CN102918397A - 用于神经毒性检测的标志物和测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于诊断对象中神经毒性的方法和测定方法。对对象的神经毒性损伤的程度通过测量体液如CSF或血清中一个或多个生物标志物进行评估。提供的其它用途和优点包括上市前的药物发现、监测、药物神经毒性筛选和已知潜在神经毒性的药物上市后的安全评估和监测。

Description

用于神经毒性检测的标志物和测定方法

相关申请的交叉参考

本申请要求2010年4月1日申请的号为61/320,122的美国临时申请、2010年8月25日申请的号为61/376,967的美国临时申请和2011年3月23日申请的号为61/XXX,XXX及名称为用于神经毒性检测的标志物和测定方法的美国临时申请的优先权，这些优先权文件的全部内容在这里通过参考并入。

技术领域

本发明涉及神经毒性的标志物的鉴定和使用。发明的标志物包括蛋白；或蛋白片段；自身抗体；DNA；RNA；或miRNA。发明的生物标志物可以在中枢神经系统功能和治疗中起作用。

背景技术

神经退行性变和神经毒性是与在中枢神经系统（CNS）中药理活性的一些化合物相关联的安全风险。但是，监测神经退行性变在临床前和临床药物开发中都是困难的。与在患者中在临床前模型中脑病理的依赖性组织学评估相比，神经退行性变和神经毒性的基于定量的脑脊髓液（cerebral spinal fluid，CSF）和血液的蛋白生物标志物能改善非临床安全性评估和我们在临床研究中监测病人安全的能力。

创伤的、缺血性的和神经毒性的化学损伤，和遗传疾病一起，都呈现脑或其它神经系统损害的前景。虽然通过临床反应检测和电脑断层扫描（CT）和磁共振成像（MRI）检测，这些病因的每一个的严重形式的诊断是明确的，但是这些诊断有其局限性，因为光谱成像是既昂贵又耗时的，而无行为能力的个人的临床反应检测是有限值的，并往往排除了细致入微的诊断。此外，由于现有的诊断的局限性，对象经受对他们的神经系统状况的应力以致对象常常没有意识到损害已经发生或寻求作为细微症状的治疗的情形往往很快解决。这些对对象的神经系统状况的轻度至中度的攻击的治疗的缺乏可以具有累积效应，或随后导致在任何情况下具有差临床预后的严重的脑损伤事件。

为了克服与神经系统疾病的成像和主观的临床反应诊断相关的局限性，对使用生物标志物作为对象的分子或细胞水平健康状况变化的内部指示剂给予越来越多的关注。由于生物标志物的检测使用从对象获得的样品并检测在该样品典型地脑脊髓液、血液或血浆中的生物标志物，生物标志物检测具有廉价、快速和客观地测量神经系统疾病的前景。随着神经系统疾病的迅速和客观指示剂的获得允许人们规模化和带有一定程度的客观性确定非正常的脑部疾病的严重程度，从而预测预后，指导疾病的治疗，以及监视对象的反应和恢复。此外，从众多的对象获得的这种信息使人们获得了对脑损伤机制的一定程度的了解。

同样重要的是与化学损伤和候选治疗物相关联的毒性的测量或鉴定。由于不可预见的毒性，显著比例的药物候选物从临床试验中脱离。由于毒性问题在临床前阶段没有存活的化合物的数量就更大了。在人类中目前所采用的毒性筛选和毒性预测之间的脱节仍然保留。关于神经毒性，这是特别正确的。神经毒性既是难以测量的而且往往与药物候选物的已知机制是无关的。需要神经毒性的更好的测量，以便允许进入临床试验之前早期检测潜在的不期望的副作用。

暴露于化学或生物试剂例如在药物或其它治疗候选物筛选过程中仍然难以研究。这些研究一般分析神经细胞死亡。然而，存在需要对于检测来自攻击的神经细胞功能、结构、组织或其它比较不严重的结果的改变有用的组合物和方法。中枢神经系统（central nervoussystem，CNS）神经毒性损伤的生物标志物例如由本发明提供的那些能够给予科学家们可定量的神经化学标志物以帮助不仅确定神经毒性的严重程度和细胞病理学，而且也提供治疗性干预的替代标志物。

因此，存在需要一种神经毒性的敏感和特异的生化标志物，其也可以提高诊断能力和病人管理，并促进疗效评价。

作为触发导致神经元损伤的轴突和树突状退变的主要促成因素之一，谷氨酸诱导的兴奋性毒性已经建立为用于神经退行性疾病以及许多其他神经系统疾病的一个模型系统。TBI的神经病理后果是通过在导致蛋白酶例如某些蛋白的钙蛋白酶和半胱天冬酶片段激活的胞浆Ca2+上的持续的谷氨酸诱导增加以及大脑蛋白/片段至体液（例如CSF、血液、血浆、血清）的选择释放进行介导的，这些被认为是脑损伤的生物标志物。红藻氨酸（Kainic acid，KA）是一种已知的激活离子型谷氨酸受体的子类的兴奋性毒素，且它是神经毒性的，即使当皮下注射时（sq.）。

因此，还存在需要一种大鼠KA兴奋性毒性模型来研究TBI的几种生物标志物的分布、关系和定位：泛素C-末端水解酶1（ubiquitin C-terminal hydrolase 1，UCHL 1）、胶质纤维酸性蛋白（glialbrillary acidic protein，GFAP）、αII-血影蛋白降解产物（SBDP150、SBDP145和SBDP120）。特别在已知为海马的大脑区域的神经元退变导致激动和抑制的不平衡，其自身表现为癫痫。从而生物标志物对于在动物模型和病人中癫痫的检测和预测也是重要的。此外，癫痫已经被描述为在TBI中的长期并发症之一。

此外，例如在乳腺癌中化疗诱导的认知下降已经被认为该治疗方案的严重的副作用之一。癌症是在世界各地特别是美国的妇女中癌症相关的死亡的首要原因。在20世纪50年代和20世纪60年代发现化疗剂以来，化疗仍然是用于乳腺癌的主要的和经常仅仅可得的有疗效的治疗。然而，使用这种有效的治疗往往由其不利的副作用所限制。对于最广泛使用的有效的乳腺癌治疗的各种全身剂，包括紫杉烷类化合物（taxanes）（即，紫杉醇（paclitaxel）和多西紫杉醇（docetaxel））和铂化合物（即，顺铂（cisplatin）、奥沙利铂（oxaliplatin）、卡铂（carboplatin）），具有随之而来的神经病变的神经毒性是普遍公认的主要副作用。由紫杉醇和顺铂产生的神经毒性可以限制治疗剂量或导致其停止，从而削弱了其有用性和有效性。此外，神经病变可以显著损害病人的生活质量。虽然PNS神经毒性是一种普通的经过充分研究的副作用（Murillo等，2008），几份报告显示这些试剂也能对中枢神经系统有神经毒性（Perry和Warner，1996）。因此，用于早期检测由于乳腺癌化疗导致的PNS和CNS神经病变的新的生物标志物的发现导致合适治疗策略的更明智的选择以尽量减少长期神经病变的严重或风险的不利后果。

因此，存在需要一种使用生物标志物检测药物发现中的神经毒性或作为治疗给药的辅助物的方法。还存在需要一种监测由化疗药物诱导的CNS和PNS中的神经毒性和神经病变的方法用于早期检测神经毒性控制剂量以限制神经毒性，特别用于乳腺癌化疗药物，并允许早期治疗干预以尽量减少化疗的神经毒性副作用。

附图说明

图1说明了对甲基安非他明或顺铂的神经毒性反应后在体液区中生物标志物升高。

图2描绘了红藻氨酸（KA）（9mg/kg）给药在大鼠CSF中GFAP和UCH-L1的水平上的时间依赖效果。

图3描绘了红藻氨酸（KA）（9mg/kg）给药在大鼠CSF中血影蛋白降解产物上的时间依赖效果。

图4A描绘了用于SBDP145和SBDP150的Western blot检测，图4B以及图4C是来自SBDP145和SBDP150血影蛋白降解产物的Western blot检测的描绘KA（9mg/kg）给药在大鼠海马中血影蛋白降解产物上的时间依赖效果的条形图。

图5是显示在KA处理的大鼠的海马中αII-血影蛋白降解产物的增加的水平的组织学图像。

图6是显示在KA处理的大鼠的海马中GFAP表达的增加的水平的组织学图像。

图7是显示在KA处理的大鼠的海马中激活的半胱天冬酶-3的增加的水平的组织学图像。

图8描绘了显示α-微管连接蛋白（α-internexin）作为释放到人TBI CSF样品中的生物标志物（α-internexin BDP）的Western blot分析。

图9描绘了用于α-微管连接蛋白的Western blot分析，其中α-微管连接蛋白（54kDa）的水平在成年与胚胎第18天大鼠脑中没有变化。

图10描绘了用于在成年与胚胎第18天大鼠脑中巢蛋白（Nestin protein）的水平的Westernblot分析。

图11描绘了用于α-微管连接蛋白（α-internexin）作为释放到人TBI CSF样本中的生物标志物（α-internexin BDP）的Western blot分析的比较。

具体实施方式

历史上，由于缺少淋巴系统和血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）的保护，大脑被认为是享有免疫特权的。但是，大脑损伤，无论是来自化学、撞击，或其它损伤，往往造成对脑组织或BBB的损害，导致释放抗原如肽、降解的蛋白片段、蛋白、DNA和RNA（包括miRNA）至脑脊髓液（CSF）或血液，对它们的自身抗体随后增加形成。本发明在通过检测释放的细胞材料检测由化学毒性、身体创伤、疾病、或感染在体内或体外导致的正常或不正常的神经系统状况中具有用处。具体而言，本发明具有用处用于由于化学或其它损伤导致的神经毒性的筛选分析或诊断。

本发明还具有用处用作一种检测可预测或指示未来疾病或损伤的神经系统创伤或状况的方法。举例来说，本发明具有用处用作一种体内或体外用于药物开发的安全或有效筛选实验方案。药物开发并不局限于针对神经系统疾病的药物。在一个优选的具体实施例中，发明的生物标志物具有用处用于在体外动物研究中检测预期的或意外的神经系统的副作用，作为一种选择先导化合物用于分析的方法，或作为一种评估先前确定的药物候选物的安全性的方法。可以理解，在疾病发病之前，通过监测如在这里详细描述的至少一种生物标志物以检测神经系统疾病的诱导作为用于确定对象可以暴露的最大剂量水平的基础，一种药物，无论是批准的商业治疗物（如化疗物）还是药物候选物，很容易施用给对象。还可理解，不同的个人将具有特定的药物耐受性阈值，因此，本发明代表一种与具有潜在的神经毒性的化合物给药相关联的辅助监测方法。

