CN102089658A - 用于体外测试化学物质的发育毒性和胚胎毒性的蛋白生物标志物 - Google Patents

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Abstract

目前化学物质的毒理学检测主要是在体内完成的，其使用多种动物物种并且考虑人类临床、生物化学、病理学和形态学数据。在过去数年中，越来越清楚地发现，某些物质对于儿童的危害性特别高，因此，发育中的人类大脑的特定易攻击点是研究焦点。同时，推荐对具有已知的神经毒性或致畸(特别是神经致畸)风险的物质进行额外的胚胎毒性测试。此外，美国环保局(EPA)要求对杀虫剂进行胚胎毒性测试。如果某物质用作药物，则要求进行另外的测试(S7A SafetyPharmacology Studies for Human Pharmaceuticals，Guidelines of theInternational Conference on Harmonization，ICH，2001)。

Description

用于体外测试化学物质的发育毒性和胚胎毒性的蛋白生物标志物
背景技术
目前化学物质的毒理学检测主要是在体内完成的，其使用多种动物物种并且另外考虑人类临床、生物化学、病理学和形态学数据。在过去数年中，越来越清楚地发现，某些物质对于儿童的危害性特别高，因此，发育中的人类脑的特定易攻击点是研究焦点。同时，推荐对具有已知的神经毒性或致畸(特别是神经致畸)风险的物质进行额外的胚胎毒性测试。此外，美国环境保护局(EPA)要求对杀虫剂进行胚胎毒性测试。如果某物质用作药物，则要求进行另外的测试(S7ASafety Pharmacology Studies for Human Pharmaceuticals，Guidelinesof the International Conference on Harmonization，ICH，2001)。
化学物质的发育神经毒性研究受到US EPA的指南(测试指南870.63000)和OECD的指南草案(OECD指南426)的指引。根据这些指南进行的体内研究包括实验动物(通常是大鼠)的脑的形态学研究、成套的行为测试、年幼动物(直至成年期)的发育研究、神经胶质增生和细胞毒性的生物标志物的测定，以及另外的生物标志物的研究。这些毒性测试需要大量的实验动物：对于每种物质，在3-4个月的时间内将消耗大约140只母代动物及其1000只后代。由于技术和物流上的需要，这些体内测试的人力和成本耗费非常高。然而，关键一点是，在相应的指南和动物中，没有清楚的定义可信赖的和明确的末端点。目前的测试是否真能预测人类中枢神经系统的发育和相关毒性，是不确定的。在美国，这种情况已经引起动物权利和保护组织例如PETA的请愿，请求废除指南OPPTS 870.6300。
目前，在欧洲市场上有大约100,000种化学物质。但是，这些物质中仅有一少部分的可靠的毒理学数据是可以获得的。尤其是那些在1981年以前上市的化学物质，缺少安全性数据。因此，不能全面评估对雇员、消费者和环境的危险。为了改善这种不令人满意的状况，欧盟委员会(European Commission)提出了所谓的REACH概念，即化学物质的注册、评价和认证(Registration，Evaluation andAuthorization of Chemicals)。REACH的目标是系统地评价生产、使用或进口的数量在每年1顿以上的化学物质的危险。化学物质的安全性证明的负担将落在生产者和制作者身上。关于欧洲的REACH立法和美国及日本的相似发展(Schrattenholz和Klemm，2006和2007)，似乎测试化学物质的发育神经毒性的需要将导致在可预见的将来测试动物消耗的大规模增长。
