CN114828897A - 细胞活力的调节 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于增强神经元的存活、用于抑制神经元的变性和用于抑制神经元中的异常蛋白质积累的方法，所述神经元任选地为运动神经元，所述方法包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：无论所述神经元的内源性细胞周期蛋白F的水平或活性如何，增加所述神经元中的细胞周期蛋白F的水平。任选地，所述神经元在患有神经退行性疾病或处于发展为神经退行性疾病的风险的受试者中，所述神经退行性疾病通常是与神经元TDP‑43蛋白病相关的神经退行性疾病。

Description

细胞活力的调节
技术领域
本公开一般地涉及神经退行性疾病。更具体地，本公开涉及无论运动神经元的内源性细胞周期蛋白F的水平或活性如何，通过增加运动神经元中细胞周期蛋白F的水平来增强运动神经元存活、抑制运动神经元变性和治疗神经退行性疾病的组合物和方法。
本说明书中通过作者和出版年份引用的某些参考书目在说明书的末尾列出。
背景技术
肌萎缩侧索硬化症(ALS)是运动神经元疾病(MND)的最常见形式，是指分别脑和脊髓的上运动神经元和下运动神经元的选择性变性。ALS和额颞叶痴呆(FTD)属于一系列疾病，其中15％的ALS患者还表现出FTD症状，这是第二种最常见的早发性痴呆形式。对ALS和FTD的病因仍然知之甚少，但大多数ALS患者和超过一半的FTD患者具有共同的组织病理学特征。ALS患者脑和脊髓组织的尸检分析经常显示存在tau阴性、泛素阳性聚集体，这些聚集体表现为圆形或绞状内含物，最常见于受影响的神经元和神经胶质细胞的细胞质中。这些内含物散布着泛素、sqstm1、ubiquilin 1和ubiquilin 2——这些蛋白质都参与泛素介导的蛋白质周转，这表明蛋白酶体清除缺陷是ALS/FTD发病机制的一个促成因素。2006年，这些内含物的主要成分被确定为43kDa的反式激活应答DNA结合蛋白(TDP-43)，这是在ALS/FTD的情况下发现从细胞核转移到细胞质的主要核蛋白。来自患者脑裂解物的肌氨酰不溶性级分的表征揭示了TDP-43的生化特征的显著变化。在患者裂解物中，TDP-43被多泛素化、高度磷酸化并在C末端裂解。现在已经在超过98％的ALS病例和超过50％的FTD病例中发现了TDP-43蛋白病，无论是家族性还是散发性起源，这使得TDP-43阳性聚集体或内含物成为该疾病的标志性特征。
与其不溶性聚集的病理形式相反，可溶性TDP-43(sTDP-43)是正常细胞功能所必需的。就这一点而言，它参与mRNA代谢的多种机制，如前mRNA剪接、mRNA稳定性、mRNA转运和miRNA加工，并且是神经元活力所必需的。在正常情况下，sTDP-43的亚细胞定位主要是细胞核，但蛋白质的N末端核定位序列(NLS)和核输出序列的存在允许sTDP-43在细胞核和细胞质之间穿梭。还已知sTDP-43可调节参与神经元和胚胎发育的mRNA，并在发育至成年期间在整个CNS中表达。因此，应理解sTDP-43是一种必需的RNA结合蛋白，其执行其细胞作用的能力的改变对神经元细胞是有毒的。
家族性ALS(fALS)突变占所有ALS病例的5-10％，而其余病例没有明确的原因(散发性ALS；sALS)。尽管家族性基因突变占ALS病例的少数，但它们为了解疾病的潜在机制提供了宝贵的见解。因此，已在包括SOD1、VCP、TARDBP、FUS、OPTN、SQSTM1、UBQLN2、MATR3和TBK1在内的众多基因中鉴定出突变。有趣的是，编码TDP-43的基因TARDBP中的突变仅在约4％的fALS患者和约1％的sALS病例中发现。
有强有力的证据表明，TDP-43在运动神经元内的亚细胞定位是神经变性表型的中心。例如，TDP-43的异常细胞质积累(不溶性聚集体)是ALS(98％的病例)和FTD(>50％)的病理标志。2015年，产生了一种转基因小鼠，其可诱导过表达特异性错误定位到细胞质的人TDP-43变体(变体称为dNLS-TDP-43)。当过表达时，dNLS-TDP43小鼠会发展出快速的ALS样表型，导致运动麻痹和死亡。这种dNLS-TDP-43小鼠代表了散发性ALS/FTD的实验模型，因为它专门导致让人联想到散发性疾病的细胞质错误定位的TDP-43。
已经在CCNF中鉴定出ALS/FTD相关突变，其发生频率与在TARDBP中发现的那些相似。CCNF编码细胞周期蛋白F，它是多蛋白Skp1-Cul1-F-Box(SCFCyclin F)E3连接酶的配体结合成分。在这种SCF复合物中，细胞周期蛋白F(F-box蛋白)负责募集和定位底物以进行多泛素化，然后是蛋白酶体降解。迄今为止，细胞周期蛋白F活性与细胞周期进程和DNA损伤密切相关，因为它介导核糖核苷二磷酸还原酶亚基M2(RRM2)、核仁和纺锤体相关蛋白1(NuSAP)、110kDa的中心粒卷曲螺旋蛋白(CP110)、细胞分裂控制蛋白6同源物(CDC6)、组蛋白RNA发夹结合蛋白(SLBP)核酸外切酶1(exo1)和起泡相关蛋白同源物(Fzr1)的泛素化。还已知细胞周期蛋白F结合和改变myb相关蛋白B(B-Myb)的有丝分裂转录程序。重要的是，所有这些研究都报告了细胞周期蛋白F的核定位，与其作为细胞周期调节蛋白的功能一致。
在本发明人之前的工作中，发现(1)TDP-43是SCFCyclin F复合物的相互作用配偶体和底物，(2)细胞周期蛋白F的缺陷导致TDP-43在运动神经元中积累；和(3)患有神经退行性疾病的患者亚组在运动神经元中具有异常低水平或活性的细胞周期蛋白F。基于这些发现，本发明人在WO 2018/081878中公开了在患有神经退行性疾病的该患者亚组中增加运动神经元中的细胞周期蛋白F水平可减少蛋白质的异常积累，从而增强运动神经元存活。
本发明人还在患有ALS/FTD的多代澳大利亚家族中鉴定了细胞周期蛋白F的位置621处的丝氨酸到甘氨酸替换(S621G)，这导致TDP-43和其它底物的过度活跃泛素化(Lee等人,2017)。结合WO 2018/081878中公开的发现，本发明人假设细胞周期蛋白F活性受到严格调节，以维持泛素化依赖性蛋白质降解通路的适当活性，并且导致细胞周期蛋白F水平低或活性过度活跃的失调会损害这些通路并引发神经退行性疾病，例如ALS和FTD。
发明内容
本公开源于以下发现：通过向神经元补充额外的细胞周期蛋白F，可以增强具有正常水平的内源性细胞周期蛋白F的神经元(包括运动神经元)的存活。本发明人出乎意料地发现这种补充在不会显著降低sTDP-43的情况下降低了不溶性TDP-43(insTDP-43)的水平，从而选择性靶向TDP-43的病理形式，同时允许其可溶性形式发挥其正常的细胞功能。这一发现令人惊讶，因为假设额外的细胞周期蛋白F的表达将被定向到细胞核，这与已知的其在细胞分裂中的作用一致，并且这种定位将导致核TDP-43(sTDP-43)的消耗和相应的ALS样表型(Wu等人,2012)。不希望受任何特定理论的束缚，本发明人提出与其它细胞类型相比，细胞周期蛋白F在包括运动神经元在内的神经元中的表达定位于细胞质，这允许选择性靶向和隔离病理性insTDP-43。
本发明人还发现，细胞周期蛋白F直接结合并介导insTDP-43的多泛素化以进入泛素-蛋白酶体蛋白水解通路，并且这通过不依赖于细胞周期蛋白F中的已知底物识别基序(MRYIL)和底物中的结合基序(R-X-L)的非典型相互作用发生。不希望受任何特定理论的束缚，相信存在于细胞周期蛋白F中的非典型结合基序选择性地靶向insTDP-43以用于清除，并提供了关于为什么细胞周期蛋白F能够在两种显著不同的细胞类型——分裂细胞和非分裂神经元执行不同且离散的功能的生物学原理。
这些发现已经在用于增强神经元存活(包括运动神经元存活)的方法中付诸实践，而无论神经元中内源性细胞周期蛋白F的水平或活性如何，和/或其中神经元不具有相对于对照降低的内源性细胞周期蛋白F水平或活性，用于治疗神经退行性疾病，包括与TDP-43蛋白病适当相关的家族性和散发性神经退行性疾病，如下文所述。
因此，一方面，本公开提供了用于增强神经元(例如，运动神经元)的存活的方法，适合于患有神经退行性疾病或处于发展为神经退行性疾病的风险的受试者。这些方法通常包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：无论所述神经元的内源性细胞周期蛋白F的水平或活性如何，增加所述神经元中的细胞周期蛋白F的水平，从而增强所述神经元的存活。
本公开的另一方面提供了用于抑制神经元(例如，运动神经元)的变性的方法，适合于患有神经退行性疾病或处于发展为神经退行性疾病的风险的受试者。这些方法通常包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：无论所述神经元的内源性细胞周期蛋白F的水平或活性如何，增加所述神经元中的细胞周期蛋白F的水平，从而抑制所述神经元的变性。
在另一方面，本公开提供了用于抑制神经元(例如，运动神经元)中的异常蛋白质积累的方法，适合于患有神经退行性疾病或处于发展为神经退行性疾病的风险的受试者。这些方法通常包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：无论所述神经元的内源性细胞周期蛋白F的水平或活性如何，增加所述神经元中的细胞周期蛋白F的水平，从而抑制所述神经元中的异常蛋白质积累。适当地，异常蛋白质积累包括蛋白质(例如，对蛋白质积累或聚集敏感的蛋白质，例如TDP-43)的异常积累。
在相关方面，本公开提供了用于抑制神经元(例如，运动神经元)中的聚集的或不可溶性TDP-43积累的方法，适合于患有神经退行性疾病或处于发展为神经退行性疾病的风险的受试者。这些方法通常包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：无论所述神经元的内源性细胞周期蛋白F的水平或活性如何，增加所述神经元中的细胞周期蛋白F的水平，从而抑制所述神经元中的聚集的或不可溶性TDP-43积累。
本公开的另一方面提供了用于治疗患有神经退行性疾病或处于发展为神经退行性疾病的风险的受试者的方法。这些方法通常包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：无论神经元的内源性细胞周期蛋白F的水平或活性如何，增加所述受试者的神经元(例如，运动神经元)中的细胞周期蛋白F的水平。
在任何上述方面或实施方案中，所述方法适当地包括使神经元(例如，运动神经元)与增加所述神经元中细胞周期蛋白F水平的药物(agent)接触。在具体实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用有效量的所述药物。在一些实施方案中，所述药物包含构建体，所述构建体包含与在所述神经元(例如，运动神经元)中可操纵的启动子可操纵地连接的编码细胞周期蛋白F的核苷酸序列。在这种类型的说明性实例中，所述构建体包含在递送载具中(例如，病毒载体，例如腺相关病毒(AAV)载体，或非病毒载体)。在具体实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用有效量的所述构建体。
在任何上述方面或实施方案中，所述方法适当地包括在神经元(例如，运动神经元)中过表达细胞周期蛋白F的编码序列。
在任何上述方面或实施方案中，神经元(例如，运动神经元)可以具有相对于对照正常的内源性细胞周期蛋白F水平或活性。
在任何上述方面或实施方案中，神经元(例如，运动神经元)可以不具有相对于对照降低的内源性细胞周期蛋白F水平或活性。
在任何上述方面或实施方案中，在增加神经元中的细胞周期蛋白F的水平之前，所述方法合适地没有检测神经元(例如，运动神经元)中内源性细胞周期蛋白F的水平或活性相对于对照降低的步骤。
在任何上述方面或实施方案中，所述方法可以包括在增加神经元中的细胞周期蛋白F的水平之前，检测神经元(例如，运动神经元)中内源性细胞周期蛋白F相对于对照的水平或活性的步骤，其不是所述神经元中内源性细胞周期蛋白F的水平或活性相对于所述对照降低。
在任何上述方面或实施方案中，所述方法可以包括在增加神经元中的细胞周期蛋白F的水平之前，检测神经元(例如，运动神经元)中内源性细胞周期蛋白F的水平或活性相对于对照正常的步骤。
在任何上述方面或实施方案中，受试者适当地患有神经退行性疾病或处于发展为神经退行性疾病的风险，其中神经退行性疾病与神经元TDP-43蛋白病相关。在这种类型的代表性实例中，受试者可能患有家族性神经退行性疾病(例如，家族性ALS、家族性FTD、家族性阿尔茨海默病(AD)等)或散发性神经退行性疾病(例如，散发性ALS、散发性FTD、散发性AD等)。
本公开的另一个方面涉及增加神经元(例如，运动神经元)中细胞周期蛋白F的水平的药物在制备药剂中的用途，所述药剂用于治疗或抑制与神经元TDP-43蛋白病相关的神经退行性疾病的发展，而无论所述神经元的内源性细胞周期蛋白F的水平或活性如何。
在相关方面，本公开提供了一种试剂盒，包含增加神经元(例如，运动神经元)中细胞周期蛋白F的水平的药物，用于在治疗或抑制与神经元TDP-43蛋白病相关的神经退行性疾病的发展中使用，而无论所述神经元的内源性细胞周期蛋白F的水平或活性如何。在一些实施方案中，所述试剂盒还包括用于实施所述方法的指导材料。
附图说明
图1是显示细胞周期蛋白F结合TDP-43的照片和示意图。A.用细胞周期蛋白F-flag和TDP-43-HA转染HEK293细胞。24小时后，裂解细胞并使用抗flag抗体或IgG对照对Flag-细胞周期蛋白F进行免疫沉淀。使用识别细胞周期蛋白F和TDP-43的抗体通过免疫印迹分析洗脱液。B.用细胞周期蛋白F-flag和TDP-43-HA转染HEK293细胞。在转染后24小时，裂解细胞并使用识别Flag标签的抗体对Flag-细胞周期蛋白F进行免疫沉淀。使用识别细胞周期蛋白F和磷酸化-TDP-43(S409/410)的抗体通过免疫印迹分析洗脱液。C.示意图显示了RxL>AxA突变在TDP-43中的位置。D.用细胞周期蛋白F和TDP-43(WT)或TDP-43(RxL>AxA)转染细胞。使用识别Flag标签的抗体从细胞裂解物中免疫沉淀细胞周期蛋白F。使用抗细胞周期蛋白F和抗TDP-43分析洗脱液。E.示意图显示了用于免疫沉淀的TDP-43片段。F.HEK293细胞用编码Flag-细胞周期蛋白F的构建体以及编码TDP-43的Myc标记的N末端或C末端片段的构建体转染。细胞裂解后，使用抗myc抗体对myc-TDP-43进行免疫沉淀。使用识别细胞周期蛋白F和myc的抗体通过免疫印迹分析洗脱液。
图2是显示SCFcyclin F直接结合TDP-43并使其泛素化的示意图和照片。A.显示用于下拉研究的重组蛋白的示意图。B.将重组细胞周期蛋白F和重组TDP-43一起孵育，然后通过Ni-NTA磁珠富集TDP-43。使用抗细胞周期蛋白F和抗TDP-43通过免疫印迹分析洗脱液。C.细胞周期蛋白F的细胞周期蛋白结构域是重组制备的，并与重组TDP-43一起孵育。孵育后，通过His-标签下拉TDP-43。使用识别GST和TDP-43的抗体通过免疫印迹分析洗脱液。D.使用免疫沉淀的Flag-细胞周期蛋白F和重组His-TDP-43进行体外泛素化测定。
图3示出了TDP-43氨基酸序列，表明TDP-43在氨基酸268-270之间携带单个RxL基序。
图4是示意图和图示，显示全长TDP-43直接结合细胞周期蛋白F的细胞周期蛋白结构域。A.来自单独GST和TDP-43之间相互作用的微尺度热泳(MST)输出显示没有明确的结合。B.GST-细胞周期蛋白结构域和TDP-43之间相互作用的MST输出表明浓度依赖性方式的蛋白质结合。
图5是照片和图形表示，显示小鼠中枢神经系统中细胞周期蛋白F的过表达导致RIPA不溶性TDP-43物质的减少。A.免疫印迹显示从小鼠运动皮层分离的insTDP-43物质以及丽春红S。B.对应于相对于GAPDH归一化的TDP-43的泳道的光密度测定。Student t检验用于确定组间的光密度测量是否显著不同。左侧柱：WT细胞周期蛋白F；右侧柱：GFP。C.免疫印迹显示不溶性TDP-43。对应于相对于丽春红S归一化的TDP-43的泳道的光密度测定。左侧柱：GFP；右侧柱：WT细胞周期蛋白F。Student t检验用于确定组间的光密度测量是否显著不同。**p<0.01。
图6提供了图示，显示在运动神经元中选择性过表达人TDP-43的转基因斑马鱼中野生型细胞周期蛋白F(WT)的实验性过表达导致人TDP-43的细胞核水平降低。不形成活性泛素连接酶的细胞周期蛋白F(LP/AA)的过表达不会导致TDP-43水平降低。A.注射野生型(WT)人CCNF mRNA或注射编码人细胞周期蛋白F(LP/AA)变体(WT-IA)的mRNA后斑马鱼运动神经元中人TDP-43的全细胞荧光强度。B.注射野生型(WT)人CCNF mRNA或注射编码人细胞周期蛋白F(LP/AA)变体(WT-IA)的mRNA后斑马鱼运动神经元中人TDP-43的细胞质荧光强度。C.注射野生型(WT)人CCNF mRNA或注射编码人细胞周期蛋白F(LP/AA)变体(WT-IA)的mRNA后斑马鱼运动神经元中人TDP-43细胞核荧光强度。Student t检验用于确定实验组之间存在统计学上的显著差异。*p<0.05；***p<0.001；****p<0.0001。
表A.
序列简述
Figure BDA0003704755770000061
Figure BDA0003704755770000071
Figure BDA0003704755770000081
Figure BDA0003704755770000091
Figure BDA0003704755770000101
Figure BDA0003704755770000111
具体实施方式
1.定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文所述的那些相似或等效的任何方法和材料可以用于本公开的实践或测试，但是描述了优选的方法和材料。出于本公开的目的，以下术语定义如下。
冠词“a”、“an”和“the”是指冠词的语法对象中的一个或多于一个(即，至少一个)，除非上下文另有明确说明。
如本文所用，“和/或”指的是并涵盖一个或多个相关列出的项目的任何和所有可能的组合，以及当解释为可选(或)时缺乏组合。
此外，如本文所用，术语“约”和“大约”在指可测量的值，例如量、剂量、时间、温度、活性、水平、数量、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量、位置、长度等时，意在涵盖指定量、剂量、时间、温度、活性、水平、数量、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量、位置、长度等的±15％、±10％、±5％、±1％、±0.5％或甚至±0.1％的变化。
如本文所用，术语“活性”应理解为对转录产物或翻译产物产生生物效应的能力的量度或对生物活性分子水平的量度。因此，在细胞周期蛋白F的情况下，术语“活性”是指以下任何一种或多种活性：(1)与其它亚基缔合形成Skp1-Cul1-F-box(SCF)E3泛素-蛋白连接酶复合物(SCFCyclin F)；(2)抑制B-Myb活性以促进细胞周期检查点控制；(3)与底物(例如，CDC6、RRM2、CP110和SLBP，以及TDP-43)相互作用以促进底物的泛素化和降解；以及(4)如本文所公开的，直接与TDP-43结合。
如本文所用，术语“施用”是指通过导致化合物至少部分定位在所需位点的方法或途径将本文描述的药物置于受试者体内。本文所述的药物可以通过任何合适的途径施用，该施用在受试者中产生有效的治疗，即，施用导致递送到受试者的期望位置，其中至少一部分组合物被递送。示例性的施用方式包括但不限于注射、输注、滴注或摄取。“注射”包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下腔、脊髓内、脑脊髓内和胸骨内注射和输注。
术语“同时施用(administration concurrently)”或“同时施用(administeringconcurrently)”或“共施用(co-administering)”等是指施用包含两种或更多种活性物质的单一组合物，或将每种活性物质作为单独的组合物施用和/或在足够短的时间内通过分开的途径同时期或同时或依次进行递送，以使有效结果等同于当所有这些活性物质作为单一组合物施用时所获得的结果。“同时”是指活性剂基本上同时间施用，并且理想地在同一制剂中一起施用。“同时期”是指活性剂在时间上接近地施用，例如，一种药物在另一种药物之前或之后的约一分钟内至约一天内施用。任何同时期的时间都是有用的。然而，通常的情况是，当不同时施用时，各药物将在约一分钟内至约八小时内施用，并且适当地在少于约一至约四小时内施用。当同时期施用时，各药物适当地在受试者的相同部位施用。术语“相同部位”包括确切位置，但可以在约0.5至约15厘米内，优选在约0.5至约5厘米内。如本文所用，术语“分开”是指各药物以一定间隔施用，例如以约一天至数周或数月的间隔施用。可以以任一顺序施用各活性剂。如本文所用，术语“依次”是指按顺序施用各药物，例如以数分钟、数小时、数天或数周的间隔或多个间隔。如果合适，各活性剂可以定期重复循环施用。
术语“药物(agent)”包括诱导期望药理学和/或生理学效应的化合物。该术语还涵盖本文具体提及的那些化合物的药学上可接受的和药理学活性成分，包括但不限于盐、酯、酰胺、前药、活性代谢物、类似物等。当使用上述术语时，应理解这包括活性剂本身以及药学上可接受的药理学活性盐、酯、酰胺、前药、代谢物、类似物等。术语“药物”不应狭义地解释，而是延伸至小分子、蛋白质分子如肽、多肽和蛋白质以及包含它们的组合物和遗传分子如RNA、DNA及其模拟物和化学类似物以及细胞剂。术语“药物”包括能够产生和分泌本文提及的多肽以及包含编码该多肽的核苷酸序列的多核苷酸的细胞。因此，术语“药物”延伸至用于在一系列细胞中表达和分泌的核酸构建体，包括载体如病毒或非病毒载体、表达载体和质粒。如本文所用，术语“候选药物”和“测试药物”可互换使用，是指待筛选以下能力的药物和/或组合物：刺激和/或增加和/或促进运动神经元存活，和/或抑制或减少运动神经元变性，和/或抑制或减少运动神经元中的异常蛋白质积累。
如本文所用，“增强细胞周期蛋白F的水平或活性的药物”或“细胞周期蛋白F增强剂”是指增加细胞周期蛋白F mRNA或蛋白质的水平、细胞周期蛋白F的活性、细胞周期蛋白FmRNA或蛋白质的半衰期、或细胞周期蛋白F与另一个分子(例如，细胞周期蛋白F的底物如TDP-43和/或SCFCyclin F复合物的其它组分)的结合的药物。例如，药物可以直接或间接增强细胞周期蛋白F与SCFCyclin F复合物的其它组分缔合并使蛋白质泛素化以被蛋白酶体清除的能力。可以使用标准RNase保护测定或原位杂交测定来确定mRNA的表达水平，并且可以使用标准Western或免疫组织化学分析来确定蛋白质水平。也可以使用标准测定法测量蛋白质的泛素化水平。在一些实施方案中，增强细胞周期蛋白F水平或活性的药物将细胞周期蛋白F活性增加至少20、40、60、80或90％。在一些实施方案中，在存在细胞周期蛋白F增强剂的情况下，细胞周期蛋白F的水平高至少2、3、5、10、20或50倍。
术语“顺式作用元件”、“顺式作用序列”或“顺式调节区”在本文中可互换使用以表示调节可操纵连接的启动子的转录活性和/或可操纵连接的核苷酸序列的表达的任何核苷酸序列。本领域技术人员将意识到，顺式序列可能能够激活、沉默、增强、抑制或以其它方式改变任何核苷酸序列(包括编码序列和非编码序列)的表达水平和/或细胞类型特异性和/或发育特异性。
“编码序列”是指有助于编码基因的多肽产物或基因的最终mRNA产物(例如，剪接后基因的mRNA产物)的任何核酸序列。相反，术语“非编码序列”是指对基因的多肽产物或基因的最终mRNA产物的编码没有贡献的任何核酸序列。
在整个本说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”、“包含”和“含有”将被理解为暗示包含陈述的步骤或元素或步骤或元素的组，但不排除任何其它步骤或元素或步骤或元素的组。因此，使用术语“包括”等表示列出的元素是必需的或强制性的，但其它元素是可选的并且可能存在或不存在。“由……组成”的意思是包括并限于短语“由……组成”后的任何内容。因此，短语“由……组成”表示列出的元素是必需的或强制性的，并且可能不存在其它元素。“基本上由……组成”是指包括在该短语后列出的任何元素，并且限于不干扰或有助于在公开中为列出的元素指定的活性或动作的其它元素。因此，短语“基本上由……组成”表示所列要素是必需的或强制性的，但其它要素是可选的，可能存在也可能不存在，这取决于它们是否影响所列要素的活性或作用。
如本文所用，术语“疾病(condition)”包括相对于正常的解剖学和生理学偏差，其对活体动物或其部分之一的正常状态具有损害，中断或改变身体机能的表现。
术语“条件表达(conditional expression)”、“条件地表达(conditionallyexpressed)”、“条件地表达(conditionally expressing)”等是指通过存在或不存在刺激或其它信号(例如，化学、光、激素、胁迫或病原体)来激活或抑制目的基因表达的能力。在具体实施方案中，目的核酸序列的条件表达取决于诱导物的存在或抑制剂的不存在。
“保守氨基酸替换”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基代替的替换。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义，其一般可细分如下：
表1.氨基酸亚类
Figure BDA0003704755770000141
保守氨基酸替换还包括基于侧链的分组。例如，具有脂肪族侧链的氨基酸组是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族羟基侧链的氨基酸组是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的氨基酸组是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香侧链的氨基酸组是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸组是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；以及具有含硫侧链的氨基酸组是半胱氨酸和蛋氨酸。例如，可以合理地预期用异亮氨酸或缬氨酸替换亮氨酸、用谷氨酸替换天冬氨酸、用丝氨酸替换苏氨酸或用结构上相关的氨基酸替换类似氨基酸不会对所得变体多肽的性质产生重大影响。氨基酸变化是否导致功能性多肽可以通过测定其活性来容易地确定。保守替换显示在表2中示例性和优选替换的标题下。落入本公开范围内的氨基酸替换通常通过选择对于维持以下的效果没有显著差异的替换实现的：(a)替换区域中肽骨架的结构，(b)分子在靶位点的电荷或疏水性，或(c)侧链的主体。在引入替换后，筛选变体的生物活性。
表2.示例性和优选的氨基酸替换
Figure BDA0003704755770000142
Figure BDA0003704755770000151
如本文所用的与接触运动神经元或运动神经元替代细胞有关的术语“接触(contacting)”或“接触(contact)”包括使运动神经元或替代细胞经受包含指定化合物和/或药物的适当培养基。当运动神经元或替代细胞在体内时，“接触(contacting)”或“接触(contact)”包括通过适当的施用途径将药物组合物中的化合物和/或药物施用于受试者，使得化合物和/或药物接触体内的运动神经元或替代细胞。在具体实施方案中，测定接触的运动神经元或替代细胞的细胞存活。细胞存活的测量可以基于在细胞与化合物或药物接触后经过一段时间后活细胞的数量。例如，可以在约至少5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、2天、3天或更长时间之后对活细胞数进行计数，并与未处理对照中的活细胞数进行比较。
