CN101137903A - 神经变性疾病的生物标记 - Google Patents

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CN101137903A CNA2005800314065A CN200580031406A CN101137903A CN 101137903 A CN101137903 A CN 101137903A CN A2005800314065 A CNA2005800314065 A CN A2005800314065A CN 200580031406 A CN200580031406 A CN 200580031406A CN 101137903 A CN101137903 A CN 101137903A
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H·J·费德罗夫
K·马圭尔-泽伊斯
T·R·马海里
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C·考克斯
F·马歇尔
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Abstract

公开了神经变性疾病的生物标记。鉴定这类生物标记的方法和使用这类生物标记用于例如诊断神经变性疾病和监测疾病进程和治疗的方法。还公开了与生物标记有关的分析方法、试剂盒和固体支持物。

Description

神经变性疾病的生物标记
致谢
本研究由国家老年研究所(LEAD AG09016、R01AG14411和AG00107-15)和阿尔茨海默病中心AG08665提供的资金和国家科学基金(CCR9701911)提供的资金支持。美国政府在本发明中享有一定权利。
相关申请的交叉引用
本申请要求以2004年7月19日提交的美国临时申请No.60/589,318作为优先权基础。美国临时申请No.60/589,318的全部内容以援引的方式纳入本文。
背景技术
神经变性疾病影响着数以百万计的人口，严重降低了他们的生活质量并在很多情况下导致死亡。一种相当常见的神经变性疾病是帕金森病，每年有超过五十万美国人患此病。帕金森病的特征为运动缓慢(运动徐缓)、间歇性震颤、颈部和肢体末端强直、体态弯曲、脸部表情少、吞咽有问题(吞咽困难)和相关运动(例如摆臂)的贫乏。一些病人还经历与这类运动功能异常有关的痴呆。帕金森病为一种年龄依赖性疾病，通常在50至70岁之间开始逐渐发病，并在此后的10至20年中缓慢发展直至死亡。
阿尔茨海默病是另一种常见的神经变性疾病。阿尔茨海默病的进程与意识的逐渐改变，记忆力、知觉和定向力的丧失以及个性和智力的丧失相关联。阿尔茨海默病的发病率随着年龄的增长急剧增加。
在尸体解剖之前对神经变性疾病的正确和简便地做出诊断还是一个难题。对例如帕金森病和阿尔茨海默病的多种神经变性疾病的病因学也还不完全了解。而且，与一种神经变性疾病相关的症状经常与其它神经变性疾病的症状相似，特别是在疾病的早期。这些困难会引起在对这类神经变性疾病患者进行诊断和治疗时的混淆和困难。例如，在对发生在神经元中的形态改变进行组织学分析时，发生在阿尔茨海默病患者的神经纤维中的病变通常也会呈阳性诊断结果。据显示阿尔茨海默病患者脑中的基因表达发生了改变，这种基因表达的改变可用于鉴定阿尔茨海默病患者的疾病发生和疾病进程。然而，由于这种分析需要获得患者的脑样本，因此大多数时候是在死后的处置中才有用。
由于对例如帕金森病和阿尔茨海默病的神经变性疾病的早期诊断可有助于治疗，因此需要一种准确率高而且便于操作的相对侵入性较少的方法。因此，本领域需要鉴别、诊断和监测神经变性疾病的组合物和方法。本文公开的主题致力于满足上述需要和其他需要。例如本文公开了用于诊断例如帕金森病和阿尔茨海默病的神经变性疾病的方法和组合物，所述方法和组合物涉及到采集患者的外周血样本而不是采集神经组织样本。
发明内容
根据所公开的材料、化合物、组合物、物品和方法的目的，正如本文所具体体现和概述那样，一方面，所公开的主题涉及化合物和组合物以及制备和使用这些化合物和组合物的方法。另一方面，所公开的主题涉及在具体的受试者中诊断和预测神经变性疾病(如帕金森病和阿尔茨海默病)的方法。又一方面，所公开的主题涉及筛选用于治疗神经变性疾病的治疗剂的方法。另外，本文公开了在受试者中监测神经变性疾病进程的方法。另一方面，所公开的主题涉及在受试者中监测对神经变性疾病治疗的反应的方法、在测试受试者中鉴定患神经变性疾病风险的方法以及在测试受试者中鉴别诊断神经变性疾病的方法。还公开了神经变性疾病的诊断分析方法以及可用于本文所公开的方法中的芯片、微球和阵列。在很多实施例中，本文所公开的组合物和方法涉及到来自受试者的血液的使用以及对血细胞中基因表达的分析。
下文所描述的优点将通过所附权利要求书中特别指出的要素和组合的方式得以实现和获得。应该理解的是，上文之概述和下文之详细描述均仅为示例性和解释性的，而非限制性的。
附图说明
被引入本说明书并构成该说明书的一部分的附图说明了一些实施方案，并且与说明书一起说明了所公开的组合物和方法。
图1A为第一次研究的典型变量1和2的图。这张图以及图1B和图1C中的典型变量来源于下列与细胞周期相关的信息的数据：细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白G1、wee1、hTR2、CDC25b、GSK3β和蛋白激酶Cα。对阿尔茨海默病病例(“AD”)和对照病例(“Con”)之间差异的Wa ld-Wolfowitz游程检验p<0.05。所包括的病例示于表1。
表1：
Dx N 年龄 性别 MMSE CDR Blessed Duration Fam.Hx
AD 8 77.8 3女/5男 21.3 1.3 4.6 4.1 3+/5-
Con 7 76.4 3女/5男 30 0 0 NA 2+/5-
图1B为第二次研究的典型变量1和2的图。这张图中的典型变量来源于与图1A所述相同的与细胞周期相关的信息的数据。对AD和对照病例之间差异的Wald-Wolfowitz游程检验p<0.05。所包括的病例示于表2。
表2：
Dx N 年龄 性别 MMSE CDR Blessed Durat ion Fam.Hx
AD 8 78 5女/3男 19 1.5 3.3 3.4 2+/6-
Con 8 76 5女/3男 30 0 0 NA 0+/8-
图1C为第三次研究的典型变量1和2的图。这张图中的典型变量来源于与图1A所述相同的与细胞周期相关的信息的数据。对AD和对照病例之间差异的Wald-Wolfowitz游程检验p<0.05。所包括的病例示于表3。
表3：
Dx N 年龄 性别 MMSE CDR Blessed Duration Fam.Hx
AD 5 77 4女/1男 21 1.2 3.5 3.5 2+/3-
Con 5 62 2女/3男 30 0 0 NA 3+/2-
图2A为第一次研究的典型变量1和2的图。这张图中的典型变量来源于下列与炎症相关的信息的数据：C5、C1抑制剂、C5a、补体C3、环氧合酶1、IL17、IL8、LIF、TNFα和IL10r。对AD和对照病例之间差异的Wald-Wolfowitz游程检验p<0.05。所包括的病例与图1A所示的相同。
图2B为第二次研究的典型变量1和2的图。这张图中的典型变量来源于与图2A所述相同的与炎症相关的信息的数据。对AD和对照病例之间差异的Wald-Wolfowitz游程检验p<0.05。所包括的病例与图1B所示的相同。
图2C为第三次研究的典型变量1和2的图。这张图中的典型变量来源于与图2A所述相同的与炎症相关的信息的数据。对AD和对照病例之间差异的Wald-Wolfowit z游程检验p<0.05。所包括的AD和对照病例与图1C所示的相同。在这里还加入了两名帕金森病(“PD”)病例。
图3为第一系列的8名AD受试者和7名对照受试者(见表1)的第一典型变量的组图。在多变量分析中与细胞周期相关的转录物为：细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白G1、wee1、hTR2、CDC25b、GSK3β和蛋白激酶Cα。在多变量分析中与炎症系统相关的转录物为：C5、C1抑制剂、IL-17r、IL-8、LIF、TNFα和IL-10r。在多变量分析中与细胞应激相关的转录物为：α-1抗胰凝乳蛋白酶、HSP27、HSP90、晶体蛋白(crystalline)、GAPDH、铁蛋白H、铁蛋白L、cox1、cox2和转铁蛋白。在全部三幅图中，对早期AD和对照病例之间差异的Wald-Wolfowitz游程检验p<0.05。
图4为第二系列的受试者(8名AD和8名对照，见表2)的第一典型变量的组图。转录物与图3中的相同。在全部三幅图中，对早期AD和对照病例之间差异的Wald-Wolfowitz游程检验p<0.05。
图5为第三系列的受试者(5名AD、2名对照和2名PD)的第一典型变量的组图。转录物与图3中的相同。在全部三幅图中，对早期AD和对照病例之间差异的Wald-Wolfowitz游程检验p<0.05。
图6为银染2D凝胶电泳图。对2个独立的人类血液白细胞样本的差异成像显示有一些点仅存在于一个样本之中而不存在于另一样本中。
图7为对所分离的差异表达蛋白的MALDI-TOF质量分析。
图8为一系列的图，显示了来源于整组的对照(“CTL”)和帕金森病受试者的外周白细胞蛋白斑点的差异表达。对来源于整组的对照(n＝12)和PD(n＝12)受试者的斑点亚群的计算机分析表明了其鉴别白细胞蛋白质组的差异表达斑点的能力。
图9为显示实施例4所述试验中的研究参与者的平均基线特征的两幅图。
图10A、10B、10C和10D为已经经过银染和干燥的二维(2D)蛋白凝胶电泳的四张扫描图。图10A为显示在来自用丙戊酸盐(VPA)治疗前的阿尔茨海默病患者的白细胞中表达的蛋白质水平的图。图10B为显示在来自开始用VPA治疗四周后的同一患者的白细胞中表达的蛋白质的图。图10C和图10D分别为图10A和图10B用蛋白质斑点检测软件处理过的放大图。在图10C和图10D中用#278标记的斑点为VPA治疗前和VPA治疗后差异表达的蛋白质。
图11为使用本文公开的方法鉴定的生物标记的实例列表。
图12为一组四张的直方图，定量显示了所示VPA浓度对四种候选生物标记在培养白细胞中表达的影响。这四种蛋白质被确定为经VPA治疗的患者的生物标记，其中有三种对于VPA剂量增加的治疗表现出表达改变的反应。
具体实施方式
在公开和描述本申请的化合物、组合物、物品、装置和/或方法前，应当理解的是，除非另外说明，它们不限于具体的合成方法或具体的重组生物技术方法，或者除非另外说明，它们不限于具体的试剂，因此它们应当可以有所变化。还应当理解的是，本文所使用的术语只是出于描述具体的实施方案的目的，而并非意在限制。
A.定义
在本说明书和后面的权利要求书中将引用各种术语，它们具有下面所定义的含义：
在说明书和权利要求书中通篇使用的词“包括”和该词的其他形式例如“含有”和“包含”，含义是包括但不限于，并不意在排除例如其他添加剂、组分、整数或步骤。
除非上下文中清楚指明相反的情况之外，在说明书和权利要求书中使用的单数形式的“一”、“一种”和“该”也包括它们的复数形式。因此，例如“一种生物标记”的涵义包括两种或多种这类生物标记的混合物，“一种抗体”的涵义包括两种或多种抗体的混合物，“该受试者”的涵义包括两名或多名受试者等等。
本文中范围可以表示为从“大约”一个具体的数值，和/或至“大约”另一个具体的数值。当表示为这种范围时，另一个实施方案包括从一个具体的数值和/或至另一个具体的数值。类似地，当通过在前面使用“大约”将数值表示为近似值时，应当理解的是，该具体的数值构成另一个实施方案。应当进一步理解的是，每个范围的端点在与另一个端点相关和独立于另一个端点时都是有意义的。还应当理解的是此处公开了许多数值，并且除了数值自身外，每个数值在此还以“大约”该具体数值公开。例如，如果公开了数值“10”，那么也公开了“大约10”。还应当理解的是，当公开了一个数值时，也公开了“小于或等于该数值”、“大于或等于该数值”以及数值间可能的范围，这正如本领域技术人员所恰当理解的。例如，如果公开了数值“10”，那么也公开了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。还应理解，在整个本申请中，以多种不同形式提供数据，这些数据代表了端点和起点，以及这些数据点任何组合的范围。例如，如果公开了具体的数据点“10”和具体的数据点15，应该理解，大于、大于或等于、小于、小于或等于和等于10和15以及10和15之间的数值也认为已经被公开。
“任选的”或“任选地”意为随后描述的事件或情况可能发生也可能不发生，并且本说明书包括所述事件或情况发生的实例和它们不发生的实例。
“探针”为可以与靶标核酸相互作用的分子，所述相互作用通常为序列特异性的方式，例如通过杂交。核酸的杂交为本领域所熟知并且在本文中也有所讨论。通常，探针可由本领域可得的核苷酸或核苷酸衍生物或核苷酸类似物的任意组合而制备。
“引物”为探针的一类，它可以支持一些类型的酶操作，它也可以与靶标核酸杂交以使得可以进行酶操作。引物可由不干扰酶操作的本领域可得的核苷酸或核苷酸衍生物或核苷酸类似物的任意组合而制备。
术语“增加”、“提高”或“上升”指高于对照水平或参照水平的水平。这些术语也可以包括事件的出现或发生(例如对照水平或参照水平为零时比它们高的水平)。术语“减少”、“降低”或“下降”指低于对照水平或参照水平的水平。这些术语也可以包括事件的缺失或消失(例如对照水平或参照水平不为零时为零的水平)。
本文所使用的术语“受试者”和“患者”可以互换使用，含义为个体。因此，“受试者”或“患者”可包括家养的动物(例如猫、狗等)、牲畜(例如牛、马、猪、绵羊、山羊等)、实验动物(例如小鼠、兔、大鼠、豚鼠等)和鸟类。“受试者”或“患者”可包括例如灵长类的哺乳动物。在一个具体方面，“受试者”或“患者”可以为人类。
本文所使用的“样本”指取自受试者或患者的任何生物材料。一方面，样本可包括血液、脑脊液(“CSF”)或尿液。另一方面，样本可包括全血、血浆、从血液样本中富集的白细胞和培养的细胞(例如来自受试者的白细胞)。样本还可包括活检样本或包括神经组织的组织样本。再另一方面，样本可包括整个细胞和/或细胞裂解物。细胞的实例包括但不限于白细胞，例如嗜中性粒细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞或它们的任意组合。在另一个具体方面，样本可包括白细胞或基本纯的白细胞群或其裂解物。术语“基本纯的”在用于白细胞群或其裂解物时，意指样本中含有的白细胞以外的细胞占样本中细胞总数的少于约1％、少于约5％、少于约7％、少于约10％、少于约12％、少于约15％、少于约20％、少于约25％或少于约30％。在一个具体实例中，样本可包括淋巴细胞、基本纯的淋巴细胞群或基本纯的淋巴细胞群的裂解物。任选地，可对所选类型富集白细胞。例如，可对淋巴细胞富集白细胞群并用于本文所述的方法。富集可使用例如FACS的细胞分选技术实现。
“神经变性疾病”意为以神经元功能障碍和/或神经元死亡导致脑、脊髓、中枢神经系统和/或周围神经系统的神经功能丧失为特征的任何疾病。神经变性疾病可为慢性的或急性的。神经变性疾病的实例包括但不限于：帕金森病、额颞叶痴呆(frontotemporal dementia)、额颞叶痴呆和帕金森氏综合征、阿尔茨海默病、轻度认知缺损、弥漫性路易体病、路易体型痴呆、例如多发性硬化和急性横贯性脊髓炎的脱髓鞘病、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿病、克罗伊茨费尔特-雅各布病、艾滋病痴呆综合征(AIDs dementia complex)、锥体束外和小脑疾病例如皮质脊髓系统损伤、基底神经节疾病、皮质基底节变性(corticobasalganglionic degeneration)、周围神经病变(在糖尿病或化疗治疗后继发)、进行性核上性麻痹、小脑的结构性损伤、脊髓小脑变性例如脊髓性共济失调、弗里德赖希共济失调、小脑皮质变性、多系统变性病(Mencel、Dejer ine-Thomas、Shi-Drager和Machado-Joseph)、多系统萎缩病、全身性疾病(雷弗素姆氏病、无β脂蛋白血症(abetalipoprotemia)、共济失调、毛细管扩张和线粒体多系统疾病)、例如神经源性肌萎缩(前角细胞变性、婴儿型脊髓性肌萎缩和青少年脊髓性肌萎缩)的运动单位疾病、中年的唐氏综合征、亚急性硬化性全脑炎、哈勒沃登-施帕茨病、拳击员痴呆、皮克氏病(Pick’s disease)等等。急性神经变性疾病的一些实例为中风、缺血和多发性梗塞痴呆。神经元的突然损失可使患者脑部呈现癫痫特征和那些引起低血糖损伤和脑部、周围神经或脊髓的创伤性损伤的特征。
本申请通篇引用了各种出版物。这些出版物的公开内容通过引用的方式全文纳入本申请，以便更充分地描述与本发明有关的现有技术状况。基于倚赖参考文献的句子中所论述的包含在所述参考文献中的素材，公开的参考文献也通过引用的方式单独地并特别地纳入本说明书。
现在将具体提及所公开的化合物、组合物、物品、设备和方法的具体方面以供参考，它们的实例在随后的实施例和附图中有详细的说明。
B.组合物和方法
本文公开了生物标记，也包括鉴定和应用生物标记的方法。在一些具体方面，所公开的生物标记可用于：(i)诊断神经变性疾病(例如帕金森病和阿尔茨海默病)的方法；(ii)跟踪神经变性疾病的进程的方法；(iii)检测受试者对神经变性疾病的治疗的反应的方法；(iv)鉴定患神经变性疾病的风险的方法；(v)区别一种神经变性疾病与另一种神经变性疾病的方法；以及本文公开的其他一些方法。
“生物标记”意为可用于在受试者体内或样本中鉴定疾病(例如神经变性疾病或未患神经变性疾病)或疾病状况的任何可检测的特征或组合物。在本文公开的一些实例中，生物标记可为基因，它的表达特征可用于在受试者体内或样本中鉴定疾病或疾病状况。在另一些实例中，生物标记可为基因产物。“基因产物”意为转录物、核酸或蛋白质。因此，本文公开的生物标记的存在、缺失或相对含量可用于在受试者体内或样本中鉴定疾病或疾病状况。在一个具体实例中，生物标记可为基因产物，它在受试者体内的存在或缺失是受试者是否患有具体的神经变性疾病、是否有发展为神经变性疾病的特别的风险以及是否处于疾病的特定阶段的特征。在另一个实例中，生物标记可为基因产物，它的增加或减少是具体神经变性疾病、发展为神经变性疾病的特别的风险以及疾病的具体阶段的指标。在另一个实例中，生物标记可为一组不同的基因产物，它们的存在或缺失是受试者是否患有具体神经变性疾病、是否有发展为神经变性疾病的特别的风险以及是否处于疾病的特定阶段的指标。在另一个实例中，生物标记可为一组基因产物，它们上升和下降的表达模式是患有或未患具体神经变性疾病的指标。再另外，生物标记可为一种或一组基因产物，其表达模式是存在或不存在某种神经变性疾病的特征，或是疾病特定的预后或结果的特征。本文中所用的生物标记可作为其他临床检测的代用品。可以通过测量本文所鉴定的生物标记，从而确定水平、表达情况、活性，或用于检测变体。在本文通篇中讨论到检测表达水平或活性时，应当理解的是它可以反映给定生物标记的变体。变体包括氨基酸变体或核酸变体或翻译后修饰的变体。
在本文通篇中，除了明确指明相反或本领域普通技术人员根据上下文理解出相反的情况以外，凡是讨论了一种蛋白质，也就公开了其核酸(例如转录物)。类似地，凡是讨论了一种核酸，也就公开了其蛋白质。除了明确指明相反或本领域普通技术人员根据上下文理解出相反的情况以外，在本文讨论基因产物时，也同时个别地和总体地公开了蛋白质、核酸和转录物。
而且，虽然生物标记可为特定的基因产物或基因产物的特定水平或量，但是生物标记也可为在多变量典型分析中对这些基因产物的水平或量进行分析时获得的特定变量(例如第一和/或第二典型变量)。
在所公开主题的一些实例中，对例如阿尔茨海默病或帕金森病的神经变性疾病的生物标记被用于在受试者体内诊断所述疾病。而且，从死人的脑获得的单个神经元或匀浆液的信息表达情况可用于将神经变性疾病与对照样本区别开(参见例如Cheetham JE，et al.，J.Neurosci.Methods，1997；77(1)：43-48；Chow N，et al.，Proc.Natl.Acad.Sc i.U.S.A.，1998；95：9620-9625)，一方面，本文公开了将基因和/或蛋白和多变量典型分析结合在一起以区别神经变性疾病(例如轻微AD或散发型PD)和对照血液样本的方法。
在本文公开的一个实例中，从被阿尔茨海默病中心诊断为很可能患有AD的患者和年龄与性别与其相匹配的对照样本采集血液。从白细胞提取信使RNA并对其进行扩增。然后使用低密度阵列定量分析所选定信息的表达水平。多变量典型分析区分出AD白细胞和对照白细胞。所研究的信息种类还从AD和对照样本中鉴别出了两例帕金森病病例。这些结果说明使用多变量的生物标记产生了进一步的准确性。在所检测的各类mRNA种类中，用于区分AD白细胞和对照白细胞的最好的mRNA是那些参与细胞周期和炎症过程的mRNA。这些同类mRNA的成员也能区别AD脑和对照脑，这一事实与我们对阿尔茨海默病患者脑中那些选定现象的理解相符，无需实际侵入大脑。已有许多讨论阿尔茨海默病的诊断的申请和专利，包括1997年10月24日提交的美国申请No.60/063,274、1997年10月23日提交的美国申请No.09/178,170、2001年1月25日提交的美国申请No.09/770,534和美国公布的申请No.2005-0084875-A1，这些文献中至少与阿尔茨海默病的诊断及其方法相关的内容以及与AD的诊断相关的基因的内容都以援引的方式纳入本文。
如本文公开的那样，对被诊断为帕金森病的患者进行了类似的试验。具体而言，从一群包括PD患者和与其年龄相当的对照患者的患者身上采集新鲜的全血样本。测定了白细胞的蛋白质浓度，并使用Progenesis Discovery软件(Nonlinear USA，Inc.；Durham，NC)鉴定了PD患者和对照患者之间强度不同的蛋白质斑点。对差异的测量结果进行了统计学检验。鉴定了帕金森病患者与对照相比表达提高或降低的蛋白斑点。差异表达的斑点被分离并鉴定。结果显示外周血的蛋白质分析可用于诊断例如PD的神经变性疾病。
本文公开的组合物和方法基于这一鉴定结果：来自患有神经变性疾病的受试者的样本(例如血液)中的某些基因的表达有所改变。所公开的方法通常包括将受试者血液中的某个基因或某一系列基因的表达与对照样本中的同一个基因或同一系列基因的表达相比较。可以理解的是，对照样本可以为同时进行试验的未患神经变性疾病的受试者，或者可为通过分析一名或多名未患神经变性疾病的受试者并采集表达数据而创建的标准。因此，对照样本可为被创建并持续使用的标准。例如，可根据本文所公开的未患AD或未患PD的病例的表达情况而创建标准。标准可包括例如未患神经变性疾病的受试者或任何其他对照组的一种基因或特定系列的基因的平均表达水平。
在一个具体方面，本文公开了在受试者体内诊断神经变性疾病(例如帕金森病或阿尔茨海默病)的方法。所公开的方法可包括评估来自待诊断的受试者的样本中一种或多种选定生物标记(例如基因产物)的表达水平或活性，所述样本为例如含有白细胞或其裂解物的样本；并将选定生物标记的表达水平或活性与代表一名或多名对照受试者中选定生物标记的表达水平或活性的参照标准进行比较。在这些方法中，依照具体的参照标准，选定生物标记的表达水平或活性与参照标准之间的近似或差异表示了受试者未患有或患有某种具体神经变性疾病。本文公开了评估或比较生物标记的表达水平或活性的方法。
“诊断”或该词的其他形式例如“做出诊断”和“诊断(作名词)”，意为鉴定某种具体的疾病。这一术语还意为将一种具体的疾病与另一种疾病相区别，或将患有一种特定疾病与未患有该特定疾病相区别。用于本文的“诊断”还表示鉴定疾病的特定阶段，鉴定发展为疾病的风险或鉴定疾病的预后。
在这些具体的方法中，受试者可为本文所述的受试者，例如任何个体，例如人类。在一个实例中，将就具体神经变性疾病对受试者进行诊断。待诊断的受试者可能具有具体神经变性疾病的症状，或者受试者没有具体神经变性疾病(例如帕金森病或阿尔茨海默病)的症状或处于其临床前期。
对照受试者可为患有具体神经变性疾病(例如帕金森病或阿尔茨海默病)的受试者，处于疾病的具体阶段的受试者，具有发展为疾病的风险的受试者或未患具体神经变性疾病的受试者。在一个实例中，待诊断的受试者和对照受试者可为年龄相当和/或性别相匹配的。因此，通过将来自受试者的一个或多个选定生物标记的表达水平和来自对照受试者的相同生物标记的表达水平(即参照标准)相比较，就可以就某种神经变性疾病对受试者进行诊断。
生物标记的表达水平或活性的近似或差异可以通过对样本和参照标准的一个或多个生物标记水平的任何定量或定性比较分析而测定。例如当对照受试者患有具体神经变性疾病时，那么在使用所公开的方法时，受试者和对照受试者的生物标记水平之间的近似表示待诊断的受试者也患有具体神经变性疾病。在另一个实例中，当对照受试者患有具体神经变性疾病时，那么在使用所公开的方法时，受试者和对照受试者的生物标记水平之间的差异表示待诊断的受试者未患有具体神经变性疾病。或者，当对照受试者未患有具体的神经变性疾病时，那么，在本实例中，受试者和对照受试者的生物标记水平之间的差异表示待诊断的受试者患有具体的神经变性疾病。在又一实例中，当对照受试者并未患有具体神经变性疾病时，那么在这一实例中，受试者和对照受试者的生物标记的水平之间的近似表示待诊断的受试者未患有具体的神经变性疾病。
在另一个实例中，如果通过在被诊断患有例如帕金森病或阿尔茨海默病的神经变性疾病的患者体内检测到某基因产物的表达或活性提高，从而将该选定基因产物鉴定为生物标记，那么来自受试者的样本中该生物标记的表达的提高(相对于参照标准)就表明受试者患有该神经变性疾病。另一方面，如果通过在被诊断为患有神经变性疾病的患者体内检测到某基因产物的表达或活性降低，从而将选定的一种或多种基因产物鉴定为生物标记，那么来自受试者的样本中该蛋白质的表达的降低(相对于参照标准)就表明受试者患有该神经变性疾病。
再另外，所公开的方法中可以使用生物标记的组合。例如，相对于参照标准，一种或多种生物标记可增加，而其他生物标记可减少，由此可表明是否患有神经变性疾病。
1.评估表达水平
a)样本采集
正如所注意到的那样，本文公开的方法通常包括从受试者采集样本。样本可为受试者的外周血，但是也考虑到了使用其他样本。可使用任何可分离细胞及随后从细胞中提取基因产物的方法来采集血液样本。例如，可通过注射器采集血样，然后储存于4℃。血液样本可通过真空管采集，管中含有但不限于肝素、EDTA或ADC(黄色管)或任何其他抗凝血药。另一种采集和储存血液的方法为使用PAXgeneuTMBlood RNA管，它可使全血在室温下稳定保存最多达5天。其他任何增加真核细胞mRNA稳定性的化合物或化学物质也可以用于这一过程。在一个具体实例中，可以通过在200μL缓冲液(20mM Tris，pH7.5、0.5％Nonidet、1mM EDTA、1mM PMSF、0.1M NaCl、1X Sigma蛋白酶抑制剂和1X Sigma磷酸酶抑制剂1和2)中在4℃振荡而重悬细胞沉淀。将悬液至于冰上，间歇地振荡20分钟。在4℃以15000×g离心5分钟，然后将上清液分成等分并储存于-70℃。例如尿液、CSF、组织等对其他类型的样本的采集可通过本领域已知的方法进行。
b)收集细胞
通常，采集到样本后就可分离样本中所含的各种细胞。例如，在某些实施方案中，分析了样本所含的白细胞群中的一种基因或一系列基因的表达模式。可用任何方法分析各种细胞，只要最后能保留住细胞以使得可以从其中收集基因产物即可。例如，一种分离白细胞的方法是通过裂解血液样本中的红细胞然后通过例如离心收集剩下的白细胞。可以对白细胞的亚型进行分析，例如淋巴细胞及其亚类、单核细胞和其他类型的血细胞。另外，可对血细胞之外的其它细胞例如来自皮肤、颊刮取物、肌肉、口腔上皮、消化系统、泌尿系统和生殖系统的那些细胞进行分析。可以任何方式发生裂解，包括例如在无RNA酶的条件下通过使用氯化铵或使用例如IMMUNOLYSETM和OPTILYSETM(Coulter International Corporation；Miami，FL)的市售试剂来裂解。或者，可以使用HISTOPAQUETM(Sigma；Milwaukee，WI)在添加或不添加Ficoll的条件下来离心抗凝血从而分离白细胞和红细胞。另一种实现这一目的的方法是使抗凝血在室温下沉淀1-2小时并收集白细胞部分。另一个裂解的实例包括将抗凝血以150-200g离心约5分钟；然后除去血沉棕黄层(buffy coat)。相似的裂解方法为本领域已知并且也可采用。
也可以通过例如使用用于细胞分选的白细胞特异性标记来收集白细胞。总的白细胞可以被分选为一些亚型例如B细胞、T细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、monophils、单核细胞和血小板以及这些总的类别中的亚型。标记包括但不限于：MHC糖蛋白；整联蛋白；归巢受体；IgG、IgE、IgM、IgA和IgD的Fc受体；淋巴因子的补体受体；干扰素；集落刺激因子；胰岛素受体；神经递质受体；趋化受体(chemotactic receptor)；膜酶和运输蛋白。这些白细胞可通过例如抗体来分选，这些抗体可识别170种以上的CD抗原。
通常，例如白细胞的细胞被收集后，白细胞本身会被裂解以收集核酸和/或蛋白质。这些细胞可用任何方式裂解。白细胞的核酸还可通过如下方法收集：例如使用4M的异硫氰酸胍裂解液和氯化铯超速离心，或者使用4M的硫氰酸胍/25mM柠檬酸钠/0.5％肌氨酰/0.1Mβ-巯基乙醇来裂解白细胞，然后加入2M NaOAc，之后进行离心和异丙醇沉淀。另外，可使用hydroxy appetite收集核酸或使用正电荷磁珠收集核酸。核酸还可以例如被沉淀。还可使用TRIZOLTM试剂(Gibco LifeTechnologies，Inc.；Rockvil le，MD)获得总RNA，该试剂为苯酚和异硫氰酸胍的单相溶液。可以在破坏细胞并溶解细胞组分时保持RNA的完整性的任何其他试剂也都可以应用。还可以通过在“破裂缓冲液”(50mM Tris-HCl(pH6.8)、100mM DTT、100μg/ml PMSF、2％十二烷基硫酸钠(SDS)、10％甘油、1μg/ml胃酶抑素A、1μg/ml亮肽酶素、1μg/ml抑肽酶和1M原钒酸钠)中裂解细胞来收集白细胞的蛋白质和肽，并用22号针头对其进行剪切。样本中的蛋白质含量可使用DC蛋白质分析(BioRad)来评估。可使用含10％SDS的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)来辨析蛋白质(10-20μg)。
通常应先将总的基因产物(例如生物标记)分离或收集。这可使用收集核酸和/或蛋白质的任何方法进行。当收集到基因产物后，可将它们洗涤和例如洗脱(如果它们能附着于某种类型的亲和系统例如磁珠上)。通常，进行收集基因产物的步骤是为了获得样本中的mRNA和/或蛋白质，如果采用直接收集基因产物则不需要此步骤。而基因产物可通过任何适于基因表达分析的方法制备。
c)RNA的制备
在一些实例中，所公开的方法涉及一些水平的RNA制备。RNA制备步骤并不必须作为连续方法的一部分来进行，但是在某些方法中，需要制备RNA以使得它可以被杂交。在另一些方法中，RNA可用于产生cDNA，该cDNA随后可用作例如PCR反应的模板或通过例如与探针杂交被直接分析。在理论上，RNA制备步骤的进行可与实际的扩增和定量步骤相距很远(例如在另一个实验室中、或者在很早的时间之前进行)，在许多实施方案中，RNA的分离和制备或cDNA的扩增等步骤是与本方法的扩增和定量步骤(例如PCR或杂交)在一起进行的，但这并不是必须的。
当所公开的方法包括RNA制备步骤时，RNA制备的方法可以为可产生可进行酶操作的mRNA或可分析的RNA的任何RNA制备方法。例如，RNA可通过使用下述方法分离：异硫氰酸胍-超速离心法、胍和酚-氯仿法、氯化锂-SDS-尿素法，或使用寡(dT)纤维素方法从组织裂解物中分离多聚A+/mRNA。重要的是在分离RNA时要分离出足够的RNA。另外，通常所得的RNA的量应被测定。例如，通常可分离出至少0.01ng或0.5ng或1ng或10ng或100ng或1000ng或10000ng或100000的RNA。如本文将要讨论的那样，在多变量定量PCR的扩增过程中，重要的是在每种目标的扩增速度还保持在倍增速率的至少80％或85％或90％或95％时停止扩增。能以继续保持在倍增速率左右所进行的PCR循环的次数与用于cDNA产生步骤的总RNA的量相关。
