CN108459160A - 生物标志物在制备用于检测中枢神经系统的试剂中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种生物标志物在制备用于检测、治疗及监控中枢神经系统或神经血管单元性疾病或脑部类淋巴系统异常的试剂中的用途，其中，所述生物标志物选自循环星形胶质细胞。本发明同时提供一种用于检测、治疗及监控中枢神经系统或神经血管单元性疾病或脑部类淋巴系统异常的试剂盒，其包括用于检测生物样品中的中枢神经系统或神经血管单元性疾病或脑部类淋巴系统异常生物标志物的试剂，其中所述生物标志物选自循环星形胶质细胞。

Description

生物标志物在制备用于检测中枢神经系统的试剂中的用途
关于联邦政府赞助的研究的声明
本发明在国家健康研究院批准的授权号为Nos.AI040635，NS083967和DA034515，以及国家科学基金(NSF)-CN的81370740的政府支持下完成，政府对本发明有某些权利。
技术领域
本发明涉及涉及分子与细胞生物学领域。更特别地，涉及脑血管疾病(CVD)和中枢神经系统(CNS)障碍的生物标志物及其检测方法。本发明的某些方面包括在脑血管疾病和中枢神经系统障碍的诊断、治疗和预后中的应用。
背景技术
本发明引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，通过引用并入本发明，其程度如同每个参考文献被单独地和具体地指出通过引用并入本发明并在本发明中全部阐述。下面的描述包括对理解本发明有用的信息。这并不是承认本文提供的任何信息是现有技术或与目前要求保护的发明相关，或明确地或隐含地参考的任何出版物是现有技术。
由非微生物与微生物因素引起的CVD和CNS失常，例如外部机械力引起的脑损伤(创伤性脑损伤)、中风、药物滥用、脑肿瘤、脑炎或神经退行性疾病等，仍然是世界上死亡和残疾的主要原因。大脑是身体最微妙的器官。它受到血脑屏障(BBB)的保护。与神经血管单位(NVU)或BBB损伤相关的疾病比几乎所有其他疾病总和都要多，因此需要更多住院治疗和延长的护理。CVD或CNS疾病的患病人数和死亡人数远远超过了所有类型的全身性癌症或心脏病的总和。全民中有三分之一以上的人会在一生中遇到中枢神经系统疾病。CVD通常与高血压(HBP)有关。大约三分之一的美国成年人(32％)有HBP，而另外1/3的美国成年人有高血压前期。CVD和CNS失常的发生率随年龄增长而增加。
神经艾滋病(NeuroAIDS)作为脑的微生物感染形式是HIV脑病病症的重要原因。尽管高效抗逆转录病毒疗法取得了进展，但NeuroAIDS的患病率最近有所增加。这主要是由于抗逆转录病毒药物无法穿过BBB，而CNS就像艾滋病毒(HIV-1)的蓄积容器，以致该病毒能够自由迁移进出大脑。在老年人口和吸毒人群中，NeuroAIDS的发病率更高或更快。
NVU或BBB损伤的定量评估一直是研究由微生物和非微生物原因引起的CVD或CNS失常的最具挑战性的问题之一。脑微血管内皮细胞(BMECs)是建立NVU或BBB相关体外模型的主要工具，成功分离和培养BMECs能够在体外对归因于微生物或非微生物因素引起的BBB损伤的致病机制进行分子特性和全基因组分析。然而，很难在体内对NVU或BBB损伤进行全基因组、非侵入性的评估。
目前，已使用各种方法来评估NVU或BBB在体内的功能。外周蛋白如纤维蛋白原和白蛋白向CNS的渗透已被用于评估与病毒性脑炎和其他CNS感染相关的BBB的渗透性。虽然这些技术具有使用内源蛋白质的优点，但由于某些非特异性效应，NVU或BBB损伤可能与CNS中的蛋白质水平无关。目前尚无研究表明，使用分子生物标志物的血液检测能准确地测定脑血管病(CVD)的存在或严重程度，如创伤性脑损伤(TBI)，因为没有临床工具可有效的测量脑部类淋巴系统所调节的大脑间质内的分子运动。
近来，基于磁共振(MRI)的分子成像技术在神经科学中越来越受到关注。虽然已经在体外测试了越来越多的合成分子显像剂，但是在活的动物的大脑中已经证实的确很少。主要挑战是分子神经影像学方法处理传递介质穿透BBB的能力差以及不能用于早期诊断或预警。其他包括将染料(如伊文思蓝和荧光素钠)注射到用于评估BBB通透性的各种动物模型系统中的方法。这些技术的主要限制是它们不能在人类中使用。
尽管在过去几十年中通过临床前和临床研究鉴定了数百种分子标记物，但临床上目前还没有血液检测可用于客观评估NVU或BBB损伤的存在或严重程度。因此，需要非侵入性生物标志物来解决CVD或CNS疾病的诊断，预后，预防和治疗的问题。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供生物标志物在制备用于检测、治疗及监控中枢神经系统或神经血管单元性疾病或脑部类淋巴系统异常的试剂中的用途及检测试剂盒。
本发明一方面提供生物标志物在制备用于检测、治疗及监控中枢神经系统或神经血管单元性疾病或脑部类淋巴系统异常的试剂中的用途，其中，所述生物标志物选自循环星形胶质细胞。
本发明另一方面提供一种用于检测、治疗及监控中枢神经系统或神经血管单元性疾病或脑部类淋巴系统异常的试剂盒，其包括用于检测生物样品中的中枢神经系统或神经血管单元性疾病生物标志物的试剂，其中所述生物标志物选自循环星形胶质细胞。
附图说明
说明书附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。本发明公开的实施例和视图为示例性的，仅用于解释本发明，而不能视为对本发明的限制。
图1是MfSD2a在小鼠脑中的表达。用大肠杆菌K1或HIV-1致病因子gp41刺激小鼠。通过Western印迹分析来定量脑中Mfsd2a的水平。Western结果显示，大肠杆菌感染和gp41处理的小鼠脑中Mfsd2a水平升高。以抗β-肌动蛋白为对照，使用Bio-Rad TDS QuantityOne软件加载的Bio-Rad Gel Doc 2000系统测量大肠杆菌刺激的小鼠脑中的Mfsd2a水平。所有数据表示为均值±SEM，表示为强度/mm2。*<0.05；**<0.01与对照组相比。CON，对照.n＝4litters(3个生物重复)。
图2是用大肠杆菌或gp120/gp41处理小鼠外周血模型中BBB的cBMEC脱落的增长。用PBS处理的小鼠作为对照，通过使用UEA磁珠分离并收获来自小鼠全部外周血的cBMEC。使用DAPI(蓝色)和针对CD146(ECs特异性)的抗体进行双重染色。在用大肠杆菌(A，C)和gp120(B，D)处理的小鼠的外周血样品中检测到更多的cBMEC。CON，对照(***P<0.001)，n＝3litters(3个生物重复)。
图3是用gp41处理的人脑微血管内皮细胞(HBMEC)中Mfsd2a的增长表达。使用1μggp41(A)和不同剂量的gp41(B)处理不同时间点，通过蛋白质印迹分析显示Mfsd2a的水平。用免疫荧光显微镜分析(C)进行HBMECs中Mfsd2a表达。使用抗Mfsd2a抗体和核DNA染色染料DAPI获得免疫荧光显微镜图像。C1：Con是未使用gp41处理的HBMECs中Mfsd2a表达。C2是用500ng/mL gp41处理的HBMECs的Mfsd2a表达。C3是用1μg/mL gp41处理的HBMECs的Mfsd2a表达。C4是用10μg/mL gp41处理的HBMECs的Mfsd2a表达。
图4是患有外伤性脑损伤(TBI)的患者的外周血样品中cAstr(A)和cBMEC(B)细胞的密度显着高于对照样品。竖条表示平均值，误差线表示SEM.*p<0.0 5；**P<0.01。