术语“构建体”是指包含一个或多个来自不同来源的分离的核酸序列的重组基因分子。因此，构建体是嵌合分子，其中两个或更多个不同来源的核酸序列组装成单个核酸分子，并且包括包含以下内容的任何构建体：(1)自然界中未一起发现的核酸序列，包括调节和编码序列(即，至少一个核苷酸序列相对于至少一个其它核苷酸序列是异源的)，或(2)非天然邻接的编码功能性RNA分子或蛋白质的部分的序列，或(3)非天然邻接的启动子的部分。代表性构建体包括来源于任何来源的能够进行基因组整合或自主复制的任何重组核酸分子，例如质粒、粘粒、病毒、自主复制多核苷酸分子、噬菌体或线性或环状单链或双链DNA或RNA核酸分子，包括其中一个或多个核酸分子已可操纵地连接的核酸分子。本公开的构建体通常包括指导也包含在构建体中的目的核酸序列的表达所必需的元件，例如靶核酸序列或调节物核酸序列。这样的元件可以包括控制元件，例如与目的核酸序列可操纵地连接(以便指导转录)的启动子，并且通常还包括多聚腺苷酸化序列。在本公开的某些实施方案中，构建体可以包含在载体中。除了构建体的组分之外，载体可以包含例如一种或多种选择标记、一个或多个复制起点(例如原核和真核起点)、至少一个多克隆位点和/或促进将构建体稳定整合到宿主细胞的基因组中元件。两个或更多个构建体可以包含在单个核酸分子(例如单个载体)中，或者可以包含在两个或更多个分开的核酸分子(例如两个或更多个分开的载体)中。“表达构建体”通常至少包括与目的核苷酸序列可操纵地连接的控制序列。以这种方式，例如，在表达构建体中提供了与待表达的核苷酸序列可操纵地连接的启动子，用于在包括宿主细胞的生物体或其部分中表达。对于本公开的方法的实践，用于制备和使用构建体和宿主细胞的常规组合物和方法是本领域技术人员熟知的，参见例如，MolecularCloning:A Laboratory Manual,第3版，第1、2和3卷.J.F.Sambrook,D.W.Russell和N.Irwin,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2000。
如本文所用，术语“对照神经元”是指来自一名或多名健康受试者或未患有神经退行性疾病和/或未患有TDP-43蛋白病的受试者(例如，对照受试者)的神经元(例如，运动神经元)。
“对应”或“对应于”是指显示出与参考氨基酸序列的实质序列相似性或同一性的氨基酸序列。一般而言，氨基酸序列将显示出与参考氨基酸序列的至少一部分具有至少约70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、97、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％或甚至高至100％的序列相似性或同一性。
术语“减少”、“降低”或“抑制”和它们的语法等同物在本文中均一般用于表示减少统计学显著量。然而，为免生疑问，术语“减少”、“降低”或“抑制”及其语法等同物是指与参考水平相比减少至少10％，例如减少至少约20％，或至少约30％，或至少约40％，或至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％，其中减少小于100％。在一个实施方案中，减少包括100％减少(例如，与参考样品相比不存在水平)，或与参考水平相比10-100％之间的任何减少。
如本文所用，“剂量单位”是指适合作为用于待治疗受试者的单位剂量的物理离散单位；每个单元包含经计算产生治疗效果的预定量的药物，以及所需的药学载体。
如本文所用，术语“有效量”是指有效促进运动神经元细胞存活或抑制或减缓此类细胞死亡的化合物和/或药物的量。有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。通常，有效量可随受试者的病史、年龄、状况、性别以及受试者的医学病症的严重性和类型以及抑制神经退行性疾病中的病理过程的其它药物的施用而变化。
如本文所用，术语“编码(encode)”、“编码(encoding)”等是指核酸提供另一核酸或多肽的能力。例如，如果核酸序列可以被转录和/或翻译以产生多肽，或者如果它可以被加工成可以被转录和/或翻译以产生多肽的形式，则称其“编码”多肽。这样的核酸序列可以包括编码序列或编码序列和非编码序列两者。因此，术语“编码(encode)”、“编码(encoding)”等包括因DNA分子转录而得到的RNA产物、因RNA分子翻译而得到的蛋白质、因DNA分子转录以形成RNA产物并且RNA产物随后翻译而得到的蛋白质，或因DNA分子转录以提供RNA产物，RNA产物加工以提供经加工的RNA产物(例如mRNA)并且经加工的RNA产物随后翻译而得到的蛋白质。
如本文所用，短语“增强运动神经元存活”是指与对照相比运动神经元细胞存活的提高。在一些实施方案中，运动神经元与本文所述的细胞周期蛋白F增强剂的接触导致相对于未处理的对照，运动神经元存活提高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍或更多。运动神经元存活可以通过以下来评估，例如(i)培养物中运动神经元的存活时间增加；(ii)培养物中或体内神经元相关分子例如胆碱乙酰转移酶、乙酰胆碱酯酶和细胞周期蛋白F的产生增加；(iii)培养物中或体内包括TDP-43在内的蛋白质的异常积累降低；或(iv)体内运动神经元功能障碍的症状减轻。这样的效果可以通过本领域已知的任何方法来测量。在一个非限制性实例中，运动神经元存活的提高可以通过Arakawa等人(1990,J.Neurosci.10:3507-3515)描述的方法测量；神经元相关分子产生的增加可以通过生物测定、酶测定、抗体结合、Northern印迹测定等来测量，具体取决于待测量的分子；蛋白质的异常积累的减少可以通过检测聚集体和包涵体中的聚集蛋白质来测定，例如Shen等人(2011,Cell Biochem Biophys 60:173–185)描述的，并且运动神经元功能障碍可以通过评估运动神经元疾病的物理表现来测量。在一个实施方案中，运动神经元存活的提高可以通过测量细胞周期蛋白F水平的增加来评估。细胞存活也可以通过钙黄绿素AM(活染料二乙酸荧光素的类似物)的摄取来测量。钙黄绿素被活细胞摄取并在细胞内切割成荧光盐，荧光盐被活细胞的完整膜保留。活神经元的显微计数与通过荧光活力测定获得的相对荧光值直接相关。因此，该方法提供了对给定培养物的总细胞群中细胞存活的可靠和定量测量(Bozyczko-Coyne等人,J.Neur.Meth.50:205-216,1993)。其它评估细胞存活的方法描述于美国专利号5,972,639、6,077,684和6417,160中，其内容通过引用并入本文。体内运动神经元存活可以通过受试者中运动神经元、神经运动或神经肌肉功能的增加来评估。在一个非限制性实例中，受试者的运动神经元存活可以通过与受试者的运动神经元功能障碍或死亡相关的疾病(例如，ALS或FTD)的进展、恶化或严重程度的逆转、减轻、改善、抑制、减慢或停止来评估。
术语“内源性”是指在宿主生物体或其细胞中存在和/或天然表达的分子(例如，核酸、碳水化合物、脂质或多肽)。例如，“内源性细胞周期蛋白F”是指在细胞(例如，运动神经元)中天然表达的细胞周期蛋白F多肽。
如本文所用，术语“外源性”是指被引入宿主细胞的分子(例如，核酸、碳水化合物、脂质或多肽)。在具体的实施方案中，外源多肽是指由以下多核苷酸表达的多肽：对其被引入的细胞而言是外源的多核苷酸，或与其被引入的细胞中的序列同源但在宿主细胞核酸内多核苷酸通常不存在的位置处的多核苷酸。
关于基因序列的术语“表达”是指基因转录以产生RNA转录物(例如，mRNA、反义RNA、siRNA、shRNA、miRNA等)，并在适当时所得mRNA转录物翻译成蛋白质。因此，如从上下文中将清楚的，编码序列的表达由编码序列的转录和翻译产生。相反，非编码序列的表达由非编码序列的转录产生。
如本文所用，术语“基因”是指能够用于产生mRNA、反义RNA、siRNA、shRNA、miRNA等并且在一些实施方案中用于产生多肽的核酸分子。基因可能能够或可能不能够被用来产生功能性蛋白质。基因可以包括编码区和非编码区(例如，内含子、调节元件，包括启动子、增强子、终止序列以及5'和3'非翻译区)。在某些实施方案中，术语“基因”在其范围内包括编码特定多肽的开放阅读框、内含子和涉及表达调节的相邻5'和3'非编码核苷酸序列。在这方面，基因可以进一步包含控制序列，例如与给定基因天然相关的启动子、增强子、终止和/或多腺苷酸化信号，或异源控制序列。基因序列可以是cDNA或基因组DNA或其片段。可以将基因引入适当的载体以用于染色体外维持或用于引入宿主。
术语“增加”、“增强”或“激活”以及它们的语法等同物在本文中均用于一般表示静态显著量的增加；为避免任何疑问，术语“增加”、“增强”或“激活”及其语法等同物是指与参考水平相比增加至少10％，例如与参考水平相比增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或最高达并包括100％增加或10-100％之间的任何增加，或与参考水平相比至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍或至少约10倍增加，或2倍至10倍或更多倍之间的任何增加。
如本文所用，短语“抑制运动神经元变性”是指减少运动神经元活力的损失、减少运动神经元功能的损失和/或减少运动神经元数量的损失。在一些实施方案中，运动神经元与本文所述的药物接触导致与未处理的对照相比，运动神经元变性降低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍或更多倍。运动神经元变性可以一般地通过例如测定氧化应激或内质网应激或细胞凋亡或神经元死亡来评估。
如本文所用，术语“水平”涵盖细胞周期蛋白F的绝对量、细胞周期蛋白F的相对量或浓度以及与其相关或可从其推导出的任何值或参数。例如，该水平可以是重量、摩尔数、丰度、浓度(例如μg/L)，或相对量，例如参考或对照水平的9/10、4/5、7/10、3/5、1/2、2/5、3/10、1/5、1/10、1/20、1/50、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13、10-14或约10-15。任选地，术语水平包括相对于内部归一化对照(例如管家基因的表达)进行归一化的细胞周期蛋白F水平。适用于细胞周期蛋白F的水平的术语“水平”在其范围内包括CCNF转录产物(例如，CCNF mRNA)和/或CCNF翻译产物(例如，细胞周期蛋白F)的水平。
如本文所用，术语“水平”和/或“活性”进一步指基因表达水平或基因活性。基因表达可以定义为通过转录和翻译来利用基因中包含的信息，从而产生基因产物。测得的“表达水平”是产生的转录或翻译产物的量的指标。
如本文所用，术语“调节”意指引起或促进感兴趣的分子、过程、通路或现象中的定性或定量变化、改变或修饰。非限制性地，这样的变化可以是增加、减少、结合特性的变化，或过程、通路或现象的不同组分或分支的相对强度或活性的变化。
如本文所用，短语“运动神经元变性”或“运动神经元的变性”是指运动神经元恶化的疾病，其中神经元死亡或变为较低或较少功能活性的形式。
术语“神经退行性疾病”是一个包容性术语，包括中枢或外周神经系统的急性和慢性病症、障碍或疾病，并且通常由神经系统的细胞或组织的恶化引起或与之相关。神经退行性疾病可能与年龄有关，或者可能由损伤或创伤引起，或者可能与特定疾病或障碍有关。急性神经退行性疾病包括但不限于与神经元细胞死亡或损害相关的疾病，包括脑血管功能不全、局灶性或弥漫性脑外伤、弥漫性脑损伤、脊髓损伤或外周神经创伤，例如，由物理或化学灼烧、深度割伤或断肢引起。急性神经退行性疾病的实例有：脑缺血或梗塞，包括栓塞性闭塞和血栓性闭塞、急性缺血后的再灌注、围产期缺氧缺血性损伤、心脏骤停以及任何类型的颅内出血(如硬膜外、硬膜下、蛛网膜下和脑内)，以及颅内和椎内病变(如挫伤、穿透、剪切、压迫和撕裂)，以及鞭打和摇晃婴儿综合征。慢性神经退行性疾病包括但不限于阿尔茨海默病、弥漫性路易体病、进行性核上性麻痹(Steel-Richardson综合征)、多系统变性(Shy-Drager综合征)、与神经退行性变相关的慢性癫痫病、运动神经元疾病，包括肌萎缩侧索硬化症(ALS)、额颞叶痴呆(FTD)、退行性共济失调、皮质基底变性、关岛型ALS-帕金森症-症呆复合症(ALS-Parkinson's-Dementia complex of Guam)、亚急性硬化性全脑炎、亨廷顿病(Huntington's disease)、帕金森病(Parkinson's disease)、突触核蛋白病(包括多系统萎缩)、原发性进行性失语症、纹状体黑质变性(striatonigral degeneration)、马查多-约瑟夫病(Machado-Joseph disease)/3型脊髓小脑性共济失调和橄榄体脑桥小脑变性、Gilles De La Tourette病、延髓和假性延髓麻痹、脊髓和脊髓延髓肌萎缩(肯尼迪病)、原发性侧索硬化症、家族性痉挛性截瘫、韦德尼希-霍夫曼病(Werdnig-Hoffmann disease)、库格尔贝格-韦兰德病(Kugelberg-Welander disease)、泰-萨克斯病(Tay-Sach'sdisease)、桑德霍夫病(Sandhoff disease)、家族性痉挛病、Wohlfart-Kugelberg-Welander病、痉挛性截瘫、进行性多灶性白质脑病、家族性自主神经异常(Riley-Day综合征)和朊病毒病(包括但不限于克罗伊茨费尔特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob)、格斯特曼-施特劳斯勒-沙因克病(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease)、Kuru和致命的家族性失眠症)、脱髓鞘疾病和障碍，包括多发性硬化症，和遗传性疾病，例如脑白质营养不良。在具体实施方案中，神经退行性疾病选自ALS和FTD。
如本文所用，术语“神经元”包括神经元及其一个或多个部分(例如，神经元细胞体、轴突或树突)。如本文所用，术语“神经元”表示神经系统细胞，其包括中央细胞体或胞体(soma)，以及两种类型的延伸或突起：树突，通常大部分神经元信号通过树突传递至细胞体，和轴突，通常大部分神经元信号通过轴突从细胞体传递到效应细胞，例如目标神经元或肌肉。神经元可以将来自组织和器官的信息传递到中枢神经系统(传入或感觉神经元)，并将信号从中枢神经系统传递到效应细胞(传出或运动神经元)。称为中间神经元的其它神经元连接中枢神经系统(脑和脊柱)内的神经元。神经元可以是任何神经元，包括但不限于感觉神经元、交感神经元、副交感神经元或肠神经元，例如背根神经节神经元、运动神经元和中枢神经元，例如来自脊髓的神经元。可经受根据本公开的治疗或方法的神经元类型的某些具体实例包括小脑颗粒神经元、背根神经节神经元和皮层神经元。在一些实施方案中，神经元是感觉神经元。在一些实施方案中，神经元是运动神经元。
术语“神经元变性”和“神经元的变性”在本文中可互换使用，是指神经元细胞中的任何病理变化，包括但不限于神经元细胞的死亡或丧失、细胞死亡之前的任何变化以及神经元细胞的活性或功能的任何减少或丧失。病理变化可以是自发的或可以由任何事件诱发，包括例如与细胞凋亡相关的病理变化。神经元可以是任何神经元，包括但不限于感觉神经元、交感神经元、副交感神经元或肠神经元，例如背根神经节神经元、运动神经元和中枢神经元，例如来自脊髓的神经元。神经元变性或细胞丧失是多种神经疾病或病症例如神经退行性疾病或病症的特征。在一些实施方案中，神经元是感觉神经元。在一些实施方案中，神经元是运动神经元。
术语“嗜神经病毒载体”是指选择性感染神经元细胞(包括运动神经元)的病毒载体。
“获得”是指拥有。如此获得的样品包括例如分离或源自特定来源的核酸提取物或多肽提取物。例如，提取物可以直接从受试者的生物体液或组织中分离。
如本文所用，术语“可操纵地连接”或“可操纵地链接”是指并置，其中如此描述的组件处于允许它们以它们的预期方式起作用的关系中。例如，与目的核苷酸序列(例如编码和/或非编码序列)“可操纵地连接”的调控序列(例如启动子)是指控制序列相对于目的核苷酸序列的定位和/或取向，以允许该序列在与控制序列相容的条件下表达。控制序列不必与目的核苷酸序列连续，只要它们起到指导其表达的作用。因此，例如，插入的非编码序列(例如，未翻译但转录的序列)可以存在于启动子和编码序列之间，并且启动子序列仍然可以被认为与编码序列“可操纵地连接”。
术语“过表达(overexpress)”、“过表达(overexpression)”或“过表达的(overexpressed)”可互换地指与正常细胞或比较细胞(例如，正常运动神经元)相比以可检测的更高水平被转录或翻译的基因。因此，过表达是指蛋白质和RNA的过表达(由于提高的转录、转录后加工、翻译、翻译后加工、改变的稳定性和改变的蛋白质降解)，以及由于蛋白质运输模式改变导致的局部过表达(增加的核定位)，以及增强的功能活性，例如，底物的增加的酶水解。与正常细胞或比较细胞(例如，正常运动神经元)相比，过表达也可以至少大10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％。
本文可互换使用的术语“患者”、“受试者”、“宿主”或“个体”是指需要治疗或预防的任何受试者，特别是脊椎动物受试者，甚至更特别是哺乳动物受试者。落入本公开范围内的合适的脊椎动物包括但不限于脊索动物亚门的任何成员，包括灵长类动物(例如人、猴和类人猿，并且包括来自猕猴属的猴物种(例如，食蟹猴(cynomologus monkey)，如食蟹猕猴(Macaca fascicularis)和/或恒河猴(Macaca mulatta))和狒狒(Papio ursinus)，以及狨猴(来自狨猴属(Callithrix)的物种)、松鼠猴(来自松鼠猴属(Saimiri)的物种)和金狮猴(tamarin)(例如来自柽柳猴属(Saguinus)的物种)以及类人猿物种，例如黑猩猩(Pantroglodytes))、啮齿动物(例如小鼠、大鼠、豚鼠)、兔类动物(例如家兔、野兔)、牛科动物(例如牛)、绵羊类动物(例如绵羊)、山羊类动物(例如山羊)、猪类动物(例如猪)、马类动物(例如马)、犬科动物(例如狗)、猫科动物(例如猫)、禽类(例如鸡、火鸡、鸭、鹅、伴侣鸟如金丝雀、虎皮鹦鹉等)、海洋哺乳动物(如海豚、鲸)、爬行动物(蛇、青蛙、蜥蜴等)和鱼。优选的受试者是需要提高细胞周期蛋白F的水平或活性和/或治疗神经退行性疾病的人。然而，应当理解，上述术语并不意味着存在症状。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内，适合与人类和动物的组织接触，而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的收益/风险比相称的那些化合物、药物、材料、组合物和/或剂型。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料、组合物或载具，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂(例如润滑剂、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌、或硬脂酸)或溶剂包封材料，其涉及将主题药物从一个器官或身体的一部分携带或运输到另一器官或身体的另一部分。在与制剂的其它成分相容且对患者无害的意义上，每种载体必须是“可接受的”。
术语“多核苷酸”在本文中可与“核酸”互换使用以表示核苷的聚合物。通常，本公开的多核苷酸由通过磷酸二酯键连接的天然存在于DNA或RNA中的核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)组成。然而，该术语涵盖包含核苷或核苷类似物的分子，所述核苷类似物包含化学或生物修饰的碱基、修饰的骨架等，无论是否存在于天然存在的核酸中，并且此类分子对于某些应用可能是优选的。当本申请涉及多核苷酸时，应理解提供了DNA、RNA，以及在每种情况下都提供了单链和双链形式(以及每个单链分子的互补物)。如本文所用的“多核苷酸序列”可以指多核苷酸材料本身和/或在生物化学上表征特定核酸的序列信息(例如，用作碱基缩写的连续字母)。除非另有说明，否则本文呈现的多核苷酸序列以5'至3'方向呈现。
如本文所用，术语“多肽”是指氨基酸的聚合物。术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。肽是相对较短的多肽，通常长度在约2至60个氨基酸之间。本文使用的多肽通常含有氨基酸，例如蛋白质中最常见的20种L-氨基酸。然而，可以使用本领域已知的其它氨基酸和/或氨基酸类似物。可以修饰多肽中的一个或多个氨基酸，例如，通过添加化学实体如碳水化合物基团，磷酸基团，脂肪酸基团，用于缀合、官能化等的接头。具有与其共价或非共价结合的非多肽部分的多肽仍被认为是“多肽”。示例性修饰包括糖基化和棕榈酰化。多肽可以从天然来源纯化，使用重组DNA技术生产，通过化学手段如常规固相肽合成等合成。本文使用的术语“多肽序列”或“氨基酸序列”可以指多肽材料本身和/或以生物化学方式表征多肽的序列信息(例如，用作氨基酸名称缩写的连续字母或三字母代码)。除非另有说明，否则本文呈现的多肽序列以N末端至C末端的方向呈现。
术语“启动子”是指通常位于可转录序列的上游(5')的核苷酸序列，其通过提供对RNA聚合酶和正确转录所需的其它因子的识别来控制可转录序列的表达。“启动子”包括最小启动子，它是短核酸序列，包含TATA框和用于指定转录起始位点的其它序列，可以向其添加控制元件(例如，顺式作用元件)以控制表达。“启动子”还指包含最小启动子和能够控制编码序列或功能性RNA表达的控制元件(例如，顺式作用元件)的核苷酸序列。这种类型的启动子序列由近端和更远端的上游元件组成，后一种元件通常称为增强子。因此，“增强子”是可以刺激启动子活性的核酸序列，并且可以是启动子的先天元件或插入以增强启动子的水平或组织特异性的异源元件。它能够在两个方向(正常或翻转)上运行，并且即使从启动子向上游或下游移动时也能够发挥作用。增强子和其它上游启动子元件都结合介导其作用的序列特异性核酸结合蛋白。启动子可以全部源自天然基因，或者由源自自然界中发现的不同启动子的不同元件构成，或者甚至由合成核酸片段构成。启动子还可以包含参与蛋白质因子结合的核酸序列，这些蛋白质因子控制响应生理或发育条件的转录起始的有效性。在没有上游活化的情况下是无活性的或具有大幅降低的启动子活性的启动子元件(特别是TATA元件)被称为“最小或核心启动子”。在存在合适的转录因子的情况下，最小启动子发挥功能以允许转录。因此，“最小或核心启动子”仅由转录起始所需的所有基础元件组成，例如TATA盒和/或起始子(initiator)。术语“调节型启动子”是指不是组成型而是以时间和/或空间调节的方式指导基因表达的启动子，包括组织特异性和诱导型启动子。其包括天然和合成序列以及可以是合成和天然序列的组合的序列。不同的启动子可以在不同组织或细胞类型中，或在不同的发育阶段，或响应不同的环境条件指导基因表达。不断发现可用于宿主细胞的各种类型的新启动子。由于在大多数情况下，调控序列的确切边界尚未完全确定，因此不同长度的核酸片段可能具有相同的启动子活性。示例性的调节型启动子包括但不限于安全剂诱导型启动子、源自四环素诱导型系统的启动子、源自水杨酸诱导型系统的启动子、源自醇诱导型系统的启动子、源自糖皮质激素诱导型系统的启动子、源自病原体诱导型系统的启动子、源自碳水化合物诱导型系统的启动子、源自激素诱导型系统的启动子、源自抗生素诱导型系统的启动子、源自金属诱导型系统的启动子、源自热休克诱导型系统的启动子和源自蜕皮激素诱导型系统的启动子。
“调控序列”、“调控元件”等是指位于编码序列上游(5'非编码序列)、内部或下游(3'非编码序列)的核苷酸序列，其影响直接或间接的相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译。调控元件包括增强子、启动子、翻译前导序列、内含子、Rep识别元件、基因间区域和多腺苷酸化信号序列。它们包括天然和合成序列以及可以是合成和天然序列的组合的序列。
如本文所用，术语“重组多核苷酸”是指通过将核酸操纵成在自然界中通常不存在的形式而在体外形成的多核苷酸。例如，重组多核苷酸可以是表达载体的形式。通常，这样的表达载体包含可操纵地连接到核苷酸序列的转录和翻译调节核酸。
“重组多肽”是指使用重组技术(即通过重组多核苷酸的表达)制备的多肽。
本文使用的关于运动神经元中细胞周期蛋白F水平的术语“降低的水平”是指低于没有神经退行性疾病的年龄匹配的健康受试者的随机群体(例如，年龄匹配的10、20、30、40、50、100或500名健康受试者的随机群体)的中值水平的任何细胞周期蛋白F水平。在具体的实施方案中，细胞周期蛋白F的降低的水平对应于与以下一种或两种相关的细胞周期蛋白F水平：(1)TDP-43异常定位于细胞区室(例如，细胞质和/或细胞核)中；(2)形成异常TDP-43结构(例如，包含TDP-43的聚集体或内含物)。在某些实施方案中，运动神经元中细胞周期蛋白F的降低的水平或活性小于对照运动神经元中的细胞周期蛋白F的水平或活性的约9/10、4/5、7/10、3/5、1/2、2/5、3/10、1/5、1/10、1/20、1/50、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13、10-14或约10-15。
如本文所用，术语“样品”包括可以来自受试者的提取、未处理、处理、稀释或浓缩的任何生物样本。样品可以包括但不限于生物流体，例如全血、血清、红细胞、白细胞、血浆、唾液、尿液、粪便(即排泄物)、眼泪、汗液、皮脂、乳头抽吸物(nipple aspirate)、导管灌洗液、肿瘤渗出液、滑液、腹水、腹膜液、羊水、脑脊液、淋巴液、细针抽吸物、羊水、任何其它体液、细胞裂解物、细胞分泌物、炎症液、精液和阴道分泌物。样品可以包括组织样品和活检、组织匀浆等。在某些实施方案中，样品包含组织，并且在这种类型的代表性示例中，样品来自切除、活检或芯针活检。此外，可以使用细针抽吸物样品。样品可以包括石蜡包埋和冷冻组织。在具体实施方案中，样品包含神经元组织，包括运动神经元。在其它实施方案中，样品包含作为运动神经元替代物的细胞，其非限制性实例包括成纤维细胞，例如由Yang等人(2015,Neurotox Res 28:138–146)公开的和血细胞，例如在www.sciencedaily.com/releases/2014/04/140408121918.htm中公开的。术语“样品”还包括未处理或预处理(或预先处理)的样品。在一些实施方案中，样品是未经处理的生物样品。样品可以通过从受试者中取出细胞样品来获得，但也可以通过使用先前分离的细胞来完成(例如，在之前的时间点分离并由同一人或另一个人分离)。
如本文所用，术语“序列同一性”是指序列在比较窗口上在逐个核苷酸的基础上或逐个氨基酸的基础上相同的程度。因此，“序列同一性百分比”是通过如下计算的：在比较窗口中比较两个最佳对齐的序列，确定两个序列中出现相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中位置的总数(即窗口大小)，并将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。本公开内容考虑在本文公开的方法中使用全长细胞周期蛋白F多肽以及它们的生物活性片段。通常，全长细胞周期蛋白F多肽的生物活性片段可以参与相互作用，例如分子内或分子间相互作用。
“相似性”是指相同或构成如上文表1和2中定义的保守替换的氨基酸数目的百分比。可使用序列比较程序如GAP(Deveraux等人1984,Nucleic Acids Research 12:387-395)确定相似性。以这种方式，可以通过在对齐中插入空位来比较与本文所引用的那些长度相似或基本上不同的序列，这样的空位例如通过GAP使用的比较算法来确定。
用于描述两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列关系的术语包括“参考序列”、“比较窗口”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”和“基本相同”。“参考序列”的长度为至少12个，但通常15至18个，通常至少25个单体单元，包括核苷酸和氨基酸残基。因为两个多核苷酸可以各自包含(1)在两个多核苷酸之间相似的序列(即，完整多核苷酸序列的仅一部分)，和(2)在两个多核苷酸之间不同的序列，所以两个(或更多个)多核苷酸之间的序列比较通常通过在“比较窗口”中比较两个多核苷酸的序列来鉴定和比较序列相似性的局部区域来进行。“比较窗口”是指至少6个(通常约50至约100，更通常约100至约150个)连续位置的概念片段，其中在两个序列最佳对齐后，将序列与相同数量的连续位置的参考序列进行比较。与参考序列(其不包括添加或缺失)相比，比较窗口可包含约20％或更少的添加或缺失(即，空位)，以用于两个序列的最佳对齐。用于比对比较窗口的序列的最佳对齐可以通过算法的计算机化实施(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，其在以下中：Wisconsin GeneticsSoftware Package Release 7.0,Genetics Computer Group,575Science DriveMadison,WI,USA)或通过检查和由所选的各种方法中的任何一种产生的最佳比对(即，在比较窗口中产生最高百分比的同源性)来进行。还可以参考例如Altschul等人,1997,Nucl.Acids Res.25:3389所公开的BLAST系列程序。序列分析的详细讨论可见于Unit19.3of Ausubel等人,“Current Protocols in Molecular Biology”,John Wiley&SonsInc,1994-1998,第15章。
