WO2011087009A1 - 糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命を制御する制御遺伝子、及びタンパク質、並びにスクリーニング方法 - Google Patents

糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命を制御する制御遺伝子、及びタンパク質、並びにスクリーニング方法 Download PDF

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井上　聡
和博 池田
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Definitions

  • the present invention controls a regulatory gene that controls at least one of sugar metabolism, lipid metabolism, obesity, and life span, a protein expressed by the gene, and at least one of sugar metabolism, lipid metabolism, obesity, and life span.
  • the present invention relates to a method for screening a substance having an action.
  • COX7RP cytochrome oxidase subunit 7a related polypeptide
  • COX7A cytochrome oxidase subunit 7a related polypeptide
  • the Mitochondria are major intracellular organs that produce energy through respiration, play an important role in energy metabolism such as sugar metabolism and lipid metabolism, and are thought to be deeply involved in aging and diseases.
  • COX7RP gene is known to be involved in uterine cancer, breast cancer, and bladder cancer (see, for example, Patent Document 1), it regulates glucose metabolism, lipid metabolism, obesity, life span, anti-aging, metabolic syndrome It is not yet known that it can be a molecular target for abnormal sugar / lipid metabolism and obesity.
  • a regulatory gene capable of controlling at least one of sugar metabolism, lipid metabolism, obesity, and life span which can be a molecular target of at least one of anti-aging, metabolic syndrome, abnormal sugar / lipid metabolism, and obesity,
  • a screening method for a protein expressed by the gene and a substance having an action of controlling at least one of sugar metabolism, lipid metabolism, obesity, and life span is a strong demand for a screening method for a protein expressed by the gene and a substance having an action of controlling at least one of sugar metabolism, lipid metabolism, obesity, and life span.
  • the present invention can control at least one of sugar metabolism, lipid metabolism, obesity, and life span that can be a molecular target of at least one of anti-aging, metabolic syndrome, abnormal sugar / lipid metabolism, and obesity. It is an object of the present invention to provide a screening method for a regulatory gene that can be produced, a protein expressed by the gene, and a substance having an action of controlling at least one of sugar metabolism, lipid metabolism, obesity, and life span.
  • the COX7RP gene has functions to control sugar metabolism, lipid metabolism, obesity, and life span at the individual level, and is a molecular target for anti-aging, metabolic syndrome, abnormal sugar / lipid metabolism, and obesity. This is a new finding.
  • ⁇ 1> A control gene which is represented by any of the following (A) and (B) and controls at least one of sugar metabolism, lipid metabolism, obesity, and life span.
  • A DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • B DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and any of the complementary strands of the DNA.
  • a protein characterized by controlling at least one of sugar metabolism, lipid metabolism, obesity, and life span, and being expressed by a gene represented by any one of (A) and (B) below.
  • A DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • B DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and any of the complementary strands of the DNA.
  • the conventional problems can be solved, and can be a molecular target of at least one of anti-aging, metabolic syndrome, abnormal sugar / lipid metabolism, and obesity, sugar metabolism, lipid metabolism, obesity, And a control gene capable of controlling at least one of lifespan, a protein expressed by the gene, and a screening method for a substance having an action of controlling at least one of sugar metabolism, lipid metabolism, obesity, and lifespan can do.
  • FIG. 1 is a diagram showing a retroviral vector used for the production of a COX7RP knockout mouse and its insertion site.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of electrophoresis of PCR products performed to confirm that COX7RP was knocked out.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of Western blot analysis.
  • FIG. 4 is a diagram showing the measurement results of COX activity.
  • FIG. 5 is a diagram showing measurement results of ATP production.
  • FIG. 6 is a diagram showing survival curves (Kaplan-Meier survivor curves) of wild-type mice (WT) and COX7RP knockout mice (KO) mice in normal diet breeding.
  • FIG. 1 is a diagram showing a retroviral vector used for the production of a COX7RP knockout mouse and its insertion site.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of electrophoresis of PCR products performed to confirm that COX7RP was knocked out.
  • FIG. 3
  • FIG. 7A is a graph showing changes in body weight of male wild-type mice (WT) and COX7RP knockout mice (KO) in a normal diet.
  • FIG. 7B is a graph showing changes in body weight of female wild-type mice (WT) and COX7RP knockout mice (KO) in a normal diet.
  • FIG. 8A is a diagram showing changes in body weight of male wild-type mice (WT) and COX7RP knockout mice (KO) in a high fat diet.
  • FIG. 8B is a graph showing changes in body weight of female wild-type mice (WT) and COX7RP knockout mice (KO) in a high-fat diet.
  • FIG. 9A shows the weights of liver, kidney, heart, and skeletal muscle of male wild-type mice (WT) and COX7RP knockout mice (KO).
  • FIG. 9B shows the weight of adipose tissue around the kidney, epididymis and inguinal region of male wild-type mice (WT) and COX7RP knockout mice (KO).
  • FIG. 9C shows liver, kidney, heart, and skeletal muscle weights of female wild type mice (WT) and COX7RP knockout mice (KO).
  • FIG. 9D is a graph showing the perirenal, periuterine, and inguinal adipose tissue weights of female wild type mice (WT) and COX7RP knockout mice (KO).
  • FIG. 10A is a diagram showing a glucose concentration at each blood collection time in a glucose tolerance test.
  • FIG. 10B is a diagram showing the insulin concentration at each blood collection time in the glucose tolerance test.
  • FIG. 11 is a diagram showing the insulin concentration at each blood collection time in the insulin tolerance test.
  • the regulatory gene of the present invention is represented by any of the following (A) and (B) and controls at least one of sugar metabolism, lipid metabolism, obesity, and life span.
  • the regulatory gene is a COX7RP (cytochrome oxidase subunit 7a related polypeptide) gene. As shown in Test Examples 1 to 3 to be described later, in the mice in which the COX7RP gene was knocked out, the sugar metabolism, lipid metabolism, obesity, and life span were improved compared to the wild-type mice. Lipid metabolism, obesity, and longevity are controlled.
  • the base sequence of the COX7RP gene can be easily obtained through, for example, a public database such as GeneBank (NCBI), and the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 can be obtained from NCBI accession number NM_004718.2. it can.
