CN103827671B - 用于检测神经疾病的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供预测受试者是否将发展能够影响认知功能的疾病的方法。更确切地讲，本发明涉及预测性检测受试者的神经疾病。所提供的方法和系统使得能够基于生物流体中的生物标志物的测量来定量评价并且理论预测新皮质淀粉样蛋白负荷或β淀粉样蛋白水平，该定量评价和理论预测将提供受试者是否可能发展神经疾病如阿兹海默病（AD）的指示。

Description

用于检测神经疾病的方法

发明领域

本发明涉及用于预测影响认知功能的神经疾病的预后的方法。更确切地讲，本发明涉及受试者的与淀粉样蛋白负荷升高相关的神经疾病如阿兹海默氏病的预后检测。

发明背景

阿兹海默氏病（AD）是特征为记忆力丧失的一种神经变性疾病，并且导致认知功能的渐进性丧失以及痴呆，在达到65岁时每八个人中就有一个人受此病影响。在神经病理学上，AD的特征是神经斑（NP）的存在、神经原纤维缠结（NFT）以及神经元丧失，连同多种其他发现。

AD可攻击年龄低至40至50岁的人，然而因为在没有侵入性技术如大脑活组织检查的情况下，疾病的存在难以确定，所以发作时间一般是未知的。实际上，AD通过大脑组织的检查来确定性地诊断，然而经常利用其他半诊断技术，如对于所考虑的受试者所进行的临床标准评估。然而，由于大脑活组织检查的侵入性和危险质以及临床标准评估所提供的有限的置信度，用于决定性诊断AD的唯一有保证的方式通常是在尸体解剖下提供的那种。AD受害者的大脑组织的验尸切片展现出淀粉样蛋白的存在，该淀粉样蛋白处于AD所特有的神经斑的蛋白质细胞外核的形式。

在任何认知下降之前的AD的诊断（或预后）代表一个限制性步骤，其中相当长的时间、专业技能以及智力劳动已经（并且进一步需要）被耗费掉。这假定AD的病因在任何认知下降之前就已开始，并且因此引入临床前AD的概念。临床前AD的概念是由痴呆诊断之前几十年就存在的细微认知缺陷以及验尸观察结果来支持，这些观察结果示出：AD神经病状（包括淀粉样蛋白斑的大脑沉积物）存在于超过四分之一的75岁以上的非痴呆的人中（这一比率与85岁人士的痴呆发病率相等）。

通过可靠地测量来自怀疑患有AD的受试者的生物样品中存在的标志物来检测临床前或早期疾病的能力也将允许疾病的治疗和管理更早地开始。因此，研究工作已经集中于开发在体内诊断AD的非侵入方法，包括成像技术，或用于检测生物标志物的生化或基因组方法。

成像技术已经面世多年。为了对大脑疾病如淀粉样蛋白原纤维或斑块形成神经疾病进行成像，已开发了硫黄素T的一系列不带电荷的衍生物作为淀粉样蛋白成像剂和放射性示踪剂，这些衍生物展现出对于淀粉样蛋白沉积物有较高亲和性和跨越血脑屏障的较高渗透性。由硫黄素BTA-1所代表的这些淀粉样蛋白成像剂的广泛体外和体内研究表明：它们在正电子发射断层摄影术研究期间特异性结合至在可检测到的那些典型的浓度下的淀粉样蛋白沉积物上。在人脑的复杂环境中，淀粉样蛋白成像化合物的非特异性结合较低，甚至在没有淀粉样蛋白沉积物的对照大脑中也是如此。

在这些淀粉样蛋白成像剂中经过验证最佳的是匹兹堡型复合物-B（PiB；克伦克（Klunk）等人，神经病学年鉴（Annals of Neurology），55,306-319,2004），它是淀粉样蛋白结合染料硫黄素-T的类似物。AD中的PiB-正电子发射断层摄影术（PiB-PET）研究已经示出PiB与淀粉样蛋白斑的稳固皮质结合（克伦克等人，2004；肯帕伊宁（Kemppainen）等人，神经病学（Neurology），67,1575-1580,2006；罗维（Rowe）等人，神经心理学（Neuropsychologia），46,1688-1697,2008；额（Ng）等人，核医学杂志（Journal of NuclearMedicine），48,547-552,2007）。这提供了有前景的早期并且准确的检测标志物，或许可被视为金标准。在尸检的AD大脑中，PiB在体外特异性结合至细胞外和血管内原纤维Aβ沉积物。PiB确实非特异性结合至白质，这可能是由于亲脂性化合物从白质中的延迟的清除（佛德罗·塔沃雷蒂（Fodero-Tavoletti）·M·T等人，核医学杂志；50(2):198-2042009）。最近，已经基于PiB靶向β淀粉样蛋白的类似功能来研究其他化合物，如由Avid放射性药物私人有限公司（Avid Radiopharmaceuticals Pty Ltd）（费城（Philadelphia））生产的AV-45（弗匹胺（florpiramine）F-18），其另外被称为F-18AV-45。

然而，由于成本较高、仪器的可获得性有限以及当前使用的放射性示踪剂的半衰期较短，因此在绝大多数人群中，PET成像在AD的检测方面受到限制。因此，作为AD的早期筛选工具，成像剂和测量是不可行的，并且用于早期诊断或更好预后的简单血液测试是令人希望的。

鉴别生物标志物以用于早期检测大脑疾病已经成为最近的研究焦点。已经发现脑脊髓液（CSF）中的生物标志物是已经进行成像诊断的一些神经疾病的强有力地确认性评价（萧（Shaw）等人，自然·评论·药物发现（Nature Reviews Drug Discovery），6,295-303,2007；汉佩尔（Hampel）等人，阿兹海默症与痴呆（Alzheimers&Dementia），4,38-48,2008；汉佩尔等人，自然·评论·药物发现9,560-574,2010；迪布瓦（Dubois）等人，柳叶刀神经学（Lancet Neurology），9,1118-1127,2010）。然而，这需要侵入性腰椎穿剌以便对CSF进行取样。此外，使用特异性脑脊髓液标志物（例如，增加的磷酸化τ和降低的β淀粉样蛋白水平）的研究尚未示出作为疾病病况的标志物的商业和医用价值。

获得针对AD的简单血液测试的努力迄今为止很少有成功，并且在任何临床症状发作之前的早期诊断仍然是特别具有挑战性的。然而，许多近期研究（雷（Ray）等人，自然：医学（Nature Medicine），13,1359-1362,2007以及欧科比（O’Bryant）等人，阿兹海默氏病研究（Alzheimer's Res）2010）已经提出对AD具有诊断能力的多组生物标志物。然而，这些近期测试已经发现是不可重现的，并且已经存在关于用于产生结果的小群组（样本大小）的批评。

现在可获得具有多组特异性生物标志物的一些商业试剂盒，这些生物标志物的选择是基于国王学院伦敦（Kings College London）的研究（蛋白质组学科学（ProteomicsSciences），赞比塞帝（Thambisetty）等人，PLoS ONE,6,2001）。然而，这些试剂盒使用昂贵的仪器如质谱仪，并且在一些情况下需要使用CSF。

因此，还可提供AD早期检测的更易于得到的筛选方法将允许进行简单、低廉并且有效的筛选，并且进而可提供确认性CSF或确认性大脑成像测试的合理性。

因此，存在提供能够早期并且经济地预后阿兹海默氏病或阿兹海默氏样疾病的改进的系统的需要，这种系统可在可检测的临床指示物表现之前帮助临床医生实现早期预后，并且将消除对于实际确认性大脑成像测试的需要。

在AD的疾病改善疗法正在经历临床测试的情况下，存在鉴别可在尽可能早的阶段下检测处于风险中的个体的疾病特征的生物标志物的社会和经济必需性，这样使得抗AD疗法可在疾病负荷较轻微的时候来给予并且它可防止或延迟功能性和不可逆认知丧失。

文献、行为、材料、装置、制品等等的讨论仅出于提供本发明背景的目的而包含在本说明书中。不暗示或表示任何或所有这些内容形成现有技术基础的一部分或是与本发明有关的领域中的常见一般知识，因为它在本申请的各项权利要求的优先权日之前就存在。

当术语“包含（comprise）”、“包含（comprises）”、“包含（comprised）”或“包含（comprising）”用于本说明书（包括权利要求）中时，它们应解释为指定所陈述特征、整数、步骤或部件的存在，但是不排除一个或多个其他特征、整数、步骤或部件或其组的存在。

发明概述

存在对鉴别患有神经疾病如AD的受试者的改进的方法的需要，特别是在疾病发作时和临床症状出现之前。因此，AD的早期鉴别将有助于通过早期干预来延迟疾病进展。为此目的，本发明人已经开发基于生物流体测量来提供新皮质淀粉样蛋白负荷或β淀粉样蛋白水平的定量评价的方法和系统。因此，这些方法和系统提供得自生物流体的基于标志物的检测系统和任选地临床测量，这些临床测量与如通过放射评价如PiB-PET来成像的新皮质淀粉样蛋白负荷相关。鉴于新皮质淀粉样蛋白负荷与AD的被证实的关联性和基于血液的测试的令人希望性，本发明有前景作为人群的早期筛选工具以便区分处于发展AD的风险中的那些人。

通过采用所描述的方法和系统，本发明人能够鉴别存在于个体的生物样品（例如血液，包括血清或血浆）中的一系列生物标志物，这些生物标志物的组合水平在患有神经疾病或处于发展神经疾病如阿兹海默氏病（AD）的风险中的个体体内被改变。本发明还已经鉴别了在患有神经疾病的个体体内改变的生物标志物，这些生物标志物可用于提供个体患有或可能发展AD的可能性的预后指示。

在本发明的方法中认为能够预测新皮质淀粉样蛋白负荷水平的生物标志物可通过将受试者的多个预定的经过验证的样品加以比较来确定，这些受试者已经针对一系列生物标志物来加以测定，并且其新皮质淀粉样蛋白负荷水平已经得到确定。这种比较是使用从受试者的多个预定的经过验证的样品中得到的一组相关系数来进行的。进一步认为受试者的多个预定的经过验证的样品可从群组数据集或群组研究中获得。虽然来自群组研究的多个群组数据集或结果有可能用在本发明的方法中以确定相关系数和/或生物标志物，从而预测新皮质淀粉样蛋白负荷水平，但是预期可能只需要一个群组数据集，只要该群组数据集包含来自同一测定个体的生物标志物的值和新皮质淀粉样蛋白负荷水平的评估值即可。

在本发明的一个方面，提供一种用于预后或帮助诊断个体的神经疾病的方法，该方法是通过测量生物样品（如来自个体的生物样品）中的一种或多种生物标志物的量，并且将所测量的生物标志物的特征标志（signature）相关联并且基于新皮质淀粉样蛋白负荷的理论水平来计算预测AD状态。根据本发明，提供基于组合或单独的生物标志物和任选地临床标志物来产生一组相关系数的方法，这些相关系数能够用于预测新皮质淀粉样蛋白负荷，并且由此提供受试者发展AD的可能性的指示，该方法是通过从来自受试者的生物样品确定理论新皮质β淀粉样蛋白水平。

在本发明的一个另外方面，提供一种用于检测可将受试者的AD状态定性的生物标志物的方法，所述一种或多种生物标志物可在生物样品中检测到，其中将怀疑生物流体还包含增加水平的淀粉样前体蛋白或β淀粉样蛋白肽。

还提供可在生物流体中鉴别的肽、多肽、蛋白质、寡核苷酸、其片段和/或其他标志物，如金属、代谢物或维生素，和包含可在生物流体中鉴别的肽、多肽、蛋白质、寡核苷酸、其片段和/或其他标志物，如金属、代谢物或维生素的试剂盒，这些试剂盒可用于确定可能指示受试者患有AD或可能发展AD的生物标志物的身份。

本发明的其他方面在本领域普通技术人员审阅本发明的具体实施例的以下描述时将变得显而易知。

附图简述

为了进一步理解本发明的方面和优势，应参考结合附图进行的以下详细说明。

图1(a)示出来自澳大利亚成像、生物标志物以及生活方式（AIBL）研究的273名受试者的新皮质淀粉样蛋白负荷的交叉验证预测的接受者工作特征曲线（ROC）。

图1(b)示出来自澳大利亚成像、生物标志物以及生活方式（AIBL）研究的273名受试者的预测的基线新皮质淀粉样蛋白负荷与实际测量的新皮质淀粉样蛋白负荷（如由PiB-PET标准化更新值比率（SUVR）来给出）的相关性。

图2(a)示出来自澳大利亚成像、生物标志物以及生活方式（AIBL）研究的273名受试者的实际测量的新皮质淀粉样蛋白负荷（如由PiB-PET标准化更新值比率（SUVR）来给出），这些受试者按照临床诊断来分组。

图2(b)示出来自澳大利亚成像、生物标志物以及生活方式（AIBL）研究的817名非成像受试者的预测的新皮质淀粉样蛋白负荷（如由PiB-PET标准化更新值比率（SUVR）来给出），这些受试者按照临床诊断来分组。

图3示出相对于其在基线和18个月过渡处的临床诊断，预测具有高新皮质淀粉样蛋白负荷的参与者的百分比。

图4示出来自阿兹海默氏病神经成像倡议（ADNI）研究的74名受试者的新皮质淀粉样蛋白负荷的预测的接受者工作特征曲线（ROC）。

图5示出用于确定并且产生适当模型的方法的统计分析流程图。

图6示出通过不同多变量模型来选择的血液标志物的维恩图（venn diagram）连同与其相关灵敏度和专一性；B：应用于成像的AIBL子群组的交叉验证的随机森林模型的ROC曲线；C：应用于成像的ADNI子群组的随机森林模型的ROC曲线。[橙色=M1，蓝色=M2，粉红色=M3，灰色=M4]。

图7(a)示出按照临床诊断来划分的成像的AIBL子群组的实际SUVR值。

图7(b)示出按照临床诊断来划分的非成像的AIBL子群组的预测的SUVR值。

发明详细说明

1.生物标志物

本发明提供选择、鉴别或使用多个生物标志物来预测淀粉样蛋白负荷的理论值，进而帮助鉴别受试者发展淀粉样蛋白斑形成相关疾病如AD的风险或确定受试者的AD或AD样疾病的进展。