在这个背景下，毒性相关筛选的高度预测性的、省时的体外测试法的开发变得日益重要。细胞培养模型将作为高度争议性的、有问题的、有时令人讨厌的动物实验的替代品。目标是取代目前评估神经毒性、尤其是神经发育毒性的法令所需要的动物测试，这些动物测试成本非常高且非常耗时。
体外模型已经在药理学领域应用了数年。很多目前的体外检验涉及分化模型，其使用胚胎干细胞。胚胎干细胞测试(EST)显示出很有前景的结果，该测试能够区分强烈致畸的、中等的或无胚胎毒性的化合物(Spielmann等人，1997)。EST利用小鼠胚胎干细胞在培养物中分化的潜力，从而在体外测试胚胎毒性。该模型有局限性，部分原因是，仅仅对那些破坏心脏分化的化合物定义了毒理学末端点。
因此，本领域需要一种改进的体外方法，用于可靠地确定化学物质和药物的毒性。特别地，本领域需要提供新型的、快速的和智能的体外测试策略以测定发育毒性。
本发明的目标是提供用于体外筛选化学物质的毒性、尤其是发育毒性的方法和试剂。
发明内容
本发明人发现，特异性蛋白生物标志物是化学和药物化合物的发育毒性的诊断。物质对这些生物标志物的影响是该物质的发育毒性的预测。所述影响可以这样测定：将其中产生至少一种蛋白生物标志物的细胞样品与物质接触，并测定由于暴露于该物质造成的该细胞样品中所述蛋白生物标志物的变化。
在一个方面，本发明提供了用于测定物质的发育毒性的体外方法，其包括以下步骤：
(i)将细胞样品暴露于该物质；和
(ii)测定由于暴露于该物质造成的该细胞样品中一种或多种蛋白生物标志物的变化。
本发明的“蛋白生物标志物”选自热休克蛋白β-1(HspB1)、Ras-GTP酶-活化蛋白SH3-结构域结合蛋白(G3BP)、Ran结合蛋白5(RanBP5)、钙网蛋白(Calr)、二氢嘧啶酶-样2(DRP2)、应激诱导的磷蛋白1(STIP1)、U2af2蛋白(U2AF)、钙结合蛋白39，同种型CRA_b(Cab39)、含有NmrA-样家族结构域的1(NMRL1)，及其翻译后同种型。
本发明的生物标志物是熟知的蛋白。这些蛋白的通常命名总结于表1。
表1
Figure BDA0000043185750000031
Figure BDA0000043185750000041
术语“发育毒性”是指在妊娠期诱导的或由于亲代暴露造成的任何副作用。特别地，发育毒性包括胚胎毒性。
适合用于本发明方法的“细胞样品”是任何包含能够产生至少一种上述蛋白生物标志物的细胞或细胞成分的样品。细胞样品可以例如选自器官、器官样品、组织、体液、细胞和细胞裂解物。
细胞样品优选是脊椎动物来源的。特别优选的是哺乳动物、尤其是人类来源的细胞样品。
根据优选的实施方式，细胞样品包含干细胞。所述干细胞可以是全能的、多能的(pluripotent)、多潜能的(multipotent)和/或寡能的干细胞。特别优选的是胚胎干细胞。最优选地，干细胞是人类胚胎干细胞(hESC)。
在本发明的方法的步骤(i)中，将细胞样品暴露于发育毒性待测的物质。优选地，在细胞样品与待测物质接触之前，测定所述样品中一种或多种生物标志物的基线值。然后，在步骤(ii)中，测定由于暴露于所述物质造成的该细胞样品中一种或多种蛋白生物标志物的变化。
