVYVGARCCLMPWSLPGPHPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR
在一个具体实施方式中，微图案化是通过以下方式实现，制作聚二甲基硅氧烷(PDMS)薄片模板，其具有在所述PDMS薄片中切割的多个几何形状，将所述PDMS模板密封入培养容器，所述基质涂覆在培养容器中的PDMS模板上，这样当PDMS模板被移除时，只有在所述多个几何形状中生长的细胞保留在培养容器中。优选地，所述培养容器是培养皿或96孔板中的孔，然而任何盛放基质以使胚胎干细胞生长的容器均适用。
在另一具体实施方式中，所述微图案化通过在基质上施用多个生长因子梯度来形成。所述多个生长因子梯度可以多个几何形状的形式印于基质上，使用例如微接触印刷(microcontact printing)、微流体图案化、喷墨印刷(inkjet printing)或任何其他本领域已知的将图案印于基质上的方法进行。
在一个具体实施方式中，所述多个几何形状具有相同的尺寸和形状。
在另一个具体实施方式中，所述多个几何形状的尺寸不同或形状不同。
所述多个几何形状可以是任何形状，例如圆形、正方形、半圆形、长方形或任意需要的形状。
优选地，所述培养基包含Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞分泌的凝胶状蛋白基质混合物。此已知为MatrigelTM(BD Biosciences)或Cultrex BMETM(Trevigen Inc)。其他能够支持胚胎细胞生长和分化的合适的培养基均适用，例如明胶、层粘连蛋白或本领域已知的合成肽。
所述测试方法可使用任何胚胎干细胞，但优选地，所述胚胎干细胞是人胚胎干细胞(hESC)。在一个具体实施方式中，所述胚胎干细胞以400万细胞/ml的密度接种。
优选地，中内胚层细胞分化测试是通过将针对中内胚层标记物的抗体和细胞温育，并使细胞成像以检测标记物而实现的。
优选地，与不存在测试化合物相比，在存在测试化合物的情况下，中内胚层细胞分化在微图案化的外周变化表明所述测试化合物是发育毒性剂。
我们提出的技术提供了在人干细胞中评价化学或药物诱导的发育毒性的新方法。我们的技术概括了中内胚层分化的空间图案，其标志着原肠胚的局部区域最早期分化结果。通过将人干细胞在具有特定几何结构的细胞外基质(ECM)岛上图案化，以对人胚胎干细胞(hESC)集落施加机械性梯度来实现。集落几何边缘的细胞倾向于分化成中内胚层。微图案化的hESC集落能产生对应于集落几何形状的中内胚层图案。这种分化图案在非细胞毒性浓度时受已知致畸剂的干扰，例如丙戊酸和沙利度胺。在微图案化的人干细胞集落中由于内源性机械胁迫导致的分化图案能通过成像方法定量，并且提供用于不同化学品和药物发育毒性的定量测量方法。
空间图案化的hESC分化由微图案化细胞集落中的内源性机械性梯度引起。
我们的技术能通过提供hESC实验数据以完善v-Embryo数据库补充ToxCast，其使用计算模型预测肝脏和发育毒性。
微图案化平台可用作研究发育生物学的实验工具。
我们的技术的优势包括以下内容：
●技术用人胚胎或多潜能干细胞进行。
○我们提出的技术已显示用人ES细胞有效。
●建立用于实验/药物测试的模型时间更短。
○3天而不是小鼠EST的7/10天。
●测量分化模式的干扰而不是难以确定基准的分化水平变化。
●通过测量分化模式的干扰，我们能定量获取非对称比例的变化，基于此可以进行清晰的药物分类。然而，在目前测量hESC分化水平变化的模型中，在相同条件下，甚至属于相同谱系的不同基因的表达变化可能会彼此大不一样。
●区分非特异性细胞毒性和谱系定向分化的干扰。
○我们的技术产生hESC分化图案并将测量这些形态学图案的干扰作为发育毒性试验的测试读数。因为我们不测量细胞存活力，所以我们的测量不会与一般细胞毒性混淆，其还影响细胞存活力。
●兼容高通量和高含量成像分析系统。
○例如，我们能让我们的模型适用于可更简单和更少耗时地进行基质涂覆的96孔板模式。在96孔板中接种hESC后，包括日常的培养基更换和免疫荧光染色在内的所有随后的样品制备过程可使用JANUSTM自动液体处理系统(Perkin Elmer)(由新加坡BioLaboratories定制)自动化操作。此外，可使用VTI HCS Reader(Thermo Scientific)获取图像以显著改善成像速度。最后，对于数据分析，我们可以只修饰程序使得能够在MATLAB软件中做连续非对称比例计算。