本发明提供生物标志物如UCH-L1、GFAP、MAP-2、S100β和血影蛋白降解产物如SBDP145、SBDP150、SBDP150i和SBDP120在对象的各种组织中的鉴定，以及它们的浓度和神经退行性疾病及tau蛋白病的相关性。本发明还包括在诊断神经系统疾病中使用生物标记的方法。这样一种方法是在它们通过色谱法（例如，电泳和Western blotting）分离之后在大脑提取物中和在大脑组织切片（免疫组织化学）中生物标志物的一种或多种生物标志物的检测。一个另外的应用是在病人的体液（例如CSF、血清、血浆和尿液）中一种或多种这些生物标志物的检测和定量，用于诊断目的和监测治疗干预。

本发明还提供了一种用于安全评估药物发现、监测、药物神经毒性筛选和上市后安全评估和监测已知潜在神经毒性的药物的方法。例如监测对癌症药物的反应以防止或尽量减少这些药物的副作用，例如化疗后认知损伤（post-chemotherapy cognitive impairment，PCCI，被称为化疗脑）和化疗诱导的周围神经病变（chemo-inducedperipheral neuropathy，CIPN）。

由于红藻氨酸的性质是一种强有力的中枢神经系统兴奋剂，在实验动物中诱导癫痫，本发明还提供了癫痫、癫痫持续状态或单一癫痫发作包括刺激发作病人的健康评估，由于过量导致癫痫发作的药物如抗精神病药物的上市后评估，和由非法药物或酒精及其停止导致的损害评估。长期暴露于神经毒素，如红藻氨酸，已知有助于神经退行性疾病如阿尔茨海默氏病，因此，本发明还提供了一个诊断长期暴露于神经毒素导致的神经退行性疾病的度量。

如在这里所使用的，损伤是在细胞或分子完整性、活性、水平、鲁棒性、状态的改变，或其它可追溯至一个事件或损害的改变。损伤示例性地包括物理的、机械的、结构的、化学的、生物的、功能的、感染的或其它的细胞或分子特性的调节物。事件示例性地是化学或生物损害，如暴露于化学或生物剂。事件可选的是由感染源导致的感染。本领域技术人员知道由术语损伤或事件包含的许多相当的损伤。可以理解，这样一种试剂表示治疗疾病施用的药物，但在某些剂量或在某些对象中具有神经毒性。

在这里使用的术语“生物标志物”表示抗体、DNA、RNA、miRNA、RNA片段、DNA片段、肽、蛋白、脂质、或其它其存在、不存在、水平或活性与神经毒性、损害或疾病相关或预测的生物材料。可选地，生物标志物是蛋白。可选地或另外，发明的生物标志物是编码或是：αII-血影蛋白；血影蛋白降解产物（SBDP）示例性地SBDP150、SBDP150i、SBDP145和SBDP120；GFAP；神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）；神经丝蛋白轻链（neurofilament protein light chain，NFP）；a-微管连接蛋白（α-internexin）；巢蛋白（nestin），泛素C-末端水解酶L1（ubiquitin C-terminal hydrolase L1，UCH-L1）；神经元核蛋白（NeuronalNuclei protein，NeuN）；2'，3'-环核苷酸3'-磷酸二酯酶（2',3′-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase，CNPase）；可溶性细胞间粘附分子-1（Soluble Intercellular AdhesionMolecule-1，sICAM-1）；诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的寡核苷酸或肽的一部分或全长，或在表1中列出的其它标志物。可选的，发明的生物标志物识别、编码或是UCH-L1或SBDP150或SBDP145。发现神经元特异性烯醇化酶（NSE）主要存在于神经元中。发现GFAP只存在于雪旺氏细胞中。发现CNPase存在于中枢神经系统的髓鞘质中。

表1

非红系α-II血影蛋白是一种细胞骨架蛋白，由蛋白酶钙蛋白酶当该酶由进入受损细胞的钙流激活时酶切，随着大鼠和人的创伤性脑损伤的增加幅度，150、145和120kDa（分别为SBDP-150、-145、和-120）的α-II血影蛋白降解产物浓度增加。发生在化合物诱导的神经毒性中的类似的胞内钙流导致钙蛋白酶的充分激活以在CSF中产生可检测的SBDP，从而SBDP是化合物诱导的神经退行性疾病的敏感的生物标志物。神经退行性疾病的特征在于组织病理学和CSF中测量的SBDP-145的浓度在具有最小轻微损伤的大鼠中持续观察SBDP-145的浓度大于3倍增加，具有更严重损伤时20-150-倍增加。

可选地，本发明关于UCH-L1、SBDP150或SBDP145进行描述。可以理解，这些生物标志物给出仅用于说明的目的，并不意味着特别或其它方式暗示本发明的范围限于UCH-L1或SBDP145。可以理解，发明的用于检测对象中神经毒性的方法和组合物同样适用于示例性包括在表1中列出的那些的其它生物标志物。本领域技术人员应该理解，使用与上述的生物标志物反应的抗体，ELISA试验发明的生物标志物按顺序或平行容易地进行。同样，与上述的生物标志物之一相关的多核酸容易地通过常规技术如PCR进行复制以检测神经毒性。

红藻氨酸的使用还提供了以下主要进展：1）用于临床前和临床研究中评估药物安全性的生物标志物（单个/多个）的进展（红藻氨酸为例，其他化合物也是可能的），因为目前的方法依赖于临床前模型的脑组织切片的组织学评估，不容易应用于临床研究；2）一组用于在体液例如CSF、血浆和血清中体内检测神经退行性疾病（特别用于红藻氨酸）的基于蛋白的生物标志物的进展。当前数据仅用于CSF；和3）一组用于检测癫痫发作，特别基于红藻氨酸诱导的癫痫模型的基于蛋白的生物标志物的进展。

可以使用在可选的具体实施例中的其它化合物包括氯代丙酸（Chloropropionic acid，Sigmacat#306797）、溴杀灵（Bromethalin，Bell Labs，CAS#63333-35-7）和戊四唑（Pentylenetetrazole，PTZ，Sigma cat#P6500）、紫杉醇、和有机铂化合物如原型顺铂。

如这里使用的，术语“神经毒性”和“神经毒性损伤”是指在中枢神经系统（CNS）或周围神经系统（PNS）中的神经元的细胞或其它细胞（例如神经胶质细胞、少突胶质细胞或雪旺氏细胞、小神经胶质细胞）的可能会或可能不会导致细胞死亡的可逆或不可逆的变化。神经毒性包括结构上的改变，如在树突状树的树枝的结构或组织中的改变，或分子或大分子重组，如与细胞代谢、神经递质的通路等相关的改变。神经毒性示例性地是由于：辐射损伤；线粒体中毒；如由嘌呤霉素或放线菌酮进行的蛋白合成的阻断；如由放线菌素-D或离子通道阻滞剂导致的包括基因转录和mRNA翻译的异常蛋白合成的阻断、加速或开始；或导致在神经元细胞内、由神经元细胞分泌、或以其它方式与神经元细胞相关的一个或多个蛋白的积聚增加的蛋白降解事件中的改变。神经毒性还包括化学-（如抗癌药物或化疗）诱导的周围神经病变或化疗诱导的在大脑结构或功能中的变化（也称“化学脑”）。

发明的生物标志物示例性地是肽或蛋白。蛋白的存在或不存在，或蛋白水平的增加或减少的检测与神经毒性水平相关。如这里所使用的，“肽”是指任何长度的肽，包括蛋白。术语“多肽”，“寡肽”在这里使用，没有任何特定的大小的限制，除非另外说明特定的大小。

蛋白生物标志物的示例性例子包括UCH-L1和用于α-II血影蛋白降解产物（SBDP）的α-II-血影蛋白。α-II-血影蛋白主要富集在脑中，位于神经元而不是神经胶质细胞中。此外，α-II-血影蛋白出现位于轴突中（Czogalla和Sikorski,2005;Riederer等,1986）。α-II-血影蛋白由两个半胱氨酸蛋白酶：钙蛋白酶和半胱天冬酶酶切。钙蛋白酶，以静止状态处于静止细胞中，响应细胞内钙离子的显著升高，诱导至过分活跃状态，并伴随着TBI（Fineman等,1993）。该酶酶切α-II-血影蛋白成150和145kDa的片段。钙蛋白酶蛋白水解主要与坏死胀亡有关（Kampfl等,1997;Liu等，2004;Wang,2002）。半胱天冬酶，其激活与凋亡性细胞死亡相关，酶切血影蛋白成不同的150和120kDa的片段（Pike等,2001;Wang,2000）。这种差异性酶切不仅允许表明血影蛋白切割酶响应神经毒性损伤的CNS-特异性过度激活，而且允许坏死和/或凋亡作为损伤病理的促成因素的相对重要性的评估。

可选地，发明的生物标志物是多核酸如寡核苷酸。寡核苷酸是DNA或RNA分子。RNA分子的例子示例性地包括mRNA和miRNA分子。历史上认为RNA分子在血浆中具有短半衰期。最近以来，研究表明，RNA分子在血浆中可被蛋白或脂质囊泡所保护。因此，在发明的方法中，例如神经损伤后释放的RNA分子可以在细胞、组织、血液、血浆、血清、CSF、或其它生物材料中检测到，并与损伤的存在相关。现有技术中已知许多方法用于从生物样品中分离RNA。示例性地，由El-Hefnaway等,Clinical Chem.,2004;50(3);564-573描述的方法，其内容在这里通过参考并入，在本发明中是可操作的。

在一些具体实施例中，检测到UCH-L1 RNA。由此得到的人UCH-L1 RNA或cDNA是已知的序列，能够在NCBI的数据库中以登录号NM_004181找到。本领域的普通技术人员知道，其它TBI相关的RNA序列例如那些编码在表1中列出的蛋白的序列同样可在NCBI数据库中找到。作为进一步的例子，GFAP的mRNA序列以用于GFAP的两个亚型的登录号NM_001131019.1和NM_002055.3找到。用于人α血影蛋白的完整的cDNA和蛋白序列以登录号M61877 J05244找到。以每个登录号的每个文件的内容在这里通过参考并入。