检测可以包括定性和/或定量测定一种或多种蛋白生物标志物。本发明的生物标志物是熟知的蛋白，其检测是本领域的公知常识。例如，检测可以通过免疫学测定或免疫测定法进行。在免疫测定法中，使用一种或多种抗体与其抗原的反应来测定一种或多种蛋白生物标志物的存在。该测定利用了抗体与其抗原的特异性结合。在检测本发明的蛋白生物标志物时，生物标志物代表抗原。优选地，使用单克隆抗体来检测它们，因为单克隆抗体通常仅结合至特定分子的一个位点，因此提供了特异性和精确性更高的测试，其较不容易受到存在的其它分子的影响。
为了检测本发明的一种或多种生物标志物，还可以测定其活性，尤其是在细胞样品与待测物质接触之后的活性变化。
可以通过多种本领域已知的方法进行本发明的蛋白生物标志物的定量。例如，在免疫测定法中，可以对蛋白生物标志物的抗体进行标记。所述标记可以是酶、放射性同位素、磁性标记物或荧光标记物。用于检测本发明的蛋白生物标志物的其它合适的技术包括Western印迹和ELISA。
在本发明的优选实施方式中，持续检测在细胞样品与待测物质接触之后的一种或多种生物标志物的变化。用于持续测定的实例有分光光度测定、荧光法测定或化学发光法测定。或者，在细胞样品与待测物质接触之后，不连续地一次或多次测定一种或多种蛋白生物标志物。例如，可以将细胞样品或其提取物进行色谱分离，例如二维或三维凝胶电泳，例如SDS-PAGE。可以通过染色的方式显示分离的蛋白。可以通过例如质谱法进行蛋白的分子分析。
根据本发明方法的优选方面，测定至少一种另外的生物标志物。一种或多种另外的生物标志物优选是一般性细胞毒性的标志物。因此可以区分发育毒性和一般毒性。其行为不依赖于施用的物质但与EC50测量值相关的示例性标志物是：热休克蛋白8(HSP8)、应激诱导的磷蛋白1(P-同种型2)、Fascin同源物1肌动蛋白集束蛋白(Fscn1)、核不均一核糖核蛋白A/B同种型2，及其翻译后同种型。优选的另外的生物标志物的通常命名总结于表2。
表2：一般毒性的标志物
Figure BDA0000043185750000061
Figure BDA0000043185750000071
本发明的另一个实施方式涉及如上文定义的一种或多种蛋白生物标志物作为用于评估物质的发育毒性的标志物的用途。可以在用于毒性、发育毒性或胚胎毒性的任何已知的体内或体外模型中监测蛋白生物标志物。
本发明的另一个实施方式是用于测定物质的发育毒性的试剂盒，其包括一种或多种细胞样品，其中优选的细胞样品如上文所定义。所述试剂盒还包括用于测定一种或多种蛋白生物标志物的工具。根据本发明的优选方面，所述试剂盒还包括用于测定至少一种另外的生物标志物的工具。一种或多种另外的生物标志物优选是一般毒性的标志物。最优选地，试剂盒包括用于测定另外的标志物热休克蛋白8(HSP8)、应激诱导的磷蛋白1(P-同种型2)、Fascin同源物1肌动蛋白集束蛋白(Fscn1)、核不均一核糖核蛋白A/B同种型2、和/或其翻译后同种型的工具。
本发明的蛋白生物标志物是熟知的蛋白。但是，本发明第一次描述了特定蛋白是化学和药学化合物的发育毒性的诊断生物标志物。
实验背景
本发明人将差别的蛋白质组学技术应用到与发育毒性相关的来自啮齿类和人类样品的蛋白生物标志物的定量和统计学分析中。这些样品包括：
●在两个独立实验室进行的用于验证EST测试的多个实验中的蛋白裂解物。将根据标准程序(ECVAM确认的替代性测试)从鼠胚胎干细胞分化的心肌细胞暴露于已知具有胚胎毒性效力的物质组并以剂量依赖性方式进行功能控制。
●从暴露于已知胚胎毒性物质之后的鼠胚胎干细胞分化来的神经细胞培养物的蛋白裂解物。
●从暴露于已知胚胎毒性物质之后的人胚胎干细胞分化来的神经细胞培养物的蛋白裂解物。