图5是美金刚(MEM)对小鼠外周血中大肠杆菌E44诱导的cAstr(A)和cBMEC(B)细胞密度增长的影响。MEM调节α7nAChR受体的化学阻断。竖条表示平均值，误差线表示SEM.**P<0.01；***P<0.001。
图6是gp120或甲基苯丙胺对用gp120和METH处理的小鼠外周血中cAstr(A)和cBMEC(B)细胞的密度的影响。竖条表示平均值，误差线表示SEM.**P<0.01；***P<0.001。
主要元件符号说明
无
如下具体实施方式将结合上述附图进一步说明本发明。
具体实施方式
下面结合参考附图对本发明的方案进行详细解释，本领域技术人员将会理解，下面示例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
除非另有定义，本文使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。除非具体相反指出，本发明的实施例将采用本领域技术范围内的分子生物学和重组DNA技术的常规方法，以下大部分描述仅为了说明的目的。这些技术在文献中得到充分解释。参见例如Singleton et al.,Dictionary of Microbiology andMolecular Biology 3rd ed.,J.Wiley&Sons(New York,NY 2001)；March,AdvancedOrganic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure 5th ed.,J.Wiley&Sons(NewYork,NY2001),Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rdEdition,2000)；Sambrook and Russel,Molecular Cloning:A Laboratory Manual 3rded.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor,NY 2001),DNACloning:A Practical Approach,vol.I&II(D.Glover,ed.)；Oligonucleotide Synthesis(N.Gait,ed.,1984)；Oligonucleotide Synthesis:Methods and Applications(P.Herdewijn,ed.,2004)；Nucleic Acid Hybridization(B.Hames&S.Higgins,eds.,1985)；Nucleic Acid Hybridization:Modern Applications(Buzdin and Lukyanov,eds.,2009)；Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins,eds.,1984)；AnimalCell Culture(R.Freshney,ed.,1986)；Freshney,R.I.(2005)Culture of Animal Cells,a Manual of Basic Technique,5th Ed.Hoboken NJ,John Wiley&Sons；B.Perbal,APractical Guide to Molecular Cloning(3rd Edition 2010)；Farrell,R.,RNAMethodologies:A Laboratory Guide for Isolation and Characterization(3rdEdition 2005),Methods of Enzymology:DNA Structure Part A:Synthesis andPhysical Analysis of DNA Methods in Enzymology,Academic Press；UsingAntibodies:A Laboratory Manual:Portable Protocol No.1by Edward Harlow,DavidLane,Ed Harlow(1999,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ISBN 0-87969-544-7)；Antibodies:A Laboratory Manual by Ed Harlow(Editor),David Lane(Editor)(1988,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ISBN 0-87969-3,4-2),1855.Handbook of DrugScreening,edited by Ramakrishna Seethala,Prabhavathi B.Fernandes(2001,NewYork,N.Y.,Marcel Dekker,ISBN0-8247-0562-9)；and Lab Ref:A Handbook of Recipes,Reagents,and Other Reference Tools for Use at the Bench,Edited Jane Roskamsand Linda Rodgers,(2002,Cold Spring Harbor Laboratory,ISBN0-87969-630-3)provide one skilled in the art with a general guide to many of the terms usedin the present application.
本领域技术人员应认识到，许多与本文所述类似或等同的方法和材料能够用于实践本发明。根据以下结合附图所进行的详细描述，本发明的其他方面和优点将变得显而易见，本发明实施例的各种特征在附图中通过举例的方式加以说明。实际上，本发明决不受限于所描述的方法和材料。为了方便起见，此处收集在本说明书、实施例和所附权利要求书中使用的某些术语。
以下术语和短语具有以下所示的含义，除非本文中另外提供。除非另有明确说明或从上下文中可明显看出，下列术语和短语不排除所述术语或短语在其所属领域已具有的含义。本发明的范围仅由权利要求限制，以下定义仅用于帮助描述特定实施例，并不旨在限制所要求保护的发明。除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语的含义均与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的一样。
“有益结果”包括但不限于减轻或减缓疾病的严重性，阻止疾病恶化，治愈疾病状况，预防疾病状况发展，降低患者疾病的发病机率并延长患者寿命或预期寿命。在一些实施方式中，该疾病是CNS失常。在另一些实施方案中，该疾病是神经血管单位或血脑屏障损伤。
“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指需要诊断，预后或治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括但不限于人、家畜、农场动物、动物园动物、运动动物、宠物动物例如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛；灵长类动物如猿、猴、猩猩和黑猩猩；犬科动物如狗和狼；猫科动物如猫、狮子和老虎等；马科动物如马、驴和斑马；饲养动物如牛、猪和羊；有蹄类动物如鹿和长颈鹿；啮齿动物如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠。根据某个实施例，哺乳动物是人。该术语不表示特定的年龄或性别。因此，成人和新生儿，像胎儿，无论是男性还是女性，都包含在该术语的范围内。