RNA可从任何所需细胞或细胞类型和任何生物体分离，所述生物体包括：例如小鼠、大鼠、兔、狗、猫、猴和人的哺乳动物；以及例如鱼或两栖类的非哺乳动物；以及植物；以及甚至例如细菌的原核生物。
d)RNA表达分析
当例如白细胞的细胞或细胞类型被收集时，可分析在这些细胞中含有的表达的信使RNA。可使用多种方式任一方法达到上述目的，例如杂交、RNA印迹、RT-PCR、实时RT-PCR、单通道定量多重RT-PCR(single channel quantitative multiplex RT-PCR)、寡聚cDNA阵列和/或cDNA阵列，或者可用于核苷酸定量的任何技术。这种方法的实例可由基于使用DNA芯片技术的自动仪器产生，其实例可在IntegratedNano-Technologies LLC公司找到，网址为http://www.integratednano.com/。例如，分析总mRNA的一种方法是通过例如裂解细胞并沉淀核酸的方法收集细胞中含有的所有核酸。可用任何方法收集信使RNA，例如使用可与信使RNA转录物所含的多腺苷酸(polyA)尾特异性杂交的多胸苷酸(polyT)。然而，这种方法依赖于3’-polyA尾的存在，但是在某些情况下，该尾可能被降解。因此，另一种直接分析包括片段的所有信使RNA的方法可使用信使RNA特异性引物和反转录酶来制备cDNA。然后这种cDNA可被直接分析或通过例如本文讨论的定量PCR扩增并被分析。可以理解的是，最终的目标是分析基因的表达，这个目标可由任何可分析基因表达和比较其表达的方法来实现。可以理解的是，考虑了直接杂交或鉴定mRNA的其他手段，以及操作mRNA以形成例如cDNA的手段，所述cDNA可通过例如杂交或其他鉴定方法直接分析，或者自身可扩增而产生例如PCR产物，该PCR产物自身可通过例如杂交被直接分析或以其它方式被鉴定或被操作。只要能实现鉴定基因表达的最终目标，就都在本文的考虑范围之内。
对表达的分析可通过例如探针的杂交而进行。例如，可在例如芯片上含有待分析的特定基因的探针，可通过mRNA与芯片的结合来分析mRNA。这些芯片通常指阵列，例如微阵列或宏阵列。
(1)微阵列
阵列为样本的有序排列，提供了基于碱基配对规则匹配已知和未知DNA样本的介质。通常鉴定未知物的过程是自动的。阵列实验可应用例如微量滴定板或标准印迹膜等常见的分析系统，可以手工制备或或使用机器人来沉积样本。总体而言，阵列被描述为宏阵列或微阵列，其区别为样本点的大小。宏阵列含有的样本点大小约为300μm或更大，可以容易地用现有的凝胶和印迹扫描装置成像。微阵列含有的样本点大小可为300μm或更小，但通常直径小于200μm，这些阵列中通常包括几千个点。微阵列通常需要为每种专一用途的微阵列制造的专门的机器人和/或成像装置。文献中使用了一些术语来描述这种技术，这些术语包括但不限于：生物芯片、DNA芯片、DNA微阵列、GENECHIPTM(Affymetrix公司的高密度、基于寡核苷酸的DNA阵列产品(Affymetrix，Inc.；Santa Clara，CA))和基因阵列。
一般而言，DNA微阵列通常是在玻璃或尼龙基质上由高速机器人装配而成，用于将已知同一性的探针用于测定互补结合，由此可平行进行大量的基因表达和基因开发研究。使用一块基因芯片进行的实验可同时提供几千个基因的信息。本文考虑了所公开的微阵列可用于任何目的，包括监测基因表达、疾病诊断、基因开发、药物开发(药物基因组学)和毒理学研究或毒理基因组学。
根据具有已知同一性的排列的DNA序列的属性，DNA微阵列技术有两个变种。I型阵列和II型阵列主要的区别在于：I型阵列通常为单一序列或一系列相关的序列，例如一系列等位基因的序列，而在II型微阵列中，在表面上会附着多种不同的序列。
I型微阵列包括探针，探针通常为使用机器点样固定于例如玻璃的固体表面的cDNA(长500至约5000个碱基)，该探针暴露于一系列分离的或混合的靶标。传统上将这种方法称为DNA微阵列。在I型微阵列中，一个或多个多核苷酸序列的集中的多个拷贝(优选单个多核苷酸序列的拷贝)被固定于基质表面的多个限定区域。多核苷酸指的是范围通常为5至10000个核苷酸的核苷酸链。这些多核苷酸序列的固定化拷贝适于在杂交实验中用作探针。通常用多个不同的样本在芯片的不同区域探测固定化的序列，由此鉴定含有可与固定化样本杂交的核苷酸的样本。
为制备被固定化探针包被的微球，要将微球浸没在含有所需探针序列的溶液中，然后探针序列以共价或非共价方式固定在微球上。或者将探针固定于杆上，可将特定的探针点样于杆上的限定区域。通常，点样器包括将溶液送递至基质的微量加液器和控制微量加液器与基质相对位置的机器人系统。可用多路点样器以使反应物可被同时送递至反应区域。在一个实施方案中，微阵列可通过使用基于压电效应的喷墨技术形成，藉此使得含有例如寡核苷酸合成反应物的目的液体的窄管由适配器所环绕。穿过适配器的电荷使得适配器以不同于该管的速度膨胀，从而将一小滴液体推到基质上(参见Baldeschweiler，et al.，PCT申请WO95/251116)。
样本可为含有目的多核苷酸(靶标多核苷酸)的任何样本，可从任何体液(血液、尿液、唾液、痰液、胃液等等)、培养细胞、活检组织或其他组织制品中获得。可根据本领域技术人员已知的多种方法中的任何一种来从样本中分离DNA或RNA。例如，纯化核酸的方法描述于Laboratory Techniques in Biochemi stry and Molecular Biology：Hybridization with Nucleic Acid Probes.Part I.Theory andNucleic Acid Preparation，P.Tijssen，ed.Elsevier(1993)。在一个实施方案中，使用TRIZOLTM总RNA分离试剂(Gibco LifeTechnologies，Inc.，Rockville，MD)来分离总RNA，使用寡d(T)柱色谱法或玻璃珠来分离mRNA。在杂交和处理后，获得的杂交信号可准确反映加入样本中的对照靶标多核苷酸的量。
用于固定多核苷酸的基质上的多个限定区域可以以多种形式排列。例如，区域可垂直或平行于套管的长排列。另外，靶标不必直接与基质结合，而可以通过连接基团结合至基质。连接基团的长度通常为大约6个原子至50个原子。合适的连接基团包括乙二醇寡聚物、二胺、二酸等。基质表面上的反应性基团与连接物的一个末端部分反应而使连接物结合至基质上。然后连接物上的其他部分被官能化以结合探针。
样本多核苷酸可用一个或多个标记部分作标记使得杂交的探针/靶标多核苷酸复合物可以被探测。标记部分可包括能被分光方法、光化学方法、生物化学方法、生物电子学方法、免疫化学方法、电学方法、光学方法或化学方法检出的组合物。标记部分包括：例如32P、33P或35S的放射性同位素；化学发光化合物；标记结合蛋白；重金属原子；例如荧光标记和染料的分光方法标记物；磁性标记；连接酶；质谱标签；自旋标记；电子转移供体和受体；生物素等等。
可在例如聚合酶链式反应的扩增反应中和在体外或体内转录反应中进行标记。或者，可在杂交后形成探针-靶标复合物后引入标记部分。在一个优选实施方案中，如上所述在扩增步骤中先引入生物素。在杂交反应后，未结合的核酸被洗去，使得依然结合在基质上的生物素仅为与多核苷酸探针相杂交的靶标多核苷酸上所附着的生物素。然后加入以高亲和力与生物素结合的抗生物素蛋白缀合的荧光团，例如抗生物素蛋白-藻红蛋白。
杂交使得多核苷酸探针和互补靶标通过碱基配对形成稳定的双链体。杂交方法为本领域技术人员所熟知，杂交的严格条件可通过盐浓度、温度和其他化学物质以及本文讨论的条件进行限制。其他的可变参数，例如杂交时间、洗涤剂(十二烷基硫酸钠，SDS)或溶剂(甲酰胺)的浓度以及是否含有载体DNA，这些都是本领域技术人员熟知的。这些条件中的另外的变化对本领域技术人员而言是显而易见的(WahlGM，and Berger SL，Methods Enzymol.，1987；152：399-407；KimmelAR，Methods Enzymol.，1987；152：507-511；Ausubel FM，et al.，Short Protocol s in Molecular Biology，John Wi ley&Sons，New York，N.Y.，1997；和Sambrook J，et al.，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Plainview，N.Y.，1989)。
检测复合物形成的方法为本领域技术人员所熟知。在一个实例中，多核苷酸探针用荧光标记进行标记，并通过例如共焦荧光显微镜的荧光显微镜完成对复合物形成模式和水平的测量。氩离子激光激发荧光标记，发射光发射到光电倍增管上，由此检测和量化发射光的量。检测到的信号应该与微阵列每一位置上的探针/靶标多核苷酸复合物的量成比例。荧光显微镜可与计算机控制的扫描装置相连接，以产生量化的杂交强度的二维图像。检测扫描图像以测定每一种杂交的靶标多核苷酸的丰度/表达水平。
在差异杂交实验中，使用具有不同发射光波长的两个或多个不同的荧光标记来标记来自两个或多个不同生物样本的多核苷酸靶标。用设置为检测特定波长的不同的光电倍增管分别检测荧光信号。获得了两个或多个样本中的靶标多核苷酸的相对丰度/表达水平。通常，当在类似的测试条件下使用一个以上的微阵列时，可将微阵列的荧光强度进行标准化以重点考虑杂交强度的变化情况。在一个实例中，使用每个微阵列中含有的内部标准化对照物产生的强度来对个别的多核苷酸探针/靶标复合物的杂交强度进行标准化。
II型微阵列含有寡核苷酸(例如约20个至约80个核苷酸的寡聚体)或肽核酸(PNA)探针的阵列，该肽核酸探针通过原位(在芯片上)合成，或通过常规合成法合成后固定在芯片上。将阵列暴露于被标记的样本DNA并杂交，从而测定互补序列的同一性/丰度。这种方法“在历史上”被称为DNA芯片，由Affymetrix，Inc.，(Santa Clara，CA)公司开发，该公司以GENECHIP为商标出售其以光刻法制备的产品。
使用II型阵列研究基因表达的基本概念十分简单：来源于实验样本的mRNA的被标记的cDNA或cRNA靶标与固体支持物上附着的核酸探针相杂交。通过监测与每个DNA区域相连接的标记的量，可以得知每种mRNA所代表的丰度。虽然使用杂交来检测和定量核酸已有几十年的历史，但是将微型化技术和日益增长的大量的序列信息相结合，可以大幅扩大可研究的基因表达的规模。
微阵列制作可在5英寸见方的石英片层上开始。首先要洗涤石英片已使其表面均匀地羟基化。由于石英天然就是羟基化的，所以它为化学物质的结合提供了极好的基质，所述化学物质例如后面用于使探针定位于阵列的连接分子。
将片层置于硅烷浴中，硅烷与石英的羟基基团反应并形成共价连接的分子的点阵。这些硅烷分子之间的距离决定了探针集合的密度，使得阵列可以在仅有1.28平方厘米的面积内集成50万个以上的探针区域或特征组件。每个这样的特征组件可包含数百万个相同的DNA分子。硅烷薄膜为启动探针组装提供了均匀的羟基密度。附着到硅烷点阵上的连接分子提供了可被光空间激活的表面。
探针合成可以平行进行，使得A、C、T或G核苷酸可同时添加至多条正在延伸的链。为确定每一步中哪条寡核苷酸链将再加上一个核苷酸，将带有与个别特征组件的大小相对应的18至20平方微米的窗口的光刻掩模置于被包被的片层上。窗口在掩模上的分布是基于每个探针所需的序列。在合成的第一步中，当紫外光照在掩模上时，暴露的连接物被脱去保护并可被核苷酸偶联。
在所需的特征组件被激活时，使含有单一一种带有可脱去的保护基团的脱氧核苷酸的溶液流过片层表面。核苷酸连接到激活的连接物上从而启动合成过程。
虽然寡核苷酸序列的每一个位置上都可能出现4种核苷酸中的1种，从而导致表面上看每块片层需要25×4即100个不同的掩模，但是可以通过对合成过程进行设计而大大减少这一需求。通过调整个别探针的合成速度和确定同一掩模可多次使用的条件，有助于掩模使用数量最小化的算法可推测如何最好地协调探针生长。
不管所有的微阵列其预定用途是什么，选择和设计的一些关键要素在所有微阵列的生产过程中是共通的。例如优化探针杂交的策略就是探针选择过程中必须包括的因素。可以通过考虑解链温度和使用与所需杂交表现相关的经验性规律来优化具体pH、盐类和温度条件下的杂交。
为获得基因活性的完整图谱，从多个剪接变体或多腺苷酸变体共用的区域中选择了一些探针。在另一些情况下，优选能区分各种变体的独特的探针。探针间的距离也是选择过程的一个影响因素。
使用另一不同系列的策略来选择用于基因型阵列的探针，所述基因型阵列依赖于探测序列中个别核苷酸的多个探针。可以使用仅在靶标位置上不同的四种相同的探针(每一种探针含有四种可能碱基中的一种)推导出靶标碱基。
或者，可以用代表特定等位基因的一种或两种探针来检测是否存在共有序列。为对杂合或遗传混合样本进行基因分型，可制造具有多个探针的阵列以提供足够的信息来得到明确的基因型。此外，在一些应用中可使用属特异性探针(generic probe)以使得到最大的适用性。一些探针阵列例如可从复合混合物中分离个别的反应产物并对其进行分析，例如在一些实验手册中使用的用于鉴定单核苷酸多态性(SNP)的探针阵列。
在某些实例中，将所公开的基因或基因系列附着于微阵列，这些基因或基因系列在样本(例如外周血)中的表达与具体的神经变性疾病(例如阿尔茨海默病或帕金森病)相关。在某些实例中，例如芯片可被分为几个区段，每一区段含有诊断系列中的一个基因的不同区域和等位基因，芯片的另一区域中含有诊断系列中的另一个基因的不同区域和等位基因。在另一个实例中，芯片的每一区域都含有诊断系列中所有基因的所有等位基因和所有区域。这类实例可有多种变化方案，实例中包括使用所公开的神经变性疾病诊断性基因的所有亚类或任意亚类，应该理解的是，所公开的基因的任意区域，从3个碱基到全长序列，都可以作为用于固定的探针区域。另外也可以使用任何等位基因或变体。
(2)多变量单通道定量RT-PCR(multivariate single channelquantitative RT-PCR)
用于分析表达水平的一种特别有用的手段就是使用多变量单通道定量RT-PCR。这类方法公开于2001年11月30日提交的美国专利申请60/336,095、2002年7月19日提交的美国专利申请60/397,475、2002年12月2日提交的美国专利申请10/496,626、2001年3月12日提交的美国专利申请60/275,229和2002年3月12日提交的美国专利申请10/096,710，这些文献中至少是关于与多变量单通道定量RT-PCR有关的方法和组合物的内容以援引的方式纳入本文。简而言之，该方法应用了基于PCR的高通量方法从而可同时分析多个基因的表达情况。例如在只能获得单个靶标核酸的情况下例如从一个靶细胞只能获得转录物的单拷贝时，该方法可使用微量的起始材料而达到单拷贝水平的效率。例如，要对4名受试者进行三个平行的20种转录物的分析，对每名受试者仅需要不到1μg的总RNA。所公开的方法可同时分析多个基因。所公开的方法以特定的方式使用基因特异引物。所公开的方法通过使用例如荧光探针的单一信号试剂，可以定量多个基因。
通常，该方法可用于获得在含有少至一个细胞的样本中的多个不同基因的表达的定量信息。由于公开的本方法是定量的，所以可实现各种不同细胞阶段或细胞类型之间表达模式在定量水平上的比较。通常可使用任何分离方法从目标样本中分离总RNA。然后可使用任何方法由该RNA产生第一链的DNA拷贝(cDNA)，所述任何方法为例如使用随机引物、寡脱氧胸苷酸引物或随机寡脱氧胸苷酸引物，所述随机寡脱氧胸苷酸引物是3’端偶联至一段囊括所有可能组合的特定短序列的寡脱氧胸苷酸引物，这样引物就在信使RNA(mRNA)的polyA部分和非polyA部分相连接的地方启动反应。然后将cDNA用作PCR反应中的模板。该PCR反应要使用引物对进行，所述引物对为特异性针对将被跟踪的被表达基因的正向和反向引物。该反应可包括所需多种不同引物对，但通常包括5至100对不同的引物，每对引物特异性针对一种基因或一种亚型(包括5至100的任一具体数目)。通常所有引物的摩尔浓度应大致相等。在进行了一定数目的PCR循环例如15个循环之后(此时DNA仍以约大于倍增速率的80％或85％或90％或95％扩增)，停止PCR。通常，如果在第一轮PCR中进行定量PCR(实时PCR)则达不到扩增的循环阈值。然而，如果扩增在循环阈值之后继续进行约不足9、8、7、6、5、4、3、2或1个循环，则某些实施方案中所公开的方法还是可用的。第一轮中的循环数目取决于起始材料的量。例如对单细胞的试验，可使用20个循环。然后将PCR反应物分配至用于第二轮(新一轮)PCR的新反应管中。每管中含有一部分前一次的PCR反应混合物，所述反应混合物含有由第一次PCR混合物中存在的所有特异性引物产生的所有产物。在含有一部分第一次PCR混合物的第二次PCR混合物中，除了带有分子信标(molecular beacon)的通用引物之外，通常只加入一个特异性引物对或加入一个新的引物对，然后进行PCR。通常按照定量实时PCR实验步骤进行该第二轮PCR，定量实时PCR实验例如基于PCR每一循环荧光的增加，荧光的增加是在通用引物(uniprimer)与DNA序列结合时由淬灭序列(quencher sequence)发出的荧光产生的(例如与一种扩增探针的一部分相杂交的探针)。在实时定量PCR中使用的荧光手段通常是基于例如SYBR green、FAM、荧光素、HEX、TET、TAMRA等的荧光报告染料和例如DABSYL、Black Hole等的淬灭剂。在PCR的延长期间中，当淬灭剂与探针分离时可以测量报告物的荧光。例如Molecular Beacon、Taqman Probe、ScorpionPrimer或Sunrise Primer的系统和其他系统使用这种手段进行实时定量PCR。有关实时探测的方法和试剂的实例可见于美国专利No.5,925,517、6,103,476、6,150,097和6,037,130，这些文献中至少与核酸检测方法和PCR方法有关的内容以援引的方式纳入本文。除了进行上述步骤之外，还应做出引物对(通常是对每种引物对)的标准曲线，以使得由第二轮PCR得到的数据可与目标样本中的最初起始材料的绝对拷贝数精确地相关，所述目标样本中含有例如一个或多个目标细胞。本文详细讨论了一般方法的每一步骤和试剂以及该方法变化方案。理解本公开方法的关键方面是第一次PCR和第二次PCR组的结合，其中所述第一次PCR在一批PCR混合物中含有多种不同的引物对，其中所有的目标基因产物或基因产物片段都被扩增；所述第二次PCR组中发生特异性扩增反应，其中使用特异的引物对扩增这一批PCR混合物的一部分。通常，通过参照对全部引物对或对每一个个别引物对做出的标准曲线而实现定量测定。
e)蛋白质的制备
在一些实例中，所公开的方法可包括一定水平的蛋白质或肽的制备。蛋白质或肽的制备步骤并不必须作为连续方法的一部分来进行，但是在某些方法中，需要制备蛋白质或肽以使得它可以例如按照本文公开的方法被分析。在理论上，蛋白质或肽的制备步骤的进行可与实际的分析步骤相距很远(例如在另一个实验室中、或者在很早的时间之前进行)，但是在许多实施方案中，例如电泳的蛋白质或肽的分离和制备与本方法的定量步骤在一起进行的，但这并不是必须的。
当所公开的方法包括蛋白质或肽的制备步骤时，制备蛋白质或肽的方法可为产生可分析蛋白质或肽的任何制备蛋白质或肽的方法。例如，相同的细胞可在“破裂缓冲液”(50mM Tris-HCl(pH6.8)、100mMDTT、100μg/ml PMSF、2％SDS、10％甘油、1μg/ml胃酶抑素A、1μg/ml亮肽酶素、1μg/ml抑肽酶和1M原钒酸钠)中裂解，并用22号针头剪切。样本的蛋白质含量可使用DC蛋白质分析(BioRad)来评估。可使用含10％SDS的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)来辨析蛋白质(10-20μg)。通常要测定所得的蛋白质或肽的量。
蛋白质或肽可从任何所需细胞或细胞类型和任何生物体中分离，所述生物体包括：例如小鼠、大鼠、兔、狗、猫、猴和人的哺乳动物；以及例如鱼或两栖类的非哺乳动物；以及植物；以及甚至例如细菌的原核生物。
f)蛋白质表达分析
在所公开的方法的某些实施方案中，可进行一种或多种蛋白质或肽的表达水平的评估。可以既进行蛋白质或肽的表达水平的评估又进行本文公开的核酸分析，或者用蛋白质或肽的表达水平的评估代替核酸分析。对样本中一种或多种蛋白质的表达水平的评估可通过本领域已知的各种技术进行。例如，表达水平的评估可包括通过下列手段分析一种或多种蛋白质：二维凝胶电泳、质谱(MS)、基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF)、表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱(SELDI-TOF)、高效液相色谱(HPLC)、快速蛋白液相色谱(FPLC)、多维液相色谱(LC)之后的串联质谱(MS/MS)、蛋白质芯片表达分析、基因芯片表达分析和激光密度测定，也包括这些技术的组合。在分析蛋白质表达水平的技术的另一个实例中，可以分析编码一种或多种特定蛋白质的mRNA的量。
在另一些技术中，可使用选择性结合蛋白质的抗体或其他试剂以检测样本中表达的该蛋白的量。例如，蛋白质的表达水平可使用包括但不限于下列的方法来测量：蛋白质印迹、免疫沉淀、酶联免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫(RIA)和荧光激活细胞分选(FACS)，或它们的组合。并且，可将特异性结合蛋白质的抗体、适体或其他配体固定于所谓的“蛋白质芯片”(蛋白质微阵列)上，并用于测量样本中蛋白质的表达水平。在其他方法中，可使用免疫荧光技术可视地评估样本中的蛋白质表达水平。免疫荧光技术中，将特异性结合蛋白质的抗体可视化，并在完整白细胞的细胞表面和/或在整个透化的白细胞间接地检测是否存在蛋白质。
本文中使用的术语“抗体”为广义的，包括单克隆抗体和多克隆抗体。术语“抗体”不仅包括完整的免疫球蛋白分子，还包括这些免疫球蛋白分子的片段或聚合物，以及免疫球蛋白分子的人源化形式及其片段。单克隆抗体包括“嵌合”抗体，“嵌合”抗体的重链和/或轻链的一部分与来源于某一特定物种的抗体的相应序列相同或同源，或属于某一特定抗体类别或亚类，而链的其余部分与来源于另一物种的抗体的相应序列相同或同源，或属于另一抗体类别或亚类；单克隆抗体还包括“嵌合”抗体的片段，只要它具有所需的抗性活性即可(参见美国专利No.4,816,567和Morrison，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1984；81：6851-6855)。
在一个实例中，可使用针对α-突触核蛋白(α-synuclein)或其构象异构体的抗体来鉴定α-突触核蛋白或其各种构象异构体的水平。具体而言，可使用针对天然α-突触核蛋白、多巴胺加成的α-突触核蛋白和寡α-突触核蛋白或α-突触核蛋白的聚集体的抗体。这些抗体和它们的制备与分离的方法公开于2005年7月19日提交的、申请人为Federoff等人的、题目为“α-突触核蛋白抗体及其相关方法”(“A-Synuclein Antibodies and Methods Related Thereto”)的美国专利申请中。
也可以使用选择性结合蛋白质的非抗体配体来检测是否存在蛋白质和/或定量检测其表达水平。例如，配体可被荧光标记(例如与例如绿色荧光蛋白(GFP)的荧光分子缀合)，或者配体可被放射性标记。可将被标记配体与样本接触，并评估被标记配体与蛋白质的结合。与样本中的蛋白质结合的被标记配体的量是样本中存在的特定蛋白的量的指标。当蛋白为细胞表面分子时，可将蛋白质配体与完整的细胞样本相接触，以检测细胞表面的蛋白质表达水平。或者，可通过透化或裂解细胞而破坏样本中白细胞的完整性，然后评估与裂解白细胞样本中的蛋白质结合的被标记配体的量。
标记可以直接地或间接地与抗体或非抗体配体相连接。直接标记包括例如将标记直接连接到抗体或非抗体配体上。间接标记包括例如将标记连接到第二抗体或第三抗体或非抗体配体上。
蛋白质表达水平在基因水平上被调节时，可以通过检测编码该蛋白质的基因的表达水平来间接监测蛋白质的表达水平。可用的适于检测和/或定量测量基因表达的方法包括但不限于：RNA印迹、RNA酶保护分析、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和基因芯片(例如核苷酸表达微阵列)技术。
任选地，可同时或几乎同时地测定多种蛋白质的表达水平。例如，可使用二维(2D)凝胶电泳来同时或几乎同时地评估样本中几千种蛋白的表达水平(参见例如Vietor and Huber，Biochim.Biophys.Acta.，1997；1359：187-99，该文献中至少评估蛋白质表达水平的方法的教导以援引的方式纳入本文)。在一方面，所公开的方法可包括2D凝胶电泳，其中来自样本的蛋白质混合物可通过例如裂解白细胞和用样本缓冲液混合蛋白质裂解物制备。可将蛋白质裂解物上样至凝胶板上，在两个维度进行电泳，然后干燥凝胶板。在通过2D电泳解析以后，可以评估个别蛋白质或蛋白质组的表达水平。可通过银染法或考马斯亮蓝染色法评估蛋白质水平。如果样本中的蛋白质是被标记的，则可通过测量标记的量来评估蛋白质的量。
g)基因产物的表达水平和典型变量
如本文所公开的那样，可以任何方式对如下基因即生物标记的表达水平进行检测：目标基因、本文公开的与具体神经变性疾病(例如帕金森病和阿尔茨海默病)相关的基因以及特别是在患病受试者的样本(例如血液)中与神经变性疾病是否存在相关的那些基因。在一些实例中，通常需要检测核酸(例如转录物)。在另一些实例中，通常需要检测蛋白质。有许多用于检测基因产物的手段，例如放射性或荧光方法或本文公开的任何其他方法。可以使用任何手段。
通常，采集到的任何数据都可以根据细胞中总的表达水平进行标准化。这可通过多种途径进行，例如通过将所有的转录物与在所有细胞中都存在的β-肌动蛋白的表达相比较。其他标准化方法可基于不是关于任何单个基因表达的手段。对于定量PCR，对每个所分析的信息可以得到一条标准曲线。这些标准曲线就成为产生绝对拷贝数的基础。内部对照物包括但不限于：β-肌动蛋白、GAPDH、微管蛋白等，外部对照物例如但不限于：细胞质或核LacZ、agamous或已知的在每次杂交中掺入的被标记cRNA。使用生物芯片手段，也可以通过将目的样本对总体阵列背景进行平均而得到标准化数据。
在某些与杂交相关的实例中，可以有增加读数特异性的脱膜(stripping)和再杂交(reprobing)步骤。例如，样本可对于T7启动子进行脱膜和再杂交。
通常，在获得某种基因产物或某个系列基因产物的表达模式后，必须分析表达模式。分析通常包括对基因或基因系列本身之间的相对表达水平进行某些类型的统计学分析，并将其与对照或标准基因或基因系列进行比较。本文公开了这类分析方法。
在一个实例中，可对生物标记(例如核酸或蛋白质基因产物)的表达水平进行单变量和/或多变量典型分析，以产生第一和/或第二典型变量。单变量检验可为公知的T-检验或N-检验。一种适用于本发明的N-检验公开于http://www.urmc.roches ter.edu/smd/biostat/people/techreports.html中的技术报告04/01中，该报告中至少关于N-检验统计学分析的教导以援引的方式纳入本文。
有多种多变量分析的方法。这些方法中任何一种都可以应用。在一个实例中，可使用市售的软件进行多变量分析，例如SAS Institute，Inc.公司(Cary，NC)出售的SAS/STAT软件。例如可以使用典型分析和主成分分析。这两种分析都使用数据的分析矩阵方法。通常典型变量由第一典型变量和第二典型变量组成。多变量分析实质上为对多次检验推导的非参数检验。这类多变量统计学检验依赖于典型判别分析。该分析确定可最明显地区分各组的变量(信息)，并为每个变量分配权重。第一典型变量通常能最明显地区分各组。第二典型变量对第一典型变量未考虑的剩余的变量进行操作。其它重复可能效果逐渐减少。
典型判别分析与在定量变量和一系列由类别变量编码的虚拟变量之间进行的典型相关分析是等价的。在下面的说明中，可用y表示虚拟变量，用x表示定量变量。对于x变量和y变量的总样本协方差阵为：
Figure A20058003140600371
当c为组数、nt为t组中的观测数、且St为在t组中对x变量的样本协方差阵时，对x变量的合并类内协方差阵为：
S p = 1 &Sigma; n t - c &Sigma; ( n t - 1 ) S t
典型相关系数pi是下面矩阵的本征值λi的平方根。对应的本征向量为Vi。
Spi -1/2SxySyy -1SyxSp -1/2
设V为具有本征向量Vi的矩阵，Vi对应于列的非零本征值，则未标准化的原始变量的典型系数可按下式计算。
R＝Sp -1/2V
合并类内标准化典型系数为：
P＝diag(Sp)1/2R
总样本标准化典型系数为：
T＝diag(Sxx)1/2R
它可通过下式中任何一个计算：
XcR
Xcdiag(Sp)1/2P
Xcdiag(Sxx)1/2T
对于基于E-1H的多变量分析，其中n为总观测数。
E＝(n-1)(Syy-SyxSxx -1Sxy)
H＝(n-1)SyxSxx -1Sxy
上述的多变量分析可如上所述地使用市售软件进行，例如SASInstitute，Inc.公司(Cary，NC)出售的SAS/STAT软件。在本文公开的方法中，可将一系列基因产物得到的表达水平输入这类程序中。基因产物的系列可为任何基因系列，例如本文公开的系列。在一些实例中，一系列基因产物可对应一个或一组对照样本，另一系列基因产物可对应一个或一组患病的样本。基因产物的水平可用含量或浓度的绝对值或相对值输入。水平还可为来自基因产物的放射性分析或荧光分析的信号强度。注意多变量分析的结果为第一和/或第二典型变量。
如本文公开的那样，由多变量分析产生的该第一和/或第二典型变量代替生物标记的表达水平用于所公开的方法，或与生物标记的表达水平一起用于所公开的方法。换言之，在本文公开的一些实例中，通过对来自受试者的一种或多种生物标记的表达水平的分析而得到的第一和/或第二典型变量，可与参照标准相比较，所述参照标准包括通过对来自一个或一组对照受试者的生物标记的表达水平的多变量典型分析而得到的第一和/或第二典型变量。
例如，如本文所示，使用多变量典型分析进行阿尔茨海默病的诊断。例如，当使用与炎症相关的基因时，对第一典型变量的对照值的范围可为约-0.5至约-3.1，对AD的范围可为约0至+4.4。对于与细胞应激相关的基因，对第一典型变量的对照值的范围可为约-4.8至约-0.1，对AD的范围可为约+0.1至约+4.1。对于与细胞周期/细胞死亡相关的基因，对第一典型变量的对照值的范围可为约+2.6至约-3.1，对AD的范围可为约+3.0至约-2.3。虽然有一些重叠，但是这三类基因产物的每一类都可以区分AD和对照，区分的程度都达到了Wald-Wolfowitz游程检验的统计学显著程度。从AD和对照的重叠来看，细胞周期/细胞死亡组的重叠最大，炎症组有一例重叠，细胞应激组显示没有重叠。
应当注意，多变量分析的结果理所应当地依赖于具体的输入值(例如具体的基因产物、这些基因产物的具体水平和具体的样本系列)。因此，加入其他基因或用其他基因代替或应用于不同的疾病都会改变典型变量的范围。这通过图4和图5中的比较来说明，其中对于细胞应激的第一典型变量在图4和图5中不同，这是由于图5在对照中包括两例PD患者。正如本领域技术人员能认识到的那样，虽然第一和/或第二典型变量的具体值是可变的，但是还是可以区分出疾病的(例如图5中所说明的那样)。
2.信息分类
所公开的组合物和方法的核心是对某些信息的分析，这些信息与例如帕金森病和阿尔茨海默病的神经变性疾病相关。在某些实施方案中，这些信息可为单一的信息，但是通常会分析一类或一系列的信息，因为它们与该类或该系列中包括的任何一个基因本身相比，都能够提供更准确的评估。表4示出了可用于分析的示例性靶标。同时分析多种基因产物(mRNA或蛋白质)，可使得例如帕金森病或阿尔茨海默病的神经变性疾病被诊断出来。
例如，可用于诊断例如阿尔茨海默病的神经变性疾病的一类基因是一类细胞周期转录物。它们可包括例如细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白G1、wee1、hTR2、CDC25b、GSK3β和蛋白激酶Cα。