除了使用机械胁迫控制空间分化，我们也能直接图案化生长因子来诱导局部分化，形成生长因子梯度而非空间梯度，其也能应用于发育毒性测试。在这个实例中，微图案化是通过改变培养基上的中内胚层诱导培养基含量实施的。使用多步微图案化或微流体的生长因子图案化可能更难以处理但是仍能实现。
实施例
材料和方法
细胞图案化
为了产生机械胁迫梯度，使用AutoCAD软件设计了圆形或正方形的具有两种不同尺寸(785000μm2或196250μm2)的Matrigel基质。然后制作聚二甲基硅氧烷(PDMS)模板，所述制作通过使用激光切割机(Universal LaserSystem)在一张127μm厚的PDMS薄片(Specialty Silicone Products Inc.)上切割设计形状的图案并将其与激光切割的2mm厚的PDMS衬垫结合进行。为了细胞图案化，通过加入200μl 70％乙醇将所述PDMS模板首先密封入60mm培养皿中并在组织培养箱(hood)中干燥，然后通过与MatrigelTM溶液温育至少1小时涂覆MatrigelTM(BD Biosciences)基质(图1)。此后以400万细胞/ml的密度接种细胞。，温育1小时以使细胞附着之后，移去模板和多余的未附着的细胞。然后使用0.5％普郎尼克酸(pluronic acid)钝化表面10分钟，随后清洗3次。得到的图案化hESC在mTesR1维持培养基(StemCellTechnologies)中温育过夜以稳定化，第二天开始中内胚层诱导。
中内胚层诱导
用中内胚层诱导培养基诱导图案化的hESC集落分化，所述培养基是包含100ng/ml激活素，25ng/ml BMP4和10ng/ml FGF2的基础无血清的APELTM培养基(STEMdiffTM，StemCell Technologies)。为了发育毒性测试，所述图案化的hESC集落与测试化学品一起在中内胚层诱导培养基中培养。所述诱导持续3天，每天更换一半培养基，用/不用所述测试化合物。
免疫荧光染色、成像和数据分析
在分化第3天固定样品。进行免疫荧光染色检测早期中内胚层标记物Brachyury的表达分布。使用Olympus荧光显微镜在10X物镜下获取图像，并使用MATLAB程序计算非对称比例(图5)。
结果
体外形成的空间非对称中内胚层分化图案
在中内胚层诱导培养基中培养3天后，集落中的中内胚层的空间位置与集落的几何形状一致，形成“圆环样”结构(图2和图3)。换句话说，分化3天后，形成了与hESC集落的形状一致的几何形状的中内胚层结构。这种“圆环样”的结构具有独特的3维结构，Brachyury阳性细胞位于细胞薄片的顶层，一种“管样”结构形成于闪亮的“圆环”下方。这种现象表明我们的系统中确实发生了局部细胞分化和形态发生移动，其在人胚胎发生中也是并发的且不可避免的。
致畸剂的空间非对称图案干扰
使用这种模型测试三种已知的致畸剂(0.1mM丙戊酸(VPA)、0.05ug/ml5-氟尿嘧啶(5-FU)和0.8mM沙利度胺)。将中内胚层诱导培养基与药物一起加入我们的模型中，并温育3天，然后将所述样品固定以进行Brachyury的免疫荧光染色。每天用所述药物更换一半的培养基。仅在不含任何药物的中内胚层诱导培养基中培养的未处理对照也同样处理。结果显示全部三种药物可以干扰原始非对称分化图案，即破坏“圆环”的形成(图4)。为了测量这种干扰，我们以表示“环”区域与“非环”区域平均亮度比的非对称比例作为参数以评价经过或未经过药物处理的非对称图案(图5)。结果显示，对于未处理的对照，平均非对称比例大约2.5-3.5(图6)。当使用致畸剂处理时，非对称比例值因发育毒性作用而显著下降。对于0.05ug/ml 5-FU，非对称比例下降了46.7％，从3降至1.6；0.1mM丙戊酸和0.8mM沙利度胺的不对称比例下降了～70％，从3降至～0.9。这些结果意味着我们的模型对不同致畸剂的处理相当敏感(图6)，其作用可定量测量并用于药物的分类和评分。
几何形状的模板
制备不同几何形状(长方形、圆形、半圆形、正方形)的模板以确定PS诱导是否影响H9hESCs
1.使用60mm PS培养皿，
2.将所述模板用乙醇密封于60mm PS培养皿上，
3.在紫外光下使其干燥。