  • the stringent conditions are not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • the sodium concentration is preferably 25 mM to 500 mM, more preferably 25 mM to 300 mM, and the temperature is 42 ° C. to 68 ° C. Is preferable, and 42 ° C to 65 ° C is more preferable.
  • 5 ⁇ SSC 83 mM NaCl, 83 mM sodium citrate
  • temperature 42 ° C. may be mentioned.
  • the DNA that hybridizes under stringent conditions is considered to have high sequence identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the high sequence identity is preferably 70% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, and particularly preferably 95% or more in the entire base sequence.
  • Such a base sequence having high sequence identity is considered to have substantially the same function as the regulatory gene of the present invention.
  • the form of the regulatory gene is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include genomic DNA, cDNA, chemically synthesized DNA, and the like.
  • the method for preparing the genomic DNA is not particularly limited, and a known method can be selected as appropriate.
  • genomic DNA is extracted from an organism having the control gene, a genomic library is prepared, and this is developed.
  • a method of preparing a primer specific to the base sequence of the DNA and its neighboring base sequence on the genome and performing PCR using this primer is performed.
  • a method for preparing the cDNA is not particularly limited, and a known method can be appropriately selected.
  • cDNA is synthesized based on mRNA extracted from an organism having the control gene and inserted into a vector.
  • a cDNA library is prepared and developed, and colony hybridization or plaque hybridization is performed using a probe or primer prepared on the basis of the nucleotide sequence information described in SEQ ID NO: 1. The method of preparing by performing is mentioned.
  • the method for preparing the chemically synthesized DNA is not particularly limited, and a known method can be appropriately selected. For example, synthesis can be performed using an existing automatic DNA synthesizer. It can also be obtained by requesting synthesis from a synthesis contractor.
  • the protein of the present invention controls at least one of sugar metabolism, lipid metabolism, obesity, and life span, and is expressed by the gene shown in any of (A) and (B) below.
  • the method for preparing the protein is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include a method for purification from an organism having the protein, and culture of a cell containing a vector in which the regulatory gene is incorporated. And a method of purifying the product. There is no restriction
  • purification, etc. are mentioned.
  • the purification tag is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include a His tag.
  • the screening method of the present invention is a screening method for a substance having an action of controlling at least one of sugar metabolism, lipid metabolism, obesity, and life span, and includes suppression of expression of the control gene of the present invention, and the present invention. Inhibition of the activity of the protein is used as an index. There is no restriction
  • the screening method using the suppression of the expression of the regulatory gene of the present invention as an index is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose.
  • a test substance is administered to any one of an individual and a cell.
  • the method for measuring the expression level of the regulatory gene in the measurement step is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose.
  • the method for evaluating the expression level at the mRNA level and the method for measuring the expression level at the protein level are not particularly limited and can be appropriately selected from known methods according to the purpose. For example, Northern blotting, quantification RT-PCR method, Western blot method, ELISA method, immunostaining method, and the like.
  • the promoter activity of the regulatory gene may be measured.
  • the method for measuring the promoter activity is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include luciferase assay.
  • selection process when the expression level of the control gene is suppressed in either the individual or cell administered with the test substance compared to either the individual not administered with the test substance and the cell Can be selected as a substance having an action of controlling at least one of sugar metabolism, lipid metabolism, obesity, and life span.
  • the screening method using the suppression of the expression of the protein of the present invention as an index is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • administration in which a test substance is administered to either an individual or a cell Any one of a step, an individual administered with the test substance, and a cell, and an individual not receiving the test substance, and a measurement step of measuring the activity of the protein in any of the cells, an individual not receiving the test substance, and A selection step of selecting the test substance when the activity of the protein is suppressed in the individual administered with the test substance compared to any of the cells and in either of the cells, etc. Can be mentioned.
  • the test substance can be selected as a substance having an action of controlling at least one of sugar metabolism, lipid metabolism, obesity, and life span.
  • suppression of the expression of the regulatory gene may be used alone, suppression of the activity of the protein may be used alone, or both may be used in combination.
  • the substance selected by the screening method is considered to have a function as a COX7RP inhibitor. Therefore, the screening method can select compounds, drugs, food additives, and the like that can control at least one of sugar metabolism, lipid metabolism, obesity, and life span.
  • Example 1 preparation of a COX7RP knockout mouse is shown, and in the following Test Examples 1 to 3, by analyzing the COX7RP knockout mouse, COX7RP shows at least one of sugar metabolism, lipid metabolism, obesity, and life span. Indicates that it can be controlled.
  • Example 1 Preparation of COX7RP knockout mouse>
  • the COX7RP knockout mouse was produced by Lexicon Genetics (Woodlands, TX) using ES cells in which a retroviral vector was inserted into the first intron of the COX7RP gene so that the COX7RP gene was not produced (Zambroughz BP, Friedrich).
  • GA Buxton EC, Lilleberg SL, Person C, Sands AT., “Disruption and sequence identification of 2,000 genes in mouse embroidic stem cells.”, 6 (Ninety. did.
  • LTR indicates a long terminal repeat
  • SA indicates a splicing acceptor site
  • NEO indicates a neomycin resistance gene
  • pA indicates a poly A addition signal
  • PGK indicates a phospho A glycerate kinase gene promoter is indicated
  • BK indicates a Breton tyrosine kinase
  • SD indicates a splicing donor site
  • F indicates a splicing donor site
  • FIG. 2 shows the results of electrophoresis of the PCR product.
  • fetal fibroblasts (MEF)- Fetal fibroblasts (MEF) were prepared from fetuses on the 16th day of embryonic day, in DMEM (Dulbaco's modified Eagle's medium) medium containing 10% fetal calf serum, 100 units / mL penicillin, 100 ⁇ g / mL streptmysin, 5% The cells were cultured at 37 ° C. with CO 2 .
  • DMEM Dulbaco's modified Eagle's medium
  • fetal fibroblasts were composed of 150 mM KCl, 25 mM Tris-HCl, pH 7.4, 2 mM EDTA, 10 mM potassium phosphate, 0.1 mM MgCl 2 , 0.1% bovine serum albumin, 50 ⁇ g / mL digitinin.
  • FIG. 6 shows survival curves (Kaplan-Meier survivor curves) of wild type mice and COX7RP knockout mice. From FIG. 6, it should be noted that the maximum life span was 777 days in the wild-type mouse, while it was extended to 830 days in the knockout mouse.
