CN102707065A

CN102707065A - Prohibitin蛋白抗体在制备诊断老年性痴呆的试剂盒中的应用

Info

Publication number: CN102707065A
Application number: CN2012100795955A
Authority: CN
Inventors: 吴健
Original assignee: CHANGSHU YUSHAN GREEN TEA Co Ltd
Current assignee: CHANGSHU YUSHAN GREEN TEA Co Ltd
Priority date: 2012-03-23
Filing date: 2012-03-23
Publication date: 2012-10-03

Abstract

本发明公开了一种具有抗乳腺癌活性的寡肽，其序列为His-Asn-Tyr-Gly-Phe-Val-Pro-Ser-Leu。所述寡肽在较低浓度下能选择性抑制体外乳腺癌细胞的生长，而对正常乳腺细胞的生长无影响。体内试验也表明，该寡肽对癌细胞的生长和增殖有很强的抑制作用，并呈现明显的剂效关系。因其安全、高效、理想的抗癌效果，该寡肽可用于制备抗癌药物，并具有良好的应用前景。

Description

Prohibitin蛋白抗体在制备诊断老年性痴呆的试剂盒中的应用

技术领域

本发明涉及Prohibitin蛋白抗体在制备诊断老年性痴呆的试剂盒中的应用。

背景技术

当前，世界各国人口老龄化速度日趋加快，经济发达国家人口平均寿命已达到或接近80岁。我国人口平均寿命70岁，其中60岁以上的老人已达1.3亿，预计在本世纪，衰老以及老化相关疾病如老年性痴呆等将成为影响人类健康和生活质量的重要因素。在西方国家及我国上海等大城市，老年性痴呆己成为继心脏病、肿瘤和脑卒中之后第四位致死原因。

老年性痴呆，又称为阿尔茨海默氏痴呆(Alzheimer's disease, AD )，1907年由德国神经病理学家Alois Alzheimer首先报道，属于系统性神经退化疾病，以高级认知功能降低为特点；是普遍、迅速增长、常发生于老年及中年末期的年龄依赖性的老年性痴呆。目前在老年人口中发病率为7.38-18.2%，其发病率增长势头惊人，全世界现有AD病人1800万，预计2025年将达到3000万人，国内65岁以上患病率为6.5%。美国用于诊断和护理AD的开支为500亿美元/年，如果推迟一年发病，将节省开支100亿美元。

AD是神经变性性疾病，导致认知损害(健忘、失语、失用和失认)，以进行性痴呆为临床特征，起病缓慢，早期为近事记忆减退和性格改变(如出现固执、主观、自私、急躁、淡漠，常有睡眠节律改变)；中期以理解、判断、计算等智能活动全面减退为特点；后期则出现严重痴呆、语言障碍、二便失禁、生活不能自理等表现。脑电图出现慢波慢活动，影象学检查有脑萎缩。

老年期痴呆，首先必须确定痴呆，国内外广为接受DSM-III-R诊断标准。然后再判断可逆及不可逆的痴呆，一般需要收集发病年龄、病情进展等病史和临床表现，并做相关的生化、头部影像和脑电活动等辅助检查。一些神经心理学检查量表，比如HDS-R长谷川简易痴呆、MMSE简易精神状态、ADL日常生活能力、WAIS智力等量表常用来进行患者痴呆严重程度的评定。

其次诊断，目前比较权威的仍是“NINCDS-ADRDA诊断标准”，它于1984年公开发表，包括“可能的、支持可能的、可疑的、确定的”等不同程度的诊断依据，对AD的诊断敏感性88%，特异性达91%，诊断可信限为92%。以其作为参考，制定了我国AD的CMA诊断标准。

最后必须做好鉴别诊断，老年期痴呆的原因多种多样，也包括一些治疗可能相反的原因，如：忧郁症、药物损害、代谢改变、营养缺乏等，必须充分进行鉴别诊断。从发病率来说，AD、VD(血管性痴呆)、MID(多发梗塞性痴呆)常是最需要进行鉴别的。常用Hackinki缺IfIL量表判断)]画IIIL管病，再用DSM-IV进行AD, VD的鉴别诊断。