引物和探针的设计是在本领域技术人员的水平范围内。任何合适的引物和探针，以及其上的标记是可操作用于本主题发明的mRNA生物标志物的检测。示例性地，引物和探针的设计可以使用从商业来源可得的自动化程序进行。可选地，许多商业供应商提供引物和探针的设计服务，包括Applied Biosystems（Foster City，CA）。

发明的用于RNA的方法示例性地包括从可能怀疑具有神经系统疾病的对象获得生物样品；从所述样品获得RNA；分析RNA中RNA生物标志物的存在；比较检测到的RNA生物标志物的水平与来自没有神经系统疾病的对象的RNA生物标志物的水平；及诊断可疑对象中神经系统疾病存在或不存在。

可选地，发明的方法涉及分析生物样品中多个生物标志物的存在。多个可以是任何大于1的数。可选地，两个生物标志物进行了分析。可选地，生物标志物是UCH-L1和SBDP145。在发明的方法中更多的生物标志物可同时或依次分析，示例性地包括3，4，5，6，7，8，9，10，20，50，100，1000，或之间的任何数或更大。

可选的，用于生物标志物的检测和定量的方法包括实时PCR（RT-PCR）。RT-PCR允许同时扩增和定量多个生物标志物。可选地，质谱分析法例如电喷雾电离质谱加上飞行检测计时和高效液相色谱法同样是可操作的。可以理解，如本领域的普通技术人员将会理解的，其它的方法是同样可操作的用于检测。

许多miRNA分子在本发明中是可操作作为生物标志物的。术语“miRNA”根据其普通和平常意义进行使用，是指在真核生物中发现的涉及基于RNA的基因调控的小RNA分子。例子包括调节在表1中列出的一个或多个蛋白的表达的miRNA分子。一些miRNA分子已经确定，并在发明的方法中可操作作为生物标志物。示例性地，由Redell，JB等,J.Neurosci.Res.,2009;87:1435-48;Lei,P.等,Brain Res.,doi:10.1016/j.brainres.2009.05.074;Lu,N等,Exp.Neurology，2009;doi:10.1016/j.expneurol.2009.06.015;and Jeyaseelan,K等,Stroke,2008;39:959-966描述的miRNA分子，每一份文献的内容在这里通过参考在那里限定的miRNA以及还专门参考在每份参考文献中描述的miRA的分离和定量的方法并入。这些方法，或由本领域的普通技术人员所认识到的其改变，使用在本发明的方法中。

可选的方法包括检测针对从示例性地由候选药物、疾病、损伤或其它异常导致的神经系统损伤如化学损伤的位点释放的抗原的自身抗体。不局限于特定的理论，神经毒性损伤导致细胞损伤，其释放细胞内或细胞膜中的内容物到CSF或血液或其它体液如尿液、唾液、汗、泪）中。这些蛋白如在表1中列出的那些蛋白的许多的水平通常不存在于非神经组织如脑组织的细胞质或细胞膜的体液中，或如果它们存在，它们的水平由神经毒性损伤改变。这些抗原的存在通常导致在对象中对这些抗原的自身抗体的产生。自身抗体作为生物标志物的检测是诊断对象中异常神经系统疾病存在的优选的方法。

美国专利US6010854描述用于产生筛选抗原的方法和用于筛选对神经元谷氨酸受体的自身抗体的方法。这些方法同样适用于本发明主题。因此，美国专利US6010854在这里通过参考它的用于产生可操作用于筛选自身抗体的筛选抗原的方法的教导并入。美国专利US6010854同样在这里通过参考它的检测自身抗体的方法的教导并入。可以理解，检测抗体的其它方法示例性地包括ELISA、Western blotting，质谱法、气相色谱法、染色法，和在本领域中已知的方法同样是可操作的。

可选地，全长蛋白如表1中列出的任何蛋白是可操作作为用于自身抗体的筛选抗原。例如，UCH-L1是抗原性的，在对象中产生自身抗体。人UCH-L1蛋白的序列以NCBI登录号NP_004172.2找到。同样，用于人GFAP的序列以NCBI登录号NP_002046.1找到。用于包括SBDP145序列的α血影蛋白的序列以登录号M61877 J05244列出。其它可选的抗原示例性地包括α-血影蛋白、SBDP145、MAP、Tau、Neurofascin、CRMP-2、MAP2粗品和人脑裂解液。

产生表1的肽和蛋白的任何合适的方法在这里是可操作的。示例性地，和纯化标签一起使用或不使用的克隆和蛋白表达系统是有用的。用于产生免疫原性肽的可选的方法包括通过本领域已知的方法进行的合成肽的合成。任一方法用于为筛选生物样品中自身抗体存在可操作的抗原产生是可操作的。

可以理解，生物标志物如肽、RNA、miRNA、DNA、和自体抗体的图谱是可操作的以定位神经异常的位点和严重程度。示例性地，对大脑的损害揭示多个生物标志物的图谱不同于对中枢神经系统的其它区域的损害所揭示的。此外，对海马的损害将产生生物标志物的图谱不同于对额叶的损害所揭示的。因此，损伤的定位通过多个生物标志物的比较检测实现。例如，在细胞内的miRNA的水平响应脑损伤以特定的图谱改变。（见Redell，J,et al，J.Neurosci.Res.,2009;87:1435-1448.）

本发明人惊奇地发现，调节表1中的蛋白的表达的miRNA生物标志物的水平依赖于损伤的严重程度或从损伤发生以来的时间通过上调或下调类似地改变。miRNA和其它生物标志物的图谱随伤害或疾病进展而变化。这可能是继发性损伤事件、延迟的细胞凋亡、或其它机制改变RNA、DNA、或蛋白的释放的结果。Redell,J，上面在这里通过参考并入，说明miRNA生物标志物在3小时和24小时的改变。一些miRNA在3个小时上调，而其它仅在24小时上调。对于miRNA的下调观察到类似的结果。因此，Redell,J等，J.Neurosci.Res.,2009;87:1435-1448的miRNA生物标志物的调节，其检测方法，和在表达上随时间的改变在这里通过参考并入，同样适用于本主题发明。同样，由Jeyaseelan,K等,Stroke,2008;39:959-966观察到的，响应中风，miRNA的表达的时间性质在这里也通过参考其中教导的特定miRNA以及其中教导的分离、定量和检测方法并入。

因此，可选地，本发明从生物样品筛选第一和第二生物标志物。更大的数目同样是可操作的。GFAP生物标志物是可选的第一生物标志物。因为GFAP与神经胶质细胞如星形胶质细胞相关，优选地另一生物标志物是与神经功能相关的不同类型的细胞的健康相关。更优选地，另一细胞类型是轴突、神经元、或树突。通过使用包括与神经胶质细胞以及至少一个其它类型的神经细胞相关的生物标志物的发明的测定方法，该类型神经细胞受压或杀死，以及产生神经系统疾病的定量。GFAP生物标志物可选的和至少一个另外的生物标志物的协同作用并将GFAP生物标志物和另外的生物标志物的量和标志物的正常水平比较提供对象神经系统疾病的确定。特定的生物标志物的水平，单独或与GFAP生物标志物相呼应测量时提供对象的神经系统疾病的优越的评价，示例性地包括SBDP150和SBDP145（钙蛋白酶介导的急性神经坏死）、SBDP120（半胱天冬蛋白酶介导的延迟的神经细胞凋亡）、UCH-L1（神经元细胞体损伤标志物），和MAP-2。

与发明的生物标志物相关的特定蛋白的性质允许牢固确定损伤的程度、位置、和严重程度。表2表示与发明的生物标志物相关的蛋白的生物位置。可以理解，蛋白、自身抗体、或RNA，例如，外周蛋白的增加相当于异常不同于对UCH-L1、SBDPs、MAP-2和GFAP的自身抗体或RNA的增加。

发明的生物标志物的检测也是可操作的以筛选潜在的药物候选物，或分析先前确定的药物候选物的安全性。这些测定方法可选的在体外或在体内。在体内筛选或测定实验方案示例性地包括在响应神经毒性产生给定的生物标志物的动物示例性地包括小鼠、大鼠或人或其它的非人类哺乳动物中生物标志物的测量。确定或监测如UCH-L1或SBDP145生物标志物的水平的研究可选的结合行为分析或运动障碍分析如：动作协调性测试，示例性地包括旋转法（Rotarod）、行走试验、步态分析、网格测试、悬挂试验和吞线试验；镇静试验，示例性地包括那些在开放式现场中检测自主活动的试验；用于痛觉异常的敏感试验-冷浴试验，38℃热板测试和Von Frey测试；用于痛觉过敏的敏感试验-52℃热板测试和Randall-Sellito测试；和EMG评估，如感觉和运动神经传导、肌肉复合动作电位（Compound Muscle ActionPotential，CMAP）和H-波反射。

发明的生物标志物的分析是示例性地可操作的以检测、诊断或治疗疾病状态或筛选化学或其它治疗物以治疗疾病或损伤。可筛选的疾病或病症示例性地包括但不限于：髓鞘疾病涉及如多发性硬化、中风、肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）、化疗、癌症、帕金森氏病、源于化学或生理异常的神经传导异常如尺神经炎和腕管综合征、其它周围神经病变示例性地包括坐骨神经夹伤（创伤性神经病变）、链尿佐菌素（streptozotozin，STZ）（糖尿病神经病变）、抗有丝分裂诱导的神经病变（化疗诱导的神经病变）、实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）、延迟型超敏（DTH）、类风湿关节炎、癫痫、疼痛、神经性疼痛、和子宫内创伤。

为了提供神经系统疾病和UCH-L1及其它生物标志物的测得量之间的相关性，CSF或血清样品从带有要测量生物标志物的样品的对象进行采集。对象在神经系统疾病各不相同。UCH-L1生物标志物的检测的水平可选的与CT扫描结果以及GCS得分相关联。基于这些结果，形成和验证发明的测定方法（Lee等,Pharmacological Research 23:312-328,2006）。可理解，UCH-LL生物标志物，除了从CSF和血清获得外，还容易地从血液、血浆、唾液、尿、以及固体组织活检获得。虽然由于与神经系统的直接接触，CSF是一种优选的采样流体，可理解，其它体液在作为用于其它目的的采样时具有优势，因此允许用于神经系统疾病的发明的确定作为在单一样品例如血液、血浆、血清、唾液或尿液上进行成套测试的一部分。