在另一个实例中，可用于诊断例如阿尔茨海默病的神经变性疾病的一类基因是一类炎性反应转录物。它们可包括例如C5、C1抑制剂、IL-17r、IL-8、LIF、TNF-α和IL-10r。
在又一个实例中，可用于诊断例如阿尔茨海默病的神经变性疾病的一类基因是一类细胞应激转录物。它们可包括例如α-1抗胰凝乳蛋白酶、HSP27、HSP90、晶体蛋白、GAPDH、铁蛋白H、铁蛋白L、cox1、cox2和转铁蛋白。
在再一个实例中，可以使用细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白G1、wee1、hTR2、CDC25b、GSK3β、蛋白激酶Cα、C5、C1抑制剂、IL-17r、IL-8、LIF、TNF-α、IL-10r、α-1抗胰凝乳蛋白酶、HSP27、HSP90、晶体蛋白、GAPDH、铁蛋白H、铁蛋白L、cox1、cox2和转铁蛋白的任何组合或亚群。
在其它实例中，可使用本领域技术人员已知的与细胞周期/死亡、炎症和应激相关的其他基因。
在另一个实例中，可用于诊断例如帕金森病的神经变性疾病的一类基因包括：例如HSP60、二氢硫辛酰胺脱氢酶、ER-60蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、ATP-合成酶β链、膜联蛋白I、14-3-3ε、抑制素(Prohibitin)、磷酸甘油酸变位酶1、载脂蛋白AI、超氧化物歧化酶、RNA-结合蛋白调节亚基、A链硫氧还蛋白过氧化物酶B、RAS相关蛋白RAP1B、肿瘤排斥抗原、触珠蛋白、纤维蛋白β、肌动蛋白-相互作用蛋白1(AIP1)、有丝分裂原活化蛋白激酶I(MAPKI)、肌动蛋白或其片段、戊二醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、转化蛋白RhoA、酸性富含亮氨酸的核磷蛋白32家族成员B(acidic leucine-rich nuclearphosphoprotein 32 family member B，ANP32B或APRIL)、过氧化物氧还蛋白II、淀粉状前体蛋白(APP)、α-分泌酶、β-分泌酶、γ-分泌酶、Aβ肽、Fe65、Tip60、SERCA、PS1/2、结合素-1a和老年斑的非淀粉状蛋白β组分(NACP/a-突触核蛋白)。
在一系列或一类中可有任意数目的基因产物。例如，在一系列或一类中可有至少2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，35，40，45，50，75或100种不同的基因或基因产物。此外，应当理解的是，某种特定基因的多个等位基因也可以成为一个系列。在某些实施方案中，可将一系列转录物中的7种或8种基因用于分析。
在某些实施方案中，可将一个基因用于分析，例如与α-1抗胰凝乳蛋白酶、晶体蛋白和环加氧酶II相关的基因产物。
表4：可用于分析的例如阿尔茨海默病和帕金森病的神经变性疾病的示例性靶标。虽然有些靶标可能具有影响除了所鉴定的细胞过程之外的各种细胞过程的功能，还是提供了这些靶标的总体分类。
序列号SEQ ID NO： 基因名称 NCBI编号 功能 注释 分类
1 α1-ACT J05176 α-1-抗胰凝乳蛋白酶mRNA 炎症/细胞周期/应激
2 α1-ACT T40002 α-1-抗胰凝乳蛋白酶前体mRNA cDNA克 炎症/细胞
隆 周期/应激
3 GAPDH M17851 在催化中激活巯基 代谢作用
4 CREB M34356 cAMP反应元件结合蛋白 转录因子
5 GFAP J04569 在CNS发育中区别星形细胞和其他胶质细胞的细胞特异性标记 星形细胞标记
6 Nestin X65964 在末梢神经发育过程中分化，nestin被下调并被神经纤维替代 DNA 早期神经元标记
7 PS1/S182 AF416717 参与APP和NOTCH的蛋白水解过程，调节上皮钙粘蛋白的功能 蛋白水解酶
8 HSP27 NM_001540 参与应激抵抗和肌动蛋白形成 应激
9 HSP90-α NM_005348 分子伴侣，由于相似性具有ATP酶活性 应激
10 HSP90-β NM_007355 分子伴侣，由于相似性具有ATP酶活性 应激
11 NF-M Y00067 含有参与维持神经管(neuronalcaliber)的中间纤维蛋白N、M和H DNA 神经元结构
12 NF-L X05608 含有参与维持神经管(neuronalcaliber)的中间纤维蛋白N、M和H 不完整编码区，DNA 神经元结构
13 C-jun AY217548 转录因子AP-1 DNA 转录因子
Tuber in/549和Tuberin/4B2 对列出的这两种tuber in，见下述的TSC1和TSC2： 细胞周期/死亡
14 TSC2 X75621 结节性硬化2蛋白：似乎为肿瘤抑制剂，可能在小泡运输中起作用，还可能细胞生长停滞的调节和类固醇受体介导的转录的调节中起作用，hamartin和tuberin之间的相互作用可能促进小泡驻留，特异性激活Ras相关蛋白RAP1A和RAB5的内生性GTP酶的活性，表明了在调节细胞生长中起作用的可能机制，tuberin的突变导致RAP1A在肿瘤中的组成性活化 mRNA，不完整编码区 细胞周期/死亡
15 TSC1 NM_000368 Hamartin，结节性硬化蛋白1，似乎为肿瘤抑制剂，可能在小泡运输中起作用，hamartin和tuberin之间的相互作用可能促进小泡驻留 细胞周期/死亡
16 IAP homoB NM_001166 细胞凋亡抑制剂 细胞周期/死亡
17 驱动蛋白轻链1 NM_182923 可能在细胞器转运中起作用 分子马达
18 驱动蛋白轻链2 NM_022822 Force producing蛋白，可能在细胞器转运中起作用 克隆 分子马达
19 铁蛋白L NM_000146 胞内分子，以无毒、可溶、易得的方式储存铁。 应激和炎症/ROS(活性氧簇)
20 铁蛋白H NM_002032 功能性分子，在其中心腔内有接近球形的多聚体三价铁核心 应激和炎症/ROS
21 SOD-1 NM_000454 破坏细胞内正常产生并且对生物系统有毒性的自由基 应激和炎症
22 α微管蛋白 NM_006082 微管的主要组成成分 细胞结构
23 Bc1-2 M13995 在多种细胞系统中抑制凋亡，通过控制线粒体膜的透性调节细胞死亡，似乎在半胱天冬酶的反馈回路中起作用，抑制半胱天冬酶活性 细胞死亡
24 ICE-re1-II U28014 激活级联反应/凋亡的执行，切割半胱天冬酶I 细胞死亡
25 IL1BCE M87507 白细胞介素(Interleulin)1β转化酶，硫基蛋白酶在ASP和ALA之间切割IL-1β，释放参与多种炎性过程的成熟细胞因子，被牛痘病毒CRMA蛋白特异性地抑制。 细胞死亡/炎症
26 BAK NM_001188 通过结合/拮抗A抑制剂BCL1-2或其腺病毒同系物E1B19K蛋白来加速程序性细胞死亡 细胞死亡
27 Bf1-1 NM_004049 延缓由IL-3脱离诱导的凋亡 细胞死亡
28 RAN TC4 NM_006325 GTP结合核蛋白RAN，参与核与质的转运，为在蛋白质入核和RNA出核过程所必需 应激
29 Ras-L，TC25 XM_171081 调节细胞反应 应激
30 Cdk4 AF507942 参与细胞周期的控制，细胞分裂蛋白激酶4 DNA
31 细胞周期蛋白B1 P14635 在G2/M过渡期中控制细胞周期 仅有克隆 细胞周期/死亡
32 细胞周期蛋白G1 NM_004060 在生长调节中起作用，与DNA损伤引起的G2/M期停滞相关 细胞周期/死亡
33 细胞周期蛋白H NM_001239 调节CDK7，参与细胞周期控制和RNA聚合酶II参与的RNA转录 细胞周期/死亡
34 细胞周期蛋白A1 NM_003914 可能在G1/S和G2/M过渡期参与细胞周期 细胞周期/死亡
35 细胞周期蛋白A2 AF518006 在细胞周期G1/S和G2/M过渡期起关键作用 DNA 细胞周期/死亡
36 细胞周期蛋白E1 AF518727 在G1/S过渡期中控制细胞周期 DNA 细胞周期/死亡
37 细胞周期蛋白E2 AF106690 在细胞周期的G1后期和S期早期起关键控制作用 细胞周期/死亡
38 细胞周期蛋白G2 NM_004354 在生长调节中起作用，反向调节细胞周期进程 细胞周期/死亡
39 细胞周期蛋白D1 NM_053056 在细胞周期G1/S过渡期中起关键控制作用 细胞周期/死亡
40 HSP70 M11717 完整的人类热休克蛋白(hsp70)基因 DNA 应激
41 HS71 NM_005345 热休克70kDa蛋白1，与其他分子伴侣合作，HSP70S使现有蛋白稳定化而防止聚集，并介导新翻译出的多肽的折叠，HSP70S在线粒体和内质网中提供蛋白易位的驱动力，参与HSP90的信号转导途径 应激
42 HS72 NM_021979 热休克相关的70kDa蛋白2，HSP70S使现有蛋白稳定化而防止聚集，并介导新翻译出的多肽的折叠 应激
43 HS74 NM_002154 热休克70kDa蛋白4 应激
44 HS76 X51757 热休克70kDa蛋白6 DNA 应激
45 HS77 M11236 热休克70kDa蛋白(片段) DNA，基因区段 应激
46 c-fos K00650 调节被指定形成和维持骨骼的细胞的发育，被认为在信号转导、细胞增殖和分化中起作用 DNA 细胞周期/死亡
47 Weel X62048 可能是细胞进入G2/M过渡期的负调节子 细胞周期/死亡
48 Fral X16707 Fos相关抗原1 DNA 细胞周期/死亡
49 Hesl AF264785 转录中需要BHLH蛋白的基因的转录阻遏物，可能是肌形成的负调节子 转录因子
晶体蛋白 见下述的16个CR基因 应激炎症
50 CRAA NM_000394 α晶体蛋白A链，可能对晶状体的透明度和折射指数有贡献 应激炎症
51 CRAB NM_001885 Rosentha1纤维蛋白，α晶体蛋白B链，可能对晶状体的透明度和折射指数有贡献-Acc#M24906-CRAB 应激炎症
52 CRAC NM_014365 α晶体蛋白C链，蛋白激酶H11 应激炎症
53 CRB1 U35340 β晶体蛋白B1，脊椎动物眼晶状体的主要结构组分 应激炎症
54 CRB2 NM_000496 β晶体蛋白B2，脊椎动物眼晶状体的主要结构组分 应激炎症
55 CRB3 P26998 β晶体蛋白B3，脊椎动物眼晶状体的主要结构组分 应激炎症
56 CRBA P05813 β晶体蛋白A3，脊椎动物眼晶状体的主要结构组分 应激炎症
57 CRBB AF166331 β晶体蛋白A2，脊椎动物眼晶状体的主要结构组分 应激炎症
58 CRBD NM_001886 β晶体蛋白A4，脊椎动物眼晶状体的主要结构组分 应激炎症
59 CRBS NM_017541 β晶体蛋白S，γ晶体蛋白S，脊椎动物眼晶状体的主要结构组分 应激炎症
60 CRGA P11844 γ晶体蛋白A，γ晶体蛋白5，脊椎动物眼晶状体的主要结构组分 应激炎症
61 CRGB M19364 γ晶体蛋白B，脊椎动物眼晶状体的主要结构组分 DNA 应激炎症
62 CRGC NM_020989 γ晶体蛋白C，脊椎动物眼晶状体的主要结构组分 应激炎症
63 CRDG NM_006891 γ晶体蛋白D，脊椎动物眼晶状体的主要结构组分 应激炎症
64 CRYL NM_015974 λ晶体蛋白的同系物， 应激炎症
65 CRYM NM_001888 μ晶体蛋白的同系物，结合甲状腺激素，推断它参与调节三碘甲状腺原氨酸的胞内游离浓度及其与其核受体的接近，在神经组织、肌肉和肾中表达 应激炎症
66 Cdc2 AF512554 高级细胞进入S期和有丝分裂所必需 DNA 细胞周期/死亡
67 hTR2-11 M29960 人类类固醇受体 未知
68 突触结合蛋白 NM_005639 在突触活跃区域的突触小泡运输过程中的膜相互作用中起调节作用 突触
69 AP180 AB014556 相信与膜蛋白的胞质尾端相互作用 突触
70 BDNF M61176 促进位于CNS中的神经群或直接连接的神经群的存活 细胞死亡
71 bc1-x1 U72398 细胞死亡的强抑制剂 DNA 细胞死亡
72 bc1-2 P10415 抑制凋亡，调节细胞死亡，抑制半胱天冬酶活性 细胞死亡
73 钙结合蛋白D2 X06661 缓冲胞质溶胶中的钙 炎症/细胞周期/死亡
74 SOD-1 NM_000454 破坏正常产生并且有毒性的自由基 应激/细胞死亡
75 谷氧还蛋白 NM_002064 还原低分子量二硫键和抵御ROS的蛋白 应激/炎症
76 驱动蛋白H X65873 微管相关force-producing蛋白，可能在细胞器转运中起作用 不完整编码区 分子马达
77 PKC-typeβII X07109 βI型 细胞周期/死亡
78 Rit U71203 Ras家族小GTP结合蛋白RIT 细胞增殖
79 Rin U71204 见下述的3个Rin基因 细胞死亡
80 Rinl L36463 Ras效应蛋白，可能为在恶性记忆形成过程中神经塑性的抑制调制剂 细胞死亡
81 Rin2 NM_018993 Ras效应蛋白，可能起RAB5B的上游激活剂和/或下游效应物作用，可能起RAB5B的鸟嘌呤核苷酸交换(GEF)作用 细胞死亡
82 Rin3 AL159141 潜在的Ras效应蛋白，可能起鸟嘌呤核苷酸交换(GEF)作用 细胞死亡
83 蛋白酪氨酸激酶 D50479 酪氨酸蛋白激酶受体，特别是在中枢神经系统中可能参与细胞粘合过程 细胞死亡
84 NAIP NM_004536 阻止运动神经元凋亡 细胞死亡
85 NMDA Rec(zetal) L13266 在突触塑性、突触形成、兴奋性中毒、记忆获取和学习中起关键作用，在谷氨酸神经传递中介导神经功能 突触
86 α肌动蛋白 J05192 人类α-肌动蛋白(ACTA)的mRNA的完整编码区 细胞结构
87 β肌动蛋白 X00351 参与多种类型的细胞运动 DNA 细胞结构
88 拓扑异构酶I NM_003286 导致DNA的一种拓扑异构体转变为另一种 细胞周期/死亡
89 拓扑异构酶II NM_001067 使双链断开，使DNA链暂时断开然后重新连接 细胞周期/死亡
CDK4抑制剂p16 见下述的三种CDK 细胞周期/死亡
90 CDKN2 L27211 细胞周期蛋白依赖性激酶4抑制剂A，p16INK4，与CDK4和CDK6强烈相互作用，抑制其与细胞周期蛋白D的作用能力，可作为正常细胞增殖的负调节子 细胞周期/死亡
91 CDKN2B U17075 细胞周期蛋白依赖性激酶4抑制剂B，与CDK4和CDK6强烈相互作用，强抑制剂，TBF-β诱导的细胞周期停滞的潜在效应物 细胞周期/死亡
92 CDKN2D U49399 细胞周期蛋白依赖性激酶4抑制剂D，与CDK4和CDK6强烈相互作用 细胞周期/死亡
93 锚蛋白2，脑 Z26634 使整个膜蛋白与细胞骨架元件相接，也结合细胞骨架蛋白 不完整 细胞结构
94 锚蛋白1，红细胞 M28880 使整个膜蛋白与细胞骨架元件相接，也结合细胞骨架蛋白 细胞结构
95 PIG3 AF010309 细胞死亡
96 BaxA L22473 促进细胞程序性死亡，膜异构体α 细胞死亡
97 BaxB L22474 促进细胞程序性死亡，膜异构体β 细胞死亡
Clq 见下述的三种C1Q基因 炎症
98 C1QA NM_015991 补体Clq亚组分A链(前体)；与辅酶C1R和C1S结合以产生血清补体系统的第一组分C1 炎症
99 C1QB X03084 补体Clq亚组分B链(前体)；与辅酶C1R和C1S结合以产生血清补体系统的第一组分C1 不完整编码区 炎症
100 C1QC NM_172369 补体Clq亚组分C链(前体) 克隆 炎症
101 C1RF NM_006688 C1Q相关因子 炎症
102 SF2Flag NM_006924 剪接因子，富含精氨酸/丝氨酸1，前mRNA剪接因子SF2，P33亚基，在外显子跳跃中起作用 剪接因子
103 MCIF AF273052 CTCL肿瘤抗原se70-2 细胞死亡
104 APP1 NM_005166 可能在突触后功能中起作用，可调节轴突过度生长 细胞死亡
105 APP2 NM_001642 可能在止血调节中起作用，可能对凝血因子有抑制性，可能与G-蛋白信号途径相互作用 细胞器运输
106 突触素 P08247 可能以组织其他膜组分的方式参与结构功能，或参与小泡向质膜的靶向 突触
107 Tau J03778 促进微管组装和稳定性 细胞结构
108 组织蛋白酶D NM_001909 细胞内蛋白裂解中有酸性蛋白酶活性，参与例如乳腺癌和阿尔茨海默病的发病机理 应激
109 GAP43 NM_002045 与神经生长相关 细胞生长
110 pGTH4 J03817 谷胱甘肽S-转移酶Mu1，使还原型谷胱甘肽与多种外源性和内源性疏水性亲电体相缀合 应激/细胞死亡
111 pHMGST J03746 微粒体谷胱甘肽S-转移酶1，使还原型谷胱甘肽与多种外源性和内源性疏水性亲电体相缀合，有广泛底物特异性 应激/细胞死亡
112 Tra2-C2 U61267 富含精氨酸/丝氨酸剪接因子10，序列特异性RNA结合蛋白，参与前mRNA剪接的控制 剪接因子
113 MCD-C2 NM_012470 Transpor in-SR 未知
114 泛蛋白 XM_055013 参与蛋白的ATP依赖性选择性降解，维持染色质结构，调节基因表达，应激反应，核糖体的生源 应激/细胞死亡
115 Pht6 AB011149 推定前mRNA剪接因子RNA螺旋酶，可能的参与前mRNA剪接的ATP结合RNA螺旋酶 剪接因子
116 pGHT1 P11166 加速的葡萄糖转运体，1型葡萄糖转运体，红细胞/脑 应激/细胞死亡
117 CR3 AF251550 表皮生长因子样cripto蛋白CR3 DNA 应激/炎症
118 CR3α链 NM_000632 参与单核细胞、巨噬细胞和粒细胞的多种粘合相互作用，还介导补体包被颗粒的摄 应激/炎症
取
119 C5 NM_001735 补体C5前体 应激/炎症
线粒体基因 见如下列表：
120 MPR-S12 015235 构成12S rRNA和30种不同蛋白的线粒体核糖体小单元的组分 细胞能量
121 MRP-16 NM_016065 28S核糖体蛋白S16。人类线粒体核糖体蛋白S16(MRPS16)编码线粒体蛋白的核基因，mRNA 细胞能量
122 CO I D38112 细胞色素C氧化酶多肽I，人类线粒体DNA，16559bp，催化氧还原成水的呼吸链的组分。细胞色素C是形成酶复合物功能性核心的1-3亚基 DNA 细胞能量
123 COII M90100 细胞色素C氧化酶多肽II，1-3亚基形成酶复合物的功能性核心，人类环氧合酶(Cox-2)mRNA的完整编码区 细胞能量
124 COIII J01415 细胞色素C氧化酶多肽III，1-3亚基形成酶复合物的功能性核心。人类线粒体完整基因组，16569bp，DNA环状PRI DNA 细胞能量
125 V00662 人类线粒体基因组，16569bp，DNA环状PRI线粒体基因包括：12S、16S核糖体RNA，22tRNA，ATP酶亚基68，(NADH脱氢酶亚基1、2、3、4、4L、5、6)，细胞色素b、(细胞色素c氧化酶亚基I、II、III)(转运RNA：Arg、Ala、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val) DNA 细胞能量
126 补体因子D NM_001928 补体因子D前体。因子D在因子B与因子C3B复合时切割因子B，激活C3BBB复合物，使其变成替代途径的C3转化酶 应激/炎症/死亡
127 C1抑制剂 M13656 在C1抑制剂的控制下激活C1复合物；可能在生理途径中起重要作用 应激/炎症/死亡
128 丛生蛋白 NM_001831 功能还不清楚，与细胞程序性死亡相关 应激/炎症/死亡
129 因子1 NM_000204 补体因子1前体，在辅因子C4结合蛋白和H因子分别存在的情况下负责切割C4B和C3B的α链 应激/炎症
130 S蛋白 NM_001264 在皮肤中表达
131 C3a过敏毒素 NM_000064 在补体系统的激活中起核心作用 应激/炎症/死亡
132 C5a过敏毒素 NM_001735 C5转化酶对C5的激活可启动后期补体组分C5-C9自发组装至膜攻击复合物中 应激/炎症/死亡
133 1型补体受体 Y00816 介导颗粒与已激活补体的免疫复合物的细胞结合 应激/炎症/死亡
134 2型补体受体 NM_001877 补体3CDd的受体，以及在人类B细胞和T细胞上爱泼斯坦-巴尔病毒的受体，参与B淋巴细胞的激活 应激/炎症/死亡
135 COX1 M59979 可能在调节或促进细胞增殖方面起重要作用 应激/炎症
136 COXII NM_000963 前列腺素G/H合成酶2前体，可以炎症的主要介导物起作用和/或在活性依赖塑性的类前列腺素信号中起作用 应激/炎症
小鼠ATP特异性琥珀酰辅酶A合成酶：见下列：
137 Q9P2R7 三羧酸循环的磷酸化 细胞能量
138 白细胞介素I受体 NM_000877 白细胞介素-I受体，I型前体，IL-1A、IL-1B、IL-1RA的受体 应激/炎症
139 基础转录因子SP4 Q02446 转录因子
140 白细胞介素17受体 NM_014339 白细胞介素-17受体前体 应激/炎症
141 白细胞介素8 NM_000584 趋化因子吸引嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和T细胞；参与嗜中性粒细胞的激活和在炎症刺激下的释放 应激/炎症
142 白细胞介素15 U14407 促进T淋巴细胞的增殖 应激/炎症
143 白细胞介素15受体 U31628 白细胞介素15受体α链前体 应激/炎症
144 白细胞介素16 AF053412 促进CD4+淋巴细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞的迁移反应；诱导白细胞介素2受体在T淋巴细胞的表达；CD4的配体 应激/炎症
145 白细胞介素10受体α NM_001558 IL-10的受体；以高亲和力结合IL-10 应激/炎症
146 白细胞介素10受体β Z17227 IL-10和IL-22的受体，作为活性IL-10受体复合物十分关键的副链，并起动IL-10诱导的信号转导活动 应激/炎症
147 LIF NM_002309 白血病抑制因子，前体，具有诱导白血病细胞终末分化的能力 应激/炎症
148 TNF-α M10988 能诱导某种肿瘤细胞系的细胞死亡；强热原；在某种条件下可促进细胞增殖；诱导细胞分化 炎症/死亡
149 TGF-β1 NM_000660 控制增殖和分化；调节多种其它生长因子的活动 生长因子
150 白细胞介素12α链 NM_000882 可作为活化的T细胞和NK细胞的生长因子 应激/炎症
151 TNF-R2 NM_001066 TNFSF2/TNF-α的高亲和力受体，TRAF1/TRAF2复合物募集凋亡抑制剂 细胞死亡
152 破骨细胞发生抑制因子 NM_002546 肿瘤坏死因子受体家族超家族成员11B(前体)，作为RANKL的诱饵受体，由此抵消其在破骨细胞发生中的功能，抑制破骨细胞的激活和在体内促进破骨细胞的凋亡 细胞死亡
153 内皮缩血管肽-2 NM_001956 内皮产生的血管收缩肽 血管收缩
154 内皮缩血管肽-3 NM_000114 内皮产生的血管收缩肽 血管收缩
155 内皮缩血管肽受体 M74921 内皮缩血管肽1、2和3的非特异性受体 细胞死亡
156 CCR5 X68149 与BLC结合的细胞因子受体 mRNA，不完整编码区 应激/炎症
157 人类染色体17序列 AC005837 人类染色体17序列，克隆hRPK.318_A_15，完整序列
158 人类染色体22序列 AL022312 对染色体22q12.3-13.1的克隆RP5-1104E15的人类DNA序列，含有甘露糖基(β-1，4-)-糖蛋白β-1，4-N-乙酰葡糖氨基转移酶的MGAT3基因，用于预测蛋白的基因，激活转录因子4(tax反应增强元件B67)的ATF4基因，电压依赖性钙通道的CACNA1I基因的5’端，αII亚基，含有EST、STS、GSS和5个推测的CpG岛，完整序列 细胞能量
159 CD45 Y00062 通过抗原受体激活T细胞的过程所必需 mRNA，不完整编码区 应激/炎症
160 IIC型FcγR U90938 低亲和力免疫球蛋白γFc区受体II-C前体；参与多种效应物和调节功能，例如免疫复合物的胞吞作用和B细胞产生抗体的调节 应激/细胞死亡
161 LOX-1或OLR-1 NM_002543 应激/细胞死亡
162 LRP-1 NM_002332 参与乳糜微粒残留物和激活的α2-巨球蛋白的血浆清除，还参与血纤蛋白溶解酶原激活剂及其内源性抑制剂的复合物的局部代谢 炎症
163 MRP(8) Y00278 在慢性炎症中由巨噬细胞表达，囊性纤维化病抗原，钙粒蛋白A mRNA不完整编码区 炎症
164 Q9BX80al so： AF352582 ATP结合盒式转运体MRP8 细胞能量
165 B2-微球蛋白 NM_004048 I类主要组织相容性复合物分子的β链 炎症
166 ENA-78 U12709 参与嗜中性粒细胞的激活 DNA 炎症
167 CD74 NM_004355 在II类MHC抗原过程中起关键作用 炎症
168 核糖体蛋白S4 AA366442 细胞死亡
169 网格蛋白 AA361745 见下列的5种网格蛋白基因： 突触
170 A180 NM_014841 突触体相关蛋白，网格蛋白外层组装蛋白AP180，衔接蛋白在被包被的小泡中连接网格蛋白和受体的适体复合物的组分，相信蛋白复合物与膜蛋白的胞质尾部相互作用，导致它们的筛选和浓缩 突触/细胞周期/死亡
171 CLCA M20471 网格蛋白轻链A，为被包被的窝(pit)和小泡的多面体包被的主要蛋白 突触/细胞周期/死亡
172 CLCB M20469 网格蛋白轻链B，为被包被的窝和小泡的多面体包被的主要蛋白 突触/细胞周期/死亡
173 CLH1 NM_004859 网格蛋白重链1，为被包被的窝和小泡的多面体包被的主要蛋白，两种不同的适体将网格蛋白的网格与质膜或高尔基体反面的网络结构相连接 突触/细胞周期/死亡
174 CLH2 U41763 将网格蛋白的网格与质膜或经高尔基体的网格相连接的蛋白复合物；网格蛋白重链2，为被包被的窝和小泡的多面体包被的主要蛋白，两种不同的适体将网格蛋白的网格与质膜或高尔基体反面的网络结构相连接 DNA复制
175 PCNA M15796 DNA聚合酶δ的辅助蛋白，参与真核细胞DNA复制的控制 细胞周期
176 P55cdc NM_001255 CDC20细胞分裂周期20的同系物 细胞周期/死亡
177 cdc25A(MPI1) NM_001789 作为有丝分裂控制中的剂量依赖性诱导物，为细胞周期进程中必须的一种酪氨酸蛋白磷酸酶，它直接脱去CDC2的磷酸并激活其激酶活性，在体外还能脱去与细胞周期蛋白E形成复合物的CDK2上的磷酸 细胞周期/死亡
178 Cdc25B(MPI2) M81934 作为有丝分裂控制中的剂量依赖性诱导物，为细胞周期进程中必须的一种酪氨酸蛋白磷酸酶，它直接脱去CDC2的磷酸并激活其激酶活性 细胞周期/死亡
179 FADD NM_003824 凋亡适体分子，将半胱天冬酶-8或半胱天冬酶-10募集至激活的FAS(CD95)或TNFR-1受体，产生被称为诱导DISC死亡的信号复合物的聚集体，执行半胱天冬酶-8的蛋白水解激活 细胞死亡
180 Skp1 U33760 SCF泛蛋白连接酶复合物的关键组分(作为连接F-box蛋白和CUL1的适体)，介导参与细胞周期进程、信号转导和转录的蛋白的遍在蛋白化 细胞周期/死亡
181 Mch4 U60519 参与负责执行凋亡的半胱天冬酶的激活级联反应，以FADD依赖方式募集至FAS和TNFR-1；切割激活一些半胱天冬酶并水解一些小分子底物 细胞周期/死亡
182 GSK-3B NM_002093 参与Wnt信号途径，参与包括糖原合成酶、myb和和转录因子c-jun的一些调节蛋白的激素控制 细胞周期/死亡
183 ERCC6 NM_000124 参与活性基因的优先修复，可能有DNA或RNA解链功能 DNA修复
184 SKI X15218 可能在骨骼肌细胞的终末分化中起作用，但不决定细胞的肌原谱系 细胞分化
185 EB1： NM_012325 微管相关蛋白RP/EB家族成员1，可能与微管聚合和纺锤体功能有关 细胞结构
186 or NM_004718 细胞色素C氧化酶VII-a相关蛋白，线粒体 细胞能量
187 CLK3 L29217 使剪接体复合物的富含丝氨酸和精氨酸的(SR)蛋白磷酸化，可能为使SR蛋白能控制RNA剪接的调节机制的网络的构成 剪接
188 转铁蛋白R NM_003234 转铁蛋白受体蛋白1；转铁蛋白受体是红细胞和神经系统发育中必需的 应激/ROS
189 转铁蛋白R NM_003227 转铁蛋白受体蛋白2；以非铁依赖方式介导结合转铁蛋白的铁的细胞摄入 应激/ROS
190 PKC-a X52479 钙激活，磷脂依赖丝氨酸和苏氨酸特异性酶，PKC被二酰甘油激活，结果使多种细胞蛋白磷酸化；也作为佛波酯(一类肿瘤促进剂)的受体 应激/细胞周期/死亡
191 CAK NM_001799 CDK激活激酶，转录因子，CDK’s通过结合细胞周期蛋白而被激活，介导细胞周期的进程 细胞周期
192 JAK-1 NM_002227 非受体型酪氨酸激酶，参与IFN-α/β/γ信号途径，白细胞介素(IL)-2受体的激酶伴侣 炎症/应激
193 MAPKAP NM_004635 有丝分裂原激活的蛋白激酶激活的蛋白激酶3 细胞周期/死亡
194 GSTP NM_000852 谷胱甘肽S转移酶P，使还原型谷胱甘肽与多种外源性和内源性的疏水(homophobic)亲电体缀合 细胞能量
195 Apopain U26943 参与负责执行凋亡的半胱天冬酶的激活级联反应，切割和激活固醇调节元件结合蛋白(SREBPS)，参与切割Hunt ingt in 细胞死亡
196 ERCC5 NM_000123 参与DNA外切修复的单链DNA内切核酸酶，在修复中进行3’端内切 DNA修复
197 ERCC3 NM_000122 ATP依赖性3’-5’DNA螺旋酶，核-TFIIH基础转录因子的组分，参与DNA的核苷酸内切修复，当与CAK复合时参与由RNA聚合酶II进行的RNA转录 DNA修复
CCAAT-BP 见下述9个基因 转录
198 CBFA NM_006166 通过识别/结合启动子中的CCAAT基序促进多种基因的转录，结合CCAAT的转录因子A亚基 转录
199 NFYA M59079 通过识别/结合启动子中的CCAAT基序促进多种基因的转录，结合CCAAT的转录因子B亚基 转录
200 CBF NM_005760 刺激从HSP70启动子开始转录，结合CCAAT盒的转录因子 应激/转录
201 CEBA U34070 识别与多种启动子同源共有的CCAAT和与许多增强子同源共有的增强核心的DNA结合蛋白，CCAAT/增强子结合蛋白α DNA 转录
202 CEBB X52560 在参与免疫和炎症反应的基因的调节中的重要的转录激活剂，CCAAT/增强子结合蛋白β DNA 转录/炎症
203 CEBD NM_005195 识别与多种启动子同源共有的CCAAT和与许多增强子同源共有的增强核心的DNA结合蛋白，参与免疫和炎症反应，CCAAT/增强子结合蛋白δ 转录/炎症
204 CEBE U48865 识别与多种启动子同源共有的CCAAT和与许多增强子同源共有的增强核心的DNA结合蛋白，CCAAT/增强子结合蛋白ε DNA 转录
205 CEBG NM_001806 结合IL4基因的增强子元件PRE-1的转录因子，CCAAT/增强子结合蛋白γ 转录
206 CUT1 M74099 可能有发育调节基因表达的抑制物作用，可能通过阻止启动子与正向激活因子的结合而起作用，CCAAT替代蛋白 转录/死亡
207 HLHP Id2 NM_002166 DNA结合蛋白抑制剂ID2 细胞周期/死亡