术语“统计学显著”或“显著”是指统计学显著性并且通常是指低于正常或更低的标志物浓度的两个标准偏差(2SD)。该术语是指存在差异的统计证据。它被定义为当零假设确实为真时做出拒绝零假设的决定的概率。通常使用p值做出决定。
术语“TDP-43蛋白病”在本文中用于描述与TDP-43沉积相关的神经退行性疾病，包括但不限于肌萎缩侧索硬化症(ALS)、嗜银颗粒病、额颞叶痴呆(例如FTD-TDP-43和FTD-tau)、关岛型ALS-帕金森症-症呆复合症、皮质基底节变性(corticobasal degeneration)、路易体痴呆、亨廷顿病(HD)、路易体病、运动神经元病、额颞叶变性(FTLD)、额颞叶痴呆、具有泛素阳性包涵体的额颞叶变性、海马硬化、包涵体肌病、包涵体肌炎、帕金森病(PD)、帕金森病痴呆、纪伊半岛帕金森症痴呆复合症(Parkinson-dementia complex in Kiipeninsula)、皮克病(Pick's disease)、马查多-约瑟夫病(Machado-Joseph disease)等。Gendron等人,2010,Neuropathol.Appl.Neurobiol.36:97-112和Lagier-Tourenne等人,2010,Hum.Mol.Gen.19(1):R46-R64中描述了TDP-43蛋白病的更多细节；其公开内容通过引用并入本文。在具体实施方案中，TDP-43蛋白病与TDP-43在神经元中的沉积相关，其在本文中称为“神经元TDP-43蛋白病”。
如本文所用，术语“治疗(“treatment”)”、“治疗(treating)”等是指获得期望的药理学和/或生理学效果。就完全或部分预防疾病或其症状而言，该效果可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈病症和/或可归因于该病症的副作用而言，该效果可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖哺乳动物，特别是人类的疾病的任何治疗，并且包括：(a)抑制可能易感于该疾病但尚未被诊断为患有该疾病的受试者中病症的发展；(b)抑制疾病，即阻止其发展；(c)缓解疾病，即导致疾病的消退。因此，“神经退行性疾病的治疗”在其范围内包括延迟或防止这种疾病的发作(例如运动神经元的死亡)，逆转、减轻、改善、抑制、减慢或停止这种疾病的进展或严重程度的进展、加剧或恶化。在一个实施方案中，神经退行性疾病的症状减轻至少20％、至少30％、至少40％或至少50％。在一个实施方案中，神经退行性疾病的症状减轻超过50％。在一个实施方案中，神经退行性疾病的症状减轻80％、90％或更多。治疗还包括改善神经肌肉功能。在一些实施方案中，神经肌肉功能改善至少约10％、20％、30％、40％、50％或更多。
如本文所用，术语“转基因”是指用于转化植物、动物或其它生物体的任何核苷酸序列。因此，转基因可以是编码序列、非编码序列、cDNA、基因或其片段或部分、基因组序列、调控元件等。“转基因”生物体，例如转基因植物、转基因微生物或转基因动物，是已经将转基因递送或引入其中的生物体并且转基因可以在转基因生物体中表达以产生产物，该产物的存在可以在生物体中赋予效果和/或表型。
“载体”是指来源于例如质粒、噬菌体、酵母或病毒的多核苷酸分子，合适地为DNA分子，多核苷酸可以插入或克隆到其中。载体可以包含一个或多个独特的限制性位点，并且可能能够在包括靶细胞或组织或其祖细胞或组织在内的限定宿主细胞中自主复制，或与限定宿主的基因组整合，使得克隆的序列是可重现的。因此，载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如线性或闭合环状质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可以包含任何确保自主复制的手段。替代地，载体可以是这样的载体，当被引入宿主细胞中时，它被整合到基因组中并与它所整合的染色体一起复制。载体系统可以包含单个载体或质粒、两个或更多个载体或质粒，它们一起包含待引入宿主细胞基因组的总DNA，或转座子。载体的选择通常取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。在实例中，载体优选是病毒或病毒来源的载体，其在动物和优选哺乳动物细胞中具有可操纵的功能。可用于本公开的实践的非限制性病毒载体包括腺相关病毒载体(AAV)、慢病毒载体、腺病毒载体和单纯疱疹病毒载体。载体还可以包括选择标记，例如可用于选择合适转化体的抗生素抗性基因。这样的抗性基因的实例是本领域技术人员已知的并且包括赋予对抗生素卡那霉素和G418
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的抗性的nptII基因和赋予对抗生素潮霉素B的抗性的hph基因。
术语“野生型”、“天然的”和“天然存在的”在本文中可互换使用，是指当具有从天然存在的来源分离时该基因或基因产物的特征的基因或基因产物。野生型、天然或天然存在的基因或基因产物(例如，多肽)是在群体中最常观察到的，因此被任意指定为基因或基因产物的“正常”或“野生型”形式。
如本文所用，基因名称的下划线或斜体应指示基因，与其蛋白质产物相反，后者由基因名称在没有任何下划线或斜体的情况下指示。例如，“细胞周期蛋白F”应指细胞周期蛋白F基因，而“细胞周期蛋白F”应表示由“细胞周期蛋白F”基因的转录和翻译和/或可变剪接产生的一种或多种蛋白质产物。
除非另有明确说明，否则本文所述的每个实施方案加上必要的变通都适用于各个和每个实施方案。
2.缩写
以下缩写在整个申请中使用：
MND＝运动神经元病
ALS＝肌萎缩侧索硬化症
FTD＝额颞叶痴呆
AD＝阿尔茨海默病
HD＝亨廷顿病
PD＝帕金森病
3.用于调节运动神经元活力的药物和方法
本公开首次证明细胞周期蛋白F定位于包括运动神经在内的神经元的细胞质，并选择性地靶向定位于细胞质的病理性insTDP-43以进行蛋白水解降解，而不会显著干扰核定位的sTDP-43的细胞周期调节功能。这一发现意义重大，因为它将细胞周期蛋白F增强剂的效用扩展到与神经元TDP-43蛋白病相关的神经退行性疾病，以前认为与神经元TDP-43蛋白病相关的神经退行性疾病对利用这种细胞周期蛋白F增强剂的治疗不敏感，包括与神经元细胞周期蛋白F缺陷无关的散发性神经退行性疾病，例如散发性ALS、FTD和AD。与这些发现一致，本公开提供了用于增强神经元存活、抑制神经元变性、抑制神经元中的异常蛋白质积累和/或治疗神经退行性疾病(例如，ALS、FTD、AD等)，合适地与神经元TDP-43蛋白病相关的那些的方法，这些方法包括使神经元与增加神经元中细胞周期蛋白F水平的细胞周期蛋白F增强剂接触，而无论神经元的内源性细胞周期蛋白F的水平或活性如何，包括其中神经元不具有相对于对照降低的内源性细胞周期蛋白F水平或活性的实施方案。
3.1细胞周期蛋白F增强剂
本公开考虑了增强或增加神经元(例如，运动神经元)中细胞周期蛋白F的水平或活性从而促进神经元存活、抑制神经元变性和抑制神经元中异常蛋白质积累的任何药物。在一些实施方案中，增强细胞周期蛋白F的水平或活性的药物将神经元中细胞周期蛋白F的水平或活性相对于对照增加至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％或至少1、2、3、5、10、20、50或100倍或更多。
3.2核酸构建体
在具体实施方案中，药物是核酸构建体，核酸构建体包含编码细胞周期蛋白F多肽并且可操纵地连接至启动子的CCNF多核苷酸。可以使用任何CCNF多核苷酸，并且合适地包含对应于野生型CCNF编码序列的核苷酸序列，其说明性实例在SEQ ID NO:1、2、4和5中示出或与其对应的序列(例如，在严格条件下与SEQ ID NO:1、2、4或5所示序列中的任一个杂交的序列)。在某些实施方案中，编码序列编码如SEQ ID NO：3、6或7所示的氨基酸序列，或与其对应的序列。
本公开还涵盖CCNF等位基因变体(相同基因座)、同源物(不同基因座)和直系同源物(不同生物体)以及非天然存在的CCNF多核苷酸。CCNF多核苷酸可以包含相对于野生型CCNF多核苷酸序列的核苷酸替换、缺失、倒位和插入。变异可以发生在编码区和非编码区之一或两者中。变异可以产生保守和非保守氨基酸替换(与编码产物相比)。对于核苷酸序列，保守变体包括由于遗传密码的简并性而编码与参考细胞周期蛋白F多肽序列相同的氨基酸序列的那些序列。CCNF核苷酸序列还包括合成来源的核苷酸序列，例如使用定点诱变产生但仍编码细胞周期蛋白F多肽的那些。通常，CCNF核苷酸序列与特定核苷酸序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，如通过例如本文所述的序列对齐程序使用默认参数确定的。在一些实施方案中，CCNF核苷酸序列与选自SEQ ID NO:1、2、4或5的核苷酸序列或其互补序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。
本公开内容还考虑了在下文描述的严格条件下与参考CCNF核苷酸序列或其互补序列(例如，SEQ ID NO:1、2、4或5，或其互补序列)杂交的多核苷酸。如本文所用，术语“在中等严格、高严格或非常高严格条件下杂交”描述了用于杂交和洗涤的条件。进行杂交反应的指导可以在Ausubel等人,(1998,同上),第6.3.1-6.3.6节中找到。该参考文献中描述了水性和非水性方法，并且可以使用任何一种。本文提及的中等严格条件包括并涵盖至少约16％v/v至至少约30％v/v甲酰胺和至少约0.5M至至少约0.9M盐，用于在42℃杂交，并且至少约0.1M至至少约0.2M盐，用于在55℃洗涤。中等严格条件还可包括1％牛血清白蛋白(BSA)、1mM EDTA、0.5M NaHPO4(pH 7.2)、7％SDS用于在65℃杂交，以及(i)2×SSC、0.1％SDS；或(ii)0.5％BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO4(pH 7.2)、5％SDS用于在60-65℃洗涤。中等严格条件的一个实施方案包括在约45℃的6×SSC中杂交，然后在60℃的0.2×SSC、0.1％SDS中进行一次或多次洗涤。高严格条件包括并涵盖至少约31％v/v至至少约50％v/v甲酰胺和约0.01M至约0.15M盐用于在42℃杂交，并且约0.01M至约0.02M盐用于在55℃洗涤。高严格条件还可包括1％BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO4(pH 7.2)、7％SDS用于在65℃杂交，以及(i)0.2×SSC、0.1％SDS；或(ii)0.5％BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO4(pH 7.2)、1％SDS用于在超过65℃的温度洗涤。高严格条件的一个实施方案包括在约45℃的6×SSC中杂交，然后在65℃的0.2×SSC、0.1％SDS中进行一次或多次洗涤。
在某些实施方案中，细胞周期蛋白F多肽由在非常高严格条件下与公开的核苷酸序列杂交的多核苷酸编码。非常高严格条件的一个实施方案包括在65℃的0.5M磷酸钠、7％SDS中杂交，然后在65℃的0.2×SSC、1％SDS中进行一次或多次洗涤。
其它严格条件在本领域中是众所周知的，并且技术人员将认识到可以操纵各种因素以优化杂交的特异性。优化最终洗涤的严格性可用于确保高度杂交。有关详细实例，参见Ausubel等人，(1998，同上)第2.10.1至2.10.16页以及Sambrook等人，(1989，同上)第1.101至1.104节。
虽然严格洗涤通常在约42℃至68℃的温度进行，但本领域技术人员将理解其它温度可能适用于严格条件。最大杂交率通常发生在低于Tm约20℃至25℃，以形成DNA-DNA杂交体。本领域众所周知，Tm是解链温度，或两个互补多核苷酸序列解离的温度。用于估计Tm的方法在本领域中是众所周知的(参见Ausubel等人，(1994，同上)，第2.10.8页)。通常，完美匹配的DNA双链体的Tm可以通过以下公式近似预测：
Tm＝81.5+16.6(log10 M)+0.41(％G+C)-0.63(％甲酰胺)–(600/长度)
其中：M是Na+的浓度，优选在0.01摩尔至0.4摩尔的范围内；％G+C是鸟嘌呤和胞嘧啶碱基之和占碱基总数的百分比，在30％至75％G+C的范围内；％甲酰胺是按体积计的甲酰胺浓度百分比；长度是DNA双链体中碱基对的数量。随机错配的碱基对数量每增加1％，双连体DNA的Tm就会降低约1℃。洗涤对于高严格来说通常在Tm–15℃进行，或对于中等严格来说在Tm–30℃进行。
在杂交程序的一个实例中，使包含固定化DNA的膜(例如，硝酸纤维素膜或尼龙膜)在杂交缓冲液(50％去离子甲酰胺，5×SSC，5×Denhardt溶液(0.1％聚蔗糖、0.1％聚乙烯吡咯烷酮和0.1％牛血清白蛋白)、0.1％SDS和200mg/mL含标记探针的变性鲑鱼精子DNA)中在42℃杂交过夜。然后对膜进行两次连续的中等严格洗涤(即，2×SSC、0.1％SDS中在45℃15分钟，然后在2×SSC、0.1％SDS中在50℃15分钟)，然后是两次顺序的更高严格性洗涤(即，在0.2×SSC、0.1％SDS中在55℃12分钟，然后在0.2×SSC和0.1％SDS溶液中在65-68℃12分钟)。
3.3递送载具
本公开还考虑了用于将CCNF核酸构建体递送至神经元(例如，运动神经元)的递送载具，包括病毒载体和非病毒载体。
3.3.1病毒载体
用于实施本文公开的方法的合适病毒载体包括但不限于腺相关病毒载体(AAV)、慢病毒载体、腺病毒载体和单纯疱疹病毒载体，并且在具体实施方案中是嗜神经病毒载体。
腺相关病毒
可以通过使用腺相关病毒载体(AAV载体)将CCNF核酸构建体递送至中枢神经系统的细胞，包括神经元(例如，运动神经元)。使用AAV载体将基因递送至脑中是本领域众所周知的(参见例如美国专利号8,198,257和7,534,613，美国专利申请序列号13/881,956，其每一个都通过引用并入)。
用于将CCNF多核苷酸递送至运动神经元的AAV载体是本领域已知的(参见美国专利号7,335,636，通过引用并入)。可以使用已知技术构建AAV载体，以至少提供控制元件的可操纵连接的组件，包括转录起始区(例如，启动子)、转录终止区和任选的至少一个转录后调节序列。控制元件被选择为在靶细胞中起作用。包含可操纵连接的组件的所得构建体通常在5'和3'区的侧翼是功能性AAV反向末端重复序列(ITR)。
AAV ITR区的核苷酸序列是已知的。AAV-2的ITR序列描述在例如Kotin等人HumanGene Therapy,5:793-01(1994)；Fields&Knipe,Fundamental Virology,“Parvoviridaeand their Replication”(1986年第2版)中。熟练的技术人员将理解，可以使用标准分子生物学技术来修饰AAV ITR(例如，Green&Sambrook,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,(2012年第4版))。因此，在本公开的载体中使用的AAV ITR不需要具有野生型核苷酸序列，并且可以被改变，例如，通过核苷酸的插入、缺失或替换。此外，AAV ITR可以来源于多种AAV血清型中的任一种，包括但不限于AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9等。此外，位于AAV表达载体中选定核苷酸序列侧翼的5'和3'ITR不必相同或源自相同的AAV血清型或分离株，只要ITR的功能符合预期，即允许当AAV rep基因产物存在于细胞中时，用于切除和复制感兴趣的界定的核苷酸序列即可。
本领域技术人员可以理解，调控序列通常可以由来源于病毒例如多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40的常用启动子提供。使用病毒调控元件来指导蛋白质的表达可以允许蛋白质在多种宿主细胞中的高水平组成型表达。还可以使用普遍表达启动子，包括，例如，早期巨细胞病毒启动子(Boshart等人,Cell,41:521-30(1985))、疱疹病毒胸苷激酶启动子(McKnight等人Cell,37:253-62(1984))、β-肌动蛋白启动子(例如，人β-肌动蛋白启动子，Ng等人,Molecular Cell Biology,5:2720-32(1985))和集落刺激因子-1启动子(Ladner等人,EMBO J.,6:2693-98(1987))。
可选地，AAV载体的调控序列可以指导基因优先在特定细胞类型中的表达，即可以使用组织特异性调控元件。可以使用的组织特异性启动子的非限制性实例包括中枢神经系统(CNS)特异性启动子，例如神经元特异性启动子(例如，神经丝启动子；Byrne和Ruddle,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:5473-77(1989)和神经胶质特异性启动子(Morii等人,Biochemical&Biophysical Research Communications,175:185-91(1991))。在具体的实施方案中，启动子是组织特异性的并且在中枢神经系统之外基本上没有活性，或者启动子在中枢神经系统中的活性高于在其它系统中的活性。例如，可以选择对脊髓、脑干(髓质、脑桥和中脑)、小脑、间脑(丘脑、下丘脑)、端脑(纹状体、大脑皮层或在皮层、枕骨、颞叶、顶叶或额叶)或其组合具有特异性的启动子。启动子可能对特定的细胞类型是特异性的，例如CNS中的神经元或神经胶质细胞。如果启动子在神经胶质细胞中具有活性，则启动子可能对星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞、雪旺细胞或小胶质细胞是特异性的。如果启动子在神经元中具有活性，则启动子可能对特定类型的神经元是特异性的，例如运动神经元、感觉神经元或中间神经元。此外，启动子可能对具有特定表型的神经元具有特异性，例如产生多巴胺的神经元、产生血清素的神经元等。在某些实施方案中，启动子对脑特定区域的细胞具有特异性，例如，皮质、纹状体、黑质和海马。
合适的神经元特异性启动子包括但不限于神经元特异性烯醇化酶(NSE)(Olivia等人,Genomics,10:157-65(1991).GenBank登录号:X51956)，以及人神经丝轻链启动子(NEFL)(Rogaev等人,Human Molecular Genetics,1:781(1992),GenBank登录号:L04147)。神经胶质特异性启动子包括但不限于神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子(Morii等人,Biochemical&Biophysical Research Communications,175:185-91(1991),GenBank登录号:M65210)、S100启动子(Morii等人，Biochemistry&Biophysical ResearchCommunications,175:185-91(1991)，GenBank登录号：M65210)和谷氨酰胺合酶启动子(Vanden等人，Biochimica Biophysica Acta,2:249-51(1991)，GenBank登录号：X59834)。在一个优选的实施方案中，基因上游(即，5')侧翼是神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子。在另一个优选的实施方案中，目的基因上游(即，5')侧翼是延伸因子1α(EF)启动子。合适的表型特异性启动子包括但不限于酪氨酸羟化酶启动子、多巴胺β-羟化酶、乙酰胆碱酯酶启动子、胆碱乙酰转移酶启动子、多巴胺受体I和II启动子、多巴胺转运蛋白启动子、囊泡单胺转运蛋白启动子、神经视蛋白启动子和囊泡乙酰胆碱转运蛋白启动子。
含有侧翼为AAV ITR的来自可表达的CCNF多核苷酸核酸构建体和转录后调控序列(PRE)的AAV载体可以通过将目的核苷酸序列和PRE直接插入已切除了主要AAV开放阅读框(“ORF”)的AAV基因组中来构建。也可以缺失AAV基因组的其它部分，只要保留足够的ITR部分以允许复制和包装功能即可。这些构建体可以使用本领域众所周知的技术来设计。(参见，例如，Lebkowski等人,Molecular&Cellular Biology,8:3988-96(1988)；Vincent等人,Vaccines 90(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1990)；Carter,Current OpinionBiotechnology,3:533-39(1992)；Muzyczka,Current Topics Microbiology&Immunology,158:97-29(1992)；Kotin,Human Gene Therapy,5:793-01(1994)；Shelling等人,GeneTherapy,1:165-69(1994)；和Zhou等人,J Experimental Medicine,179:1867-75(1994))。可选地，可以从病毒基因组或从包含它们的AAV载体中切除AAV ITR并使用标准连接技术融合在存在于另一载体中的所选核酸构建体的5'和3'，例如Green&Sambrook(Green&Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,(4th ed.,2012))中描述的那些。多种AAV载体可从美国典型培养物保藏中心(“ATCC”)以登录号53222、53223、53224、53225和53226获得。
为了产生重组AAV颗粒，可以使用已知技术例如通过转染将AAV载体引入合适的宿主细胞。许多转染技术在本领域中通常是已知的(参见，例如，Graham等人,Virology,52:456(1973)；Green&Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,(4th ed.,2012)；Davis等人,Basic Methods Molecular Biology,(Elsevier,1986)；和Chu等人,Gene,13:197(1981))。特别合适的转染方法包括磷酸钙共沉淀(Graham等人,Virology,52:456-67(1973))、直接显微注射到培养的细胞中(Capecchi,Cell,22:479-88(1980))、电穿孔(Shigekawa等人,BioTechniques,6:742-51(1988))、脂质体介导的基因转移(Mannino等人,BioTechniques,6:682-90(1988))、脂质介导的基因转移(Feigner等人,ProceedingsNat'l Acad.Sci.USA,84:7413-17(1987))，以及使用高速微粒的核酸递送(Klein等人,Nature 327:70-73(1987))。
用于产生重组AAV颗粒的合适宿主细胞包括但不限于可以用作或已经用作外源核酸分子的接受者的微生物、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。因此，如本文所用的“宿主细胞”通常是指已经用外源核酸分子转染的细胞。宿主细胞包括任何真核细胞或细胞系，只要该细胞或细胞系与待表达的蛋白质、选择的选择系统或使用的发酵系统相容即可。非限制性实例包括CHO DHFR-负细胞(Urlaub and Chasin Proceedings Nat'l Acad.Sci.USA,77:4216-420(1980))、293细胞(Graham等人,J.General Virology 36:59-72(1977))，或骨髓瘤细胞如SP2或NSO(Galfre&Milstein,Methods Enzymology,73:3-46(1981))。
在一些实施方案中，宿主细胞是来自稳定的人细胞系293(通过例如ATCC以登录号ATCC CRL 1573容易获得)的细胞，它是已用5型腺病毒DNA片段转化的人胚胎肾细胞系(Graham等人,J.General Virology,36:59-72(1977))，并表达腺病毒E1a和E1b基因(Aiello等人,Virology,94:460-69(1979))。293细胞系容易转染，并提供了产生AAV病毒颗粒的特别方便的平台。
必须使包含上述AAV载体的宿主细胞能够提供AAV辅助功能，以便复制和包裹侧翼是AAV ITR的表达盒以产生重组AAV颗粒。AAV辅助功能通常是AAV来源的编码序列，可以表达这些序列以提供AAV基因产物，这些基因产物进而反式发挥作用以进行生产性AAV复制。AAV辅助功能在此用于补充AAV载体中缺少的必要AAV功能。因此。AAV辅助功能包括主要AAV开放阅读框(ORF)中的一个或两个，即rep和cap编码区，或其功能同源物。
AAV基因组的AAV rep编码区编码复制蛋白Rep 78、Rep 68、Rep 52和Rep 40。这些Rep表达产物已显示具有许多功能，包括AAV的DNA复制的起点的识别、结合和切割、DNA解旋酶活性和来自AAV(或其它外源)启动子的转录的调节。Rep表达产物共同地是复制AAV基因组所必需的。AAV基因组的AAV cap编码区编码衣壳蛋白VP1、VP2和VP3，或其功能同源物。通过在包含表达盒的AAV载体的转染之前或同时用AAV辅助构建体转染宿主细胞，可以将AAV辅助功能引入宿主细胞，因此AAV辅助构建体用于提供至少瞬时的AAV rep和/或cap基因的表达，以补充生产性AAV感染所必需的缺失的AAV功能。AAV辅助构建体缺乏AAV ITR，既不能复制也不能自我包装。这些构建体可以是质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒或病毒颗粒的形式。已经描述了许多AAV辅助构建体，例如编码Rep和Cap表达产物二者的常用质粒pAAV/Ad和plM29+45(参见，例如，Samulski等人,J.Virology,63:3822-28(1989)；McCarty等人,J.Virology,65:2936-45(1991))。已经描述了许多编码Rep和/或Cap表达产物的其它载体(参见例如美国专利号5,139,941，通过引用并入)。
作为用辅助病毒感染宿主细胞的结果，产生了AAV Rep和/或Cap蛋白。Rep蛋白还用于复制AAV基因组。表达的Cap蛋白组装成衣壳，AAV基因组被包装到衣壳中。这导致AAV被包装到包含表达盒的重组AAV颗粒中。在重组AAV复制后，可以使用各种常规纯化方法(例如CsCl梯度)从宿主细胞中纯化重组AAV颗粒。所得重组AAV颗粒随后可用于将基因递送至各种细胞类型。
在一些实施方案中，施用于受试者的病毒载体和/或病毒颗粒的数量可以在103至1015个颗粒/mL的数量级，或者它们之间的任何值，例如约107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014或1015个颗粒/mL。在一些实施方案中，施用高于1013个颗粒/mL的载体和/或病毒颗粒。可以施用1μL至10mL的体积，以便受试者接收102至1016个总载体和/或病毒颗粒。因此，在一些实施方案中，施用约102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1014或1016个载体和/或病毒颗粒。
在本公开的方法的实践中，可以使用任何血清型的AAV。在本发明的某些实施方案中使用的病毒载体的血清型选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7和AAV8(参见，例如，Gao等人,2002,PNAS 99:11854-11859；和Viral Vectors for Gene Therapy:Methodsand Protocols,ed.Machida,Humana Press,2003)。可以使用除本文所列之外的其它血清型。此外，假型AAV载体也可用于本文所述的方法中。假型AAV载体是在第二种AAV血清型的衣壳中包含一种AAV血清型基因组的载体；例如，包含AAV2衣壳和AAV1基因组的AAV载体或包含AAV5衣壳和AAV2基因组的AAV载体(Auricchio等人,2001.Hum.Mol.Genet.10(26):3075-81)。AAV载体来源于对哺乳动物无致病性的单链(ss)DNA 细小病毒(综述于Muzyscka,1992.Curr.Top.Microb.Immunol.158:97-129)。简而言之，基于重组AAV的载体具有占去除的病毒基因组的96％的rep和cap病毒基因，留下两个侧翼145碱基对(bp)反向末端重复(ITR)，其用于启动病毒DNA复制、包装和整合。在没有辅助病毒的情况下，野生型AAV在染色体19q 13.3处以优先位点特异性整合到人宿主细胞基因组中，或者它可能以附加体形式存在。单个AAV颗粒可容纳最高达5kb的ssDNA，因此留下约4.5kb用于转基因和调控元件，这通常就足够了。然而，例如在美国专利号6,544,785中描述的反式剪接系统，可能几乎是这个限制的两倍。