本文所用的“治疗”和“处理”是指诊断、预防和治疗，其目的是预防或减缓(减轻)靶标病理状况，预防病理状况，追求或获得有益效果，或即使治疗最终不成功，也能降低个体发病率。需要治疗的人包括已患病者，易患病者，及易感人群。治疗实例包括但不限于监察，观测，外科手术，化学疗法，免疫治疗，放射治疗(例如大剂量血管外照射，立体定向放射外科手术(γ刀)和分级立体定向放射治疗(FSR))，局部治疗，全身治疗，疫苗疗法，病毒疗法，分子靶向治疗或其组合。
“患者结果”是指患者是否由于治疗而存活或死亡。本发明提供给患者更准确的预后增加了患者存活的机会。
尽管进行了积极的研究，CVD或CNS疾病，包括由微生物感染，中风，滥用药物或其他致病性损害引起的NVU或BBB损伤仍然是世界上引发残疾的主要原因。我们以前发现，作为BBB主要成分的星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞(BMECs)的功能障碍可能是由尼古丁，脑膜炎病原体和微生物因素引起的，包括HIV-1致病因子gp41和gp120。这一领域最具挑战性的问题之一是在外周血中没有可用的基于细胞的生物标志物，用于由微生物和非微生物损害引起的CVD或CNS失常。为了鉴定能用于NVU或BBB损伤的细胞生物标志物，我们的研究表明，用尼古丁，METH和gp120随着加强的伊文思蓝和白蛋白外渗进入小鼠的大脑，导致血液中CD146+(内皮标志物)/S100B+(大脑标记)，循环星形胶质细胞(cAstr)，循环BMECs(cBMECs)和CD133+[祖细胞(PC)标记物]/CD146+内皮细胞(EPCs)有所增加。尼古丁和gp120能够显着增加小鼠血清中泛素C端水解酶1和S100B的水平，这与cAstr和/或cBMECs的变化相关。在α7nAChR敲除的小鼠中，尼古丁和大肠杆菌K1诱导的脑膜炎增加了cAstr和cBMEC的水平，穿过BBB的白细胞迁移和进入大脑的白蛋白渗出显着降低，表明该炎症调节剂在由微生物和非微生物因素引起的CNS炎症和BBB病症起了重要作用。这些结果表明，cAstr以及cBMECs可用作潜在的基于细胞的生物标志物，用于检测NVU或BBB损伤。
因此，本发明至少部分地基于这样的发现。本发明解决了对用于检测CVD或CNS失常的指标的需要，例如NVU/BBB的损伤以及用于指导治疗选择。本文提供了用于检测CVD或CNS失常的进程，系统和方法，例如NVU或BBB的损伤及其治疗方法。
在一些实施方案中，CVD或CNS失常是血脑屏障损伤，创伤性脑损伤(TBI)，CNS感染，癫痫，中风，脑肿瘤，神经变性疾病或其组合中的任何一种或多种。在一个实施例中，CVD或CNS失常是血脑屏障损伤。在示例性实施例中，血脑屏障损伤可能起因于例如脑膜炎，脑脓肿，癫痫，多发性硬化，神经性脑炎，晚期神经性锥虫病，进行性多灶性脑白质病，体内疾病和/或阿尔茨海默病等疾病。
在一些实施方案中，样品可以是组织，血液，血浆，脑脊液(CSF)或其组合中的任何一种或多种。在一个实施例中，样品是外周血。本发明还提供了一种用于确定样品中cAstr的系统，其中样品获自疑似有BBB损伤的受试者。该系统包括样本分析器，其被配置为当cAstr细胞存在于从疑似有BBB损伤的对象获得的样本中时产生信号，并且计算机子系统被编程为计算cAstr细胞的密度，基于检测到的信号是否大于或小于参考值(正常波动范围)。
在系统的一些实施方案中，受试者是人，并且疑似有BBB损伤。在一些实施方案中，分离的样品是通过使用UEA-1包被的磁珠亲和纯化血液样品获得的细胞。在其他实施方案中，检测模块是荧光显微镜。在系统的其它实施方案中，分离的样品是血液样品。在其他实施方案中，检测模块是流式细胞仪或荧光显微镜。在各种实施方案中，从受试者获得的样品用至少一种抗CD146抗体和抗-MfSD2a抗体染色。cBMEC细胞可以通过CD146+MfSD2a+表型鉴定。在一些实施方案中，样品用至少一种抗CD45抗体，抗CD31抗体和抗GLUT1抗体染色，cBMEC细胞由GLUT1+CD31+CD45-表型鉴定。在各种实施方案中，cBMEC细胞的参考量是没有BBB损伤的受试者群体中cBMEC细胞的平均值或中间值。
近来，外周血中循环内皮细胞(CEC)的定量已被开发为用于评估由心血管疾病和炎性疾病引起的内皮损伤或功能障碍的新颖且可重现的方法。20世纪70年代中期第一次报道了用于检测具有内皮特征的血液中的循环细胞的方法。这些方法包括密度离心分离，重要光学显微镜和组织学染色，但都没有可靠地分离和鉴定CECs。在开发可靠的流程以检测这些罕见的细胞群体之前，已经有二十年了。目前，最常见的CEC定量方法包括使用耦合到抗内皮抗原如CD146(内皮标志物)或CD34(祖细胞标记)的抗体的磁珠来进行细胞免疫分离的富集步骤。在血液中循环的内皮细胞中，有些是终末分化的成熟细胞(CECs)，而其他细胞则显示出祖细胞样表型[内皮祖细胞(EPCs)]，这表明EPC可以参与新血管的产生通过回归到血管生成的起始。在过去十年中，在许多病理状况(包括癌症和心脏病)中检测到增加的CECs。然而，这种基于细胞的生物标志物在由CNS感染和炎症引起的BBB病症中没有被特异性鉴定。由于BBB主要由称为BMECs和星形胶质细胞的特异性内皮细胞组成，因此循环BMECs(cBMECs)和星形胶质细胞(cAstr)作为NVU或BBB损伤的生物标志物似乎是合理的。
基于我们对NVU或BBB损伤和CVD或CNS失常的长期兴趣和研究，我们假设具有完整NVU/BBB表型的cAstr和cBMECs从NVU中动态脱落根据CNS的病理生理变化。cAstr和BMECs可以通过实验方法进行监测，并用作非侵入性血液生物标志物标引由各种致病性损害引起的NVU或BBB损伤。在我们使用动物模型系统的研究中，我们首次证明了可以定性和定量的检测到小鼠的NVU/BBB损伤中的cAstr和cBMEC，该NVU/BBB损伤通过微生物(gp120和大肠杆菌K1)和非微生物(甲基苯丙胺和尼古丁)损害引起的。此外，我们还证明，美金刚(MEM)，一种α7nAChR拮抗剂，可以降低cAstr和cBMEC的血液浓度，表明这是一种重要的炎症调节因子在由各种致病性损害引起的NVU和BBB损伤相关的cAstr和cBMEC脱落中。
促进调解蛋白超家族2A(The major facilitator superfamily domaincontaining 2a，Mfsd2a)是主要协助转运蛋白超家族(major facilitator superfamily，MFS)的第二活性转运蛋白。以前的工作表明，Mfsd2a表达是在禁食期间由肝脏引起的，蛋白质也涉及抗生素转运和人类胎盘细胞融合。在最近的一份报告中，发现Mfsd2a被选择性地表达在BBB内皮，并且是BBB完整性的正常形成和维持所必需的。另一项研究发现，Mfsd2a是调节大脑吸收二十二碳六烯酸的主要转运蛋白，它是大脑正常生长和认知功能所必需的ω-3脂肪酸。此外，Mfsd2a还用作细胞表面分子来调节膜融合或贩运。这些结果表明，Mfsd2a在BBB功能中起着重要的作用。
在体外和体内模型系统中，我们已经证明由微生物因子(大肠杆菌K1和HIV)引起的CVD和CNS失常可能导致脑中Mfsd2a水平的变化。此外，由大肠杆菌K1和HIV-1致病因子gp41引起的BBB损伤可增加外周血中Mfsd2a生物标志物捕获的cBMEC数量。