生物样品通过常规技术从对象获得。例如，CSF通过腰椎穿刺获得。在一些具体实施例中，CSF不是通过套管插入术例如腰椎穿刺或类似于Nirogi et al,J.Neurosci.Methods,2009;178(1):116-119的技术通过在采集时间插入针示例性地蝶形针经皮导入枕大池获得，该文献内容在这里通过参考并入。血液通过静脉穿刺获得，而血浆和血清根据已知的方法通过分馏全血获得。用于获得固体组织样本的外科技术在本领域中是公知的。例如，获得神经系统组织样本的方法描述在标准神经外科文本如Atlas ofNeurosurgery:Basic Approaches to Cranialand Vascular Procedures,by F.Meyer,Churchill Livingstone,1999;Stereotactic and ImageDirected Surgery of Brain Tumors,1st ed.,by David G.T.Thomas,WB Saunders Co.,1993;andCranial Microsurgery:Approaches and Techniques,by L.N.Sekhar and E.De Oliveira,1st ed.,Thieme Medical Publishing,1999中。用于获得和分析脑组织的方法还描述在Belay等,Arch.Neurol.58:1673-1678(2001);和Seijo等,J.Clin.Microbiol.38:3892-3895(2000)中。

可选的，生物标志物是可选择的用于检测或诊断神经系统疾病，如神经毒性损伤和类似的。可选地，生物标志物是特异的和有效的用于检测和区分化学诱导的神经毒性的水平。这样的生物标志物可选的称为神经活性生物标志物。

可理解，生物标志物的存在或活性的时间性质是可操作的作为神经毒性的指示物或识别物。在一个非限制性的例子中，实验性的全身暴露于MK-801的严重程度，其导致奥尔尼病变，与在CSF中UCH-L1的时间保持相关联。

可选的，生物标志物分析使用生物样品或体液进行。在这里可操作的示例性的生物样品示例性地包括，细胞、组织、脑脊髓液（CSF）、人造脑脊髓液、全血、血清、血浆、细胞内液、尿、粪便、胃液、消化液、唾液、鼻腔或其它气道流体、阴道分泌液、精液、缓冲盐水、盐水、水，或其它在本领域公认的体液。

除了增加的细胞表达，蛋白生物标志物可选地还出现在与损伤的细胞流体连通的体液中。从对象获取体液如脑脊髓液（CSF）、血液、血浆、血清、唾液和尿液比获得固体组织活检样本通常少得多地侵入性和创伤性。因此，是体液的样品优选使用在本发明中。特别地，CSF优选用于检测对象中的神经损伤，因为它与神经系统直接接触，并且是容易得到的。血清作为示例性的生物样品是很容易获得的，并表现出对供体对象进一步损伤或副作用的低得多的风险。

损伤后，在体外培养基中或在对象中原位的神经细胞比不进行损伤的这样的细胞表达一个或多个蛋白或RNA分子的改变的水平或活性。因此，含有神经细胞的样品例如中枢神经系统或外周神经系统组织的活检样本是合适的生物样品用于使用在本发明中。然而，除了神经细胞，示例性地表达αII-血影蛋白的其它细胞包括例如红细胞、心肌细胞、骨骼肌、肝细胞、肾细胞和在睾丸中的细胞。包括这样的细胞或从这些细胞分泌的流体的生物样品也可以使用在发明的方法的适应性改变中，以确定和/或表征损伤至这样的非神经细胞。

在这里所使用的对象示例性地包括狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、鸡、非人类的灵长类动物、大鼠、豚鼠、仓鼠、和老鼠。因为本发明涉及人类对象，用于本发明的方法的对象可选的是人类。

最受益于本发明的对象可选的是那些怀疑具有或处于形成异常神经系统疾病或损伤的风险的对象，如由创伤性损伤（例如，枪伤、车祸、运动意外、摇晃婴儿综合症、其它撞击损伤）、缺血性事件（例如，中风、脑出血、心脏骤停）、神经退行性疾病（如老年痴呆症、亨廷顿氏病、和帕金森氏病；朊蛋白相关疾病；其它形式的痴呆症）、癫痫症、物质滥用（例如：安非他明、迷幻药/摇头丸、或乙醇）、和外周神经系统病理如糖尿病神经病变、化疗诱导的神经病变和神经病理性疼痛引起的脑损伤的受害者。

为了提供神经系统疾病和测量的生物标志物的量之间的相关性，CSF或血清CSF是可选的体液。示例性地，CSF或血清的样品从带有要测量生物标志物的样品的对象进行采集。体液或其它生物样品的采集示例性地在施用化学剂或生物剂之前或之后。示例性地，可选的，对象施用化学剂，如用于药物筛选的试剂。在施用之前，在施用时，或之后任何期望的时间，生物样品从对象获得。优选的，在对象的血液中发现药物期间或之后不久，获得生物样品。示例性地，在口服给药后观察到血浆浓度增加过程中获得生物样品。示例性地，血浆浓度峰获得之后得到生物样品。可选地，在给药后1、2、3、4、5、10、12、24小时或之间任何时候得到生物样品。可选地，1、2、3、4、5、6、7天或之间任何时间得到生物样品。在一些具体实施例中，1、2、3、4周或更多，或之间的任何时间得到生物样品。可理解，神经毒性在给药后立即发生或延迟。可选的，1、2、3、6个月或更长，或之间任何时间得到生物样品以检测延长的神经毒性。在一些具体实施例中，对象以小时、天、周、月或年持续给药，在这段时间内获得一个或多个生物样品用于筛选生物标志物。在一些具体实施例中，第四阶段试验使用用于监测市售的化学或生物剂的持续安全性。可选的，这些试验继续多年或无限期。因此，从给药前至第一次给药后多年的任何时间，获得生物样品用于检测神经毒性的一个或多个发明的生物标志物。

对象在神经系统疾病各不相同。可选的，一个或多个生物标志物的检测的水平然后与公认的或标准的基准水平或可选的CT扫描结果以及GCS得分相关联。基于这些结果，可选的，形成和验证发明的测定方法。可理解，神经活性生物标志物，除了从CSF和血清获得外，也很容易从血液、血浆、唾液、尿、以及固体组织活检得到。虽然由于与神经系统的直接接触，CSF是一种优选的采样流体，可理解，其它体液在作为用于其它目的的采样时具有优势，因此允许用于神经系统疾病的发明的确定单独或作为在单一样品例如血液、血浆、血清、唾液或尿液上进行成套测试的一部分。神经毒性损伤的临床表现示例性地包括GCS评分负变化、癫痫发作、和神经生成。

生物标志物的基准水平是在没有已知神经系统疾病的期望对象的物种中的目标生物样品中获得的那些水平。这些水平不需要以硬浓度表示，而反而可以从平行对照实验得知，并以荧光单位、密度单位、和类似单位表示。典型地，在没有神经系统疾病的情况下，一个或多个SBDPs以可以忽略不计的量存在于生物样品中。然而，UCH-L1在神经元中是一种非常丰富的蛋白。确定特定物种的例如神经元、血浆或CSF中UCH-L1或UCH-L1生物标志物例如mRNA的基准水平是本领域技术人员熟知的。同样，确定其它生物标志物的基准水平的浓度是本领域技术人员熟知的。

如这里所使用的，术语“诊断”是指识别神经系统疾病或其它疾病例如神经毒性的存在或不存在。可选的，诊断称为测定方法的结果，其中生物标志物的特定的比例或水平检测到或不存在。

如这里所使用的，“比例”要么是一个正比例，其中目标的水平大于第二个样品中的目标，或相对于相同目标的已知的或公认的基准水平。负比例说明目标的水平低于第二个样品中的目标，或相对于相同目标的已知的或公认的基准水平。中性比例说明在目标生物标志物中没有观察到变化。

如这里所使用的，术语“施用”是输送治疗物至对象。治疗物是意图减轻疾病的一个或多个症状或治疗疾病而施用的化学或生物剂。如这里所使用的，术语“暴露”使用用于暗示施用至对象以及体外或体内靶向接触对象细胞。治疗物通过本领域技术人员确定的适合特定对象的途径施用。例如，治疗物口服、非肠胃（例如静脉注射的，通过肌内注射、腹腔注射，瘤内的，通过吸入，或经皮的）施用。根据对象的年龄、体重和通常状况，治疗的神经系统疾病的严重程度，使用的特定的治疗物、其给药方式、和类似物，所需的治疗物的确切量每个对象均会有所不同。合适的量可以由本领域普通技术人员仅使用在这里给出的常规实验或由本领域中的知识而无需过多的试验来确定。

用于检测生物样品中一个或多个神经活性生物标志物的存在或不存在的示例性的方法包括从对象例如人获得生物样品，将生物样品接触能够检测要分析的生物标志物的化合物或试剂，示例性地包括引物、探针、抗原、肽、化学剂、或抗体，并且分析该样品中生物标志物的存在。可理解，其它检测方法同样是可操作的示例性地接触蛋白或核酸特异性染色。

可选的，发明的方法使用用于体外以及体内检测生物样品中UCH-L1生物标志物和一个或多个其它的神经活性生物标志物。样品中UCH-L1生物标志物的表达量与适当的对照相比，如已知表达要分析的标志物的可检测水平的第一样品（阳性对照）和已知不表达要分析的标志物的可检测水平的第二样品（阴性对照）。例如，用于检测标志物的体外技术包括酶联免疫吸附法（ELISAs）、放射免疫法分析、放射性分析、Western印迹、Southern杂交、Northern杂交、免疫沉淀、免疫荧光法、质谱法、RT-PCR、PCR、液相色谱法、高效液相色谱法、酶活性测定、细胞检测、正电子发射断层扫描、质谱法、它们的组合、或其它本领域已知的技术。此外，用于检测标志物的体内技术包括导入特异性结合标志物的标记的试剂进入生物样品或测试对象。例如试剂可以用放射性标记物进行标记，其在生物样品或测试对象中的存在和位置可以通过标准的成像技术进行检测。

能特异性结合或以另外的方式使用用于识别UCH-L1生物标志物的任何合适的分子在本发明中是可操作的。用于检测UCH-L1、SBDP145、GFAP、或其它生物标志物如在表1中列出的那些的优选的试剂是能够结合与要分析的生物标志物能够结合的自身抗体或抗体的抗原。这样的抗体可以是多克隆或单克隆的。完整的抗体、其片段（如Fab或F（ab'）₂）、或设计的其变体（例如，sFv）也可以使用。这样的抗体可以是任何免疫球蛋白类，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD和它们的任何子类。在这里可操作的抗体可选的是单克隆的或多克隆的。

RNA和DNA结合抗体在本领域中是已知的。示例性地，RNA结合抗体从来自噬菌体展示文库的一系列抗体片段进行合成。使用用于合成RNA结合抗体的示例性的例子在Ye,J,et al,PNAS USA,2008;105:82-87中找到，其内容在这里通过参考产生RNA结合抗体的方法并入。因此，产生针对基于RNA的生物标志物的抗体在本领域的技能范围内。