208 G-Sα亚基 P04895 鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(S)，α亚基(促进腺嘌呤核苷酸环化酶的Gα蛋白)，在多种跨膜信号系统中作为调节子或转导物 细胞能量/死亡/许多其他功能
参与
209 INI1 NM_003073 参与染色质重建，开放染色质以促进转录机制接近其靶标的复合物的一部分 转录
210 LCR-F1 U08853 激活红细胞特异性珠蛋白的基因表达
211 低亲和力NGF-R NM_002507 肿瘤坏死因子受体超家族成员16，可结合NGF、BDNF、NT-3、NT-4的低亲和力受体，介导神经细胞的细胞存活和细胞死亡 细胞生长/死亡
212 EGF-R U48722 EGF受体，参与控制细胞生长和分化 细胞生长
213 胰岛素R NM_000208 胰岛素受体，结合胰岛素，具有酪氨酸蛋白激酶活性 细胞能量
214 A-连环蛋白 NM_001903 α-1-连环蛋白，钙粘蛋白相关蛋白，与多种钙粘蛋白的胞质结构域相关，连环蛋白与钙粘蛋白的连接产生连接到肌动蛋白纤维网络的复合物，可能在细胞分化中起关键作用 细胞周期/死亡
215 NM_004389 α-2-连环蛋白，α连环蛋白相关蛋白 细胞周期/死亡
216 整联蛋白a-3 M59911 纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原、表皮整联配体蛋白(epi legr in)、血小板凝血酶敏感素的受体 炎症/死亡
217 纤连蛋白Rα P08648 整联蛋白α-5前体，整联蛋白α-5/β1是血纤蛋白原和纤连蛋白的受体，它识别序列R-G-D及其配体 炎症/死亡
218 GM-CSF M11734 促进多种谱系的造血前体细胞的生长和分化的细胞因子 生长因子
219 Glu-6-P异构酶 AI250347 细胞能量
220 MCP-1 M24545 吸引单核细胞和嗜碱性粒细胞的趋化因子，提高单核细胞的抗肿瘤活性，结合CCR2和CCR4 炎症/死亡
221 多向生长因子(Pleiotrophin) NM_002825 结合肝素的有丝分裂蛋白，具有轴突延伸活性 细胞周期
222 胸腺素b-10 NM_021103 在细胞骨架结合的形成中起重要作用，隔离肌动蛋白单体(G肌动蛋白)，因此抑制肌动蛋白的聚合 细胞结构
223 高度碱性的蛋白(Highlybasicprotein) R94142 Soares胎儿肝脾1NFLS人类克隆 未知
224 XGPT NM_007255 蛋白聚糖特别是皮肤中小蛋白聚糖的四糖连接区域的生物合成所必需 细胞能量
225 BAD AF031523 促进细胞死亡，似乎作为生长因子受体信号和凋亡途径之间的连接物 细胞死亡
226 Mch3 U39613 参与负责执行凋亡的半胱天冬酶的激活级联反应 细胞死亡
227 Mch6 U56390 参与负责执行凋亡的半胱天冬酶的激活级联反应 细胞死亡
228 MPP2 L16783 推测的M期磷蛋白2 细胞周期
229 Mek2 L11285 细胞周期
230 4.1N Q9H4G0 Band4.1样蛋白1，(神经蛋白4.1)，可能通过多种相互作用为神经膜提供稳定性和塑性 细胞结构
231 全长NSE NM_001975 γ烯醇化酶，神经特异性烯醇化酶， 神经元标记
动力蛋白 见下述9个基因
232 DL2A AF161511 动力蛋白轻链2A，胞质，可能参与动力蛋白的组装和动力功能，动力蛋白在细胞分化和细胞内运输中起中心作用 细胞周期/细胞器转运
233 DL2B NM_130897 动力蛋白轻链2B，胞质，可能参与动力蛋白的组装和动力功能，动力蛋白在细胞分化和细胞内运输中起核心作用 细胞周期/细胞器转运
234 DL4A AL035366 动力蛋白轻链4A，轴丝，呼吸纤毛中的force genera t ing蛋白 mRNA，不完整编码区 细胞周期/细胞器转运
235 DYH9 AF257737 动力蛋白重链9，呼吸纤毛中的forcegenerating蛋白 细胞周期/细胞器转运
236 DYL1 NM_003746 动力蛋白轻链1，胞质，可能参与一些与动力蛋白相关的细胞内运输和运动，可能在改变或维持细胞骨架结构的空间分布中起作用 细胞周期/细胞器转运
237 DYHB Q96DT5 纤毛动力蛋白重链11，呼吸纤毛中的force generating蛋白 细胞周期/细胞器转运
238 DYHC Q14204 动力蛋白重链，细胞溶胶；胞质动力蛋白作为小泡和细胞器沿微管的后退运动的驱动器，动力蛋白具有ATP酶活性 细胞周期/细胞器转运
239 DYI1 AF063228 动力蛋白中间链1，胞质溶胶；中间链似乎帮助动力蛋白结合动力蛋白激活蛋白的150kDa组分，可能在介导胞质动力蛋白与膜细胞器和动粒的相互作用中起作用 细胞周期/细胞器转运
240 DYI2 NM_001378 动力蛋白中间链2，胞质溶胶；中间链似乎帮助动力蛋白结合动力蛋白激活蛋白的150kDa组分 细胞周期/细胞器转运
还有一些生物标记的实例，可以评估它们的表达水平并与参照标准相比较，这些实例例如包括：人类转换基因2-β、hTra2-β、人类SAF-b、Mainclone、pht6、MIF、mainclone相互作用因子、pp17、ESAF、hnRNPG、类cd2激酶c1k1-4。生物标记的另一些实例列于表5。这些生物标记的具体实例包括但不限于：HSP60、二氢硫辛酰胺脱氢酶、ER-60蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、ATP-合成酶β链、膜联蛋白I、14-3-3ε、抑制素、磷酸甘油酸变位酶1、载脂蛋白AI、超氧化物歧化酶、RNA-结合蛋白调节亚基、A链硫氧还蛋白过氧化物酶B、RAS相关蛋白RAP1B、肿瘤排斥抗原、触珠蛋白、纤维蛋白β，还包括它们的组合。在另一些实例中，合适的生物标记包括但不限于：分子量(MW)为27100以及等电点(pI)为7.58的蛋白质、MW为25400以及pI为6.2的蛋白质和MW为27600以及pI为5.92的蛋白质。
表5：被鉴定的在帕金森病患者和对照受试者中有差异的蛋白。
蛋白# MW(分子量) pI(等电点)
1 66,204 5.67
2 63,131 7.59
3 62,052 5.98
4 59,332 7.42
5 54,879 5.42
6 36,106 7.58
7 32,567 5.10
8 29,785 5.80
9 29,559 7.60
10 26,908 5.65
11 25,546 7.64
12 24,376 6.36
13 23,327 5.82
14 21,719 5.92
15 145,916 5.29
16 42,839 5.42
17 60,376 6.72
18 27,100 7.58
19 25,400 6.2
20 27,600 5.92
还有其他一些生物标记的具体实例，可以如本文所公开的那样评估它们的表达水平并与参照标准相比较，这些实例包括：肌动蛋白相互作用蛋白1(AIP1)、有丝分裂原活化蛋白激酶I(MAPKI)、肌动蛋白或其片段、膜联蛋白I、14-3-3蛋白ε、戊二醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、转化蛋白RhoA、酸性富含亮氨酸的核磷蛋白32家族成员B(ANP32B或APRIL)、过氧化物氧还蛋白II、淀粉状前体蛋白(APP)、α-分泌酶、β-分泌酶、γ-分泌酶、Aβ肽、Fe65、Tip60、SERCA、PS1/2、结合素-1a或者老年斑的非淀粉状蛋白β组分(NACP/a-突触核蛋白)。
3.比较表达水平
在所公开方法的一些实例中，当评估了生物标记的表达水平(并任选地得到了第一和/或第二典型变量)时，可将该水平(或典型变量)与参照标准中的生物标记的表达水平(或从中得到的典型变量)相比较。“参照标准”意为来自未患神经变性疾病、处于疾病的不同阶段或缺少某种特定变量(例如治疗性药物)的样本或受试者的特定生物标记的表达水平。或者，参照标准可包括已知量的生物标记。这种已知量可与未患神经变性疾病、处于疾病的不同阶段或缺少某种特定变量(例如治疗性药物)的受试者的平均水平相关。如本文所述，参照标准还可包括来源于一名或多名不同样本或受试者的一种或多种生物标记的表达水平。例如，参照标准可包括对来自未患神经变性疾病、处于神经变性疾病进程的不同阶段或未接受神经变性疾病治疗的受试者的样本中的一种或多种生物标记的表达水平的评估。另一种示例性的参照标准可包括对来自未患神经变性疾病、处于神经疾病进程的不同阶段或未接受神经疾病治疗的多名受试者的样本中的一种或多种生物标记的表达水平的评估。
当参照标准包括未接受治疗剂治疗的样本或受试者中的一种或多种生物标记的表达水平时，对照样本或受试者可为在用治疗剂治疗之前或之后的同一待测样本或受试者，或者可为未接受治疗剂的不同的样本或受试者。或者参照标准可为从多名未患具体的神经变性疾病的受试者中计算的平均表达水平。参照标准还可包括本领域已知的对照水平或对照值。在本文公开的方法的一个方面，可能需要与被诊断为神经变性疾病的受试者年龄相近的参照标准。参照标准还可为通过对来自一名或一组对照受试者的生物标记的表达水平进行多变量典型分析而得到的第一或第二典型变量。
在一种比较来自两个不同样本(例如一个被诊断患有神经变性疾病的受试者的样本和参照标准)的基因产物的表达水平的技术中，每个样本要分别进行2D凝胶电泳。或者，将每个样本作不同的标记并将两个样本上样到同一块2D凝胶上。参见例如Unlu et al.，Electrophoresis，1997；18：2071-2077，该文献中至少关于评估和比较基因产物表达水平的方法的教导以援引的方式纳入本文。通过2D电泳辨析得到的基因产物的图谱中的相对位置可以鉴定每个样本中的相同基因产物或同一组基因产物。然后将第一个样本中一种或多种基因产物的表达水平与第二个样本中相同基因产物的表达水平相比较，由此可鉴定在两个样本中表达有差异的一种或一组基因产物(例如生物标记)。这种比较可在怀疑受试者患有神经变性疾病之前或之后、在开始治疗过程之前或之后和在治疗过程中进行。
在另一种技术中，单一样本中一种或多种基因产物的表达水平可表示为全部表达的基因产物的百分比。可将这样评估的表达水平与现存的参照标准进行比较，由此可鉴定在该样本中相对于参照标准表达有差异的基因产物。
对表达水平与参照标准不同的基因产物，可通过例如从2D凝胶上提取那些基因产物并使用例如质谱(MS)的鉴定技术进行鉴定，质朴技术包括例如基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF)。因此在一方面，本文公开了通过检测样本(例如包括白细胞或其裂解产物的样本)中基因产物的表达而鉴定与神经变性疾病的不同阶段(例如其发病和病程)相关的生物标记的方法。
可使用其他方法代替2D电泳来鉴定样本中基因产物的表达水平并将该水平与参照标准相比较，这些其他方法也可用于本文公开的方法。这些方法有的应用了分光技术，例如表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱(SELDI-TOF)。另一些方法依赖于色谱技术，例如高效液相色谱(HPLC)或快速蛋白液相色谱(FPLC)。多维液相色谱(LC)和串联质谱(MS/MS)可分离和鉴定多种肽。参见Link，et al.，Na t.Biotechnol.，1999；17：676-82。用于鉴定多种蛋白的其他色谱方法描述于美国专利No.6,908,740。在另一些方法中，可使用芯片(例如蛋白质结合抗体、配体或适体的阵列)来鉴定在样本中的表达不同于参照标准的基因产物。参见例如Glokler and Angenendt，J.Chroma togr.B Analyt.Technol.Biomed.Life Sci.，2003；797：229-240。上述文献中至少关于评估和比较基因产物表达水平的方法的教导以援引的方式纳入本文。
当有差异的基因表达导致样本中一种或多种基因产物的表达不同于参照标准时，可使用鉴定差异表达的基因转录物的方法进一步鉴定这一种或多种基因产物，例如使用基因芯片(核苷酸表达微阵列)或差异显示技术(例如Clontech公司，Palo Alto，CA或GenHunter公司，Nashville，TN的差异显示试剂盒)。这些文献中至少关于评估和比较蛋白质表达水平的方法的教导以援引的方式纳入本文。
在将基因产物的表达水平与参照标准进行比较时，如果基因产物的表达水平比参照标准高，就可确定该基因产物为诊断例如帕金森病或阿尔茨海默病等神经变性疾病的生物标记。或者，如果基因产物的表达水平比参照标准低，也可确定该基因产物为诊断神经变性疾病的生物标记。最后，与参照标准相比增加的基因产物和降低的基因产物的组合可将所述基因产物鉴定为诊断神经变性疾病的生物标记。
由所公开的方法所鉴定的生物标记可用于许多种其他方法中。例如，生物标记可用于诊断具体的神经变性疾病。在另一实例中，生物标记可用于监测疾病的进程，因为随着具体神经变性疾病的发展，一些生物标记的表达水平可更为显著(或者不那样显著)。在又一实例中，生物标记可用于监测受试者对疾病治疗的反应。这些用途和其他用途在本文中公开。
4.具体方法
所公开的是诊断神经变性疾病如阿尔茨海默病或帕金森病的方法，包括从受试者采集样本(如血液或白细胞)，分析样本中一系列基因的表达情况，并将该表达情况与对照相比较。
还公开了诊断神经变性疾病的方法，所述方法包括：从受试者收集血液样本，分析样本中一系列基因的表达情况，并将该表达情况与对照相比较。
还公开了诊断神经变性疾病的方法，所述方法包括：从受试者收集白细胞，分析白细胞中一系列基因的表达情况，并将该表达情况与对照相比较。
公开了方法，其中所述受试者还由临床痴呆测试所诊断，其中所述临床痴呆测试为NINCDS或DSM-IV测试。
公开了方法，其中在细微精神状态检查(Mini-Mental StatusExamination，MMSE)中，所述对照得分高于27，AD患者得分低于22。
还公开了方法，其中在临床痴呆评定量表(Clinical DementiaRating scale，CDR)中所述AD患者得分高于1.2或1.5。
公开了方法，其中使用Blessed痴呆评定量表(Blessed DementiaRating scale，BDR)测定所述对照。
公开了诊断神经变性疾病的方法，所述方法包括从受试者收集外周血液样本，裂解该样本中含有的红细胞，收集所剩下的白细胞，裂解该白细胞产生裂解样本，收集该裂解样本中的总核酸形成核酸样本，分离该核酸样本中的RNA，提取该核酸样本中的RNA，收集多腺苷酸RNA，并鉴定一系列RNA转录物是否存在。
还公开了诊断神经变性疾病的方法，所述方法包括从受试者收集样本(如白细胞样本)，收集该样本中的mRNA，将该mRNA与一组核酸杂交，其中该组核酸包含一种或多种表4中的基因，例如细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白G1、wee1、hTR2、CDC25b、GSK3β和蛋白激酶Cα(它们与细胞周期相关)，C5、C1抑制剂、IL-17r、IL-8、LIF、TNF-α和IL-10r(它们与炎性系统相关)以及α-1抗胰凝乳蛋白酶、HSP27、HSP90、晶体蛋白、GAPDH、铁蛋白H、铁蛋白L、cox1、cox2和转铁蛋白(它们与细胞应激相关)，还包括它们的任意组合。
公开了诊断神经变性疾病的方法，所述方法包括从受试者收集外周血液样本，裂解该样本中含有的红细胞，收集所剩下的白细胞，裂解该白细胞产生裂解样本，收集该裂解样本中的总核酸形成核酸样本，分离该核酸样本中的RNA，提取该核酸样本中的RNA，收集多腺苷酸RNA，并鉴定一系列RNA转录物是否存在。
还公开了诊断神经变性疾病的方法，所述方法包括从受试者收集外周血液样本，从该外周血液样本收集白细胞，其中收集白细胞包括裂解该外周血液样本中的红细胞，并离心、裂解该白细胞，从该裂解白细胞收集总核酸样本，其中对所述核酸的收集包括将该核酸吸附至磁珠上，从该核酸样本收集总RNA样本，从该总RNA样本收集多腺苷酸mRNA样本，将该总mRNA样本与一系列诊断基因杂交，分析哪种诊断基因与该mRNA样本中的mRNA杂交，其中所述一系列诊断基因包括表4中的一种或多种基因，例如细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白G1、wee1、hTR2、CDC25b、GSK3β和蛋白激酶Cα(它们与细胞周期相关)，C5、C1抑制剂、IL-17r、IL-8、LIF、TNF-α和IL-10r(它们与炎症系统相关)，以及α-1抗胰凝乳蛋白酶、HSP27、HSP90、晶体蛋白、GAPDH、铁蛋白H、铁蛋白L、cox1、cox2和转铁蛋白(与细胞应激相关)，还包括它们的任意组合。
使用阵列数据时，该数据可通过将持家基因例如GapDH、亲环蛋白(cyclophilin)或肌动蛋白标准化得以标准化。其他方法包括掺加样本，将整个阵列上的信号强度标准化为平均值或总和。
a)筛选治疗剂的方法
另一方面，本文公开了筛选用于治疗神经变性疾病(如帕金森病或阿尔茨海默病)的治疗剂的方法。所公开的方法包括将一个或一群白细胞与待筛选药剂相接触，并检测所述神经变性疾病的生物标记的表达水平或活性。或者，不使用白细胞，而使用神经细胞或其群体。在这些方法中，所述生物标记的表达水平或活性的升高或降低可指示所述待筛选药剂是用于治疗所述神经变性疾病的治疗剂。
另一方面，所公开的方法可用于筛选核酸、抗体、多肽或小分子等药剂，包括其任何一种治疗混合物或组合物。
与所述白细胞或其裂解物相接触可由任何技术完成。例如，所述细胞或裂解物可浸没或浸入所述药剂中或含有该药剂的溶液中。在另一实例中，所述细胞或裂解物可由所述药剂或含有该药剂的溶液包被或喷雾。在又一实例中，该细胞或裂解物可与介质如培养介质接触，所述介质含有该药剂或者含该药剂的溶液。在另一实例中，该细胞或裂解物可由该药剂或含有该药剂的溶液灌注。将白细胞或其裂解物与待筛选药剂相接触的具体方法对于本领域的普通技术人员而言是显而易见的，并且取决于诸如样本大小、待筛选的具体药剂、便利性、偏好等因素。
表达水平或活性被检测的生物标记可为一种或多种在神经变性疾病中被下调的基因或蛋白。在该实例中，药剂提高了该基因或蛋白生物标记的表达水平或活性时，表明该药剂是用于治疗所述具体神经变性疾病的治疗剂。或者，生物标记可为一种或多种在神经变性疾病中上调的基因或蛋白。在该实例中，药剂降低了该基因或蛋白生物标记的表达水平或活性时，表明该药剂是治疗所述具体神经变性疾病的治疗剂。另外，在神经变性疾病中，一种或多种生物标记可被上调，而其他的一种或多种生物标记可被下调。在该实例中，药剂降低了在神经变性疾病中被上调的一种或多种基因或蛋白生物标记的表达水平或活性，以及/或者提高了在神经变性疾病中被下调的一种或多种基因或蛋白生物标记的表达水平或活性，表明该药剂是治疗所述神经变性疾病的治疗剂。
在所公开方法的另一方面，可进一步测定治疗剂是否改变了神经元中生物标记的表达水平或活性。一方面，该神经元为多巴胺能神经元。
另一方面，所公开的方法可进一步包括测定治疗剂是否阻止了神经变性疾病的动物模型中该病的发展或延缓其进程。例如，该神经变性疾病为帕金森病时，合适的动物模型包括但不限于：MPTP模型、6-OHDA模型、百草枯(paraquat)模型或鱼藤酮模型。
b)监测神经变性疾病进程的方法
另一方面，本文公开了在受试者中监测神经变性疾病(如帕金森病或阿尔茨海默病)进程的方法。所公开的方法包括比较样本中神经变性疾病的生物标记的表达水平或活性，所述样本包括在多个时间点自所述受试者获得的白细胞或其裂解物。
本文还公开了在受试者中监测对神经变性疾病(如帕金森病)治疗的反应的方法，所公开的方法包括比较样本中神经变性疾病的生物标记的表达水平或活性，所述样本包括在治疗所述受试者期间的多个时间点自所述受试者获得的白细胞或其裂解物。
在这些方法中，受试者可为上文所公开的受试者(如人)。同时，所述受试者在多个时间点的一点或多点没有神经变性疾病的症状或处于神经变性疾病的临床前期。在另一实例中，受试者在多个时间点的一点或多点并未接受过神经变性疾病的治疗。
“治疗”意思是为治愈、预防或缓解疾病，受试者所接受或经历的医学介入。治疗可包括但不限于药理学疗法(如药物给予)、营养学疗法(如维生素、激素、营养制品或添加剂的给予，或饮食的改变)、物理疗法、外科手术治疗、非药理学疗法、行为矫正等。任选地，受试者在多个时间点的一点或多点接受神经变性疾病的治疗。任选地，受试者在多个时间点的一点或之前由神经保护药剂治疗。任选地，受试者在多个时间点的一点或多点由多巴胺激动剂(如左旋多巴)治疗。在另一具体实例中，受试者在多个时间点的一点或多点由神经保护药剂治疗。
可用于治疗受试者的神经保护药剂的实例包括但不限于乙酰胆碱酯酶抑制剂、谷氨酸能(glutamatergic)受体拮抗剂、激酶抑制剂、HDAC抑制剂、抗炎剂、激酶抑制剂、双丙戊酸钠，或其任意组合物。其他神经保护药剂的实例包括但不限于双复磷(Obidoxime Chloride)、氯解磷定(Pralidoxime Chloride)、碘解磷定(Pralidoxime Iodide)、甲磺酸磷定(Pralidoxime Mesylate)、枸橼酸阿尔维林(Alverinc Citrate)、甲溴辛托品(Anisotropine Methylbromide)、阿托品(Atropine)、盐酸氧阿托品(Atropine Oxide Hydrochloride)、硫酸阿托品(Atropine Sulfate)、颠茄(Belladonna)、盐酸贝那利秦(Benapryzine Hydrochloride)、盐酸苄替米特(Benzetimide Hydrochloride)、苯咯溴铵(BenziloniumBromide)、比哌立登(Biperiden)、盐酸比哌立登(BiperidenHydrochloride)、乳酸比哌立登(Biperiden Lactate)、克利溴铵(Clidinium Bromide)、盐酸环喷托酯(Cyclopentolate Hydrochloride)、右苄替米特(Dexetimide)、盐酸双环维林(Dicyclomine Hydrochloride)、盐酸双己维林(Dihexyverine Hydrochloride)、富马酸多马唑啉(Domazoline Fumarate)、依兰群(Elantrine)、依鲁卡因(Elucaine)、乙苯托品(Ethybenztropine)、盐酸尤卡托品(EucatropineHydrochloride)、格隆溴铵(Glycopyrrolate)、海特溴铵(HeteroniumBromide)、氢溴酸后马托品(Homatropine Hydrobromide)、甲溴后马托品(Homatropine Methylbromide)、莨菪碱(Hyoscyamine)、氢溴酸莨菪碱(Hyoscyamine Hydrobromide)、硫酸莨菪碱(HyoscyamineSulfate)、异丙碘铵(Isopropamide Iodide)、溴美喷酯(MepenzolateBromide)、甲硝阿托品(Methylatropine Nitrate)、美托喹嗪(Metoquizine)、氯化奥昔布宁(Oxybutynin Chloride)、溴帕拉喷酯(Parapenzolate Bromide)、甲硫戊哌铵(Pentapiperium Methylsulfate)、芬卡米特(Phencarbamide)、甲硫泊尔定(Poldine Methylsulfate)、丙谷胺(Proglumide)、溴丙胺太林(Propantheline Bromide)、盐酸奥昔利平(Propenzolate Hydrochloride)、氢溴酸东莨菪碱(ScopolamineHydrobromide)、甲硫托铵(Tematropium Methylsulfate)、盐酸替喹胺(Tiquinamide Hydrochloride)、盐酸托芬那辛(TofenacinHydrochloride)、托喹嗪(Toquizine)、硫酸曲安吡嗪(TriampyzineSulfate)、盐酸苯海索(Trihexyphenidyl Hydrochloride)、托吡卡胺(Tropicamide)。其他实例包括但不限于阿布妥因(Albutoin)、氨托利(Ameltolide)、阿托利特(Atolide)、布拉氨酯(Buramate)、卡马西平(Carbamazepine)、桂溴胺(Cinromide)、西替酰胺(Citenamide)、氯硝西泮(Clonazepam)、环庚米特(Cyheptamide)、地秦胺(Dezinamide)、二甲双酮(Dimethadione)、双丙戊酸钠(DivalproexSodium)、依特比妥(Eterobarb)、乙琥胺(Ethosuximide)、乙苯妥英(Ethotoin)、盐酸氟西泮(Flurazepam Hydrochloride)、氟齐胺(Fluzinamide)、磷苯妥英钠(Fosphenytoin Sodium)、加巴喷丁(Gabapentin)、伊来西胺(Ilepcimide)、拉莫三嗪(Lamotrigine)、硫酸镁(Magnesium Sulfate)、美芬妥英(Mephenytoin)、甲苯比妥(Mephobarbital)、美替妥英(Methetoin)、甲琥胺(Methsuximide)、盐酸米拉醋胺(Milacemide Hydrochloride)、大麻折尼(Nabazenil)、盐酸萘咪酮(Nafimidone Hydrochloride)、硝西泮(Nitrazepam)、苯乙酰脲(Phenacemide)、苯巴比妥(Phenobarbital)、苯巴比妥钠(Phenobarbital Sodium)、苯琥胺(Phensuximide)、苯妥英(Phenytoin)、苯妥英钠(Phenytoin Sodium)、朴米酮(Primidone)、普罗加胺(Progabide)、雷利托林(Ralitoline)、盐酸瑞马酰胺(RemacemideHydrochloride)、罗匹嗪(Ropizine)、沙贝鲁唑(Sabeluzole)、司替戊酮(Stiripentol)、舒噻美(Sulthiame)、硫喷妥钠(Thiopental Sodium)、盐酸替来他明(Tiletamine Hydrochloride)、托吡酯(Topiramate)、三甲双酮(Trimethadione)、丙戊酸钠(Valproate Sodium)、丙戊酸(Valproic Acid)、氨己烯酸(Vigabatrin)、盐酸佐尼氯唑(ZoniclezoleHydrochloride)、唑尼沙胺(Zonisamide)。抗炎药的另一些实例包括但不限于阿氯芬酸(Alclofenac)、二丙酸阿氯米松(AlclometasoneDipropionate)、阿孕奈德(Algestone Acetonide)、阿法淀粉酶(AlphaAmylase)、安西法尔(Amcinafal)、安西非特(Amcinafide)、安芬酸钠(Amfenac Sodium)、盐酸安普立糖(Amiprilose Hydrochloride)、阿那白滞素(Anakinra)、阿尼罗酸(Anirolac)、阿尼扎芬(Anitrazafen)、阿扎丙宗(Apazone)、巴柳氮二钠(Balsalazide Disodium)、苄达酸(Bendazac)、苯噁洛芬(Benoxaprofen)、盐酸苄达明(BenzydamineHydrochloride)、菠萝蛋白酶(Bromelains)、溴哌莫(Broperamole)、布地奈德(Budesonide)、卡洛芬(Carprofen)、环洛芬(Cicloprofen)、辛喷他宗(Cintazone)、克利洛芬(Cliprofen)、丙酸氯倍他索(ClobetasolPropionate)、丁酸氯倍他索(Clobetasone Butyrate)、氯吡酸(Clopirac)、丙酸氯硫卡松(Cloticasone Propionate)、醋酸可米松(CormethasoneAcetate)、可托多松(Cortodoxone)、地夫可特(Deflazacort)、地奈德(Desonide)、去羟米松(Desoximetasone)、二丙酸地塞米松(Dexamethasone Dipropionate)、双氯芬酸钾(Diclofenac Potassium)、双氯芬酸钠(Diclofenac Sodium)、双醋二氟拉松(DiflorasoneDiacetate)、二氟米酮钠(Diflumidone Sodium)、二氟尼柳(Diflunisal)、二氟泼尼酯(Difluprednate)、地弗他酮(Diftalone)、二甲亚砜(DimethylSulfoxide)、羟西奈德(Drocinonide)、恩甲羟松(Endrysone)、恩莫单抗(Enlimomab)、依诺利康钠(Enolicam Sodium)、依匹唑(Epirizole)、依托度酸(Etodolac)、依托芬那酯(Etofenamate)、联苯乙酸(Felbinac)、非那莫(Fenamole)、芬布芬(Fenbufen)、芬氯酸(Fenclofenac)、苯克洛酸(Fenclorac)、芬度柳(Fendosal)、苯吡帕酮(Fenpipalone)、芬替酸(Fentiazac)、夫拉扎酮(Flazalone)、氟扎可特(Fluazacort)、氟芬那酸(Flufenamic Acid)、氟咪唑(Flumizole)、醋酸氟尼缩松(Flunisolide Acetate)、氟尼辛(Flunixin)、氟尼辛葡甲胺(FlunixinMeglumine)、氟可丁酯(Fluocortin Butyl)、醋酸氟米龙(Fluorometholone Acetate)、氟喹宗(Fluquazone)、氟比洛芬(Flurbiprofen)、氟瑞托芬(Fluretofen)、丙酸氟替卡松(FluticasonePropionate)、呋喃洛芬(Furaprofen)、呋罗布芬(Furobufen)、哈西奈德(Halcinonide)、丙酸卤倍他索(Halobetasol Propionate)、醋酸卤泼尼松(Halopredone Acetate)、异丁芬酸(Ibufenac)、布洛芬(Ibuprofen)、布洛芬铝(Ibuprofen Aluminum)、布洛芬吡啶甲醇(Ibuprofen Piconol)、伊洛达普(Ilonidap)、吲哚美辛(Indomethacin)、吲哚美辛钠(Indomethacin Sodium)、吲哚洛芬(Indoprofen)、吲哚克索(Indoxole)、吲四唑(Intrazole)、醋酸异氟泼尼松(IsoflupredoneAcetate)、伊索克酸(Isoxepac)、伊索昔康(Isoxicam)、酮洛芬(Ketoprofen)、盐酸洛非咪唑(Lofemizole Hydrochloride)、氯诺昔康(Lornoxicam)、氯替泼诺碳酸乙酯(Loteprednol Etabonate)、甲氯芬那酸钠(Meclofenamate Sodium)、甲氯芬那酸(Meclofenamic Acid)、二丁酸甲氯松(Meclorisone Dibutyrate)、甲芬那酸(Mefenamic Acid)、美沙拉秦(Mesalamine)、美西拉宗(Meseclazone)、磺庚甲泼尼龙(Methylprednisolone Suleptanate)、Momif lumate、萘丁美酮(Nabumetone)、萘普生(Naproxen)、萘普生钠(Naproxen Sodium)、萘普索(Naproxol)、尼马宗(Nimazone)、奥沙拉秦钠(OlsalazineSodium)、奥古蛋白(Orgotein)、奥帕诺辛(Orpanoxin)、噁丙嗪(Oxaprozin)、羟布宗(Oxyphenbutazone)、盐酸瑞尼托林(ParanylineHyd rochloride)、戊聚硫钠(Pentosan Polysulfate Sodium)、保泰松甘油酸钠(Phenbutazone Sodium Glycerate)、吡非尼酮(Pirfenidone)、吡罗昔康(Piroxicam)、肉桂酸吡罗昔康(Piroxicam Cinnamate)、吡罗昔康乙醇胺(Piroxicam Olamine)、吡洛芬(Pirprofen)、泼那扎特(Prednazate)、普立非酮(Prifelone)、普罗度酸(Prodolic Acid)、普罗喹宗(Proquazone)、普罗沙唑(Proxazole)、枸橼酸普罗沙唑(ProxazoleCitrate)、利美索龙(Rimexolone)、氯马扎利(Romazarit)、柳胆来司(Salcolex)、沙那西定(Salnacedin)、双水杨酯(Salsalate)、血根氯铵(Sanguinarium Chloride)、司克拉宗(Seclazone)、丝美辛(Sermetacin)、舒多昔康(Sudoxicam)、舒林酸(Sulindac)、舒洛芬(Suprofen)、他美辛(Talmetacin)、他尼氟酯(Talniflumate)、他洛柳酯(Talosalate)、特丁非隆(Tebufelone)、替尼达普(Tenidap)、替尼达普钠(Tenidap Sodium)、替诺昔康(Tenoxicam)、替昔康(Tesicam)、替昔米德(Tesimide)、四氢甲吲胺(tetrydamine)、硫平酸(Tiopinac)、替可的松匹伐酯(Tixocortol Pivalate)、托美丁(Tolmetin)、托美丁钠(Tolmetin Sodium)、三氯奈德(Triclonide)、三氟米酯(Triflumidate)、齐多美辛(Zidometacin)或佐美酸钠(Zomepirac Sodium)。