因此，单一临床试验不能确诊AD，必须依赖全面的健康史，物理检查，神经精神状态评价，血、尿分析，脑影像学、脑电流图、正式精神病学评估和神经心理测试等综合判断。

临床也正在不断地寻找有助于早期诊断的方法，比如建议载脂蛋白E(ApoE)基因型多态性分析可作为AD的一个诊断参考指标。认为ApoE不仅参与脂类代谢，而且与AD发病有密切的关系，ApoE能促进淀粉样蛋白(amyloidp-protein，Aβ)纤维的形成，与Aβ共同形成复合物存在于老年斑((senile plaque, SP)中，介入脑神经细胞的变性过程。国内研究ApoE基因多态性后认为，ApoEε4等位基因是个体发生AD的危险因素，内含子1内增强子元件(IE1) G/G与ε4相关，能增加AD发病风险。对早老素(PS)的基因多态性的研究，证明PS-1 1/1基因型和1等位基因可增加散发性与晚发性AD发病风险。其他用胆碱能拮抗剂(如托毗卡胺)进行扩瞳实验、进行血浆和/或脑脊液的激素、神经肤、免疫复合物、微量元素及生化等检查辅助诊断，但有证据表明，在中枢神经系统内和AD整个进展过程，甚至涉及全部的生化异常。因此，迄今为止，AD只有通过脑活检或尸体解剖才能确诊。相对滞后的确诊和治疗，严重影响了AD的预后。所以，AD分子水平作用机制的确立是研究简便、快捷、确切的AD早期诊断方法的基础。

AD是年龄相关的多因素疾病，起始病因可引起编码APP等其他与家族性(familial AD，FAD)或散发性((sporadic AD，SAD) AD发病机制有关蛋白的基因突变。FAD有遗传性或表型等不同表现，即不同的基因突变可引起AD表型，同一基因的不同突变可引起不同表型的疾病，包括Alzheimer型痴呆，和伴有脑出血及卒中的脑淀粉样血管病。老化、性别、脑创伤及ApoE基因的变异都是增加AD形成的危险因子，这些特点都使得AD的病因和病理机制非常复杂。许多科学家就AD的确切病因及发病机制进行了不断的探索和研究，但其致病原因至今尚未阐明。目前认为AD是由遗传学因素、环境因素和代谢因素等多种因素相互联系、相互影响、共同作用所引起的一种病理过程，尤其是近年来由于分子生物学的发展，促进了AD病因学研究。

AD分子水平研究的目的是尽快全面了解淀粉样变等AD病理产生的原因，在临床症状出现前正确预测发病危险，帮助寻求有效的干预防治措施，为进一步治疗提供理论基础，同时可延缓衰老，提高老年人生存质量，因此AD分子水平作用机制的研究已成为医学界乃至整个人类社会广泛关注的重大课题。

Aβ是老年斑的核心成分，自1987年被首次分离成功后，它的结构及功能一直是科学工作者研究的焦点，从离体实验到体内实验，从细胞水平到分子水平的研究都显示Aβ是AD最主要的致病因子，是AD形成和发展的关键因素，由此而形成了淀粉样蛋白级联假说，这是目前解释老年痴呆病因的主流学说。该学说认为脑内Aβ聚集是AD患者的原发性改变，其他病理过程均由Aβ产生和清除的不平衡所致，由此形成了β淀粉样蛋白级联假说的理论依据。具体内容是:早发型AD患者由于APP, PSl , PS2基因突变使Aβ生成增加，晚发型患者由于Aβ清除机制障碍致Aβ随年龄逐渐上升，两者共同作用的结果使Aβ积聚、沉积。Aβ可激活小胶质和星形胶质细胞，伴随着炎症反应，导致突触进行性损伤，改变了神经元内的离子平衡状态，产生氧化损伤，改变了激酶/磷酸酶活性，引起神经元死亡，逐渐产生痴呆。这一假说主要证据包括:1.同时表达突变的人淀粉样蛋白前体(amyloid precursor protein, APP)和tau蛋白的转基因小鼠与单一tau蛋白表达的转基因小鼠相比，前者NFTs更多，而Aβ斑块的结构和数量基本没有差异，提示AD患者Aβ改变发生在tau改变之前，进而经实验证实了Aβ与tau蛋白因与果的关系; 2.编码tau蛋白的基因突变，在脑内可引起严重的神经元纤维缠结，但没有Aβ沉积，提示tau蛋白改变不能诱导出AD特征性的类淀粉样蛋白斑块，因此，神经元纤维缠结很可能在Aβ形成斑块之后发生; 3. APP转基因小鼠和ApoE缺陷小鼠杂交的后代，脑内Aβ沉积明显减少，提示ApoE基因突变的致病作用很可能涉及Aβ代谢; 4. Aβ分解代谢和清除方面的功能障碍对晚发型AD起作用。