同样DNA结合抗体在本领域中是公知的。产生DNA结合抗体的示例性的方法在Watts,RA,et al,Immunology,1990;69(3):348-354中找到，其内容在这里通过参考作为产生抗DNA的抗体的示例性的方法并入。

抗体可选的进行标记。本领域的普通技术人员知道在这里可操作的许多标记物。标记物和标记试剂盒是商业可得的，可选的来自Invitrogen Corp,Carlsbad,CA。标记物示例性地包括，荧光标记物、生物素、过氧化物酶、放射性核苷酸、或在本领域中已知的其它标记物。

基于抗体的测定方法优选用于分析生物样品中UCH-L1、SBDP145、GFAP、MAP2、S100b或其它生物标志物的存在。合适的Western印迹方法对于那些本领域技术人员是已知的。为了更快速的分析（在医疗急救情况下可能是重要的），免疫吸附测定（例如，ELISA和RIA）和免疫沉淀测定也可使用。作为一个例子，生物样品或其一部分固定在基体上，如由硝化纤维素或聚偏氟乙烯制成的膜；或由聚苯乙烯或其它塑料聚合物制成的刚性基体如微量滴定板，基体与特异性结合UCH-L1、SBDP150、SBDP145、MAP2、GFAP、NSE、S100b或其它发明的生物标志物之一在允许抗体结合至要分析的生物标志物的条件下接触。洗涤后，在基体上抗体的存在表示样品包含要分析的生物标志物。如果抗体直接偶联可检测的标记物，例如酶、荧光基团、或放射性同位素，标记物的存在可选的通过检测基体中可检测的标记物进行检测。可选择的，结合标志物特异性抗体的可检测的标记的第二抗体加入到基体上。洗涤后，在基体上可检测的标记的存在表示样品含有标志物。可选择地，使用夹心测定法，其中针对生物标志物的特异性一抗结合至固体基体。生物样品和板一起孵育，非特异性结合的材料洗涤掉。标记的或其它方式可检测的二抗使用用于结合通过一抗附着至基体的生物标志物。结合的二抗的检测表示生物样品中生物标志物的存在。

这些基本的免疫测定的众多的排列组合在本发明中也是可操作的。这些包括生物标志物特异性抗体，与样品固定在基体上相反，基体与偶联可检测的标记物的UCH-Ll、SBDP150、SBDP145、GFAP、MAP2，或其它神经活性生物标志物在使得抗体结合标记的标志物的条件下接触。然后，基体在允许要分析的标志物结合抗体的条件下接触样品。洗涤后基体上可检测的标记物的量的减少表明样品含有标志物。

虽然抗体因为其广泛的特征在本发明中是可操作的组合物，特异性结合UCH-Ll、SBDP150、SBDP145、GFAP、MAP2，或其它生物标志物的任何其它的合适的试剂（例如，肽、适体或小的有机分子）可选的用来代替抗体。例如，可以使用特异性结合αII-血影蛋白和/或一个或多个其SBDPs的适体。适体是结合特异性配体的基于核酸的分子。用于形成具有特定结合特异性的适体的方法已知详述在美国专利US5475096、US5670637、US5696249、US5270163、US5707796、US5595877、US5660985、US5567588、US5683867、US5637459和US6011020中。

在用于生物标志物表达的诊断测定方法中可操作的无数的可检测的标记物在本领域中是已知的。使用在用于检测UCH-L1或其它生物标志物的方法中的试剂偶联至可检测的标记物，例如，酶如辣根过氧化物酶。用辣根过氧化物酶标记的试剂可以通过添加在辣根过氧化物酶存在下产生颜色变化的适当的底物进行检测。可以使用的一些其它可检测的标记物是众所周知的。这些的常见例子包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、荧光化合物、发光化合物、胶体金、磁性颗粒、生物素、放射性同位素、和其它酶。可理解，一抗/二抗系统可选的使用用于检测一个或多个生物标志物。特异性识别一个或多个生物标志物的一抗暴露于可能含有感兴趣的生物标志物的生物样品。然后识别一抗的种类或同种型的带有合适标记物的二抗与样品接触，以便实现样品中一个或多个生物标志物的特异性检测。

本发明采用将生物样品中UCH-Ll、SBDP145、SBDP150、MAP2、GFAP、或其它生物标志物的存在或量与神经细胞损伤的严重性和/或类型相关联的步骤。作为一个说明，在生物样品中UCH-L1的量与由神经系统疾病形成的神经毒性损伤相关。协同测量UCH-L1生物标志物和一个或多个其它生物标志物的发明的测定方法的结果可以帮助医生确定涉及已经损害细胞类型的损伤的类型和严重程度。这些结果与CT扫描和GCS结果一致，但这些结果是定量的，获得更迅速，并具有低得多的成本。

本发明提供了将UCH-L1生物标志物的量以及可选的至少一种其它生物标志物示例性地SBDP145或SBDP150的量与正常水平或一个或每个进行比较以确定对象的神经系统疾病的步骤。可理解，另外的生物标志物的选择允许人们确定牵涉异常神经系统疾病如神经毒性的神经细胞的类型以及在轴突损伤标志物即针对SBDP或GFAP的自身抗体的情况下细胞死亡的性质。

为对象的最佳利益，发明的方法的实践提供了一个可以帮助医生确定合适的治疗物进行施用的测试。虽然在例子中找到的随后提供的数据提供关于脑损伤的全谱，可理解，这些结果是适用于缺血性事件、神经退行性疾病、朊病毒相关的疾病、癫痫、化学或生物剂病因、以及周围神经系统疾病病理。性别差异可能存在异常的对象的神经系统疾病中。

还提供了一种用于分析对象中细胞损伤或其它细胞疾病的测定方法。该测定方法示例性地包括：（a）用于保持从怀疑具有损伤的神经细胞的对象分离的样品的基体，样品在从对象分离之前是与对象的神经系统流体连通的流体；b）UCH-L1生物标志物特异性结合剂；（c）可选的，用于另一生物标志物如SBDP145特异性的结合剂；和（d）打印的说明书用于反应：UCH-L1生物标志物与生物样品或生物样品的一部分以检测UCH-L1生物标志物的存在或量，和对于另一生物标志物特异性的试剂与生物样品或生物样品的一部分以检测生物样品中至少一个其它生物标志物的存在或量。因财务报酬，发明的测定方法可用于检测神经毒性。

发明的测定方法可选地包括可检测的标记物，如偶联至试剂的标记物、或者偶联至特异性结合试剂的物质如二抗的标记物。

本发明可选地包括可以改变目标生物标志物的一个或多个特性的一种或多种治疗剂。可选的，治疗剂作为目标生物标志物或一种生物标志物的上游效应子的激动剂或拮抗剂。可选的，治疗剂影响生物标志物的下游功能。例如，乙酰胆碱（Acetylcholine，Ach）在病理神经元兴奋中起作用，TBI诱导的毒蕈碱胆碱能受体的激活可能导致兴奋性毒性过程。因此，可选的，生物标志物包括乙酰胆碱或毒蕈碱受体的水平或活性。可选地，可操作的生物标志物是由毒蕈碱受体的活性影响的分子、蛋白、核酸或其它物质。因此，在本主题发明中可操作的治疗剂示例性地包括那些调节毒蕈碱胆碱能受体激活各个方面的物质。

可操作作为治疗靶点或治疗靶点调节物的具体的毒蕈碱受体包括M₁、M₂、M₃、M₄、和M₅毒蕈碱受体。

在检测和治疗TBI中毒蕈碱胆碱能受体通路的合适性产生于证明在实验性TBI（Gormanet al.,1989;Lyeth et al.,1993a）和缺血（Kumagae and Matsui,1991）后的大脑脑脊髓液（CSF）中升高的Ach的研究，以及通过应用类胆碱实现的高水平的毒蕈碱胆碱能受体的激活的伤害性（Olney et al.,1983;Turski et al.,1983）。此外，毒蕈碱受体拮抗剂的急性施用改善实验性TBI后的行为恢复（Lyeth et al.,1988a;Lyeth et al.,1988b;Lyeth and Hayes,1992;Lyeth et al,1993b;Robinson et al，1990）。因为结合或改变毒蕈碱胆碱能受体的特性的这些化学或生物剂可选的进行筛选用于例如在临床前药物发现中靶点优化期间确定细胞或组织的神经毒性。

治疗剂、化学剂、或生物剂，在本主题发明中可操作的，示例性地是任何分子、化合物、家族、提取液、溶液、药物、前体药物，或其它可操作用于改变，优选改善，处于神经毒性损伤风险或经受神经毒性损伤的对象的治疗结果的机制。试剂可选的是毒蕈碱胆碱能受体调节剂例如激动剂或拮抗剂。激动剂或拮抗剂可通过直接或间接的。间接的激动剂或拮抗剂可选的是降解或合成乙酰胆碱或其他毒蕈碱受体相关分子的分子，示例性地目前用于治疗阿尔茨海默氏病的分子。胆碱模仿或类似分子在这里是可操作的。在这里可操作的治疗剂的示例性的列表包括：双环维林（dicyclomine）、东莨菪碱（scoplamine）、米拉美林（milameline）、N-甲基-4-哌啶二苯基乙醇酸或酯NMP（N-methyl-4-piperidinylbenzilate NMP），毛果芸香碱（pilocarpine），哌仑西平（pirenzepine），乙酰胆碱（acetylcholine），乙酰甲胆碱（methacholine），氨甲酰胆碱（carbachol）、氨甲酰甲胆碱（bethanechol）、毒蕈碱（muscarine）、氧化震颤素M（oxotremorine M）、氧化震颤素（oxotremorine）、毒胡萝卜素（thapsigargin）、钙通道阻滞剂或激动剂、尼古丁（nicotine）、呫诺美林（xanomeline）、BuTAC、氯氮平（clozapine）、奥氮平（olanzapine）、西维美林（cevimeline）、醋克立定（aceclidine）、槟榔碱（arecoline）、托特罗定（tolterodine）、罗西维林（rociverine）、IQNP、吲哚生物碱、喜巴辛（himbacine）、cyclostellettamines、红藻氨酸（kainic acid）、氯丙酸（chloropropionic acid）、溴杀灵（bromethalin）、氨甲喋呤（methotrexate）、抗癌化疗药物，如紫杉醇（paxlitaxel），和有机铂化合物、戊四氮（pentylenetetrazol）；抗精神病药，非法精神药物、醇；上述任何物质的衍生物、上述任何物质的前体药物、和上述任何物质的组合。治疗剂可选的是可操作改变钙蛋白酶或半胱天冬酶的水平或活性的分子。这样的分子和它们的施用是本领域已知的。