  • FIG. 8A shows the weight change of male wild type mice and COX7RP knockout mice
  • FIG. 8B shows the weight change of female wild type mice and COX7RP knockout mice. From FIG. 8A and FIG. 8B, it became clear that COX7RP knockout mice have less body weight than wild type even in a state bred with a high fat diet.
  • “*” indicates that P ⁇ 0.05
  • FIG. 8B “**” indicates that P ⁇ 0.01.
  • FIGS. 9A to 9D show liver, kidney, heart, skeletal muscle weight of male wild type mice (WT) and COX7RP knockout mice (KO), and FIG. 9B shows male wild type mice (WT) and COX7RP knockouts.
  • FIG. 9A shows liver, kidney, heart, skeletal muscle weight of male wild type mice (WT) and COX7RP knockout mice (KO)
  • FIG. 9B shows male wild type mice (WT) and COX7RP knockouts.
  • FIG. 9A shows liver, kidney, heart, skeletal muscle weight of male wild type mice (WT) and COX7RP knockout mice (KO)
  • FIG. 9B shows male wild type mice (WT) and COX7RP knockouts.
  • FIG. 9C shows the perirenal, epididymal and inguinal adipose tissue weights of mice (KO), FIG. 9C shows liver, kidney, heart of female wild type mice (WT) and COX7RP knockout mice (KO).
  • FIG. 9D shows the weight of perirenal, periuterine, and inguinal adipose tissue of female wild type mice (WT) and COX7RP knockout mice (KO). From FIG. 9A to FIG. 9D, it is clear that each weight of the COX7RP knockout mouse is lighter than that of the wild type mouse, and the COX7RP knockout mouse is resistant to obesity in the fat diet. Became. 9B and 9D, “*” indicates that P ⁇ 0.05, and “**” indicates that P ⁇ 0.01.
  • FIGS. 10A and 10B show the glucose concentration at each blood collection time
  • FIG. 10B shows the insulin concentration at each blood collection time
  • “**” indicates that P ⁇ 0.01 for the wild type mouse
  • “*” indicates P ⁇ 0.05 for the wild type mouse. Indicates. From FIG. 10A and FIG. 10B, it becomes clear that the blood glucose level after fasting is lower in the knockout mouse than in the wild type mouse, and the increase in the blood glucose level by the glucose tolerance test is kept low in the knockout mouse. Improved metabolism was seen. Also, the blood insulin concentration at that time was kept low.
  • mice were fasted for 2.5 hours, insulin (0.5 units / kg) was intraperitoneally administered, and blood collected from the tail vein after 0 minutes, 30 minutes, 60 minutes, and 120 minutes was used. The glucose concentration was measured.
  • the insulin concentration was measured by an ELISA method (Seikagaku Corporation).
  • FIG. 11 shows the insulin concentration at each blood collection time.
  • FIG. 11 shows that knockout mice (KO) have significantly better responsiveness to hypoglycemia to insulin, suggesting improved insulin sensitivity.
  • “*” indicates that P ⁇ 0.05.
  • Table 1 shows the results of measuring the blood glucose concentration and insulin concentration during normal breeding without fasting for the mice subjected to the glucose tolerance test.
  • TG triglyceride
  • NEFA free fatty acid
  • the results are shown in Table 2.
  • the triglyceride was measured using Triglyceride E-Test Wako (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • the cholesterol was measured using Cholesterol E-Test Wako (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • the free fatty acid was measured using NEFA C-Test Wako (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • COX7RP is a control gene that can control glucose metabolism, lipid metabolism, obesity, and lifespan, and has anti-aging, metabolic syndrome, abnormal sugar / lipid metabolism, and obesity. It has been shown that it can be a molecular target.
  • the regulatory gene of the present invention can control glucose metabolism, lipid metabolism, obesity, and life span, it can be suitably used as a molecular target for anti-aging, metabolic syndrome, abnormal sugar / lipid metabolism, and obesity.
  • the protein of the present invention is expressed by the gene, it can be suitably used as a molecular target for anti-aging, metabolic syndrome, abnormal sugar / lipid metabolism, and obesity.
  • Substances to be searched for by the screening method of the present invention include anti-aging materials, drugs, and metabolic syndrome and drugs and food additives that can be used for the improvement and prevention of diabetes, hyperlipidemia, obesity, etc. Is available as