在某些情况下，AAV血清型选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、rh.10、rh.39、rh.43和CSp3。
靶向CNS细胞的基于AAV的基因治疗载体已在例如美国专利号6,180,613和6,503,888中进行了描述。其它示例性AAV载体是编码人蛋白质的重组AAV2/1、AAV2/2、AAV2/5、AAV2/7、AAV2/8和AAV2/9血清型载体。在具体实施方案中，AAV是选自rAAV2/1、rAAV2/8和rAAV2/9的嗜神经性AAV，例如在Ayers等人(2015,Mol Ther.23(1):53–62)中描述的。
可选地，本公开的载体可以是除腺相关病毒之外的病毒或其部分，其允许表达引入病毒核酸中的CCNF核酸分子。例如，可以使用复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒和慢病毒。用于产生重组逆转录病毒和用这样的病毒感染体外或体内细胞的方案可在Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology§§9.10-9.14(GreenePublishing Associates,1989)和其它标准实验室手册中找到。合适的逆转录病毒的实例包括本领域技术人员熟知的pLJ、pZIP、pWE和pEM。合适的包装病毒系的实例包括Crip、Cre,2和Am。可以操纵腺病毒的基因组，使其编码和表达目的蛋白质，但就其在正常溶菌病毒生命周期中复制的能力而言是失活的(参见例如，Berkner等人,BioTechniques,6:616-29(1988)；Rosenfeld等人,Science,252:431-34(1991)；Rosenfeld等人,Cell 68:143-55(1992))。来源于腺病毒Ad 5型d1324株或其它腺病毒株(例如Ad2、Ad3、Ad7等)的合适的腺病毒载体是本领域技术人员熟知的。
慢病毒
慢病毒载体可用于在神经系统的细胞(包括神经元(例如，运动神经元))中表达CCNF多核苷酸，并且合适的慢病毒载体的产生是本领域众所周知的(参见，例如，美国专利申请序列号13/893,920，通过引用并入)。根据本公开的慢病毒载体可以源自或可源自任何合适的慢病毒。重组慢病毒颗粒能够用目的核苷酸转导靶细胞。一旦位于RNA基因组来自的细胞内，载体颗粒就会被逆转录成DNA并整合到靶细胞的基因组中。
慢病毒载体是更大的逆转录病毒载体组的一部分。慢病毒的详细列表可在Coffin等人,Retroviruses 758-763(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1997)中找到。简而言之，慢病毒可分为灵长类和非灵长类组。灵长类慢病毒的实例包括但不限于人类免疫缺陷病毒(HIV)和猿免疫缺陷病毒(SrV)。非灵长类慢病毒组包括原型“慢病毒”维斯那-梅迪(visnaimaedi)病毒(VMV)，以及相关的山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒病毒(BIV)。
慢病毒与逆转录病毒家族的其它成员的不同之处在于慢病毒具有感染分裂和非分裂细胞二者的能力(Lewis等人,EMBO J.,11:3053-58(1992))；Lewis&Emerman,JVirology,68:510-16(1994))。相比之下，其它逆转录病毒，例如MLV，不能感染非分裂或缓慢分裂的细胞，例如构成肌肉、脑、肺和肝组织的细胞。
如本文所用，慢病毒载体是包含至少一个源自慢病毒的组成部分的载体。该组成部分可能涉及载体感染细胞、表达基因或复制的生物学机制。逆转录病毒和慢病毒基因组的基本结构具有许多共同特征，例如5'LTR和3'LTR，在它们之间或之内定位有使基因组能够被包装的包装信号、引物结合位点、能够整合到宿主细胞基因组中的整合位点以及编码包装组分的gag、pol和env基因，包装组分是病毒颗粒组装所需的多肽。慢病毒具有额外的特征，例如rev和rev响应元件(RRE)序列，它们能够将整合的原病毒的RNA转录物从受感染靶细胞的细胞核有效地输出到细胞质中。在原病毒中，病毒基因两端的侧翼是被称为长末端重复(LTR)的区域。LTR负责原病毒整合和转录。LTR也充当增强子-启动子序列并且可以控制病毒基因的表达。LTR本身是相同的序列，可以分为三个元件，分别称为“U3”、“R”和“U5”。U3来源于RNA3'末端独特的序列，R来源于RNA两端重复的序列，U5来源于RNA5'末端独特的序列。这三个元件的大小在不同病毒之间可能会有很大差异。
在有缺陷的慢病毒载体基因组中，gag、pol和env可能不存在或没有功能。RNA两端的R区是重复序列。U5和U3分别代表RNA基因组5'和3'末端的独特序列。
在本公开的典型慢病毒载体中，复制所必需的一个或多个蛋白质编码区的至少一部分可以从病毒中去除，这使得病毒载体复制缺陷。病毒基因组的一部分也可以被核酸替代以产生包含能够转导靶非分裂宿主细胞和/或将其基因组整合到宿主基因组中的核酸的载体。在一个实施方案中，慢病毒载体是美国专利申请序列号12/138,993(通过引用并入本文)中所述的非整合载体。
在另一个实施方案中，载体具有递送不含或缺乏病毒RNA的序列的能力。异源结合结构域(与gag异源)可以位于待递送的RNA上，并且可以使用gag或pol上的同源结合结构域来确保待递送的RNA的包装。这两种载体都在美国专利申请序列号12/139,035(通过引用并入本文)中进行了描述。慢病毒载体可以是“非灵长类动物”载体，即源自不主要感染灵长类动物(尤其是人类)的病毒。
非灵长类慢病毒的实例可以是不会自然感染灵长类动物的慢病毒科的任何成员，并且可以包括猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)、Maedi-visna病毒(MW)或马传染性贫血病毒(EIAV)。
在一些实施方案中，病毒载体来源于EIAV。EIAV具有最简单的慢病毒基因组结构。除了gag、pol和env基因外，EIAV还编码其它三个基因：tat、rev和S2。Tat充当病毒LTR的转录激活物(Derse&Newbold,Virology,194:530-36(1993)；Maury等人,Virology,200:632-42(1994))。Rev通过rev-响应元件(RRE)调节和协调病毒基因的表达(Martarano等人,J.Virology,68:3102-11(1994))。这两种蛋白质的作用机制被认为与灵长类病毒中的类似机制大体相似(Martarano等人,J.Virology,68:3102-11(1994))。S2的功能未知。此外，已鉴定出一种EIAV蛋白Ttm，它由在跨膜蛋白起始处剪接至env编码序列的tat的第一个外显子编码。
可以操纵病毒载体以去除非必需元件并保留必需元件，以便提供感染、转导和递送目的核苷酸序列至靶宿主细胞所需的功能(参见，例如，美国专利号6,669,936，通过引用并入)。在一些实施方案中，基因组限于足够的慢病毒遗传信息以允许在存在包装组分的情况下将RNA基因组包装成能够感染靶细胞的病毒颗粒。靶细胞的感染可以包括逆转录和整合到靶细胞基因组中。慢病毒载体携带将由载体递送至靶细胞的非病毒编码序列。在一些实施方案中，载体不能在最终靶细胞内独立复制以产生感染性慢病毒颗粒。通常重组慢病毒载体缺乏功能性gag-pol和/或env基因和/或复制所必需的其它基因。本公开的载体可以被配置为分裂内含子载体(参见，例如，美国专利号7,303,910，通过引用并入)。
载体可以是自失活载体。可以通过缺失3'LTR的U3区中的转录增强子或增强子和启动子来构建自失活逆转录病毒载体。在一轮载体逆转录和整合之后，这些变化被复制到5'和3'LTR二者中，产生转录失活的原病毒(Yu等人,Proceedings Nat'l Acad.Sci.USA,83:3194-98(1986)；Dougherty和Temin等人,Proceedings Nat'l Acad.Sci.USA,84:1197-01(1987):Hawley,Proceedings Nat'l Acad.Sci.USA,84:2406-10(1987)；Yee等人,Proceedings Nat'l Acad.Sci.USA,91:9564-68(1994))。然而，此类载体中LTR内部的任何启动子仍将具有转录活性。该策略已被用于消除病毒LTR中的增强子和启动子对内部放置的基因的转录的影响。这样的作用包括增加转录(Jolly等人,Nucleic Acids Research,11:1855-72(1983))或转录抑制(Emerman&Temin,Cell,39:449-67(1984))。该策略还可用于消除从3'LTR到基因组DNA的下游转录(Herman&Coffin,Science,236:845-48(1987))。这在人类基因治疗中尤为重要，其中防止内源性癌基因的意外激活至关重要。
用于在宿主细胞/包装细胞内产生病毒基因组的质粒载体还将包括与慢病毒基因组可操纵地连接以指导基因组在宿主细胞/包装细胞中转录的转录调控序列。这些调控序列可以是与转录的慢病毒序列相关的天然序列，即5'U3区，或者它们可以是异源启动子，例如另一种病毒启动子，例如CMV启动子。一些慢病毒基因组需要额外的序列才能有效生产病毒。例如，在HIV的情况下，优选包括rev和RRE序列；然而，通过密码子优化可以减少或消除对rev和RRE的需求(参见美国专利申请序列号12/587,236，通过引用并入)。执行与rev/RRE系统相同的功能的替代序列也是已知的。例如，在梅森辉瑞猴病毒中发现了revIRRE系统的功能类似物。这被称为组成型转运元件(CTE)，并且包含基因组中的RRE型序列，该序列被认为与受感染细胞中的因子相互作用。细胞中的因子可以被认为是rev类似物。因此，CTE可以用作reviRRE系统的替代方案。已知或变得可用的任何其它功能等效物可能与本公开的方法相关。例如，HTLV-1的Rex蛋白可以在功能上替代HIV-1的Rev蛋白。众所周知，Rev和Rex与IRE-BP具有相似的效果。
在某些实施方案中，慢病毒载体是自失活的最小慢病毒载体，其来源于马传染性贫血病毒(EIAV)，CCNF多核苷酸可从中表达。该载体可以通过用三个质粒瞬时转染细胞(例如HEK293T细胞)来产生，这些质粒编码：(1)重组EIAV PROSAVIN(Oxford BioMedica pic,Oxford UK)载体基因组(Farley等人,J.Gen.Med.,9:345-56(2007)；美国专利号7,259,015，通过引用并入)；(2)合成的EIAV gag/pol表达载体(pESGPK，美国专利申请序列号13/893,920和12/587,236，通过引用并入)；和(3)VSV-G包膜表达载体(pHGK)。
单纯疱疹病毒
单纯疱疹病毒(HSV)载体也可用于在神经系统的细胞(包括神经元(例如，运动神经元))中表达CCNF多核苷酸。1型(HSV-1)的基因组是约150kb的线性双链DNA，包含约70个基因。许多病毒基因可以缺失，而病毒不会失去其繁殖能力。首先转录“立即早期”(IE)基因。它们编码调节其它病毒基因表达的反式作用因子。“早期”(E)基因产物参与病毒DNA的复制。晚期基因编码病毒颗粒的结构组分以及启动IE和E基因的转录或破坏宿主细胞蛋白质翻译的蛋白质。
HSV载体可以是基于质粒的系统，由此产生包含编码基因的核苷酸序列和两个顺式作用HSV识别信号的质粒载体(称为扩增子)。识别信号是DNA复制的起点和切割不编码HSV基因产物的包装信号。因此，需要辅助病毒来复制扩增子并将其包装到HSV外壳中。因此，该载体在受体细胞内不表达病毒基因产物，并且由于缺陷的HSV载体基因组内存在最少量的HSV DNA序列，该载体与潜伏病毒的重组或再激活受到限制。
HSV介导的基因治疗的实例是本领域众所周知的(Breakefield&DeLuca.NewBiologist,3:203-18(1991)；Ho&Mocarski,Virology,167:279-93(1988)；Palella,等人,Molecular&Cellular Biology,8:457-60(1988)；Palella等人,Gene,80:137-44(1988)；Andersen等人,Human Gene Therapy,3:487-99(1992)；Kaplitt等人,Current TopicsNeuroendocrinology,11:169-91(1993)；Spade&Frenkel,Cell,30:295-04(1982)；Kaplitt等人,Molecular&Cellular Neuroscience,2:320-30(1991)；Federoff等人,ProceedingsNat.Acad.Sci.USA,89:1636-40(1992))。
腺病毒
腺病毒载体可用于在神经系统细胞(包括神经元(例如，运动神经元))中表达CCNF多核苷酸。腺病毒基因组由约36kb的双链DNA组成。腺病毒靶向气道上皮细胞，但也能够感染神经元。重组腺病毒载体已被用作非分裂细胞的基因转移载具。这些载体与重组HSV载体相似，因为腺病毒E1a立即早基因被去除，但大多数病毒基因被保留。由于Ela基因很小(约1.5kb)并且腺病毒基因组是HSV基因组大小的约三分之一，因此去除了其它非必需的腺病毒基因以便在腺病毒基因组中插入外源基因。
腺病毒介导的基因治疗的实例是本领域众所周知的(Akli等人,NatureGenetics,3:224-28(1993)；La Salle等人,Science,259:988-90(1993),La Salle,NatureGenetics,3:1-2(1993)；Neve,Trends Biochemical Sci.,16:251-53(1993))。
3.3.2非病毒载体
可以使用非病毒递送系统递送细胞周期蛋白F，例如，作为裸核酸与递送试剂组合。本领域已知的任何核酸递送方法均可用于本文所述的方法中。这包括在胶体分散系统中将核酸递送至期望组织，胶体分散系统包括例如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒和包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体的基于脂质的体系。合适的递送试剂包括但不限于例如Mirus Transit TKO亲脂性试剂；lipofectin；lipofectamine；cellfectin；聚阳离子(例如聚赖氨酸)、去端肽胶原、纳米复合物(nanoplexes)和脂质体。去端肽胶原作为核酸分子的递送载具的使用描述在Minakuchi等人Nucleic Acids Research,32:e109(2004)；Hanai等人Annals N.Y.Acad.Sci.,1082:9-17(2006)；Kawata等人Molecular CancerTherapeutics,7:2904-12(2008)中。
脂质体是可用作体外和体内递送载具的人造膜囊泡。为了使脂质体成为有效的基因转移载具，应具有以下特征：(1)高效封装遗传物质，同时不损害生物活性；(2)与非靶细胞相比，与靶细胞的优先和实质性结合；(3)将囊泡的水性内容物高效递送至靶细胞胞质；和(4)遗传信息的准确和有效表达(Mannino等人,BioTechniques,6:682-90(1988))。
适用于本文所述方法的脂质体可以由标准的囊泡形成脂质形成，所述脂质通常包括中性或带负电荷的磷脂和甾醇，例如胆固醇。脂质的选择通常通过考虑诸如期望的脂质体尺寸和脂质体在血流中的半衰期等因素来指导。合适的脂质脂质体生产的实例包括磷脂酰化合物，例如磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂、脑苷脂和神经节苷脂。脂质的其它实例包括但不限于聚赖氨酸、鱼精蛋白、硫酸盐和3.β-[N--(N',N'-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇。已知有多种制备脂质体的方法，例如，以下中描述的：Szoka等人,Annual Rev.Biophysics&Bioengineering,9:467-08(1980)；以及美国专利号4,235,871；4,501,728；4,837,028；和5,019,369，其通过引用并入本文。
脂质体由分散在水性介质中并自发形成多层同心双层囊泡(也称为多层囊泡(MLV))的磷脂形成。MLV通常具有25nm至4m的直径。MLV的超声处理导致形成直径在200至500埃范围内的小单层囊泡(SUV)，其核心包含水溶液。
还可以修饰用于本方法中使用的脂质体以避免被单核巨噬细胞系统(“MMS”)和网状内皮系统(“RES”)清除。此类修饰的脂质体在表面上具有调理作用抑制部分或并入脂质体结构中。
用于制备本文所述脂质体的调理作用抑制部分通常是结合到脂质体膜的大的亲水聚合物。如本文所用，当调理作用抑制部分以化学或物理方式附着到膜(例如，通过将脂溶性锚嵌入膜本身，或通过直接与膜脂的活性基团结合)时，调理作用抑制部分“结合”到脂质体膜。这些调理作用抑制亲水聚合物形成保护性表面层，显著降低MMS和RES对脂质体的摄取；例如，如美国专利号4,920,016中描述的，通过引用并入本文。
在一些实施方案中，适合于修饰脂质体的调理作用抑制部分是数均分子量为约500至约40,000道尔顿或约2,000至约20,000道尔顿的水溶性聚合物。此类聚合物包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)衍生物；例如，甲氧基PEG或PPG，以及PEG或PPG硬脂酸酯；合成聚合物，例如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯烷酮；直链、支链或树枝状聚酰胺胺；聚丙烯酸；多元醇，例如与羧基基团或氨基基团化学连接的聚乙烯醇和聚木糖醇，以及神经节苷脂，例如神经节苷脂GM1。PEG、甲氧基PEG或甲氧基PPG或其衍生物的共聚物也是合适的。此外，调理作用抑制聚合物可以是PEG和聚氨基酸、多糖、聚酰胺胺、聚乙烯胺或多核苷酸的嵌段共聚物。调理作用抑制聚合物也可以是天然多糖，其包含氨基酸或羧酸，例如半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、甘露糖醛酸、透明质酸、果胶酸、神经氨酸、海藻酸、角叉菜胶；胺化多糖或寡糖(直链或支链)；或羧化多糖或寡糖，例如，与碳酸衍生物反应，产生与羧基基团连接。在一些实施方案中，调理作用抑制部分是PEG、PPG或其衍生物。用PEG或PEG衍生物修饰的脂质体有时称为“PEG化脂质体”。
4.细胞周期蛋白F增强剂的递送
神经元(例如，运动神经元)可以与在细胞培养物中(例如，在体外或离体)或施用于受试者(例如，在体内)的本文所述的细胞周期蛋白F-增强剂接触。在一些实施方案中，本文所述的细胞周期蛋白F-增强剂可以施用于受试者以治疗或抑制神经退行性疾病的发展，包括与神经元TDP-43蛋白病相关的那些，例如ALS、FTD和AD。
对于体外方法，神经元可以从不同来源获得。例如，神经元可以从受试者获得。在一些实施方案中，神经元是全细胞。在一些实施方案中，受试者患有神经退行性疾病(例如，与神经元TDP-43蛋白病相关的神经退行性疾病)。在一些实施方案中，受试者处于发展为神经退行性疾病(例如，与神经元TDP-43蛋白病相关的神经退行性疾病)的风险。在一些实施方案中，受试者被怀疑患有神经退行性疾病(例如，与神经元TDP-43蛋白病相关的神经退行性疾病)。在一些实施方案中，受试者处于发展为以神经元细胞死亡为特征的疾病的风险中。在一些实施方案中，受试者被怀疑患有以神经元细胞死亡为特征的疾病。在一些实施方案中，受试者遭受神经元细胞死亡。在一些实施方案中，受试者患有ALS。在一些实施方案中，受试者患有FTD。在一些实施方案中，受试者患有AD。在一些实施方案中，受试者是携带者，例如无症状携带者。在一些实施方案中，运动神经元细胞来源于受试者的胚胎干细胞(ESC)。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施例中，受试者是小鼠。在一些实施方案中，小鼠是转基因小鼠。从胚胎干细胞诱导运动神经元分化的方法在本领域中是已知的，例如描述于Di Giorgio等人,Nature Neuroscience(2007),2007年4月15日在线公开；doi:10.1038/nn1885以及Wichterle等人,Cell(2002)110:385-397。在一些情况下，诱导多能干细胞可以从受试者产生，然后分化成运动神经元。从受试者获得运动神经元的一种示例性方法描述在Dimos,J.T.等人Science(2008)321,1218-122(Epub Jul.31,2008)中。
对于体内方法，可以将有效量的本文所述的细胞周期蛋白F-增强剂施用于受试者。向受试者施用药物的方法是本领域已知的并且本领域技术人员容易获得。
本领域技术人员还将理解，本文所述的药物可用于抑制神经元变性或增强神经元存活，这可能导致以神经元(例如，运动神经元)变性为特征的许多疾病的治疗、抑制发展或改善。
在具体实施方案中，神经元变性包括运动神经元变性。运动神经元疾病(MND)是一组选择性影响运动神经元的神经退行性疾病，运动神经元是控制自主肌肉活动，包括说话、行走、呼吸、吞咽和身体的一般运动的神经细胞。骨骼肌受位于脊髓腹角的将腹根突出到肌肉细胞的一组神经元(下运动神经元)的神经支配。这些神经细胞本身受皮质脊髓束或从脑运动皮层突出的上运动神经元的神经支配。在宏观病理学上，存在着脊髓腹角变性，以及腹根萎缩。在脑中，额叶和颞叶可能出现萎缩。在显微镜检查中，神经元可能表现出海绵状组织增生，存在活化的星形胶质细胞和小胶质细胞，以及许多包涵体，包括特征性的“绞状”包涵体、布尼纳小体(bunina bodies)和空泡化。运动神经元疾病的影响多种多样且具有破坏性。它们的起源和因果关系通常存在明显差异，但对患者的后果却具有相似结果：严重的肌肉无力。肌萎缩侧索硬化症(ALS)、额颞叶痴呆(FTD)、原发性侧索硬化症(PLS)、进行性肌萎缩(PMA)、假性延髓麻痹、进行性延髓麻痹、脊髓性肌萎缩(SMA)和脊髓灰质炎后综合征都是MND的实例。运动神经元变性的主要部位对神经退行性疾病进行分类。
ALS影响上运动神经元和下运动神经元二者，是MND的最常见形式。进行性延髓麻痹会影响脑干的下运动神经元，导致言语不清以及咀嚼和吞咽困难。患有这些病症的人几乎总是在手臂和腿部有异常体征。原发性侧索硬化症是一种上运动神经元的疾病，而进行性肌萎缩仅影响脊髓中的下运动神经元。用于诊断MND的手段为本领域技术人员所熟知。症状的非限制性实例如下所述。
4.1肌萎缩侧索硬化症 (ALS)
肌萎缩侧索硬化症(ALS)，也称为卢伽雷氏病(Lou Gehrig's disease)或经典运动神经元病，是一种进行性、最终致命的疾病，其最终会破坏所有随意肌的信号。在美国，医生可互换地使用术语运动神经元疾病和ALS。上和下运动神经元均受到影响。约75％的患有经典ALS的患者还会出现延髓肌肉(控制说话、吞咽和咀嚼的肌肉)的无力和消瘦。症状通常首先出现在手臂和手、腿或吞咽肌中。肌无力和萎缩不成比例地发生在身体两侧。受影响的个体失去移动手臂、腿和身体的力量和能力。其它症状包括痉挛、过度反射、肌肉抽筋、肌束震颤，以及吞咽和构词问题增加。讲话可能会变得含糊不清或鼻音。当横膈膜和胸壁的肌肉无法正常工作时，个体会在没有机械支持的情况下失去呼吸能力。尽管这种疾病通常不会损害个人的思想或性格，但最近的几项研究表明，一些患有ALS的人可能会改变认知功能，例如决策和记忆问题。ALS最常见于40至60岁的人群，但年轻人和老年人也可能患上这种疾病。男性比女性更容易受到影响。大多数ALS病例是散发性的，并且这些个体的家族成员不被认为处于增加的发展为这种疾病的风险。然而，成人中存在家族性ALS，这通常是由负责RNA代谢(例如，TDP43和FUS)和蛋白质降解(例如，UBQLN2、TBK1和CCNF)的基因的突变引起的。此外，一种罕见的青少年发病形式的ALS是遗传的。大多数患有ALS的个体死于呼吸衰竭，通常在症状出现后3至5年内。然而，约10％的受影响个体可以存活10年或更长时间。
4.2额颞叶痴呆(FTD)
额颞叶痴呆(FTD)是额颞叶变性的临床表现，其特征为主要涉及额叶和/或颞叶的进行性神经元丧失，以及超过70％的梭形神经元(spindle neuron)的典型丧失，而其它神经元类型在FTD中仍然存在完整，额叶和颞叶部分萎缩或缩小。脑的额叶和颞叶通常与性格、行为和语言有关。常见的体征和症状会有所不同，具体取决于受影响的脑部分。一些患有FTD的人的性格发生了巨大的变化，变得不适合社交、冲动或情感冷漠，而另一些人则失去了使用语言的能力。体征和症状包括社交和个人行为的显著变化、冷漠、情绪迟钝以及表达和接受语言二者的缺陷。目前，没有治愈FTD的方法，但有一些治疗方法可以帮助缓解症状。
4.3脊髓性肌萎缩症(SMA)
脊髓性肌萎缩症(SMA)是指许多不同的疾病，它们都有共同的遗传原因和由于脊髓和脑干的运动神经元丧失而导致的无力表现。骨骼肌的无力和消瘦是由脊髓前角细胞的进行性变性引起的。腿部的这种无力通常比手臂更严重。SMA有多种形式，具有不同的发病年龄、遗传模式以及症状的严重程度和进展。下面描述了一些更常见的SMA。
SMN基因产物中的缺陷被认为是SMA的主要原因，并且SMN蛋白水平与患有SMA的受试者的存活相关。SMA的最常见形式是由SMN基因的突变引起的。包含SMN(存活运动神经元)基因的5号染色体区域有大量重复。包含多个基因的大序列在相邻片段中出现两次。因此，该基因有两个拷贝，SMN1和SMN2。SMN2基因有一个额外的突变，使其在产生蛋白质方面的效率降低，尽管它在较低水平这么做。SMA是由两条染色体上的SMN1基因的丧失引起的。SMA的严重程度(从SMA 1到SMA 3)部分地与剩余的SMN 2基因如何弥补SMN 1的丧失有关。
SMA I型，也称为韦德尼希-霍夫曼病(Werdnig-Hoffmann disease)，在儿童6个月大时明显。症状可能包括肌张力减退(肌张力严重降低)、肢体运动减弱、肌腱反射缺乏、肌束震颤、颤抖、吞咽和喂养困难以及呼吸受损。一些儿童还会出现脊柱侧弯(脊柱弯曲)或其它骨骼异常。受影响的儿童从不坐着或站着，绝大多数通常在2岁之前死于呼吸衰竭。
SMA II型的症状通常在儿童6个月大之后开始。特征可能包括无法站立或行走、呼吸问题、肌张力减退、肌腱反射减弱或消失以及肌束颤动。这些孩子可能会学会坐，但不会站立。预期寿命不同，有些个体会活到青春期或更晚。
SMA III型(库格尔贝格-韦兰德病(Kugelberg-Welander disease))的症状出现在2至17岁之间，并且包括步态异常；难以跑步、爬楼梯或从椅子上站起来；以及手指轻微颤抖。下肢最常受到影响。并发症包括脊柱侧弯和关节挛缩——由异常的肌张力和无力引起的关节周围肌肉或肌腱的慢性缩短，从而阻止关节自由活动。
SMA的其它形式包括例如遗传性延髓-脊髓SMA肯尼迪病(X连锁，雄激素受体)、具有呼吸窘迫的SMA(SMARD 1)(染色体11，IGHMBP2基因)、具有上肢优势的远端SMA(染色体7、甘氨酰tRNA合酶)和X-连锁的婴儿SMA(基因UBE1)。
SMA的当前治疗由预防和管理慢性运动单位丧失的继发效应组成。一些正在临床研究中用于治疗SMA的药物包括丁酸盐、丙戊酸、羟基脲和利鲁唑。
法齐奥-隆德病(Fazio-Londe)的症状出现在1至12岁之间，可能包括面部无力、吞咽困难(难以吞咽)、喘鸣(通常与喉部急性阻塞有关的高音调呼吸音)、说话困难(构音障碍)和眼部肌肉麻痹。大多数患有SMA III型的个体死于呼吸并发症。
肯尼迪病，也称为进行性脊髓延髓肌萎缩症，是一种X连锁隐性疾病。患有肯尼迪病的个体的女儿是携带者，有50％的机会生出患上这种疾病的儿子。发病年龄在15至60岁之间。症状包括面部和舌肌肉无力、手颤抖、肌肉痉挛、吞咽困难、构音障碍以及男性乳房和乳腺过度发育。无力通常从骨盆开始，然后扩散到四肢。有些个体会患上非胰岛素依赖型糖尿病。
疾病的病程不同，但通常是缓慢进展的。个体倾向于保持非卧床，直到疾病晚期。患有肯尼迪病的个体的预期寿命通常是正常的。