发明的方法示例性地包括用于诊断对象中神经系统疾病的方法、治疗具有神经系统疾病的对象的方法，或两者均包括。在一些具有实施例中，发明的方法示例性地包括从对象获得生物样品。生物样品通过本领域已知的机制进行分析，用于检测或确定生物样品中一个或多个生物标志物的存在。基于生物样品中目标生物标志物的量或存在，一个或多个生物标志物的比例可选的进行计算。比例可选的是一个或多个生物标志物的水平相对于在相同或平行样品中另一个生物标志物的水平，或生物标志物的量与在已知没有神经系统疾病的对象中测得的或先前形成的相同的生物标志物的基准水平的比例。比例允许在对象中诊断神经系统疾病。发明的方法可选的施用治疗物至对象，其直接或间接改变一个或多个生物标志物的比例。

还提供发明的方法用于检测、诊断或治疗多器官损伤。多器官示例性地包括神经系统组织例如脑和脊髓等等的子集，或大脑的特定区域，例如皮层、海马等等。多器官损伤示例性地包括通过用于半肤天冬酶诱导的SBDPs的生物标志物的存在可检测的细胞凋亡；和通过用于钙蛋白酶诱导的SBDPs的生物标志物的存在可检测的细胞胀亡。本发明方法示例性地包括测定从对象获得的生物样品中的许多生物标志物，其中当生物样品从对象获得时，生物样品可选地与经受神经毒性损伤的器官或对照器官液体接触。发明的方法基于许多生物标志物的第一比例确定器官损伤的第一亚型。发明的方法还基于生物样品中许多生物标志物的第二比例确定第二器官损伤的第二亚型。比例示例性地通过在这里描述的或本领域已知的方法确定。

在发明的方法中的多器官损伤的治疗示例性地通过对对象施用至少一种有效调节因响应第一器官损伤而活性改变的蛋白的活性的治疗拮抗剂或激动剂，和施用至少一种有效调节因响应第二器官损伤而活性改变的蛋白的活性的治疗拮抗剂或激动剂。

本主题发明示例性地包括用于区分对象中神经毒性损伤的程度的组合物。一种发明组合物要么是一种试剂要么是多种试剂的混合物。在优选的具体实施例中，组合物是一种混合物。该混合物可选地包含源自对象的生物样品。对象可选地怀疑具有神经毒性疾病。生物样品在从对象分离之前与对象的神经系统流体连通。发明组合物还包含至少两个主要试剂，优选抗体或引物，其特异性地和独立地结合至可能存在生物样品中的至少两个生物标志物。在一些可选的具体实施例中，第一主要试剂是特异性结合泛素羧基末端水解酶生物标志物优选UCHL1生物标志物的抗体。第二主要试剂优选特异性结合血影蛋白降解产物生物标志物例如SBDP 145的抗体。

发明组合物的试剂可选地是可动的，或以其它方式与基体接触。发明教导还可选地用至少一种可检测的标记物进行标记。在可选的具体实施例中，在每种试剂上的可检测的标记物是独一无二的和可独立检测的。可选地，特异性用于检测或结合至主要试剂的次要试剂用至少一种可检测的标记物进行标记。在非限制实例中，主要试剂是兔源抗体。次要试剂可选的是对兔源一抗具有特异性的抗体。抗体结合至抗原的检测的机理是本领域熟知的，本领域普通技术人员很容易想到适于检测生物样品中的抗原或生物标志物的许多方法和试剂。

还提供了试剂盒，包括适于连接生物样品中的目标生物标志物的基体。生物样品可选地与试剂盒一起提供或由使用本发明试剂盒的医师获取。一种发明试剂盒还包括可选地特异性地和独立地结合至至少两个生物标志物的至少两个抗体。抗体优选地区分两种生物标志物。优选地，第一抗体是特异性的和独立的用于结合和检测第一生物标志物。第二抗体是特异性的和独立的用于结合和检测第二生物标志物。采用这种方式，可以确定或区分在单一生物样品中的多个生物标志物的存在或缺乏。在一些可选的具体实施例中，生物样品中的目标生物标志物示例性地包括用于αII-血影蛋白、αII-血影蛋白降解产物（SBDP）例如SBDP 145、泛素羧基末端水解酶、GFAP和MAP2蛋白的生物标志物的那些。一种发明试剂盒还包括用于将抗体与生物样品或一部分生物样品反应从而检测生物样品中生物标志物的存在或量的操作指南。

在试剂盒中，生物样品可以是CSF或血液，试剂可选地是特异性结合用于神经系统疾病的至少一种生物标志物的抗体、适体、引物、蛋白或其它分子。合适的试剂在上面已经描述。试剂盒还可以包括可检测的标记物，例如偶联至试剂的标记物，或偶联至特异性结合试剂的物质（例如，二抗）的标记物。

本发明采用将生物样品中生物标志物的存在或量与神经细胞（或其它表达生物标志物的细胞）毒性的严重程度和/或类型相关联的步骤。在生物样品中生物标志物的量直接与神经组织毒性的严重性相关，因为更加严重的损伤损害更多数目的神经细胞，其反过来导致更大量的生物标志物积累在生物样品（例如CSF；血清）中。神经毒性损伤是否触发细胞死亡的凋亡类型和/或坏死类型可以通过检测生物样品中存在的用于SBDPs如SBDP 145的生物标志物来确定。细胞坏死优先激活钙蛋白酶，而细胞凋亡优先激活半胱天冬酶-3。因为可以区分钙蛋白酶和半胱天冬酶-3SBDPs，这些标志物的测量表明对象中细胞损害的类型。例如，坏死诱导的钙蛋白酶激活导致SBDP150和SBDP145的产生；凋亡诱导的半胱天冬酶-3激活导致SBDP150i和SBDP120的产生，两种通路都激活导致所有四种标志物的产生。同样，存在于生物样品中的UCH-L1生物标志物的水平或动力学程度可以可选地区分轻度损伤和更严重的损伤。在示例性的实例中，相对于轻度激发（30分钟），严重的MACO（2小时）在CSF和血清中均产生增加的UCH-L1，然而两者均产生超过未损伤对象的UCH-L1水平。而且，生物样品中标志物的持久性或动力学程度指示神经毒性的严重程度，更大的毒性表示对象中UCH-L1或SBDP生物标志物的增加的持久性，其是通过一种发明方法在损伤后在几个时间点获取的生物样品中测量的。

这种测试的结果可以帮助医生确定施用特定治疗物例如钙蛋白酶和/或半胱天冬酶抑制剂或毒蕈碱胆碱能受体拮抗剂是否可能有益于病人。该应用在检测细胞死亡机制中年龄和性别差异方面可能是尤其重要的。

涉及常规生物技术的方法在这里进行了描述。这些技术一般是本领域已知的，并详细描述在方法专题著作例如分子克隆（Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd ed.,vol.1-3,ed.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989）；和分子生物学现行实验方案（Current Protocols in Molecular Biology，ed.Ausubel et al.,Greene Publishingand Wiley-Interscience,New York,1992）（定期更新）中。免疫学方法（如，抗原特异性抗体制备，免疫沉淀和免疫印迹）描述在，例如，免疫学现行实验方案（Current Protocols inImmunology，ed.Coligan et al.,John Wiley & Sons,New York,1991）；和免疫学分析方法（Methods of Immunological Analysis,ed.Masseyeff et al.,John Wiley & Sons,New York,1992）中。

本发明的各个方面通过以下非限制的实例进行阐述。这些例子只用于说明目的，而不是限制本发明的任何实践。将可以理解，可以作出变化和更改而不背离本发明的精神和范围。虽然实例一般是针对哺乳动物组织，具体地说，分析大鼠组织，本领域普通技术人员认识到本领域已知的相似的技术和其它技术容易将实例应用到其它哺乳动物例如人类上。在这里说明的试剂均通常是在哺乳动物物种间交叉反应的，或具有类似性质的替代试剂是商业上可获得的，本领域普通技术人员容易知道哪里可以得到这些试剂。

实例1：用于生物标志物分析的材料。碳酸氢钠，（Sigma Cat#：C-3041），封闭缓冲液（Startingblock T20-TBS )(Pierce Cat#:37543），含吐温20的Tris盐缓冲液(TBST；Sigma Cat#：T-9039）。磷酸盐缓冲液（PBS；Sigma Cat#:P-3813）；吐温20（Sigma Cat#：P5927）；超级TMB ELISA(Pierce Cat#:34028)；和Nunc maxisorp ELISA板(Fisher)。单克隆和多克隆UCH-L1抗体是本实验自制或来自Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz,CA。针对αII-血影蛋白和降解产物（SBDP）以及MAP2的抗体可以从Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz,CA得到。用于许多亚型的抗体的标记物可以从Invitrogen,Corp.,Carlsbad,CA得到。生物样品中蛋白浓度用标准白蛋白使用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid）微量蛋白测定法（Pierce Inc.,Rockford,IL,USA)测定。所有其它必须的试剂和材料对于本领域技术人员是已知的而且容易获得的。

实例2：用于神经毒性的体外药物候选物筛选

小鼠、大鼠皮质或海马原代神经元培养21DIV，研究药物的剂量依赖性反应。培养的细胞暴露于10μΜ甘氨酸中不同浓度的谷氨酸（0.01-1000μΜ），均在HBSS中；B）在培养基中0.01到100μΜ红藻氨酸；C）在培养基中过氧化氢（0.001-1000μΜ）；C）在培养基中锌（0.01-1000μΜ）；D）在培养基中U0126（0.001-100μΜ）；和E）和等体积的培养基作为对照。谷氨酸处理进行30分钟后，将细胞洗涤，HBSS用培养基更换和分析。剩余的候选物处理24小时和分析。细胞裂解后分析了细胞内UCH-L1和SBDP145的水平，通过ELISA使用抗UCH-Ll和SBDP145特异性抗体筛选裂解产物。UCH-L1的水平增加，特别暴露于谷氨酸和过氧化氢后。