适用于本发明中的特定生物标志物包括已经在现有技术中鉴别为具有诊断能力的那些生物标志物。虽然单独的生物标志物是有用的诊断生物标志物，但是已经发现与单一生物标志物单独相比，生物标志物的组合可提供具体病况的更大预测值。确切地讲，检测样品中的多种生物标志物（经常被称为“生物标志物概况”或“生物标志物指纹”），或使用多种生物标志物作为用于分析样品一个组，可增加测试的灵敏度和/或专一性。生物标志物已经典型地发现于血液、血浆、血清或CSF、尿或其他流体之中，并且在本发明中，这些物质都将可能加以选择。

一些基于特异性蛋白质的生物标志物包括年龄和ApoE基因型（神经学1997;48:139-147)；玻连蛋白（VTN或蛋白质S）以及保护素（CD59），它们都被认为抑制膜插入（大脑研究（Brain Res.）1992年5月8日；579(2):337-4）；免疫球蛋白生长因子结合蛋白2（IGF-BP2），它已示出在患有AD的个体的CSF中较高。IGF-BP2也已经与CSFτ的水平相关联。（生物因素（Biofactors）2008;33:99-106；神经传递杂志-帕金森氏病和痴呆部分（Journal ofNeural Transmission-Parkinson’s Disease and Dementia Section）1993;5:165-176；Plos One2011;6）。蛋白质如抗凝血酶3（AT3）、抗胰凝乳蛋白酶（ACT）和锌α2糖蛋白（ZAG）是发现于CSF中的丰富蛋白质，并且被发现可针对淀粉样蛋白β42和T蛋白给予类似预测能力（蛋白质组学临床应用（Proteomics Clan.Appl.）2007,1）。可适合于AD诊断的另外的非基于血液的生物标志物包括发现于CSF中的标志物，如骨桥蛋白、泛素、C4A des-Arg、α2微球蛋白（神经学档案（Arch Neurol），64(3)2007,366-37）。示出AD与对照受试者之间的一些差别变化的其他蛋白质还包含S-谷胱甘肽基化甲状腺素转运蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制素C、泛素、血管形成抑制素II片段、胰核糖核酸酶、骨桥蛋白前列腺素-D合成酶、嗜铬粒蛋白B肽以及运铁蛋白

具有免疫应答的多个组和或免疫信号传导蛋白如趋化因子（C-X-C基序）配体BLC（CXCL13）、IgM、IL-17、VCAM1、CD40、C-反应性蛋白（CRP）以及再有IGF-BP2也已经加以描述并且可用于本发明（PCT/AU2010/001575）。US7993868描述使用质谱法来从CSF鉴别与AD病况有一些相关性的三种标志物，即皂化蛋白D、FAM3C以及β-2-微球蛋白。WO2011/143574描述从宾夕法尼亚大学（University of Penn）研究中得到的一个优选组，该组由皮质醇、胰多肽、骨桥蛋白、IGF BP2以及抵抗素组成。其他生物标志物也在此项研究中得到鉴别，但是不认为它们与这五种标志物一样稳固。这些其他标志物包括α-1巨球蛋白、血管生成素-2、载脂蛋白E、β-2微球蛋白、BLC、E-选择素、FAS、脂肪酸结合蛋白、白介素10、PAPP-A、干细胞因子、凝血酶调节蛋白、皮质醇、肝细胞生长因子、NT-Pro-BNP、TIMP-1、VCAM-1、VEGF以及温韦伯氏因子

许多另外的潜在蛋白质生物标志物也描述于WO2011/142901中，其中优选的生物标志物是含有造血SH2域的蛋白质（HSH2D）、含有三角状五肽重复序列的蛋白质2（PTCD2）、60S核糖体蛋白L41（RPL41）或含有FERM域的蛋白质8（FRMD8）。从多个临床群组结果中得到的潜在生物标志物的列表被描述于US2005/0221348中，其中7种优选生物标志物的列表是脑源性神经营养因子（BDNF）、可溶性白介素6受体（sIL-6R）、Il-8、MIP-1γ、血小板衍生生长因子BB同源二聚体（PDGF-BB）以及金属蛋白酶的组织抑制剂-1（TIMP-1）。

另外，如US2011/0129920中描述，许多蛋白质或肽也可有助于神经疾病检测，这种检测涉及通过质谱法来鉴别以下各项的完整蛋白质或片段：血色素结合蛋白、泛素-3aa、胰核糖核酸酶、甲状腺素转运蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制素、分泌神经素、血管形成抑制素II、嗜铬粒蛋白A-β1-40、嗜铬粒蛋白B载脂蛋白A-II二聚体、C3a des-Arg、前列腺素-D合成酶、α-1-抗胰凝乳蛋白酶、骨桥蛋白、VGF、胸腺素、白蛋白、β-2-微球蛋白、运铁蛋白，仅举几个例子。

认为任何以上提及的标志物或生物标志物，以及来自其他不同样品源的任何其他生物标志物可根据本发明的方法用于鉴别存在于受试者体内的生物标志物以便对受试者的神经疾病病况进行定性。

本发明提供与不存在或未完全指示神经疾病的受试者相比较，存在于患有疾该病如AD的受试者体内的生物标志物的鉴别，并且提供利用所鉴别的生物标志物来对受试者的神经疾病病况进行定性的方法。本发明还提供鉴别与神经疾病如AD相关的治疗剂，并且监测神经疾病的进展的方法。进一步提供根据所鉴别的特征性生物标志物的存在来预测新皮质淀粉样蛋白负荷的理论计分的方法，从而可使个体发展AD或AD样疾病的可能性的预测得到改进。

本发明总体上包涵生物标志物的鉴别、个体体内存在生物标志物的鉴别、使用所鉴别的生物标志物来评价受试者患有神经变性疾病如AD的风险或状态的方法。

因此，本发明的一个方面包括一种用于产生供预测新皮质β淀粉样蛋白水平的一组相关系数的方法，该方法包括a)将分类算法应用于来自多个预定的经过验证的样品的多个生物标志物值；并且b)将分类算法应用于从步骤a)的相同多个预定的经过验证的样品获得的多个β淀粉样蛋白水平，其中应用分类算法产生一组相关系数，这些相关系数能够通过将生物标志物与β淀粉样蛋白水平相关联来预测β淀粉样蛋白水平。

出于简洁的目的，一些以下描述将在AD的背景中进行。然而，认为熟练的受用者将能够理解：本发明还可用作预后或帮助诊断和/或监测与淀粉样蛋白斑聚集相关的其他神经疾病的进展。另外，认为熟练的受用者将理解：本发明还可适用于根据其他神经疾病的严重程度来将患者分级，这些神经疾病如与神经变性和淀粉样蛋白斑聚集相关的那些，包括但不限于帕金森氏病（PD）和与路易体相关的痴呆、淀粉样蛋白斑形成疾病以及AD样疾病。

在本发明中，发明人提出其中两个是淀粉样蛋白β42和载脂蛋白E（基因型）的多种生物标志物的存在可用于产生可预测淀粉样蛋白负荷的特征标志，这种淀粉样蛋白负荷然后帮助确定受试者是否将有可能发展与淀粉样蛋白斑水平或聚集增加相关的神经疾病，并且这些生物标志物可因此提供在评价受试者是否患有或可能发展神经疾病如AD的方法中使用的适当靶标。

发明人进一步提出用于确定受试者是否将有可能发展与淀粉样蛋白斑水平或聚集增加相关的神经疾病的多种生物标志物的存在还可通过选择性使用其他生物标志物来提供，这些其他生物标志物包括选自以下组列表的那些生物标志物中的任何一个，这个组列表包括6Ckine、Aβ42（AB42）、脂连素、Agouti相关蛋白、醛醣还原酶、α.2.巨球蛋白、α-1-抗糜蛋白酶、α-1-抗胰蛋白酶-A1AT、α-1-微球蛋白、α-2-巨球蛋白、α1酸糖蛋白、丙氨酸转氨酶-ALT、白蛋白-Alb、碱性磷酸酶-AP、α共核蛋白、α-胎蛋白-AFP、双调蛋白、血管生成素、抗凝血酶3-AT3、血管生成素-2-ANGPT.2、血管收缩素-转化酶-ACE、CD143、血管收缩素原、膜联蛋白A1、ApoE_ECU、载脂蛋白AII二聚体、载脂蛋白B-Apo.B.、载脂蛋白C-I、载脂蛋白D-Apo.D、载脂蛋白E-Apo.E、载脂蛋白H-Apo.H、载脂蛋白（a）、载脂蛋白CIII、Ast、AXL受体酪氨酸激酶-AXL、B细胞活化因子、B淋巴细胞化学引诱物-BLC、B12、Baso、Bcl-2样蛋白质2、β-2-微球蛋白-B2M、B细胞生长因子、β2微球蛋白、胆红素、骨形态发生蛋白6-BMP6、大脑衍生神经营养因子-BDNF、C3、Caer、钙结合蛋白、降钙素、癌抗原125、癌抗原15-3、癌抗原19-9、癌抗原72-4、癌胚抗原-CEA、组织蛋白酶D、CD40抗原-CD40、CD40.配体、CD5抗原样、血浆铜蓝蛋白、CgA、趋化因子（C-X-C基序）、趋化因子CC-4-CK.MB、嗜铬粒蛋白-4、睫状神经营养因子、Cl、成簇蛋白、胶原质IV、补体C3、补体因子H、结缔组织生长因子、皮质醇、C-肽、C-反应蛋白-CRP、肌酸激酶-MB、嗜铬粒蛋白B、内皮糖蛋白、内皮抑素、内皮素-1、Eos、嗜酸细胞活化趋化因子（所有亚单位）、表皮生长因子-EGF、表皮生长因子受体-EGF.R、表皮调节素、上皮细胞粘附分子、促红细胞生成素、E-选择蛋白、细胞外新鉴别的RAGE-结合蛋白-EN.RAGE、埃兹蛋白、红细胞沉降率-ESR、估算的肾小球滤过率-eGFR、因子.VII、FAS、FASLG受体、序列相似性家族3成员C（FAM3C(I)）、脂肪酸结合蛋白、铁蛋白、胎球蛋白-A、纤维蛋白原、成纤维细胞生长因子4、碱性成纤维细胞生长因子、纤蛋白-1C、卵泡刺激激素-FSH、FT3、G、半乳糖凝集素-3、凝溶胶蛋白、γ谷氨酰移转酶-GGT、胰高血糖素、胰高血糖素样肽1、总-GLP.1.总、葡萄糖-6-磷酸异构酶、谷氨酸-半胱氨酸连接酶调控亚单位、谷胱甘肽S-转移酶α、谷胱甘肽S-转移酶μ1、粒细胞集落刺激因子-G.CSF、GRO.α、生长激素-GH、结合珠蛋白、HCC.4、HCY、HE4、热休克蛋白60、肝素结合EGF样生长因子-HB.EGF、肝细胞生长因子-HGF、肝细胞生长因子受体、丝氨酸蛋白酶、血色素结合蛋白、人绒毛膜促性腺素β、人表皮生长因子受体2、血红蛋白-Hb、高密度脂蛋白-HDL、铁-Fe、免疫球蛋白A-IgA、免疫球蛋白E-IgE、免疫球蛋白M-IgM、Inno_AB_比率、Inno_AB40、Inno_AB42、胰岛素、胰岛素样生长因子结合蛋白4、胰岛素样生长因子结合蛋白5、胰岛素样生长因子结合蛋白6、胰岛素样生长因子结合蛋白1、胰岛素样生长因子结合蛋白2、胰岛素样生长因子结合蛋白2-IGF.BP.2、胰岛素样生长因子结合蛋白3、细胞间粘附分子1-ICAM.1、干扰素γ、干扰素γ诱导的蛋白质10、干扰素可诱导的T-细胞α化学引诱物、白介素-1α、白介素-1β、白介素-1受体拮抗剂、白介素-1受体拮抗剂-IL.1ra、白介素-10、白介素-10-IL.10、白介素-12亚单位p40、白介素-12亚单位p70、白介素-12亚单位p70-IL.12p70、白介素-13-IL.13、白介素-15-IL.15、白介素-16-IL.16、白介素-17-IL.17、白介素-18-IL.18、白介素-2、白介素-2受体α、白介素-2、白介素-3-IL.3、白介素-4IL.4、白介素-5-IL.5、白介素-6受体、白介素-7、白介素-8-IL.8、激肽释放酶5、激肽释放酶-7、肾损伤分子-1、乳酰谷胱甘肽裂解酶、转化生长因子β1的隐性相关肽、凝血素样氧化LDL受体1、瘦素、脂蛋白.a、促黄体激素-LH、长链血浆神经酰胺C22:0、长链血浆神经酰胺C24:0、淋巴细胞趋化因子-Lymp、低密度脂蛋白-LDL、巨噬细胞集落刺激因子1-M.CSF、巨噬细胞炎症性蛋白质3β、巨噬细胞炎症性蛋白质-1α、巨噬细胞炎症性蛋白质-1β、巨噬细胞炎症性蛋白质-3α、巨噬细胞迁移抑制因子、巨噬细胞衍生趋化因子-MDC、巨噬细胞刺激蛋白质、丙二醛修饰的低密度脂蛋白、乳腺丝抑蛋白（Maspin）、基质金属蛋白酶-1、基质金属蛋白酶-10、基质金属蛋白酶-2-MMP.2、基质金属蛋白酶-3、基质金属蛋白酶-7、基质金属蛋白酶-9-MMP.9、平均红细胞血红蛋白浓度-MCHC、平均血小板体积-MPV、黑色素聚集激素-MCH、膜辅蛋白1-MCP.1、修饰的瓜氨酸波形蛋白-MCV、Mehta_AB_比率、Mehta_AB40、Mehta_AB42、间皮素、金属平均铬.同位素.52、金属平均铬同位素.53、金属平均铜同位素.65、金属平均铁同位素.57、金属平均钕.同位素.85、金属平均硒同位素.78、金属平均锌同位素66、MHC I类链相关蛋白质A、微量白蛋白、MIP.1β、MIP.1α、Mono、单核细胞趋化蛋白质1、单核细胞趋化蛋白2、单核细胞趋化蛋白3、单核细胞趋化蛋白4、γ干扰素诱导的单核因子、MPO、肌球素、髓系祖细胞抑制因子1-MIF、髓过氧化物酶、嗜中性粒细胞活化肽-ENA.78、神经生长因子β、神经元细胞粘附分子-NrCAM、神经元特异性烯醇化酶、神经纤毛蛋白-1、嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白、嗜中性粒细胞、大脑利尿钠肽的N端激素原、核苷二磷酸激酶B、雌二醇、骨桥蛋白、骨保护素、帕金森氏蛋白质5、帕金森氏蛋白质7、血小板计数-Plt、钾-K、PPY-胰腺.多肽、血细胞压积-PCV、PAI.1、胰核糖核酸酶-PARC、胃蛋白酶原I、肽YY、过氧化物氧还蛋白-4、磷酸丝氨酸转氨酶、胎盘生长因子、纤溶酶原活化剂抑制因子1、血小板衍生生长因子BB-PDGF、怀孕相关血浆蛋白A-PAPP.A、PRL、黄体酮、胰岛素原-完整、胰岛素原-总、催乳激素、前列腺蛋白、蛋白质I-309、前列腺特异性抗原、游离-.PSA..游离、前列腺素D合成酶、前列腺酸性磷酸酶-PAP、蛋白质S100-A4、蛋白质S100-A6、肺部和活化调节趋化因子、受体酪氨酸蛋白激酶erbB-3、抵抗素、红细胞分布宽度-RDW、红血球计数-RCC、红血球叶酸-rFol、皂化蛋白A、皂化蛋白B、皂化蛋白D、饱和运铁蛋白-tr.sat、血清叶酸-sFol、钠-Na、干细胞因子-SCF、S100钙结合蛋白B、胰泌素、血清铁传递蛋白、分泌神经素、血清淀粉样P组分-SAP、血清谷草酸转氨基酶-SGOT、性激素结合球蛋白-SHBG、分拣蛋白、鳞状细胞癌抗原-1、sRAGE、基质细胞衍生因子-1、超氧化物歧化酶1、可溶性-SOD、分泌的T淋巴细胞、塔姆-霍斯福尔（Tamm-Horsfall）尿糖蛋白、T-细胞特异性蛋白质RANTES-RANTES、TECK、肌腱蛋白-C、睾酮-总、四连接素、凝血调节蛋白、血小板生成素、胸腺素β、凝血酶敏感蛋白-1、甲状腺球蛋白、甲状腺刺激激素-TSH、甲状腺素结合球蛋白-TBG、组织因子、金属蛋白酶的组织抑制剂1-TIMP.1、组织类型纤溶酶原活化剂、睾酮-Testo、凝血酶敏感蛋白1-THBS1、甲状腺素、FT4、总钙-Ca、总蛋白质-tPr、TNC、TNF相关细胞凋亡诱导配体受体3、TRAIL.R3、运铁蛋白、转化生长因子α、转化生长因子β-3、甲状腺素运载蛋白、三叶因子3、Trig、肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子β、肿瘤坏死因子受体2-TNF.RII、肿瘤坏死因子受体I、具有Ig和EGF同源性域的酪氨酸激酶2、脲、尿激酶类型纤溶酶原活化剂、尿激酶类型纤溶酶原活化剂受体、泛素3、泛素4、血管细胞粘附分子-1、血管内皮生长因子、血管内皮生长因子B、血管内皮生长因子C、血管内皮生长因子D、血管内皮生长因子受体1、血管内皮生长因子受体2、血管内皮生长因子受体3、维生素K依赖性蛋白质S、玻连蛋白、YKL-40、血管细胞粘附蛋白质1-VCAM.1、血管内皮生长因子-VEGF、温韦伯氏因子-vWF，或白细胞计数-WCC