伴有关节弯曲的先天性SMA(具有固定异常肢体姿势的关节持续挛缩)是一种罕见疾病。表现包括严重的挛缩、脊柱侧弯、胸部畸形、呼吸问题、下巴异常小和上眼睑下垂。
进行性延髓麻痹，也称为进行性延髓萎缩，涉及球状脑干——控制吞咽、说话、咀嚼和其它功能所需的下运动神经元的区域。症状包括咽部肌肉无力(涉及吞咽)、下巴和面部肌肉无力、进行性语言丧失和舌肌萎缩。伴有上下运动神经元体征的肢体无力几乎总是可见，但不太明显。受影响的人会突然大笑或哭泣(称为情绪不稳定)。个体最终变得无法进食或说话，并且处于增加的窒息和吸入性肺炎的风险，这是由液体和食物通过声带进入下呼吸道和肺部引起的。中风和重症肌无力都有某些与进行性延髓麻痹相似的症状，在诊断这种疾病之前必须排除。在约25％的ALS病例中，早期症状始于延髓受累。约75％的经典ALS患者最终表现出一些延髓受累。许多临床医生认为，没有手臂或腿部异常的证据下，进行性延髓麻痹本身，是极其罕见的。
假型延髓麻痹，其具有进行性延髓麻痹的许多症状，其特征为上运动神经元变性和说话、咀嚼和吞咽能力的进行性丧失。面部肌肉的逐渐无力导致面无表情。个体可能会出现沙哑的声音和增加的呕吐反射。舌头可能会变得不动，并且无法从嘴里伸出。个体也可能经历情绪不稳定。
原发性侧索硬化症(PLS)仅影响上运动神经元，并且在男性中的发病率几乎是女性的两倍。发病一般发生在50岁以后。PLS的原因尚不清楚。当大脑皮层(覆盖脑的细胞薄层，负责大多数高级心理功能)中控制自主运动的特定神经细胞逐渐变性导致受其控制的肌肉无力时，就会发生这种情况。这种综合征——科学家认为极小遗传性——会在数年或数十年内逐渐进展，导致受影响的肌肉僵硬和笨拙。这种疾病通常首先影响腿部，然后是躯干、手臂和手，最后是延髓肌肉。症状可能包括平衡困难、腿部无力和僵硬、笨拙、腿部痉挛导致运动缓慢和僵硬、双脚拖曳(导致无法行走)和面部受累导致构音障碍(发音不清)。ALS和PLS(被认为是ALS的一种变体)之间的主要区别在于所涉及的运动神经元和疾病进展的速度。PLS可能被误认为痉挛性截瘫，这是一种上运动神经元的遗传性疾病，会导致腿部痉挛，通常在青春期开始。大多数神经科医生在诊断出PLS之前至少会跟踪受影响个体的临床过程3年。这种疾病不是致命的，但可能会影响生活质量。PLS经常发展为ALS。
进行性肌肉萎缩(PMA)的特征是仅下运动神经元的缓慢但进行性变性。它主要影响男性，发病时间早于其它MND。无力通常首先出现在手上，然后扩散到下半身，此时可能会很严重。其它症状可能包括肌肉萎缩、手部动作笨拙、肌束震颤和肌肉痉挛。躯干肌肉和呼吸可能会受到影响。暴露于寒冷会使症状恶化。在许多情况下，该疾病会发展为ALS。
脊髓灰质炎后综合征(PPS)是一种在脊髓灰质炎幸存者从脊髓灰质炎康复数十年后可能袭击他们的疾病。PPS被认为是在受伤、疾病(如退行性关节疾病)、体重增加或衰老过程损害或杀死脊髓灰质炎最初发作后仍保持功能的脊髓运动神经元时发生。许多科学家认为PPS是先前受脊髓灰质炎影响的肌肉的潜在弱点，而不是新的MND。症状包括疲劳、缓慢进行性肌肉无力、肌肉萎缩、肌束震颤、不耐寒以及肌肉和关节疼痛。这些症状最常出现在受初始疾病影响的肌肉群中。其它症状包括骨骼畸形，例如脊柱侧弯和呼吸、吞咽或睡眠困难。症状在老年人和受早期疾病影响最严重的个体中更为常见。有些个体只会出现轻微的症状，而另一些则会出现SMA，而且很少出现看似是但不是ALS的一种形式。PPS通常不会危及生命。医生估计，麻痹性脊髓灰质炎幸存者中PPS的发病率为约25％至50％。
本文考虑的神经元TDP-43蛋白病也可能与ALS以外的疾病有关，例如额颞叶痴呆(FTD)、AD、佩里综合征(Perry syndrome)、慢性创伤性脑病、关岛型ALS/帕金森症-痴呆复合症、海马硬化和多系统蛋白质病。相关TDP-43蛋白病的非排他性列表包括阿尔茨海默病(AD)、额颞叶变性、皮质基底节变性、进行性核上性麻痹、格斯特曼-施特劳斯勒尔-沙因克尔综合征(Gerstmann Straussler Scheinker)、伴有脑铁累积的神经变性、球状神经胶质tau病变、原发性年龄相关tau病变、年龄相关的tau星形神经胶质病、脑炎后帕金森病、亚急性硬化性全脑炎、泛酸激酶相关神经变性、慢性创伤性脑病、唐氏综合症(Down syndrome)、早发性AD、强直性营养不良、脂褐质沉着症、C型尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease)、亚历山大病(Alexander disease)、佩里综合征(Perry syndrome)、科凯恩综合征(Cockaynesyndrome)、神经节胶质瘤/神经节细胞瘤、纤维性星形细胞瘤、铅脑病、外伤性脑损伤(急性)和包涵体肌炎，例如在Chornenkyy等人(Laboratory Investigation 99:993–1007(2019))中提出的。
4.4阿尔茨海默病
AD的主要标志是：(1)β-淀粉样蛋白(所谓神经炎斑块中的Aβ肽)在神经元外的进行性累积，干扰突触处的神经元与神经元的通讯并可能导致细胞死亡；(2)Aβ肽也以所谓的血管淀粉样蛋白在脑血管周围积聚，从而干扰血液中必需营养素向脑的摄取；(3)tau蛋白(神经原纤维缠结)在神经元内异常沉积，阻碍了神经元内货物的运输。这是神经元功能障碍和细胞死亡的主要驱动因素。最终，淀粉样蛋白沉积物和缠结二者都会对脑造成不可逆转的损害，导致脑萎缩和认知功能丧失。AD最常见的早期症状是难以记住最近发生的事件，随着疾病的进展，症状可能包括语言问题、迷失方向(包括容易迷路)、情绪波动、失去动力、无法自我照顾和行为问题。随着个人的病情恶化，他们往往会退出家庭和社会。渐渐地，身体机能丧失，最终导致死亡。尽管进展速度可能会有所不同，但诊断后的典型预期寿命为三到九年。
在一些实施方案中，本文所述的方法进一步包括选择被诊断患有神经退行性疾病的受试者，合适地是与神经元TDP-43蛋白病相关的受试者。可以基于呈现的症状选择患有神经退行性疾病的受试者。例如，患有ALS的受试者可能表现出以下症状：肌束震颤、痉挛、肌肉紧绷和僵硬(痉挛状态)、手臂、肩膀或舌头抽搐、影响手、手臂或腿的肌肉无力、口齿不清和鼻音、或咀嚼或吞咽困难。
在一些实施方案中，本文所述的方法还包括选择处于发展为神经退行性疾病的风险的受试者，合适地是与神经元TDP-43蛋白病相关的受试者。可以基于遗传诊断测试(例如，针对与神经退行性疾病相关的基因中的突变或基于所呈现的症状)来选择处于发展为神经退行性疾病的风险的受试者。
5.治疗方法
本公开的某些方面涉及用于治疗神经退行性疾病的方法，特别是与神经元TDP-43蛋白病相关的那些神经退行性疾病，和/或治疗以神经元变性为特征的疾病。因此，本公开的一个方面涉及一种在有此需要的受试者中治疗或抑制适当地与神经元TDP-43蛋白病相关的神经退行性疾病发展的方法，其中该方法包括向受试者施用有效量的增强或增加受试者的神经元(例如，运动神经元)中细胞周期蛋白F水平或活性的药物。在另一个方面，本公开涉及在有此需要的受试者中治疗或抑制以神经元变性和TDP-43蛋白病为特征的疾病发展的方法，其中该方法包括向受试者施用有效量的增强或增加受试者的神经元(例如，运动神经元)中细胞周期蛋白F的水平或活性的药物。
适当地，药物增强或增加细胞周期蛋白F的水平或活性，并在受试者中增强神经元存活(例如，运动神经元存活)和/或抑制神经元变性(例如，运动神经元变性)。在一些实施方案中，药物增强或增加细胞周期蛋白F的水平或活性并在受试者中改善与神经退行性疾病相关的至少一种症状。在一些实施方案中，药物增强或增加细胞周期蛋白F的水平或活性并治疗受试者的神经退行性疾病。在一些实施方案中，药物增强或增加细胞周期蛋白F的水平或活性并防止受试者发展为神经退行性疾病。在一些实施方案中，药物增强或增加细胞周期蛋白F的水平或活性并防止受试者的神经退行性疾病进展。
在一些实施方案中，药物增加包含复合物底物(例如，TDP-43)的SCF细胞周期蛋白F复合物的水平，并在受试者中增强神经元存活(例如，运动神经元存活)和/或抑制神经元变性(例如，运动神经元变性)。在一些实施方案中，药物增加包含复合物底物(例如，TDP-43)的SCF细胞周期蛋白F复合物的水平，并在受试者中改善神经退行性疾病相关的至少一种症状。在一些实施方案中，药物增加包含复合物底物(例如，TDP-43)的SCF细胞周期蛋白F复合物的水平并治疗受试者的神经退行性疾病。在一些实施方案中，药物增加包含复合物底物(例如，TDP-43)的SCF细胞周期蛋白F复合物的水平并防止受试者发展为神经退行性疾病。在一些实施方案中，药物增加包含复合物底物(例如，TDP-43)的SCF细胞周期蛋白F复合物的水平并防止受试者的神经退行性疾病进展。
在一些实施方案中，药物降低对蛋白质聚集敏感的蛋白质(例如，TDP-43)的量并在受试者中增强神经元存活(例如，运动神经元存活)和/或抑制神经元变性(例如，运动神经元变性)。在一些实施方案中，药物降低对蛋白质聚集敏感的蛋白质(例如，TDP-43)的量并在受试者中改善与神经退行性疾病相关的至少一种症状。在一些实施方案中，药物降低对蛋白质聚集敏感的蛋白质(例如，TDP-43)的量并治疗受试者的神经退行性疾病。在一些实施方案中，药物降低对蛋白质聚集敏感的蛋白质(例如，TDP-43)的量并防止受试者发展为神经退行性疾病。在一些实施方案中，药物降低对蛋白质聚集敏感的蛋白质(例如，TDP-43)的量并防止受试者的神经退行性疾病进展。
任何增加神经元(例如，运动神经元)中细胞周期蛋白F的水平或活性的药物都可以用于本文所述的实施方案中。
在一些实施方案中，受试者是人。
在一些实施方案中，受试者选择用于治疗神经退行性疾病或以运动神经元变性为特征的疾病。在一些实施方案中，受试者处于发展为发生神经退行性疾病的风险，特别是与神经元TDP-43蛋白病相关的神经退行性疾病，或以运动神经元变性为特征的疾病。在一些实施方案中，受试者被怀疑患有神经退行性疾病，特别是与神经元TDP-43蛋白病相关的神经退行性疾病，或以运动神经元变性为特征的疾病。在一些实施方案中，受试者患有神经退行性疾病，特别是与神经元TDP-43蛋白病相关的神经退行性疾病。神经退行性疾病可以是本文所述的任何神经退行性疾病。在一些实施方案中，神经退行性疾病以运动神经元变性为标志。在一些实施方案中，神经退行性疾病是运动神经元疾病。在一些实施方案中，神经退行性疾病是ALS。在一些实施方案中，神经退行性疾病是FTD。在一些实施方案中，神经退行性疾病包括除了运动神经元变性之外的神经元变性。在一些实施方案中，神经退行性疾病是AD。
在一些实施方案中，还向受试者施用另一种治疗剂。这样的另一种治疗剂或“辅助”剂通常与细胞周期蛋白F增强剂同时施用。例如，治疗剂可以在相同的制剂中或在分开的制剂中施用，例如丁酸盐、丙戊酸、羟基脲或利鲁唑。在一些实施方案中，本文所述的药物与适用于治疗ALS的一种或多种症状的另一种治疗剂组合使用，后者包括但不限于(i)氢化吡啶并[4,3-b]吲哚或其药学上可接受的盐和(ii)促进或增加肌肉细胞能量供应的药物、COX-2抑制剂、聚(ADP-核糖)聚合酶-1(PARP-I)抑制剂、3OS核糖体蛋白抑制剂、NMDA拮抗剂、NMDA受体拮抗剂、钠通道阻滞剂、谷氨酸释放抑制剂、K(V)4.3通道阻滞剂、抗炎剂、5-HT1A受体激动剂、神经营养因子增强剂、促进运动神经元表型存活和/或神经突生成的药物、保护血脑屏障免受破坏的药物、一种或多种促炎细胞因子产生或活性的抑制剂、免疫调节剂、神经保护剂、星形胶质细胞功能调节剂、抗氧化剂(例如小分子催化抗氧化剂)、自由基清除剂、减少一种或多种活性氧物质的量的药物、抑制非蛋白质硫醇含量减少的药物、正常细胞蛋白质修复通路的刺激物(例如激活分子伴侣的药物)、神经营养剂、神经细胞死亡抑制剂、神经突生长刺激剂、防止神经细胞死亡和/或促进受损脑组织再生的药物、细胞因子调节剂、降低小胶质细胞活化水平的药物、大麻素CB1受体配体、非甾体抗炎药、大麻素CB2受体配体、肌酸、肌酸衍生物、多巴胺受体激动剂的立体异构体如盐酸普拉克索、睫状神经营养因子、编码睫状神经营养因子的药物、神经胶质来源的神经营养因子、编码神经胶质来源的神经营养因子药物、神经营养因子3、编码神经营养因子3的药物，或其任何组合。
在一些实施方案中，本文所述的药物与适用于治疗ALS或FTD的一种或多种症状的另一种治疗剂组合使用，后者包括但不限于以下一种或多种：抗生素(例如氨基糖苷类、头孢菌素、氯霉素、克林霉素、红霉素、氟喹诺酮类、大环内酯类、Azolides、甲硝唑、青霉素、四环素类、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑(Trimethoprim-sulfamethoxazole)、万古霉素)、类固醇(例如，Andranes(例如，睾酮)、胆甾烷(例如，胆固醇)、胆酸类(例如，胆酸)、皮质类固醇(例如，地塞米松)、雌烯烃(Estraenes)(例如，雌二醇)、孕烷(例如，黄体酮)、麻醉和非麻醉镇痛药(例如，吗啡、可待因、海洛因、氢吗啡酮、左啡诺、哌替啶、美沙酮、氧化酮(Oxydone)、丙氧芬、芬太尼、美沙酮、纳洛酮、丁丙诺啡、布托啡诺、纳布啡、喷他佐辛)、抗炎药(例如，阿氯芬酸(Alclofenac)、二丙酸阿氯米松(Alclometasone Dipropionate)、丙缩阿尔孕酮(Algestone Acetonide)、α淀粉酶、安西法尔(Amcinafal)、安西非特(Amcinafide)、氨芬酸钠(Amfenac Sodium)、盐酸氨普立糖(Amiprilose Hydrochloride)、阿那白滞素、阿尼罗酸(Anirolac)、阿尼扎芬(Anitrazafen)、阿扎丙宗(Apazone)、巴柳氮二钠(BalsalazideDisodium)、苄达酸(Bendazac)、苯噁洛芬(Benoxaprofen)、盐酸苄达明(BenzydamineHydrochloride)、菠萝蛋白酶(Bromelains)、溴哌莫(Broperamole)、布地奈德(Budesonide)、卡洛芬(Carprofen)、环洛芬(Cicloprofen)、辛喷他宗(Cintazone)、克利洛芬(Cliprofen)、丙酸氯倍他索(Clobetasol Propionate)、丁酸氯倍他松(ClobetasoneButyrate)、氯吡酸(Clopirac)、丙酸氯硫卡松(Cloticasone Propionate)、醋酸三氟米松(Cormethasone Acetate)、可托多松(Cortodoxone)、癸酸盐(Decanoate)、地夫可特(Deflazacort)、庚酸睾酮(Delatestryl)、环戊丙酸睾酮(Depo-Testosterone)、地奈德(Desonide)、地塞米松(Desoximetasone)、双丙酸地塞米松(DexamethasoneDipropionate)、双氯芬酸钾、双氯芬酸钠、二醋酸二氟拉松(Diflorasone Diacetate)、二氟米酮钠(Diflumidone Sodium)、二氟尼柳(Diflunisal)、二氟泼尼酯(Difluprednate)、地弗他酮(Diftalone)、二甲基亚砜、羟西奈德(Drocinonide)、恩甲羟松(Endrysone)、恩莫单抗(Enlimomab)、依诺立康钠(Enolicam Sodium)、艾匹唑(Epirizole)、依托度酸(Etodolac)、依托芬那酯(Etofenamate)、联苯乙酸(Felbinac)、非那莫(Fenamole)、芬布芬(Fenbufen)、芬氯酸(Fenclofenac)、苯克洛酸(Fenclorac)、芬度柳(Fendosal)、苯吡噁二酮(Fenpipalone)、芬替酸(Fentiazac)、氟苯哌酮(Flazalone)、氟扎可特(Fluazacort)、氟芬那酸(Flufenamic Acid)、芬氟咪唑(Flumizole)、醋酸氟尼缩松(FlunisolideAcetate)、氟尼辛(Flunixin)、氟尼辛葡甲胺(Flunixin Meglumine)、氟可丁丁酯(Fluocortin Butyl)、醋酸氟米龙(Fluorometholone Acetate)、氟喹宗(Fluquazone)、氟比洛芬(Flurbiprofen)、氟瑞托芬(Fluretofen)、丙酸氟替卡松(FluticasonePropionate)、呋喃洛芬(Furaprofen)、呋罗布芬(Furobufen)、哈西奈德(Halcinonide)、卤倍他索丙酸酯(Halobetasol Propionate)、醋酸卤泼尼松(Halopredone Acetate)、异丁芬酸(Ibufenac)、布洛芬(Ibuprofen)、布洛芬铝、皮考布洛芬(Ibuprofen Piconol)、伊洛达普(Ilonidap)、吲哚美辛(Indomethacin)、吲哚美辛钠、吲哚洛芬(Indoprofen)、吲哚克索(Indoxole)、吲四唑(Intrazole)、醋酸异氟泼尼松(Isoflupredone Acetate)、伊索克酸(Isoxepac)、伊索昔康(Isoxicam)、酮洛芬(Ketoprofen)、盐酸洛非咪唑(LofemizoleHydrochloride)、氯诺昔康(Lomoxicam)、依碳酸氯替泼诺(Loteprednol Etabonate)、甲氯芬那酸钠(Meclofenamate Sodium)、甲氯芬那酸(Meclofenamic Acid)、二丁酸甲氯松(Meclorisone Dibutyrate)、甲芬那酸(Mefenamic Acid)、氨水杨酸(Mesalamine)、美西拉宗(Meseclazone)、美睾酮(Mesterolone)、美雄酮(Methandrostenolone)、美替诺龙(Methenolone)、醋酸美替诺龙(Methenolone Acetate)、磺庚甲泼尼龙(Methylprednisolone Suleptanate)、吗尼氟酯(Morniflumate)、萘丁美酮(Nabumetone)、诺龙(Nandrolone)、萘普生(Naproxen)、萘普生钠、耐普索(Naproxol)、尼马宗(Nimazone)、奥沙拉嗪钠(Olsalazine Sodium)、奥古蛋白(Orgotein)、奥帕诺辛(Orpanoxin)、氧雄龙(Oxandrolane)、奥沙普秦(Oxaprozin)、羟基保泰松(Oxyphenbutazone)、羟甲烯龙(Oxymetholone)、盐酸瑞尼托林(Paranyline Hydrochloride)、戊糖多硫酸钠(PentosanPolysulfate Sodium)、保泰松甘油酸钠(Phenbutazone Sodium Glycerate)、吡非尼酮(Pirfenidone)、吡罗昔康(Piroxicam)、肉桂酸吡罗昔康(Piroxicam Cinnamate)、吡罗昔康乙醇胺(Piroxicam Olamine)、吡洛芬(Pirprofen)、泼那扎特(Prednazate)、普立非酮(Prifelone)、普罗度酸(Prodolie Acid)、普罗喹宗(Proquazone)、普罗沙唑(Proxazole)、柠檬酸胺丙噁二唑(Proxazole Citrate)、利美索龙(Rimexolone)、氯马扎利(Romazarit)、柳胆来司(Salcolex)、沙那西定(Salnacedin)、双水杨酯(Salsalate)、血根氯铵(Sanguinarium Chloride)、司克拉宗(Seclazone)、丝美辛(Sermetacin)、司坦唑醇(Stanozolol)、舒多昔康(Sudoxicam)、舒林酸(Sulindac)、舒洛芬(Suprofen)、他美辛(Talmetacin)、他尼氟酯(Talniflumate)、他洛沙酯(Talosalate)、特丁非隆(Tebufelone)、替尼达普(Tenidap)、替尼达普钠(Tenidap Sodium)、替诺昔康(Tenoxicam)、替昔康(Tesicam)、苄叉异喹酮(Tesimide)、睾酮(Testosterone)、混合睾酮(Testosterone Blends)、四氢甲吲胺(Tetrydamine)、硫平酸(Tiopinac)、巯氢可的松(Tixocortol Pivalate)、托美汀(Tolmetin)、托美汀钠(Tolmetin Sodium)、三氯氟松(Triclonide)、三氟氨酯(Triflumidate)、齐多美辛(Zidometacin)、佐美酸钠(ZomepiracSodium))，或抗组胺药(例如，乙醇胺(如苯海拉明(diphenhydrmine)、卡比沙明(carbinoxamine))、乙二胺(如曲吡那敏(tripelennamine)、美吡拉敏(pyrilamine))、烷基胺(如扑尔敏(chlorpheniramine)、右氯苯那敏(dexchlorpheniramine)、溴苯那敏(brompheniramine)、曲普利啶(triprolidine))，其它抗组胺药，如阿司咪唑(astemizole)、氯雷他定(loratadine)、非索非那定(fexofenadine)、溴苯那敏(Bropheniramine)、氯马斯汀(Clemastine)、对乙酰氨基酚(Acetaminophen)、伪麻黄碱(Pseudoephedrine)、曲普利啶(Triprolidine))。
在一些实施方案中，本文所述的药物与适用于治疗AD的一种或多种症状的另一种治疗剂组合使用，后者包括但不限于认知增强剂，例如但不限于多奈哌齐(donepezi)、卡巴拉汀(rivastigmine)、美金刚(memantine)和加兰他敏(galantamine)。
6.制剂和施用
对于施用于受试者，本文所述的药物可以口服、肠胃外施用，例如皮下、静脉内、肌内、腹膜内、通过鼻内滴注或通过施用于粘膜例如鼻、喉和支气管的粘膜。一种靶向神经系统(例如脊髓神经胶质)的方法是鞘内施用。靶向药物被释放到周围CSF和/或组织中，并且在急性鞘内注射后，释放的化合物就可以渗透到脊髓实质中。有关包括CNS递送在内的药物递送策略的全面综述，参见Ho等人,Curr.Opin.Mol.Ther.(1999),1:336-3443；Groothuis等人,J.Neuro Virol.(1997),3:387-400；和Jan,Drug Delivery Systmes:Technologiesand Commercial Opportunities,Decision Resources,1998，其内容通过引用并入本文。
它们可以单独施用或与合适的药物载体一起施用，并且可以是固体或液体形式，例如片剂、胶囊剂、散剂、溶液剂、混悬剂或乳剂。
药物可以配制成药学上可接受的组合物，该组合物包含与一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂一起配制的有效量的药物。药物可以特别配制用于以固体或液体形式施用，包括适于以下施用的那些：(1)口服施用，例如，浸剂(水性溶液剂或非水性溶液剂或混悬液)、锭剂、糖衣丸、胶囊剂、丸剂、片剂(例如，针对口腔、舌下和全身吸收的那些)、推注剂(boluses)、散剂、颗粒剂、用于舌头的糊剂；(2)肠胃外施用，例如通过皮下、肌肉内、静脉内或硬膜外注射，例如无菌溶液剂或无菌混悬剂，或缓释制剂；(3)局部应用，例如，作为应用于皮肤的乳膏剂、软膏剂或控释贴剂或喷雾剂；(4)阴道内或直肠内，例如，作为阴道栓剂、乳膏剂或泡沫剂；(5)舌下；(6)眼睛(ocularly)；(7)透皮；(8)经粘膜；或(9)经鼻。此外，化合物和/或药物可以植入患者体内或使用药物递送系统注射。例如，参见Urquhart等人(1984.Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.24:199-236)；Lewis,ed.“ControlledRelease of Pesticides and Pharmaceuticals”(Plenum Press,New York,1981)；美国专利号3,773,919；和美国专利号353,270,960。
可用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：(1)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和醋酸纤维素；(4)黄蓍胶粉；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，例如硬脂酸镁、月桂基磺酸钠、滑石粉等；(8)赋形剂，例如可可脂、栓剂蜡；(9)油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油、大豆油；(10)二醇，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇(PEG)；(12)酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；(22)填充剂，例如多肽和氨基酸；(23)血清成分，例如血清白蛋白、HDL和LDL；(22)C2-C12醇，例如乙醇；和(23)药物制剂中使用的其它无毒相容物质。润湿剂、着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、矫味剂、芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于制剂中。术语如“赋形剂”、“载体”、“药学上可接受的载体”等在本文中可互换使用。
药学上可接受的抗氧化剂包括但不限于：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
PEG在其范围内包括任何乙二醇聚合物，其包含约20至约2000000个连接单体，通常约50-1000个连接单体，通常约100-300个。聚乙二醇包括包含多个连接单体的PEG，例如PEG20、PEG30、PEG40、PEG60、PEG80、PEG100、PEG115、PEG200、PEG300、PEG400、PEG500、PEG600、PEG1000、PEG1500、PEG2000、PEG3350、PEG4000、PEG4600、PEG5000、PEG6000、PEG8000、PEG11000、PEG12000、PEG2000000及其任何混合物。
可以将药物配制成明胶胶囊剂、片剂形式、糖衣丸、糖浆剂、混悬剂、外用乳膏剂、栓剂、可注射溶液剂，或用于在临使用前制备糖浆剂、混悬剂、外用乳膏剂、栓剂或可注射溶液剂的试剂盒。此外，化合物和/或药物可以包括在有助于其缓慢释放到血流中的复合材料中，例如硅盘、聚合物珠粒。
制剂可以方便地以单位剂量形式存在并且可以通过药学领域中众所周知的任何方法制备。技术、赋形剂和制剂通常见于例如Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.1985,第17版,Nema等人,PDA J.Pharm.Sci.Tech.199751:166-171。制备本发明制剂的方法包括使活性剂与一种或多种赋形剂或载体结合或接触的步骤。通常，通过将一种或多种药物与液体赋形剂或细碎的固体赋形剂或两者均匀且紧密地结合，然后，如果合适，使产品成型来制备制剂。
制备程序可以包括药物制剂的灭菌。这些药物可以与不会与药物发生有害反应的助剂如润滑剂、防腐剂、稳定剂、影响渗透压的盐等混合。
可注射形式的实例包括溶液剂、混悬剂和乳剂。可注射形式还包括用于临时制备可注射溶液剂、混悬剂或乳剂的无菌粉末。本发明的药物可以可以与药物载体一起注射，所述药物载体例如当量盐水(normal saline)、生理盐水(physiological saline)、抑菌水、Cremophor.TM.EL(BASF,Parsippany,N.J.)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、林格溶液、葡萄糖溶液、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、植物油及其合适的混合物，以及本领域已知的其它水性载体。也可以使用合适的非水性载体，实例包括不挥发油和油酸乙酯。在所有情况下，组合物必须是无菌的并且应该是流体以达到易于注射的程度。它必须在制造和储存条件下保持稳定，并且必须防止微生物如细菌和真菌的污染作用。例如，可以通过使用包衣如卵磷脂、通过在分散体的情况下保持所需的粒度和通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂来防止微生物的作用，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇和氯化钠。可通过在组合物中包含延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶来延长可注射组合物的吸收。合适的载体是含5％葡萄糖的盐水。通常，需要在载体中包括添加剂，例如缓冲剂和防腐剂或其它物质以增强等渗性和化学稳定性。