Aβ导致AD主要有以下的机制:

(1)基因突变:基因突变因素主要与家族型AD密切相关，早发型AD患者由于APP, PSI , PS2基因突变使Aβ生成增加，晚发型患者则由ApoE基因突变所致。①APP基因:即Aβ的前体蛋白基因，位于人21号染色体，APP发生基因突变导致APP异常表达和Aβ聚集沉淀。某些基因调控的异常也会刺激APP基因过度表达，引起Aβ沉淀。② Presenilin基因(PS)其中PSl位于14号染色体，PS2位于1号染色体，大多数家族型AD患者均发现PSI,PS2突变，Presenilin蛋白可能参与APP蛋白的合成后加工，最终导致Aβ异常产生、沉淀形成SPs或神经退行病变。也有研究者推测Presenilin参与介导神经细胞凋亡。③ApoE基因: ApoE在脂质运输过程导致胆固醇运输功能障碍，最后致使突触丢失。

(2)诱导细胞凋亡:细胞凋亡涉及到复杂的调控机制，其中Bcl-2家族起了极其重要的作用，其家族成员Bcl-2抑制细胞凋亡的发生，而Bax促进细胞凋亡的发生，Bax/Bcl-2组成了一个平衡体系，Aβ能下调Bcl-2表达，上调Bax表达，促进细胞凋亡，另外Aβ的沉淀可在沉淀激活p53，促进其表达并增加诱导细胞凋亡。

(3)触发氧化应激:AD与氧化应激的关系已成为探讨AD发病机制的新研究方向，外源性给予Aβ损伤神经元有氧化应激介导的证据，提示Aβ本身可触发机体氧化损伤。Aβ神经毒性机制可能是由于纤维状Aβ的本身具有自由基性质，促使细胞外自由基链反应，引起细胞膜脂质过氧化物生成增多，破坏细胞膜功能，使细胞膜通透性增加，细胞外Ca²⁺进入细胞内，激活钙依赖性蛋白酶、脂酶、激酶，使细胞内自由基增多，从而损伤细胞器和细胞骨架，最后导致细胞死亡。

(4)免疫炎症作用:AD发生通常是一个缓慢的炎症病理改变过程，SP中Aβ沉积激活小胶质细胞引起炎症反应是AD的核心病理机制。炎症初期小胶质细胞表达吞噬受体清除Aβ，随着Aβ增多，Aβ封闭了吞噬受体，使小胶质细胞失去吞噬作用，同时，小胶质细胞被激活释放炎性细胞因子如:IL-1、IL-6、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)等，这些炎性因子反过来激活小胶质细胞和星形细胞产生APP及Aβ，形成恶性正反馈环路，导致APP及Aβ增加。

(5)细胞骨架改变:微管是神经细胞中参与胞体与轴突营养输送的通道，是细胞骨架的重要成分，它由微管蛋白和微管相关蛋白组成，tau蛋白是MAP的主要成分。在AD脑内，异常过度磷酸化的tau蛋白含量显著升高并聚集成双螺旋丝形式，丧失了促进微管组装的生物活性导致细胞骨架的结构异常和神经细胞的死亡。