检测cAstr的实验
本发明所述的各种确定cAstr的密度的工艺，实验，系统和方法，包括使用手动或自动化方法定量从受试者或参考样品获得细胞数目。在一些实施方案中，定量测定样品中cAstr的密度的方法包括但不限于磁珠提取(MBE)，流式细胞术，测量电阻，染色，图像分析，使用血细胞计数器测定，使用配备有Neubauer网格的血细胞计数器，分光光度法，基于微流体细胞操作的单细胞技术，及其组合。[Zhong JF et.al.(2008),A microfluidicprocessor for gene expression profiling of single human embryonic stemcells.Lab Chip.2008,8:68-74；Leslie M(2011).News Focus:The power ofOne.Science,331:24-26；Kalisky T,Quake SR(2011),Single cell genomics.NatMethods.8:311-4；Fritzsch FS(2012),Single-Cell Analysis in Biotechnology,Systems Biology,and Biocatalysis.Annu Rev ChemBiomol Eng.].用于确定样品中cAstr水平的其它方法对于本领域技术人员也是显而易见的。在示例性实施例中，可以使用BIO-RAD的TC20TM自动细胞计数器或EMD Millipore的SCEPTERTM手持式自动细胞计数器来确定受试者的样品中cAstr的水平。
本发明所述的各种确定cAstr的密度的工艺，实验，系统和方法，还包括测定在cAstr细胞表面上表达的细胞表面标志物的水平。cAstr的细胞标记物包括但不限于谷氨酸-天冬氨酸转运蛋白(GLAST)，脑脂质结合蛋白(BLBP)和神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。确定标记物表达的水平包括测量样品中存在的cAstr上的标记蛋白的量，或测量样品中存在于cAstr上的标记蛋白的核酸量或其组合。
测定Mfsd2a的方法
本发明所述的各种确定含有Mfsd2a的细胞的水平的工艺，实验，系统和方法，包括使用手动或自动化方法定量从受试者和/或参考样品获得的样品中基于细胞的生物标志物。
任何合适的免疫测定方法可以用来定量样品中含有Mfsd2a的细胞。已知的免疫测定技术的广泛讨论在这里是不需要的，因为这些是本领域技术人员已知的。典型的合适的免疫测定技术包括夹心酶联免疫测定(ELISA)，放射免疫测定(RIA)，竞争性结合测定，均相测定，异源测定等。各种已知的免疫测定方法被讨论，例如in Methods in Enzymology,70,pp.30-70and 166-198(1980)。在本发明中使用“夹心型”测定法。“夹心型”测定法的一些实例见于Grubb等人的美国专利No.4,168,146号，和Tom等人的美国专利No.4,366,241。另一种技术是“竞争型”测定法。在“竞争型”测定法中，标记的探针通常与分析物相同或相似的分子缀合。因此，标记的探针与感兴趣的分析物竞争可用的接受材料。竞争性免疫测定装置的实例见于Deutsch等人的美国专利U.S.No.4,235,601，Liotta的Pat.No.4,442,204号和美国专利No.Buechler等人的U.S.Pat.No.5,208,535号。
本发明所述的各种定量含有Mfsd2a的细胞的水平工艺，实验，系统和方法，包括将CNS病症(例如BBB损伤)的患者的样品与抗体或其片段接触，所述抗体或其片段特异性结合Mfsd2a，在抗体与存在于样品中的Mfsd2a之间形成抗体-蛋白质复合物，洗涤样品以除去未结合的抗体，加入被标记的并对与样品中的Mfsd2a结合的抗体具有反应性的检测抗体，洗涤以除去未结合标记的检测抗体以及将标记转换成检测信号，其中可检测信号表示来自患者的样品中含有Mfsd2的细胞的水平。在一些实施方案中，影响因子组分是可检测部分选自荧光标记，放射性化合物，酶，底物，表位标签，电子致密试剂，生物素，digonigenin，半抗原及其组合。在一些实施方案中，所述检测抗体被与酶共价结合所述标记。可以通过测量由样品中的Mfsd2a与抗体的反应形成的抗体-蛋白质复合物而产生的光散射强度来获得含有Mfsd2a的细胞的水平。
本领域技术人员本身可以使用公知的方法来生产抗体，包括多克隆和单克隆抗体，或者它们可以由专门基于已知蛋白质序列的抗体的服务提供商制造。例如，可以使用传统的杂交瘤方法进行单克隆抗体的制备，首先用可选择的分离蛋白或其片段的抗原免疫小鼠，并制备各自产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系。然后使用例如ELISA或抗原微阵列测定法或免疫斑点印迹技术测定由不同克隆分泌的抗体与抗原结合的能力。可以使用常规方法和使用用于免疫的抗原和其他抗原作为对照来选择对于感兴趣的蛋白质的检测最特异的抗体。检测选择特定的抗原和蛋白质的抗体，并且没有其它抗原或蛋白质在本发明中所述的工艺，实验和方法被选择。最好的克隆可以无限期地生长在合适的细胞培养基中。它们还可以注射到小鼠(肠周围腹膜内)，在那里它们产生富含抗体的腹水，从中可以分离和纯化抗体。可以使用本领域普通技术人员熟知的技术来纯化抗体。在本发明中，蛋白质序列是已知的，因此针对它们生产抗体是常规方法。
抗体可以被标记。在一些实施方案中，通过共价连接酶，荧光化合物或金属标记，化学发光化合物标记来标记检测抗体。例如，检测抗体可以用过氧化氢酶标记，转化使用比色底物组合物包含碘化钾，过氧化氢和硫代硫酸钠；该酶可以是醇脱氢酶，并且转化使用比色底物组合物，其包含醇，pH指示剂和pH缓冲剂，其中pH指示剂是中性红，pH缓冲液是甘氨酸-氢氧化钠；酶也可以是次黄嘌呤氧化酶，并且转化使用比色底物组合物包含黄嘌呤，四唑鎓盐和4,5-二羟基-1,3-苯二磺酸。在一个实施方案中，通过共价连接酶，荧光化合物或金属标记，化学发光化合物标记来标记检测抗体。
直接和间接标签可用于免疫测定。直接标签可以被定义为实体，其在天然状态下，肉眼可见或借助于光学过滤器和/或施加的刺激(例如紫外线)来促进荧光。可以使用的着色标签包括金属溶胶颗粒，金溶胶颗粒，染料溶胶颗粒，染色的胶乳颗粒或包封在脂质体中的染料。其他直接标记包括放射性核素和荧光或发光部分。根据本发明间接标记如酶也可以使用。已知可用作标记的各种酶，例如碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，溶菌酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，乳酸脱氢酶和脲酶。关于免疫测定中酶的详细讨论，参见Engvall，EnzymeImmunoassay ELISA and EMIT，Methods of Enzymology，70,419-439(1980)。
抗体可以附着于表面。用于检测所需抗原的抗体可以附着的有用表面包括硝酸纤维素，PVDF，聚苯乙烯和尼龙。表面或支撑体也可以是多孔载体(参见U.S.Patent No.7,939,342)。可以使用各种试验装置进行，该试验装置在以下专利中描述，例如U.S.Pat.No.4,906,439；5,051,237and 5,147,609to PB Diagnostic Systems,Inc.