将从人类胚胎干细胞神经分化来的高质量裂解物进行这种差别蛋白质组学分析。hESC培养物经过甲基汞和丙戊酸处理。样品(包括经处理的和未处理的未分化的hESC和各自的神经前体)经过放射性标记并使用之前描述过的高分辨率2D-PAGE(例如Schrattenholz&Groebe 2007；Groebe等人，2007；Wozny等人，2007)进行差别定量模式分析：发现177个蛋白点迹受到该处理的差别化影响，其中的很多丰富的翻译后同种型目前已经使用自动化高通量MALDI-TOF质谱法鉴定出来。在所鉴定的蛋白中，有细胞核的、细胞骨架的、细胞外基质的和应激蛋白(stress protein)，以及参与蛋白质周转的蛋白。这些发现的重要意义需要从来自mESC的材料(心肌细胞、EST测试和mESC神经元)中获得的相应结果中解读，以下将会讨论。
以相似的方式，研究了合作者获得的MgHgCl-处理的mESC分化成的神经细胞裂解物，以及在不同实验室在经过物质处理之后获得的mESC分化成的心肌细胞的裂解物(材料来自经验证的EST测试的数据库的扩大化)。对于mESC神经细胞，发现并鉴定了93个差别化的点迹。以下将在进一步的但相似且密切相关的来自心肌细胞的相关数据的情况下讨论相应的生物标志物标志的生物学意义。
最大的数据集是使用来自两个独立实验室的EST模型中的物质测试的裂解物并应用以前成功测试并发表的合并方案获得的。该策略的重点在于，在对复杂生物样品进行2D-PAGE或多维LC(Groebe等人，2007，
Figure BDA0000043185750000081
等人，2008)分析之后，对蛋白点迹和/或峰的复杂模式进行定量的统计学上可信赖的控制。
在两个地点测试的物质包括地乐酚、除草醚、赭曲霉素-A、洛伐他汀、MAM、β-氨基丙腈、甲氧氯普胺、杜克西拉明、D-青霉胺、普伐他汀、华法林、和呋喃苯胺酸。在每种物质处理的EST裂解物的单个差别化分析中，通过自动化高通量MALDI-TOF质谱法发现并鉴定了380种差别化的蛋白。有大量的丰富的蛋白同种型指向广泛的翻译后修饰。将差别的定量数据进行簇分析(如图1所示)，其揭示了三个簇，以非常有意义的方式对物质进行了分类：簇1主要包含高度胚胎毒性的；簇2是无胚胎毒性的；簇3是具有中度胚胎毒性的物质。值得注意的是，虽然生物学方面仅仅在IC50值的意义上进行控制，而不是以数目、活性幅度和细胞类型的百分率的意义上进行控制，即具有很大程度的异质性和随机性，但分子数据的意义揭示了以下内容：
1.分子标志能够对物质效应进行分类。
2.它们还可以帮助指示失败的或高度异常的实验。
3.只有大约15-20种蛋白生物标志物以显著的方式表现并代表所有的物质。
4.这些中的一些以及有趣的是，主要是细胞骨架蛋白对于所有条件显示出一致的行为，不依赖于物质或簇：我们分析，这些最有可能代表一般性细胞毒性或细胞压力。
5.但是一些以几种丰富的同种型存在的蛋白生物标志物清楚地以分级的模式作用，取决于物质的假设的胚胎毒性。这些包括ras途径的调节元件和小的GTP酶，以及钙依赖性的IP3途径的调节元件。这些途径和蛋白在胚胎形成中的作用已经清楚地阐释，并且在胚胎毒性的情况下是非常可信的。
6.正在进行的生物信息学努力和数据采掘工作显示，这些(＞10)生物标志物候选者具有成为胚胎毒性的真正标志物的潜力。
这些标志物与从hESC和mESC衍生的、经MgHgCl和丙戊酸处理的神经元鉴定的蛋白(其指向一般性胚胎毒性的潜在标志物的一般重要意义)具有部分重叠。
用于胚胎毒性的确定的蛋白生物标志物显示于表3。
表3：用于胚胎毒性的蛋白生物标志物
Figure BDA0000043185750000101