由于AD研究的样品的来源受到限制，而其病因尚未完全阐明，因此建立良好的AD研究动物和细胞模型尤为重要。AD动物模型大致有损伤模型、自然衰老模型和转基因动物模型三大类。每一种模型在一定程度上、某些方面模拟了AD症状和病理改变，但均有各自的适用范围和局限性，对于研究AD分子机制方面不如细胞模型。Yankner等在1990年首先发现并证实合成的Aβ对培养大鼠海马神经元有毒性作用，体外培养的细胞模型以其简便、实用的优点逐渐被广泛用来研究Aβ的神经毒性机制。实验常用的细胞有原代培养的海马、大脑皮层等神经元。其中以Aβ作用原代培养大鼠海马神经元模型最为常见。该模型有以下优点:海马区是AD中损伤最严重的部位，同时与学习、记忆密切相关，而且原代培养更符合实际的情况，因此选用原代培养的海马神经细胞作为研究AD的细胞模型较为理想。但是由于原代培养大多采取大鼠等实验动物来研究，而实验动物与人之间细胞生理机能、代谢途径、基因组成、蛋白质构相上存在着一定的差异。就AD病而言大鼠、小鼠的Aβ氨基酸序列与人的相比只有3个氨基酸不同，但却能使保持较稳定的可溶性状态，而不发生聚集、沉淀产生痴呆。另外原代细胞培养操作难度大，周期长、培养系统不够稳定;还有原代培养属于混和培养，培养过程中胶质细胞也活跃增生，对实验的标准化不利，结果缺乏说服力。为了克服原代培养大鼠海马神经元模型的不足，研究中经常使用Aβ损伤人神经细胞相关的细胞系构建AD模型，常用的细胞系有星型胶质细胞瘤源性细胞系B12/50，大鼠嗜福细胞瘤细胞系PC12，人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y(又名成神经瘤细胞系)，这些细胞系具有神经元的形态特点，能在体外不断传代，较原代培养的海马神经元容易培养。本发明选择SH-SYSY细胞建模，用Aβ_25-35作用于SH-SY5Y细胞构建Aβ_25-35损伤神经元的体外培养模型。

AD的发生与脑内多种调控基因的失调密切相关，但它们与疾病的因果关系还有待进一步证实，因此，探明影响AD发生发展的基因的种类、结构、功能及基因表达调控机制，对于揭示AD的发病机制具有重要意义。传统的实验方法多是针对某一或几个AD相关的基因进行相对孤立地研究，而AD的发病机制十分复杂，是遗传背景和外在因素(如环境条件)相互作用的结果，必然涉及多个基因和蛋白的表达调控，必须整体地、全面地了解发病的机制。蛋白质组学可以一次检测大量蛋白甚至细胞内几乎所有蛋白的表达情况，获得大量的数据并进行平行分析，同时进行多样本比较，由于排除了一系列复杂因素导致的各项比较实验的内在差异，使一次性多样本比较性分析的精确性大大提高，具有高通量、自动化的特点，适合用于老年痴呆等神经退行性病变及各种肿瘤发生机制的研究。

直到20世纪90年代中期，生物化学家、分子生物学家和细胞生物学家还在研究单独的基因和蛋白质或与生物化学途径相关的少量组分。那时可用的技术有Northern印迹法(用于基因表达分析)和western印迹法(用于蛋白质分析)，利用这些技术研究和分析多基因或多蛋内质是非常因难的。蛋白质组学的出现使大规模、高通量的蛋白质研究成为可能。

以下4种重要工具的发展和结合使用给研究人员提供了灵敏性和专一性较高的识别和鉴定蛋白质的方法。

第一种工具是数据库。蛋白质、EST和基因组序列数据库共同提供了生物表达全部蛋白质的完整数据库目录。例如，根据对果蝇的所有编码序列的分析，有110个果蝇基因编码具有EGF类结构域的蛋白质，87个基因编码具有酪氨酸激酶催化结构域的蛋白质。在进行果蝇蛋白质组学研究时，检索大量已知的可能蛋白质结构域。当用限定的序列信息，甚至原始质谱数据进行检索时，可以根据质谱数据与数据库的匹配情况鉴定蛋白质组分。

第二种工具是质谱(MS)。质谱仪的使用在过去十年中有了极大的革新，在发展为分析生物分子，特别是分析蛋白质和肪的高灵敏度和肽可靠性上达到顶点。MS仪器的使用可提供三类分析，这三类分析在蛋白质组学分析中都非常有用。首先，MS可以进行l00kDa或更大完整蛋白质的精确质量测定。估计蛋白质质量的最好方法是MS分析，而不是测定蛋白质在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的迁移。高精度蛋白质质量测定的应用有限，因为它们往往不够灵敏。净质量对精确鉴定蛋口质往往是不充分的。其次，MS也能对蛋白质水解消化产生的肤进行精确的质量测定。相对于完整蛋白质质量测定，肽质量测定可以有高灵敏度和高质量准确度。可以直接用肽质量测定数据在数据库中进行检索，这样常常可以确切鉴定靶蛋白质。最后，MS可以对蛋白质水解消化得到的肤序列进行分析。日前认为MS是肤序列分析中的最新技术。MS序列数据为蛋白质鉴定提供了最有力和最精确的方法。