发明人进一步提出用于确定受试者是否将有可能发展与淀粉样蛋白斑水平或聚集增加相关的神经疾病的多种生物标志物的存在还可通过选择性使用其他生物标志物来提供，这些其他生物标志物包括选自表8中提供的列表的那些生物标志物中的任何一个。

在一个另外的实施例中，所选择的该组生物标志物是淀粉样蛋白β42和载脂蛋白E，并且在与如表8中提供的至少一个另外的标志物相组合时，并且在与选自包括以下的列表的至少一种临床标志物相组合时：性别、采样位置、社区参与、贫血状况、年龄、婚姻状况、受教育年限、身体活动四分位、颅内容积、海马容积、临床痴呆评级（CDR）笔盒（ClinicalDementia Rating sum of boxes）、或体重指数，这些生物标志物也可用于产生特征标志，这种特征标志可预测淀粉样蛋白负荷，该淀粉样蛋白负荷然后帮助确定受试者是否将有可能发展神经疾病，并且这些生物标志物可由此提供在评价受试者是否患有或有可能发展神经疾病如AD的方法中使用的适当靶标。

在一个优选实施例中，所选择的该组生物标志物是淀粉样蛋白β42和载脂蛋白E，它们与选自包括以下的列表的至少一个另外的标志物相组合：皮质醇、IgM、IL-17、PPY、VCAM1或BLC。可替代地，所选择的该组生物标志物可包括淀粉样蛋白β42和载脂蛋白E，在与至少一种临床标志物，如性别、采样位置、社区参与、贫血状况、年龄、婚姻状况、受教育年限、身体活动四分位、颅内容积、海马容积、临床痴呆评级（CDR）笔盒、或体重指数之一相组合时，这些生物标志物也可用于产生特征标志，这种特征标志可预测淀粉样蛋白负荷，该淀粉样蛋白负荷然后帮助确定受试者是否将有可能发展神经疾病，并且这些生物标志物可由此提供在评价受试者是否患有或有可能发展神经疾病如AD的方法中使用的适当靶标。

2.定义

如在此使用的术语“阿兹海默氏病患者”、“AD患者”以及“诊断患有AD的个体”被认为都是指已经诊断患有AD或给出可能患有阿兹海默氏病（AD）的诊断的个体。

如在此使用的术语“生物标志物”包括但是不认为限于存在于生物样品中的蛋白质、多肽、多核苷酸和/或代谢物（例如，金属或维生素等等），它们的值（例如浓度、表达和/或活性）是在来自受试者或对照群体的生物样品中。进一步认为生物标志物还可包括所感兴趣的蛋白质、多肽、多核苷酸和/或代谢物的片段或部分或其衍生物。任何列出的生物标志物被认为也包括其基因和蛋白质同义名。生物标志物是存在于从具有一种表型状态（例如，患有疾病）的受试者体内获得的样品中的有机生物分子。单独或组合的生物标志物被认为是统计相关的，只要它的值或其与其他生物标志物的关系不同于其他表型状态。统计学显著性的常见检验尤其包括t-检验、X2检验、ANOVA、克鲁斯卡尔-沃利斯（Kruskal-Wallis）、威尔科克森（Wilcoxon）、曼-惠特尼（Mann-Whitney）和优势比。单独或组合的生物标志物提供受试者属于一种表型状态或另一种表型状态的相对风险的度量。因此，生物标志物常规上用作指示受试者将发展疾病的可能性（预后）、患有疾病（诊断）或确定药物疗效（治疗诊断学）以及药物毒性的标志物，

如在此使用的术语“AD生物标志物”等等不意欲指示生物标志物只用于预后，帮助诊断、监测或对患有AD的个体进行分级。在本披露中清楚的是，本发明的生物标志物也适用于例如评价认知功能、评价MCI、对AD进行分级等，而且还评价认知功能和对其他神经疾病（如与神经变性相关的那些疾病）进行分级。

如在此使用的术语“AD生物标志物多核苷酸”是指以下任何一个：编码AD生物标志物的多核苷酸序列、相关反式作用控制元件（例如，启动子、增强子以及其他基因调控序列）和/或编码AD生物标志物的mRNA。

提及“AD预后标志物”、“AD诊断标志物”、“AD生物标志物”以及“生物标志物”（可在此互换使用）是指在此描述的标志物和其用途的便利术语，并且不意欲指示标志物只用于提供AD的预后或诊断。

如在此使用的“帮助诊断”的方法是指帮助关于AD或神经疾病的存在或性质作出临床或接近临床确定的方法，并且关于明确诊断可为或可不为决定性的。例如，一种帮助诊断AD的方法可包括测量来自从个体获得的生物样品的如在此描述的一种或多种生物标志物的量。

在另一个实例中，一种帮助诊断AD的方法可包括测量与从个体获得的生物样品中的AD的存在相关的一种或多种AD生物标志物的量。在另一个实例中，根据本发明的一种帮助诊断神经病状的方法可与临床评价神经疾病的其他方法组合使用，这些其他方法包括但不限于，记忆和/或心理测试、语言障碍和/或其他病灶性认知缺陷（如失用症、失算症和左右取向障碍）的评价、判断障碍和一般性问题解决困难的评价、从进展性被动到明显躁动范围内的个性改变的评价。

如在此使用的“帮助诊断”的方法是指帮助关于AD的存在或性质作出临床前确定评价的方法，并且关于明确诊断可为或可不为决定性的。例如，帮助预后AD的方法可包括测量与从个体获得的生物样品中的AD的存在相关的生物标志物的量或值，并且利用这些生物标志物的存在来确定个体将患有或将发展AD的可能性。在另一个实例中，根据本发明的一种帮助预后神经病状（如AD）的方法可与临床评价神经疾病的其他方法组合使用，这些其他方法包括但不限于记忆和/或心理测试、判断障碍和一般性问题解决困难的评价、从进展性被动到明显躁动范围内的个性改变的评价。如果正当的话，诊断可然后加以验证或确认，如通过使用PET、MRI等来成像。

如在此使用，术语“分级”典型地是指基于神经疾病的特征将个体分类成不同类别或层次。例如，将患有神经疾病的个体的群体分级涉及基于疾病的严重程度（例如，轻度、中度、晚期等）来分配个体。

如在此使用的术语“预测”是指作出个体具有发展神经疾病（如AD）的显著增强的概率的发现结果。

如在此使用的术语“生物样品”典型地是指从个体获得的可用于预后、诊断或监测测定的多种样品类型并且包括但不限于血液（包括全血）、血浆或血清、尿液、脑脊髓液、眼泪或唾液。血液样品可包括例如存在于血液中的各种细胞类型，包括血小板、淋巴细胞、多形核细胞、巨噬细胞、红细胞。在本发明的一些实施例中，生物标志物可选自表8中列出的那些生物标志物中的任何一个。该术语还包括在取得之后以任何方式处理的样品，如用试剂处理、增溶或针对某些组分如蛋白质或多核苷酸来加以富集。

如在此使用的术语“生物材料（biological）”包涵从个体获得的多种流体样品类型并且可用于诊断或监测测定。该定义包涵血液、外周血、血小板、血清以及血浆。该定义还包括在取得之后以任何方式处理的样品，如用试剂处理、增溶或针对某些组分如蛋白质或多核苷酸来加以富集。该术语总体上被认为还指含有或怀疑含有可充当生物标志物（包括但不限于蛋白质、多肽、寡肽、多核苷酸、寡核苷酸或其片段、核酸、类固醇或类固醇激素、糖/碳水化合物、脂质、金属、其他小分子和细胞）、充当本发明描述的一种或多种配体的生物学相关分子的所有流体。生物材料可为含有多种已知或未知配体的溶液或含有多种已知或未知配体的混合物。生物材料的典型实例包括选自血液、血浆、血清、溶血产物等等的体液。“生物材料”的另外的实例包括培养细胞、组织、细菌以及病毒的培养基上清液，连同从细胞、组织、细菌或病毒获得的溶解产物。细胞和组织可得自如上所述的任何单细胞或多细胞生物体。

“血液样品”是得自血液、优选地（或循环）血液的生物样品。血液样品可为例如全血、血浆或血清。

术语“淀粉样蛋白负荷（amyloid load）”或“淀粉样蛋白负荷（amyloid loading）”（可互换使用）是指沉积在大脑中的大脑淀粉样蛋白-β肽（Aβ或β淀粉样蛋白）的浓度或水平，淀粉样蛋白-β肽是（老年）斑的主要成分。

组织病理学研究推断大脑淀粉样蛋白负荷在AD的临床前和临床过程中逐渐地增加。聚集的β淀粉样蛋白首先影响新皮质区域，然后扩散至异皮质区域如扣带回（gyruscinguli）和扁桃体，稍后还涉及间脑核（包括丘脑和纹状体），并且最后延伸至脑干和小脑。在此肽的测量中，通常使用成像剂。在一个优选实施例中，所使用的成像剂是放射性示踪剂，并且在一个特别优选的实施例中，所采用的放射性示踪剂是PiB。已经存在将放射性示踪剂信号或输出与Aβ水平相关联的许多研究，并且这已经产生PiB阳性和PiB阴性的术语。典型地，发生PiB输出或示踪剂吸收的归一化以便允许进行受试者间和受试者内比较。在临床实践中，进行放射性剂量和患者体重或体积的归一化（另外被称为标准吸收值（SUV））。归一化还结合（通常）未受影响的小脑的标准化以便提供标准吸收值比率（SUVR）。这已经导致确定阈值以便将具有高新皮质负荷的那些患者（PiB阳性）与具有低负荷的那些患者（PiB阴性）加以区分。1.5的阈值已经被建议作为似乎与患病状态较好相关的公认“截止”或“极限”值，但替代阈值可能更适合于个体研究。

“个体”是哺乳动物、更优选地是人。哺乳动物包括但不限于人、灵长类、农畜、运动动物、啮齿动物以及宠物。进一步认为术语“个体”和“受试者”可互换使用以便指针对生物标志物的存在来加以检查或分析并且进行评估以便确定神经疾病如AD的病况的相同测试受试者。

如在此针对定量和定性数据来使用的术语“正常”个体或来自“正常”个体的样品总体上被认为是指已经或将被医师评价为未患有AD，并且具有25-30范围内的简易精神状态检查（MMSE）（在福斯坦因（Folstein）等人1975中提及）计分或将取得25-30范围内的MMSE计分的个体。“正常”个体总体上在5至10岁范围内有年龄匹配，包括但不限于与有待评估的个体年龄匹配的个体。

如在此使用的与个体相联系的术语“可疑AD”总体上被认为是如下个体：(a)已经诊断患有AD或已经给出可能患有AD的诊断，并且(b)已经用简易精神状态检查（MMSE）（在福斯坦因（Folstein）等人1975中提及）来评价并且记分为25-28或在MMSE测试时将取得25-28的MMSE计分。因此，“可疑AD”是指关于MMSE计分为25-28和或在MMSE测试时将取得25-28的MMSE计分的个体中的AD。

术语“患有轻度AD的个体”总体上被认为是如下个体：(a)已经诊断患有AD或已经给出可能患有AD的诊断，并且(b)已经用简易精神状态检查（MMSE）（在福斯坦因等人1975中提及）来评价并且记分为22-27或将在MMSE测试时取得22-27的MMSE计分。因此，“轻度AD”是指已经用MMSE评价并且MMSE计分为22-27或在MMSE测试时将取得22-27的MMSE计分的个体中的AD。在一些实施例中，“轻度AD”的MMSE计分范围是20-25。