实例3：筛选开发的神经毒性化合物的神经毒性。

ReNcell CX细胞从Millipore（Temecula,CA）获得。冻结在通道3的细胞解冻并展开在层粘连蛋白包被的T75平方厘米组织培养瓶中（Corning,Inc.,Corning,NY）中在补充表皮生长因子（EGF）（20ng/ml；Millipore）和碱性成纤维细胞生长因子（FGF-2）（20ng/ml；Millipore）的ReNcell NSC维持培养基（Millipore）中。平板接种后3到4天（例如，达到80％融合之前），细胞传代，通过用accutase（Millipore）分离，在300×g离心5分钟，在含有EGF和FGF-2的新鲜维持培养基中重悬浮细胞沉淀。对于所有的实验，将细胞以每孔10,000个细胞的密度再接种在层粘连蛋白包被的costar 96孔板（Corning,Inc.,Corning,NY）中。

进行免疫组织化学实验以确定在暴露于1nM-100μM的基本上描述在Breier JM et al,Toxicological Sciences,2008;105(1):119-133中的甲基氯化汞（methyl mercury chloride）、反式维甲酸（trans-retinoic acid）、D-苯丙胺硫酸盐（D-amphetamine sulfate）、氯化镉、地塞米松（dexamethasone）、醋酸铅（lead acetate）、5,5-苯妥英（5,5-diphenylhydantoin）、丙戊酸（valproicacid）之前和之后24小时的细胞中的UCH-L1和SBDP145的水平，上述文献内容在这里通过参考并入。细胞用4％多聚甲醛溶液固定，并用封闭液（5％正常山羊血清，0.3％的TritonX-100的磷酸盐缓冲液）透性化。荧光素标记的抗-UCH-L1抗体＃3524（Cell SignalingTechnology，Danvers,MA）与固定细胞4℃过夜孵育，并使用Nikon TE200倒置荧光显微镜以20倍物镜可视化。图像使用RT Slider相机（Model 2.3.1.,Diagnostic Instruments,Inc.,SterlingHeights,MI）和SPOT Advantage软件（Version 4.0.9,Diagnostic Instruments,Inc.）拍摄。

实例4：用于神经毒性的急性口服体内药物候选物筛选

雌性SD大鼠（Charles River Laboratories,Inc.,Wilmington,MA）用甲基安非他明（40mg/kg作为4次以1小时间隔10mg/kg腹腔注射（i.p.））（n=8）或抗癌药物顺铂10mg/kg（单次i.p.注射）（n=4）给药。麻醉采用腹膜内注射戊巴比妥钠（50mg/kg）进行。测试物质也可以以单一剂量通过管饲法使用胃管或合适的插管套管施用。动物在给药前禁食。共有4到8只动物用于研究的每个剂量水平。

给药后30、60、90、和120分钟，将大鼠斩首处死，并通过心脏穿刺得到血液。体液UCH-L1和SBDP150和GFAP的水平通过夹心ELISA或Western blot使用UCH-L1和SBDP150和GFAP特异性抗体进行分析。相对于对照动物，甲基苯丙胺的神经毒性水平诱导UCH-L1和SBDP150和GFAP的增加的CSF浓度。顺铂增加UCH-Ll和SBDP150的水平，如图1所示。

实例5：在红藻氨酸介导的神经毒性的大鼠模型中脑损伤生物标志物：UCHL1，GFAP和αII-血影蛋白降解产物的增加的水平。

使用重量从180至200克的雄性SD大鼠（Harlan:Indianapolis,IN）。大鼠允许免费使用实验室正常的饮食和氯化饮用水。在使用在研究中之前，所有的大鼠至少一个星期适应房屋设施和饮食。在动物房中的控制设置为保持温度为20℃-24℃和30％-70％相对湿度。大鼠维持在12小时的光/暗周期。

动物接受以9mg/kg的剂量单次皮下注射红藻氨酸（Sigma,Chemical,St.Louis,MO,USA），注射后24h处死。使用独立的对照/处理动物组。脑组织和CSF样品在注射后6、24、48和72小时的时间点采集。

在适当的时间点，将动物用在氧气作为载气中的4％异氟烷麻醉4分钟，随后用在相同的载气中的2-3％异氟烷维持麻醉。将大鼠放置在立体定位仪中，来自每只动物的小脑延髓池的约100μl CSF通过连接到聚乙烯管的25号针头经皮采集。CSF样品采集后立即在干冰上冷冻。CSF采集后，从立体定位仪上取下动物，麻醉鼻锥，动物仍然在麻醉状态下，立即斩首处死。皮质、海马、小脑和纹状体将迅速解剖，冷PBS冲洗，并在液氮快速冷冻。要获得用于IHC动物的脑组织，动物用戊巴比妥致死剂量安乐死，用4％的多聚甲醛灌注固定，取走全脑，石蜡处理和包埋。

TBI生物标志物的水平和细胞定位采用ELISA、Western blot和免疫组织化学（IHC）分析在石蜡包埋6μm的脑切片上进行检测。

免疫组化分析

IHC在石蜡包埋6μm的脑切片上进行。载玻片去石蜡，在Trilogy溶液（Cell Marque,HotSprings,AK）中95℃孵育10分钟用于抗原修复，阻断内源性过氧化物，和一抗（GFAP，SBDP145，SBDP150，SBDP120和Casp3）4℃孵育过夜，然后用二抗处理（LSAB+,#K0679,Dako）。染色用3,3'-二氨基联苯胺（DAB）（Dako,Carpinteria,CA）显示，为棕色显色。切片用苏木精（Dako,Carpinteria,CA）复染。阴性对照仅用物种相匹配的二抗进行处理。

免疫印迹分析

在Tris-甘氨酸缓冲系统中进行SDS-凝胶电泳和电转后，印迹膜在环境温度下在5％的脱脂奶粉中在Tris盐缓冲液（TBS）中封闭1小时，然后在含有0.05％Tween-2的TBS（TBST）中，然后在如制造商推荐的以1：3000（3.5μl/10ml）稀释在PBS中的单克隆抗-αII-血影蛋白抗体一抗（Biomol,Plymouth Meeting,PA,USA）中4℃孵育过夜。这之后是用TBST洗涤三次，并在环境温度下与连接生物素化二抗的二抗（Amersham,Cat#RPN1177vl）孵育2小时，然后与偶联链霉素的碱性磷酸酶孵育30分钟（比色法）。然后用一步法BCIP/NBT试剂（KPL,Cat#50-81-08）进行比色法显色。完整αII-血影蛋白和αII-血影蛋白降解产物（SBDPs）的分子量通过一侧跑彩虹色的分子量标准物（Amersham,Cat#RPN800V）进行评估。αII-血影蛋白和它的降解产物SBDP150和SBDP145和SBDP120的水平的半定量评估采用电脑辅助高分辨率平板式扫描仪爱普生XL3500和用Image J软件（NIH）密度图像分析进行。尽管仔细的蛋白浓度确定和仔细的样品处理和凝胶上样（20mg/泳道），可能发生不同泳道不均衡的样品上样。为了克服这种变化性来源，使用相同的样品进行Western印迹，β-肌动蛋白（monoclonal,Sigma,#A5441）作为对照。

UCH-L1生物标志物夹心ELISA分析方法

UCH-L1的血清和CSF样品浓度使用从先前报道的实验方案（Papa L.et al.,2010;Liu M.et al.,200）修改的UCH-L1夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）版本1b进行测量。小鼠单克隆抗体（捕获抗体）和兔多克隆抗体（检测抗体）自制分别抗重组人UCH-L1全长蛋白和部分蛋白）。两者都是使用基于目标蛋白的亲和层析柱亲和纯化。它们的仅对目标蛋白（UCH-L1）的特异性也通过免疫印迹法证实。反应孔用在0.05M碳酸氢钠，pH9.6中的捕获抗体（5μg/mL纯化的小鼠单克隆抗人UCHL1）包被，并在4℃下孵育过夜，板然后用350/孔的封闭缓冲液（Tris盐缓冲液，含02％（V/V）Tweeen-200;TBST）洗涤并进一步用300/孔TBST在环境温度下轻轻振荡孵育30分钟。抗原标准（UCH-L1标准曲线：0，0.06-15ng/ml，未知样品（1-10μlCSF或20μl血清）或分析内部对照样品与检测抗体（兔多克隆抗人UCH-L1，自制；0.72μg/ml；100μl总体积）孵育过夜。随后捕获抗体包被的板与检测抗体-样品混合物在室温孵育1.5小时，使用自动洗板机洗涤（每个孔用350μl洗涤缓冲液[TBST]淋洗）。在封闭缓冲液中的二抗抗兔IgG HRP（Amersham Biosciences；1/2000稀释）然后以100μl/孔添加到孔中（100μl），板进一步在室温孵育1小时。最后，板用底物溶液：Ultra-TMB ELISA 100μl/孔（Pierce#34028）孵育10分钟显色，板用96孔分光光度计（Molecular Device Spectramax 190）在450nm处读取。

GFAP生物标志物夹心ELISA方法

GFAP的血清和CSF样品浓度使用GFAP夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）版本2a进行测量。小鼠单克隆抗体（捕获抗体）和兔多克隆抗体（检测抗体）自制分别抗重组人GFAP全长蛋白和部分蛋白）。它们分别是蛋白A亲和层析纯化的。它们的仅对目标蛋白（GFAP）的特异性通过免疫印迹法使用纯化的人GFAP证实（未示出）。反应孔用在0.05M碳酸氢钠，pH9.6中的捕获抗体（5μg/mL，100μl/孔纯化的小鼠单克隆抗人GFAP）包被，并在4℃下孵育8小时至过夜，板然后用350μl/孔的封闭缓冲液（Tris盐缓冲液，含02％（V/V）Tweeen-200;TBST）洗涤并进一步用300/孔TBST在环境温度下轻轻振荡孵育30分钟。抗原标准（GFAP标准曲线：0.02-20ng/孔，未知样品（3-10μl CSF或10-30μl血清）或分析内部对照样品与检测包被板室温孵育2小时。随后板使用自动洗板机洗涤（每个孔用350μl洗涤缓冲液[TBST]淋洗）。然后与检测抗体（兔多克隆抗人GFAP，0.25μg/mL）室温孵育1.5小时。进一步洗涤后，在封闭缓冲液中的二抗抗兔IgG HRP（Jacksonville Immuno Research Lab;1/4000）然后以100μl/孔添加到孔中，板进一步在室温孵育1小时。最后，板用底物溶液：Ultra-TMB ELISA100μl/孔（Pierce#34028）孵育5-10分钟显色，板用96孔分光光度计（Molecular DeviceSpectramax 190）在450nm处读取。在检测动态范围内，批间CV=2.1％-13.0％，批间CV=1.0％至10.0％。检测极限（LOD）确定为0.020ng/mL。对于具有不可检测（ND）水平的样品，它们赋值LOD的50％（即0.010ng/ml）。如果样品产生信号超过定量范围，样品将进行稀释并重新分析。作为阴性对照，我们注意到，如果抗GFAP捕获或检测抗体用非免疫正常IgG（鼠）或（兔）取代，没有目标信号检测到。