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Abstract

　下記（Ａ）及び（Ｂ）のいずれかで示され、糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命の少なくともいずれかを制御する制御遺伝子である。 （Ａ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ。 （Ｂ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ、及び、前記ＤＮＡの相補鎖のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。

Description

糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命を制御する制御遺伝子、及びタンパク質、並びにスクリーニング方法
　本発明は、糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命の少なくともいずれかを制御する制御遺伝子、及び該遺伝子によって発現するタンパク質、並びに糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命の少なくともいずれかを制御する作用を有する物質のスクリーニング方法に関する。
　社会的にアンチエイジングに関心が高まり、その介入法の開発が望まれている。また、近年特に増加が著しいメタボリック症候群、糖尿病、高脂血症、肥満に関する新しい予防や治療法の開発が希求されている。
　従来、健康な個体の寿命を延ばすために、確立された方法は無い。カロリー制限がこの夢に向けての希望となっているが、確実な対処法かどうかは未だ不明で、過度の食事制限は万人に勧められる方法とはいい難いという問題がある。
　メタボリック症候群に対しては、食生活や運動などの生活習慣の改善の他に、糖尿病や高血圧に対する薬物療法が行われている。糖尿病に対しては、インスリン投与やインスリン分泌を促進する薬及び消化管からの糖の吸収を抑制する薬が利用されている。また、高脂血症にはコレステロールや中性脂肪の合成阻害剤などが利用されている。しかし、血糖値、コレステロール値、中性脂肪値、血圧のコントロールの不良や低血糖を誘起したり、また薬剤が効かなくなる例も存在するという問題があり、そもそもこれらを共通して予防できる方法が待望されている。
　これらの問題を克服するためには、新たな作用機序に基づく療法薬の開発が望まれている。
　ＣＯＸ７ＲＰ（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　ｃ　ｏｘｉｄａｓｅ　ｓｕｂｕｎｉｔ　７ａ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）遺伝子は、本発明者らによって、先に単離された遺伝子である（非特許文献１参照）。この遺伝子のアミノ酸配列は、ミトコンドリアに存在するシトクロムｃオキシダーゼ（ＣＯＸ）のサブユニットであるＣＯＸ７Ａと保存性が高いことから、この酵素が関与するミトコンドリアの酸化的リン酸化の反応に関わることが予想される。ミトコンドリアは、呼吸によってエネルギーを産生する主要な細胞内器官であり、糖代謝、脂質代謝などのエネルギー代謝に重要な役割を担っており、加齢、疾患に深く関わると考えられている。
　しかし、ＣＯＸ７ＲＰ遺伝子が、子宮癌、乳癌、及び膀胱癌に関わることが知られているものの（例えば、特許文献１参照）、糖代謝、脂質代謝、肥満、寿命を制御し、アンチエイジング、メタボリック症候群、糖・脂質代謝異常、肥満症の分子標的となり得ることは、未だ知られていないのが現状である。
　したがって、アンチエイジング、メタボリック症候群、糖・脂質代謝異常、及び肥満症の少なくともいずれかの分子標的となり得る、糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命の少なくともいずれかを制御することができる制御遺伝子、及び該遺伝子によって発現するタンパク質、並びに糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命の少なくともいずれかを制御する作用を有する物質のスクリーニング方法の提供が強く求められているのが現状である。
国際公開第２００８／１５６１７２号
Ｗａｔａｎａｂｅ　Ｔ，　Ｉｎｏｕｅ　Ｓ，　Ｈｉｒｏｉ　Ｈ，　Ｏｒｉｍｏ　Ａ，　Ｋａｗａｓｈｉｍａ　Ｈ，　Ｍｕｒａｍａｔｓｕ　Ｍ．、「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｓｔｒｏｇｅｎ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｇｅｎｅｓ　ｗｉｔｈ　ａ　ＣｐＧ　ｉｓｌａｎｄ　ｌｉｂｒａｒｙ．」、Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．、１８（１）、４４２－４４９、１９９８
　本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、アンチエイジング、メタボリック症候群、糖・脂質代謝異常、及び肥満症の少なくともいずれかの分子標的となり得る、糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命の少なくともいずれかを制御することができる制御遺伝子、及び該遺伝子によって発現するタンパク質、並びに糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命の少なくともいずれかを制御する作用を有する物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
　前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、ＣＯＸ７ＲＰ遺伝子が、個体レベルで糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命を制御する機能を有しており、アンチエイジング、メタボリック症候群、糖・脂質代謝異常、及び肥満症の分子標的となるという新たな知見である。
　本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞　下記（Ａ）及び（Ｂ）のいずれかで示され、糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命の少なくともいずれかを制御することを特徴とする制御遺伝子である。
（Ａ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（Ｂ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ、及び、前記ＤＮＡの相補鎖のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
＜２＞　糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命の少なくともいずれかを制御し、下記（Ａ）及び（Ｂ）のいずれかで示される遺伝子によって発現することを特徴とするタンパク質である。
（Ａ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（Ｂ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ、及び、前記ＤＮＡの相補鎖のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
＜３＞　糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命の少なくともいずれかを制御する作用を有する物質のスクリーニング方法であって、前記＜１＞に記載の制御遺伝子の発現の抑制、及び前記＜２＞に記載のタンパク質の活性の抑制の少なくともいずれかを指標とすることを特徴とするスクリーニング方法である。
　本発明によると、前記従来における諸問題を解決することができ、アンチエイジング、メタボリック症候群、糖・脂質代謝異常、及び肥満症の少なくともいずれかの分子標的となり得る、糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命の少なくともいずれかを制御することができる制御遺伝子、及び該遺伝子によって発現するタンパク質、並びに糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命の少なくともいずれかを制御する作用を有する物質のスクリーニング方法を提供することができる。