制成两个平板。
平板1：具有大的和小的形状的混合。
平板2：仅有大尺寸的形状。
1.加热mTeSR 1、accutase和DMEM/F12，
2.用10μm ROCKi补充3ml TeSR1(每份培养基加入5mM储存液2μl)。
3.移去分化的区域，
4.用DMEM/F12清洗培养物一次，
5.每个60mm培养皿加入1ml accutase并在37℃温育5-10分钟，
6.轻轻研磨将集落破碎成单个细胞，
7.将细胞转移至15ml试管，
8.每1ml accutase用至少5ml的DMEM/F12冲洗培养皿，收集培养基至15ml试管中，
9.将细胞在1000rpm离心3-5分钟，
10.移去细胞并且在mTeSR 1中重悬，每个模板用1.5ml补充的mTeSR1(对于2X模板使用3×6孔)，
11.抽取细胞悬液，使用DMEM/F12清洗一次，
12.加入3ml DMEM/F12至模板周边区域。使用镊子轻轻移去模板。除去DMEM/F12，
13.加入3ml APEL培养基+1ng/ml激活素A、25ng/ml BMP4和10ng/ml FGF2，
14.两天后更换一半体积的培养基(1.5ml)，
15.固定并进行免疫染色。
免疫染色
样品在3.7％多聚甲醛中固定20分钟，用含0.5％Triton X-100的PBS渗透15分钟。在封闭缓冲液(含2％BSA和0.1％Triton X-100的TBS缓冲液)中于4℃温育过夜后，与一抗(封闭缓冲液中5-10μg/ml)于4℃温育过夜。所使用的一抗是山羊抗Brachyury(10μg/ml，AF2085，R&D system)。样品以15分钟间隔洗涤5次后加入Alexa Fluor染料缀合的二抗(1∶1000，Molecular Probes)。室温温育1小时后，样品以15分钟间隔洗涤5次并用Hoechst 33342(10μg/ml，Molecular Probes)复染5分钟。此后，样品用PBS清洗3次后使用FluorsaveTM(Calbiochem)固定(mount)。
图7显示了由微图案化的不同hESC细胞系形成的几何形状的中内胚层结构的图像。微图案化为不同形状和尺寸的两种hESC系(H9和H1)3天的中内胚层分化后产生了几何形状中内胚层结构。图7A显示分化3天后的微图案化的H9hESCs，图7B显示分化3天后的微图案化的H1hESCs。左幅显示相衬图像；右幅显示中内胚层标记物Brachury(T)的免疫染色。比例尺＝200μm。
空间图案化分化然后进行的形态发生性细胞运动
图8显示几何形状的中内胚层结构化图形的特性。通过空间图案化分化然后进行协调的形态发生性细胞运动形成了几何形状的中内胚层结构。图8A显示第1天至第3天(D1-D3)微图案化的hESC(μP-hESC)集落的相位和荧光图像。中内胚层(T+)细胞第1天空间图案化于集落边缘，然后在第3天展示举例集落边缘～150-200μm。通过(1)空间图案化中内胚层分化然后进行(2)协调的细胞运动形成几何形状的结构图形(图8A)。
图8B显示分化3天后其他中内胚层标记物的空间图案化；Wnt3a、Fgf8、Cripto1(绿色)与T(红色)共定位于μP-hESC集落中。图8C显示上皮细胞-间充质转化(EMT)标记物在μP-hESC集落的边缘和中心周围的转录水平。与集落中心的细胞相比，μP-hESC集落边缘附近的细胞具有更高的诸如snail和波形蛋白的EMT标记物表达水平。Brachuary(T)、Wnt3a、Fgf8和Cripto1全部是中内胚层标记物。空间图案化的分化通过中内胚层标记物Brachyuary、Fgf8、Cripto1和Wnt3a(图8B)，以及上皮细胞-间充质转化活性(图8C)的局部表达表明了空间图案化的分化。
图8D显示在10X物镜下的μP-hESC集落3天活体成像拼图，其显示3天分化过程中的细胞运动。图8E显示在3天活体成像窗口中沿着图1D上的集落的黄线进行的波动曲线记录图分析。集落边缘附近的细胞在第2天显示随机细胞迁移，但是在第3天经历了定向的集合性细胞运动。如通过活体成像所观察的，空间局部分化细胞(在干细胞集落的边缘)经历协调的细胞运动后形成3维状结构图形(图8D)。协调的细胞运动轨迹可从分化的干细胞的空间-时间图(波动曲线记录图)(图8E)中看出。
发育毒性药物影响μP-hESC模型中中内胚层结构的物理形态学/位置