在一些实施方案中，本文所述的药物可以封装在脂质体中施用。这样的脂质体的制造和将分子插入这样的脂质体在本领域中是众所周知的，例如，如美国专利号4,522,811中所述。脂质体悬浮液(包括靶向特定细胞(例如垂体细胞)的脂质体)也可以用作药学上可接受的载体。
在一个实施方案中，药物与将保护化合物和/或药物免于从体内快速消除的载体一起制备，例如控释制剂，包括植入物和微胶囊化递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。制备这样的制剂的方法对于本领域技术人员将是显而易见的。这些材料也可以从AlzaCorporation和Nova Pharmaceuticals,Inc.商购获得。
在口服摄取的情况下，用于口服施用的固体制剂的赋形剂是本领域中通常使用的那些，有用的实例是如乳糖、蔗糖、氯化钠、淀粉、碳酸钙、高岭土、结晶纤维素、甲基纤维素、甘油、海藻酸钠、阿拉伯树胶等的赋形剂，如聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯吡咯烷酮、乙基纤维素、阿拉伯树胶、虫胶、蔗糖、水、乙醇、丙醇、羧甲基纤维素、磷酸钾等的粘合剂，如硬脂酸镁、滑石粉等的润滑剂，并且还包括如通常已知的着色剂的添加剂、如海藻酸和PRIMOGELTM等的崩解剂。
药物可以口服施用，例如，与惰性稀释剂或与可同化的可食用载体一起，或者它们可以被封装在硬壳或软壳胶囊中，或者它们可以被压制成片剂，或者它们可以被直接引入饮食中的食物。对于口服治疗施用，这些化合物和/或药物可以与赋形剂结合并以片剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂等形式使用。这样的组合物和制剂应包含至少0.1％的化合物和/或药物。这些组合物中药物的百分比当然可以变化，并且可以方便地在单位重量的约2％至约60％之间。这样的治疗有用的组合物中的化合物和/或药物的量使得将获得合适的剂量。制备根据本发明的优选组合物，使得口服剂量单位含有约100至2000mg的化合物和/或药物。
可用于栓剂制剂的基质的实例是油质基质，例如可可脂、聚乙二醇、羊毛脂、脂肪酸甘油三酯、witepsol(商标，Dynamite Nobel Co.Ltd.)等。液体制剂可以是水性或油性混悬剂、溶液剂、糖浆剂、酏剂等形式，可以使用添加剂通过常规方式制备。
组合物可以作为推注给药施用，以在给药后的最长时间长度内使循环水平最大化。也可以在推注给药后使用连续输注。
药物也可以以气雾剂的形式直接施用于气道。对于通过吸入施用，溶液或混悬液中的药物可以以气雾剂喷雾的形式从加压容器或分配器递送，该加压容器或分配器包含合适的抛射剂，例如气体如二氧化碳，或烃抛射剂如丙烷、丁烷或异丁烯。药物也可以以非加压形式施用，例如在雾化器或喷雾器中。
药物也可以肠胃外施用。这些药物的溶液剂或混悬剂可以在与表面活性剂如羟丙基纤维素适当混合的水中制备。也可以在甘油、液体聚乙二醇及其在油中的混合物中制备分散体。示例性油是石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油或矿物油。一般而言，水、盐水、葡萄糖水溶液和相关的糖溶液，以及二醇如丙二醇或聚乙二醇，是优选的液体载体，特别是对于可注射溶液。在一般储存和使用条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物生长。
将口服或胃肠外组合物配制成剂量单位形式可能是有利的，以便于施用和剂量的均匀性。
还可以通过经粘膜或经皮方式施用。对于经粘膜或经皮施用，制剂中使用适合待渗透屏障的渗透剂。这样的渗透剂在本领域中通常是已知的，并且包括例如用于经粘膜施用的去污剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。经粘膜施用可以通过使用鼻喷雾剂或栓剂来完成。对于经皮施用，将药物配制成本领域公知的软膏、油膏、凝胶或乳膏。
药物可以与其它药物活性剂组合施用于受试者。示例性的药学活性化合物和/或药物包括但不限于在以下中发现的那些：Harrison's Principles of InternalMedicine,13.sup.th Edition,Eds.T.R.Harrison等人McGraw-Hill N.Y.,NY；Physician's Desk Reference,50.sup.th Edition,1997,Oradell New Jersey,Medical EconomicsCo.；Pharmacological Basis of Therapeutics,8.sup.th Edition,Goodman和Gilman,1990；United States Pharmacopeia,The National Formulary,USP XII NF XVII,1990，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，药物活性剂选自丁酸盐、丙戊酸、羟基脲和利鲁唑组成的组。
药物和其它药物活性剂可以在相同的药物组合物中或在不同的药物组合物中(同时或不同时间)施用于受试者。例如，可以在相同的药物组合物中或在不同的药物组合物中(同时或在不同的时间)向受试者施用极光激酶抑制剂和用于治疗神经退行性疾病的另外的药物。
可以与载体材料组合以产生单一剂量形式的药物的量通常是产生治疗效果的药物的量。通常，在百分之一百中，该量为化合物的约0.1％至99％，优选约5％至约70％，最优选10％至约30％。
片剂、胶囊剂等还可以包含粘合剂，例如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，例如磷酸二钙；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸；润滑剂，例如硬脂酸镁；和甜味剂，例如蔗糖、乳糖或糖精。当剂量单位形式是胶囊剂时，除了上述类型的材料之外，它还可以含有液体载体，例如脂肪油。
各种其它材料可以作为包衣存在或用于改变剂量单位的物理形式。例如，片剂可以包衣有虫胶、糖或两者。除了活性成分之外，糖浆剂还可以包含作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料和矫味剂，例如樱桃或橙香料。
药物组合物可以与施用说明一起包含在容器、包装或分配器中。
关于将递送有效量的化合物和/或药物来治疗ALS或FTD的功效和剂量的指导可以从ALS或FTD的动物模型获得，参见例如Hsieh-Li等人(2000.Nature Genetics 24:66-70)和其中引用的参考文献中描述的那些。
毒性和治疗功效可以通过细胞培养或实验动物中的标准药学程序来确定，例如，用于确定LD50(对群体中50％致死的剂量)和ED50(对群体中50％有效的剂量)。毒性和治疗作用之间的剂量比是治疗指数，它可以表示为比值LD50/ED50。表现出大治疗指数的组合物是优选的。
从细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于制定用于人类的剂量范围。这样的化合物和/或药物的剂量优选地在包括ED50且毒性很小或没有毒性的循环浓度范围内。根据所用剂量形式和所用施用途径，剂量可在此范围内变化。
有效剂量可以最初从细胞培养测定中估计。可以在动物模型中制定剂量以达到包括在细胞培养中确定的IC50(即，达到症状最大抑制一半的治疗剂浓度)的循环血浆浓度范围。例如，可以通过高效液相色谱法测量血浆中的水平。任何特定剂量的效果都可以通过合适的生物测定来监测。合适的生物测定的实例包括DNA复制测定、基于转录的测定、GDF-8结合测定和免疫测定。
剂量可以由医生确定并根据需要进行调整，以适应观察到的治疗效果。通常，施用组合物以使得以以下剂量施用化合物和/或药物：1μg/kg至100mg/kg、1μg/kg至50mg/kg、1μg/kg至20mg/kg、1μg/kg至10mg/kg、1μg/kg至1mg/kg、100μg/kg至100mg/kg、100μg/kg至50mg/kg、100μg/kg至20mg/kg、100μg/kg至10mg/kg、100μg/kg至1mg/kg、1mg/kg至100mg/kg、1mg/kg至50mg/kg、1mg/kg至20mg/kg、1mg/kg至10mg/kg、10mg/kg至100mg/kg、10mg/kg至50mg/kg、或10mg/kg至20mg/kg。对于抗体化合物和/或药物，一种优选的剂量是0.1mg/kg体重(通常10mg/kg至20mg/kg)。如果抗体要在脑中起作用，50mg/kg至100mg/kg的剂量通常是合适的。
关于治疗的持续时间和频率，熟练的临床医生通常监测受试者以确定治疗何时提供治疗益处，并确定是否增加或减少剂量、增加或减少施用频率、停止治疗、恢复治疗或对治疗方案进行其它改变。根据许多临床因素，例如受试者对多肽的敏感性，给药方案可以从每周一次到每天变化。所需剂量可以一次施用或分成亚剂量，例如2-4次亚剂量，并在一段时间内施用，例如，在一天中以适当的间隔或其它适当的方案施用。这样的亚剂量可以作为单位剂量形式施用。给药方案的实例是每周一次、每周两次、每周三次、每天、每天两次、每天三次或每天四次或更多次施用。
7.试剂盒
本文所述的药物可以在试剂盒中提供。试剂盒包括：(a)药物，例如包含药物的组合物，和(b)信息材料。信息材料可以是描述性的、指导性的、营销的或与本文所述的方法和/或用于本文所述的方法的药物的使用有关的其它材料。例如，信息材料描述了施用药物以增强运动神经元存活、治疗或抑制神经退行性疾病，特别是与神经元TDP-43蛋白病相关的神经退行性疾病(例如，ALS、FTD、AD等)，或者神经退行性疾病或与功能障碍或神经元减少(例如，运动神经元)相关的疾病的至少一种症状的发展的方法。
在一个实施方案中，信息材料可以包括以合适的方式施用药物的说明，例如以合适的剂量、剂型或施用方式(例如，本文描述的剂量、剂型或施用方式)。在另一个实施方案中，信息材料可以包括用于鉴定合适的受试者，例如人，例如成年人的说明。试剂盒的信息材料不限于其形式。在许多情况下，信息材料(例如说明)以印刷品形式提供，例如印刷文本、图画和/或照片，例如标签或印刷单。然而，信息材料也可以以其它形式提供，例如盲文、计算机可读材料、视频记录或音频记录。在另一个实施方案中，试剂盒的信息材料是链接或联系信息，例如物理地址、电子邮件地址、超链接、网站或电话号码，其中试剂盒的用户可以获得关于调节剂和/或其在本文描述的方法中使用的实质性信息。当然，也可以以任何形式组合来提供信息材料。
除了药物，试剂盒的组合物可以包括其它成分，例如溶剂或缓冲剂、稳定剂或防腐剂，和/或用于治疗本文所述的病症或疾病的第二药物。替代地，其它成分可以包括在试剂盒中，但在与药物不同的组合物或容器中。在这样的实施方案中，试剂盒可以包括用于混合药物和其它成分，或用于将药物与其它成分一起使用的说明。
药物可以任何形式提供，例如液体、干燥或冻干形式。优选药物是基本上纯的和/或无菌的。当药物以液体溶液提供时，液体溶液优选为水溶液，优选无菌水溶液。当化合物和/或药物以干燥形式提供时，通常通过添加合适的溶剂重构。试剂盒中可以任选地提供溶剂，例如无菌的水或缓冲液。
试剂盒可以包括一个或多个用于包含化合物和/或药物的组合物的容器。在一些实施方案中，试剂盒包含用于药物(例如，在组合物中)和信息材料的分开的容器、分隔器或隔室。例如，药物(例如，在组合物中)可以包含在瓶子、小瓶或注射器中，并且信息材料可以包含在塑料套管或包装中。在其它实施方案中，试剂盒中分开的组分包含在单个未分开的容器中。例如，药物(例如，在组合物中)包含在瓶子、小瓶或注射器中，该瓶子、小瓶或注射器已附接到其上以标签形式的信息材料。在一些实施方案中，试剂盒包括多个(例如，一包)单独容器，每个容器包含药物(例如，在组合物中)的一种或多种单位剂量形式(例如，本文所述的剂型)。例如，该试剂盒包括多个注射器、安瓿、箔包或泡罩包装，每个都包含单个单位剂量的药物。试剂盒的容器可以是气密的和/或防水的。
药物(例如，在组合物中)可以施用于受试者，例如成年受试者，例如需要增强神经元(例如，运动神经元)的存活或活力和/或抑制神经元(例如，运动神经元)的变性和/或抑制神经元(例如，运动神经元)中异常蛋白质积累的受试者。该方法可以包括评估受试者，例如，以评估受试者中神经元TDP-43蛋白病的存在，从而确定受试者可能对本文所述的细胞周期蛋白F-增强剂的治疗敏感。
为了可以容易地理解本发明并将其付诸实践，现在将通过以下非限制性实施例来描述特别优选的实施方案。
实验
细胞周期蛋白F是TDP-43的相互作用配偶体
鉴于细胞周期蛋白F过表达导致神经元样细胞中TDP-43的超泛素化(Williams,Topp等人2016)，我们质疑细胞周期蛋白F是否可以直接负责介导TDP-43的泛素化。因此，我们首先评估了细胞周期蛋白F是否可以结合TDP-43。已知细胞周期蛋白F通过底物上的Cy基序(RxL)结合底物(Dankert,Rona等人2016)。TDP-43的氨基酸序列分析揭示了氨基酸268-27之间的单个RxL基序(图3)。为了确定细胞周期蛋白F是否与TDP-43结合，我们进行了一系列标准免疫沉淀实验。在这里，用编码Flag标记的细胞周期蛋白F和HA标记的TDP-43的构建体转染HEK293细胞。在转染后24小时，裂解细胞并通过免疫沉淀富集Flag-细胞周期蛋白F。洗脱液的免疫印迹分析显示，细胞周期蛋白F与TDP-43共免疫沉淀(图1A)。考虑到磷酸化TDP-43(409/410)与病理性TDP-43内含物特异性相关，还研究了细胞周期蛋白F与磷酸化形式的TDP-43之间的相互作用。因此，使用识别磷酸化TDP-43的抗体通过免疫印迹分析了用细胞周期蛋白F-flag免疫沉淀的裂解物，揭示细胞周期蛋白F也识别全长磷酸化TDP-43(409/410)(图1B)。
为了确定细胞周期蛋白F是否通过存在于所有已知细胞周期蛋白F底物中的典型RxL基序与TDP-43相互作用，将表达野生型TDP-43或变体TDP-43(RxL>AxA)的构建体转染到HEK293细胞中(图1C)。24小时后，裂解细胞，使Flag-细胞周期蛋白F免疫沉淀并通过免疫印迹分析TDP-43。野生型和携带RxL>AxA突变的TDP-43与细胞周期蛋白F共免疫沉淀，表明结合区域独立于RxL基序(图1D)。与该数据一致，我们还使用全长细胞周期蛋白F和用myc标记的TDP-43的截短片段进行了免疫沉淀(图1E)。TDP-43的N末端和C末端片段与Flag-细胞周期蛋白F一起过表达，裂解细胞并通过免疫沉淀富集TDP-43。在这里，TDP-43的N末端片段(1-161)而不是C末端片段(167-414)与细胞周期蛋白F共免疫沉淀，进一步表明细胞周期蛋白F和TDP-43之间的相互作用独立于TDP-43中的RxL基序(图1F)。
细胞周期蛋白F直接结合并介导TDP-43的泛素化
由于细胞周期蛋白F不通过典型的RxL基序与TDP-43相互作用，本发明人质疑细胞周期蛋白F和TDP-43之间的相互作用是否确实是直接相互作用。因此，他们使用重组细胞周期蛋白F-GST和His-TDP-43进行了一系列下拉研究。在这里，产生了全长TDP-43和GST标记的细胞周期蛋白F的全长和截短片段(图2A)，并在使用Ni-NTA磁珠分离His标记的TDP-43与共相互作用蛋白之前一起孵育。这些下拉研究的结果表明，细胞周期蛋白F确实直接与TDP-43相互作用(图2B)。此外，细胞周期蛋白F的细胞周期蛋白结构域负责与TDP-43直接结合(图2C)，这一结果已通过微尺度热泳(MST)验证(图4)。
在先前的研究中，已经显示细胞周期蛋白F使用其细胞周期蛋白结构域内的MRYIL序列结合底物(Klein等人,2015)。该结构域出现在本文SEQ ID NO：2的氨基酸残基309-313处。因此，在细胞周期蛋白结构域(SEQ ID NO：2的氨基酸残基309-310)中引入了MR>AA替换以干扰相互作用。MR/AA变体的氨基酸序列在SEQ ID NO：7中所示。与细胞周期蛋白F通过非典型相互作用与TDP-43结合的概念一致，MR>AA替换不影响重组细胞周期蛋白F和TDP-43之间的结合(图2C)。
尽管非典型结合，本发明人评估了TDP-43是否是细胞周期蛋白F的直接泛素化底物(不同于相互作用蛋白质)。为此，他们开发了一种体外E3连接酶泛素化测定，其中包含蛋白质泛素化的所有必要成分。首先，将Flag标记的细胞周期蛋白F转染到HEK293细胞中，并用抗Flag抗体免疫沉淀细胞周期蛋白F。本发明人先前已经证明，使用这种方法，细胞周期蛋白F与SCF复合物的其它组分(Skp1、Cul 1和Rbx1)一起共免疫沉淀，并且这共同保留了E3连接酶活性。然后在使用重组His-TDP-43作为底物的体外泛素化测定中使用免疫沉淀的细胞周期蛋白F(SCF细胞周期蛋白F)。本文提供的结果表明，SCF细胞周期蛋白F能够在体外介导重组TDP-43的多泛素化(图2D)。相反，使用不形成活性泛素连接酶的细胞周期蛋白F(LP/AA)对泛素化TDP-43的水平没有影响(图2D)。总之，这些数据表明TDP-43是SCF细胞周期蛋白F的直接泛素化底物。
TDP-43蛋白病几乎见于所有ALS病例和超过一半的FTD病例(Ling,Polymenidou等人,2013)。在许多情况下，发现TDP-43在细胞质聚集体中积累时会从细胞核中耗尽。这表明功能性TDP-43的丧失可能是ALS/FTD发病机制的一个促成因素。因此，在确定导致TDP-43异常细胞质积累和聚集的分子机制方面存在相当大的兴趣。值得注意的是，TDP-43存在于死后患者组织的细胞质包涵体中的一个特征是超泛素化，这被认为反映了TDP-43蛋白酶体清除的破坏。因此，对TDP-43泛素化和清除的内源性通路的鉴定具有相当大的意义。
本发明人现在首次报道导致TDP-43泛素化和随后蛋白酶体降解的ALS相关分子通路。他们提供了一系列生化数据(免疫沉淀，MST)，共同证明细胞周期蛋白F与TDP-43结合，随后SCF细胞周期蛋白F复合物使TDP-43泛素化。令人惊讶的是，他们发现这种相互作用是非典型的，因为它独立于对于所有已知细胞周期蛋白F底物报道的R-X-L基序和细胞周期蛋白F中的MRYIL底物识别基序发生。认为这代表了负责TDP-43清除的特定UPS介导的通路的首次体内报道。
小鼠中的细胞周期蛋白F过表达导致不溶性TDP-43物质的清除率提高
为了确定细胞周期蛋白F过表达在小鼠中枢神经系统中的影响，将AAV9-PHP.B用于在8个月内在野生型小鼠的神经元(突触蛋白启动子)中特异性递送细胞周期蛋白F或空载体对照的表达。从这些小鼠获得死后运动皮层，并通过免疫印迹分析RIPA可溶性和RIPA不溶性TDP-43的存在。如图5A所示，如预期的在43kDa处观察到了对应于TDP-43的条带。此外，还检测到更高分子量的物质，表明存在泛素化的TDP-43物质。免疫印迹的光密度分析显示，相对于对照，在过表达细胞周期蛋白F的小鼠中，单体和泛素化TDP-43均显著降低。
TDP-43转基因斑马鱼中mRNA介导的CCNF过表达
在运动神经元中表达GFP标记的人野生型TDP-43的转基因斑马鱼用于评估CCNF相互作用。图6中显示的结果表明，注射编码野生型人细胞周期蛋白F的mRNA会导致人TDP-43的核水平降低，而注射编码非活性细胞周期蛋白F(IP/AA)变体的mRNA(会与TDP-43结合但未能泛素化)不会导致人TDP-43减少。
材料和方法
质粒和克隆
如先前所述使用编码融合到N末端标签(例如荧光团或肽纯化标签)的野生型和S621G CCNF cDNA的表达构建体(Williams等人Nature Communications 7:11253(2016)；Lee等人Cell Mol Life Sci.75(2):335-354(2018)；Hogan等人Hum Mol Genet.28(4):698(2019))。
将融合到C末端Flag标签的野生型和S621G CCNF cDNA克隆到pcDNA3.1载体中。将编码GST标记的细胞周期蛋白F或细胞周期蛋白F的细胞周期蛋白框的基因序列克隆到pGEX5载体中。
细胞培养
使用的HEK293、Neuro-2a、SHSY5Y和NSC-34细胞维持在具有10％FBS和抗生素(100mg/mL链霉素和100U/mL青霉素)的DMEM中。所有细胞都保持在37℃、5％CO2和95％湿度的培养箱中。HEK293 Flp-In T-Rex细胞(Thermo)保持在类似条件下。用Zeocin维持细胞，直到用Flp重组酶转染细胞，然后使用潮霉素和杀稻瘟菌素选择经转染的细胞。
Flag和mCherry亲和纯化
使用Lipofectamine 2000用编码mCherry-细胞周期蛋白F、Flag-细胞周期蛋白F或TDP-43-HA的构建体转染HEK293或Neuro-2A细胞。24小时后收获经转染的细胞并将细胞沉淀重悬于NP40裂解缓冲液(1％(v/v)Nonidet P-40、Tris缓冲盐水(TBS)、2mM EDTA、完整蛋白酶抑制剂混合物和phosSTOP(Roche))中。对细胞重悬液进行探头超声处理(10秒，设置3，Branson Sonifier 450)以破坏蛋白质聚集体。将所得裂解物在14,000×g下离心30分钟以去除细胞碎片。将每种上清液的500μg等分试样与2μg抗Flag M2(Sigma)、1μg抗mCherry(Clonetech)或1μg抗TDP-43(Abnova)在4℃孵育1小时。为了捕获抗体-蛋白质复合物，将上清液与蛋白A/G磁珠(Pierce)在4℃孵育2小时。使用磁体收集珠粒并在NP40裂解缓冲液中洗涤3次。对于蛋白质印迹分析，将珠粒重悬在包含30mM DTT的1×LDS缓冲液中，并在95℃煮沸5分钟。
SDS PAGE和免疫印迹
在4-12％Bis-Tris SDS PAGE凝胶上分离等量的蛋白质。使用Trans-blot Turbo半干转移池将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。膜在PBST中的5％奶粉中封闭半小时，然后与一抗在4℃孵育过夜或在室温孵育1小时。本研究中使用的一抗是：兔多克隆抗细胞周期蛋白F(1:300；cat#sc-952，Santa Cruz Biotechnology)、小鼠单克隆抗mCherry(1:300；cat#632543，Clonetech)、小鼠单克隆抗TDP-43(1:1000；cat#H00023435-M01,Abnova)、小鼠单克隆β-微管蛋白(1:1000；cat#T5168,Sigma)。孵育后，将膜在PBS-T中洗涤3次，每次10分钟，然后在室温应用荧光标记的IRDye 800CW山羊抗兔IgG(1:15,000；cat#926-32211，LI-COR)二抗30分钟。使用Li-Cor Odyssey成像系统在适当的波长下对蛋白质进行成像。
产生用于下拉研究的重组蛋白
将编码GST标记的细胞周期蛋白F的基因序列克隆到pGEX5载体中。编码细胞周期蛋白F的细胞周期蛋白结构域(aa 302-497)的构建体也克隆到pGEX5载体中。还将MR/AA突变引入细胞周期蛋白结构域。这发生在氨基酸309-313处的疏水片(序列MRYIL)中。所有得到的构建体都单独转化到Rosetta密码子加BL21大肠杆菌中，以产生重组蛋白。在诱导重组蛋白表达之前，用转化的Rosetta大肠杆菌BL21的单个菌落接种5mL LB肉汤(含氨苄青霉素和氯霉素)，并在轨道摇床上于37℃生长。17小时后，用起始培养物接种400mL LB培养基(含氨苄青霉素和氯霉素)。该培养物在37℃生长6-7小时。在18℃，用0.13mM IPTG诱导蛋白质表达，过夜。将收获的细胞在包含0.2％NP40和蛋白酶抑制剂片剂(Roche)的冰冷2X PBS(pH7.4)中通过超声处理(Bioruptor)裂解。以14,000×g离心后，将澄清的裂解物与(GEHealthcare)的GST琼脂糖基质珠粒一起孵育45分钟，然后用冰冷的2×PBS洗涤柱5次。使用洗脱缓冲液(50mM tris(pH 8)中的10mM还原型谷胱甘肽，1mM DTT)洗脱经纯化的蛋白质。为了去除谷胱甘肽，经纯化的蛋白质在透析缓冲液(50mM Tris(pH 8)、150mM NaCl、1mMDTT)中在4℃透析过夜。
免疫荧光显微镜
HEK293、NSC-34或Neuro2a细胞在盖玻片上生长，然后使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)用编码mCherry-细胞周期蛋白F、HA-细胞周期蛋白F、Flag-细胞周期蛋白F、TDP-43-HA或空载体的适当构建体转染。24小时后，将细胞在4％甲醛中固定15分钟，然后在PBS中洗涤。将细胞使用包含0.2％Triton X-100的PBS透化10分钟，然后使用包含0.2M甘氨酸的1％BSA-PBST封闭30分钟。将透化细胞与1:1000抗TDP-43(ProteinTech)、抗myc或抗HA在4℃孵育过夜。然后将样品与物种特异性1:500Alexa Fluor 488或647一起孵育，细胞核用Hoechst核染料染色。使用Zeiss AxioImager显微镜获得mCherry-细胞周期蛋白F和TDP-43表达细胞的荧光图像。
微尺度热泳(MST)
将重组His标记的TDP-43(Julie Atkin教授实验室的礼物)在PBS-T缓冲液(137mMNaCl、2.5mM KCl、10mM Na2HPO4、2mM KH2PO4，pH 7.4；0.05％(v/v)Tween-20)中稀释至200nM。RED-tris-NTA染料在PBS-T中稀释至100nM。对于标记，将重组蛋白和经稀释的染料以1:1的体积比混合，并在室温下孵育30分钟。在分析之前，重组细胞周期蛋白F-GST也在PBS-T缓冲液中稀释。细胞周期蛋白F-GST(细胞周期蛋白盒)的浓度范围为0-22μM。在进行MST测量之前，将样品在4℃以14,000xg离心10分钟。所有MST测量均在NanoTemperMonolithTMNT.115仪器上使用标准处理过的毛细管在室温进行。25nM的最终染料浓度在50％的LED功率下产生约300个计数的荧光强度。因此，MST功率范围在40-60％强度之间，激光开启时间为30秒，激光关闭时间为5秒。所有数据均通过MO Affinity AnalysisSoftware进行分析。
下拉测定
将重组全长细胞周期蛋白F或细胞周期蛋白F的重组细胞周期蛋白框与重组全长TDP-43在冰冷的PBS中在旋转的同时在4℃孵育4小时。此后，将预洗过的Ni-NTA磁珠添加到混合物中1小时，并在旋转的同时在4℃孵育。然后将珠粒从混合物中分离出来并用PBS洗涤五次，然后将珠粒在2×Laemmli样品缓冲液(BioRad)中在95℃煮沸5分钟。
体外泛素化测定
使用lipofectamine 2000根据制造商的说明用细胞周期蛋白F-Flag、酶促死亡的细胞周期蛋白F(LP/AA)或空载体对照对HEK293细胞进行转染。在包含完整蛋白酶抑制剂混合物的NP40裂解缓冲液(50mM Tris-HCl、150mM NaCl、2mM EDTA、2mM EGTA、1％(v/v)NP-40，pH 7.4)中裂解细胞。使用与磁性蛋白A/G珠粒(Pierce)缀合的抗Flag M2抗体(Sigma)对细胞周期蛋白F进行免疫沉淀。免疫沉淀的蛋白质在裂解缓冲液中洗涤四次，然后在泛素化测定缓冲液(100mM Tris-HCl、10mM MgCl2、0.2mM二硫苏糖醇pH 8)中洗涤两次。泛素化测定在50μL的体积中进行，其中包含1mM ATP、5nM E1(UBA1)、100nM E2(UBE2D3)和2μg生物素化泛素和5μg重组TDP-43。
野生型小鼠中AAV介导的CCNF过表达
将在神经元特异性突触蛋白启动子(AAV-CCNF)控制下编码野生型人CCNF基因(与GFP融合)的AAV9立体定向注射到新生野生型小鼠的脑中。这涉及将1μL AAV颗粒(1×1013vg/mL)注射到4个部位，每个部位双侧进入冷冻麻醉小鼠的脑。实验对照是注射在突触蛋白启动子的控制下仅编码GFP的AAV9。将小鼠在标准饲养条件下饲养8个月，此时用PBS灌注小鼠并收集大脑用于SDS-PAGE和免疫印迹(如上所述)。
TDP-43转基因斑马鱼中mRNA介导的CCNF过表达
在运动神经元中表达GFP标记的人TDP-43的转基因斑马鱼用于评估CCNF相互作用。将荧光(mKate)CCNF RNA(WT,S621G)注射(～2nL)到斑马鱼胚胎的单细胞阶段。使用荧光报告因子对成功注射的幼虫进行验证，并在28.5℃饲养至受精后3-5天。在第3-5天，所有处理组使用相同采集设置捕获GFP阳性脊髓神经元的共聚焦显微镜图像。最大强度投影用于计算脊髓运动神经元的TDP-43荧光强度。将CCNF注射组的TDP-43水平的平均比率(细胞核对比于全细胞强度)与未注射对照组进行比较。分析了每个处理组的四条不同的鱼，每条鱼的脊髓内至少有三个不同的位置(随机)。分析是盲式的。