不等方差双尾学生t-检验可以用来测量患者的含有Mfsd2a的细胞表达与正常血液样品或患者自己的血液(匹配对照)或由计算机汇集许多控制样本产生的参考值的不同。当p值等于或小于0.05时，可以获得显着的差异。
参考值
在本发明所述的工艺，试验，系统和方法的各种实施方案中，参考值基于任何一个可适用的cAstr的细胞数量密度或含Mfsd2a的cBMEC细胞水平。在一个实施例中，参考水平基于正常人血液样本。在一个实施方案中，参考水平基于正常人外周血样品。参考值是不具有CNS失常的正常受试者群体中cAstr的平均值或中间值水平。参考值是不具有CNS病症的正常受试者群体中含有Mfsd2细胞(cBMEC)的平均值或中间值水平。
在各种实施方案中，与参考值相比，受试者(BBB损伤引起的CNS失常的受试者)的cAstr的密度增加至少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或100％。在各种实施方案中，与参考值相比，受试者(BBB损伤引起的CNS失常的受试者)的cAstr的密度增加至少约1倍，2倍，3倍，4倍，5倍，10倍，15倍，20倍，25倍，30倍，35倍，40倍，45倍，50倍，55倍，60倍，65倍，70倍，75倍，80倍，85倍，90倍，95倍，100倍或更多或其组合。
在各种实施方案中，与参考值相比，受试者(BBB损伤引起的CNS失常的受试者)中含有Mfsd2的细胞的水平增加至少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或100％。在各种实施方案中，与参考值相比，受试者(BBB损伤引起的CNS失常的受试者)中含有Mfsd2的细胞的水平增加至少约1倍，2倍，3倍，4倍，5倍，10倍，15倍，20倍，25倍，30倍，35倍，40倍，45倍，50倍，55倍，60倍，65倍，70倍，75倍，80倍，85倍，90倍，95倍，100倍或其组合。
治疗方法
如本发明所述，在示例性实施例中，NVU或BBB损伤或脑部类淋巴系统异常可能由于以下疾病导致，包括但不限于高血压，睡眠紊乱，青光眼，微血管疾病，糖尿病，脑水肿，脑膜炎，创伤性脑损伤，脑脓肿，癫痫，多发性硬化，神经性脑炎，后期神经性锥虫病，进行性多灶性白质脑病，德体病和/或阿尔茨海默氏病。血脑屏障的损害也可能由微生物感染，中风，滥用药物和/或其他致病性损害引起。
cAstr和/或cBMEC可以用作治疗反应的生物标志物。BBB的瞬时破坏已经被用作将各种烷基甘油有效递送到CNS的新方法[Patel MM(2009),Getting into the brain:approaches to enhance brain drug delivery.CNS Drugs.23:35-58]。BBB破坏的最佳程度对于监测这些药物的治疗反应至关重要。可以很容易地通过对cAstr或cBMEC的量化来表示，其可以提供BBB细胞组分的全基因组图谱，以克服MRI的限制和分子成像剂不能穿过BBB的无能为力。[Lelyveld VS(2010),Int J Imaging Syst Technol.20:71-79]。cAstr/cBMEC也可用作鉴定或验证新的CNS药物靶标以及指导药物最佳剂量的生物标志物。cAstr和/或cBMEC的检测能导致对可能穿过BBB而不损害脑微血管系统的CNS疾病的特异性药物靶标的鉴定和验证。确定CNS药物的最佳剂量和时间表已被证明是一个挑战。越来越多地认识到，进一步探索药物的推荐剂量应该是最佳生物药物剂量(OBD)，而不是最大耐受剂量。剂量升高后cAstr和/或cBMEC计数的变化可能会在评估影响BBB的药物时，为建立OBD提供有用的见解。EPC可能具有巨大的潜力用作增强BBB病症血管修复的细胞疗法，因为EPC是在血液中循环的罕见细胞群，具有区分BMEC的能力。
在一些实施方案中，如果受试者具有增加BBB损伤的可能性，则可以调节治疗剂量，这对本领域技术人员是显而易见的。例如，如果BBB损伤是由于细菌或病毒感染引起的，则可以增加或减少规定的治疗剂量，以减少和/或抑制BBB的损伤。
在一些实施方案中，如果受试者具有增加的BBB损伤的可能性，则可以任选地在凝血酶注射后立即施用Src抑制剂或非特异性Src家族激酶抑制剂(PP2)以阻断脑水肿和BBB破坏(例如，参见Liu et al.Blood-brain barrier breakdown and repair by Src afterthrombin-induced injury,Ann Neurol.2010Apr；67(4):526-33；Paul et al.Srcdeficiency or blockade of Src activity in mice provides cerebral protectionfollowing stroke,Nat Med.2001Feb；7(2):222-7)。
在一些实施方案中，如果受试者具有增加BBB损伤的可能性，皮质类固醇和糖皮质激素例如可的松，氢化可的松，强的松，泼尼松龙，甲泼尼龙，地塞米松，倍他米松，曲安奈德，倍氯米松，醋酸氟氢可的松，醋酸脱氧皮质酮(DOCA)，醛固酮；糖皮质激素受体激动剂和糖皮质激素受体配体将被施用于受试者(例如，参见Fraser,“Can a broken barrier berepaired”J Physiol.2006June 1；573(Pt 2):287)。
在一些实施方案中，如果受试者具有BBB损伤的可能性增加，Na-K-Cl协同转运蛋白抑制剂如布美他尼将被施用于受试者(例如，参见O'Donnell et al.Bumetanideinhibition of the blood-brain barrier Na-K-Cl cotransporter reduces edemaformation in the rat middle cerebral artery occlusion model of stroke,J CerebBlood Flow Metab.2004Sep；24(9):1046-56)。
实施例
以下实施例不旨在将权利要求书的范围限制于本发明，而是旨在作为某些实施方案的具体示例。本领域技术人员发现的示例性方法中的任何变化均落入本发明的范围内。
化合物及试剂