总体上，“患有中度AD的个体”是如下个体：(a)已经诊断患有AD或已经给出可能患有AD的诊断，并且(b)已经用MMSE评价并且记分为16-21或在MMSE测试时将取得16-21的MMSE计分。因此，“中度AD”是指已经用MMSE评价并且计分为16-21或在MMSE测试时将取得16-21的MMSE计分的个体中的AD。在一些实施例中，“中度AD”的MMSE计分范围是10-20。

总体上，“患有重度AD的个体”是如下个体：(a)已经诊断患有AD或已经给出可能患有AD的诊断，并且(b)已经用MMSE评价并且记分为12-15或在MMSE测试时将取得12-15的MMSE计分。因此，“重度AD”是指已经用MMSE评价并且计分为12-15或在MMSE测试时取得12-15的MMSE计分的个体中的AD。在一些实施例中，“重度AD”的MMSE计分范围是10-20。

术语临床标志物值用于指示由医疗专业人员或在一些情况下使用互联网上的程序进行的临床评价。如语言障碍和/或其他病灶性认知缺陷（如失用症、失算症以及左右取向障碍）、评估判断障碍和一般问题解决困难、评估从逐渐被动到明显躁动范围内的人格改变的评估都是可能的标志物值。一种系统化评价是临床痴呆评级（CDR），它是一种五点量表，其中CDR-0意味着没有认知障碍，并且然后其余四个点是针对不同阶段的痴呆：CDR-0.5=非常轻微的痴呆，CDR-1=轻度，CDR-2=中度，CDR-3=重度。得到CDR计分的信息由在临床仪器中收集的一组标准信息组成。六个领域（domain）是：记忆、取向、判断以及问题解决、社区事务、家庭和爱好，以及个人护理。

可用于进一步增强诊断的风险的其他有影响的决定因素包括年龄、性别、采样位置、社区参与、体重指数、婚姻状况、受教育年限、APOE基因型、贫血状况、身体活动四分位、颅内容积、海马容积等。如在此使用，可考虑到另外的因素并且用于分类算法中以便增加灵敏度和/或专一性。

如在此使用，术语“治疗”是指减轻、改善和/或稳定症状，并且延迟具体疾病的症状的进展。例如，AD的“治疗”包括以下任何一种或多种：消除AD的一种或多种症状、减少AD的一种或多种症状、稳定AD的症状（例如，未能进展至AD的更晚期阶段），以及延迟AD的一种或多种症状的进展（即，恶化）。

如在此使用，“参考值”可以是绝对值；相对值；具有上限和/或下限的值；值的范围；平均值（average value）；中值、平均值（average value）、缩小的质心值，或如与具体对照或基线值相比的值。应了解其他统计学变量可用于确定参考值。参考值可基于单独的样品值，例如像，从来自患有AD的个体的样品、但是在较早时间点获得的值；或从来自除了所测试个体以外的AD患者或“正常”个体（即诊断未患有AD的个体）的样品获得的值。参考值可基于大量样品，如来自AD患者或正常个体或基于包括或不包括有待测试的样品的样品池。

取决于所实施的本发明的方面，用于与来自受试者的生物标志物如AD生物标志物的测量水平进行比较的参考水平可变化，如从前述讨论中将了解的。为了鉴别指示受试者患有AD的生物标志物，参考水平将典型地为预定参考水平如从未患有AD的群体获得的水平的平均值，但是在一些情况下，参考水平可为来自包括神经疾病患者的一组个体的平均或中值水平。在一些情况下，预定的参考水平是得自从年龄匹配的群体获得的水平（例如，是平均值或中值）。

对于AD预后方法，“参考水平”典型地是预定参考水平如从患有AD的群体获得的水平的平均值，但是在一些情况下，参考水平可以是来自包括AD患者的一组个体的平均或中值水平。在一些情况下，预定参考水平是得自从年龄匹配的群体获得的水平（例如，是平均值或中值）。在在此披露的一些实例中，年龄匹配的群体包括患有非AD神经变性疾病的个体。

对于AD监测方法（例如，帮助诊断AD患者中的AD进展的预后方法），参考水平可以是预定水平，如从未患有AD的群体、已经诊断患有AD的群体获得的水平的平均值，并且在一些情况下，参考水平可以是来自包括AD患者的一组个体的平均或中值水平。可替代地，参考水平可以是具体患者的历史参考水平（例如，从得自同一个体的样品中、但是在较早时间点获得的EGF水平）。在一些情况下，预定参考水平是得自从年龄匹配的群体获得的水平（例如，是平均值或中值）。

年龄匹配的群体（从中可获得参考值）理想地与所测试个体的年龄相同，但是近似年龄匹配的群体也是可接受的。近似年龄匹配的群体可在所测试个体的年龄的1、2、3、4或5岁范围内，或可以是包涵所测试个体的年龄的具有不同年龄的组。近似年龄匹配的群体可以按2、3、4、5、6、7、8、9或岁递增。

如在此使用，“相关系数”可被认为是与一个或多个变量（生物标志物）相关的值，该值已经基于变量与应答（新皮质淀粉样蛋白负荷）的相关性来进行计算。它还可以涉及与一组变量相关的一组值，这组值已经基于这组经过组合的变量与应答的相关性来进行计算。因此，它们限定了变量与应答之间的关系和相关性并且可用于模型产生，并且在给出变量的值的情况下可用于提供应答的预测评估。

3.鉴别生物样品中的生物标志物的方法

本发明提供适用于通过使用所鉴别的生物标志物来确定受试者中的理论新皮质淀粉样蛋白负荷的方法，这种负荷进而适用于预后、帮助预后、帮助诊断、评价风险、监测神经变性疾病，和/或预测神经变性疾病。

在本发明的实施中所测量的生物标志物可以是例如在受试者的生物样品中所发现的任何蛋白质生物标志物。应了解，被认为是“鉴别出”的生物标志物是适用于帮助预后、帮助诊断、监测和/或预测神经变性疾病如AD（或AD样疾病）的生物标志物，只要它在所测试的生物样品的子集之间显著不同。

在本发明的一个方面，确定来自一个或多个受试者的生物样品中的一种或多种生物标志物的存在。在一个实施例中，选择样品以使得它们可基于神经疾病如AD来区分成一个或多个子集（例如，来自健康个体、被诊断患有其他痴呆或疾病的那些个体（作为其他痴呆对照）的样品，或来自患有AD的个体的样品）。

在本发明的一个实施例中，提供测定、检测或测量来自一个或多个个体的一组生物样品（其中样品可基于神经疾病或另一种分类来区分成一个或多个子集）的用于进行比较的值的方法，其中不同的生物标志物集合或概况或特征标志可用于预后、帮助诊断、监测和/或预测神经疾病的可能性。在一个另外的实施例中，所获得的生物样品可为外周生物流体。

在一个另外的实施例中，本发明的方法包括基于所鉴别的一组生物标志物的存在来鉴别处于发展神经变性疾病风险中的受试者。在一个另外的实施例中，该方法包括确定指示神经疾病的至少一种生物标志物的身份，其中该疾病是AD。

可通过以下进行本发明的方法：获得来自一组生物样品的多个生物标志物的一组测量值，其中这些生物样品可相对于神经疾病如AD的存在而分成至少两个子集，比较跟踪具体属性如淀粉样蛋白负荷的每种生物标志物或生物标志物集合或特征标志的所述测量值。在一个另外的实施例中，针对生物标志物来检查的生物样品可包括来自受试者的预定的经过验证的样品，这些受试者可能已经针对神经疾病的存在加以研究。在仍然另外的实施例中，多个生物标志物的测量值可从来自受试者的预定的经过验证的样品中获得，这些受试者已经针对神经疾病如AD的存在来加以研究。

在从生物样品确定或鉴别生物标志物的存在时，认为总体上可使用熟练的受用者可完全精通的许多不同测定或方法。虽然一些测定格式将允许在没有事先处理样品的情况下测试生物样品，但也有可能在测试之前对生物样品进行处理。处理可采取消除血液样品中的细胞（成核和非成核）如红细胞、白细胞以及血小板的形式，并且还可包括从血液中消除某些蛋白质如某些凝血级联蛋白，或蛋白质分离、富集或纯化的其他标准手段。在事先处理的实例中，将生物样品收集于包含EDTA的容器中。

在本发明的一个另外的方面，提供从一个或多个个体获得的一组生物样品如血液样品，这些生物样品可加以分析以便确定受试者将发展AD的可能性。可选择有待分析的该组生物样品以使得它们可基于AD或另一种分类基础来划分成一个或多个子集。划分成子集可基于疾病的存在/不存在或疾病的子分类（例如，复发/缓解相比于进展性复发）。在一个实施例中，可选择样品以使得在通过临床分析或任何其他方法如MRI和/或PET扫描技术来评估受试者或个体之后，这些样品可划分成多个组，其中一个组可基于AD的可能存在或不存在。在另一个实施例中，在本发明的实施中所测量的生物标志物可为在生物样品中发现的任何蛋白质生物标志物。

在一个另外的实施例中，生物样品可包括从怀疑患有AD的受试者体内获得的、并且可经由用于确定AD的存在的其他临床手段来评估的那些样品。在一个另外的实施例中，生物样品可包括从被诊断为具有高新皮质淀粉样蛋白负荷的个体体内获得的那些样品。在一个另外的实施例中，生物样品从被诊断为具有高水平的β淀粉样蛋白负荷的个体体内获得。在一个另外的实施例中，除了来自被诊断为具有高水平的β淀粉样蛋白负荷的个体的那些样品以外，包括其他样品以便提供来自正常或健康并且可能不具有高水平的β淀粉样蛋白的个体的混合物。

在一个另外的方面，本发明提供鉴别适用于预测或预后患有神经疾病如AD的个体的至少一种生物标志物的方法，该方法是通过从得自于至少一个个体体内的一组生物样品中获得多个生物标志物的测量值。在一个实施例中，将生物样品中的生物标志物之间的关系相对于已经确定为指示受试者患有或可能发展AD的一组参考生物标志物的测量值来进行比较。

在本发明的一个另外的方面，发明人已经确定基于多种生物标志物、其中两种是淀粉样蛋白β42和载脂蛋白E（基因型）以及其天然发生的变异体或片段在来自个体的生物样品中的存在的特征标志可为患有或可能发展神经变性疾病如AD的个体的特征，并且可提供测试受试者发展神经变性疾病如AD的存在或可能倾向的指示。

在本发明的一个实施例中，发明人已经确定基于多种生物标志物、其中两种可包括淀粉样蛋白β42和载脂蛋白E（基因型）（在与至少一种或多种标志物相组合时，该一种或多种标志物下组，该组包括皮质醇、IgM、IL-17、PPY、VCAM1、BLC以及其天然发生的变异体或其片段）在来自个体的生物样品中的存在的特征标志可为患有或可能发展神经变性疾病如AD的个体的特征，并且可提供测试受试者发展神经变性疾病如AD的存在或可能倾向的指示。

在一个另外的实施例中，发明人已经确定基于多种生物标志物、其中两种可包括淀粉样蛋白β42和载脂蛋白E（基因型）（在与表8中提供的至少一种另外的标志物和其天然发生的变异体或其片段相组合时）在来自个体的生物样品中的存在的特征标志可为患有或可能发展神经变性疾病如AD的个体的特征，并且可提供测试受试者发展神经变性疾病如AD的存在或可能倾向的指示。

在确定生物标志物在来自受试者的生物样品中的存在中，样品可划分成许多等分部分，其中单独的等分部分用于测量不同的生物标志物（但是也涵盖将生物样品划分成多个等分部分以便允许多次确定具体样品中的生物标志物的水平）。可替代地，可使用能够在单一测定中测量不同生物标志物的单独的水平的测定来测试生物样品（或其等分部分）以便在单一反应中确定多个生物标志物的水平，该测定如阵列类型测定或利用多重检测技术的测定（例如，利用以不同萦光染料标志物来标记的检测试剂的测定）。

在检查生物标志物在生物样品中的存在时，在本领域中通常在测量生物标志物时进行‘重复’测量。重复测量通常通过将样品划分成多个等分部分，并且在同一测定系统的单独反应中单独地测量一种或多种生物标志物来获得。重复测量对于本发明的方法来说并非必需的，但是本发明的实施例能够利用重复测试，尤其重复两次和重复三次的测试。

认为确定生物标志物在生物样品中的存在还可通过在本领域中已知的许多测量技术来提供，这些技术如基于亲和性的技术，它们利用特异性结合至靶标如在此描述的有待测量的AD生物标志物的分子。这类亲和性分子可认为是“亲和性试剂”并且可包括分子如抗体或适体。然而，认为其他技术例如像基于光谱法的技术（例如，基质辅助的激光解吸电离-飞行时间（MALDI-TOF）光谱法）或测量生物活性的测定（例如，测量生长因子的丝裂原活性的测定）也可使用并且认为它们能够用于确定生物标志物如AD的生物标志物的存在。

还可使用基于亲和性的技术来确定生物标志物的存在并且可认为这些技术进一步包括基于抗体的测定（免疫测定）和利用适体（特异性结合至其他分子的核酸分子）的测定如ELONA（酶联寡核苷酸测定）。另外，出于鉴别至少一种AD生物标志物的本发明的方法的目的，也涵盖同时利用抗体与适体两者的测定（例如，利用抗体来捕获和适体来检测的夹心格式测定）。

广泛多种基于亲和性的测定在本领域中是已知的。基于亲和性的测定将利用得自所感兴趣的AD生物标志物的至少一个表位，并且许多基于亲和性的测定格式利用多于一个表位（例如，两个或更多个表位涉及在“夹心”格式测定之中；至少一个表位用于捕获标志物，并且至少一个不同表位用于检测标志物）。

进一步认为基于亲和性的测定和技术可用于竞争或直接反应形式中以用于确定生物标志物的存在。这类测定将利用夹心类型格式，并且可进一步为异质的（例如，利用固体载体）或均质的（例如，发生于单相中）和/或利用免疫沉淀反应。大多数测定涉及使用标记的亲和性试剂（例如，抗体、多肽或适体）；这些标记可为例如酶、萦光、化学发光、放射性或染料分子。在另一种方法中，生物样品中的所有蛋白质可使用标准蛋白质化学技术来标记并且所标记的生物标志物是通过排列于固体载体上的亲和性试剂来捕获。扩增来自探针的信号的测定也是已知的；实例是利用生物素和抗生物素蛋白的测定，和酶标记并且介导的免疫测定，如酶联免疫吸附测定（ELISA）和ELONA测定。如熟练的受用者将了解，生物标志物或对于生物标志物具有特异性的试剂可附着至表面并且水平可直接或间接地来测量。