蛋白质组学的第三个必要工具是对数据库中特定蛋白质序列与MS数据进行比对的各种软件。前面提到从MS数据可以测定序列，但是这种从头开始分析成百上千的谱图时是一项费时费力的任务。蛋白质组学软件将未分析的MS数据，在特定算法的帮助下与蛋白质、EST和基因组序列数据库的序列相比对，自动检测大量用于蛋白质序列匹配的MS数据。然后研究人员检查自动枪测的结果，估计数据的质量，所用的时间比手工解释每一张谱图要少得多。

蛋白质组学的第四种必需工具是蛋白质的分析分离技术。在蛋白质组学中蛋白质分离有两个目的。第一，通过将蛋白质混合物分离成单一蛋白质或蛋白质小组以简化复杂蛋白质混合物。第二，蛋白质的分离分析可以比较两个样品蛋白质的不同表现，研究者可以标记用于分析的特定蛋白质。2D-SDS-PAGE是员广泛用于蛋白质组学的技术。2D凝胶电泳也许是在复杂样品中分离蛋白质的最好单项技术。其他的蛋白质分离技术，包括1D-SDS-PAGE、高效液相层析(HPLC)、毛细管电泳(CE)、等电聚焦(IEF)和亲和层析，也都是分析蛋白质组学的有用工具。最有力的技术是将不向的蛋白质和肤分离技术结合为多维技术。例如，离子交换液相层析(LC)与反相(RP)-HPLC的串联是分离复杂肽混合物的有力工具。

PHB蛋白包括phb1和phb2，1989年Meelung等首先从老鼠肝脏内克隆出哺乳动物的phb1基因。Phb1被认为是一种细胞增殖抑制因子，因此命名为Prohibitin。PHB已被证实存在于果蝇、酵母和植物中。同phb1一样，phb2在人和啮齿类动物间以及低等生物中都高度保守。近来发现PHB既存在于线粒体内膜上，发挥分子伴侣作用，也存在于细胞核内，发挥着负性转录调控作用。Phb1蛋白发现存在于细胞核，并且配合转录因子在细胞周期过程中发挥重要作用。Phb2同样影响细胞核转录因子，作为一种雌激素受体抑制因子研究多年的REA最终被克隆发现序列同源于phb2。Phb1和phb2已被证实存在于质膜，脂滴和脂筏前体中。此外woodloek等发现细胞浆里也有少量的PHB表达，可以与B淋巴细胞表面的IgM发生非共价结合，可能参与B细胞的早期信号传递。

发明内容

本发明从蛋白质组学出发，以比较蛋白组学技术为研究手段，对细胞样品中蛋白质进行整体水平研究，通过二维凝胶电泳分离蛋白质，建立Aβ_25-35作用的SH-SY5Y细胞和作为对照组的正常SH-SY5Y细胞的差异蛋白图谱；用生物质谱技术对差异蛋白质进行分析，建立了蛋白质肽指纹图谱和肽序列标签，结合生物信息学软件查询蛋白质数据库，找到了一种在AD中存在的差异表达的蛋白质，经质谱鉴定为Prohibitin蛋白。进一步的免疫印迹试验证实，Prohibitin蛋白的确在AD患者和正常个体血清中存在显著的差异表达。

基于Prohibitin蛋白与AD的这种相关性，该蛋白可以作为一个蛋白质分子标记，对其表达量进行检测可以用于检测AD。

本发明的一个目的在于提供一种检测老年性痴呆的试剂盒。

本发明的另一个目的在于提供一种Prohibitin蛋白抗体在制备用于检测老年性痴呆试剂盒中的应用。

Prohibitin蛋白与AD的相关性为AD的诊断和/或治疗提供了一条全新的途径。

附图说明

图1为AD患者和正常个体血清中Prohibitin蛋白免疫印迹检测结果。其中，第1泳道为正常个体血清样本，2-4泳道分别为3例AD患者的血清样本。上部为Prohibitin蛋白，下部为作为内参的β-Actin蛋白。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步对本发明加以说明。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，按照常规条件操作或按照制造厂商建议的条件。

实施例1、AD细胞模型样品的制备：

1.细胞培养:

从液氮中取出冷冻SH-SYSY细胞进行复苏，迅速投入37℃水浴中，约lmin溶化，恢复至室温的15%胎牛血清培养基稀释至原体积5倍(8-10ml)，1000rpm低速离心,10min，弃上清，沉淀用15%胎牛血清培养基15m1，37℃, 5% CO₂培养。倒置显微镜观察细胞生长情况，当细胞长满培养瓶底面时传代换液(大约48h)，倒掉旧培养液，用0.25%胰酶作用细胞lmin，当细胞形态变为圆形时立即停止消化，然后用培养液直接吹打法传代(也可以直接吹打)。对生长状态良好的细胞适当冻存保种，其方法为：收集细胞1X10⁷细胞于用15%胎牛血清培养基中，另加DMSO至终浓度为20%，采用梯度降温(减少-15℃左右细胞内形成冰晶对细胞的损伤)，立即4℃, 30min再-20℃, 4-8h再-70℃过夜，最后液氮保存。

2.药物处理细胞制备AD细胞模型

(1)收集SH-SYSY细胞，血球板进行细胞记数，调节细胞数为1X10⁷细胞分别加入两个培养瓶，保证细胞数一致。加入15%的FBS的RPMI 1640，37℃，5% CO₂常规培养

(2) 凝聚态Aβ_25-35的制备:用超纯水将冻干的Aβ_25-35充分溶解配成lmmol/L的储存液，于-20℃保存，临用前于37℃放置4-24h使其形成凝聚态Aβ_25-35，加入其中一瓶进行处理，工作浓度为10μmol/L，另一瓶作为对照组，常规培养48h。

3.蛋白收集和浓度测定

在细胞状态良好时收集细胞，刮取贴壁细胞并计数，细胞浓度约为10⁷/mL，用PBS(pH=7.4)洗涤细胞3次。加入细胞裂解液(8mol/L尿素，4% CHAPS，40mmol/L Tris-HCI，pH=7.4)，振荡30 min，充分混匀样品后，将细胞裂解液高速离心(16 000g离心20 min)，取上清液，采用Bradford法测定蛋白浓度后置于-70℃冰箱保存。

实施例2、差异蛋白的筛选

1.第一向等电聚焦电泳与平衡

将样品与水化液(7mol/L尿素，2mol/L硫脲，4％CHAPS，65mmol/L DTT，0.2％IPGBuffer，痕量溴酚蓝)混合，总体积为500 μL，总蛋白量为200μg，加入聚焦盘中，并将IPG干胶条胶面向下置于聚焦盘中，然后在ProteanIEF Cell等电聚焦仪中进行等电聚焦。参数设置如下：17℃被动水化16 h，100 V聚焦5 h，250 V聚焦3 h，500 V聚焦2 h，1 000 V聚焦2 h，10 000 V聚焦5 h，总电压时间积为60 000 Vh后终止聚焦。电泳结束后取出胶条冲洗并先后于DTT和碘乙酰胺中各平衡1次，每次均为15 min。

2.第二向SDS-PAGE电泳　

将平衡后的胶条置于10%的均匀SDS-PAGE分离胶上端，用0.5%的琼脂糖封胶。电泳参数设置：第一步为恒定电流5 mA/gel，50 min；第二步为25mA/gel，待溴酚蓝迁移至凝胶下缘时停止电泳。

3.凝胶染色　

采用和质谱相容的银染方法显示2-DE图谱，其步骤分为固定、漂洗、水洗、银染、水洗、显色、终止、水洗及保存。

4.凝胶扫描与图像分析　

每组细胞重复上样5次，得到5张不同的凝胶。用双向电泳凝胶专用图像扫描仪GS-710对所有凝胶进行透射扫描。利用ImageMaster 2D软件对凝胶进行分析。整个分析过程包括通过自动检测和手工标记进行蛋白质点检测，利用背景扣除消减部分背景和垂直条纹并进行蛋白质点的匹配和匹配蛋白质点的表达量差异分析。图谱显示，除已用于AD筛查的标志物外，表达差异的蛋白质点共7个。

5.质谱分析　

将双向电泳分析发现的表达有明显差异的蛋白质点，从凝胶上切下，进行水洗、脱色、酶解、萃取和冷冻干燥后，在MALDI-TOFMS质谱仪上进行分析，获得肽质量指纹图谱(PMF)和相应数据。