酒石酸尼古丁(NT)和甲基苯丙胺(METH)购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。免疫磁珠M-450Tosylactivated获自Invitrogen(Carlsbad，CA)。Ulexeuropaeus 1(UEA I)凝集素和具有4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的载体介质购自Vector(Buringame，CA)。HIV-1gp120购自Immunodiagnostics(Woburn，MA)。Creative Biomart(New York，NY)(S100B)和ProteinTech(Chicago，IL)(泛素C端水解酶1，UCHL1)的抗体和抗原通过ELISA测定血清水平的分子标记。Mfsd 2a抗体购自Santa Cruz Biotechnology，Inc.(达拉斯，TEXAS)。所有初级抗体(Ab)购自商业来源：兔抗α7nAChR Ab购自Genescript(Piscataway，NJ)；大鼠抗小鼠Ly-6G(Gr-I)Ab、小鼠抗CD44Ab(sc-7297)，兔抗-肌动蛋白(sc-7210)和兔抗大鼠Ly-6G(Gr-I)Ab FITC-conjugated购自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)；大鼠抗小鼠Ly-6G(Gr-I)Ab FITC-conjugated以及抗小鼠CD146AbFTC-conjugated购自eBiosciences(San Diego，CA)，兔抗SIOOB Ab-rhodamine-conjugated，和来自的兔抗CD133Ab rhodamine-conjugated购自Abbiotec(San Diego，CA)。Transwell过滤器(3μm孔径，6.5mm直径)，血板和CBA测定试剂盒购自BD Biosciences(San Jose，CA)。除非另有说明，化学品均购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。
动物模型和治疗方案
使用C57BL/6J和gp120转基因小鼠进行所有动物实验。具有C57BL/6J背景(B6.129S7-Chrna7tm1Bay/J)的杂合(+/-)α7缺陷型小鼠购自Jackson Laboratory(BarHarbor，ME)。根据供应商提供的PCR方法测定α7+/+小鼠(WT小鼠)，α7-/-小鼠(KO小鼠)和杂合α7+/-小鼠的基因型。这些动物在8周龄的转基因育种中被使用以获得最佳的繁殖性能。新生小鼠的平均窝仔数为10-15天。在所有实验中使用年龄和性别匹配的小鼠。进行了三次实验。对于脑膜炎小鼠模型，将C57BL/6Jmice(6-8天龄)分为两组(I：对照用PBS处理；II：用E44处理)(n＝4)。所有小鼠接受大肠杆菌K1菌株E44(2×105CFU)腹腔注射。大肠杆菌接种18小时后，用氯胺酮和利多卡因麻醉动物，从心脏穿刺采集血液样品，用羊血板进行细菌培养。在用20ml PBS冲洗心脏灌注后，打开颅骨。如前所述收集脑组织和CSF样品。对于NeuroAIDS小鼠模型，用PBS(III)处理C57BL/6Jmice(2个月龄)作为对照；IV：用gp41处理的gp120转基因小鼠(n＝4)。如前所述，组IV中的动物每天从尾静脉(约10mg/Kg小鼠重量)注射无内毒素的重组HIV-1gp41 2天。然后从心脏穿刺采集血液样品，用羊血板进行细菌培养。如上所述方法收集脑组织和CSF样品。
小鼠cBMECs的分离和计数
如本领域普通技术人员已知的，用Ulexeuropaeus 1(UEA 1)凝集素包被的Dynabeads分离小鼠cBMEC。磁珠根据制造商的说明书(Invitrogen)制备，并重新悬浮在Hanks平衡盐溶液(HBSS，Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA，USA)中加5％胎牛血清(HBSS+5％FCS)至终浓度为4×10 8个珠/毫升。全血小鼠cBMECs在4℃下与UEAUEA-1涂层Dynabeads亲和捕获。为了消除非特异性细胞与珠的结合，在洗涤步骤期间将细胞悬浮液冲洗通过移液管尖端，然后通过使用磁性颗粒聚集器(MPC)悬浮在PBS中。将结合的细胞与0.5M岩藻糖在室温下温育10分钟以从靶细胞释放磁珠。然后将珠子用HBSS+5％FBS洗涤5次，并用MPC收集。然后收集悬浮液并离心。收集沉淀物并用Msd2a预涂Dynabeads在4℃下亲和捕获。封闭和洗涤后，用2％多聚甲醛和0.25％戊二醛固定与珠子缀合的细胞30分钟。然后加入FITC缀合的CD146抗体(用于cBMEC鉴定的BMECs特异性标记)，并与珠结合的细胞一起孵育过夜(暗)。最后，加入DAPI并与珠结合的细胞孵育30分钟。将细胞(10ul)转移到细胞计数器中，并在荧光显微镜下计数。
星形胶质细胞的分离和计数
用本领域普通技术人员已知的伴刀豆球蛋白A(ConA)或GLAST抗体涂覆的Dynabeads分离小鼠星形胶质细胞。磁珠根据制造商的说明书(Invitrogen)制备，并重新悬浮在Hanks平衡盐溶液(HBSS，Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA，USA)中加5％胎牛血清(HBSS+5％FCS)至终浓度为4×10 8个珠/毫升。全血中的小鼠星形胶质细胞在4℃下用ConA或GLAST抗体涂覆的Dynabeads亲和捕获。为了消除非特异性细胞与珠的结合，在洗涤步骤期间将细胞悬浮液冲洗通过移液管尖端，然后通过使用磁性颗粒聚集器(MPC)悬浮在PBS中。将结合的细胞与0.5M岩藻糖在室温下温育10分钟以从靶细胞释放珠粒。然后将珠子用HBSS+5％FBS洗涤5次，并用MPC收集。然后收集悬浮液并离心。收集沉淀物并用ConA或GLAST抗体Dynabeads在4℃下亲和捕获。封闭和洗涤后，用2％多聚甲醛和0.25％戊二醛固定与珠子缀合的细胞30分钟。然后加入FITC-缀合的GLAST或GFAP抗体，并与珠结合的细胞一起孵育过夜(暗)。将细胞(10ul)转移到细胞计数器中，并在荧光显微镜下计数。
统计分析
对于体外数据的分析，使用ANOVA和协变量，随后进行多重比较测试，例如Newmann-Keuls测试来确定对照组和治疗组之间的统计学显着性。软件GraphPadPrsim 5.0用于动物实验数据的分析。P<0.05被认为是显着的。
数据以平均值±标准偏差表示。随着各实验的数量一式三份，将分类变量进行了比较。软件GraphPad Prism 5.0用于分析实验数据。P<0.05被认为是显着的。
数据库
Swissprot数据库中的蛋白质编码列表如下：α7nAChR，Mus muscularus，Q9JHD6；CD31，Mus muscularus，Q08481；CD34，Mus muscularus，Q64314；CD45，Mus muscularus，P06800；CD146，Mus muscularus，Q8R2Y2；S100B，Mus muscularus，P50114；UCHL1，Musmuscularus，P09936.
cBMEC脱落的Transwell测定
为了进一步研究cBMEC脱落，双室联合培养系统(Transwell试验)的体外BBB模型被使用。如我们最近的出版物所述，从WT和α7nAChR KO小鼠中分离BMEC。将BMECs在具有12μm孔径(Coming Costar)的胶原涂覆的Transwell聚碳酸酯组织培养插入物上培养5天。BMECs被极化并显示200-250Qcm2的跨内皮电阻(TEER)，用Endohm伏/欧姆表与前述Endohm室(World Precision Instruments)一起测量。将上清液中的BMEC单层暴露于低剂量的METH(10nM)，NT(10μM)，gp120(50ng/ml)和METH(10nM)+gp120(50ng/ml)36小时后，下腔室中的脱落的cBMECs在显微镜下计数。同时，通过测量TEER来评估BMEC单层的完整性。在每个样品的每个时间点进行三次测量。.