本文引用的每个专利、专利申请和出版物的公开内容通过引用整体并入本文。
本文对任何参考文献的引用不应被解释为承认这样的参考文献可作为本申请的“现有技术”获得。
在整个说明书中，目的是描述本公开的优选实施方案，而不将本公开限制于任何一个实施方案或特征的特定集合。因此，本领域技术人员将理解，根据本公开内容，在不脱离本公开内容的范围的情况下，可以对示例的特定实施方案进行各种修改和变化。所有这些修改和改变都旨在包括在所附权利要求的范围内。
序列表
<110> 麦考瑞大学（Macquarie University）
<120> 细胞活力的调节
<130> 35548307
<150> AU 2019903956
<151> 2019-10-21
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
ctgcgcctgc gcgagggcta cgcgcgctcc ggccggggcg cgggcgcgct ctcaggcggg 60
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ggattacaag gaggtcctgc tgacgctagt ccctgtggag ctgagaaccc agcacctgtg 1380
cagcttcctc tgcgagctct ccctgctgca caccagcctg tccgcctacg ccccagcccg 1440
cctggctgcc gcagccctgc tcctggccag actgacgcac gggcagacac agccctggac 1500
cactcagctg tgggacctca ccggattctc ctatgaagac ctcattccct gcgtcttgag 1560
cctccataag aagtgcttcc atgatgacgc ccccaaggac tacaggcaag tctctctgac 1620
cgccgtgaag cagcggtttg aggacaagcg ctatggagaa atcagccagg aagaggtgct 1680
gagctacagc cagttgtgtg ctgcattagg agtgacacaa gacagccccg accccccgac 1740
tttcctcagc acaggggaga tccacgcctt cctcagctct ccctcggggc ggagaaccaa 1800
acggaagcgg gagaacagcc tccaggaaga cagaggcagc ttcgttacca cccccactgc 1860
ggagctgtcc agccaggagg agacgctgct gggcagcttc ctcgactgga gcctggactg 1920
ctgctctggc tatgaaggcg accaggagag tgagggcgag aaggagggcg acgtgacagc 1980
tcccagcggc atcctcgatg tcaccgtggt ctacctgaac ccagaacagc attgctgcca 2040
ggaatccagt gatgaggagg cttgtccaga ggacaaggga ccccaggacc cacaggcact 2100
ggcgctggac acccagatcc ctgcaacccc tggacccaaa cccctggtcc gcaccagccg 2160
ggagccaggg aaggacgtca cgacctcagg gtactcctcc gtcagcaccg caagtcccac 2220
aagctccgtg gacggtggct tgggggccct gccccaacct acctcagtgc tgtccctgga 2280
cagtgactcg cacacacagc cctgccacca tcaggccagg aagtcatgtt tacagtgtcg 2340
tcccccaagt cccccggaga gcagtgttcc ccagcaacag gtgaagcgga taaacctatg 2400
catacacagt gaggaggagg acatgaacct gggccttgtg aggctgtaag tgtgtcagca 2460
catttgccgc agtggatgtg tactgagggg gctggaggcg aagggtggga gcatagcata 2520
ggaacgctgc atagaccatg gaggcctttg cgcagagagc agagaggatg acttgcggcc 2580
accaagtttc tgtctccgcg ggagtcccgt gcaagccatc agaatgttga aatgagggtg 2640
aagagctcag atccctctct ttggaaagtt tagcctggaa gcagttggcc acactgtgtg 2700
gagggcacct ctctgtccct tccgtgtctc actgtctctg gaagcttcag cccatgtgtg 2760
tcctggtgtt cccagcccca ccagagcccc gtgccgggag ctgacagctt tcacgcttaa 2820
ggcacgtgtg acctgggtag tcagacacca cttgagcccc tgcccacatc tgctggtttg 2880
gggcttcagt ggggagctga cagctgtgag cacaccactg tcccctcatc cacctcggcc 2940
tgcatggggc acccacttcc ttctgggtgg ggcttccatg gtaagggggc ctgcgtccct 3000
gcacactgcg aggactgcct tggccacagg cccactccct acgacacgtg actcgtttta 3060
gagctctgtc ccagaggcgt tcgtatgtga cccacagatg gcgtcaatgt gaacacctct 3120
ctttgtgctg aatttctggg ccattctttt cctgtcttat ttctaaattt ccttcttcca 3180
agatgaaaac aaaagaaaaa cttaaaacag aaggtattaa aaaaacaaga gattcccacc 3240
attatttagg ttcacctgca aaacaaaaat cttactccag cccctcaatg ccatcctgac 3300
acactttatg caaaaagaat tttcccagat aggctagcca gaaaaaactt caagtcctct 3360
gtaacatctg aggtgaccaa gaggcagaag agcagagcag tcgggggccg tgtcctggct 3420
gatcccaact gcagctctgc tgtgggggcc cgtgggaggg aggcagaccc ctgggctttc 3480
ctgctggcca cggagactct gctcctgcat ggaaagggag cctgggagcc agcagcccac 3540
gcctggggag cctgcctggg gccatgtgac catggcctct ccctgggaac gggctgacca 3600
caacacaccc tgctgccatc cacttctgtt tactctgcaa atgtaagaaa gaaccacttg 3660
gccagaagtg tcccccagat gctttttttt tttttttttt ggagacagtt ttgctcttgt 3720
ctccccggct ggagtgcagt ggcatgatct caactctcaa ctcactgtaa cctccgcctc 3780
ccggatactc ctgcctcagc ctcctgggta gctgggatta caagcaccca accacgccca 3840
gctaattttt gtattttcgg tagagacggg atttcaccat gttggccagg ctagtctcga 3900
actcatgacc tcaagtgatc cgcccacttc ggtctcccaa agtgctggga ttacaggcat 3960
gagccacggc gcctggcccc caaatgctct tgaaccggaa acccagggat gggagatgct 4020
cactgagctg ctgcttttat gtgtgctggt gctatgtgtg ttcatgtccg cggcagctgt 4080
ctttttgcta ctataaggga attctggcca ccctgggtgg ggtgtggtcg gggtgagaac 4140
ccaagcgttg gaactgtaga cccgtcctgt cgactgtgtg cccctgggca tgtgtgagcc 4200
tcagtttcct catctgtaag gggggcaatg atacctacct cacaggggtg ttgtgaggat 4260
taaatgtgag gaggatagtg gcagatg 4287
<210> 2
<211> 2361
<212> DNA
<213> 智人
<400> 2
atggggagcg gcggcgtggt ccactgtagg tgtgccaagt gtttctgtta tcctacaaag 60
cgaagaataa ggaggaggcc ccgaaacctg accatcttga gtctccccga agatgtgctc 120
tttcacatcc tgaaatggct ttctgtagag gacatcctgg ccgtccgagc tgtacactcc 180
cagctgaagg acctggtgga caaccacgcc agtgtgtggg catgtgccag cttccaggag 240
ctgtggccgt ctccagggaa cctgaagctc tttgaaaggg ctgctgaaaa ggggaatttc 300
gaagctgctg tgaagctggg catagcctac ctctacaatg aaggcctgtc tgtgtctgat 360
gaggcccgcg cagaagtgaa tggcctgaag gcctctcgct tcttcagtct cgctgagcgg 420
ctgaatgtgg gtgccgcacc tttcatctgg ctcttcatcc gccctccgtg gtcggtgagc 480
ggaagctgct gcaaggccgt ggttcacgag agcctcaggg cagagtgcca gctgcagagg 540
actcacaaag catccatatt gcactgcttg ggcagagtgc tgagtctgtt cgaggatgag 600
gagaagcagc agcaggccca tgacctgttt gaggaggctg ctcatcaggg atgtctgacc 660
agctcctacc tcctctggga aagcgacagg aggacagatg tgtcagatcc tgggcgatgc 720
ctccacagct tccgaaaact cagggactac gctgccaaag gctgctggga agcgcagctg 780
tctttagcca aagcctgtgc aaatgcaaac cagcttggac tggaggtgag agcttccagt 840
gagatcgtct gccagctatt tcaggcttcc caggctgtca gtaaacaaca agtcttctcc 900
gtgcagaagg gactcaatga cacaatgagg tacattctga tcgactggct ggtggaagtt 960
gccaccatga aggacttcac aagcctgtgc ctgcacctga ccgtggagtg tgtggaccgg 1020
tacctgcgga ggaggctggt gccgcggtac aggctccagc tgctgggcat cgcctgcatg 1080
gtcatctgca cccggtttat cagtaaagag atcctgacca tccgggaggc cgtatggctc 1140
acggacaaca cttacaagta cgaggacctg gtgagaatga tgggcgagat cgtctccgcc 1200
ttggaaggga agattcgagt ccccactgtg gtggattaca aggaggtcct gctgacgcta 1260
gtccctgtgg agctgagaac ccagcacctg tgcagcttcc tctgcgagct ctccctgctg 1320
cacaccagcc tgtccgccta cgccccagcc cgcctggctg ccgcagccct gctcctggcc 1380
agactgacgc acgggcagac acagccctgg accactcagc tgtgggacct caccggattc 1440
tcctatgaag acctcattcc ctgcgtcttg agcctccata agaagtgctt ccatgatgac 1500
gcccccaagg actacaggca agtctctctg accgccgtga agcagcggtt tgaggacaag 1560
cgctatggag aaatcagcca ggaagaggtg ctgagctaca gccagttgtg tgctgcatta 1620
ggagtgacac aagacagccc cgaccccccg actttcctca gcacagggga gatccacgcc 1680
ttcctcagct ctccctcggg gcggagaacc aaacggaagc gggagaacag cctccaggaa 1740
gacagaggca gcttcgttac cacccccact gcggagctgt ccagccagga ggagacgctg 1800
ctgggcagct tcctcgactg gagcctggac tgctgctctg gctatgaagg cgaccaggag 1860
agtgagggcg agaaggaggg cgacgtgaca gctcccagcg gcatcctcga tgtcaccgtg 1920
gtctacctga acccagaaca gcattgctgc caggaatcca gtgatgagga ggcttgtcca 1980
gaggacaagg gaccccagga cccacaggca ctggcgctgg acacccagat ccctgcaacc 2040
cctggaccca aacccctggt ccgcaccagc cgggagccag ggaaggacgt cacgacctca 2100
gggtactcct ccgtcagcac cgcaagtccc acaagctccg tggacggtgg cttgggggcc 2160
ctgccccaac ctacctcagt gctgtccctg gacagtgact cgcacacaca gccctgccac 2220
catcaggcca ggaagtcatg tttacagtgt cgtcccccaa gtcccccgga gagcagtgtt 2280
ccccagcaac aggtgaagcg gataaaccta tgcatacaca gtgaggagga ggacatgaac 2340
ctgggccttg tgaggctgta a 2361
<210> 3
<211> 786
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Met Gly Ser Gly Gly Val Val His Cys Arg Cys Ala Lys Cys Phe Cys
1 5 10 15
Tyr Pro Thr Lys Arg Arg Ile Arg Arg Arg Pro Arg Asn Leu Thr Ile
20 25 30
Leu Ser Leu Pro Glu Asp Val Leu Phe His Ile Leu Lys Trp Leu Ser
35 40 45
Val Glu Asp Ile Leu Ala Val Arg Ala Val His Ser Gln Leu Lys Asp
50 55 60
Leu Val Asp Asn His Ala Ser Val Trp Ala Cys Ala Ser Phe Gln Glu
65 70 75 80
Leu Trp Pro Ser Pro Gly Asn Leu Lys Leu Phe Glu Arg Ala Ala Glu
85 90 95
Lys Gly Asn Phe Glu Ala Ala Val Lys Leu Gly Ile Ala Tyr Leu Tyr
100 105 110
Asn Glu Gly Leu Ser Val Ser Asp Glu Ala Arg Ala Glu Val Asn Gly
115 120 125
Leu Lys Ala Ser Arg Phe Phe Ser Leu Ala Glu Arg Leu Asn Val Gly
130 135 140
Ala Ala Pro Phe Ile Trp Leu Phe Ile Arg Pro Pro Trp Ser Val Ser
145 150 155 160
Gly Ser Cys Cys Lys Ala Val Val His Glu Ser Leu Arg Ala Glu Cys
165 170 175
Gln Leu Gln Arg Thr His Lys Ala Ser Ile Leu His Cys Leu Gly Arg
180 185 190
Val Leu Ser Leu Phe Glu Asp Glu Glu Lys Gln Gln Gln Ala His Asp
195 200 205
Leu Phe Glu Glu Ala Ala His Gln Gly Cys Leu Thr Ser Ser Tyr Leu
210 215 220
Leu Trp Glu Ser Asp Arg Arg Thr Asp Val Ser Asp Pro Gly Arg Cys
225 230 235 240
Leu His Ser Phe Arg Lys Leu Arg Asp Tyr Ala Ala Lys Gly Cys Trp
245 250 255
Glu Ala Gln Leu Ser Leu Ala Lys Ala Cys Ala Asn Ala Asn Gln Leu
260 265 270
Gly Leu Glu Val Arg Ala Ser Ser Glu Ile Val Cys Gln Leu Phe Gln
275 280 285
Ala Ser Gln Ala Val Ser Lys Gln Gln Val Phe Ser Val Gln Lys Gly
290 295 300
Leu Asn Asp Thr Met Arg Tyr Ile Leu Ile Asp Trp Leu Val Glu Val
305 310 315 320
Ala Thr Met Lys Asp Phe Thr Ser Leu Cys Leu His Leu Thr Val Glu
325 330 335
Cys Val Asp Arg Tyr Leu Arg Arg Arg Leu Val Pro Arg Tyr Arg Leu
340 345 350
Gln Leu Leu Gly Ile Ala Cys Met Val Ile Cys Thr Arg Phe Ile Ser
355 360 365
Lys Glu Ile Leu Thr Ile Arg Glu Ala Val Trp Leu Thr Asp Asn Thr
370 375 380
Tyr Lys Tyr Glu Asp Leu Val Arg Met Met Gly Glu Ile Val Ser Ala
385 390 395 400
Leu Glu Gly Lys Ile Arg Val Pro Thr Val Val Asp Tyr Lys Glu Val
405 410 415
Leu Leu Thr Leu Val Pro Val Glu Leu Arg Thr Gln His Leu Cys Ser
420 425 430
Phe Leu Cys Glu Leu Ser Leu Leu His Thr Ser Leu Ser Ala Tyr Ala
435 440 445
Pro Ala Arg Leu Ala Ala Ala Ala Leu Leu Leu Ala Arg Leu Thr His
450 455 460
Gly Gln Thr Gln Pro Trp Thr Thr Gln Leu Trp Asp Leu Thr Gly Phe
465 470 475 480
Ser Tyr Glu Asp Leu Ile Pro Cys Val Leu Ser Leu His Lys Lys Cys
485 490 495
Phe His Asp Asp Ala Pro Lys Asp Tyr Arg Gln Val Ser Leu Thr Ala
500 505 510
Val Lys Gln Arg Phe Glu Asp Lys Arg Tyr Gly Glu Ile Ser Gln Glu
515 520 525
Glu Val Leu Ser Tyr Ser Gln Leu Cys Ala Ala Leu Gly Val Thr Gln
530 535 540
Asp Ser Pro Asp Pro Pro Thr Phe Leu Ser Thr Gly Glu Ile His Ala
545 550 555 560
Phe Leu Ser Ser Pro Ser Gly Arg Arg Thr Lys Arg Lys Arg Glu Asn
565 570 575
Ser Leu Gln Glu Asp Arg Gly Ser Phe Val Thr Thr Pro Thr Ala Glu
580 585 590
Leu Ser Ser Gln Glu Glu Thr Leu Leu Gly Ser Phe Leu Asp Trp Ser
595 600 605
Leu Asp Cys Cys Ser Gly Tyr Glu Gly Asp Gln Glu Ser Glu Gly Glu
610 615 620
Lys Glu Gly Asp Val Thr Ala Pro Ser Gly Ile Leu Asp Val Thr Val
625 630 635 640
Val Tyr Leu Asn Pro Glu Gln His Cys Cys Gln Glu Ser Ser Asp Glu
645 650 655
Glu Ala Cys Pro Glu Asp Lys Gly Pro Gln Asp Pro Gln Ala Leu Ala
660 665 670
Leu Asp Thr Gln Ile Pro Ala Thr Pro Gly Pro Lys Pro Leu Val Arg
675 680 685
Thr Ser Arg Glu Pro Gly Lys Asp Val Thr Thr Ser Gly Tyr Ser Ser
690 695 700
Val Ser Thr Ala Ser Pro Thr Ser Ser Val Asp Gly Gly Leu Gly Ala
705 710 715 720
Leu Pro Gln Pro Thr Ser Val Leu Ser Leu Asp Ser Asp Ser His Thr
725 730 735
Gln Pro Cys His His Gln Ala Arg Lys Ser Cys Leu Gln Cys Arg Pro
740 745 750
Pro Ser Pro Pro Glu Ser Ser Val Pro Gln Gln Gln Val Lys Arg Ile
755 760 765
Asn Leu Cys Ile His Ser Glu Glu Glu Asp Met Asn Leu Gly Leu Val
770 775 780
Arg Leu
785
<210> 4
<211> 4196
<212> DNA
<213> 智人
<400> 4
ggtctgcgcc tgcgcgaggg ctacgcgcgc tccggccggg gcgcgggcgc gctctcaggc 60
gggctccggc ggcagcgacg cgagcgcggc gatggggagc ggcggcgtgg tccactgtag 120
gtgtgccaag tgtttctgtt atcctacaaa gcgaagaata aggaggaggc cccgaaacct 180
gaccatcttg agtctccccg aagatgtgct ctttcacatc ctgaaatggc tttctgtaga 240
ggacatcctg gccgtccgag ctggctgctg aaaaggggaa tttcgaagct gctgtgaagc 300
tgggcatagc ctacctctac aatgaaggcc tgtctgtgtc tgatgaggcc cgcgcagaag 360
tgaatggcct gaaggcctct cgcttcttca gtctcgctga gcggctgaat gtgggtgccg 420
cacctttcat ctggctcttc atccgccctc cgtggtcggt gagcggaagc tgctgcaagg 480
ccgtggttca cgagagcctc agggcagagt gccagctgca gaggactcac aaagcatcca 540
tattgcactg cttgggcaga gtgctgagtc tgttcgagga tgaggagaag cagcagcagg 600
cccatgacct gtttgaggag gctgctcatc agggatgtct gaccagctcc tacctcctct 660
gggaaagcga caggaggaca gatgtgtcag atcctgggcg atgcctccac agcttccgaa 720
aactcaggga ctacgctgcc aaaggctgct gggaagcgca gctgtcttta gccaaagcct 780
gtgcaaatgc aaaccagctt ggactggagg tgagagcttc cagtgagatc gtctgccagc 840
tatttcaggc ttcccaggct gtcagtaaac aacaagtctt ctccgtgcag aagggactca 900
atgacacaat gaggtacatt ctgatcgact ggctggtgga agttgccacc atgaaggact 960
tcacaagcct gtgcctgcac ctgaccgtgg agtgtgtgga ccggtacctg cggaggaggc 1020
tggtgccgcg gtacaggctc cagctgctgg gcatcgcctg catggtcatc tgcacccggt 1080
ttatcagtaa agagatcctg accatccggg aggccgtatg gctcacggac aacacttaca 1140
agtacgagga cctggtgaga atgatgggcg agatcgtctc cgccttggaa gggaagattc 1200
gagtccccac tgtggtggat tacaaggagg tcctgctgac gctagtccct gtggagctga 1260
gaacccagca cctgtgcagc ttcctctgcg agctctccct gctgcacacc agcctgtccg 1320
cctacgcccc agcccgcctg gctgccgcag ccctgctcct ggccagactg acgcacgggc 1380
agacacagcc ctggaccact cagctgtggg acctcaccgg attctcctat gaagacctca 1440