SBDP145生物标志物夹心ELISA方法

SBDP145ELISA采用了专有的兔多克隆抗体用于固相固定化和专有的小鼠单克隆抗体偶联HRP用于检测。测试样品允许依次与这些抗体反应，导致SBDP145分子夹在两个抗体之间。检测包括生物素基-酪胺扩增步骤，基于化学发光底物。生物标志物的浓度的定量测定通过比较未知样品的结果和从相同的测定获得的标准曲线来实现。目标浓度以ng/ml报道。这假设样品中检测到的血影蛋白降解产物也有与校准物类似的分子量，即145kDa。如果实际的降解产物具有不同的或未知的分子量，则所报告的值应被认为仅是相对的浓度。

SBDP120生物标志物夹心ELISA方法

SBDP120 ELISA采用了专有的兔多克隆抗体用于固相固定化和专有的小鼠单克隆抗体偶联HRP用于检测。测试样品允许依次与这些抗体反应，导致SBDP120分子夹在两个抗体之间。检测包括生物素基-酪胺扩增步骤，基于化学发光（TMB）底物。生物标志物的浓度的定量测定通过比较未知样品信号强度和从进行相同的测定的校准物获得的标准曲线来实现。目标浓度以ng/ml报道。这假设样品中检测到的血影蛋白降解产物也有与校准物类似的分子量，即120kDa。如果实际的降解产物具有不同的或未知的分子量，则所报告的值应被认为仅是相对的浓度。

SBDP150生物标志物夹心ELISA方法

SBDP150 ELISA采用了专有的兔多克隆抗体用于固相固定化和专有的小鼠单克隆抗体偶联HRP用于检测。测试样品允许依次与这些抗体反应，导致SBDP150分子夹在两个抗体之间。检测包括生物素基-酪胺扩增步骤，基于化学发光（TMB）底物。生物标志物的浓度的定量测定通过比较未知样品信号强度和从进行相同的测定的校准物获得的标准曲线来实现。目标浓度以ng/ml报道。这假设样品中检测到的血影蛋白降解产物也有与校准物类似的分子量，即150kDa。如果实际的降解产物具有不同的或未知的分子量，则所报告的值应被认为仅是相对的浓度。

结果

实验在两组动物中进行：对照组（注射生理盐水）和处理组（KA注射）。Western blot分析表明在KA组中在海马中完整的αII-血影蛋白水平的降低和由钙蛋白酶（SBDP150和SBDP145）和半胱天冬酶-3（SBDP120）产生的其降解片段的出现，以及在皮质中较小程度。IHC分析表明在经受KA注射的动物的海马和皮质中GFAP、SBDP150、SBDP145和SBDP120的增加的水平，但不是在来自对照组的动物中。ELISA分析表明与对照组相比，在KA组的CSF中UCHL1、GFAP的表达的增加和αII-血影蛋白降解产物（SBDP150、SBDP145和SBDP120）的积累，结果显示在图2-7中。

实例6：从红藻氨酸介导的神经毒性的大鼠模型的血浆中分离的脑损伤生物标志物UCHL1、GFAP和神经丝蛋白（NF）-H的增加的水平。

用血浆作为受试样品源代替CSF重复实例5的方法。观察到生物标志物水平升高，仍然与红藻氨酸暴露相关联为时间的函数，类似于图2-7所示的。

实例7：从红藻氨酸介导的神经毒性的大鼠模型的CSF中分离的脑损伤生物标志物UCHL1、GFAP和神经丝蛋白（NF）-H的增加的水平

重复实例5的方法，大鼠暴露于以16mg/kg和32mg/kg的剂量单次和重复的紫杉醇的腹膜内注射，以在大鼠中诱导高径有髓纤维的选择性功能障碍和造成伤害性周围神经病变。

顺铂也以单次腹腔2或10mg/kg的剂量施用至健康大鼠，以导致Pt-DNA加合物在24小时内积累，并使得这些与周围神经病变的严重性相关联。神经元退变通过要么银染（CNS）要么甲苯胺蓝（PNS-胫骨或坐骨神经）检测到并定量。观察到生物标志物水平升高，与紫杉醇或红藻氨酸暴露相关联为时间的函数，类似于图2-7所示的。

实例8：进行用于α-internexin和巢蛋白的试验，证明巢蛋白和α-internexin和它们的降解产物是用于神经元损伤包括TBI和神经毒性的典型的生物标志物。在对照CSF中，通过免疫印迹法没有检测到α-internexin和α-internexin-BDP，如图8所示。与此相反，用来自两个严重TBI病人（01和03）的系列CSF样品，在几个急性时间点（12-30h内）和延迟的时间点（78-144h）检测到35kDa的α-internexin-BDP（*）。1°抗体：抗-α-internexin（稀释：1：500）；2°抗体：山羊抗小鼠IgG AP偶联物（稀释：1：5000）。图9示出了来自成年或胚胎18天的SD大鼠的整个大鼠脑裂解物的蛋白分离并进行免疫印迹以检测α-internexin。因此，α-internexin是成年和幼崽脑损伤以及根据实例5的实验方案暴露于红藻氨酸后的示例性的神经丝蛋白损害标志物。检测的组织：整个大鼠脑裂解液、一抗：EnCor、MCA-2E3、单克隆。图10示出来自从成年或胚胎18天的SD大鼠分离的整个大鼠脑裂解物进行免疫印迹以检测巢蛋白，一个开发的调节蛋白。因此，巢蛋白是示例性的神经前体细胞标志物（检测的组织：整个大鼠脑裂解液，一抗：抗巢蛋白，Millipore，单克隆）。最后，图11示出在对照CSF中，通过免疫印迹没有检测到α-internexin和α-internexin-BDP。与此相反，用来自两个严重TBI病人（01和03）的系列CSF样品，在几个急性时间点（12-30h内）和延迟的时间点（78-144h）检测到35kDa的α-internexin-BDP（*）。1°抗体：抗-α-internexin（稀释：1：500）；2°抗体：山羊抗小鼠IgG AP偶联物（稀释：1：5000）。

在本说明书中提到的专利和出版物反映了本发明相关的领域的技术人员的水平。这些专利和出版物在这里通过参考纳入，就如每份单独申请或出版物在这里具体和单独详细表述相同的程度。

上述描述是本发明的特定具体实施例的说明，但并不意味着对其实践的限制。下面的权利要求，包括其所有等同物，用于限定本发明的范围。

在这里提到的所有参考文献每一份在这里都通过参考并入，就如每份参考文献的内容完整和清楚地包括进来用于每份参考文献引用的材料。

Claims (20)

1.一种用于筛选神经毒性损伤的方法，包括：

可选的，将细胞暴露于怀疑为神经毒素的化学或生物剂;

测定对象的生物样品中神经毒性的一个或多个生物标志物的存在；和

基于在所述样品中所述一个或多个所述生物标志物的存在检测神经毒性损伤。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述测定用于神经系统疾病的两个生物标志物的存在，其中所述检测基于在所述样品中所述两个生物标志物的比例。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物标志物是选自包括泛素羧基末端水解酶-L1（UCH-L1）；血影蛋白；血影蛋白降解产物（SBDP）；MAP1，MAP2；GFAP，泛素羧基末端酯酶；泛素羧基末端水解酶；神经元定位细胞内蛋白；MAP-tau；C-tau；聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）；脑衰蛋白响应调节蛋白；突触结合蛋白，βIII-微管蛋白，S100β；神经元特异性烯醇化酶，神经丝蛋白轻链，巢蛋白，α-internexin；其降解产物，其翻译后修饰形式，其衍生物，和其组合的组的蛋白。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物标志物是泛素羧基末端水解酶、SBDP150、SBDP145、SBDP150i、SBDP120、MAP1、MAP2、GFAP、突触结合蛋白、βIII-微管蛋白、或S100β中的至少一个。

5.根据权利要求2所述的方法，其中所述生物标志物比例大于2。

6.根据权利要求2所述的方法，其中所述生物标志物比例小于0.5。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物标志物是RNA生物标志物。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述RNA生物标志物是miRNA。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物标志物是针对选自包括泛素羧基末端水解酶-L1；GFAP；血影蛋白；血影蛋白降解产物（SBDP）；巢蛋白；α-internexin；MAP1，MAP2；泛素羧基末端酯酶；神经元定位细胞内蛋白；MAP-tau；C-tau；聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）；脑衰蛋白响应调节蛋白（CRMP）；其降解产物，其翻译后修饰形式，其衍生物，和其组合的组的蛋白的自身抗体。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述生物标志物是针对泛素羧基末端水解酶-L1、SBDP150、SBDP145、SBDP150i、SBDP120、MAP1、MAP2、GFAP、突触结合蛋白、βIII-微管蛋白、或S100β中的至少一个的自身抗体。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样品是全血、血浆、血清、脑脊髓液、其他体液（包括尿液、唾液、汗、眼泪）、分离的细胞、细胞裂解产物，细胞释放物、组织、组织裂解产物、组织释放物。

12.根据权利要求1-11任一所述的方法，其中将细胞暴露于所述化学或生物剂的步骤存在。

13.根据权利要求1所述的方法，其中将细胞暴露于所述化学或生物剂的步骤存在，所述生物剂是红藻氨酸、氯丙酸、溴杀灵、氨甲喋呤、抗癌化学治疗剂、或戊四唑（PTZ）中的至少一个。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述生物剂是红藻氨酸。

15.根据权利要求14所述的方法，其中神经毒性损伤具有红藻氨酸诱导的癫痫发作的临床表现。

16.根据权利要求13所述的方法，其中神经毒性损伤具有癫痫发作的临床表现。

17.根据权利要求13所述的方法，其中神经毒性损伤具有神经退行性疾病的临床表现。

18.根据权利要求17所述的方法，其中神经退行性疾病由阿尔茨海默氏病导致。

19.根据权利要求13所述的方法，其中所述化学治疗剂是紫杉醇或有机铂化合物。

20.根据权利要求13所述的方法，还包括减少所述化学或生物剂的量；测定来自对象的第二生物样品中所述化学或生物剂的存在以确定一个量，低于该量，神经毒性损伤观察不到。

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