Mfsd2a分析的免疫印迹分析
Western印迹用以确定HBMECs、小鼠脑和CSF或临床CSF样品中Mfsd2a的蛋白质表达水平。将脑悬浮在含有1％蛋白酶抑制剂Cocktail(Sigma-Aldrich)的裂解缓冲液(CellSignaling Technology，Inc.，Beverly，MA)中，然后在4℃下以12,000×g离心15分钟。将所有蛋白质组分储存在-80℃直到使用，通过Bio-Rad蛋白质定量法(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)以牛血清白蛋白为标准测定蛋白质浓度。蛋白质通过Novex 10％Tris-甘氨酸凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)在SDS-PAGE中分离，并将产物电转移到硝酸纤维素膜上。然后用含1％BSA的氨丁三醇缓冲液和含0.1％吐温20的TBST封闭细胞膜1小时，将印迹与抗兔抗β肌动蛋白抗体(1:10000)在4℃温育过夜。在TBS(Pierce，Rockford，IL)的Blocker BLOTTO中进行抗体孵育。将洗涤的细胞膜与辣根过氧化物酶(HRP)-偶联的二抗(兔抗小鼠-兔IgG)孵育1小时，当细胞膜被洗涤三次后，根据制造商的说明书(RocheApplied Science，Indianapolis,IN)使用增强的化学发光程序使蛋白质带显形。对于每个样品，蛋白质印迹重复至少三次。通过扫描仪使用Quantity One(Version4.6.2，Bio-RadLaboratories，Hercules，USA)分析Mfsd2a的相对量，并以体积(强度/mm2)表示。使用β-肌动蛋白(Cell Signaling Technology，Inc.)的水平对小鼠脑样本进行归一化，从而通过Mfsd2a/β-肌动蛋白水平来定量大脑的Mfsd2a。
实施例1
需要Mfsd2a来建立功能性BBB。体内结果显示，大肠杆菌或HIV-1gp41小鼠模型的脑中Mfsd2a水平显着升高(如图1所示)。结果显示，脑膜炎小鼠脑中Mfsd2a蛋白水平的平均值(1.88±0.26)明显高于健康对照组(0.042±0.015，P＝0.0062)。用gp41(1.62±0.21)处理的小鼠脑中Mfsd2a蛋白水平的平均值也高于健康对照组(0.044±0.017，P＝0.0032)。
实施例2
为了确定遭受微生物感染的受试者的外周血中cBMECs是否升高，UEA-1或Mfsd2a抗体包被的磁珠用来定量小鼠外周血中的CEC或cBMEC的数量。基于另一种特异性蛋白质CD146抗体进一步鉴定内皮细胞(Mfsd2a+/DAPI+)(如图2所示)。研究表明，可以从外周血中分离出非常少数量的cBMEC(10.0±1.29/ml)，并且用抗Mfsd2a抗体在用大肠杆菌和HIV致病因子处理后的动物的外周血液中捕获的cBMECs水平有着显着变化。显着地，用大肠杆菌(106.3±6.3/ml)和gp41(98.0±3.5/ml)(P<0.001)处理的小鼠中，Mfsd2a+cBMECs增加。
实施例3
这组实验尝试确定在治疗gp41时，Mfsd2a的水平是否在HBMEC中增加。Western印迹结果显示，HBMEC中gp41-增加的Mfsd2a蛋白水平是时间和剂量依赖性的(如图3A-C)。Western印迹结果进一步显示，用gp41处理的HBMEC中的Mfsd2a蛋白水平明显高于未处理的对照组。
实施例4
为了确定TBI中基于细胞的生物标志物测定的临床可行性，对TBI患者和年龄匹配对照的外周血样品中cAstr和cBMEC的检测和计数的初步研究是经机构批准进行的。研究结果显示，与年龄匹配的正常对照组相比，TBI患者的cAstr和cBMEC血液水平显着升高(P<0.001)(如图4所示)。
实施例5
由于α7nAChR在微生物和非微生物因子诱导的CNS炎症中起重要作用，星形胶质细胞和BMECs的周转和脱落可以通过α7nAChR调节。为了检验这个假设，调查了cAstr/cBMEC脱落和脑膜炎大肠杆菌K1(E44)诱导的CNS炎症中α7nAChR相关性，并且在本发明实验方法中使用α7nAChR拮抗剂美金刚(MEM)。将新生(10日龄)小鼠腹腔注射E44并用MEM处理。如图5所示，MEM可显着阻断cAstr(5A)和cBMECs(5B)的脱落(P<0.001)，表明α7nAChR在E44引起的BBB中起重要作用。
实施例6
这组实验用于确定cAstr和cBMECs是否可以被检测，并用作微生物(gp120)和非微生物(METH)致病因子引起的BBB损伤的细胞指数。如图6A和6B所示，与没有处理(CON)的对照相比，METH和gp120可以显着诱导Astr(6A)和cBMEC(6B)脱落。此外，在gp120与METH的组合中检测到显着更高水平的Astr和cBMECs。
用于发现基于细胞的BBB生物标志物的新模型被开发。cAstr/cBMECs首次被提出可以在外周血液中检测到，并用作微生物(大肠杆菌K1和gp120)和非微生物(尼古丁和METH)致病因子引起的BBB损伤的细胞指数。炎症反应可以通过波形蛋白(vimentin)和α7nAChR调节。直接对各种致病因子引起的NVU或BBB损伤或脑部类淋巴系统异常的精确、快速、无创的量化与检测(液体活检)是一个非常具有挑战性的课题。大多数对CNS疾病的生物标志物研究集中在神经元损伤而不是NVU或BBB损伤，因为某些致病因子导致的神经元敏感性是区域和疾病特异性的。此外，以前对脑损伤的研究主要集中在测量神经元与BBB损伤的分子生物标志物上。目前临床上尚无血液分子生物标志物检测法能精确用于NⅤU与脑血管损伤的早期诊断因为缺乏精准方法测量脑类淋巴系统对这些分子水平的影响。尤为重要的是，由于脑组织的特殊性对CNS疾病的病理诊断无法象外周组织(如肝、肺、肾)那样可以进行组织活检。将重点转移到NVU或BBB伤害或脑部类淋巴系统异常方面有许多临床优势。首先，大多数CNS疾病伴随着NVU或BBB功能障碍的增加。其次，NVU或BBB损伤或脑部类淋巴系统异常确实与致病因子有关，但神经损伤可能缓慢发展或延迟发展。早期发现NVU或BBB疾病为神经保护干预提供了一个机会。另一个优点是基于细胞的生物标志物cAstr/cBMEC以及单细胞谱学(SCP)方法将使CNS疾病的诊断变得更容易和可接受。在单细胞分辨率的蛋白质组学和基因组分析的生物技术的最新进展能够全面地新颖的理解复杂的生物过程。SCP方法将允许研究cAstr和/或cBMECs的多个基因/蛋白质或整个基因组/蛋白质组。考虑到这些优点，目前的研究主要旨在为使用cAstr/cBMECs作为NVU或BBB损伤或脑部类淋巴系统异常的细胞生物标志物奠定基础，这有助于各种CNS疾病的研究。在本发明中，cAstr/cBMECs可用作由微生物(例如gp120和脑膜炎大肠杆菌K1)和非微生物(例如尼古丁和METH)因子引起的NVU或BBB病症的基于细胞的生物标志物。
研究表明，微生物(例如大肠杆菌K1)和非微生物(例如尼古丁)因子都可以向上调节波形蛋白(Vim)和α7nAChR，并且这些致病因子诱导的CNS炎症可被Vim/α7抑制剂-介导阻塞和Vim/α7基因敲除。同时α7nAChR可能被与HIV相关的神经认知障碍(HAND)发病机制中的METH和gp120上调。在本发明中，Vim/α7nAChR在小鼠模型中BBB完整性的调节中起重要作用。在Vim/α7缺陷小鼠中，致病因子诱导的与BBB通透性增加相关cAstr/cBMEC脱落显着降低。实验数据表明，Vim/α7nAChR的上调对NVU和BBB的完整性和功能是不利的。