6.数据库查询　

将MALDI-TOF-MS肽指纹图谱所得到的质荷比在Mascot数据库中进行比对，再通过NCBI数据库搜索匹配蛋白。查询参数：物种分类选择为人类；酶选择为Trypsin；允许的未酶切位点选择为1；固定修饰为carbamidomethyl(C)，变量修饰为oxidation(M)，量误差为0.5Da；肽片段容差选择为100ppm；离子选择为MH+和monoiso-tope；选择直接输入Mascot Search即可进行数据库检索。其中以匹配分值(mowse score)为基础的概率(P)评价数据库搜寻结果的质量，匹配分值的大小表示鉴定蛋白属于随机匹配的可能性，当匹配分值达到或超过66分时，待测蛋白的氨基酸序列与数据库中某已知蛋白的氨基酸序列覆盖率较高，认为匹配的可能性很大，统计学上有意义(P＜0.05)。

本发明的Prohibitin蛋白得分100远高于66分，且在绿色域值以外说明结果可信。在7个显著差异蛋白质点中选择差异倍数最大的1个异常蛋白质点进行质谱分析。结果在NCBI数据库中共发现多个蛋白之匹配并可能性具有统计学意义(即匹配的程度)，搜索鉴定该差异蛋白质为Prohibitin蛋白。

实施例3、Prohibitin蛋白蛋白差异表达的免疫印迹验证

为了确认Prohibitin蛋白的差异表达，取已被确诊为AD的患者血清标本3例，并取经证实为患AD的正常血清标本1例作为对照，血液室温凝集后高速离心（12000rpm/min，15min），经常规样品处理后，进行Western blot检测。实验步骤大体如下：以40 mg蛋白上样电泳( SDS-PAGE 凝胶)，电压150V转印至Immobilon-P膜(Millipore公司)。5%脱脂奶粉室温封闭1.5 h，加入一抗。一抗分别是抗β-Actin抗体和抗Prohibitin抗体(1∶1000；Abcam公司)，次日加入二抗辣根过氧化物酶抗体，并进行ECL化学发光法染色(ECL试剂盒，Amersham公司)。免疫印迹验证结论表明，和正常人体血清中相比，Prohibitin蛋白在AD患者血清中显著高表达，与质谱结果吻合，进一步验证了质谱鉴定结果的准确性。

实施例4、Prohibitin蛋白抗体在制备用于AD检测的试剂盒中的用途

由于Prohibitin蛋白在AD中存在差异表达，显然与AD的发生发展有着密切的相关性，因此以Prohibitin蛋白作为一个蛋白质分子标记，对其表达量进行检测可以用于检测AD。相应的，特异性抗Prohibitin蛋白的抗体，包括各种抗Prohibitin蛋白的单克隆抗体和多克隆抗体，由于其能够用于检测Prohibitin蛋白的表达量。因而可以用于检测AD，或者用于制备检测AD的制剂或试剂盒等。检测方法可以包括，但不限于，免疫印迹、蛋白质芯片、免疫荧光、酶联免疫检测、免疫层析检测等方法，试剂盒中的其他试剂及其组合方法均为本领域的常规之选，抗体可进行必要的修饰，例如偶联标记物，所述标记物可以是荧光物质、酶、放射性同位素等。本领域的技术人员可利用Prohibitin蛋白在AD中存在差异表达这一重要信息，对上述内容进行适当修改，以实现相应的执行情况。但是，所有基于本发明的修改或改造新方法，属于保留的权利。

Claims

1.一种检测老年性痴呆的试剂盒，其特征在于，包括Prohibitin蛋白抗体，用于测量来自受测对象生物样本中的Prohibitin蛋白表达量。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其中，所述Prohibitin蛋白抗体为单克隆或多克隆抗体。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其中，所述Prohibitin蛋白抗体偶联有标记物。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其中，所述所述标记物选自由荧光物质、酶、放射性同位素组成的组。

5.如权利要求1-4中任一项所述的试剂盒，其中，所述生物样本为血清。

6.Prohibitin蛋白抗体在制备诊断老年性痴呆的试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒包括Prohibitin蛋白抗体，用于测量来自受测对象生物样本中的Prohibitin蛋白表达量，通过与正常个体生物样本中的Prohibitin蛋白表达量进行比较，以确定所述受测对象是否患有老年性痴呆。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其中，所述Prohibitin蛋白抗体为单克隆或多克隆抗体。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其中，所述Prohibitin蛋白抗体偶联有标记物。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其中，所述所述标记物选自由荧光物质、酶、放射性同位素组成的组。

10.如权利要求6-9中任一项所述的试剂盒，其中，所述生物样本为血清。