在异质格式中，测定可利用两个相（典型地水性液体和固体）。典型地，AD生物标志物特异性亲和性试剂结合至固体载体以便促进AD生物标志物与生物样品本体的分离。在反应持续足以允许形成亲和性试剂/AD生物标志物复合物的时间之后，典型地将含有抗体的固体载体或表面洗涤，然后检测结合的多肽。用于测量AD生物标志物的测定中的亲和性试剂可提供于载体（例如，固体或半固体）上；可替代地，样品中的多肽可固定于载体或表面上。可使用的载体的实例是硝化纤维素（例如，处于膜或微量滴定孔形式）、聚氯乙烯（例如，处于薄片或微量滴定孔形式）、聚苯乙烯胶乳（例如，处于珠粒或微量滴定板形式）、聚偏氟乙烯、重氮化纸、尼龙膜、活化珠粒、玻璃、蛋白质A珠粒、磁性珠粒以及电极。这些测定的标准与竞争格式在本领域中是已知的。因此，在一个实施例中，AD生物标志物的确定可以是作为复合物，这些复合物包含如在此描述的、结合至对于生物标志物具有特异性的试剂的一组AD预后或诊断生物标志物，其中所述试剂附着至一个表面。在此还提供复合物，这些复合物包含如在此描述的、结合至对于生物标志物具有特异性的试剂的一组AD预后或诊断生物标志物，其中所述生物标志物附着至一个表面。

进一步认为夹心抗体阵列可因此用于本发明的方法。在一个实例中，高灵敏度多重夹心ELISA可用于本发明的方法中以便分析存在于来自受试者的生物样品中的生物标志物。

在检测生物标志物的均质格式中，测定发生于单相（例如，水性液相）之中。典型地，生物样品与对于生物标志物具有特异性的亲和性试剂一起在溶液中孵育。例如，生物样品可处于将使所形成的任何亲和性试剂/抗体复合物沉淀的条件下。这些测定的标准与竞争格式在本领域中是已知的。

在一个另外的实例中，利用间接萦光检测的玻璃阵列平台可用于分析AD的一种或多种生物标志物。在一个另外的实例中，以利用间接萦光检测的玻璃阵列平台分析的该一种或多种生物标志物用于确定AD的生物标志物与对照生物标志物。

认为所形成的包含生物标志物和亲和性试剂的复合物可通过在本领域中已知的许多已知技术中的任一种来检测，这取决于测定的格式和使用者的偏好。例如，未标记的亲和性试剂可用DNA扩增技术（例如，对于适体和DNA标记的抗体来说）或结合亲和性试剂的标记的“二级”抗体来检测。在一个另外的实例中，亲和性试剂可加以标记，并且复合物的量可直接（如对于染料（萦光或可见）、珠粒或酶标记的亲和性试剂来说）或间接地（如对于用生物素、表达标签等等来“加标签”的亲和性试剂来说）来确定。

4.测量生物标志物的值

生物标志物的测量水平可为具体生物标志物的水平的一级测量并且因此为生物标志物本身的数量的测量（如通过检测样品中的生物标志物分子的数量）或它可为生物标志物的二级测量（生物标志物的数量可确定、但是不必是推导出的测量（定性数据），如酶活性的度量（在生物标志物是酶时）或编码生物标志物的mRNA的度量）。定性数据还可从初级测量中得到或获得。

例如可获得可在本发明的方法中用于测量多重蛋白质和多组组生物标志物的市售试剂盒。可使用具有以下两个组合的多重MAP（密理博（Millipore））：(I)使用CSF的α-共核蛋白、神经生长因子、β亚单位、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、帕金森氏病蛋白质5、帕金森氏病7和τ(ii)使用血清、血浆或CSF的α-1酸糖蛋白、血浆铜蓝蛋白、结合珠蛋白、血清淀粉样蛋白P组分。来自由α2巨球蛋白、载脂蛋白E、成簇蛋白α和β、血清淀粉样蛋白（SAP）、补体C3、补体因子H、γ纤维蛋白原、凝溶胶蛋白组成的蛋白质组科学血浆9重组（ProteomeSciences Plasma9-Plex panel）以及由半胱氨酸蛋白酶抑制素C、TBC、CSF样品的神经分泌蛋白VGF组成的3组测定的商业试剂盒也可用于本发明的方法中。

如在此描述，测量来自个体的生物样品中的一组生物标志物的水平。能够提供个体患有或可能发展神经疾病如AD的指示的生物标志物可通过如在此披露的任何方法来测量。生物标志物水平可使用能够确切地确定从有待测试的受试者或个体体内获得的生物样品中的生物标志物水平的任何可获得的测量技术来测量。测量可为定量或定性的，只要测量能够指示生物样品中的每种生物标志物的水平是高于还是低于所述生物标志物的参考值即可。

典型地，从受试者体内获得的测试样品中的每种标志物的水平可使用免疫组织化学或免疫测定技术例如像酶免疫测定（EIA）来确定，并且用于测定的试剂盒可容易地从许多商业供应商购得。可替代地，包括PCR或质谱平台的杂交技术可用于确定测试样品中的每种标志物的水平。测定可涉及多重技术以使得可从单一测定过程的输出来确定两种或更多种标志物的水平。

在本发明的另一个方面，在来自一个或多个个体的生物样品中，针对所鉴别的一组生物标志物中的至少一种生物标志物来确定至少一种生物标志物的水平。选择样品以使得它们可基于神经疾病或疾病来区分成一个或多个子集（例如，来自健康个体、被诊断患有其他痴呆或疾病的那些个体（作为其他痴呆对照）的样品，或来自患有确诊神经疾病的个体的样品）。在一些实施例中，获得来自一个或多个个体的一组生物样品的一组生物标志物的水平，其中样品基于受试者的确诊的神经疾病的存在来区分（segregated），并且其中受试者是健康对照。在一个实施例中，疾病是AD。

在另一个实施例中，在怀疑患有AD的受试者的样品以及淀粉样蛋白β42和载脂蛋白E（基因型）中的至少一个的对照样品中的生物标志物（在与至少再一种生物标志物相组合时，该生物标志物选自下组，该组包括皮质醇、IgM、IL-17、PPY、VCAM1、BLC以及其天然发生的变异体或片段）水平的测量所产生的标志物特征标志被测量以便产生测量值，其中生物标志物可用于预后、帮助诊断、监测和/或预测AD，并且可指示受试者发展AD或患有AD样疾病的可能性。

在一个另外的实施例中，在怀疑患有AD的受试者的样品以及淀粉样蛋白β42和载脂蛋白E（基因型）中的至少一个的对照样品中的生物标志物（在与表8中提供的至少一种另外的标志物和其天然发生的变异体或片段相组合时）水平的测量所产生的标志物特征标志被测量以便产生测量值，其中生物标志物可用于预后、帮助诊断、监测和/或预测AD，并且可指示受试者发展AD或患有AD样疾病的可能性。

这些生物标志物可形成相关变量或测量值的基础，这些变量或测量值用于产生可确定受试者发展AD或患有AD样疾病的可能性的患者的生物标志物特征标志。在一个实施例中，生物标志物特征标志的测量值可用于产生一组相关系数以便帮助预测β淀粉样蛋白的新皮质水平。

在本发明的一个另外方面，测试样品中的任何两种或更多种生物标志物的标志物水平可组合以便产生标志物特征标志（有时称为“生物标志物概况”），该特征标志的特征在于由至少两种或更多种标志物水平组成的模式。在本发明的一个实施例中，生物标志物概况可由淀粉样蛋白β42和载脂蛋白E（基因型）（在与来自包括皮质醇、IgM、IL-17、PPY、VCAM1、BLC以及其天然发生的变异体的组的至少再一个标志物相组合时）的任何组合组成。

在另一个实施例中，相对于由有待针对相关生物标志物来检查的受试者提供的测试样品，具有预定模式、即满足某些标准如AD与对照样品之间水平的最小变化倍数的生物标志物特征标志可相对于没有预定模式的标志物特征标志来指示AD。在本发明的一个另外的实施例中，来自一个或多个个体的生物样品的一组生物标志物的水平（其中样品可基于AD来分成一个或多个子集）被测量以便产生测量值，其中显著变化的生物标志物可用于预后、帮助诊断、监测和/或预测受试者的AD。

根据本发明的方法，生物标志物水平可根据在本领域中已知并且可由本领域技术人员获得的方法并且根据如在此描述的方法、如通过使用基于亲和性的测量技术来测量。如在此考虑，“亲和性”是在本领域中已得到充分理解的术语并且它被视为是一种给定试剂与另外的靶标结合的程度或强度。例如，亲和性可被认为是抗体与结合搭配物（如在此描述的用于预后的生物标志物或用于诊断的生物标志物（或其表位））的结合强度。如熟练的受用者将了解，亲和性可以按在本领域中已知的许多方式来测量和/或表示，这些方式包括但不限于平衡解离常数（K_D或K_d）、表观平衡解离常数（K_D'或K_d'）、以及IC₅₀（在竞争测定中实现50%抑制所需要的量；在此与“I₅₀”可互换使用）。

可进一步认为阵列类型的异质测定可适合于根据本发明的方法来测量生物标志物的水平，其中在一个实施例中，存在多种生物标志物的测量。在实施本发明的方法中所使用的阵列类型测定将通常利用固体衬底，该固体衬底具有以预定模式（例如，网格）结合至衬底的对于不同生物标志物具有特异性的两种或更多种捕获试剂。将生物样品施加至衬底并且样品中的生物标志物与捕获试剂结合。在去除样品（并且适当洗涤）之后，使用特异性结合至各种生物标志物的适当检测试剂的混合物来检测结合的生物标志物。检测试剂的结合可使用视觉系统如基于萦光染料的系统来完成。在一个实施例中，捕获试剂可以按预定模式安排在衬底上，并且因此阵列类型测定提供检测多种生物标志物而不需要多重检测系统的优势。

在另一个实施例中，可选择试剂以使得它们特异性结合至在本发明中鉴别的生物标志物，这些生物标志物形成指示受试者发展神经疾病如AD的存在或可能性的标志物特征标志。在仍然另外的实施例中，所选择的试剂可以作为试剂盒来提供以用于检测所鉴别的生物标志物在样品中的存在，这些生物标志物形成标志物特征标志并且可指示受试者发展神经疾病如AD的存在或可能性。在又另一个实施例中，试剂盒可提供所鉴别的生物标志物的检测，这些生物标志物可提供β淀粉样蛋白负荷的指示或预测。

如本领域技术人员将了解，在确定生物标志物的水平中检测信号的模式将取决于在测定中使用的确切检测系统。例如，如果使用放射性标记的检测试剂，那么信号将使用能够量化来自生物样品的信号或能够将来自生物样品的信号与来自参考样品的信号相比较的技术来测量，该技术如闪烁计数、自动射线照相术（典型地与扫描显像测密术相组合）等等。如果使用化学发光检测系统，那么信号典型地使用光度计来检测。检测来自检测系统的信号的方法在本领域中是熟知的并且不需在此进一步描述。

在应用本发明的方法中，如果使用免疫测定技术，那么可使用可定量或定性测量生物样品中的生物标志物水平的任何免疫测定技术。合适的免疫测定技术包括放射免疫测定、免疫萤光测定、酶免疫测定、化学发光测定、ELISA、免疫PCR、免疫红外以及蛋白质印迹测定。

同样地，可定量或定性测量生物样品中的生物标志物水平的基于适体的测定可用于本发明的方法的应用之中。总体上，在几乎所有格式的免疫测定中，适体都可取代抗体，但是适体允许另外的测定格式（如使用核酸扩增技术如PCR来扩增结合的适体或使用复合引物来进行等温扩增。

在测量AD生物标志物水平的技术的另一个实例中，在使用标准（直接反应）格式中，直接监测生物标志物/亲和性试剂复合物的水平。此举可例如通过确定所形成的、结合至生物标志物/亲和性试剂复合物的标记的检测试剂的量来完成。在竞争格式中，样品中的生物标志物的量是通过监测对于复合物中的已知量的标记的生物标志物（或其他竞争配体）的结合的竞争作用来推导。结合或复合物形成的量可定性或定量确定。

在本发明的另一个方面，提供肽、多肽、蛋白质、寡核苷酸或其片段或其他试剂，以及包含肽、多肽、蛋白质、寡核苷酸或其片段的试剂盒，这些肽、多肽、蛋白质、寡核苷酸或其片段可充当可用于确定可能指示受试者患有AD或可能发展AD的生物标志物的身份的试剂。在一个实施例中，在针对测试样品来使用时，存在于试剂盒中的任何两种或更多种生物标志物的标志物水平可产生生物标志物概况，该标志物概况的特征在于主要由至少两种或更多种标志物水平组成的模式。在一个另外的实施例中，样品的生物标志物概况或特征标志可使用特异性检测所鉴别的生物标志物的试剂来确定，这些生物标志物构成标志物概况或特征标志。在另一个实施例中，试剂可结合至根据本发明的方法所鉴别的任何生物标志物，获得这些生物标志物以便指示受试者可能患有或发展神经疾病如AD。

在本发明的另一个实施例中，肽、多肽、蛋白质、寡核苷酸或其片段或其他试剂，以及包含肽、多肽、蛋白质、寡核苷酸或其片段的试剂盒，这些肽、多肽、蛋白质、寡核苷酸或其片段可充当可用于确定生物标志物的身份的试剂。

在使用试剂盒时所获得的生物标志物概况可主要由淀粉样蛋白β42和载脂蛋白E（基因型）（在与至少再一种标志物相组合时，该标志物选自下组，该组包括皮质醇、IgM、IL-17、PPY、VCAM1、BLC以及其天然发生的变异体或片段）的任何组合组成。

在另一个实施例中，在使用试剂盒时获得的生物标志物概况可由淀粉样蛋白β42和载脂蛋白E（基因型）（在与如表8中提供的至少一种另外的标志物和其天然发生的变异体或片段相组合时）的任何组合组成，这些生物标志物被测量以便产生测量值，其中生物标志物可用于预后、帮助诊断、监测和/或预测AD，并且可指示受试者发展AD或患有AD样疾病的可能性。

在一个另外的实施例中，前述生物标志物可根据如在此描述的任何方法来用于预后或帮助检测神经疾病。在一个优选实施例中，前述生物标志物可根据本发明的方法用于预后或帮助诊断和/或监测其中疾病是AD的疾病病况。