ttccctgcgt cttgagcctc cataagaagt gcttccatga tgacgccccc aaggactaca 1500
ggcaagtctc tctgaccgcc gtgaagcagc ggtttgagga caagcgctat ggagaaatca 1560
gccaggaaga ggtgctgagc tacagccagt tgtgtgctgc attaggagtg acacaagaca 1620
gccccgaccc cccgactttc ctcagcacag gggagatcca cgccttcctc agctctccct 1680
cggggcggag aaccaaacgg aagcgggaga acagcctcca ggaagacaga ggcagcttcg 1740
ttaccacccc cactgcggag ctgtccagcc aggaggagac gctgctgggc agcttcctcg 1800
actggagcct ggactgctgc tctggctatg aaggcgacca ggagagtgag ggcgagaagg 1860
agggcgacgt gacagctccc agcggcatcc tcgatgtcac cgtggtctac ctgaacccag 1920
aacagcattg ctgccaggaa tccagtgatg aggaggcttg tccagaggac aagggacccc 1980
aggacccaca ggcactggcg ctggacaccc agatccctgc aacccctgga cccaaacccc 2040
tggtccgcac cagccgggag ccagggaagg acgtcacgac ctcagggtac tcctccgtca 2100
gcaccgcaag tcccacaagc tccgtggacg gtggcttggg ggccctgccc caacctacct 2160
cagtgctgtc cctggacagt gactcgcaca cacagccctg ccaccatcag gccaggaagt 2220
catgtttaca gtgtcgtccc ccaagtcccc cggagagcag tgttccccag caacaggtga 2280
agcggataaa cctatgcata cacagtgagg aggaggacat gaacctgggc cttgtgaggc 2340
tgtaagtgtg tcagcacatt tgccgcagtg gatgtgtact gagggggctg gaggcgaagg 2400
gtgggagcat agcataggaa cgctgcatag accatggagg cctttgcgca gagagcagag 2460
aggatgactt gcggccacca agtttctgtc tccgcgggag tcccgtgcaa gccatcagaa 2520
tgttgaaatg agggtgaaga gctcagatcc ctctctttgg aaagtttagc ctggaagcag 2580
ttggccacac tgtgtggagg gcacctctct gtcccttccg tgtctcactg tctctggaag 2640
cttcagccca tgtgtgtcct ggtgttccca gccccaccag agccccgtgc cgggagctga 2700
cagctttcac gcttaaggca cgtgtgacct gggtagtcag acaccacttg agcccctgcc 2760
cacatctgct ggtttggggc ttcagtgggg agctgacagc tgtgagcaca ccactgtccc 2820
ctcatccacc tcggcctgca tggggcaccc acttccttct gggtggggct tccatggtaa 2880
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cacgtgactc gttttagagc tctgtcccag aggcgttcgt atgtgaccca cagatggcgt 3000
caatgtgaac acctctcttt gtgctgaatt tctgggccat tcttttcctg tcttatttct 3060
aaatttcctt cttccaagat gaaaacaaaa gaaaaactta aaacagaagg tattaaaaaa 3120
acaagagatt cccaccatta tttaggttca cctgcaaaac aaaaatctta ctccagcccc 3180
tcaatgccat cctgacacac tttatgcaaa aagaattttc ccagataggc tagccagaaa 3240
aaacttcaag tcctctgtaa catctgaggt gaccaagagg cagaagagca gagcagtcgg 3300
gggccgtgtc ctggctgatc ccaactgcag ctctgctgtg ggggcccgtg ggagggaggc 3360
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ggagccagca gcccacgcct ggggagcctg cctggggcca tgtgaccatg gcctctccct 3480
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ctgtaacctc cgcctcccgg atactcctgc ctcagcctcc tgggtagctg ggattacaag 3720
cacccaacca cgcccagcta atttttgtat tttcggtaga gacgggattt caccatgttg 3780
gccaggctag tctcgaactc atgacctcaa gtgatccgcc cacttcggtc tcccaaagtg 3840
ctgggattac aggcatgagc cacggcgcct ggcccccaaa tgctcttgaa ccggaaaccc 3900
agggatggga gatgctcact gagctgctgc ttttatgtgt gctggtgcta tgtgtgttca 3960
tgtccgcggc agctgtcttt ttgctactat aagggaattc tggccaccct gggtggggtg 4020
tggtcggggt gagaacccaa gcgttggaac tgtagacccg tcctgtcgac tgtgtgcccc 4080
tgggcatgtg tgagcctcag tttcctcatc tgtaaggggg gcaatgatac ctacctcaca 4140
ggggtgttgt gaggattaaa tgtgaggagg atagtggcaa aaaaaaaaaa aaaaaa 4196
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<211> 1437
<212> DNA
<213> 智人
<400> 5
atgaggtaca ttctgatcga ctggctggtg gaagttgcca ccatgaagga cttcacaagc 60
ctgtgcctgc acctgaccgt ggagtgtgtg gaccggtacc tgcggaggag gctggtgccg 120
cggtacaggc tccagctgct gggcatcgcc tgcatggtca tctgcacccg gtttatcagt 180
aaagagatcc tgaccatccg ggaggccgta tggctcacgg acaacactta caagtacgag 240
gacctggtga gaatgatggg cgagatcgtc tccgccttgg aagggaagat tcgagtcccc 300
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cacctgtgca gcttcctctg cgagctctcc ctgctgcaca ccagcctgtc cgcctacgcc 420
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ccctggacca ctcagctgtg ggacctcacc ggattctcct atgaagacct cattccctgc 540
gtcttgagcc tccataagaa gtgcttccat gatgacgccc ccaaggacta caggcaagtc 600
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gaggtgctga gctacagcca gttgtgtgct gcattaggag tgacacaaga cagccccgac 720
cccccgactt tcctcagcac aggggagatc cacgccttcc tcagctctcc ctcggggcgg 780
agaaccaaac ggaagcggga gaacagcctc caggaagaca gaggcagctt cgttaccacc 840
cccactgcgg agctgtccag ccaggaggag acgctgctgg gcagcttcct cgactggagc 900
ctggactgct gctctggcta tgaaggcgac caggagagtg agggcgagaa ggagggcgac 960
gtgacagctc ccagcggcat cctcgatgtc accgtggtct acctgaaccc agaacagcat 1020
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caggcactgg cgctggacac ccagatccct gcaacccctg gacccaaacc cctggtccgc 1140
accagccggg agccagggaa ggacgtcacg acctcagggt actcctccgt cagcaccgca 1200
agtcccacaa gctccgtgga cggtggcttg ggggccctgc cccaacctac ctcagtgctg 1260
tccctggaca gtgactcgca cacacagccc tgccaccatc aggccaggaa gtcatgttta 1320
cagtgtcgtc ccccaagtcc cccggagagc agtgttcccc agcaacaggt gaagcggata 1380
aacctatgca tacacagtga ggaggaggac atgaacctgg gccttgtgag gctgtaa 1437
<210> 6
<211> 478
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Met Arg Tyr Ile Leu Ile Asp Trp Leu Val Glu Val Ala Thr Met Lys
1 5 10 15
Asp Phe Thr Ser Leu Cys Leu His Leu Thr Val Glu Cys Val Asp Arg
20 25 30
Tyr Leu Arg Arg Arg Leu Val Pro Arg Tyr Arg Leu Gln Leu Leu Gly
35 40 45
Ile Ala Cys Met Val Ile Cys Thr Arg Phe Ile Ser Lys Glu Ile Leu
50 55 60
Thr Ile Arg Glu Ala Val Trp Leu Thr Asp Asn Thr Tyr Lys Tyr Glu
65 70 75 80
Asp Leu Val Arg Met Met Gly Glu Ile Val Ser Ala Leu Glu Gly Lys
85 90 95
Ile Arg Val Pro Thr Val Val Asp Tyr Lys Glu Val Leu Leu Thr Leu
100 105 110
Val Pro Val Glu Leu Arg Thr Gln His Leu Cys Ser Phe Leu Cys Glu
115 120 125
Leu Ser Leu Leu His Thr Ser Leu Ser Ala Tyr Ala Pro Ala Arg Leu
130 135 140
Ala Ala Ala Ala Leu Leu Leu Ala Arg Leu Thr His Gly Gln Thr Gln
145 150 155 160
Pro Trp Thr Thr Gln Leu Trp Asp Leu Thr Gly Phe Ser Tyr Glu Asp
165 170 175
Leu Ile Pro Cys Val Leu Ser Leu His Lys Lys Cys Phe His Asp Asp
180 185 190
Ala Pro Lys Asp Tyr Arg Gln Val Ser Leu Thr Ala Val Lys Gln Arg
195 200 205
Phe Glu Asp Lys Arg Tyr Gly Glu Ile Ser Gln Glu Glu Val Leu Ser
210 215 220
Tyr Ser Gln Leu Cys Ala Ala Leu Gly Val Thr Gln Asp Ser Pro Asp
225 230 235 240
Pro Pro Thr Phe Leu Ser Thr Gly Glu Ile His Ala Phe Leu Ser Ser
245 250 255
Pro Ser Gly Arg Arg Thr Lys Arg Lys Arg Glu Asn Ser Leu Gln Glu
260 265 270
Asp Arg Gly Ser Phe Val Thr Thr Pro Thr Ala Glu Leu Ser Ser Gln
275 280 285
Glu Glu Thr Leu Leu Gly Ser Phe Leu Asp Trp Ser Leu Asp Cys Cys
290 295 300
Ser Gly Tyr Glu Gly Asp Gln Glu Ser Glu Gly Glu Lys Glu Gly Asp
305 310 315 320
Val Thr Ala Pro Ser Gly Ile Leu Asp Val Thr Val Val Tyr Leu Asn
325 330 335
Pro Glu Gln His Cys Cys Gln Glu Ser Ser Asp Glu Glu Ala Cys Pro
340 345 350
Glu Asp Lys Gly Pro Gln Asp Pro Gln Ala Leu Ala Leu Asp Thr Gln
355 360 365
Ile Pro Ala Thr Pro Gly Pro Lys Pro Leu Val Arg Thr Ser Arg Glu
370 375 380
Pro Gly Lys Asp Val Thr Thr Ser Gly Tyr Ser Ser Val Ser Thr Ala
385 390 395 400
Ser Pro Thr Ser Ser Val Asp Gly Gly Leu Gly Ala Leu Pro Gln Pro
405 410 415
Thr Ser Val Leu Ser Leu Asp Ser Asp Ser His Thr Gln Pro Cys His
420 425 430
His Gln Ala Arg Lys Ser Cys Leu Gln Cys Arg Pro Pro Ser Pro Pro
435 440 445
Glu Ser Ser Val Pro Gln Gln Gln Val Lys Arg Ile Asn Leu Cys Ile
450 455 460
His Ser Glu Glu Glu Asp Met Asn Leu Gly Leu Val Arg Leu
465 470 475
<210> 7
<211> 786
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 7
Met Gly Ser Gly Gly Val Val His Cys Arg Cys Ala Lys Cys Phe Cys
1 5 10 15
Tyr Pro Thr Lys Arg Arg Ile Arg Arg Arg Pro Arg Asn Leu Thr Ile
20 25 30
Leu Ser Leu Pro Glu Asp Val Leu Phe His Ile Leu Lys Trp Leu Ser
35 40 45
Val Glu Asp Ile Leu Ala Val Arg Ala Val His Ser Gln Leu Lys Asp
50 55 60
Leu Val Asp Asn His Ala Ser Val Trp Ala Cys Ala Ser Phe Gln Glu
65 70 75 80
Leu Trp Pro Ser Pro Gly Asn Leu Lys Leu Phe Glu Arg Ala Ala Glu
85 90 95
Lys Gly Asn Phe Glu Ala Ala Val Lys Leu Gly Ile Ala Tyr Leu Tyr
100 105 110
Asn Glu Gly Leu Ser Val Ser Asp Glu Ala Arg Ala Glu Val Asn Gly
115 120 125
Leu Lys Ala Ser Arg Phe Phe Ser Leu Ala Glu Arg Leu Asn Val Gly
130 135 140
Ala Ala Pro Phe Ile Trp Leu Phe Ile Arg Pro Pro Trp Ser Val Ser
145 150 155 160
Gly Ser Cys Cys Lys Ala Val Val His Glu Ser Leu Arg Ala Glu Cys
165 170 175
Gln Leu Gln Arg Thr His Lys Ala Ser Ile Leu His Cys Leu Gly Arg
180 185 190
Val Leu Ser Leu Phe Glu Asp Glu Glu Lys Gln Gln Gln Ala His Asp
195 200 205
Leu Phe Glu Glu Ala Ala His Gln Gly Cys Leu Thr Ser Ser Tyr Leu
210 215 220
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225 230 235 240
Leu His Ser Phe Arg Lys Leu Arg Asp Tyr Ala Ala Lys Gly Cys Trp
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260 265 270
Gly Leu Glu Val Arg Ala Ser Ser Glu Ile Val Cys Gln Leu Phe Gln
275 280 285
Ala Ser Gln Ala Val Ser Lys Gln Gln Val Phe Ser Val Gln Lys Gly
290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
Tyr Lys Tyr Glu Asp Leu Val Arg Met Met Gly Glu Ile Val Ser Ala
385 390 395 400
Leu Glu Gly Lys Ile Arg Val Pro Thr Val Val Asp Tyr Lys Glu Val
405 410 415
Leu Leu Thr Leu Val Pro Val Glu Leu Arg Thr Gln His Leu Cys Ser
420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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Asn Leu Cys Ile His Ser Glu Glu Glu Asp Met Asn Leu Gly Leu Val
770 775 780
Arg Leu
785

Claims (35)

1.一种用于增强神经元的存活的方法，所述方法包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：无论所述神经元的内源性细胞周期蛋白F的水平或活性如何，增加所述神经元中的细胞周期蛋白F的水平，从而增强所述神经元的存活。
2.一种用于抑制神经元的变性的方法，所述方法包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：无论所述神经元的内源性细胞周期蛋白F的水平或活性如何，增加所述神经元中的细胞周期蛋白F的水平，从而抑制所述神经元的变性。
3.一种用于抑制神经元中的异常蛋白质积累的方法，所述方法包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：无论所述神经元的内源性细胞周期蛋白F的水平或活性如何，增加所述神经元中的细胞周期蛋白F的水平，从而抑制所述神经元中的异常蛋白质积累。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述异常蛋白质积累包括对蛋白质积累或聚集敏感的一种或多种蛋白质的积累。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述蛋白质是TDP-43。
6.一种用于抑制神经元中的聚集的或不可溶性TDP-43积累的方法，所述方法包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：无论所述神经元的内源性细胞周期蛋白F的水平或活性如何，增加所述神经元中的细胞周期蛋白F的水平，从而抑制所述神经元中的聚集的或不可溶性TDP-43积累。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述神经元在患有神经退行性疾病或处于发展为神经退行性疾病的风险的受试者中。
8.一种用于治疗患有神经退行性疾病或处于发展为神经退行性疾病的风险的受试者的方法，所述方法包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：无论神经元的内源性细胞周期蛋白F的水平或活性如何，增加所述受试者的神经元中的细胞周期蛋白F的水平。
9.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其中所述神经退行性疾病与神经元TDP-43蛋白病相关。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，其中所述受试者患有家族性神经退行性疾病。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述家族性神经退行性疾病选自家族性ALS、家族性FTD和家族性AD。
12.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，其中所述受试者患有散发性神经退行性疾病。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述散发性神经退行性疾病选自散发性ALS、散发性FTD和散发性AD。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，包括在所述神经元中过表达细胞周期蛋白F的编码序列。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述编码序列包含如SEQ ID No：1、2、4或5中所示的核酸序列，编码如SEQ ID NO：3、6或7中所示的氨基酸序列的核酸序列，或与其具有至少约80％序列同一性的核酸序列。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述神经元不具有相对于对照降低的内源性细胞周期蛋白F的水平或活性。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述神经元具有相对于对照正常的内源性细胞周期蛋白F的水平或活性。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，在增加所述神经元中的细胞周期蛋白F的水平之前，没有检测所述神经元中内源性细胞周期蛋白F的水平或活性相对于对照降低的步骤。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，在增加所述神经元中的细胞周期蛋白F的水平之前，还包括检测所述神经元中内源性细胞周期蛋白F相对于对照的水平或活性，其不是所述神经元中内源性细胞周期蛋白F的水平或活性相对于所述对照降低。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，在增加所述神经元中的细胞周期蛋白F的水平之前，还包括检测所述神经元中内源性细胞周期蛋白F相对于对照正常的水平或活性。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，包括使所述神经元与增加所述神经元中细胞周期蛋白F的水平的药物接触。
22.根据权利要求7至21中任一项所述的方法，包括向所述受试者施用有效量的所述药物。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其中所述药物包含构建体，所述构建体包含与在所述神经元中可操纵的启动子可操纵地连接的编码细胞周期蛋白F的核苷酸序列。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述构建体包含在递送载具中。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述递送载具是病毒载体。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述病毒载体选自腺相关病毒载体(AAV)、慢病毒载体、腺病毒载体和单纯疱疹病毒载体。
27.根据权利要求25或权利要求26所述的方法，其中所述病毒载体是嗜神经病毒载体。
28.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其中所述病毒载体选自rAAV2/1、rAAV2/8和rAAV2/9。
29.根据权利要求24所述的方法，其中所述递送载具是非病毒载体。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述非病毒载体选自大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒和包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体的基于脂质的体系。
31.根据权利要求1至31中任一项所述的方法，其中所述神经元是运动神经元。
32.一种增加神经元中细胞周期蛋白F的水平的药物，用于在治疗或抑制与神经元TDP-43蛋白病相关的神经退行性疾病的发展中使用，而无论所述神经元的内源性细胞周期蛋白F的水平或活性如何。
33.增加神经元中细胞周期蛋白F的水平的药物在制备药剂中的用途，所述药剂用于治疗或抑制与神经元TDP-43蛋白病相关的神经退行性疾病的发展，而无论所述神经元的内源性细胞周期蛋白F的水平或活性如何。
34.一种试剂盒，包含增加神经元中细胞周期蛋白F的水平的药物，用于在治疗或抑制与神经元TDP-43蛋白病相关的神经退行性疾病的发展中使用，而无论所述神经元的内源性细胞周期蛋白F的水平或活性如何。
35.根据权利要求34所述的试剂盒，还包含用于实施所述方法的指导材料。
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