CNS炎症期间BBB通透性和cAstr/cBMEC脱落的致病因子介导的增加的精确机制是未知的。尽管促炎因子促进BBB通透性增加是众所周知的，但CNS疾病中这些因素的产生如何调节是不清楚的。本发明研究表明，Vim/α7nAChR可以直接或间接上调促炎因子(IL-1，IL-6，TNFa，MCP-1，MIP-1a，RANTES，CD44和ICAM-1)，显着增强PMN向CSF迁移并且对脑膜炎感染早期BBB的渗透性有不利影响。由α7nAChR介导的钙信号传导是大肠杆菌感染的脑膜炎和尼古丁暴露的CNS炎症反应的主要调节途径。根据Vim/α7KO小鼠模型证明，与野生型动物相比，减少的cAstr/cBMEC脱落与CNS炎症反应(例如，降低的PMN募集和渗透到CSF中白蛋白)相关。这些发现提供了对先前未知的对NVU/BBB完整性和cAstr/cBMEC脱落有贡献的宿主防御要素的了解，但Vim/胆碱能α7nAChR通路对BBB病症和CNS炎症发病机制和治疗的影响仍有待探索。已经发现Vim/α7nAChR能够通过两种离子事件(钙信号)和蛋白激酶的激活去介导SLURP(分泌的哺乳动物Ly-6/尿激酶纤溶酶原激活物受体相关蛋白)-1-上调的NF-KB。UCHL1和S100B都显示参与NF-KB的调节。在各种CNS失常期间，α7nAChR介导的NF-KB信号可能参与调节分子(UCHL1和S100B)和细胞(cAstr/cBMEC脱落)生物标志物。
总之，cAstr和cBMECs的血液水平，以及EPCs与NVU或BBB损伤或脑部类淋巴系统异常和被微生物和非微生物因子诱导的CNS炎症的宿主炎症反应正相关。这些结果揭示了这些非侵入性细胞生物标志物作为NVU或BBB损伤或脑部类淋巴系统异常指标及优化治疗方案中的潜力。
可能以许多方式来实现本发明的方法和装置。当然，上文描述的各种方法和技术提供多种方式来执行本发明。当然，应理解，根据本文描述的任何具体实施方案可能不一定会实现所描述的所有目的或优点。因此，例如，本领域技术人员将认识到，所述方法可以按实现或优化如本文教导的一个优点或一组优点的方式来执行，而不必实现如本文可能教导或提出的其他目的或优点。本发明提供各种替代的实施例。应当理解，本发明并不排除在某些优选实施例中添加或减少一个或多个特征，或者简单替换一个或多个特征。
此外，技术人员将认识到本文公开的不同实施方案的各种特征的可互换性。类似地，本领域普通技术人员可以组合和匹配上文论述的各种特征和步骤以及每个这种特征或步骤的其他已知的等效形式以根据本文描述的原理来执行方法。
虽然已经在某些实施方案和实例的背景下公开了本发明，但是本领域技术人员将理解，本发明可超出确切公开的实施方案而延伸到其他替代性实施方案和/或它们的使用和明显的修改以及等效形式。
本文所述的本发明的实施方案包括本发明人所知的实施本发明的最佳方式。通过阅读前述说明书，那些实施方案的变型对于本领域普通技术人员会变得显而易见。本发明人预期熟练的技术人员将会酌情采用此类变型，并且本发明人预计本发明将以本文所具体描述的以外的方式实施。因此，本发明包括适用法律允许的所附权利要求中列举的该主题的全部修改方式和等同形式。此外，除非在本文中另外指明或与上下文明显抵触，否则本发明涵盖了上述要素在其全部可能的变型中的任意组合。
针对本申请引用的每个专利、专利申请、专利申请公开物和其他材料，如文章、书籍、说明书、出版物、文档等，特此将其全部内容并入本申请作为参考。与本申请内容不一致或产生冲突的申请历史文件除外，对本申请权利要求最广范围有限制的文件(当前或之后附加于本申请中的)也除外。需要说明的是，如果本申请附属材料中的描述、定义、和/或术语的使用与本申请所述内容有不一致或冲突的地方，以本申请的描述、定义和/或术语的使用为准。
应当理解的是，本申请中所述实施例仅用以说明本申请实施例的原则。其他的变形也可能属于本申请的范围。因此，作为示例而非限制，本申请实施例的替代配置可视为与本申请的教导一致。相应地，本申请的实施例不仅限于本申请明确介绍和描述的实施例。
本文所描述的例子和实施例只是用于说明性目的，应当理解，其所涉及的各种修改或变化将启发本领域技术人员，这些修改或变化将被包括在本申请的精神和范围之内。除非特别说明，此处所使用的单词和短语应当理解和解释为：具有与相关技术领域的技术人员对这些单词和短语的理解相一致的意思。
虽然以上已经描述了本发明的各种实施例，但是应该理解的是，它们已仅通过举例的方式呈现，而非限制。本本不旨在是穷尽或将本发明限制为所公开的精确形式。鉴于以上教导，许多修改和变化是可能的。实施例仅供解释本发明及其实际应用的原理，从而使本领域技术人员能够最好地利用本发明和各种实施例的各种修改所考虑的特定用途说明。因此，本发明不受本文中所公开的具体实施例的限制。
虽然已经示出和描述了这些实施例及应用，但对于受益于本申请的本领域技术人员而言显而易见的是，在不脱离本申请中所披露的发明构思的情况下，比上面提及的更多的修改例都是可能的，因此所附权利要求旨在覆盖这些实施例的落入其真实精神和范围内的所有这些特征和优点。

Claims (17)

1.一种生物标志物在制备用于检测、治疗及监控中枢神经系统或神经血管单元性疾病或脑部类淋巴系统异常的试剂中的用途，其中，所述生物标志物选自循环星形胶质细胞。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述检测、治疗及监控包括如下步骤：
获得受试体的外周血样；
确定所述外周血样中循环星形胶质细胞的密度；
与参考样品中的循环星形胶质细胞的密度进行比较；和
基于所述比较步骤确定所述受试体是否具有中枢神经系统或神经血管单元性疾病或脑部类淋巴系统异常。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，确定所述外周血样中循环星形胶质细胞的密度还包括:将所述循环星形胶质细胞与抗体相结合。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，将所述循环星形胶质细胞与抗体相结合，进一步包括加入固定了抗体或者没有固定抗体的支撑体以及二抗或检测抗体。
5.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，当基于所述比较步骤确定所述循环星形胶质细胞密度的增加，表明所述受试体具有增加中枢神经系统或神经血管单元性病症或脑部类淋巴系统异常的可能性。
6.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述循环星形胶质细胞的密度通过测定表达细胞表面标志物的循环星形胶质细胞的水平来确定。
7.根据权利要求2所述的用途，其中所述试剂用在诊断受试者生活方式的变化对中枢神经系统疾病的影响的方法中，所述方法包括-确定事先获自待测试的受试者的体液样本中的循环星形胶质细胞水平，和将受试者的循环星形胶质细胞水平与预定的参考值比较，其中所述预定的参考值基于之前获自同一受试者的同样的体液中的循环星形胶质细胞水平，并且其中与预定的参考值比较样本中增加的循环星形胶质细胞水平指示生活方式的变化对中枢神经系统疾病的积极影响。
8.根据权利要求7的用途，其中所述生活方式的变化是抽烟或吸食毒品的改变。
9.根据权利要求8的用途，其中所述抽烟或吸食毒品的变化是少使用烟草和毒品或者完全停止使用烟草和毒品。
10.根据权利要求8的用途，其中所述试剂用来测试新的生活方式的有效性。
11.根据权利要求6的用途，其中所述生物标志物的水平是通过测定循环星形胶质细胞和/或循环脑微血管内皮细胞和参考值或正常值比较而确定的。
12.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述细胞表面标志物包括谷氨酸-天冬氨酸转运蛋白、脑脂质结合蛋白、神经胶质纤维酸性蛋白的至少一种。
13.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述参考样品中的循环星形胶质细胞的密度是未患有中枢神经系统和神经血管单元性疾病或脑部类淋巴系统异常的受试者群体中循环星形胶质细胞的密度的平均值或中间值。
14.一种用于检测、治疗及监控中枢神经系统或神经血管单元性疾病或脑部类淋巴系统异常的试剂盒，其包括用于检测生物样品中的中枢神经系统或神经血管单元性疾病生物标志物的试剂，其中所述生物标志物选自循环星形胶质细胞。
15.根据权利要求14所述的试剂盒，其特征在于，所述生物样品是受试体的外周血样或其他体液。
16.根据权利要求14所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测循环星形胶质细胞的表面标记蛋白、标记蛋白的核酸或其组合的试剂。
17.根据权利要求14所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测表达细胞表面标志物的循环星形胶质细胞及其衍生物。
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