在本发明的另一个方面，在提供预后或帮助诊断神经疾病如AD中，测量形成标志物特征标志或概况的每种生物标志物的水平可进一步包括将所检测的生物标志物的值输入用一组相关系数预校准的系统中，这些系数可帮助提供存在或不存在神经疾病的指示。在一个实施例中，测量值可相对于一组相关系数来进行比较，其中相关系数可提供样品或受试者中的β淀粉样蛋白水平的预测指示。在一个另外的实施例中，β淀粉样蛋白的水平可指示个体可能发展神经疾病如AD。在一个另外的实施例中，如由一组相关系数提供的β淀粉样蛋白的水平的指示可预测β淀粉样蛋白的新皮质水平。

在本发明的一些实施例中，在此还提供包括通过如在此描述的方法获得的值的计算机可读格式。

5.所鉴别的生物标志物的统计分析

本发明还提供鉴别适用于预后和/或监测神经疾病如AD的一种或多种生物标志物和/或通过应用统计分析来将个体分级（即，将诊断可能患有神经疾病或诊断患有神经疾病的个体分类成疾病的不同类别）的方法。

当具体生物标志物被意外鉴别到的概率小于预定值时，所鉴别的生物标志物用于确定疾病病况的有用性被认为是“统计学上显著的”。计算这种概率的方法将取决于用于比较子集之间的水平的确切方法（例如，如果使用SAM，那么q值将给出错误鉴别的概率，并且如果使用t检验（或类似统计分析），那么p值将给出该概率）。可替代地，随机森林分类和基尼指数可用于确定生物标志物是否在本发明的方法中在统计学上是相关的。对于节点的每次划分，基于随机森林中的具体变量（生物标志物），两个所得节点的基尼杂质标准小于父节点的杂质标准。将基于具体变量在森林中在每次划分时发生的基尼杂质标准减少加总可为所述变量提供重要性度量。比较这些重要性度量允许选择最重要的变量。如本领域技术人员将了解，预定值将取决于每个样品所测量的生物标志物的数量和所使用的样品数量而变化。例如，所测量的生物标志物可针对其进行比较的预定值可在高至50%到低至20%、10%、5%、3%、2%或1%的范围内。

存在用于鉴别在子集之间显著变化的生物标志物的许多统计学检验，包括常规t-检验。然而，随着所测量的生物标志物的数量增加，总体上可更便利地使用更复杂的技术，如SAM（参见图舍（Tusher）等人，美国国家科学院院刊（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.）98(9):5116-21,2001）或微阵列预测分析（PAM）（http://www-statstanford.edu/.about.tibs/PAM/index.html）或随机森林（廖（Liaw）·A&维纳（Wiener）·M，R新闻（RNews），2(3)，第18-22页，2002）。

可应用于本发明的方法中并且可有利于帮助确定生物标志物或在鉴别期间产生的模型的统计学显著性的另外的技术可包括回归和接受者工作特征曲线（ROC）（Chem.39(4)，第561-577页；M·H&坎贝尔（Campbell）·C.,1993）、树采伐（黑斯蒂（Hastie）等人，基因组生物学（Genome Biology）2001,2：研究（research）0003.1-0003.12）、自组织映射（科荷伦（Kohonen），生物控制论（Biological Cybernetics）43(1):59-69,1982）、频繁项集（阿格拉瓦尔（Agrawal）等人，美国计算机协会数据管理专业组会议论文集（Proc ACMSIGMOD），第207-216页，1993）、贝叶斯网（Bayesian networks）（圣哥达（Gottardo）等人，生物统计学（Biostatistics）(2001),11，第1-372001页）以及可购得的软件包CART和MARS。

可应用的其他统计分类器可进一步包括SMO、简单逻辑、逻辑、多层感知器（Multilayer Perceptron）、贝叶斯网（Bayes Net）、朴素贝叶斯（Naive Bayes）、简单朴素贝叶斯（Naive Bayes Simple）、朴素贝叶斯Up、IB1、Ibk、Kstar、LWL、自适应增强（AdaBoost）、回归分类（ClassViaRegression）、装饰（Decorate）、多类分类器（MulticlassClassifier）、随机委员会（Random Committee）、j48、LMT、朴素贝叶斯树（NBTree）、Part以及顺序分类器（Ordinal Classifier）。

例如，在应用随机森林技术中，样品基于分枝技术来划分，每次划分基于一种生物标志物。然后，可确定可能在统计学上显著的生物标志物的鉴别并且将重要性计分（如本文所讨论）分配给每种生物标志物。具有大于可调整阈值的计分的生物标志物被认为是所感兴趣的并且由此得以鉴别。

在本发明的一个另外方面，提供鉴别用于预后、帮助诊断和/或监测个体的神经疾病的进展和/或将个体分级的至少一种生物标志物的方法，该方法包括从来自许多个体的一组生物样品获得多种生物标志物的测量值，其中该组生物样品可基于之前是否对于生物样品达成神经疾病的诊断来分成多个子集，将每个子集的针对至少一种生物标志物的测量值相比较；并且鉴别测量值在子集之间显著不同的至少一种生物标志物。在一个实施例中，神经疾病是AD。在一个另外的实施例中，将每个子集的针对选自淀粉样蛋白β42和载脂蛋白E（基因型）的至少一种生物标志物（在与至少再一种生物标志物相组合时，该生物标志物来自下组，该组包括皮质醇、IgM、IL-17、PPY、VCAM1、BLC以及其天然发生的变异体）的测量值针对该至少一种生物标志物在各个子集之间进行比较以便鉴别针对该至少一种生物标志物的测量值是否指示它在子集之间是否是显著不同的。在一个另外的实施例中，选择至少两种前述生物标志物。在另外的实施例中，选择至少三种或至少四种或至少五种前述生物标志物。

在一个另外的实施例中，针对以下生物标志物淀粉样蛋白β42和载脂蛋白E（基因型）（在与至少再一种生物标志物相组合时，该生物标志物选自下组，该组包括皮质醇、IgM、IL-17、PPY、VCAM1、BLC以及其天然发生的变异体）中的至少一种生物标志物，诊断或评估为未患有AD的受试者的样品与被诊断患有AD的个体的对照样品之间的测量水平被测定以便产生值，其中检测到的生物标志物可用于帮助预后、帮助诊断、监测和/或预测AD，并且可指示受试者发展AD的可能性。在一个另外的实施例中，测量值可通过统计学分析来转化以便产生一个特征标志，从而帮助对提供生物样品中鉴别的至少一种生物标志物的类似测量水平的个体患有或发展AD的可能性进行预后确定或分类。

在本发明的一个另外的方面，提供鉴别多种生物标志物以便用于预后、帮助诊断和/或监测个体的神经疾病的进展，和/或将个体分级的方法，该方法包括针对多种生物标志物来从一组生物样品获得测量值，其中基于生物样品是否从已经经历神经疾病的存在的临床评估的受试者体内获得而可将该组生物样品分成多个子集。在一个实施例中，出于交叉验证的目的，将生物样品随机分成多个组。在一个优选实施例中，多个组可根据如在此提供的实例中描述的方法来交叉验证。在一个另外的实施例中，用于交叉验证的样品之间的测量水平可基于针对以下生物标志物淀粉样蛋白β42和载脂蛋白E（基因型）（在与至少再一种生物标志物相组合时，该生物标志物选自下组，该组包括皮质醇、IgM、IL-17、PPY、VCAM1、BLC、以及其天然发生的变异体中），它们是否来自被诊断为未患有AD的受试者以及来自患有AD的个体的对照样品来加以区分，其中生物标志物水平被测量以便产生测量值，其中显著变化的生物标志物可用于帮助预后、帮助诊断、监测和/或预测AD，并且可指示非临床确定的AD受试者发展AD或患有AD样疾病的可能性。

6.产生用于AD的预测评估的模型的方法

任何一种或多种生物标志物的水平的变化可用于评价新皮质淀粉样蛋白负荷以便在受试者中预后、帮助诊断神经疾病和/或监测神经疾病（例如，跟踪受试者或患者的疾病进展和/或跟踪内科或外科疗法的作用）。任何一种或多种生物标志物的水平的变化还可统计学评估以便基于一组（a panel）或一组（a set）生物标志物来产生预测模型，这些生物标志物可出于外推目的而用于基于存在于个体的生物材料中的生物标志物的水平或浓度的存在来确定个体将患有或发展AD或AD样疾病的可能性。

根据本发明的方法，发明人已经鉴别能够鉴别可存在于个体的生物样品（例如血液，包括血清或血浆）中的、并且标志物概况或特征标志在患有神经疾病如AD的个体中有所改变的多种生物标志物的方法，并且这些方法是通过评估所鉴别的一组生物标志物的浓度或水平，预测个体是否针对神经疾病的存在或发展神经疾病如AD而可能测试阳性的方法。

在本发明的一个另外的方面，提供鉴别适用于预后或帮助诊断个体的神经疾病、和/或监测个体的神经疾病的进展、和/或将患者分级（即，将诊断可能患有神经疾病或诊断患有神经疾病的个体分类成疾病的不同类别）的至少一种生物标志物的方法，该方法包括从一组生物样品获得多种生物标志物的测量值，其中该组生物样品可基于神经疾病来分成多个子集或基于神经疾病的严重程度来分级，将至少一种生物标志物的测量值进行比较；并且鉴别测量值不同（例如，在子集之间显著不同）的至少一种生物标志物，并且使用基于来自被诊断患有神经疾病的受试者的一组生物样品的测量值的统计预测系统来产生一个模型，并且使用该模型外推以便确定具有类似生物标志物的个体是否将可能测试阳性或被诊断为患有或发展神经疾病。在一些实施例中，比较过程使用随机森林来进行。在一些实施例中，神经疾病是AD。

理想地，分类算法选自下组，该组包括：变量重要性度量、线性判别分析（LDA）、对角线线性判别分析（DLDA）、对角线二次判别分析（DQDA）、SAM、随机森林（RF）、支持向量机（SVM）、支持向量回归（SVR）、神经网络、k-最近邻居方法、协方差分析（ANCOVA）。

认为在本发明的方法中，可选择用于分析生物标志物的多干组样品以使得它们可基于神经疾病来划分成一个或多个子集或基于神经疾病的严重程度来分级。在本发明的方法中，划分成子集可基于疾病的存在/不存在、疾病的分级或疾病的子分类（例如复发/缓解相比于进展性复发）。

通过本发明的方法，还提供产生模型的方法，这些模型能够基于个体体内的一组生物标志物的存在来形成并且可用于预测个体的新皮质淀粉样蛋白负荷并且因此预测个体是否有可能患有或发展AD或和AD样疾病。

本发明的一个另外的方面涉及对于由已鉴别为患有神经疾病如AD的个体的单独组的临床评估样品组成的数据的交叉验证。在一个另外的实施例中，交叉验证的数据可形成最初已经根据本发明的方法来分析的数据的子集。

因此，在本发明的一个另外的方面，提供通过预测性确定新皮质淀粉样蛋白负荷的水平（该水平进而有助于将神经疾病分级）来鉴别可用于预后、帮助诊断神经疾病如AD的至少一种生物标志物的方法，其中多种生物标志物的一组测量值是从一组生物样品获得，其中该组生物样品可相对于神经疾病来分成至少两个子集，将每种生物标志物在子集之间的所述测量值进行比较，并且鉴别子集之间的生物标志物特征标志概况。在一个实施例中，基于疾病的存在/不存在或疾病的分级来定义至少两个子集。在一个另外的实施例中，至少一个子集形成对照组，其中对照组由从评估为患有神经疾病的个体获得的生物标志物的测量值组成。在一个另外的实施例中，神经疾病是AD。

在一个另外的实施例中，所鉴别的生物标志物是针对子集之间的生物标志物特征标志概况的显著差异通过如在此描述或如熟练的受用者通常已知的任何统计学方法来进行评估。在一个另外的实施例中，统计学模型或相关系数集可使用从评估为患有神经疾病如AD的一个或多个个体的测量值获得的数据来交叉验证。在一个另外的实施例中，来自未提供有AD的诊断的受试者的测试样品可针对由评估为患有神经疾病的个体中获得的生物标志物的测量值组成的对照样品集来制备预测模型中所使用的相同生物标志物来测试，并且通过将结果与预测模型比较来提供神经变性疾病的预后。

在一个另外的实施例中，评估为患有神经疾病的个体是评估为患有AD的那些个体。在一个另外的实施例中，评估为患有AD的个体是已经使用特异性识别大脑组织中的Aβ的存在的放射性示踪剂基于新皮质淀粉样蛋白负荷而提供有AD的阳性诊断的那些个体。在一个优选实施例中，识别Aβ的放射性示踪剂是PiB。

在一个优选实施例中，用于交叉验证的样品之间的测量水平可基于来自患有AD的个体的对照样品针对以下进行区分：来自下组生物标志物的至少一种生物标志物：淀粉样蛋白β42和载脂蛋白E（基因型）（在与至少再一种生物标志物相组合时，该生物标志物来自下组，该组包括皮质醇、IgM、IL-17、PPY、VCAM1、BLC、以及其天然发生的变异体），并且根据如在此披露的方法来产生统计预测模型，测量有待测试的受试者的一组相同生物标志物并且确定相同测量的生物标志物的值，转化来自所测试个体的测量水平以便产生与由对照样品提供的模型类似的模型，并且根据对于对照样品产生的模型来评估个体是否可能患有或发展神经疾病如AD。

这些生物标志物可形成相关变量的基础，这些变量用于产生患者的可确定受试者发展AD或患有AD样疾病的可能性的相关特征标志。所鉴别的生物标志物可形成一组相关系数或一个预测模型，这些相关系数或该预测模型可用于确定受试者的新皮质淀粉样蛋白负荷的理论量。

在一个另外的方面，本发明包括多种方法，其中至少两个不同数据集可基于从个体获得的一组鉴别的生物标志物的测量水平来产生，其中这些数据集基于它们的组成来区分并且其中组成是基于以下来决定：是否已经针对个体达到了临床或诊断评估以便确定他们是否患有神经疾病如AD。在一个实施例中，提供神经疾病的阳性诊断的数据集由从被诊断为患有AD的个体获得的数据组成。在一个另外的实施例中，从具有AD的阳性诊断的个体获得的数据集是由已经评估为具有高新皮质淀粉样蛋白大脑负荷的个体来提供。在一个另外的实施例中，淀粉样蛋白负荷由特异性识别大脑组织中的β淀粉样蛋白的存在的放射性示踪剂来测量。在一个优选实施例中，识别β淀粉样蛋白的放射性示踪剂是PiB。