図１は、ＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウスの作製に用いられたレトロウイルスベクターと、その挿入部位を示す図である。 図２は、ＣＯＸ７ＲＰがノックアウトされたことの確認ために行った、ＰＣＲ産物の電気泳動の結果を示す図である。 図３は、ウエスタンブロット解析の結果を示す図である。 図４は、ＣＯＸ活性の測定結果を示す図である。 図５は、ＡＴＰ産生量の測定結果を示す図である。 図６は、通常食飼育における野生型マウス（ＷＴ）及びＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウス（ＫＯ）マウスの生存曲線（Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｃｕｒｖｅｓ）を示す図である。 図７Ａは、通常食飼育におけるオスの野生型マウス（ＷＴ）及びＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウス（ＫＯ）の体重変化を示す図である。 図７Ｂは、通常食飼育におけるメスの野生型マウス（ＷＴ）及びＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウス（ＫＯ）の体重変化を示す図である。 図８Ａは、高脂肪食飼育における、オスの野生型マウス（ＷＴ）及びＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウス（ＫＯ）の体重変化を示す図である。 図８Ｂは、高脂肪食飼育における、メスの野生型マウス（ＷＴ）及びＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウス（ＫＯ）の体重変化を示す図である。 図９Ａは、オスの野生型マウス（ＷＴ）及びＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウス（ＫＯ）の肝臓、腎臓、心臓、骨格筋の重量を示す図である。 図９Ｂは、オスの野生型マウス（ＷＴ）及びＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウス（ＫＯ）の腎周囲、精巣上体周囲、及び鼠径部の脂肪組織の重量を示す図である。 図９Ｃは、メスの野生型マウス（ＷＴ）及びＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウス（ＫＯ）の肝臓、腎臓、心臓、骨格筋の重量を示す図である。 図９Ｄは、メスの野生型マウス（ＷＴ）及びＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウス（ＫＯ）の腎周囲、子宮周囲、及び鼠径部の脂肪組織の重量を示す図である。 図１０Ａは、糖負荷試験の各採血時間におけるグルコース濃度示す図である。 図１０Ｂは、糖負荷試験の各採血時間におけるインスリン濃度を示す図である。 図１１は、インスリン負荷試験の各採血時間におけるインスリン濃度を示す図である。
（制御遺伝子）
　本発明の制御遺伝子は、下記（Ａ）及び（Ｂ）のいずれかで示され、糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命の少なくともいずれかを制御する。
（Ａ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（Ｂ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ、及び、前記ＤＮＡの相補鎖のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
　前記制御遺伝子は、ＣＯＸ７ＲＰ（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　ｃ　ｏｘｉｄａｓｅ　ｓｕｂｕｎｉｔ　７ａ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）遺伝子である。後述する試験例１～３で示すように、ＣＯＸ７ＲＰ遺伝子をノックアウトしたマウスでは、野生型のマウスに比べて糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命が向上しており、ＣＯＸ７ＲＰ遺伝子によって、糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命が制御されている。
　前記ＣＯＸ７ＲＰ遺伝子の塩基配列は、例えば、ＧｅｎｅＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）などの公共のデータベースを通じて容易に入手することができ、前記配列番号１で示される塩基配列は、ＮＣＢＩ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ　ＮＭ＿００４７１８．２で入手することができる。
　前記ストリンジェントな条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、ナトリウム濃度が２５ｍＭ～５００ｍＭが好ましく、２５ｍＭ～３００ｍＭがより好ましく、温度が４２℃～６８℃が好ましく、４２℃～６５℃がより好ましい。例えば、５×ＳＳＣ（８３ｍＭ　ＮａＣｌ、８３ｍＭクエン酸ナトリウム）、温度４２℃が挙げられる。
　前記ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡは、配列番号１で示される塩基配列と高い配列同一性を有すると考えられる。前記高い配列同一性としては、塩基配列全体で、７０％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上が特に好ましい。このような高い配列同一性を有する塩基配列は、本発明の制御遺伝子と実質的に同等の機能を有していると考えられる。
　前記制御遺伝子の形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ、などが挙げられる。
　前記ゲノムＤＮＡの調製方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、前記制御遺伝子を有する生物からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノミックライブラリーを作製し、これを展開して、配列番号１に記載の塩基配列やゲノム上のその近傍の塩基配列を基に調製したプローブを用いて、コロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製する方法、配列番号１に記載の塩基配列やゲノム上のその近傍の塩基配列に特異的なプライマーを作成し、これを利用したＰＣＲを行うことにより調製する方法、などが挙げられる。
　前記ｃＤＮＡの調製方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、前記制御遺伝子を有する生物から抽出したｍＲＮＡを基にｃＤＮＡを合成し、これをベクターに挿入してｃＤＮＡライブラリーを作成し、これを展開して、配列番号１に記載の塩基配列情報を基に作製したプローブやプライマーを用いて、コロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、ＰＣＲを行うことにより調製する方法が挙げられる。
　前記化学合成ＤＮＡの調製方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、既存のＤＮＡ自動合成装置等を利用して合成することができる。また、合成受託会社に合成を依頼することにより入手することもできる。
　前記制御遺伝子の態様としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、制御遺伝子のみからなる態様、ベクターに組み込まれた態様、などが挙げられる。
　前記ベクターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター、などが挙げられる。
（タンパク質）
　本発明のタンパク質は、糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命の少なくともいずれかを制御し、下記（Ａ）及び（Ｂ）のいずれかで示される遺伝子によって発現する。
（Ａ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（Ｂ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ、及び、前記ＤＮＡの相補鎖のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
　前記タンパク質は、前記制御遺伝子によって発現するものであるため、糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命の少なくともいずれかを制御することができると考えられる。
　前記タンパク質の調製方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記タンパク質を有する生物から精製する方法、前記制御遺伝子が組み込まれたベクターを含有する細胞の培養物から精製する方法、などが挙げられる。
　前記精製の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、硫安分画、各種クロマトグラフィー、アルコール沈殿、限外ろ過などの方法が挙げられる。
　前記タンパク質の態様としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記タンパク質のみからなる態様、精製用のタグを含有する態様、などが挙げられる。
　前記精製用のタグとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｈｉｓタグなどが挙げられる。
（スクリーニング方法）
　本発明のスクリーニング方法は、糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命の少なくともいずれかを制御する作用を有する物質のスクリーニング方法であって、前記本発明の制御遺伝子の発現の抑制、及び前記本発明のタンパク質の活性の抑制の少なくともいずれかを指標とする。