图9显示已知发育毒素引起的几何形状的中内胚层结构图形变化。图9A显示药物处理的μP-hESC集落的波动曲线记录图。在发育毒性药物处理(沙利度胺&VPA)下，集合性细胞迁移的轨迹在第2-3天受到干扰，而非发育毒性药物处理(青霉素G)下的集合性细胞迁移未受影响。换句话说，已知的发育毒素，丙戊酸和沙利度胺，改变了细胞运动的轨迹，而非发育毒素(青霉素G)没有(图9A)。图9B显示用/不用药物处理，中内胚层标记物T在第3天的位置。当使用沙利度胺或VPA处理时，中内胚层图形(T+区域)的位置发生错位，然而使用阴性对照药物青霉素G时保持不变。比例尺：100μm。换句话说，丙戊酸和沙利度胺也改变了中内胚层结构图形的形态，但未处理的样品或用青霉素G处理的样品没有(图9B)。
发育毒性药物引起的剂量依赖性发育毒性应答
图10显示提出的方法足够敏感以在不同浓度检测药物诱导作用的不同严重性。在不同药物浓度通过的成像方法定量测量中内胚层结构图形的不同形态学特征变化。用主成分分析(PCA)来分析这些在不同药物浓度的形态学特征。数据点代表各形态学特征；数据点的颜色代表处理中使用的药物浓度。图10A-C显示当使用视黄酸(RA，＞＝0.0036μg/ml)、沙利度胺(＞＝300μM)或VPA(＞＝0.8mM)处理时，μP-hESC集落内的中内胚层图形的空间分布显著被干扰。图10D显示青霉素G药物处理即使浓度达到1000μg/ml，也未显著干扰μP-hESC集落中的中内胚层图形的空间分布。对于已知的发育毒素，即(A)视黄酸(RA)、(B)沙利度胺、(C)丙戊酸(VPA)，来自相同药物浓度的形态学特征分离成不同簇，(D)对于非发育毒素(青霉素G)，用不同药物浓度处理的形态学特征不能分离。
数据收集方法：
1.每种药物用3种不同浓度处理我们的μP-hESC集落并将样品于第3天与未处理的普通样品一起固定。在Olympus荧光显微镜下获取样品的T免疫荧光图像。
2.使用Matlab处理全部T荧光图像以提取代表中内胚层图形(图像中的T+阳性区域)的空间分布的样品的全部相关形态学特征。
主成分分析(PCA)：
在Matlab中对每种药物及未处理的对照的全部样品的全部所提取的特征进行PCA，并将PCA结果绘图。
通过其发育毒性作用进行药物分类
图11显示提出的方法可以与用于成年和胚胎细胞的存活力测试组合，以通过其发育毒性作用对药物进行正确分类。图11A显示RA的有效浓度(能显著干扰μP-hESC集落中中内胚层图形空间位置的药物最低浓度)(ECRA)是～～0.0036μg/ml，该浓度对hESC细胞系H9或成年人皮肤成纤维细胞(aHDFs)无毒性。致畸药物在不影响胚胎和成年细胞存活的浓度会改变中内胚层结构图形的形态(例如视黄酸(图11A))。因此RA是一种致畸的发育毒性药物。
当导致结构图形改变的有效药物浓度与减少胚胎细胞存活力的药物浓度重叠时，药物是胚胎毒性的(例如沙利度胺和丙戊酸(图11B-C))。图11B显示EC沙利度胺是～300μM，该浓度对aHDFs无毒但对H9细胞有毒(＞50％存活)。因此沙利度胺是致畸和胚胎毒性的发育毒性药物。图11C显示ECVPA是～0.8μM，该浓度对aHDFs有轻度毒性但对H9细胞具有很强毒性(～20％存活)。因此VPA是具有很强胚胎毒性的发育毒性药物(意味着对hESCs具有很强毒性)。
当在观测到成年和胚胎细胞的细胞存活力下降的药物浓度下，中内胚层结构图形未受影响时，药物是非发育毒性(例如青霉素G(图11D))。图11D显示EC青霉素G在1000μg/ml(大多数发育毒性测试平台的最高测试浓度)以上。因此青霉素G是非发育毒性药物。
本领域的技术人员将意识到，本文所描述的发明能容许不同于那些具体描述实例的变体和修改。本发明包括所有这些变体和修改。本发明还包括在说明书中被提到或指出的所有这些步骤、特征、配制物和化合物，单独地或全体地以及任意和全部的组合或任意两个或多个步骤或特征的。
本文中引用的每份文献、参考资料、专利申请或专利都以其整体通过引用而被明确地合并于此，这意味着读者应当作为将其本文的一部分被来阅读和考虑。本文中引用的文献、参考资料、专利申请或专利没有在本文中进行重复只是出于简明的原因。
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本文描述的任何具体实施方式不限制本发明的范围。这些具体实施方式仅仅意在例证目的。功能上等同的产品、配制物和方法明显地在如本文所描述的发明范围内。