在另一实例中，受试者可由非药理学治疗方法即主要不涉及药物的治疗方法治疗。这些非药理学药物的实例包括但不限于脑部刺激(一般用于PD)、脑室分流和网膜移位(已被用于AD)。在另一实例中，受试者可由行为矫正治疗。治疗方法的又一实例涉及基因疗法、移植和干细胞。
在所公开的方法中，在一个时间点评估得到的生物标记的表达水平或活性与在另一个时间点评估得到的水平相同。这表明所述具体神经变性疾病并未发生变化(如该病并为恶化或好转)。在另一实例中，在较早时间点生物标记表达水平或活性比在较晚时间点的水平更高或更低。这表明所述神经变性疾病正在发展。若之前已发现生物标记的表达水平从较早时间点至较晚时间点有所升高，并发现其表达水平与疾病症状的(a)恶化或(b)改善相关，则早期样本相对于晚期样本较低量的生物标记被分别认为是该受试者的病情(a)恶化或(b)改善的指标。另一方面，若已发现生物标记的表达水平从较早时间点至较晚时间点有所降低，并发现其表达水平与疾病症状的(a)恶化或(b)改善相关，则早期样本相对于晚期样本较高量的生物标记被分别认为是该受试者的病情(a)恶化或(b)改善的指标。在另一实例中，可使用生物标记的组合物，此时在疾病进程期间该组合物中一些生物标记从较早时间点至较晚时间点有所升高，而其他生物标记有所降低。
同样，生物标记的水平与响应治疗方法的神经变性疾病的一个或多个症状的恶化或改善相关。基因产物可鉴定受试者中对神经变性疾病的治疗响应的生物标记，所述基因产物的表达水平在治疗前或治疗期间的较早时间点所采集的样本与在治疗期间的较晚时间点或治疗后所采集的样本之间不同。
在这些方法中，不同样本之间生物标记的表达水平或活性的差异是受试者对针对神经变性疾病所施用的治疗发生响应的指标。若之前已发现生物标记的表达在(a)响应或(b)不能响应针对神经变性疾病的治疗的受试者中升高，则晚期样本相对于早期样本较大量的生物标记被分别认为是该受试者对所述治疗(a)响应或(b)不能响应的指标。或者，若之前已发现生物标记的表达在(a)响应或(b)不能响应针对神经变性疾病的治疗的受试者中降低，则晚期样本相对于早期样本较少量的生物标记被分别认为是该受试者对所述治疗(a)响应或(b)不能响应的指标。或者，若生物标记的组合被使用，并且之前已表明一种或多种生物标记在(a)响应或(b)不能响应针对神经变性疾病的治疗的受试者中降低，并且之前已表明一种或多种其他生物标记升高，则晚期样本相对于早期样本的生物标记的组合中生物标记的量的变化可被分别认为是该受试者对所述治疗(a)响应或(b)不响应的指标。
c)在受试者中鉴定患神经变性疾病风险的方法
另一方面，本文公开了鉴定测试受试者患神经变性疾病(如帕金森病或阿尔茨海默病)风险的方法。所公开的方法包括测定从所述测试受试者获得的样本的神经变性疾病的生物标记的表达水平或活性，其中所述样本包括白细胞或其裂解物；并将对所述测试受试者测定得到的所述生物标记的表达水平或活性水平与参照受试者的水平建立联系。该方法进一步包括测定来自被诊断患有所述神经变性疾病的参照受试群和/或来自未患所述神经变性疾病的参照受试群的所述生物标记的水平。在所公开的方法中，未患神经变性疾病的参照群测定得到的水平与所述测试受试者的水平之间的相关性可鉴定所述测试受试者患所述特定神经变性疾病的较低风险。同样，所述患有神经变性疾病的参照群测定得到的水平与所述测试受试者的水平之间的相关性可鉴定所述受试者患所述神经变性疾病的较高风险。
“相关性”意为数据之间的任何关系。例如，相关性可通过生物标记表达水平或活性的统计分析(如标准差、置信度等)确定。相关性还可为以生物标记表达水平或活性为基础的经验测定。
将基因产物数据(如转录物和/或蛋白组学数据)进行下述统计分析。考虑到技术上的不稳定性，每个受试样本以三个平行样在二维凝胶上电泳(如52个受试样本×3个凝胶＝156个凝胶)。然后将平均得到的斑点强度用于进一步分析。性别、基本的临床诊断和临床指标可与蛋白组学数据一起考虑。可将使用单变量统计方法如双样本t-检验的基本比较法用于鉴定那些在白细胞中其表达在患病受试者和对照组之间不同的蛋白。二维凝胶电泳和MALDI-TOF质谱法得到的蛋白组学数据可首先由包含在Progenesis Workstation Image Analysis and Informatics软件程序(Nonlinear USA，Inc.；Durham，NC)中的、包括t-检验和ANOVA在内的统计工具分析。在这些数据之间具有高度依赖性的情况下，可将逐级降低多变量的重新取样算法(step-down multivariate resamplingalgorithm)用于进行多种检验，如在Troendle，A permutationalstep-up method of testing multiple outcomes，Biometrics，1996；52：846-859中所公开的那样，该文献中至少对统计方法的教导的内容以援引的方式纳入本文。
在某些方面，多变量统计方法在这类研究中所考虑的全部类别和联系中更为合适且有效。可进行典型判别分析以利用所公开方法中全部基因产物的分布图。可使用基于多变量观察结果的组次之间的逻辑判别(logistic discrimination)，因为它通常进行基于正常理论值的线性判别分析(参见McLachlan，Discriminant analysis and statis ticalpattern recognition，Wiley，New York，1992，至少就其对统计方法的教导通过援引将其纳入本文)。为鉴定与行为指标相关的那些蛋白质，可将线性模型和广义线性模型(如那些在Nelder and McCullagh，Generalized Linear Models，CRC Press，Boca Raton，FL，1999中公开的模型，至少就其对线性模型的教导通过援引将其纳入本文)用来对在神经变性疾病和非神经变性疾病的白细胞中差异表达的蛋白进行扼要表征，并鉴定那些其表达变化与疾病的严重程度相关的蛋白。这些模型还考虑了一些临床因素的混淆结果。漏测值可如Little和Little(Applications of Modern Missing Data Methods，CRC Press，BocaRaton，FL，2002，其中至少关于统计方法的教导以援引的方式纳入本文)所建议那样处理。在数据分析具有不可预期的复杂性的情况下，本领域的技术人员可寻求合适的统计方法，甚至可开发和编程实现这些特定目的的统计方法，包括使用在Efron and Tibshirani，Empiricalbayes methods and false discovery rates for microarrays，GenetEpidemiol.2002；23：70-86(至少就其对统计方法的教导通过援引将其纳入本文)中所提出的非参数的经验贝叶斯分析。
d)区分一种神经变性疾病和另一种疾病的方法
另一方面，本文公开了一种在测试受试者中鉴别诊断神经变性疾病(如帕金森并或阿尔茨海默病)的方法。所公开的方法包括：评估包括取自所述测试受试者的白细胞或其裂解物在内的样本中一种或多种所选择生物标记的表达水平或活性，并将该所选择生物标记的表达水平或活性与参照标准相比较，所述参照标准指示在一群或多群患有一种或多种神经病理性对照疾病的神经病理性对照受试者中所述所选择生物标记的表达水平或活性。在所公开的方法中，所选择生物标记的表达水平或活性和参照标准之间的差异或相似性指示与所述神经病理性对照疾病相比某种神经变性疾病的鉴别诊断。
“鉴别诊断”指鉴定受试者是否患有某种具体疾病和/或鉴定受试者是否未患另一种疾病。该短语还指某种具体疾病区别于另一种疾病或区别于未患有该病。本文中还使用“差异诊断”以指鉴定某种疾病的具体阶段，鉴定发展具体疾病的风险，或鉴定具体疾病的预后情况。
“神经病理性对照受试者”指患有本文所描述的一种或多种神经变性疾病的一名受试者(如人)或一组受试者。例如，神经病理性对照受试者可为一名或多名患有如下疾病的受试者：阿尔茨海默病、额颞叶痴呆(frontal-temporal dementia)、轻度认知缺损和帕金森病以及包括其他症状(如多系统萎缩症、皮质延髓神经节变性、具有阿尔茨海默病的帕金森病)的疾病。神经病理性对照受试者还可为未患具体疾病的一名受试者或一组受试者。另外，神经病理性对照受试者还可为具有发展疾病的具体风险或有易患病体质的一名受试者或一组受试者。
在这些方法中，所述测试受试群和所述参照群年龄或性别相匹配或两者均相匹配。
e)鉴定生物标记的方法
神经变性疾病如帕金森病或阿尔茨海默病的生物标记可通过本文所公开的方法鉴定。一方面，鉴定具体神经变性疾病的生物标记的方法可包括评估样本中一种或多种基因产物的表达水平，所述样本包括取自被诊断患有所述神经变性疾病的至少一名受试者(如人)的白细胞或其裂解物，并将所述基因产物的表达水平与参照标准相比较。在本方法中，与参照标准相比，所述基因产物的表达水平的升高或降低可将所述基因产物鉴定为具体神经变性疾病的生物标记。
在某些情况下，相同的生物标记可用于诊断、监测疾病进程，并且/或者监测受试者对疾病治疗的反应，是相同的生物标记。所述生物标记的表达发生变化(在两种或多种不同用途的条件下)可反映出相同的基本生化和代谢途径，所述生化和代谢途径构成了所述具体神经变性疾病的病理学基础。例如，相同的生物学途径可使得基因产物在未患有神经变性疾病的健康受试者中以特定水平表达，并可使得所述相同基因产物在响应对该疾病的治疗的受试者中以相似水平表达。
另外，因为某些生物标记的表达发生变化是由于构成疾病病理学基础的生化/代谢途径发生了变化，所以这些生物标记还表示治疗靶标。若生物标记的表达变化可引起神经变性疾病的一种或多种症状，则所述生物标记可为治疗靶标。治疗靶标可用于发现化合物(即候选治疗药剂)的方法中，所述化合物可调节一种或多种候选生物标记的表达或活性，并且/或者改善所述神经变性疾病的一种或多种症状。
5.阿尔茨海默病的临床特征
一百年前，Alois Alzheimer描述了以其姓名命名的神经变性疾病的主要行为特征和神经病理学特征。AD在临床/行为上的特征在于记忆和认知的进行性损伤。与此临床症状的缓慢进展相关的神经病理学变化和神经生物学变化包括淀粉状斑块的累积和神经纤维缠结(NFT)(Gearing M，et al.，The Consortium to Establish a Registry forAlzheimer’s Disease(CERAD).Part X.Neuropathology confirmationof the clini cal diagnos is of Alzheimer’s disease.Neurology.1995；45(3Pt1)：461-466)、神经胶质增生(Unger JW，MicroscopyRes.Technique，1998；43：24-28)、树突可塑性相对于正常年龄段有所降低(Buell and Coleman，Science，1979；206(4420)：854-856；FloodDG，et al.，brain Research，1985；345(2)：366-368；Flood DG，etal.，brain Research，1987；402(2)：205-216)以及神经元密度有所降低(Coleman PD，et al.，Neurobiology of Aging，1987；8(6)：521-545；Terry RD，et al.，Annals of Neurology，1987；21：530-539；West MJ，et al.，Lancet，1994；344：769-772)和突触密度有所降低(Scheff SW，et al.，Neurobiology of Aging，1990；11(1)：29-37)。
6.阿尔茨海默病的基因表达
对在阿尔茨海默病患者的脑组织中基因表达发生变化的研究表明信息水平普遍降低，估计降低了约35％(Doebler JA，et al.，J.Neuropathology & Experimental Neurology，1987；46(1)：28-39)、(Griffin WS，et al.，Alzheimer Disease & Associated Disorders，1990；4(2)：69-78)、(Harrison PJ，et al.，Psychological Medicine，1991；21：855-866)。针对mRNA的普遍下降这一情况，所选择的研究表明各种基因的表达有增有降。一些在阿尔茨海默病中受到影响的基因类型以神经元特异方式表达。这些基因类型特别包括表达降低的所选择基因，所述所选择基因与突触的结构和功能以及神经元细胞骨架相关(Ginsberg SD，et al.，Annals of Neurology，2000；48(1)：77-87；Yao P，et al.，J.Neuroscience，1998；18(7)：2399-2411)。其他其表达在AD中发生改变的基因类型包括那些与细胞周期相关的基因(Arendt T，Neurobiology of Aging，2000；21(6)：783-796；HussemanJW，et al.，Neurobiology of Aging，2000；21(6)：815-828；Nagy Z，et a l.，Neurobiology of Aging，2000；21(6)：761-769；Vincent I，et al.，J.Neuroscience，1997；17：3588-3598)和炎性/应激反应的基因(为查阅，参见Akiyama H，et al.，Neurobiology of Aging，2000；21(3)：383-421)。这些基因类型在存在于神经系统之外的多种细胞类型中表达，包括白细胞(Wakutani Y，et al.，Dementia，1995；6(6)：301-305)、单核细胞(Jung SS，et al.，Neurobiology of Aging，1999；20(3)：249-257)和上皮细胞(Schmitz A，et al.，Histochemistry& Cell Biology，2002；117(2)：171-180)以及其他细胞类型。
可将对来自死人脑的单个神经元或匀浆组织的多种基因产物(信息)的表达分布的多变量分析用于区分神经变性疾病(如帕金森病和阿尔茨海默病)样本和对照样本(Cheetham JE，et al.，J.NeuroscienceMethods，1997；77(1)，：43-48，Chow N，et a l.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1998；95：9620-9625)。
如本文所公开，与使用多种基因诊断神经变性疾病(如帕金森病和阿尔茨海默病)相关的数据是从诸如外周血液和血液白细胞获得的。例如，可使用变化系列的基因，并且与炎性反应以及细胞周期相关的基因是可以肯定的。血液采集自在本阿尔茨海默病中心被诊断患有可能(轻度)AD的患者，并采集自年龄和性别相匹配的对照样本。信息自外周血液中的白细胞提取并被扩增(Eberwine J，et al.，PNAS U.S.A.1992；89(7)：3010-3014)。然后将所选择信息的表达水平进行定量。多变量统计分析了分化性阿尔茨海默病的白细胞和对照白细胞。发现与细胞周期和炎性反应相关的基因的表达水平使AD病例的血液样本可区别于未患痴呆的对照病例的样本。还表明这些特别的基因系列和类型是在AD脑中也差异表达的基因类型。本研究采用三个不同系列的病例重复了三次。
如本文所公开，与细胞周期和炎性反应相关的基因的表达在AD病例的外周白细胞中受到影响，这是一个与AD脑中这些基因类型的表达发生变化相一致的发现。就本文所给出的数据而论，可以得出两个主要的结论：(1)多种基因的表达分布可有效区分轻度AD(平均CDR为1.2-1.5)病例和未患痴呆的对照病例以及；(2)描述为区分AD外周血液样本和对照外周血液样本的基因类型与已发现其表达在AD脑中发生了变化的基因类别相似。这与AD作为全身性疾病或主要引起全身性后果的疾病的概念相一致。
C.组合物
公开了用于制备所公开组合物的组分，也公开了在本文所公开方法中使用的组合物本身。本文公开了这些和那些材料，所理解的是：在这些材料的组合、子集、相互作用、分组等被公开，而每种不同的单个和共同的组合以及这些化合物的置换的具体参照没有清楚公开时，每一种均在本文中被特别考虑并描述。例如，如果诊断神经变性疾病的具体方法被公开和详细描述，并且对许多分子进行的许多修饰包括诊断神经变性疾病的方法被详细描述，则特别考虑了诊断神经变性疾病的方法的每种组合和置换以及可能的修饰，前提是没有特别指出相反。因此，若公开了一类分子A、B和C以及一类D、E和F，并且公开了组合分子A-D的实例，则即便每一种没有单独列举，还是认为每一种被单独和共同考虑的有意义组合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F已被公开。同样，这些组合的任何子集或组合也被公开。因此，认为例如A-E、B-F和C-E的亚组被公开。这个概念用于本申请的所有方面，包括但不限于制备和使用所公开的组合物的方法中的步骤。因此，若有许多其他需要进行的步骤，则应该理解的是这些其他步骤中的每一步可由所公开方法的任何一个具体实施方案或实施方案的组合进行。
1.序列相似性
应该理解的是：正如所本所详细讨论，术语同源性和同一性的使用意味着与相似性相同的含义。因此，例如，若单词同源性的使用被用于两条非天然序列之间，则应该理解的是，这并非必然指这两条序列之间的进化关系，而是着眼于其核酸序列的相似性或亲缘关系。很多测定两种进化相关分子之间的同源性的方法通常施用于任何两种或多种核酸或蛋白，目的在于测量序列相似性，而不管它们是否进化相关。
一般而言，所理解的是，限定本文所公开基因和蛋白的任何一种已知变体和衍生物或可能出现的那些变体和衍生物的一种方法是通过依照具体已知的序列的同源性限定变体和衍生物。本文所公开具体序列的这种同一性还在本文其他地方得以描述。总的来说，本文所公开基因和蛋白的变体一般与所述序列或天然序列有至少约70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、或99％的同源性。本领域的普通技术人员很容易理解如何确定两种蛋白或核酸如基因的同源性。例如，同源性可在比对两条序列之后计算得到，这样同源性就处于最高水平。
计算同源性的另一种方法可通过已公布的算法进行。序列比较的最佳比对可通过如下方法进行：Smith and Waterman，Adv.Appl.Math，1981；2：482的局部同源性算法、Needleman and Wunsch，J.Mol.Biol.，1970；48：443的同源性比对算法、Pearson andLipman，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1988；85：2444的相似性方法研究、这些算法的计算机执行(GAP，BESTFIT，FASTA，and TFASTA in the Wisconsin GeneticsSoftware Package，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)或检查。
核酸的同类同源性可由例如在Zuker M，Science，1989；244：48-52；Jaeger，et al.，Proc.Nat l.Acad.Sci.U.S.A.，1989；86：7706-7710；Jaeger，et al.，Methods Enzymol.，1989；183：281-306(至少就与核酸比对相关的材料通过援引将其纳入本文)中所公开的算法获得。所理解的是，一般可使用任何一种方法，并且在某些情况下，这些不同方法的结果可能有所不同，但是本领域的技术人员所理解的是，如果由这其中的至少一种方法发现具有同一性，则就认为该序列具有所述同一性并由本文公开。
例如，本文所使用的、被描述为与另一条序列有特定百分率同源性的序列指的是，具有由上述的一种或多种计算方法计算得到的所述同源性的序列。例如，如果使用Zuker计算方法计算得到第一条序列与第二条序列具有80％同源性，则所述第一条序列与所述第二条序列具有本文所述的80％同源性，即便是由其他计算方法计算发现所述第一条序列与所述第二条序列没有80％同源性。作为另一个实例，如果使用Zuker计算方法和Pearson和Lipman计算方法均计算得到第一条序列与第二条序列具有80％同源性，则所述第一条序列与所述第二条序列具有本文所述的80％同源性，即便是由Smith和Waterman计算方法、Needlman和Wunsch计算方法、Jaeger计算方法或任何一种其他计算方法计算得到所述第一条序列与所述第二条序列没有80％同源性。作为又一个实例，如果使用每种计算方法计算得到第一条序列与第二条序列具有80％同源性(虽然实际上不同的计算方法通常会计算得到不同的同源性百分比)，则所述第一条序列与所述第二条序列具有本文所述的80％同源性。
2.杂交/选择性杂交
术语杂交一般意为至少两种核酸分子如引物或探针和基因之间序列驱动的相互作用。序列驱动的相互作用意为以核苷酸特异方式出现在两种核苷酸或核苷酸类似物或核苷酸衍生物之间的相互作用。例如，G与C相互作用或A与T相互作用即是序列驱动相互作用。一般地，序列驱动相互作用出现在核苷酸的Was ton-Cr ick面或Hoogs teen面。两种核酸的杂交受到本领域技术人员已知的许多条件和参数的影响。例如，盐浓度、pH和反应温度都影响到两种核酸分子是否会杂交。
两种核酸分子之间选择性杂交的参数为本领域的技术人员已知。例如，在某些实施方案中，选择性杂交条件可定义为严格杂交条件。例如，杂交的严格度受控于杂交和洗涤步骤之一或两者的温度和盐浓度。例如，实现选择性杂交的杂交条件包括在高离子强度溶液(6×SSC或6×SSPE)中于低于Tm(解链温度，此时一半的分子与其杂交伙伴解离)约12-25℃的温度下杂交，然后在所选择的使得洗涤温度低于Tm约5℃至约20℃的温度和盐浓度的组合条件下洗涤。温度和盐浓度很容易根据经验在预实验中得以确定，在此预实验中，固定在滤器上的参照DNA的样本与所研究的标记核酸杂交，然后在不同严格度的条件下洗涤。DNA-RNA和RNA-RNA杂交的杂交温度一般较高。可使用如上文所述或本领域已知的所述条件获得严格度。(Sambrook，et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，N.Y.，1989；Kunkel，et al.Methods Enzymol.，1987；154：367，就至少与核酸杂交相关的材料将其纳入本文)。DNA：DNA杂交的优选严格杂交条件是在约68℃(在水溶液中)于6×SSC或6×SSPE中，然后在68℃洗涤。如果需要，杂交和洗涤的严格度可随所需要互补程度的降低而相应降低，并且还取决于探寻可变性的任何区域的G-C或A-T富集度。同样，如果需要，杂交和洗涤的严格度可随所需同源性的升高而相应升高，并且还取决于其中需要较高同源性的任何区域的G-C或A-T富集度，这均为本领域所知。
限定选择性杂交的另一种方法着眼于结合在另一种核酸上的一种核酸的量(百分比)。例如，在某些实施方案中，选择性杂交条件是在至少约60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％限量核酸结合至非限量核酸上时。一般地，非限量引物过量例如10或100或1000倍。这类分析可在如下条件下进行：限量和非限量引物两者均比其Kd低10倍或100倍或1000倍，或仅有一种核酸分子比其Kd低10倍或100倍或1000倍，或者其中的一种或两种核酸分子比其Kd高。
限定选择性杂交的另一种方法着眼于在需要杂交来促进所需酶操作的条件下，得到酶操作的引物的百分比。例如，在某些实施方案中，选择性杂交条件是在至少约60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％所述引物在促进酶操作的条件下得到酶操作时，例如如果酶操作为DNA延伸，则选择性杂交条件可在至少约60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％所述引物分子被延伸时。优选的条件还包括那些由制造商所建议的或本领域所指出的适合酶进行操作的条件。
正如同源性那样，所理解的是，本文公开了测定两种核酸分子之间杂交水平的各种方法。所理解的是，这些方法和条件可在两种核酸分子之间提供不同百分比的杂交，除非另外指出，否则足以满足任何方法的参数均足够。例如若要求80％杂交，并且只要杂交出现在这其中的任何一种方法中所要求的参数中，就认为在本文中公开。
所理解的是，本领域的技术人员认为如果某种组合物或方法整体或单独满足测定杂交的这些规则中的任何一条规则，则所述组合物或方法即为本文公开的组合物或方法。
3.核酸
本文公开了以核酸为基础的多种分子，包括例如编码例如本文所公开的、与神经变性疾病(如帕金森病和阿尔茨海默病)的发病或进程相关的任何一种基因的和本文所公开任何一种其他蛋白质的核酸，以及各种功能性核酸。所公开核酸包括例如核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物。这些和其他分子的非限定实例在本文中详细描述。所理解的是，例如载体在细胞中表达时，所表达的mRNA一般由A、C、G和U组成。同样，所理解的是，如果例如反义分子通过例如外源送递被导入细胞或细胞环境中，那么所述反义分子由核苷酸类似物组成是有利的，所述核苷酸类似物降低了细胞环境中所述反义分子的降解。
a)核苷酸和相关分子
核苷酸是包含碱基部分、糖部分和磷酸部分的分子。核苷酸通过其形成核苷酸间键合的磷酸部分和糖部分被键合在一起。核苷酸的碱基部分为腺嘌呤-9-基(A)、胞嘧啶-1-基(C)、鸟嘌呤-9-基(G)、尿嘧啶-1-基(U)和胸腺嘧啶-1-基(T)。核苷酸的糖部分为核糖或脱氧核糖。核苷酸的磷酸部分为五价磷酸。核苷酸的非限定实例为3’-AMP(3’-单磷酸腺苷)或5’-GMP(5’-单磷酸鸟苷)。
核苷酸类似物为包含对碱基、糖或磷酸部分有某种类型的修饰的核苷酸。对核苷酸的修饰为本领域已知，包括例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤和2-氨基腺嘌呤以及在糖或磷酸部分的修饰。
核苷酸替代物为具有与核苷酸相似功能性质但并不包含磷酸部分的分子，如肽核酸(PNA)。核苷酸替代物是以Waston-Crick或Hoogsteen方式识别核酸、但通过除磷酸部分外的部分连接在一起的分子。核苷酸替代物在与合适的靶标核酸相互作用时能形成双螺旋型结构。
还能将其他类型的分子(缀合物)连接至核苷酸或核苷酸类似物，以提高例如细胞摄入。缀合物可通过化学方式连接至核苷酸或核苷酸类似物。这类缀合物包括但不限于脂质部分如胆固醇部分。(Letsinggr etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86，6553-6556)。
Watson-Crick相互作用是与核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物的Watson-Crick面的至少一种相互作用。核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物的Watson-Crick面包括基于嘌呤的核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物的C2、N1和C6位置以及基于嘧啶的核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物的C2、N3、C4位置。
Hoogsteen相互作用为在核苷酸或核苷酸类似物的Hoogsteen面上发生的相互作用，所述核苷酸或核苷酸类似物暴露于双链DNA的大沟。Hoogs teen面包括嘌呤核苷酸的N7位置和C6位置上的反应基团(NH2或0)。
(1)引物和探针
所公开的组合物包括引物和探针，它们能与本文所公开的基因相互作用。在某些实施方案中，所述引物被用于支持DNA扩增反应。通常所述引物能以序列特异性方式被延伸。引物以序列特异性方式的延伸可包括任何方法，其中，与引物杂交或以其他方式连接的核酸分子的序列和/或组合物指导或影响由引物的延伸产生的产物的组合物或序列。因此，引物以序列特异性方式的延伸包括但不限于PCR、DNA测序、DNA延伸、DNA聚合、DNA转录或反转录。优选以序列特异性方式扩增引物的技术和条件。在某些实施方案中，引物用于DNA扩增反应如PCR或直接测序。所理解的是，在某些实施方案中，还可使用非酶学技术延伸引物，其中例如，用于扩增引物的核苷酸或寡核苷酸被修饰，这样它们会以序列特异性方式通过化学反应延伸引物。一般地，所公开引物与核酸或核酸的某个区域杂交，或者它们与核酸的互补部分或核酸某个区域的互补部分杂交。
与表4列出的转录物相互作用的引物或探针的尺寸，如与细胞周期相关的转录物如细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白G1、wee1、hTR2、CDC25b、GSK3β和蛋白激酶Cα；与炎性系统相关的转录物如C5、C1抑制剂、IL-17r、IL-8、LIF、TNF-α和IL-10r；和与细胞应激相关的转录物如α-1抗胰凝乳蛋白酶、HSP27、HSP90、晶体蛋白、GAPDH、铁蛋白H、铁蛋白L、cox1、cox2和转铁蛋白；和表5和6列出的蛋白质的转录物。在某些实施方案中，所述引物或探针可为支持引物的所需酶操作如DNA扩增或所述探针或引物的简单杂交的任何尺寸。下述基因的典型引物或探针至少长6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3500或4000个核苷酸：表4列出的基因如细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白G1、wee1、hTR2、CDC25b、GSK3β和蛋白激酶Cα(它们与细胞周期相关)；C5、C1抑制剂、IL-17r、IL-8、LIF、TNF-α和IL-10r(它们与炎性系统相关)；和α-1抗胰凝乳蛋白酶、HSP27、HSP90、晶体蛋白、GAPDH、铁蛋白H、铁蛋白L、cox1、cox2和转铁蛋白(它们与细胞应激相关)；和表5和6列出的蛋白质的基因。
在其它实施方案中，下述基因的引物或探针小于等于6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3500或4000个核苷酸：表4列出的基因如细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白G1、weel、hTR2、CDC25b、GSK3β和蛋白激酶Cα(它们与细胞周期相关)；C5、C1抑制剂、IL-17r、IL-8、LIF、TNF-α和IL-10r(它们与炎性系统相关)；和α-1抗胰凝乳蛋白酶、HSP27、HSP90、晶体蛋白、GAPDH、铁蛋白H、铁蛋白L、cox1、cox2和转铁蛋白(它们与细胞应激相关)；和表5和6列出的蛋白质的基因。