　前記スクリーニング方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
＜制御遺伝子の発現の抑制＞
　前記本発明の制御遺伝子の発現の抑制を指標とするスクリーニング方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、個体、及び細胞のいずれかに被験物質を投与する投与工程、被験物質を投与された個体、及び細胞のいずれか、及び、被験物質を投与されない個体、及び細胞のいずれかにおける、前記制御遺伝子の発現量を測定する測定工程、被験物質を投与されない個体、及び細胞のいずれかに比べ、被験物質を投与された個体、及び細胞のいずれかの方で、前記制御遺伝子の発現量が抑制されている場合に、その被験物質を選択する選択工程、を含む方法などが挙げられる。
－投与工程－
　前記投与工程における被験物質としては、特に制限はなく、各種候補物質の中から、目的に応じて適宜選択することができる。前記被験物質の投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口投与、注射による投与、などが挙げられる。
－測定工程－
　前記測定工程における、前記制御遺伝子の発現量を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｍＲＮＡレベルの発現量の測定、タンパク質レベルの発現量の測定、などが挙げられる。
　ｍＲＮＡレベルの発現量の評価方法、及びタンパク質レベルの発現量の測定方法としては、特に制限はなく、公知の方法の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ノーザンブロット法、定量的ＲＴ－ＰＣＲ法、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、免疫染色法、などが挙げられる。
　また、前記制御遺伝子の発現量の測定では、前記制御遺伝子のプロモーター活性を測定してもよい。前記プロモーター活性を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ルシフェラーゼアッセイなどが挙げられる。
－選択工程－
　前記選択工程において、被験物質を投与されない個体、及び細胞のいずれかに比べ、被験物質を投与された個体、及び細胞のいずれかの方で、前記制御遺伝子の発現量が抑制されている場合には、前記被験物質が糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命の少なくともいずれかを制御する作用を有する物質として、選択することができる。
＜タンパク質の発現の抑制＞
　前記本発明のタンパク質の発現の抑制を指標とするスクリーニング方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、個体、及び細胞のいずれかに被験物質を投与する投与工程、被験物質を投与された個体、及び細胞のいずれか、及び、被験物質を投与されない個体、及び細胞のいずれかにおける、前記タンパク質の活性を測定する測定工程、被験物質を投与されない個体、及び細胞のいずれかに比べ、被験物質を投与された個体、及び細胞のいずれかの方で、前記タンパク質の活性が抑制されている場合に、その被験物質を選択する選択工程、を含む方法などが挙げられる。
－投与工程－
　前記投与工程における被験物質としては、特に制限はなく、各種候補物質の中から、目的に応じて適宜選択することができる。前記被験物質の投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口投与、注射による投与、などが挙げられる。
－測定工程－
　前記測定工程における、前記タンパク質の活性を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、シトクロムｃオキシダーゼ（ＣＯＸ）の活性の測定、などが挙げられる。
－選択工程－
　前記選択工程において、被験物質を投与されない個体、及び細胞のいずれかに比べ、被験物質を投与された個体、及び細胞のいずれかの方で、前記タンパク質の活性が抑制されている場合には、前記被験物質が糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命の少なくともいずれかを制御する作用を有する物質として、選択することができる。
　前記指標は、前記制御遺伝子の発現の抑制を単独で使用してもよいし、前記タンパク質の活性の抑制を単独で使用してもよいし、両者を併用してもよい。
　前記スクリーニング方法により選択された物質は、ＣＯＸ７ＲＰ阻害剤としての機能を有すると考えられる。したがって、前記スクリーニング方法により、糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命の少なくともいずれかを制御することができる、化合物、薬品、食品添加物、などを選択することができる。
　以下に本発明の実施例、及び試験例を説明するが、本発明は、これらの実施例、及び試験例に何ら限定されるものではない。
　下記実施例１では、ＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウスの作製を示し、下記試験例１～３では、前記ＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウスを解析することにより、ＣＯＸ７ＲＰが、糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命の少なくともいずれかを制御することができることを示す。
（実施例１）
＜ＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウスの作製＞
　ＣＯＸ７ＲＰの生体における機能を解析するため、ＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウスを作製した。
　前記ＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウスは、ＣＯＸ７ＲＰ遺伝子が産生されないように、ＣＯＸ７ＲＰ遺伝子の第１イントロンにレトロウイルスベクターが挿入されたＥＳ細胞を利用し、Ｌｅｘｉｃｏｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）によって作製された（Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚ　ＢＰ，　Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ　ＧＡ，　Ｂｕｘｔｏｎ　ＥＣ，　Ｌｉｌｌｅｂｅｒｇ　ＳＬ，　Ｐｅｒｓｏｎ　Ｃ，　Ｓａｎｄｓ　ＡＴ．、「Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　２，０００　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｍｏｕｓｅ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ．」、Ｎａｔｕｒｅ．、３９２（６６７６）、６０８－６１１、１９９８）ものを使用した。
　図１に、ＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウスの作製に用いられたレトロウイルスベクターと、その挿入部位を示す。
　図１中、「ＬＴＲ」は長端末反復を示し、「ＳＡ」はスプライシング受容部位を示し、「ＮＥＯ」はネオマイシン耐性遺伝子を示し、「ｐＡ」はポリＡ付加シグナルを示し、「ＰＧＫ」はホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子プロモーターを示し、「ＢＴＫ」はブルトン型チロシンキナーゼを示し、「ＳＤ」はスプライシング供与部位を示し、「Ｆ」、「Ｒ」、及び「Ｌ」はプライマーを示す。
－ノックアウトの確認－
　ＣＯＸ７ＲＰがノックアウトされたことの確認は、ＣＯＸ７ＲＰ遺伝子のイントロン１に位置するプライマーＦ、又は挿入されたレトロウイルスベクター上に位置するプライマーＬと、プライマーＲとを用いてゲノムＤＮＡをＰＣＲすることにより野生型（ＷＴ：４８９ｂｐ）と変異型（Ｍｕｔ：２８９ｂｐ）の遺伝子型を判別し、ＣＯＸ７ＲＰ＋／＋（＋／＋）、ＣＯＸ７ＲＰ＋／－（＋／－）、及びＣＯＸ７ＲＰ－／－（－／－）のマウスを同定することにより行った。
　前記プライマーＦ、Ｒ、Ｌの配列を以下に示す。
　プライマーＦ：５’－ｔｃｔｇｇｔｔｇａｇｇｔｇｇｃｃｔｔｔｇｔｇａｃｔｔ－３’（配列番号２）
　プライマーＲ：５’－ｔｔａｔｃｃａｇｃａｃｃａａｃｃａｔｃｔｇｃｃａｇａ－３’（配列番号３）
　プライマーＬ：５’－ａａａｔｇｇｃｇｔｔａｃｔｔａａｇｃｔａｇｃｔｔｇｃ－３’（配列番号４）
　図２は、前記ＰＣＲによる産物を電気泳動した結果を示す図である。
－胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）の調製－
　胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）は胎生１６日の胎児より調整し、１０％ｆｅｔａｌ　ｃａｌｆ　ｓｅｒｕｍ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００μｇ／ｍＬ　ｓｔｒｅｐｔｍｙｓｉｎを含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂａｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍ）培地で、５％ＣＯ２、３７℃にて培養した。