一个另外的方面，本发明的方法是通过获得来自一组生物样品的多种生物标志物的一组测量值来进行，其中该组生物样品是从在临床评估下鉴别的被诊断患有神经疾病如AD的至少一个个体体内获得，并且其中可出于产生能够形成用于提供神经疾病如AD的预后的系统的统计学预测模型的数据集的目的，该组可进一步分成至少两个子集，并且其中将模型应用于未经历神经疾病的临床诊断的个体的生物样品中测量的所鉴别的一组生物标志物并且可预测个体患有或发展神经疾病如AD的可能性。在一个另外的实施例中，多个测量值或预定的经过验证的样品可由分组为群组的个体来提供。在一个另外的实施例中，临床诊断是基于新皮质淀粉样蛋白的水平或所存在的淀粉样蛋白负荷。

在本发明的一些实施例中，针对来自一个或多个个体的一组生物样品来获得一组生物标志物的水平。选择样品使得它们可基于神经疾病来区分成一个或多个子集（例如，来自正常个体和诊断患有肌萎缩性侧索硬化的那些个体的样品、或来自患有轻度AD的个体和患有重度AD和/或其他神经疾病如神经变性疾病的那些个体的样品）。

在一个另外的方面，本发明的方法进一步包括将如在此描述来自每个子集的、针对至少一个生物标志物的测量值进行比较并且可进一步将非生物标志物包括在统计分析中。在一个实施例中，非生物标志物可为临床标志物，如获得该组生物样品的个体的年龄，如在此描述（参见，例如，在此的实例）。在一个实施例中，在比较个体年龄之后，将子集进一步与来自个体的临床标志物值进行比较。在一个优选实施例中，临床标志物值包括所获得的该组生物样品的临床值，如临床痴呆评级（CDR）、体重指数，如在此描述（参见，例如，在此的实例）。

在一个另外的方面，本发明的方法进一步包括针对以下来将来自每个子集的测量值进行比较：来自下组的至少一种生物标志物：淀粉样蛋白β42和载脂蛋白E（基因型）（在与至少再一种生物标志物相组合时，该生物标志物来自下组，该组包括皮质醇、IgM、IL-17、PPY、VCAM1、BLC以及其天然发生的变异体或片段相组合时），并且这些方法进一步包括将获得该组生物样品的个体的临床标志物值如CDR或体重指数或两者进行比较，如在此描述（参见，例如，在此的实例）。在一个实施例中，预测模型是基于返回的测量值来产生。

在一个另外的实施例中，在比较个体的临床标志物值之后，子集进一步通过检查以下各项来比较：所研究个体的年龄、人口统计学、教育水平、年龄、性别、采样位置、社区参与、体重指数、婚姻状况、受教育年限、APOE基因型、贫血状况、身体活动四分位、颅内容积以及海马容积。

在一个另外的方面，本发明提供产生用于预后个体的神经疾病如AD的预测模型的方法，该方法是通过将来自测试受试者的生物标志物的测量值用从评估为临床诊断或可能患有神经疾病如AD的个体确定的临床评估标志物来补充。在一个另外的实施例中，本发明的方法进一步包括如在此描述针对至少一种生物标志物将来自每个子集的测量值进行比较，并且可进一步包括将获得该组生物样品的个体的另外临床标志物值如CDR或体重指数进行比较。

在一个另外的方面，本发明提供制备统计学模型的方法，这些模型能够基于从个体获得的生物样品中的形成标志物特征标志的一组生物标志物的存在来产生，并且可用于预测个体是否可能患有或发展AD或和AD样疾病，其中模型是基于由鉴别为患有神经疾病如AD的个体的单独组的多个预验证样品组成的数据来产生。在一个实施例中，个体的单独组的多个预验证样品可通过来自这些个体的生物流体样品以前已经得以测定的受试者或个体的群组研究数据来获得。

在一个另外的实施例，本发明包括多种方法，其中从基于从个体获得的一组鉴别的生物标志物的测量水平的至少两个相异的数据集来制备统计模型，其中这些数据集是基于它们的组成来区分并且其中该组成基于以下来确定：是否已经针对个体来进行临床或诊断评估以便确定它们是否患有神经疾病如AD。在一个另外的实施例中，至少一种生物标志物是选自以下一组生物标志物：淀粉样蛋白β42和载脂蛋白E（基因型）（在与如表8提供的至少一个另外的标志物和其天然发生的变异体或片段相组合时）。在一个实施例中，至少一种生物标志物是选自以下一组生物标志物：淀粉样蛋白β42和载脂蛋白E（基因型）（在与至少再一种生物标志物相组合时，该生物标志物来自下组：即皮质醇、IgM、IL-17、PPY、VCAM1、BLC、淀粉样蛋白β42、载脂蛋白E、皮质醇和/或BLC、IgM、IL-17、胰多肽和VCAM1、以及其天然发生的变异体或片段。

在一个另外的实施例中，本发明的方法进一步包括针对如在此描述的至少一种生物标志物将来自每个子集的测量值进行比较并且可进一步包括将获得该组生物样品的个体的另外的临床标志物值如CDR或体重指数进行比较并且转化来自所测试个体的测量水平以便产生统计模型，从而评估个体是否有可能患有或发展神经疾病如AD。在一个另外的实施例中，统计模型是使用诊断患有AD的个体的生物标志物的对照测量根据在本领域中已知的任何已知临床方法来产生。

在一个另外的实施例中，提供神经疾病的阳性诊断的数据集由从被诊断为患有AD的个体获得的数据组成。在一个另外的实施例中，从具有AD的阳性诊断的个体获得的数据集由已经用特异性识别大脑组织中的Aβ的存在的放射性示踪剂来评估的个体来提供。在一个优选实施例中，识别Aβ的放射性示踪剂是PiB。

在另外的实施例中，根据本发明的方法所使用的统计学方法包括通过使用随机森林（RF）来针对至少一种生物标志物将来自每个子集的测量值进行比较。在一些实施例中，方法在提供预后或帮助诊断个体的神经疾病如AD中提供至少85%的灵敏度和至少85%的专一性。

7.统计模型

比较测量值并且评估数据集的过程可通过在本领域中已知的任何方法来进行，包括随机森林（RF）、微阵列的显著性分析、树采伐、CART、MARS、自组织映射、频繁项集或贝叶斯网。在本发明的一些实施例中，比较测量值的过程通过选自下组的统计方法中的一种或多种来进行，该组由以下各项组成：提升树（Boosted Trees，BT）、微阵列线性模型数据（LIMMA）、分类树（CT）、线性判别分析（LDA）以及逐步逻辑回归、缩小质心、稀疏偏最小二乘或灵活判别分析。

若干不同分析方法可基于用于本发明的方法中的生物标志物值的小子集和淀粉样蛋白负荷，用于产生区分AD与健康对照参与者的公式或模型（或更具体地说，基于疾病严重程度根据淀粉样蛋白负荷的量或未诊断患有AD的那些参与者来将参与者分级）。多种方法的使用增加了关于最终一组生物标志物的有用性的结论的稳定性，因为每种方法带来不同偏差。通过多种方法选择的生物标志物更可能提供有效的预测。可进一步认为数据的交叉验证或使用训练集可提供完善统计预测并且进一步帮助确定可从多个预定的经过验证的样品中选择哪些生物标志物来形成生物标志物特征标志或概况的方法，该生物标志物特征标志或概况可帮助形成一组相关系数或预测模型来指示新皮质淀粉样蛋白负荷。

在一个实例中，使用训练集/测试集方法以使得用于拟合模型的数据独立于用于测试其作为预测器的性能的数据。多组AD病例以及已经用PiB放射性示踪剂来PET成像的那些AD病例各自划分成训练集和测试集，其中测试集不用于产生统计模型。将模型拟合至训练集并且其性能是使用ROC针对测试集来评估。将拟合和测试重复许多次（为了完善模型而视为必需），并且基于多次数据划分来产生许多训练和测试数据集。

然后，许多另外的统计学方法可用于鉴别给出单独AD组之间的良好判别的生物标志物的小子集。

RF（分类）是使用分类树来推断每种情况的类成员的一种变量选择方法。RF生长出许多分类树（森林），并且对来自树的投票数量（每个树提供一个具体类的投票）进行计数以便预测类成员。RF输出变量重要性，变量重要性是关于每个变量能够预测类成员的良好程度的相对度量。将变量重要性绘图为每个RF模型的精确度的平均降低。为了编制有用生物标志物的约简列表，并且提高类预测的精确度，可基于变量重要性来计算变量约简之后的多个RF重复。

LIMMA方法广泛地用于分析微阵列数据。它的一般目的是识别两个类之间的基因表达差异，其中P>>N（即，与观察相比，变量更多）。该方法典型地开始于将标准线性模型拟合至数据，并且然后使用经验贝叶斯方法来借用（borrow）各个变量的信息（减少样品误差），并且使用具有增强的自由度的适度t-统计量。LIMMA方法输出假发现率（FDR）调整的p-值（q-值），该值适用于平均样品之间的相对差异。LIMMA方法可用于确定HC与AD参与者之间的平均生物标志物水平的差异。

CT方法是非线性回归的替代方法，其中多个变量之间存在许多复杂的相互作用，不论它们在性质上是连续还是分类的。该方法产生数据的多次划分或细分（递归划分）以使得多个变量之间的相互作用变得更简单。循环划分类似于产生多个分类树，其中内部分支是问题，并且外部树叶是问题的答案。一旦已经制定简单划分或树，简单局部模型在输出最终树结构之前进行计算，包括每个分支（或变量）应划分的标准。此方法具有以下优势：(i)它允许看到选择了哪些变量用于模型中的最终树，并且(ii)它允许进一步生物标志物分析与接受者工作特征曲线（ROC）分析的组合；整合生活方式、基因标志物以及生物标志物以便识别成比例的AD风险。

BT（分类）是一种变量选择和类预测方法，该方法建立最初二元分类树（根节点以及两个子节点），并且然后基于来自在先树的划分剩余来拟合另一棵树。此计算可重复许多次，并且充当加权重塑过程，然后将来自所有树的类预测的投票合计。BT输出一种相对影响度量，类似于变量重要性，该度量可提供关于每个变量能够预测类成员的良好程度的相对度量。BT方法也产生类成员的预测概率，该概率适用于预测类成员与实际类成员的比较。

LDA是确定将两个或更多个类组分开的变量的线性组合的一种统计学方法。

逐步逻辑回归是其中许多预测变量被添加至逻辑回归框架的一种统计学方法，并采用多个“步骤”来添加/去除变量以便减少统计模型内的误差。以这种方式，该方法精确地评价添加至模型中的每个变量并且确定每个变量对于预测的贡献程度。因此，使用选自如在此描述的RF、BT、LIMMA以及CT方法的生物标志物（包括年龄），可进行逐步逻辑回归并且与标准逻辑回归相比较。

8.基于AD生物标志物的AD的预后确定

如之前在此讨论，用于AD的生物标志物或AD生物标志物是可在来自个体的样品如血液样品中发现并且测量的任何蛋白质或核苷酸或肽标志物，该标志物在样品中的水平在与提供参考水平的参考（对照样品）中的标志物水平比较时能够与AD预后相关联。

在一方面，所鉴别的许多生物标志物的水平可形成标志物特征标志或概况，该特征标志或概况可用于预测受试者体内的新皮质淀粉样蛋白负荷的水平。在一个实施例中，可通过以下确定新皮质淀粉样蛋白负荷的水平：基于从多个预定的经过验证的样品所鉴别的生物标志物来产生一组相关系数或预测模型。在一个另外的实施例中，来自在获得多个预定的经过验证的样品中所测定的个体的非生物标志物可输入到所鉴别的生物标志值之中，以便产生用于预测新皮质淀粉样蛋白负荷的水平的一组相关系数或预测模型。在一个另外的实施例中，多个预定的经过验证的样品可从个体的群组研究中获得。在仍然另外一个实施例中，多个预定的经过验证的样品或群组研究可进一步包括来自临床诊断为患有神经疾病如AD的个体的值。在仍然另外一个实施例中，个体的子集可通过放射性示踪剂检查评估来经历针对新皮质淀粉样蛋白负荷进行的成像或分析。在一个优选实施例中，放射性示踪剂检查可使用如本领域技术人员已知的PiB来进行。

如在实施本发明的AD预后方法（即，提供预后或帮助预后AD的方法）中将了解，如果使用多于一种的AD预后生物标志物，AD的预后评估可不同并且改进灵敏度或专一性。例如，在一些实施例中，当该方法利用五个AD预后生物标志物时，结果将被认为建议或指示个体的AD成功预后具体水平的百分比置信度，而如果使用由生物标志物与非生物标志物（如临床标志物）组成的六种、七种、八种或九种标志物，则百分比置信度（以及由此的灵敏度以及专一性）以及预后AD的可能性可增大。在一些实施例中，在预后AD中使用标志物的总体模式（例如每种标志物与一组或多组参考水平相比较的情况如何）。可使用如在此描述的各种算法、分类器和/或决策树来评估生物标志物的总体水平以便确定预后或帮助预后AD。

如本领域技术人员将认识到，在此披露的方法可包括使用多种生物标志物（可为或可不为AD标志物）中的任何一种来确定一种或多种生物样品的完整性和/或特征（例如性别）。可评估的另外生物标志物的实例提供于表8中。

AD预后可根据如健康专业人士已知、公认并且使用的任何一种或多种已知临床标准如临床神经心理学或行为评价来确定或确认。如在此描述，蛋白质和肽生物标志物淀粉样蛋白β42和载脂蛋白E（基因型）（在与至少再一种生物标志物相组合时，该生物标志物选自下组，该组包括皮质醇、IgM、IL-17、PPY、VCAM1、BLC以及其天然发生的变异体或片段）可用于预后或帮助诊断AD并且特征在于以下一个或两个：1)基于个体，AD受试者中的生物标志物的值显著不同于对照样品（如年龄匹配）中的值，并且2)作为由多个生物标志物组成的生物标志物特征标志的要素，AD受试者中的生物标志物的值的变化相对于等效对照是显著的，如与在适当对照样品中对于相同生物标志物所观察到的表达模式相比，这些生物标志物一起建立指示受试者中的AD的值变化模式。