在某些实施方案中，设计引物和探针使之成为外侧引物，所述外侧引物与表4列出的基因如细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白G1、wee1、hTR2、CDC25b、GSK3β和蛋白激酶Cα(它们与细胞周期相关)；C5、C1抑制剂、IL-17r、IL-8、LIF、TNF-α和IL-10r(它们与炎性系统相关)；和α-1抗胰凝乳蛋白酶、HSP27、HSP90、晶体蛋白、GAPDH、铁蛋白H、铁蛋白L、cox1、cox2和转铁蛋白(它们与细胞应激相关)；和表5和6列出的蛋白质的基因相互作用的最近点与如下基因的最宽泛的核苷酸边界相距0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175或200个核苷酸内：表4所列基因如细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白G1、wee1、hTR2、CDC25b、GSK3β、蛋白激酶Cα、C5、C1抑制剂、IL-17r、IL-8、LIF、TNF-α和IL-10r、α-1抗胰凝乳蛋白酶、HSP27、HSP90、晶体蛋白、GAPDH、铁蛋白H、铁蛋白L、cox1、cox2和转铁蛋白、表4列出的基因如细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白G1、wee1、hTR2、CDC25b、GSK3β、蛋白激酶Cα、C5、C1抑制剂、IL-17r、IL-8、LIF、TNF-α和IL-10r、α-1抗胰凝乳蛋白酶、HSP27、HSP90、晶体蛋白、GAPDH、铁蛋白H、铁蛋白L、cox1、cox2和转铁蛋白的某个区域或互补部分，以及表5和6列出的蛋白质的基因。
在某些实施方案中，设计引物和探针使之成为外侧引物，所述外侧引物与表4列出的基因如细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白G1、weel、hTR2、CDC25b、GSK3β和蛋白激酶Cα、C5、C1抑制剂、IL-17r、IL-8、LIF、TNF-α和IL-10r、α-1抗胰凝乳蛋白酶、HSP27、HSP90、晶体蛋白、GAPDH、铁蛋白H、铁蛋白L、cox1、cox2和转铁蛋白以及表5和6列出的蛋白质的基因相互作用的最近点与如下基因的最宽泛的核苷酸边界相距至少0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175或200个核苷酸：表4所列基因如细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白G1、weel、hTR2、CDC25b、GSK3β、蛋白激酶Cα、C5、C1抑制剂、IL-17r、IL-8、LIF、TNF-α和IL-10r、α-1抗胰凝乳蛋白酶、HSP27、HSP90、晶体蛋白、GAPDH、铁蛋白H、铁蛋白L、cox1、cox2和转铁蛋白、表4列出的基因如细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白G1、weel、hTR2、CDC25b、GSK3β、蛋白激酶Cα、C5、C1抑制剂、IL-17r、IL-8、LIF、TNF-α和IL-10r、α-1抗胰凝乳蛋白酶、HSP27、HSP90、晶体蛋白、GAPDH、铁蛋白H、铁蛋白L、cox1、cox2和转铁蛋白的某个区域或互补部分，以及表5和6列出的蛋白质的基因。
如下基因的引物一般用于生产含有所述基因特定区域的DNA扩增产物：表4列出的基因如细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白G1、wee1、hTR2、CDC25b、GSK3β和蛋白激酶Cα、C5、C1抑制剂、IL-17r、IL-8、LIF、TNF-α和IL-10r、α-1抗胰凝乳蛋白酶、HSP27、HSP90、晶体蛋白、GAPDH、铁蛋白H、铁蛋白L、cox1、cox2和转铁蛋白以及表5和6列出的蛋白质的基因。一般而言，所述产物的大小通常与被准确测定的大小相差在1或2或3个核苷酸以内。
在某些实施方案中，该产物至少长20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3500或4000个核苷酸。
在某些实施方案中，该产物小于或等于20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3500或4000个核苷酸。
(2)功能核酸
功能核酸为具有特定功能例如结合靶标分子或催化特定反应的核酸分子。功能性核酸分子可被分为如下类型，但不限于此。例如，功能核酸包括反义分子、适体、核酶、三链形成分子(triplex formingmolecule)和外部指导序列。功能核酸分子可作为靶标分子所具有的特定活性的影响物、抑制物、调节物和刺激物，或者功能核酸分子可具有不依赖于任何其他分子的新活性(de novo activity)。
功能核酸分子可与任何大分子如DNA、RNA、多肽或糖链相互作用。因此，功能核酸可与如下基因的mRNA相互作用：表4列出的基因如细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白G1、wee1、hTR2、CDC25b、GSK3β、蛋白激酶Cα、C5、C1抑制剂、IL-17r、IL-8、LIF、TNF-α和IL-10r、α-1抗胰凝乳蛋白酶、HSP27、HSP90、晶体蛋白、GAPDH、铁蛋白H、铁蛋白L、cox1、cox2和转铁蛋白和表5和6列出的蛋白质的基因；或者功能核酸可与如下基因的基因组DNA相互作用：表4列出的基因如细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白G1、wee l、hTR2、CDC25b、GSK3β、蛋白激酶Cα、C5、C1抑制剂、IL-17r、IL-8、LIF、TNF-α和IL-10r、α-1抗胰凝乳蛋白酶、HSP27、HSP90、晶体蛋白、GAPDH、铁蛋白H、铁蛋白L、cox1、cox2和转铁蛋白和表5和6列出的蛋白质的基因；或者它们可与如下基因的多肽产物相互作用：表4列出的基因如细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白G1、wee l、hTR2、CDC25b、GSK3β、蛋白激酶Cα、C5、C1抑制剂、IL-17r、IL-8、LIF、TNF-α和IL-10r、α-1抗胰凝乳蛋白酶、HSP27、HSP90、晶体蛋白、GAPDH、铁蛋白H、铁蛋白L、cox1、cox2和转铁蛋白和表5和6列出的蛋白质的基因。通常设计功能核酸使之以靶标分子和功能核酸分子之间的序列同源性为基础与其他核酸相互作用。在其他情况下，功能核酸分子和靶标分子之间的特异性识别并非基于功能核酸分子和靶标分子之间的序列同源性，而是基于使特异性识别发生的三级结构的形成。
设计反义分子使之通过典型的或非典型的碱基配对与靶标核酸分子相互作用。设计反义分子和靶标分子的相互作用使之通过例如RNAseH介导RNA-DNA杂合体的降解促进对靶标分子的破坏。或者，设计反义分子使之打断通常在靶标分子上发生的加工功能，如转录或复制。可基于靶标分子的序列设计反义分子。存在很多通过寻找靶标分子最易接近区域优化反义效率的方法。示例性方法为使用DMS和DEPC的DNA修饰研究和体外选择实验。优选反义分子以小于等于10-6、10-8、10-10或10-12的解离常数(Kd)结合靶标分子。有助于设计和使用反义分子的方法和技术的代表样本可参见美国专利的非穷尽列表：5,135,917、5,294,533、5,627,158、5,641,754、5,691,317、5,780,607、5,786,138、5,849,903、5,856,103、5,919,772、5,955,590、5,990,088、5,994,320、5,998,602、6,005,095、6,007,995、6,013,522、6,017,898、6,018,042、6,025,198、6,033,910、6,040,296、6,046,004、6,046,319和6,057,437。
适体为与靶标分子相互作用的分子，优选以特异方式。一般而言，适体为具有15-50个碱基的小核酸，它们折叠成确定的二级和三级结构如茎-环或鸟嘌呤四联体。适体可结合小分子如ATP(美国专利No.5,631,146)和茶碱(theophiline)(美国专利No.5,580,737)，以及大分子如反转录酶(美国专利No.5,786,462)和凝血酶(美国专利No.5,543,293)。适体可以小于10-12的kd与靶标分子紧密结合。优选地，适体以小于10-6、10-8、10-10或10-12的kd结合靶标分子。适体可以非常高程度的特异性结合靶标分子。例如，可分离在靶标分子和另一种分子之间结合亲和力差异超过1000倍的适体，所述靶标分子和另一种分子在其分子上仅有一个位置有所不同(美国专利No.5,543,293)。优选适体与靶标分子的kd比其与背景结合分子的kd至少低10、100、1000、10,000或100,000倍。优选在对多肽进行比较时，例如背景分子是不同的多肽。例如，在测定如下基因的适体的特异性时，背景蛋白可为血清白蛋白：表4列出的基因如细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白G1、wee l、hTR2、CDC25b、GSK3β和蛋白激酶Cα、C5、C1抑制剂、IL-17r、IL-8、LIF、TNF-α和IL-10r、α-1抗胰凝乳蛋白酶、HSP27、HSP90、晶体蛋白、GAPDH、铁蛋白H、铁蛋白L、cox1、cox2和转铁蛋白和表5和6列出的蛋白质的基因。如何制备和使用结合多种不同靶标分子的适体的代表实例可参见下面的美国专利的非穷尽列表：5,476,766、5,503,978、5,631,146、5,731,424、5,780,228、5,792,613、5,795,721、5,846,713、5,858,660、5,861,254、5,864,026、5,869,641、5,958,691、6,001,988、6,011,020、6,013,443、6,020,130、6,028,186、6,030,776和6,051,698。
核酶是能催化分子内或分子间化学反应的核酸分子。因此核酶是催化核酸。优选核酶催化分子间的反应。有很多种不同类型的催化核酶或核酸聚合酶型反应的核酶，所述核酶基于自然系统中存在的核酶，例如锤头状核酶、(例如但不限于下列美国专利No.5,334,711、5,436,330、5,616,466、5,633,133、5,646,020、5,652,094、5,712,384、5,770,715、5,856,463、5,861,288、5,891,683、5,891,684、5,985,621、5,989,908、5,998,193、5,998,203、Ludwig和Sproat的WO9858058、Ludwig和Sproat的9858057，以及Ludwig和Sproat的WO9718312)、发卡结构核酶(例如但不限于下列美国专利No.5,631,115、5,646,031、5,683,902、5,712,384、5,856,188、5,866,701、5,869,339和6,022,962)以及四膜虫核酶(tetrahymena ribozyme)(例如但不限于下列美国专利No.5,595,873和5,652,107)。还有很多不在自然系统中存在但已通过工程化使其重新催化特定反应的核酶(例如但不限于下列美国专利No.5,580,967、5,688,670、5,807,718和5,910,408)。优选的核酶切割RNA或DNA底物，并更优选切割RNA底物。核酶一般通过识别和结合靶向底物随后切割来切割核酸底物。这种识别通常主要基于典型的或非典型的碱基配对相互作用。这种性质使得核酶成为靶向特异切割核酸的特别良好的候选物，因为靶向底物的识别是基于靶向底物序列。如何制备和使用催化多种不同反应的核酶的代表实例参见下面的美国专利的非穷尽列表：No.5,646,042、5,693,535、5,731,295、5,811,300、5,837,855、5,869,253、5,877,021、5,877,022、5,972,699、5,972,704、5,989,906和6,017,756。
三链形成功能核酸分子是可与双链核酸或单链核酸相互作用的分子。三链分子与靶区域相互作用时，就形成了称为三链的结构，其中有基于Watson-Crick和Hoogsteen碱基配对的形成复合物的三条DNA链。优选三链分子，因为它们可以较高亲和力和特异性结合靶向区域。优选三链形成分子以小于10-6、10-8、10-10或10-12的kd结合靶分子。如何制备和使用结合多种不同靶分子的三链分子的代表实例可参见下面的美国专利的非穷尽列表：No.5,176,996、5,645,985、5,650,316、5,683,874、5,693,773、5,834,185、5,869,246、5,874,566和5,962,426。
外部指导序列(EGS)是结合形成复合物的靶标核酸分子的分子，并且该复合物可被切割靶标分子的RNA酶P所识别。可将EGS设计为特异性靶向所选择的RNA分子。RNA酶P有助于加工细胞内的转录RNA(tRNA)。可募集细菌RNA酶P，使其通过使用可使靶标RNA：EGS复合物模拟天然tRNA底物的EGS实际切割任何RNA。(Yale的WO 92/03566，以及Forsterand Altman，Science，1990；238：407-409)。
同样，真核EGS/RNA酶P指导的RNA切割可用于切割真核细胞内的所需靶标。(Yuan，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1992；89：8006-8010；Yale的WO93/22434；Yale的WO95/24489；Yuanand Altman，EMBO J.，1995；14：159-168；和Carrara，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1995；92：2627-2631)。如何制备和使用有助于切割多种不同靶标分子的EGS的代表实例可参见下面的美国专利非穷尽列表：5,168,053、5,624,824、5,683,873、5,728,521、5,869,248和5,877,162。
4.肽
本文还公开了以氨基酸为基础的组合物如蛋白质、肽和多肽。如本文所述以及如本领域的技术人员所理解的那样，“蛋白质”“肽”或“多肽”指以氨基酸为基础的聚合物，包括变体、衍生物和修饰物。氨基酸序列修饰物一般属于如下三类中的一类或多类：置换变体、插入变体或缺失变体。插入包括氨基和/或羧基端融合以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。插入通常是较氨基或羧基端融合的那些插入更小的插入，例如在一至四个残基的数量级上。缺失的特征在于将一个或多个氨基酸残基从蛋白序列上除去。一般，蛋白质分子内任何一个位点缺失不超过约2至6个残基。氨基酸置换一般为单个残基，但是可一次出现在多个不同位置；插入通常在约1至10个氨基酸残基的数量级上；缺失介于约1至30个残基的范围内。置换、缺失、插入或其任何一个组合可出现在本文所公开的蛋白中。术语“蛋白”“肽”和“多肽”在本文中可互换使用。
可用于本文所公开的方法中的示例性蛋白质包括HSP60、二氢硫辛酰胺脱氢酶、ER-60蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、ATP-合成酶β链、膜联蛋白I、14-3-3蛋白ε、抑制素、磷酸甘油酸变位酶1、载脂蛋白AI、超氧化物歧化酶、RNA-结合蛋白调节亚基、A链硫氧还蛋白过氧化物酶B、RAS相关蛋白RAP1B、肿瘤排斥抗原、触珠蛋白、纤维蛋白β、肌动蛋白相互作用蛋白1(AIP1)、有丝分裂原活化蛋白激酶I(MAPKI)、肌动蛋白或其片段、戊二醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、转化蛋白RhoA、酸性富含亮氨酸的核磷蛋白32家族成员B(ANP32B或APRIL)、过氧化物氧还蛋白II、淀粉状前体蛋白(APP)、α-分泌酶、β-分泌酶、γ-分泌酶、Aβ肽、Fe65、Tip60、SERCA、PS1/2、结合素-1a和老年斑的非淀粉状蛋白β组分(NACP/a-突触核蛋白)。
5.变体
所理解的是有很多本文所使用的、用于神经变性疾病分析的基因的变体和等位基因，例如表4列出的基因如细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白G1、wee1、hTR2、CDC25b、GSK3β、蛋白激酶Cα、C5、C1抑制剂、IL-17r、IL-8、LIF、TNF-α和IL-10r、α-1抗胰凝乳蛋白酶、HSP27、HSP90、晶体蛋白、GAPDH、铁蛋白H、铁蛋白L、cox1、cox2和转铁蛋白。这些变体和等位基因可如本文所公开那样检测神经变性疾病(如帕金森病和阿尔茨海默病)。如本文所述，有很多种表4列出的基因的基因产物的变体，例如细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白G1、wee1、hTR2、CDC25b、GSK3β、蛋白激酶Cα、C5、C1抑制剂、IL-17r、IL-8、LIF、TNF-α和IL-10r、α-1抗胰凝乳蛋白酶、HSP27、HSP90、晶体蛋白、GAPDH、铁蛋白H、铁蛋白L、cox1、cox2和转铁蛋白，这些基因是已知的并且在本文中得以考虑。一般这些变体表现出与相关核酸或基因有所变化，因此公开了由于例如等位基因或品系差异产生的已被公开的如下诊断和预后基因如表4列出的基因(如细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白G1、wee1、hTR2、CDC25b、GSK3β、蛋白激酶Cα、C5、C1抑制剂、IL-17r、IL-8、LIF、TNF-α和IL-10r、α-1抗胰凝乳蛋白酶、HSP27、HSP90、晶体蛋白、GAPDH、铁蛋白H、铁蛋白L、cox1、cox2和转铁蛋白)的变体。蛋白质和核酸的变体和衍生物和等位基因为本领域的技术人员所熟知，并且可包括对氨基酸序列的修饰。应当理解的是，可通过处理例如具体的等位基因而实现对方法或组合物的改变。
6.序列
有多种序列与如下物质相关：表4列出的基因如细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白G1、wee1、hTR2、CDC25b、GSK3β、蛋白激酶Cα、C5、C1抑制剂、IL-17r、IL-8、LIF、TNF-α和IL-10r、α-1抗胰凝乳蛋白酶、HSP27、HSP90、晶体蛋白、GAPDH、铁蛋白H、铁蛋白L、cox1、cox2和转铁蛋白；以及表5列出的基因，例如HSP60、二氢硫辛酰胺脱氢酶、ER-60蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、ATP-合成酶β链、膜联蛋白I、14-3-3蛋白ε、抑制素、磷酸甘油酸变位酶1、载脂蛋白AI、超氧化物歧化酶、RNA-结合蛋白调节亚基、A链硫氧还蛋白过氧化物酶B、RAS相关蛋白RAP1B、肿瘤排斥抗原、触珠蛋白、纤维蛋白β、肌动蛋白相互作用蛋白1(AIP1)、有丝分裂原活化蛋白激酶I(MAPKI)、肌动蛋白或其片段、戊二醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、转化蛋白RhoA、酸性富含亮氨酸的核磷蛋白32家族成员B(ANP32B或APRIL)、过氧化物氧还蛋白II、淀粉状前体蛋白(APP)、α-分泌酶、β-分泌酶、γ-分泌酶、Aβ肽、Fe65、Tip60、SERCA、PS1/2、结合素-1a和老年斑的非淀粉状蛋白β组分(NACP/a-突触核蛋白)；以及本文所公开的、在Genbank公开的其他蛋白；这些序列和其他序列整体或就其中所含有的子序列通过援引纳入本文。
本文提供了多种序列，这些序列和其他序列可见于www.pubmed.gov的Genbank。本领域的技术人员理解如何分辨序列偏差和差异，如何改变与具体序列相关的组合物和方法使其与其他相关序列相适应。可设计任何给出本文所公开信息的序列和本领域已知的序列的引物和/或探针。
7.备选实施方案
所理解的是，可用本文所述的任何一种变体进行转录后加工以及翻译后加工。公开了可测量这种转录后加工或翻译后加工的技术，例如但不限于转录后沉默。
8.验证生物标记的方法
神经变性疾病的生物标记可由多种方式验证。例如，生物标记的表达可在一名或多名被诊断患有神经变性疾病的受试者和一名或多名没有患有神经变性疾病的受试者中评估。其表达在两组之间不相同的生物标记是有效的生物标记。两组受试者越多，验证结果越可靠。生物标记的表达水平还可在神经变性疾病的模型系统中评估。例如，表达水平可在神经变性疾病的动物模型的、含有白细胞的样本中测试。生物标记(或其同系物)的表达可神经变性疾病的动物模型和对照组中评估。其表达在模型动物和对照动物之间不相同的生物标记或其同系物是有效的生物标记。
9.固体支持物
本文公开了固体支持物(包括稳定形式和流动形式)，其中至少一个位置是本文所公开的生物标记或配体。还公开了固体支持物，其中至少一个位置是本文所公开的任何核酸序列或肽序列中列出的序列、部分序列或序列变体，或者为所述序列的配体。公开了芯片，此芯片至少一个位置为本文所公开的任何核苷酸序列中列出的序列或部分序列，或者与之杂交的核酸。还公开了芯片，此芯片至少一个位置为本文所公开的任何肽序列中列出的序列或部分序列，或者为所述序列的配体。
还公开了芯片，此芯片至少一个位置是本文公开的任何核酸序列列出的序列或部分序列，或与所述核酸变体杂交的核酸。还公开了芯片，此芯片至少一个位置是本文公开的任何肽序列列出的序列或部分序列，或结合所述变体肽的配体。
固体支持物包括稳定支持物如含有本文所公开的任何生物标记或所述生物标记的抗体或非抗体配体的载玻片、芯片、微阵列和纳米阵列。固体支持物还包括流动支持物如含有本文所公开的任何生物标记或所述生物标记的抗体或非抗体配体的微球。
10.计算机可读介质
所理解的是，所公开的核酸和蛋白质可表示为由核苷酸或氨基酸组成的序列。有多种方式展示这些序列，例如核苷酸鸟苷可表示为G或g。同样，氨基酸缬氨酸可表示为Va1或V。本领域的技术人员理解如何以已有的多种方式中的任何方式展示和表示任何核酸或蛋白序列，其中的每一种方式被认为在本文中公开。本文特别考虑的是这些序列在计算机可读介质例如可商购的软盘、磁带、芯片、硬盘、压缩磁盘和视盘或其他计算机可读介质上的展示。还公开了所公开序列的二进制代码表示法。本领域的技术人员理解什么是计算机可读介质。因此，核酸或蛋白质序列被记录、储存或保存在计算机可读介质上。
公开了包含本文所述序列和有关所述序列的信息的计算机可读介质。
11.试剂盒
本文公开了包括用于实施本文所公开方法的试剂的试剂盒。试剂盒可包括本文所详细描述的任何试剂或试剂的组合，或者可将其理解为实施所公开方法所需要的或对其有利的。例如，试剂盒可包括在本方法的某些实施方案中详细描述的进行扩增反应的引物，以及使用引物所需要的缓冲液和酶。在其他实例中，试剂盒可包括本文所公开的一种或多种生物标记或配体，以及根据目的使用生物标记或配体所需要的缓冲液、标记物、酶、二抗或三抗等。在另一个实例中，公开了就神经变性疾病(如帕金森病或阿尔茨海默病)诊断受试者的试剂盒，包括表4列出的一种或多种寡核苷酸。
12.诊断分析
还公开了神经变性疾病的诊断分析。所公开分析包括将含有白细胞或其裂解物的样本与神经变性疾病的生物标记的一种或多种抗体或其片段相接触。所公开生物标记的抗体可由本领域已知的方法和如本文公开那样制备。
D.制备组合物的方法
除非另外专门指出，对于具体的试剂或化合物而言，本文所公开的组合物和进行所公开方法必需的组合物可使用本领域的技术人员已知的任何方法制备。
1.核酸合成
例如，核酸如用作引物的寡核苷酸可使用标准的化学合成方法制备，或者可使用酶法或任何其他已知的方法生产。这类方法既可为标准酶消化之后进行核苷酸片段分离(参见例如Sambrook et al.，MolecularCloning：A Laboratory Manual，2nd Edition(Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)Chapters 5，6)，也可为纯粹的合成法，例如使用Milligen或Beckman System1Plus DNA合成仪(例如Milligen-Biosearch，Burlington，MA的自动合成仪，型号为8700；或ABI的自动合成仪，型号为380B)通过氰乙磷酰胺酸法。用于制备寡核苷酸的合成法还描述于Ikuta et al.，Ann.Rev.Biochem.，1984；53：323-356，(磷酸三酯法和亚磷酸三酯法)和Narang，et al.，Methods Enzymol.，1980；65：610-620，(磷酸三酯法)。蛋白质核酸分子可使用已知方法如描述于Niel sen，et al.，Bioconjug.Chem.，1994；5：3-7的那些方法制备。
2.肽合成
生产所公开蛋白质的一种方法是通过蛋白质化学技术将两种或多种肽或多肽连接在一起。例如，肽或多肽可使用现有的实验室设备，使用Fmoc(9-芴甲氧羰基)或Boc(叔丁氧羰基)化学品(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)化学合成。本领域的技术人员容易理解对应于所公开蛋白的肽或多肽例如可通过标准化学反应合成。例如，可合成肽或多肽，且并不将其从合成树脂上切割，而可合成肽或蛋白质的其他片段，并随后将其从树脂上切割，由此暴露在其他片段上被功能阻断的一个末端基团。通过肽缩合反应，这两种片段可通过肽键分别在其羟基端和氨基端共价连接，形成抗体或其片段。(Grant，Synthetic Peptides：A User Guide.WH Freeman and Co.，N.Y.，1992；Bodansky and Trost，Ed.Principles of Peptide Synthesis.Springer-Verlag Inc.，N.Y.，1993，至少就与肽合成相关的材料通过援引将其纳入本文)。
或者，肽或多肽可如本文所述在体内独立合成。例如，可利用重组糖蛋白生产方法中的进展，这使得可通过转基因兔群体(www.bioprotein.com)或通过携带人N-糖基化系统酶的酵母菌株(Hamilton，et al.，Science，2003；301：1244-6；Gerngross，NatureBiotechnology，2004；22：1409)性价比更高地生产人糖蛋白。
一旦被分离，如若需要，可将独立的肽或多肽通过相似的肽缩合反应连接形成肽或其片段。例如，克隆或合成肽区段的酶连接为相对较短的肽片段被连接产生较大的肽片段、多肽或全部蛋白质结构域提供了可能(Abrahmsen，et al.，Biochemistry，1991；30：4151)。或者，可利用合成肽的天然化学连接通过合成由较短的肽片段构建较大的肽或多肽。该方法由两步化学反应组成(Dawson，et al.，Science，1994；266：776-9)。第一步是未保护合成肽硫代酸酯与另一种含有氨基端Cys残基的未保护肽区段的化学选择反应，得到作为初始共价产物的连接硫代酸酯的中间产物。在不改变反应条件的情况下，该中间产物经历突发快速的分子内反应，在连接位点形成天然肽键(Baggiolini，et al.，FEBS Lett.1992；307：97-101；Clark-Lewi s，et al.，J.Biol.Chem.，1994；269：16075；Clark-Lewis，et al.，Biochemistry，1991；30：3128；Rajarathnam，et al.，Biochemistry，1994；33：6623-30)。
或者，未保护肽区段由化学方法连接，此时由于化学连接在肽区段之间形成的键是非天然(非肽)键(Schnolzer，et al.，Science，1992；256：221)。该技术已用于合成具有充分生物学活性的蛋白质结构域的类似物和大量相对较纯的蛋白质(deLisle Milton，et al.，Techniques in Protein Chemistry IV.Academic Press，New York，N.Y.，pp.257-67，1992)。
3.抗体
所公开抗体可使用任何生产抗体的方法制备。例如，所公开单克隆抗体可使用杂交瘤法例如描述于Kohler and Milstein，Nature，1975；256：495的那些杂交瘤法制备。在杂交瘤法中，小鼠或其他合适的宿主动物一般用免疫剂免疫，以获得产生或能产生特异性结合该免疫剂的抗体的淋巴细胞。或者，淋巴细胞可例如使用本文所描述的HIVEnv-CD4复合受体复合物在体外免疫。
单克隆抗体还可通过重组DNA法如描述于美国专利No.4,816,567中的那些方法制备。使用常规方法(如通过使用寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针能特异性结合编码啮齿类抗体重链和轻链的基因)很容易分离编码所公开单克隆抗体的DNA并对其测序。还可形成抗体或活性抗体片段的文库，并使用噬菌体展示技术如描述于美国专利No.5,804,440和6,096,441(至少就其对抗体制备的教导通过援引将其纳入本文)中的技术对其进行筛选。
体外方法还适合制备单价抗体。消化抗体产生其片段尤其是Fab片段可通过本领域已知的常规技术完成。例如，消化可使用木瓜蛋白酶进行。木瓜蛋白酶消化的实例描述于WO 94/29348和美国专利No.4,342,566，至少就其对抗体制备的教导通过援引将其纳入本文。抗体的木瓜蛋白酶消化一般产生两个相同的抗原结合片段和剩下的Fc片段，所述抗原结合片段被称为Fab片段，每一个片段具有单个抗原结合位点。胃蛋白酶处理可得到具有两个抗原结合位点、并依然能交联抗原的片段。
不管片段是否与其他序列连接，它们还包括特定区域或特定氨基酸残基的插入、缺失、置换或其他所选择修饰，前提是与未修饰的抗体或抗体片段相比，该抗体或抗体片段的活性并没有显著改变或损害。这些修饰可提供一些其他性质，例如以除去/加入能二硫键合的氨基酸，以增加其生物寿命，以改变其分泌特点等。任何情况下，抗体或抗体片段必须具有生物活性如特异性结合至其同族抗原。抗体或抗体片段的功能或活性区域可通过蛋白质特定区域的突变、随后进行表达和对表达多肽的测试鉴定。这种方法对本领域的技术人员而言是显而易见的，包括编码抗体或抗体片段的核酸的位点特异性突变。(Zoller，Curr.Opin.Biotechnol.，1992；3：348-354，至少就其对抗体制备的教导通过援引将其纳入本文)。
可使用任何技术制备所公开的人抗体。人单克隆抗体生产技术的实例包括Cole等人(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，AlanR.Liss，p.77，1985)和Boerner等人(J.Immunol.，1991；147(1)：8695)(至少就其对抗体制备的教导通过援引将这两篇文献纳入本文)所描述的那些技术。还可使用噬菌体展示文库(Hoogenboom，et al.，J.Mol.Biol.，1991；227：381；Marks，et al.，J.Mol.Biol.1991；222：581，至少就其对抗体制备的教导通过援引将其纳入本文)生产人抗体(及其片段)。所公开的人抗体还可获自转基因动物。例如，已对针对免疫能产生完整的人抗体库的转基因突变小鼠进行了描述(参见例如Jakobovits，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1993；90：2551-5；Jakobovits，et al.，Nature，1993；362：255-8；Bruggermann，et al.，Year inImmunol.，1993；7：33，至少就其对抗体制备的教导通过援引将其纳入本文)。