－ウエスタンブロット解析－
　胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）のタンパク質の量を同一にしたサンプル（＋／＋、＋／－、－／－）をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにて泳動後、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）へブロッティングした。タンパク質の検出には、１次抗体としてＣＯＸ７ＲＰ、２次抗体としてＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い、ＥＣＬ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）により行った。その後、Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ（６２．５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ６．７、２％ＳＤＳ、１００ｍＭ　２－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）にて抗体を除去後、ローディングコントロールとして、一次抗体β－ａｃｔｉｎ（ＳＩＧＭＡ）、二次抗体ＨＲＰ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて検出した。
　前記ウエスタンブロット解析の結果を図３に示す。図３に示すようにＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウス（ＣＯＸ７ＲＰ－／－（－／－））の胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）では、ＣＯＸ７ＲＰタンパク質は検出されなかった。
－ＣＯＸ活性の測定－
　ＣＯＸ活性の測定は、Ｃｈｒｚａｎｏｗｓｋａ－Ｌｉｇｈｔｏｗｌｅｒｓ　ＺＭ，　Ｔｕｒｎｂｕｌｌ　ＤＭ，　Ｌｉｇｈｔｏｗｌｅｒｓ　ＲＮ．、「Ａ　ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ　ｐｌａｔｅ　ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　ｃ　ｏｘｉｄａｓｅ　ｉｎ　ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ　ｗｈｏｌｅ　ｃｅｌｌｓ．」、Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２１４（１）、４５－４９，１９９３に記載の方法に準じて行った。
　即ち、胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）を０．０１％　ｓａｐｏｎｉｎ、４ｎＭ　３，３’ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ　ｔｅｔｒａ　ｈｙｄｒｏｃｈｏｌｏｒｉｄｅ、１００μＭ　ｒｅｄｕｃｅｄ　ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　ｃ、２μｇ／ｍＬ　ｃａｔａｌａｓｅを含む０．１Ｍ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）中で１５分間インキュベートし、その後、４５０ｎｍの吸光度を測定して求めた。
　前記ＣＯＸ活性の測定結果を図４に示す。図４に示すようにＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウス（ＣＯＸ７ＲＰ－／－（－／－））の胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）では、野生型マウス（ＣＯＸ７ＲＰ＋／＋（＋／＋））の胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）よりもＣＯＸ活性が低下していた。
－ＡＴＰ産生量の測定－
　ＡＴＰ産生量の測定は、Ｏｊａｉｍｉ　Ｊ，　Ｐａｎ　Ｊ，　Ｓａｎｔｒａ　Ｓ，　Ｓｎｅｌｌ　ＷＪ，　Ｓｃｈｏｎ　ＥＡ．、「Ａｎ　ａｌｇａｌ　ｎｕｃｌｅｕｓ－ｅｎｃｏｄｅｄ　ｓｕｂｕｎｉｔ　ｏｆ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ＡＴＰ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｒｅｓｃｕｅｓ　ａ　ｄｅｆｅｃｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ａｎａｌｏｇｏｕｓ　ｈｕｍａｎ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ－ｅｎｃｏｄｅｄ　ｓｕｂｕｎｉｔ．」、Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　Ｃｅｌｌ．、１３（１１）、３８３６－３８４４、２００２に記載の方法に準じて行った。
　即ち、胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）を、１５０ｍＭ　ＫＣｌ、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ　ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、０．１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．１％　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ、５０μｇ／ｍＬ　ｄｉｇｉｔｏｎｉｎの組成の溶液に懸濁したものに、１ｍＭ　ｍａｌａｔｅ、１ｍＭ　ｐｙｒｕｖａｔｅ、１ｍＭ　ＡＤＰ、０．１５ｍＭ　ａｄｅｎｙｌａｔｅ　ｋｉｎａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　Ｐ１，Ｐ５－ｄｉ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ）ｐｅｎｔａｐｈｏｓｐｈａｔｅになるようにこれらの試薬を加え、３７℃で１０分間インキュベートした。その後、２分間煮沸して反応を停止させ、Ｅｎｌｉｔｅｎ　ａｓｓａｙ　ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＡＴＰを定量した。
　前記ＡＴＰ産生量の測定結果を図５に示す。図５に示すようにＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウス（ＣＯＸ７ＲＰ－／－（－／－））の胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）では、野生型マウス（ＣＯＸ７ＲＰ＋／＋（＋／＋））の胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）よりもＡＴＰ量が低下していた。
　前記ＣＯＸ活性の測定、及びＡＴＰ産生量の測定結果から、ＣＯＸ７ＲＰ遺伝子は、ＣＯＸ活性を制御することによって、ミトコンドリアにおけるエネルギー産生を促進することが示された。
（試験例１）
＜通常食飼育における生存期間の測定：寿命＞
　ＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウスと、同腹の野生型マウスとを通常の餌で飼育し、生存期間を測定した。なお、ノックアウトマウスはｎ＝１０、野生型マウスはｎ＝１２で行った。
　結果を図６に示す。図６は、野生型マウス及びＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウスの生存曲線（Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｃｕｒｖｅｓ）を示す。
　図６から、注目すべきことに最大寿命が、野生型マウスでは７７７日であったのに対し、ノックアウトマウスでは８３０日に延長していた。
（試験例２）
＜通常食飼育、及び高脂肪食飼育における体重変化の測定：肥満＞
－通常食飼育－
　６週齢から３５週齢になるまで、ＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウスと、同腹の野生型マウスと(それぞれ、ｎ＝１０)を、通常の餌で飼育し、週１回体重を測定した。
　結果を図７Ａ（オス）と図７Ｂ（メス）に示す。
　図７Ａと図７Ｂから、ＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウスは、通常食で飼育した状態において、統計学的に有意に野生型より体重が少ないことが明らかになった。なお、図７Ａ及び図７Ｂ中、「＊」は、Ｐ＜０．０５であることを示す。
－高脂肪食飼育－
　１７週齢から２７週齢になるまで、ＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウスと、同腹の野生型マウスと（それぞれ、ｎ＝１０)を、高脂肪食（Ｈｉｇｈ　Ｆａｔ　Ｄｉｅｔ　３２，　Ｃｒｅａ，）を自由給餌にて飼育し、週１回体重を測定した。