簇1显示了使用高度胚胎毒性的物质地乐酚、赭曲霉素、除草醚、洛伐他汀处理EST模型之后，相应的标志物蛋白的改变；簇2显示了当把无胚胎毒性的物质(β-氨基丙腈、甲氧氯普胺、杜克西拉明、D-青霉胺)用于该模型时的情况；簇3是应用中度胚胎毒性的物质例如普伐他汀和呋喃苯胺酸的效应。这些标志物的组合将允许在体外区分物质的胚胎毒性性质。
表4显示了这样的标志物，其表现不依赖于物质施用，但与EST模型中EC50测量值相关，代表了一般性细胞毒性。
表4
可以使用表中的Gene bank登记号获得这些蛋白的相关文献。特别地，已经报道Ras-GTP酶-活化蛋白SH3-结构域结合蛋白(G3BP)、二氢嘧啶酶-相关蛋白2(DRP2)和Ran结合蛋白5(RanBP5)在发育、神经发育和胚胎形成中发挥作用：对于G3BP，显示了其在胚胎生长和胚胎形成中的关键作用(Zekri等人，2005；Lypowy等人，2005)，其参与重要的致瘤途径，例如p53肿瘤抑制途径，该途径是人类肿瘤形成中的重要步骤(Kim等人，2007)。受体酪氨酸激酶(RTK)/Ras GTP酶/MAP激酶(MAPK)信号传导途径广泛用于发育以控制很多不同的生物学过程。Ras超家族的小的GTP酶是多种细胞和发育事件的主要调节子，包括分化、细胞分裂、囊泡转运、细胞核组装和分化过程中的细胞骨架的控制(一些最近的综述：Omerovic等人，2007；Wodarz和
Figure BDA0000043185750000121
2007；Kratz等人，2007)。
在RanBP5的情况下，同样是这样，因为Ran也是以上所测的小的小的GTP酶的Ras超家族的成员(Lundquist 2006)。RanBP＝karyopherin或transportin将多种RNA结合蛋白输入细胞质中的核结合底物，并通过核孔复合物靶向它们，其中RanGTP在核中将其分离(例如Cansizoglu和Chook 2007)。同样地，其在分化、发育和癌发生中的作用是明显的(Teng等人，2007)。
最初发现，在人类中鉴定的DRP基因家族的4个成员主要在哺乳动物和鸡的胚胎和初生的脑中表达，并被暗示为神经系统发育中的细胞内信号传导子(Kitamura等人，1999；Arimura等人，2004；Schmidt和Strittmatter，2007)。已经报道DRP-2促成脑发育过程中的生长轴突的途径探寻(Weitzdoerfer等人，2001；Inagaki等人，2000)。还已经显示DRP2在针对神经元应激的应答中发挥作用(例如Sommer等人，2004；Butterfield等人，2006)。
有趣的是，最近也报道了HspB1在滋养层细胞分化中的关键作用，其是正确建立胎盘的关键过程，因此对于维持胚胎发育是必需的(Winger等人，2007)。HspB1是有丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)途径的一部分，其介导一些重要的细胞过程，例如调节胚胎植入前的发育(Natale等人，2004)。
综上，在胚胎形成和新生儿发育中发现的蛋白的作用是非常有用的，本申请揭示的详细分子信息将帮助在体外预测潜在的胚胎毒性物质的影响。
附图说明
图1显示了EST模型中，经物质处理的差别化影响的蛋白的簇分析。红色代表蛋白裂解物中表达的上调，绿色代表下调。仅有几种蛋白在所有条件下都明显地以物质-和簇-依赖性方式作用；这些是胚胎毒性的有前景的候选标志物。
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Claims (15)

1.用于测定物质的发育毒性的体外方法，其包括以下步骤：