人源化非人抗体的方法为本领域所熟知。例如，人源化抗体可根据Winter及其同事的方法(Jones，et al.，Nature，1986；321：522-5，Riechmann，et al.，Nature，1988；332：323-7，Verhoeyen et al.，Science1988；239：1534-6)、通过将啮齿类的一个或多个CDR序列置换成人抗体的相应序列形成。可用于生产人源化抗体的方法还描述于美国专利No.4,816,567、565,332、5,721,367、5,837,243、5,939,598、6,130,364和6,180,377，至少就其对抗体制备的教导通过援引将其纳入本文。
4.制备组合物的方法权利要求
公开了制备组合物以及制备产生该组合物的中间产物的方法。例如，公开了SEQ ID NO：1-257中的核酸和蛋白质。有多种可用于制备这些组合物的方法，例如化学合成法和标准的分子生物学法。所理解的是特别公开了制备这些和其他所公开组合物的方法。
公开了通过包括以可操作方式连接核酸的方法生产得到的核酸分子，所述核酸包括表4列出基因如细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白G1、wee1、hTR2、CDC25b、GSK3β、蛋白激酶Cα、C5、C1抑制剂、IL-17r、IL-8、LIF、TNF-α和IL-10r、α-1抗胰凝乳蛋白酶、HSP27、HSP90、晶体蛋白、GAPDH、铁蛋白H、铁蛋白L、cox1、cox2和转铁蛋白和表5和6列出的蛋白质的基因的序列，以及调控该核酸表达的序列。
还公开通过包括以可操作方式连接核酸分子的方法生产得到的核酸分子，所述核酸分子含有与表4列出的序列具有80％同一性的序列以及调控该核酸表达的序列。
公开了通过包括以可操作方式连接核酸分子的方法生产得到的核酸分子，所述核酸分子含有在严格杂交条件下与表4列出的序列杂交的序列以及调控该核酸表达的序列。
公开了通过包括以可操作方式连接核酸分子的方法生产得到的核酸分子，所述核酸分子包括编码如下蛋白的序列：HSP60、二氢硫辛酰胺脱氢酶、ER-60蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、ATP-合成酶β链、膜联蛋白I、14-3-3ε、抑制素、磷酸甘油酸变位酶1、载脂蛋白AI、超氧化物歧化酶、RNA-结合蛋白调节亚基、A链硫氧还蛋白过氧化物酶B、RAS相关蛋白RAP1B、肿瘤排斥抗原、触珠蛋白、纤维蛋白β、肌动蛋白相互作用蛋白1(AIP1)、有丝分裂原活化蛋白激酶I(MAPKI)、肌动蛋白或其片段、戊二醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、转化蛋白RhoA、酸性富含亮氨酸的核磷蛋白32家族成员B(ANP32B或APRIL)、过氧化物氧还蛋白II、淀粉状前体蛋白(APP)、c-分泌酶、β-分泌酶、γ-分泌酶、Aβ肽、Fe65、Tip60、SERCA、PS1/2、结合素-1a和老年斑的非淀粉状蛋白β组分(NACP/a-突触核蛋白)、或者表5或6中列出的蛋白、或基因的蛋白；所述核酸分子还包括调控该核酸分子表达的序列。
公开了通过包括以可操作方式连接核酸分子的方法生产得到的核酸分子，所述核酸分子包括编码与下列蛋白具有80％同一性的蛋白的序列：HSP60、二氢硫辛酰胺脱氢酶、ER-60蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、ATP-合成酶β链、膜联蛋白I、14-3-3ε、抑制素、磷酸甘油酸变位酶1、载脂蛋白AI、超氧化物歧化酶、RNA-结合蛋白调节亚基、A链硫氧还蛋白过氧化物酶B、RAS相关蛋白RAP1B、肿瘤排斥抗原、触珠蛋白、纤维蛋白β、肌动蛋白相互作用蛋白1(AIP1)、有丝分裂原活化蛋白激酶I(MAPKI)、肌动蛋白或其片段、戊二醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、转化蛋白RhoA、酸性富含亮氨酸的核磷蛋白32家族成员B(ANP32B或APRIL)、过氧化物氧还蛋白II、淀粉状前体蛋白(APP)、α-分泌酶、β-分泌酶、γ-分泌酶、Aβ肽、Fe65、Tip60、SERCA、PS1/2、结合素-1a和老年斑的非淀粉状蛋白β组分(NACP/a-突触核蛋白)、或者表5或6中列出的蛋白；所述核酸分子还包括调控该核酸分子表达的序列。
公开了通过包括以可操作方式连接核酸分子的方法生产得到的核酸分子，所述核酸分子包括编码与表5或6列出的蛋白具有80％同一性的肽的序列以及调控该核酸分子表达的序列，其中表5或6中的任何变化为保守变化。
公开了通过用任何一种所公开核酸转化细胞的方法产生的细胞。公开了通过用任何一种非天然存在的所公开核酸转化细胞的方法产生的细胞。
公开了通过表达任何一种所公开核酸的方法产生的任何一种所公开肽。公开了通过表达任何一种所公开核酸的方法产生的任何一种非天然存在的所公开肽。公开了通过表达任何一种非天然存在的所公开核酸的方法生产得到的任何一种所公开肽。
公开了通过用任何一种本文所公开的核酸分子转染动物内的细胞的方法产生的动物。公开了通过用任何一种本文所公开的核酸分子转染动物内的细胞的方法产生的动物，其中所述动物是哺乳动物。还公开了通过用任何一种本文所公开的核酸分子转染动物内的细胞的方法产生的动物，其中所述哺乳动物是小鼠、大鼠、兔、牛、羊、猪或灵长类。
还公开了通过将本文所公开细胞加至动物的方法产生的动物。
E.使用组合物的方法
1.将组合物用作研究工具的方法
所公开的组合物可以多种方式用作研究工具。例如，所公开组合物例如SEQ ID NO：1-257可用于研究多种治疗方法对神经变性疾病的影响。
组合物可用作例如组合化学方法或其他筛选方法中的靶标，以分离具有与神经变性疾病(如阿尔茨海默病和帕金森病)相关的所需功能性质的分子。
所公开组合物还可用作与神经变性疾病如阿尔茨海默病和帕金森病相关的诊断工具。
所公开组合物可如本文所详细描述那样用作微阵列中的试剂或用作检测或分析已有微阵列的试剂。所公开组合物可用于任何已知的分离或鉴定单核苷酸多态性的方法。组合物还可用于任何已知的、与芯片/微阵列相关的筛选分析的方法。组合物还可用于任何已知的使用所公开组合物的计算机可读设备的方法，例如，以研究相关性或进行与所公开组合物相关的分子模型分析。
实施例
给出下列实施例是为了为本领域的技术人员提供本文所要求保护的化合物、组合物、物品、设备和/或方法如何制备和评价的完整公开和描述，旨在纯粹示例而非旨在限制公开。已努力确保数字(如量、温度等)的精确度，但是还是应该考虑到某些错误和误差。除非另外指出，部分是以重量计的部分，温度为℃或室温，压力为大气压或约为大气压。
A.实施例1分析白细胞RNA获得的阿尔茨海默病的分子差异
1.方法：
a)召集患者
在Monroe Community Hospital的Geriatric Neurology andPsychiatry Clinic召集患者。在征得同意参加本研究后，从患者收集了一组临床痴呆测试的信息。将血样于4℃储存，直至进行RNA分离(12小时之内)。
在此给出的数据获自三个不同组次人的三个独立样本。在不同的时间提取、杂交和分析这其中的每一个样本的RNA。样本1由8个AD病例和7个对照病例组成。样本2由8个AD病例和8个对照病例组成。样本3由5个AD病例、4个对照病例和2个PD病例组成。样本特征总结在表1-3中。
2.受试者
本研究中所包括的AD受试者被诊断可能患有AD，诊断基础是AD的NINCDS(McKhann G，et al.，Neurology，1984；34(7)：939-944)和DSM IV标准。由神经生物学家进行检测以对诊断予以确认并测量疾病的严重程度。使用如下检查评估疾病的严重程度：细微精神状态检查(MMSE)(Folstein MF，et al.，J.Psychiatric Res.，1975；12(3)：189-198)、临床痴呆评定量表(CDR)(Hughes CP，et al.，BritishJ.Psychiatry，1982；140：566-572)和Bles sed痴呆评定量表(BDRS)(Blessed G，et al.，British J.Psychiatry，1968；114(512)：797-811)。本研究中的对照受试者MMSE得分超过27，而AD病例得分低于22。AD病例的平均CDR介于1.2至1.5之间。任何具有出血素质史或凝血病史的受试者被排除在外。
3.全血样本RNA的分离
为提取白细胞中的polyA-RNA，使用了血的mRNA分离试剂盒(Roche)。简而言之，选择性裂解红细胞，离心收集白细胞。然后裂解白细胞，通过在玻璃磁珠上的非特异性吸附和磁性分离收集总核酸。对玻璃磁珠上的核酸进行一系列洗涤和洗脱后，通过使用生物素标记的oligo(dT)和抗生物素链霉素包被的磁性颗粒特异性捕获mRNA。通过洗涤除去其他核酸(DNA、rRNA、tRNA)后，收集mRNA样本并将其在-80℃储存备用。样本的浓度和纯度由OD260/280检查。所理解的是，可使用任何RNA分离方法。
4.cDNA阵列的构建和杂交
所使用的cDNA克隆在表4中列出。美国国家生物技术信息中心(Nat ional Center for Biotechnology Informat ion)的dbEST数据库用于查询相关3’-cDNA克隆，该克隆有的购自销售商，有的为各个实验室的馈赠。在本研究中所使用cDNA克隆为很多研究者的惠赠：J imEberwine赠送了CREB、抗结核菌素、巢蛋白、细胞周期蛋白D1和GAD；Denise Figlewi cz赠送了BDNF、bc1-2、bc1-xs、bc1-x1、钙结合蛋白和SOD-1；Chawnshang Chang赠送了hTR2；Rachel Neve赠送了GAP-43、APP和PS1；Bert Vogelstein赠送了PI9；T.Sudhof赠送了突触结合蛋白I；Davi博士赠送了GTH、pGTH4和pHMGST；Roharaker博士赠送了泛蛋白；Inez Vincent赠送了cdc2；并且Stefan Stamm赠送了SF2flag、Pht6和t ra2-C2。剩下的cDNA克隆是从I.M.A.G.E.Consortium cDNA克隆的销售商购买得到的dbEST克隆。
对所有cDNA克隆进行测序以确定其同一性。1微克每种被线性化的cDNA在0.2N NaOH/0.2mM EDTA中于37℃变性30分钟。样本体系由0.3M NaOAc(pH4.5)中和。使用96针点样仪(pin replicator)(Nalge Nunc)，将cDNA如前人所述(Chow N，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1998；95：9620-9625)立即印模于尼龙膜(MicronSeparations)上，每个cDNA点样四次。加入RNA探针之前，该膜在杂交溶液(50％甲酰胺/5×SSPE/5X Denhardt’s溶液/0.1％SDS/10％硫酸葡聚糖/50μg/ml变性鲑精DNA/100μg/ml tRNA)于42℃预杂交3小时。42℃过夜孵育后，印迹物在2×SSC/0.1％SDS中于55℃洗涤1小时，2×SSC/0.1％SDS/10μg/ml RNA酶A中于37℃洗涤1小时，并在2×SSC/0.1％SDS中于37℃洗涤1小时。然后将膜暴露于磷屏(storagephosphor screen)中。
5.数据获取和分析
通过激光光密度扫描(Phosphoimager，Molecular Dynamics)检测了每个斑点的杂交强度。使用局部背景值校对磷光成像仪(phosphoimager)分析获得的每个斑点的值(计数)。阵列中每个斑点上沉积的cDNA的量通过用特异性针对存在于所有载体中的T7启动子的寡核苷酸脱膜(stripping)和再杂交(reprobing)。这些数据可对沉积于膜上的cDNA斑点与斑点之间可能的差异进行校准。为确保阵列之间的准确比较，使用每个RNA样本的阵列中全部标记(cDNA)的平均值将信号标准化。所得到的标准化数据通过典型分析来进行分析。该分析确定了能最好区分组次的变量(信息)，并为每个变量分配权重。正如多变量分析那样，变量数目不准超过病例数目(Kshirsager AM，Multivariate Analysis，Dekker M，New York，N.Y.，1972)。第一典型变量提供了组次之间最大的差别。第二典型变量对典型变量1未考虑到的其他差异进行分析。其它重复可能效果逐渐减小。通过Wald-Wolfowitz游程检验(Siegel S，Nonparametric Statistics，McGraw-Hill，New York，N.Y.，1-312，1956)评估典型分析得到的AD病例和对照病例之间差异的统计显著性。
B.结果
1.区分AD血样和对照血样的信息类别
由于多变量典型分析的有效结果要求变量(在此情况下为信息)数目小于所使用病例(受试者)数目(Kshirsager AM，MultivariateAnalysis，Dekker M，New York，N.Y.，1972)，因此将所研究的全部64种信息分为每组7种或8种信息的亚类。全部3个样本中均被检测的五个信息亚类中仅有两个亚类能一致地区分AD病例和对照病例。这两个亚类是与细胞周期相关的信息和与炎性反应相关的信息。图2A、2B和2C以与细胞周期相关的那些信息的典型变量1和典型变量2作图。图2A、2B和2C以与炎性反应相关的那些信息的典型变量1和典型变量2作图。
这六幅图表明，由于组次之间的重叠很少，因此大体上可实现疾病类型的区分。注意基于白细胞的细胞周期信息表达对41个(包括2个帕金森病病例在内为43个)病例的分类与临床分类相一致，38/41(考虑PD则为40/43)个病例中，三个对照病例进入AD空间，没有AD病例进入对照空间。与炎性系统相关的基因并没有对照病例进入AD空间，但有一个AD病例进入对照空间。炎性基因正确地使两个PD病例区别于对照空间和AD空间。
应该注意的是，在那些我们测试的信息中，极少数单个信息能在AD病例和对照病例之间产生在统计学上显著(或者接近显著)的差异。它们是α-1抗胰凝乳蛋白酶、晶体蛋白和环氧合酶II。但是，仅凭它们自身还不足以将没有显著重叠的AD病例和对照区分开。
其他系列的信息的典型变量的类似的图并不能成功区分AD白细胞信息分布和对照白细胞信息分布(数据未示出)。这个证据证明图1和2中给出的阳性结果对图1和2给出的两组基因是有特异性的。
就此处给出的数据而论，有两个主要结论：(1)多种基因的表达分布可有效区分轻度AD(平均CDR为1.2-1.5)和未患痴呆的对照病例以及；(2)描述为区分AD和对照外周血液样本的基因类型与已发现其表达在AD脑中发生了变化的基因类别相似。血细胞可用来进行AD分子机制的基础研究。这些研究所得出的数据可设计治疗分子。另外，血细胞可用于监测治疗剂在临床试验中的治疗效力以及治疗个体患者的效力。
2.多种基因的表达分布可有效区分阿尔茨海默病
最为综合的AD临床诊断是涉及很多评估方法的复杂且昂贵的过程(McKhann G，et al.，Clinical diagnosis of Alzheimer’s disease：report of the NINCDS-ADRDA Work Group under the auspices ofDepartment of Heal th and Human Services Task Force on Alzheimer’sDisease.Neuro logy，1984；34(7)：939-944)。甚至是专家，也认为诊断是暂定的，需要通过尸检进行神经病理学确认。在AD中心，临床诊断达到了85-90％的尸检确认率(Gearing M，et al.，Neurology，1995；45(3Pt1)：461-466)。在差一些的专家中，尸检确认的诊断率更低。诊断AD的费用和困难使得寻求采样简单且成功的疾病的生物标记。已被描述的生物标记包括那些入侵性的生物标记(如腰椎穿刺(Davidson P，et al.，J.Neural Transmission-General Section，1997；104(6-7)：711-720))或需要昂贵的设备以及专家的生物标记(Killiany RJ，et al.，Neurology，2002；58(8)：1188-1196)。虽然这些方法在探索性研究中极为有用，但是它们并没有希望用于常规的大规模诊断。已描述了利用容易获取外周样本的测试，所述外周样本为例如来自血细胞(Nagy Z，et al.，Neuroscience Letters，2002；317(2)：81-84)(Padovani A，et al.，Archives of Neurology，2002；59：71-75)、皮肤(Ikeda K，et al.，Dementia & GeriatricCognitive Disorders，2000；11(5)：245-250)和尿液(Pratico D，et al.，Archives of Neurology，2002；59：972-976)的样本。其他研究描述了利用对药理学介入的反应性的AD测试(Scinto LF，et al.，Neurology，1999；52(3)：673-674)。这其中的很多研究旨在区分AD样本和对照样本，其基础是外周组织在AD样本和对照样本之间获得统计学上有显著差异上是成功的。但是，在这些研究中所描述的测试的临床使用受到AD样本和对照样本之间显著重叠的局限。所公开的数据表明这种重叠可通过利用多个变量逐渐消除。
在脑中的表达分布已表明对多种信息表达的多变量分析可区分AD脑和对照脑(Chow N，et al.，Proc.Natl.Acad.Sc i.USA.，1998；95：9620-9625)。更近来，多种基因表达的多变量分析已成功地区分除脑之外的恶性组织样本和非恶性组织样本(Welsh JB，et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.，2001；98(3)：1176-1181)。在本文给出的数据中，对从外周血白细胞提取的多种信息种类的表达水平方面的大量数据进行分析，有望区分AD样本和对照样本。另外，两个来自PD病例的样本已区别于AD样本和对照样本，表明AD样本和对照样本之间的差别是区别特征而非普通神经变性特征。
然而，这些数据的确将极少数病例“错误分类”。错误分类的本质是在临床上被认为未患痴呆的19个病例中有3个病例产生了落入AD病例中的数值。本文的数据与这些“临床前”病例相一致，在此“临床前”病例存在某种程度的AD病变。这说明的情况与Braaks数据相一致，所述Braaks数据表明高达20％的二十多岁的人的脑表现出AD病变(Braak H，et al.，Neurobiology of Aging，1997；18(4)：351-357)。这些数据是存在AD潜伏期延长的有力论据，在此期间有非常明显的病理。
除了给出与AD相一致数值的那些对照病例，(在21个病例中)还有一个是落入对照病例之中、在临床上被定义为AD病例的病例。对该病例的已有临床和病理数据的搜索并没有发现可将该病例理性区别于我们的样本中的其他AD病例的区别特征。
随机或以其他特征(如生长因子)为基础选择的其他系列的基因并不能区分AD样本和对照样本，而用与细胞周期和与炎性系统相关的基因系列区分是可能的(未给出数据)。这表明所公开的基于所选择基因系列的分离发现并不是我们所采用的分析方法的假象。
此处给出的数据表明本文所公开的基因系列在临床上是有用的，并且正如本文所详细描述，还可对脑和外周血细胞中的分子事件之间的关系提出建议。
3.区分AD脑的基因类别还可区分AD血样
值得注意的是，本文示出的区别AD外周血白细胞和对照外周血白细胞的基因产物的类别还属于那些在AD脑中表达发生改变的基因产物的类别。当然，希望所选择的在AD脑中受到影响的神经元特异基因产物，例如与突触相关的那些基因产物(Callahan LM，et al.，J.Neuropathology & Experimental Neurology，2002；61(5)：384-395；Yao P，et al.，Neurobiology of Di sease，2003；12：97-109)不会在白细胞中起作用。但是，存在并非神经元特异但表现出在AD脑中表达发生变化的基因产物。本文所特别关注的是与细胞周期相关的分子(Arendt T，Neurobiology of Aging，2000；21(6)：783-796；VincentI，et al.，J.Neurosci.，1997；17：3588-3598；Nagy Z，et al.，Neuroscience Letters，2002；317(2)：81-84；Harris PL，et al.，Neurobiology of Aging，2000；21(6)：837-841；Wu Q，et al.，Neurobiology of Aging，2000；21(6)：797-806；Zhu，et al.，Neurobiology of Aging，2000；21(6)：837-841)和与炎性系统相关的分子(Akiyama H，et al.，Neurobiology of Aging，2000；21(3)：383-421and Bamberger ME，and Landreth GE，MicroscopyResearch & Technique，2001；54(2)：59-70)。事实上，最近的AD脑中炎性系统的总结在“A virtual textbook of inflammatorymediators has been observed in the Alzheimer’s disease brain overthe last 15 years”(Akiyama H，et al.，Neurobiology of Aging，2000；21(3)：383-421)中叙述。实际上，对除脑之外的AD组织的研究表明几种组织中细胞周期基因(Nagy Z，et al.，NeuroscienceLetter s，2002；317(2)：81-84；Stieler JT，et al.，NeuroReport，2001；12(18)：3969-3972)和炎性系统基因(ScaliC，et al.，Neurobiology of Aging，2002；23(4)：523-530；De Luigi A，et al.，Mechani sms of Ageing&Development，2001；122(16)：1985-1995；Kusdra L.，et al.，Immunobiology，2000；202(1)：26-33；LombardiVR，et al.，J.Neuroimmunology，1999；97(1-2)：163-171；RemarqueEJ，et al.，Exper imenta l Gerontology，2001；36：171-176)的表达发生了变化，所述组织包括血细胞(Nagy Z，et al.，.NeuroscienceLetters，2002；317(2)：81-84；Scal i C，et al.，Neurobiology ofAging，2002；23(4)：523-530)和上皮细胞(Schmitz A，et al.，Histochemi stry & Cell Biology，2002；117(2)：171-180)。
上述研究并未证实所选择的外周细胞和脑细胞中基因表达的共有变化与血和脑之间共有的全身性疾病机理或共有联系的概念相一致。(Webster S，et al.，Biochemical & Biophysical ResearchCommunications，1995；217：869-875；Kimberly WT，et al.，J.Biol.Chem.，2001；276(43)：40288-40292；Cao X，et al.，Science，2001；293(5527)：115-120)。
这些数据表明细胞周期和炎性基因的表达紊乱可在神经系统之内和神经系统之外的多种细胞类型的AD病理生理学中起核心作用。AD的其他神经病理生理学方面可由如下这些关键事件引起，包括同样与细胞周期相关的激酶所引起的tau磷酸化(Busciglio J，et al.，Neuron，1995；14(4)：879-888；Ferreira A，et al.，Molecular &Cellular Neurosciences，1997；9(3)：220-234；Greenberg SM，etal.，Proc.Na t.Acad.Sc i.U.S.A.，1994；91(15)：7104-7108)和随之发生的细胞骨架破裂、有丝分裂后的神经元不能成功完成细胞周期而引起的程序性细胞死亡以及炎性攻击引起的细胞死亡的变化。
外周白细胞的多种基因的RNA的表达分布、典型判别分析可用作分析疾病中分子变化的生物学工具，还可用作区分阿尔茨海默病患者和对照患者的工具。这些方法还表明具有区分多种其他疾病的潜能。并非是单个基因之间的显著差异(尽管有少数基因有显著相关性)而是以多种基因的加权和为基础的分析能清楚区分患有特定疾病的患者和其他患者。
AD中外周血白细胞的基因表达受到影响的这一发现强化了AD是全身性疾病的概念。另外，外周血白细胞中受到影响的细胞周期和炎性的基因类别与AD的脑中受到影响的基因类别相似是一个共识，它表明在脑中和血细胞中AD的分子机制(可能由APP肽所引发)是相似的，并且该共识与此分子机制相一致。
C.实施例2炎性、细胞周期和应激的转录物和从外周血白细胞获得的阿尔茨海默病的分子差异
1.方法：
a)召集患者
在Monroe Community Hospital的Geriatric Neurology andPsychiatry Clinic召集患者。在征得同意参加本研究后，从患者收集了一组临床痴呆测试的信息。
在此给出的数据获自三个不同组次的人的三组独立样本。在不同的时间从这些样本中的每一种中提取白细胞RNA、与定制的cDNA阵列杂交并进行。样本1由8个早期AD病例和7个对照病例组成。样本2由8个新的早期AD病例和8个新的对照病例组成。样本3由5个新的早期AD病例、4个新的对照病例和2个(新的)帕金森病(没有痴呆)病例组成。对总共21个早期AD病例、19个对照病例和2个PD病例进行了研究。
2.受试者
本研究中所包括的AD受试者被诊断可能患有AD，诊断基础是AD的NINCDS(McKhann G，et al.，Neurology，1984；34(7)：939-944)和DSM IV规则。由神经生物学家进行检测以对诊断予以确认并测量疾病的严重程度。使用如下检查评估疾病的严重程度：细微精神状态检查(MMSE；Folstein MF，et al.，J.Psychiatric Res.，1975；12(3)：189-198)、临床痴呆评定量表(CDR；Hughes CP，et al.，BritishJ.Psychiatry，1982；140：566-572)和Blessed痴呆评定量表(BDRS；Blessed G，et al.，British J.Psychiatry，1968；114(512)：797-811)。本研究中的对照受试者MMSE得分超过27，而AD病例得分低于22。三个样本的每一个样本中，AD病例的平均CDR介于1.2至1.5之间。由于没有尸检确认病例，将每一个病例分配给特定疾病分类取决于临床诊断的准确性。任何具有出血素质史或凝血病史的受试者被排除在外。血样由放血医师抽取并在4℃储存，直至进行RNA分离(8小时内)。
3.全血样本RNA的分离
为提取白细胞中的polyA-RNA，使用了血的mRNA分离试剂盒(Roche)。简而言之，选择性裂解红细胞，离心收集白细胞。然后裂解白细胞，通过在玻璃磁珠上的非特异性吸附和磁性分离收集总核酸。对玻璃磁珠上的核酸进行一系列洗涤和洗脱后，通过使用生物素标记的oligo(dT)和抗生物素链霉素包被的磁性颗粒捕获mRNA。通过洗涤除去其他核酸(DNA、rRNA、tRNA)后，收集mRNA样本并将其在-80摄氏度储存备用。样本的浓度和纯度由OD260/280检查。所理解的是，可使用任何RNA分离方法。
4.cDNA阵列的构建
基于之前的微阵列研究(如Chow，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1998；95：9620-9625)和在AD研究领域中所关注的那些cDNA克隆的亚类选择阵列中所给出的cDNA克隆。美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Informat ion)的dbEST数据库用于查询相关3’-cDNA克隆。用于本研究中的cDNA克隆有的是很多研究者的馈赠，有的是从I.M.A.G.E.Consortium cDNA克隆的销售商购买得到的克隆。在该阵列中表示有172种转录物。
自己对所有cDNA克隆进行测序以确定其同一性。1微克每种被线性化的cDNA在0.2N NaOH/0.2mM EDTA中于37℃变性30分钟。样本体系由0.3M NaOAc(pH4.5)中和。使用96针点样仪(Nalge Nunc)，将cDNA如前人所述(Chow N，et al.，Proc.Na tl.Acad.Sc i.U.S.A.1998；95：9620-9625)立即印模于尼龙膜(Micron Separations)上，每个cDNA点样四次。加入RNA探针之前，该膜在杂交溶液(50％甲酰胺/5×SSPE/5X Denhardt’s溶液/0.1％SDS/10％硫酸葡聚糖/50μg/ml变性鲑精DNA/100μg/ml tRNA)于42℃预杂交3小时。42℃过夜孵育后，印迹物在2×SSC/0.1％SDS中于55℃洗涤1小时，2×SSC/0.1％SDS/10μg/ml RNA酶A中于37℃洗涤1小时，并在2×SSC/0.1％SDS中于37℃洗涤1小时。然后将膜暴露于储存磷屏中。
5.数据获取和分析
通过激光光密度扫描(Phosphoimager，Molecular Dynamics)检测了每个斑点的杂交强度。使用局部背景值校对磷光成像仪(phosphoimager)分析获得的每个斑点的值(计数)。阵列中每个斑点上沉积的cDNA的量通过用特异性针对存在于所有载体中的T7启动子的寡核苷酸脱膜和再杂交。这些数据可对沉积于膜上的cDNA斑点与斑点之间可能的差异进行校准。为确保阵列之间的准确比较，使用每个RNA样本的阵列中全部标记(cDNA)的平均值将信号标准化。所得到的标准化数据通过两个单变量检验和一个多变量检验分析。单变量检验是t-检验和N-检验。后面的N-检验是新近设计的，本质上是多种检验推测的非参数检验。(技术报告04/01，http://www.urmc.rochester.edu/smd/biostat/people/techreports .html)。多变量统计检验取决于典型判决分析。多变量分析在购自SASInstitute，Inc.(Cary，NC)的SAS/STATTM软件上进行。该分析确定了能最好区分组次的变量(信息)，并为每个变量分配权重。第一典型变量提供了组次之间最大的差别。第二典型变量对典型变量1未考虑到的其他差异进行分析。其它重复可能效果逐渐减小。
D.结果
由于多变量典型分析的有效结果要求所分析的变量(在此情况下为信息)数目小于所使用病例(受试者)数目(Kshirsager AM，Multivariate Analysis，Dekker M，New York，N.Y.，1972)，因此信息形成了由所研究的全部172种转录物组成的每组7或8种信息的5个亚类。亚类中有三个亚类是基于如下假说形成的：已知在AD脑中受到影响的特定系统在AD白细胞中也受到影响。这三个系列的转录物是与细胞应激(特别是氧化应激)、炎性系统或细胞周期/细胞凋亡相关的那些转录物。形成了另外两个亚类，一个由在t-检验中具有显著性的转录物组成，另一个由随机选择作为所使用分析方法的假结果的对照的转录物组成。然后将这些转录物系列用于分析来自早期AD受试者和对照受试者的三个独立样本的数据。通过Wald-Wolfowitz游程检验(Siegel S，Nonparametric Statistics，McGraw-Hill，New York，N.Y.，1-312，1956)评估典型分析得到的区分AD病例和对照病例的统计显著性。