本文所描述的发明可以包括数值(例如尺寸、浓度等)的一个或多个范围。数值范围将被理解成包括该范围在内的所有值，包括定义该范围的值和邻近该范围的值，其导致与紧邻定义该范围边界值的那些值相同或基本相同的结果。
除非上下文另有需要，贯穿本说明书的词语“包含(comprise)”或者各变型诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”，将被理解成暗示对所陈述的整数或整数集合的包含而非对任何其他整数或整数集合的排除。还要注意的是，在本文公开的内容中并且特别是在权利要求书和/或各段落中，诸如“包含(comprises)”、“包含(comprised)”、“包含(comprising)”等的术语可以具有美国专利法中给予的含义；例如，它们可以意指“包括(includes)”、“包括(included)”、“包括(including)”等；诸如“主要由...组成(consisting essentially of)”和“主要由...组成(consists essentially of)”的术语具有美国专利法中给予的含义，例如，它们允许未被明确记载的要素，但排除在现有技术中被发现的或者影响本发明的基本特征或新特征的要素。
用于此处的所选术语的其他定义可以在本发明的具体实施方式部分中找到并且始终可以应用。除非另外限定，本文所用的所有其他科技术语具有与本发明所属领域技术人员通常理解相同的含义。
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Claims (16)

1.一种体外测试发育毒性的方法，其包括以下步骤：
a.微图案化细胞外基质；
b.在存在中内胚层诱导培养基的情况下，使胚胎干细胞在微图案化的细胞外基质上生长以形成几何形状的中内胚层结构；以及
c.在存在或不存在测试化合物的情况下，测试所述几何形状的中内胚层结构的变化，其中，与不存在测试化合物的细胞相比，在存在测试化合物的情况下，(1)所述中内胚层细胞分化减少和/或(2)所述几何形状的中内胚层结构的形态学变化表明所述测试化合物是发育毒性剂。
2.权利要求1的方法，其中所述中内胚层诱导培养基包含激活素氨基酸、骨形态形成蛋白和成纤维细胞生长因子。
3.权利要求2的方法，其中所述中内胚层诱导培养基进一步包含血管内皮细胞生长因子。
4.权利要求1的方法，其中所述几何形状的中内胚层结构的形态学变化包括所述几何形状的中内胚层结构形状和/或位置的变化。
5.权利要求1的方法，其中通过以下方式实现所述微图案化：制作聚二甲基硅氧烷(PDMS)薄片模板，其具有在所述PDMS薄片中切割的多个几何形状，将所述PDMS模板密封入培养容器，所述基质涂覆在培养容器中的PDMS模板上，这样当PDMS模板被移除时，只有在所述多个几何形状中生长的细胞保留在培养容器中。
6.权利要求1的方法，其中通过在基质上施用多个生长因子梯度来形成微图案。
7.权利要求6的方法，其中所述多个生长因子梯度以多个几何形状的形式印在基质上。
8.权利要求5或7的方法，其中所述多个几何形状的尺寸和形状全部相同。
9.权利要求5或7的方法，其中所述多个几何形状的尺寸或形状不同。
10.权利要求5和7-9任一项的方法，其中所述多个几何形状是圆形。
11.权利要求5和7-9任一项的方法，其中所述多个几何形状是方形。
12.权利要求5或7的方法，其中所述基质包含Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞分泌的凝胶状蛋白混合物。
13.权利要求1的方法，其中所述胚胎干细胞是人胚胎干细胞(hESC)。
14.权利要求1或13的方法，其中所述胚胎干细胞以400万细胞/ml的密度接种。
15.权利要求1的方法，其中所述中内胚层细胞分化测试是通过将细胞和针对中内胚层标记物的抗体温育，并使细胞成像以检测所述标记物实现的。
16.权利要求1的方法，其中与不存在测试化合物相比，在存在测试化合物的情况下，在所述微图案的外周的中内胚层细胞分化的变化表明所述测试化合物是发育毒性剂。
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