(i)将细胞样品暴露于该物质；和
(ii)测定由于暴露于该物质造成的该细胞样品中一种或多种蛋白生物标志物的变化，
其中所述蛋白生物标志物选自热休克蛋白β-1(HspB1)、Ras-GTP酶-活化蛋白SH3-结构域结合蛋白(G3BP)、Ran结合蛋白5(RanBP5)、钙网蛋白(Calr)、二氢嘧啶酶-样2(DRP2)、应激诱导的磷蛋白1(STIP1)、U2af2蛋白(U2AF)、钙结合蛋白39，同种型CRA_b(Cab39)、含有NmrA-样家族结构域的1(NMRL1)、及其翻译后同种型。
2.权利要求1的方法，其中所述细胞样品选自器官样品、组织、体液、细胞和细胞裂解物。
3.权利要求1的方法，其中所述细胞样品包括脊椎动物细胞，特别是哺乳动物细胞例如人类细胞。
4.权利要求1的方法，其中所述细胞样品包括干细胞，特别是全能的、多能的、多潜能的和/或寡能的干细胞。
5.权利要求1的方法，其用于测定胚胎毒性，其中所述细胞样品包括胚胎干细胞。
6.权利要求1的方法，其中步骤(ii)包括定性或定量测定一种或多种生物标志物。
7.权利要求1的方法，其中持续测定细胞样品中一种或多种蛋白生物标志物的变化。
8.权利要求1的方法，其中一种或多种生物标志物的测定包括免疫学测定、活性测定和/或分子测定。
9.权利要求1的方法，其中一种或多种生物标志物的测定包括荧光检测。
10.权利要求1的方法，还包括测定至少一种另外的蛋白生物标志物，所述另外的蛋白生物标志物选自热休克蛋白8(HSP8)、应激诱导的磷蛋白1(P-同种型2)、Fascin同源物1，肌动蛋白集束蛋白(Fscn1)、核不均一核糖核蛋白A/B同种型2，及其翻译后同种型。
11.一种或多种蛋白用作测定物质的发育毒性的生物标志物的用途，所述蛋白选自热休克蛋白β-1(HspB1)、Ras-GTP酶-活化蛋白SH3-结构域结合蛋白(G3BP)、Ran结合蛋白5(RanBP5)、钙网蛋白(Calr)，二氢嘧啶酶-样2(DRP2)、应激诱导的磷蛋白1(STIP1)、U2af2蛋白(U2AF)、钙结合蛋白39，同种型CRA_b(Cab39)、含有NmrA-样家族结构域的1(NMRL1)、热休克蛋白8(HSP8)、Fascin同源物1，肌动蛋白集束蛋白(Fscn1)、核不均一核糖核蛋白A/B同种型2(hnRNP)。
12.权利要求11的用途，用于测定胚胎毒性。
13.用于测定物质的发育毒性的试剂盒，其包括：
一种或多种细胞样品，和
用于测定一种或多种蛋白生物标志物的工具，所述蛋白生物标志物选自热休克蛋白β-1(HspB1)、Ras-GTP酶-活化蛋白SH3-结构域结合蛋白(G3BP)、Ran结合蛋白5(RanBP5)、钙网蛋白(Calr)、二氢嘧啶酶-样2(DRP2)、应激诱导的磷蛋白1(STIP1)、U2af2蛋白(U2AF)、钙结合蛋白39，同种型CRA_b(Cab39)、含有NmrA-样家族结构域的1(NMRL1)、及其翻译后同种型、热休克蛋白8(HSP8)、Fascin同源物1，肌动蛋白集束蛋白(Fscn1)、核不均一核糖核蛋白A/B同种型2(hnRNP)。
14.权利要求13的试剂盒，其中所述细胞样品包括胚胎干细胞，特别是人类胚胎干细胞。
15.权利要求13的试剂盒，还包括用于确定至少一种另外的蛋白生物标志物的工具，所述另外的蛋白生物标志物选自热休克蛋白8(HSP8)、Fascin同源物1，肌动蛋白集束蛋白(Fscn1)、核不均一核糖核蛋白A/B同种型2(hnRNP)。
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