采用t-检验的单变量分析揭示有三种转录物在AD样本和对照样本之间在统计学上存在显著差异。它们是：α-1抗胰凝乳蛋白酶、晶体蛋白和环氧合酶II。采用N-检验分析的单变量分析揭示有一种转录产物在AD样本和对照样本之间在统计学上存在显著差异。它是ERCC6。由这其中的任一单变量统计所揭示的转录物中，没有一种仅凭其自身就足以将没有显著重叠的早期AD和对照区分开。
但是，多变量典型判别分析能赋予早期阿尔茨海默病受试者和对照受试者的外周血白细胞之间极好的差异。第一个研究证实对与细胞应激、炎性系统和细胞周期/细胞凋亡相关的系列转录物的典型判别分析能区分最小重叠的AD样本和对照样本。每幅图上的每一个斑点代表每个个体的合成“得分”[典型变量1]。该得分通过对8-10个转录物的多变量典型判别分析确定，所述转录物被选择用以表示细胞应激(如α-1抗胰凝乳蛋白酶、HSP27、HSP90、晶体蛋白、GAPDH、铁蛋白H、铁蛋白L、cox1、cox2和转铁蛋白)(参见图3A)、炎症(如C5、C1抑制剂、IL-17r、IL-8、LIF、TNF-α和IL-10r)(参见图3B)或细胞周期(如细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白G1、weel、hTR2、CDC25b、GSK3β和蛋白激酶Cα)(参见图3C)。基于t-检验显著性所选择或随机选择的两个转录物系列并不能清楚区分早期AD病例和对照病例(未给出数据)。
对新的非重叠系列受试者的重复实验确认与细胞应激、炎性系统和细胞周期/细胞凋亡相关的转录物系列还能区分早期AD病例和对照病例(图4)。随后，募集新的其他系列的受试者、收集白细胞、提取mRNA并将其与新阵列杂交。此次重复实验再次证明与细胞应激、炎性系统和细胞周期/细胞凋亡相关的转录物系列能区分早期AD病例和对照病例(图5)。
在每个重复研究中，基于t-检验显著性选择和随机选择的其他两个转录物系列并不能清楚区分早期AD病例和对照病例。图3-5的这9幅图表明疾病类别的极好差异通常可在极少重叠的组次之间实现(超过p<0.01水平的早期AD和对照的差异是显著的(Wald-Wolfowi tz游程检验))。注意本分析使两个帕金森病病例区别于早期AD病例和对照病例。
1.区分脑中AD的基因类别还可区分AD血样
如实施例1，在此示出的区别AD外周血白细胞和对照外周血白细胞的基因产物的类别还属于那些在AD脑中表达发生改变的基因产物的类别。所研究的三类转录物进展似乎并不一样好。尽管与细胞应激和炎性系统相关的转录物与其对疾病状态的区分极为一致，但是细胞周期转录物一致性较差。不过，这些数据表明外周细胞表达分布的多变量分析可用于阿尔茨海默病分子现象的研究之中。
所选择的AD神经病理学/神经生物学方面是由细胞周期、细胞应激和炎性事件(每一个均是细胞声明中至关重要的)的表达发生改变所致。作为一个实例，由Aβ引起的细胞周期激酶的激活可使得tau磷酸化(Busciglio et al.，Neuron.1995；14(4)：879-888；Greenberget al.，Proc.Na t.Acad.Sc i.U.S.A.，1994；91(15)：7104-7108)，这导致细胞分裂所需的细胞骨架分解。然后，细胞骨架分解将对维持神经元进程、传输和突触支持有影响。
在此给出的数据表明所使用基因类别在包括诊断(可能为早期、潜伏期或前驱诊断)在内的多方面以及监控诊断效果上具有临床用途。另外，基因产物的相似类别在脑和血中受到影响的证据使得在所选择的阿尔茨海默病或神经变性疾病的基础分子和细胞生物学机理的研究中通常可将外周血细胞用作脑细胞的替代物。在此给出的数据表明，在AD和PD的脑和血中受到影响的相似系统并不要求它们在两类细胞中作用完全相同。
2.阵列数据的分析
从阵列数据获取的含义取决于阵列特性和所使用的分析方法。将目标阵列和所使用的分析方法的组合进行设计以检验此假说：所选择的与已知在AD脑中受到影响的基础细胞生物学相关的分子系统还被发现在外周血白细胞中也受到影响。特别关注的是与炎性系统、细胞应激和细胞周期/细胞凋亡相关的转录物。因此，将本文所使用的目标阵列设计为包括与这三个系统的每个系统相关的多种探针。采用通过同时使用多种转录物能检验AD和对照之间基因表达分布的差异的分析方法，并非是强调被设计来测试AD/对照单个转录物差异的分析方法。选择了典型判别分析的经典方法。这种方法应用对现存的两组(或多组)的认识来找出最能分辨各组的变量的系列(转录物)。该分析指派给每个转录物一个权重，并且这些权重用于计算每个人的“得分”(如典型变量)。本分析如上文所述，并用SAS/STATTM软件进行。该得分在图3-5给出。
多变量统计方法在区分疾病对基因表达分布的影响的价值已在包括区分除脑外的疾病(ovarian cancer，Welsh et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.，2001；98(3)：1176-1181)和脑病(Tang et al.，2004)在内的多个研究中被证实。第二个研究以来源于血样的转录物的表达分布为基础区分三种神经学病症(结节性硬化综合征2(tuberous sclerosis complex 2)、1型神经纤维瘤病和Down’s综合征)。他们认为“每一种疾病是由血液中独特的基因表达模式所引起的，该模式可由分类器准确区分”。所给出数据强调，区分单个基因的表达水平在区分疾病状态中通常并不如基于很多基因产物的加权和的分析那样有力。对阵列数据的解释依然是人们正在进行的工作。
3.对血液细胞和脑细胞共有影响的机理
外周血白细胞的基因表达以被暗示为脑内事件的方式在阿尔茨海默病中发生改变的事实可解释为外周血成分和脑之间的通讯所导致(如Hickey WF，et al.，1991；参见Hickey，1999)。另外，已表明血脑屏障对这种交换的通透性通过包括Aβ肽在内的多种因子得以提高(如Farkas IG，et al.，2003)，并且已表明所选择的Aβ肽在AD外周血液循环中得以升高(参见Irizarry MC，2004)。没有必要仅把血-脑通讯当作血液中Aβ肽的来源，因为血细胞自身，尤其是血小板能在AD中差异表达APP、BACE和其他组分(如Colciaghi et al.，2004；Baskin et al.，2000；Li et al.，1999；Rosenberg et al.，1997)。这表明该机制而非血-脑通讯(或者包括血-脑通讯在内的机制)在调节AD对外周细胞的影响中起着重要作用。虽然可能与循环系统中Aβ肽的存在有关系，但是脉管系统外的其他外周细胞包括成纤维细胞可表达APP系统的组分，并在AD样本和对照样本之间表现出差异(Emiliani et al.，2003；Ikeda et al.，2000；Zhao et al.，2002；Scali et al.，2002；参见Etcheberrigaray et al.，1996；Gibsonet al.，1996和Gibs on and Huang，2002的综述)。这些数据与AD是全身性疾病的概念相符，所述全身性疾病其主要临床表现来源于其对脑的影响。
正如本文所述，对与外周血白细胞所表达的炎症、细胞应激和细胞周期/细胞凋亡相关的转录物的多变量分析能区分早期AD病例和对照病例。其他几个结论是：(1)本文给出的、能区分AD白细胞和对照白细胞的转录物类别与已知在AD脑中受到影响的转录物类别相似；(2)这些数据对AD的早期(可能是临床前、前驱)诊断以及监测疾病进程和疗效启示作用。
E.实施例3外周血白细胞获得的帕金森病的分子差异
帕金森病蛋白质分析鉴定了包括13名帕金森病(PD)患者和9名年龄相匹配的对照患者的患者群。采集新鲜全血，裂解红细胞并收集白细胞。测定白细胞蛋白质浓度，并通过SDS-PAGE电泳以及随后考马斯蓝染色测定蛋白的完整性。等量白细胞蛋白质裂解物用于二维凝胶电泳。将凝胶银染、干燥并用激光密度计扫描，然后进行限制性的计算机比较(图6)。使用Progenesis Discovery软件(Nonlinear USA，Inc.；Durham，NC)鉴定PD患者和对照患者之间密度不同的蛋白质斑点。将差异测量结果用于统计检验。与对照相比，在帕金森病中有17个斑点或升高或降低(表6)。差异表达的斑点可从两份考马斯蓝染色的凝胶上取出并对其进行凝胶内胰蛋白酶消化。鉴定分离得到的蛋白可通过MALDI-TOF质谱法、然后与公开的蛋白数据相比较进行(表6和图6)。
表6.帕金森病患者和对照受试者之间有差异的、暂时鉴定的蛋白。
SEQ ID NO： MW pI 获取号 Mass Spec ID
241 66,204 5.67 NM_002147 HSP60
242 63,131 7.59 AAH18648 二氢硫辛酰胺脱氢酶
243 62,052 5.98 JC5704 ER-60蛋白酶
244 59,332 7.42 AAH00337 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶
245 54,879 5.42 NP_001677 ATP-合成酶β链
246 36,106 7.58 NP_000691 膜联蛋白I
247 32,567 5.10 NP_006752 14-3-3ε
248 29,785 5.80 NP_002625 抑制素
249 29,559 7.60 AAH62302 磷酸甘油酸变位酶1
250 26,908 5.65 AAA51747 载脂蛋白AI
251 25,546 7.64 1MSD_A 超氧化物歧化酶
252 24,376 6.36 NP_009193 RNA-结合蛋白调节亚基
253 23,327 5.82 1QMV_A A链硫氧还蛋白过氧化物酶B
254 21,719 5.92 NP_056461 RAS相关蛋白RAP1B
255 145,916 5.29 NP_003290 肿瘤排斥抗原
256 42,839 5.42 AAC27432 触珠蛋白
257 60,376 6.72 P02675 纤维蛋白β
F.实施例4对阿尔茨海默病进行治疗的患者中差异表达的生物标记的鉴定
进行研究以鉴定与能响应丙戊酸盐的蛋白质。15名患有轻度至中毒阿尔茨海默病的患者在双丙戊酸钠治疗前(基线)和治疗4周后检测。图9示出参与到本研究中的患者的一些特点。使用标准静脉穿刺术在基线和开始治疗后4周将外周血样收集至10ml薰衣草顶管(lavender top tube)中。为获得白细胞蛋白质，对样本进行如下处理：选择性裂解红细胞，然后将样本离心，保留白细胞沉淀并在-80℃保存。
二维(2D)凝胶分析前，样本在冰上快速解冻并用标准增溶缓冲液裂解。通过SDS-PAGE电泳以及随后考马斯蓝染色测定蛋白质浓度并分析蛋白的完整性。等量白细胞蛋白质裂解物用于二维凝胶电泳。将凝胶银染、干燥并用激光密度计扫描，然后进行限制性的计算机比较。参见图10。使用Progenesis Discovery软件(Nonlinear USA，Inc.；Durham，NC)和统计检验(来自Nonlinear Dynamics，Durham，NC)鉴定差异表达的蛋白质斑点。针对丙戊酸盐治疗，9个斑点在患者中或升高或降低。差异表达的斑点可从两份考马斯蓝染色的凝胶上取出，对其进行凝胶内胰蛋白酶消化，并可使用MALDI-TOF质谱法(参见图11)以及与公开的蛋白数据相比较鉴定。鉴定得到的九种生物标记在图12中列出并得以描述。这九种生物标记包括肌动蛋白相互作用蛋白1(AIP1)、有丝分裂原活化蛋白激酶I(MAPKI)、肌动蛋白或其片段、膜联蛋白A1、14-3-3ε、戊二醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、转化蛋白RhoA、酸性富含亮氨酸的核磷蛋白32家族成员B(ANP32B或APRIL)或过氧化物氧还蛋白II。
这些结果表明含有生物学白细胞的生物学样本可用于鉴定生物标记，所述生物标记可用于监测患者对治疗阿尔茨海默病的反应情况。
G.实施例5使用离体白细胞的差异表达蛋白质的确认
使用丙戊酸盐存在下体外培养两天的人白细胞验证九个靶标的三个。简而言之，培养取自未患痴呆(对照)受试者的人白细胞，并在培养之初加入不同浓度丙戊酸盐(0-5mM)。将白细胞蛋白质进行SDS-PAGE电泳并使用抗靶标抗体进行蛋白质印迹。对于这三种蛋白质，丙戊酸盐治疗重现了在前述2D凝胶研究中所观察到的变化(图12)。
培养的白细胞中膜联蛋白A1和APRIL的表达水平针对丙戊酸盐治疗以剂量依赖方式降低。这些结果与在由丙戊酸盐(VPA)治疗的患者中观察到的膜联蛋白A1和APRIL表达降低相一致。还与实施例4的结果一致，培养的白细胞中过氧化物氧还蛋白II响应VPA治疗以剂量依赖方式升高，表达峰值出现在约1.0mM VPA时。在所测试的生物标记中，培养的白细胞中仅肌动蛋白表达不能再现在VPA治疗的患者中所观察到的表达模式的变化。
这些结果表明在VPA-治疗的阿尔茨海默病患者中鉴定得到的候选生物标记(至少一些，并可能是大部分)的表达模式并非是人为的，因为它们与培养细胞中的、使用不同定量技术评估的生物标记的表达模式相关。
对本领域的技术人员而言显而易见的是，在不背离本发明的范围和精神的前提下，可对本发明进行多种改进和改变。在考虑了说明书和本文公开发明的实施之后，本发明的其他实施方案对于本领域的技术人员而言是显而易见的。旨在将说明书和实施例考虑为仅仅是示例性的，并且本发明的实际范围和精神由下面的权利要求所指出。
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Claims (74)

1.一种诊断受试者中的神经变性疾病的方法，所述方法包括：
a.评估样本中的一种或多种所选择生物标记的表达水平或活性，所述样本包括来自待诊断受试者的白细胞或其裂解物；并
b.将该所选择生物标记的表达水平或活性与参照标准相比较，所述参照标准指示在一名或多名对照受试者中的该所选择生物标记的表达水平或活性，
其中，所述对照受试者患有所述神经变性疾病时，所述所选择生物标记与所述参照标准的表达水平之间的相似性表明所述待诊断受试者患有所述神经变性疾病，并且其中，所述对照受试者未患所述神经变性疾病时，所述所选择生物标记与参照标准的表达水平之间的差异表明所述待诊断受试者患有所述神经变性疾病。
2.权利要求1的方法，其中所述待诊断受试者为人。
3.权利要求1的方法，其中所述样本为血液样本。
4.权利要求3的方法，其中所述样本包括基本上纯的白细胞群或其裂解物。
5.权利要求4的方法，其中所述白细胞为嗜中性粒细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞或其任意组合。
6.权利要求1的方法，其中所述所选择生物标记为一种或多种包括如下蛋白在内的蛋白：HSP60、二氢硫辛酰胺脱氢酶、ER-60蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、ATP-合成酶β链、膜联蛋白I、14-3-3ε、抑制素、磷酸甘油酸变位酶1、载脂蛋白AI、超氧化物歧化酶、RNA-结合蛋白调节亚基、A链硫氧还蛋白过氧化物酶B、RAS相关蛋白RAP1B、肿瘤排斥抗原、触珠蛋白、纤维蛋白β、或它们的组合。
7.权利要求1的方法，其中所述所选择生物标记为一种或多种包括如下物质在内的转录物：细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白G1、wee1、hTR2、CDC25b、GSK3β、蛋白激酶Cα、C5、C1抑制剂、IL-17r、IL-8、LIF、TNF-α、IL-10r、α-1抗胰凝乳蛋白酶、HSP27、HSP90、晶体蛋白、GAPDH、铁蛋白H、铁蛋白L、cox1、cox2、转铁蛋白、或它们的组合。
8.权利要求1的方法，其中所述所选择生物标记为一种或多种包括如下蛋白在内的蛋白：分子量为27,100且等电点为7.58的蛋白、分子量25,400且等电点为6.2的蛋白、分子量为27,600且等电点为5.92的蛋白、或它们的组合。
9.权利要求1的方法，其中评估表达水平或活性包括通过一种或多种包括如下的技术分析一种或多种所选择生物标记：蛋白质印迹、免疫沉淀、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、荧光激活细胞分类术(FACS)、双向凝胶电泳、质谱法(MS)、基质辅助的激光解吸/电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF)、表面增强激光解吸电离飞行时间(SELDI-TOF)、高效液相色谱法(HPLC)、快速蛋白液相色谱法(FPLC)、多维液相色谱法(LC)之后的串联质谱法(MS/MS)、蛋白芯片表达分析、基因芯片表达分析或激光密度测定。
10.权利要求1的方法，其中评估表达水平或活性包括进行多变量典型分析。
11.权利要求1的方法，其中所述待诊断受试者和所述对照受试者年龄相近。
12.一种筛选用于治疗神经变性疾病的治疗剂的方法，所述方法包括：
a.将单个白细胞或白细胞群与待筛选药剂相接触；并
b.检测所述神经变性疾病的生物标记的表达水平或活性，所述生物标记的表达水平或活性的升高或降低表明所述待筛选药剂是用于治疗所述神经变性疾病的治疗剂。
13.权利要求12的方法，其中所述生物标记为一种或多种在神经变性疾病中被下调的基因或蛋白，并且其中所述药剂提高了基因或蛋白的表达水平或活性。
14.权利要求12的方法，其中所述生物标记为一种或多种在神经变性疾病中被上调的基因或蛋白，并且所述药剂降低了基因或蛋白的表达水平或活性。
15.权利要求12的方法，进一步包括测定所述治疗剂是否改变了神经元中所述生物标记的表达水平或活性。
16.权利要求12的方法，其中所述神经元为多巴胺能神经元。
17.权利要求12的方法，进一步包括测定所述治疗剂是否阻止了所述神经变性疾病的动物模型中所述神经变性疾病的发展或延缓其进程。
18.权利要求12的方法，其中所述动物模型为MPTP模型。
19.权利要求12的方法，其中所述动物模型为6-OHDA模型。
20.权利要求12的方法，其中所述白细胞为嗜中性粒细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞或其任意组合。
21.权利要求12的方法，其中所述生物标记为一种或多种包括如下的蛋白：HSP60、二氢硫辛酰胺脱氢酶、ER-60蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、ATP-合成酶β链、膜联蛋白I、14-3-3ε、抑制素、磷酸甘油酸变位酶1、载脂蛋白AI、超氧化物歧化酶、RNA-结合蛋白调节亚基、A链硫氧还蛋白过氧化物酶B、RAS相关蛋白RAP1B、肿瘤排斥抗原、触珠蛋白、纤维蛋白β、或它们的组合。
22.权利要求12的方法，其中所述生物标记为一种或多种包括如下物质在内的转录物：细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白G1、wee1、hTR2、CDC25b、GSK3β、蛋白激酶Cα、C5、C1抑制剂、IL-17r、IL-8、LIF、TNF-α，IL-10r、α-1抗胰凝乳蛋白酶、HSP27、HSP90、晶体蛋白、GAPDH、铁蛋白H、铁蛋白L、cox1、cox2、转铁蛋白、或它们的组合。
23.权利要求12的方法，其中所述生物标记为一种或多种包括如下蛋白在内的蛋白：分子量为27100且等电点为7.58的蛋白质、分子量25400且等电点为6.2的蛋白质、分子量为27600且等电点为5.92的蛋白质、或它们的组合。
24.权利要求12的方法，其中所述药剂为核酸、抗体、多肽或小分子。
25.一种在受试者中监测神经变性疾病进程的方法，所述方法包括比较样本中神经变性疾病的生物标记的表达水平或活性，所述样本包括在多个时间点自所述受试者获得的白细胞或其裂解物。
26.权利要求25的方法，其中所述受试者为人。
27.权利要求25的方法，其中所述受试者在多个时间点的一点或多点没有神经变性疾病症状或处于神经变性疾病的临床前期。
28.权利要求25的方法，其中所述受试者在多个时间点的一点或多点或者在此之前没有接受对神经变性疾病的治疗。
29.权利要求25的方法，其中所述受试者在多个时间点的一点或多点或者在此之前已接受了对神经变性疾病的治疗。
30.权利要求25的方法，其中所述受试者已由多巴胺激动剂治疗。
31.权利要求29的方法，其中所述受试者在多个时间点的一点或多点或者在此之前已由左旋多巴治疗。
32.权利要求29的方法，其中所述受试者在多个时间点的一点或多点或者在此之前已由神经保护药剂治疗。
33.权利要求32的方法，其中所述神经保护药剂为乙酰胆碱酯酶抑制剂、谷氨酸能受体拮抗剂、HDAC抑制剂、抗炎剂或双丙戊酸钠。
34.权利要求25的方法，其中所述生物标记为一种或多种包括如下蛋白在内的蛋白：HSP60、二氢硫辛酰胺脱氢酶、ER-60蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、ATP-合成酶β链、膜联蛋白I、14-3-3ε、抑制素、磷酸甘油酸变位酶1、载脂蛋白AI、超氧化物歧化酶、RNA-结合蛋白调节亚基、A链硫氧还蛋白过氧化物酶B、RAS相关蛋白RAP1B、肿瘤排斥抗原、触珠蛋白、纤维蛋白β、或它们的组合。
35.权利要求25的方法，其中所述生物标记为一种或多种包括如下物质在内的转录物：细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白G1、wee1、hTR2、CDC2 5b、GSK3β、蛋白激酶Cα、C5、C1抑制剂、IL-17r、IL-8、LIF、TNF-α、IL-10r、α-1抗胰凝乳蛋白酶、HSP27、HSP90、晶体蛋白、GAPDH、铁蛋白H、铁蛋白L、cox1、cox2、转铁蛋白、或它们的组合。
36.权利要求25的方法，其中所述生物标记为一种或多种包括如下蛋白在内的蛋白：分子量为27100且等电点为7.58的蛋白质、分子量25400且等电点为6.2的蛋白质、分子量为27600且等电点为5.92的蛋白质、或它们的组合。
37.权利要求25的方法，其中所述样本为血液样本。
38.权利要求25的方法，其中所述白细胞为嗜中性粒细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞或其任意组合。
39.一种在受试者中监测对神经变性疾病治疗的反应的方法，所述方法包括比较样本中神经变性疾病的生物标记的表达水平或活性，所述样本包括在治疗所述受试者期间的多个时间点自所述受试者获得的白细胞或其裂解物。
40.权利要求39的方法，其中所述受试者为人。
41.权利要求39的方法，其中所述受试者在多个时间点的一点或多点没有帕金森病症状或处于帕金森病的临床前期。
42.权利要求39的方法，其中所述受试者在多个时间点的一点或在此之前由神经保护药剂治疗。
43.权利要求39的方法，其中所述神经保护药剂为乙酰胆碱酯酶抑制剂、谷氨酸能受体拮抗剂、抗炎剂、激酶抑制剂或双丙戊酸钠。
44.权利要求39的方法，其中所述生物标记为一种或多种包括如下蛋白在内的蛋白：HSP60、二氢硫辛酰胺脱氢酶、ER-60蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、ATP-合成酶β链、膜联蛋白I、14-3-3ε、抑制素、磷酸甘油酸变位酶1、载脂蛋白AI、超氧化物歧化酶、RNA-结合蛋白调节亚基、A链硫氧还蛋白过氧化物酶B、RAS相关蛋白RAP1B、肿瘤排斥抗原、触珠蛋白、纤维蛋白β、或它们的组合。
45.权利要求39的方法，其中所述生物标记为一种或多种包括如下物质在内的转录物：细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白G1、wee1、hTR2、CDC25b、GSK3β、蛋白激酶Cα、C5、C1抑制剂、IL-17r、IL-8、LIF、TNF-α、IL-10r、α-1抗胰凝乳蛋白酶、HSP27、HSP90、晶体蛋白、GAPDH、铁蛋白H、铁蛋白L、cox1、cox2、转铁蛋白、或它们的组合。
46.权利要求39的方法，其中所述生物标记为一种或多种包括如下蛋白在内的蛋白：分子量为27,100且等电点为7.58的蛋白、分子量25,400且等电点为6.2的蛋白、分子量为27,600且等电点为5.92的蛋白、或它们的组合。
47.权利要求39的方法，其中所述样本为血液样本。
48.权利要求39的方法，其中所述白细胞为嗜中性粒细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞或其任意组合。
49.一种在测试受试者中鉴定患神经变性疾病风险的方法，所述方法包括：
a.测定从所述测试受试者获得的样本的所述神经变性疾病的生物标记的表达水平或活性，其中所述样本包括白细胞或其裂解物；并
b.将对所述测试受试者测定得到的所述生物标记的表达水平或活性水平与参照受试者的水平建立联系，
对所述未患神经变性疾病的参照受试者测定得到的水平与所述测试受试者的水平之间的相关性表明所述测试受试者患所述神经变性疾病的较低风险，对所述患有神经变性疾病的参照受试者测定得到的水平与所述测试受试者的水平之间的相关性表明所述测试受试者患所述神经变性疾病的较高风险。
50.权利要求49的方法，进一步包括测定来自被诊断患有所述神经变性疾病的参照受试群或未患所述神经变性疾病的参照受试群的所述生物标记的水平。
51.权利要求49的方法，其中所述测试受试者为人。
52.权利要求49的方法，其中所述测试受试者没有神经变性疾病症状或处于神经变性疾病的临床前期。
53.权利要求49的方法，其中所述测试受试者和参照群年龄相当。
54.权利要求49的方法，其中所述生物标记为一种或多种包括如下的蛋白：HSP60、二氢硫辛酰胺脱氢酶、ER-60蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、ATP-合成酶β链、膜联蛋白I、14-3-3ε、抑制素、磷酸甘油酸变位酶1、载脂蛋白AI、超氧化物歧化酶、RNA-结合蛋白调节亚基、A链硫氧还蛋白过氧化物酶B、RAS相关蛋白RAP1B、肿瘤排斥抗原、触珠蛋白、纤维蛋白β、或它们的组合。
55.权利要求49的方法，其中所述生物标记为一种或多种包括如下物质在内的转录物：细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白G1、wee1、hTR2、CDC25b、GSK3β、蛋白激酶Cα、C5、C1抑制剂、IL-17r、IL-8、LIF、TNF-α、IL-10r、α-1抗胰凝乳蛋白酶、HSP27、HSP90、晶体蛋白、GAPDH、铁蛋白H、铁蛋白L、cox1、cox2、转铁蛋白、或它们的组合。
56.权利要求49的方法，其中所述生物标记为一种或多种包括如下蛋白在内的蛋白：分子量为27,100且等电点为7.58的蛋白、分子量25,400且等电点为6.2的蛋白、分子量为27,600且等电点为5.92的蛋白、或它们的组合。
57.权利要求49的方法，其中所述样本为血液样本。
58.权利要求49的方法，其中所述白细胞为嗜中性粒细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞或其任意组合。
59.一种在测试受试者中鉴别诊断神经变性疾病的方法，所述方法包括：
a.评估样本中一种或多种所选择生物标记的表达水平或活性，所述样本包括来自测试受试者的白细胞或其裂解物；并
b.将所选择生物标记的表达水平或活性与参照标准相比较，所述参照标准指示在一群或多群患有一种或多种神经病理性对照疾病的神经病理性对照受试者中所述所选择生物标记的表达水平或活性，
其中，所述所选择生物标记的表达水平或活性和参照标准之间的差异或相似性指示与所述神经病理性对照疾病相比所述神经变性疾病的鉴别诊断。
60.权利要求59的方法，其中所述受试者为人。
61.权利要求59的方法，其中所述受试者没有神经变性疾病症状或处于神经变性疾病的临床前期。
62.权利要求59的方法，其中所述神经病理性对照受试群选自一名或多名患有阿尔茨海默病、额颞叶痴呆、轻度认知缺损和帕金森病的受试者。
63.权利要求59的方法，其中所述受试者和所述对照受试者年龄相当。
64.权利要求59的方法，其中所述样本为血液样本。
65.权利要求59的方法，其中所述样本包括基本上很纯的白细胞群或其裂解物。
66.权利要求65的方法，其中所述白细胞为嗜中性粒细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞或其任意组合。
67.权利要求59的方法，其中所述所选择生物标记为一种或多种包括如下蛋白在内的蛋白：HSP60、二氢硫辛酰胺脱氢酶、ER-60蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、ATP-合成酶β链、膜联蛋白I、14-3-3ε、抑制素、磷酸甘油酸变位酶1、载脂蛋白AI、超氧化物歧化酶、RNA-结合蛋白调节亚基、A链硫氧还蛋白过氧化物酶B、RAS相关蛋白RAP1B、肿瘤排斥抗原、触珠蛋白、纤维蛋白β、或它们的组合。
68.权利要求59的方法，其中所述生物标记为一种或多种包括如下物质在内的转录物：细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白G1、wee1、hTR2、CDC25b、GSK3β、蛋白激酶Cα、C5、C1抑制剂、IL-17r、IL-8、LIF、TNF-α、IL-10r、α-1抗胰凝乳蛋白酶、HSP27、HSP90、晶体蛋白、GAPDH、铁蛋白H、铁蛋白L、cox1、cox2、转铁蛋白、或它们的组合。
69.权利要求59的方法，其中所述生物标记为一种或多种包括如下蛋白在内的蛋白：分子量为27100且等电点为7.58的蛋白质、分子量25400且等电点为6.2的蛋白质、分子量为27600且等电点为5.92的蛋白质、或它们的组合。
70.权利要求59的方法，其中评估表达水平或活性包括通过一种或多种包括如下的技术分析一种或多种所选择生物标记：蛋白质印迹、免疫沉淀、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、荧光激活细胞分类术(FACS)、双向凝胶电泳、质谱法(MS)、基质辅助的激光解吸/电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF)、表面增强激光解吸电离飞行时间(SELDI-TOF)、高效液相色谱法(HPLC)、快速蛋白液相色谱法(FPLC)、多维液相色谱法(LC)之后的串联质谱法(MS/MS)、蛋白芯片表达分析、基因芯片表达分析或激光密度测定。
71.一种包含一种或多种生物标记的固体支持物，其中所述生物标记为一种或多种包括如下的蛋白：HSP60、二氢硫辛酰胺脱氢酶、ER-60蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、ATP-合成酶β链、膜联蛋白I、14-3-3ε、抑制素、磷酸甘油酸变位酶1、载脂蛋白AI、超氧化物歧化酶、RNA-结合蛋白调节亚基、A链硫氧还蛋白过氧化物酶B、RAS相关蛋白RAP1B、肿瘤排斥抗原、触珠蛋白、纤维蛋白β、或它们的组合。
72.权利要求71的固体支持物，其中所述生物标记为一种或多种选自如下的蛋白：分子量为27,100且等电点为7.58的蛋白、分子量25,400且等电点为6.2的蛋白、分子量为27,600且等电点为5.92的蛋白、或它们的组合。
73.一种包含一种或多种生物标记的固体支持物，其中所述生物标记为一种或多种包括如下物质在内的转录物：细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白G1、wee1、hTR2、CDC25b、GSK3β、蛋白激酶Cα、C5、C1抑制剂、IL-17r、IL-8、LIF、TNF-α、IL-10r、α-1抗胰凝乳蛋白酶、HSP27、HSP90、晶体蛋白、GAPDH、铁蛋白H、铁蛋白L、cox1、cox2、转铁蛋白、或它们的组合。
74.权利要求71的固体支持物，其中所述固体支持物选自芯片、微阵列、纳米阵列或微球。
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