　結果を図８Ａ、及び図８Ｂに示す。図８Ａは、オスの野生型マウス及びＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウスの体重変化を示し、図８Ｂは、メスの野生型マウス及びＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウスの体重変化を示す。
　図８Ａ、及び図８Ｂから、ＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウスは、高脂肪食で飼育した状態においても、野生型より体重が少ないことが明らかになった。
　なお、図８Ａ中、「＊」は、Ｐ＜０．０５であることを示し、図８Ｂ中、「＊＊」は、Ｐ＜０．０１であることを示す。
　また、前記高脂肪食飼育の測定終了時に、高脂肪食肥満モデルにおける野生型マウスとＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウス（それぞれ、ｎ＝７）の肝臓、腎臓、心臓、骨格筋、皮下脂肪組織（鼠径部）、腹腔内脂肪組織（腎周囲、精巣上体周囲、子宮周囲）の重量を測定した。
　結果を図９Ａ～図９Ｄに示す。図９Ａは、オスの野生型マウス（ＷＴ）、及びＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウス（ＫＯ）の肝臓、腎臓、心臓、骨格筋の重量を示し、図９Ｂは、オスの野生型マウス（ＷＴ）、及びＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウス（ＫＯ）の腎周囲、精巣上体周囲、及び鼠径部の脂肪組織の重量を示し、図９Ｃは、メスの野生型マウス（ＷＴ）、及びＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウス（ＫＯ）の肝臓、腎臓、心臓、骨格筋の重量を示し、図９Ｄは、メスの野生型マウス（ＷＴ）、及びＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウス（ＫＯ）の腎周囲、子宮周囲、及び鼠径部の脂肪組織の重量を示す。
　図９Ａ～図９Ｄから、ＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウスの各重量は、野生型マウスの各重量よりも軽くなっており、ＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウスは、脂肪食における肥満に対して抵抗性を有していることが明らかになった。
　なお、図９Ｂ、図９Ｄ中、「＊」は、Ｐ＜０．０５であることを示し、「＊＊」は、Ｐ＜０．０１であることを示す。
（試験例３）
＜糖負荷試験（ＯＧＴＴ）、インスリン負荷試験（ＩＴＴ）、並びに、トリグリセライド（ＴＧ）、コレステロール、及び遊離脂肪酸（ＮＥＦＡ）の測定：糖代謝、脂質代謝＞
－糖負荷試験（ＯＧＴＴ）－
　マウスを１６時間絶食させた後、グルコース（１．５ｍｇ／ｇ　ｂｏｄｙ　ｗｅｉｇｈｔ）を経口投与し、０分後、３０分後、６０分後、１２０分後に尾静脈より採血した。前記マウスとしては、ＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウスと、同腹の野生型マウスと（それぞれ、ｎ＝７)を用いた。
　血糖値は、Ｇｌｕｔｅｓｔ　Ｐｒｏ　Ｒ（株式会社三和化学研究所）を用いて測定した。また、インスリン濃度は、ＥＬＩＳＡ法（生化学工業株式会社）で測定した。
　結果を図１０Ａ、及び図１０Ｂに示す。図１０Ａは、各採血時間におけるグルコース濃度示し、図１０Ｂは、各採血時間におけるインスリン濃度を示す。図１０Ａ中、「＊＊」は、野生型マウスに対してＰ＜０．０１であることを示し、図１０Ｂ中、「＊」は、野生型マウスに対してＰ＜０．０５であることを示す。
　図１０Ａ、及び図１０Ｂから、絶食後の血糖値は、ノックアウトマウスが野生型マウスよりも低く、さらに糖負荷試験による血糖値の上昇がノックアウトマウスにおいて低く保たれていることが明らかになり、糖代謝の改善がみられた。また、その時の血中インスリンの濃度も低く保たれていた。
－インスリン負荷試験（ＩＴＴ）－
　マウスを２．５時間絶食させた後、インスリン（０．５　ｕｎｉｔｓ／ｋｇ）を腹腔内投与し、０分後、３０分後、６０分後、１２０分後に尾静脈より採血した血液を用いてグルコース濃度を測定した。前記マウスとしては、ＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウス（ＫＯ、ｎ＝３）と、同腹の野生型マウス（ＷＴ、ｎ＝６）とを用いた。
　前記インスリン濃度は、ＥＬＩＳＡ法（生化学工業株式会社）で測定した。
　結果を図１１に示す。図１１は、各採血時間におけるインスリン濃度を示す。
　図１１から、ノックアウトマウス（ＫＯ）の方が、インスリンに対する血糖低下の反応性が有意に良好であることが示され、インスリン感受性の改善が示唆された。
　なお、図１１中、「＊」は、Ｐ＜０．０５であることを示す。
－－通常飼育時の血糖濃度、及びインスリン濃度－－
　前記糖負荷試験を行ったマウスについて、絶食を行っていない通常飼育時の血糖濃度、及びインスリン濃度を測定した結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　表１中、「＊」は、野生型マウスに対してＰ＜０．０５であることを示す。
　表１の結果から、絶食を行っていない通常飼育時においても、ＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウスでは、血糖濃度、及びインスリン濃度が低く保たれていることが明らかになった。
－トリグリセライド（ＴＧ）、コレステロール、及び遊離脂肪酸（ＮＥＦＡ）の測定－
　前記マウスとして、ＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウスと、同腹の野生型マウスと（それぞれ、ｎ＝７)を用い、通常食事下、及び１６時間絶食後の血中のトリグリセライド、コレステロール、遊離脂肪酸の濃度を測定した。結果を表２に示す。
　前記トリグリセライドは、トリグリセライド　Ｅ－テストワコー（和光純薬社製）を用いて測定した。
　前記コレステロールは、コレステロール　Ｅ－テストワコー（和光純薬社製）を用いて測定した。
　前記遊離脂肪酸は、ＮＥＦＡ　Ｃ－テストワコー（和光純薬社製）を用いて測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２の結果から、ＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウスにおいてコレステロールの有意な上昇が観察され、トリグリセライドについても上昇している傾向がみられたことから、ＣＯＸ７ＲＰは脂質代謝にも関与していることが示された。
　前記試験例１～３の結果から、ＣＯＸ７ＲＰは、糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命を制御することができる制御遺伝子であり、アンチエイジング、メタボリック症候群、糖・脂質代謝異常、及び肥満症の分子標的となり得ることが示された。
　本発明の制御遺伝子は、糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命を制御することができるので、アンチエイジング、メタボリック症候群、糖・脂質代謝異常、及び肥満症の分子標的として好適に利用可能である。
　本発明のタンパク質は、前記遺伝子によって発現するので、アンチエイジング、メタボリック症候群、糖・脂質代謝異常、及び肥満症の分子標的として好適に利用可能である。
　また、本発明のスクリーニング方法により探索される物質は、アンチエイジング素材、薬剤、並びにメタボリックシンドロームとそれに関係の深い糖尿病、高脂血症、肥満症の改善及び予防に利用できる医薬や食品添加物などとして利用可能である。

Claims (3)

  1. 　下記（Ａ）及び（Ｂ）のいずれかで示され、糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命の少なくともいずれかを制御することを特徴とする制御遺伝子。
    （Ａ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
    （Ｂ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ、及び、前記ＤＮＡの相補鎖のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
  2. 　糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命の少なくともいずれかを制御し、下記（Ａ）及び（Ｂ）のいずれかで示される遺伝子によって発現することを特徴とするタンパク質。
    （Ａ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
    （Ｂ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ、及び、前記ＤＮＡの相補鎖のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
  3. 　糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命の少なくともいずれかを制御する作用を有する物質のスクリーニング方法であって、請求項１に記載の制御遺伝子の発現の抑制、及び請求項２に記載のタンパク質の活性の抑制の少なくともいずれかを指標とすることを特徴とするスクリーニング方法。
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