在本发明的方法中，为了将测试样品分类为AD阳性，或将受试者分类为患有AD，获得至少一种生物标志物的值并且与预测模型或一组预定的相关系数相比较。应了解可使用任何数量的单独显著的生物标志物，例如淀粉样蛋白β42和载脂蛋白E（基因型）（在与至少再一种生物标志物相组合时，该生物标志物选自下组，该组包括皮质醇、IgM、IL-17、PPY、VCAM1、BLC、或表8列出的那些、以及其天然发生的变异体或片段）中的任何一个或多个。

根据本发明的一个另外的实施例，在预测临床表型、疾病检测、监测以及治疗AD中，与任何单独标志物的绝对浓度相比，生物标志物淀粉样蛋白β42和载脂蛋白E（基因型）（在与至少再一种生物标志物相组合时，该生物标志物来自下组，该组包括皮质醇、IgM、IL-17、PPY、VCAM1、BLC以及其天然发生的变异体或片段）作为复合物或集合体在流体或其他流体中的浓度（任选地进一步包括临床标志物CDR或体重指数）更具有预测能力。另外，另一实施例可另外包括用于评估的另外临床标志物，这些临床标志物可选自下组，该组包括性别、采样位置、社区参与、贫血状况、年龄、婚姻状况、受教育年限、身体活动四分位、颅内容积或海马容积。

生物标志物值的分析可进一步涉及将至少两种生物标志物的值与预定预测模型或一组相关系数的值进行比较。在一个实施例中，该组相关系数是根据如在此描述的方法来获得。分类分析或算法可容易应用于使用计算机过程的标志物水平的分析。例如，可产生参考3D轮廓图，这种图反映与AD的疾病分类相关的如在此描述的生物标志物水平。对于任何给定受试者，可产生可比的3D图并且将该图与参考3D图相比较以便确定受试者是否具有指示AD的生物标志物特征标志。分类分析，如分类树分析完全适合于分析生物标志物水平，因为它们尤其适合于图形显示并且易于解释。然而，应了解可使用任何基于计算机的应用程序，该程序将来自两个不同受试者或来自参考样品以及受试者的多种生物标志物水平进行比较，并且提供如在此描述指示AD的疾病分类的输出。

在不同实施例中，在预后或帮助诊断的方法中通过使用该组生物标志物和/或临床标志物所获得的灵敏度是至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约71%、至少约72%、至少约73%、至少约74%、至少约75%、至少约76%、至少约77%、至少约78%、至少约79%、至少约80%、至少约81%、至少约82%、至少约83%、至少约84%、至少约85%、至少约86%、至少约87%、至少约88%、至少约89%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%。在不同实施例中，在预后或帮助诊断AD的方法中通过使用该组生物标志物所获得的专一性是至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约71%、至少约72%、至少约73%、至少约74%、至少约75%、至少约76%、至少约77%、至少约78%、至少约79%、至少约80%、至少约81%、至少约82%、至少约83%、至少约84%、至少约85%、至少约86%、至少约87%、至少约88%、至少约89%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%。在不同实施例中，在预后或帮助诊断AD的方法中通过使用该组生物标志物所获得的总精确度是至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约71%、至少约72%、至少约73%、至少约74%、至少约75%、至少约76%、至少约77%、至少约78%、至少约79%、至少约80%、至少约81%、至少约82%、至少约83%、至少约84%、至少约85%、至少约86%、至少约87%、至少约88%、至少约89%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%。在一些实施例中，灵敏度和/或专一性是相对于AD的临床诊断来测量。

在本发明的某些实施例中，AD生物标志物的水平是在多于一个的时间点从个体中获得。这种“连续”取样完全适合于本发明的涉及监测AD患者中的AD进展的方面。连续取样可以按任何所希望的时间表来进行，如每月、每季度（即，每三个月）、每半年、每年、每两年或更小频率。可在每次测量新样品时进行测量水平与参考水平之间的比较，或对于较小频率的分析，可保持关于水平的数据。

如本领域技术人员将了解，生物样品包括通常是从怀疑患有AD或发展AD的个体体内收集的生物样品。本发明也涵盖来自希望AD诊断的个体的样品。可替代地，在没有AD、疑似AD或AD风险的任何指示的情况下，个体（或涉及在例如研究中的其他人和/或临床医生可能希望这类评价。例如，正常个体可能希望这种信息。这类个体最通常是65岁或更年长，但是当怀疑发作AD或家族性AD时，从其获取生物样品（如用于本发明方法中的生物样品）的个体可年轻至35至40岁。

本发明还提供筛选用于治疗AD的候选剂的方法，该方法是通过针对调节该组AD生物标志物的活性来测定预期候选剂。筛选测定可体外和/或体内进行。在此描述的筛选方法中鉴别的候选剂可适用作为治疗AD的治疗剂。

9.受试者的AD病况的定性

如在此描述，本发明提供确定计算受试者的新皮质淀粉样蛋白负荷的理论值的方法，以便于帮助预测受试者的神经疾病如AD的病况或可能病况（即病况：AD相比于非AD）。AD的存在或不存在是通过测量相关的一种或多种生物标志物，并且然后将值与一组相关系数或预测模型一起递交至分类算法来确定。在此，将所测定的一种或多种模式生物标志物的具体值与相关系数或预测模型相关联以使得然后通过预测新皮质淀粉样蛋白负荷来将受试者与AD的具体风险水平相关联。

因此，在本发明的一个另外的方面，提供如在此描述的方法的处于系统例如像计算机软件程序形式的实行方案，该系统可由医生以及研究人员用于表征和/或量化一个受试者或一组受试者的神经疾病如AD。

在利用本发明的方法的系统的应用的实例中，对于每个受试者，将关于使用者的信息（例如年龄、性别）与所测定的受试者的生物样品组合输入。然后，软件计算计分。在一个实例中，淀粉样蛋白负荷可返回为PiB阳性或PiB阴性。可替代地，相对于SUVR计分来归一化的淀粉样蛋白负荷可在0.0与1.0之间。在一个另外的实例中，SUVR计分可大于1.5或小于1.5，并且该计分可基于所计算的新皮质淀粉样蛋白负荷来指示所测定的受试者的AD的可能病况，并且该计分基于存在于生物样品中的一组生物标志物的测量值。在这种实例中，<1.5的SUVR计分对应于健康个人并且1.5或更高的SUVR计分对应于被认为可能患有或发展AD的个人，其中考虑到受试者的人口统计状况如年龄、性别等。在一个另外的实例中，可想到阈值可为1.5或1.4或1.3，这取决于测量或转化数据的适当情况。进一步认为来自PiB图像的SUVR计分可在例如0.0与4.0之间变化，但是在具体情况中，数据可转化以使得返回数字在任何所需范围或数量之间变化。

然后，PiB阳性或阴性的评分可用于帮助进一步诊断受试者，评价治疗功效（如果治疗有效，计分应下降），或计算个体组的平均计分以便研究新疗法或组的具体特征（例如基因突变）。在一个另外的实例中，治疗功效可通过对于具体受试者所测量的SUVR计分减少来评估。此“AD计分”反映受试者朝向AD的进展。它提供新受试者在单一时间点的定量或接近于定量的评价，并且允许监测给定受试者或群体的疾病进展。

本发明的生物标志物可用于预后测试以便提供受试者的AD病况的评价，例如用于诊断AD疾病。短语“AD病况”包括区分：尤其AD对比非AD，并且具体地说AD对比非AD正常、MCI对比非AD正常、或AD对比MCI。基于此状况，可能指示另外的程序，包括另外的诊断测试或治疗程序或方案。

诊断或预后模型或测试正确预测病况的能力通常测量为测定的灵敏度、测定的专一性或ROC曲线下面积。灵敏度是测试预测为阳性的真实阳性的百分比，而专一性是测试预测为阴性的真实阴性的百分比。ROC曲线提供的测试的灵敏度随着专一性而变化。ROC曲线下面积越大，测试的预测值越强大。测试效用的其他有用度量是阳性预测值以及阴性预测值。阳性预测值是测试为阳性的实际阳性的百分比。阴性预测值是测试为阴性的实际阴性的百分比。

ROC方法主要用作定义某些标志物可藉以正确地将个人分类至指定类别中的标准的精确测量工具。ROC分析提供多个结果，其中一个，即曲线下面积（AUC）是评价模型性能的有用度量。AUC统计可用于生物标志物分析中以便将使用不同数量的生物标志物的逻辑回归与逐步逻辑回归模型（例如，来训练集数据）进行比较。还可将来自对于测试集数据来计算的统计模型的灵敏度以及专一性进行作图以便提供模型性能的图形比较。

因此，来自个体的生物样品的这些生物标志物中的任何一种或多种的水平的变化可用于评价认知功能、诊断或帮助预后或诊断神经疾病和/或监测患者的神经疾病（例如，跟踪患者的疾病进展和/或跟踪内科或外科疗法在患者中的作用）。这些生物标志物中的任何一种或多种的水平的变化也可用于将患者分级（即，将诊断可能患有神经疾病或诊断患有神经疾病的个体分类成疾病的不同类别）、并且诊断或帮助诊断轻度认知障碍（MCI）、以及诊断或帮助诊断认知障碍。

熟练的受用者应了解，如在此描述的本发明的方法在预后、帮助诊断和/或监测患有神经疾病的个体和/或将个体分级方面的敏感度和/或选择性将总体上更大，当该方法包括比较生物样品中的所有生物标志物的测量值时。

在此提供帮助诊断AD的方法，该方法是通过获得来自个体的生物样品（例如像来自个体的生物样品）中的多组AD预后生物标志物的测量水平，并且将那些测量水平与参考水平比较，其中多组生物标志物可包括淀粉样蛋白β42以及载脂蛋白E（基因型）（在与至少再一种生物标志物相组合时，该生物标志物选自下组，该组包括皮质醇、IgM、IL-17、PPY、VCAM1、BLC以及其天然发生的变异体或片段），或可包括临床标志物CDR或体重指数或两者，任何一个组可任选地包括另外生物标志物（例如一个、两个、三个或更多个另外生物标志物）。

如在此描述的提供预后或帮助诊断AD的方法可包括任何以下步骤：获得来自个体的生物样品，测量样品中的该组生物标志物中的每个生物标志物的水平并且将测量值与适当参考如一组预定相关系数比较；基于测量值与该组相关系数的比较来预测AD病况。比较样品中的用于AD预后的生物标志物的测量值可对于所识别的一组生物标志物中的每个生物标志物来进行，这些生物标志物可形成指示新皮质淀粉样蛋白负荷的具体生物标志物特征标志或概况。本发明还提供评价在此描述的分析方法的结果的方法。这种评价总体上需要评审这类结果并且可帮助例如指导关于临床和/或诊断随访和/或治疗选项。本发明还提供针对以下任何一个或多个指标来评价生物样品的方法：AD；AD进展，该方法是通过如在此描述来测量一组生物标志物中的每个生物标志物的水平或获得其测量值或比较其测量值。

本发明的一个另外的方面包括评价如来自单一或多个集合中心的被诊断患有AD或预测处于转化成AD的风险中的个体或个体的一个或多个群体中的治疗模式的功效的方法，该方法包括以下步骤中的任何一个：获得经受治疗的一个或多个个体的生物样品；测量样品中的该组生物标志物中的每个生物标志物的水平并且将测量水平与适当参考比较，参考在一些实施例中是在治疗之前从一个或多个个体获得的流体样品中的生物标志物的测量水平；获得来自这个或这些个体的样品中的该组生物标志物的每个生物标志物的测量水平并且将测量水平与适当参考比较；将从来自这个或这些个体的样品中获得的该组生物标志物中的每个生物标志物的测量水平与适当参考比较；测量来自这个或这些个体的样品中的该组生物标志物的每个生物标志物的水平；测量来自这个或这些个体的样品中的该组生物标志物的每个生物标志物的水平并且将测量水平与适当参考比较；基于测量水平与适当参考的比较来诊断治疗功效；或获得样品中的该组生物标志物中的每个生物标志物的测量值。该组生物标志物中的每个生物标志物的测量水平可在治疗形式的评价过程中获得一次或多次。

在一些实施例中，本发明的生物标志物可与个体的年龄组合用于帮助预后、诊断和/或诊断个体的神经疾病，例如，如在此描述（例如，如在此的实例部分中所描述）。

对于如在此描述的提供AD预后的方法，参考水平还可被认为是总体上被认为对于具体AD诊断生物标志物是‘正常’的预定水平（例如，诊断未患有AD的年龄匹配个体的平均水平或诊断患有除AD以外的神经疾病的年龄匹配个体和/或健康年龄匹配个体的平均水平），但是也涵盖同时确定的参考水平（例如，得自包括所测试的样品的样品池的参考值）。

如在此描述，结果的评价可取决于数据是否是通过在此描述的定性或定量方法来获得和/或所使用的参考点的类型。例如，可获得AD生物标志物水平相对于另一参考水平的定性测量，定性测量可以是相对于另一AD生物标志物的水平。在在此描述的其他方法中，可获得生物样品中的定量或绝对值，即蛋白质浓度水平。“定量”结果或数据是指绝对值，该值可包括样品的以pg/mL或ng/mL分子为单位的生物标志物的浓度。定量值的实例是直接通过例如ELISA获得的蛋白质水平的浓度测量。“定性”结果或数据提供与参考值比较的相对值。在在此的一些实施例中，定性测量是通过过滤器上的信号强度来评价。在在此的一些实施例中，对于AD生物标志物具有特异性的多种抗体附着至合适表面，例如如载玻片或过滤器。结果的定性评价可包括归一化数据。在本披露中，描述生物标志物的不同集合。应了解本发明涵盖使用这些集合中的任何一个。

10.确定发展疾病的风险

在本发明的一个另外的方面，提供确定受试者的发展疾病的风险的方法。生物标记物值或模式是各种风险状况的特征，例如高、中等或低。发展疾病的风险是通过测量该一种或多种相关生物标志物，并且然后将其提交至分类算法来确定。在一个实施例中，分类算法给出提供存在的β淀粉样蛋白（Aβ）的量的指示的公式。在一个另外的实施例中，分类算法给出提供来自受试者的测试样品的新皮质淀粉样蛋白负荷的指示的功能。

在一方面，本发明提供确定受试者的疾病阶段的方法。疾病的每个阶段都具有特征量的一种生物标志物或相对量的一组生物标志物（模式）。疾病的阶段是通过测量该一种或多种相关生物标志物，并然后将其提交至分类算法或将其与参考量、一组相关系数和/或与具体阶段相关的特定生物标志物概况进行比较来确定。

在一个实施例中，该一种或多种相关生物标志物是被识别为指示AD或和AD样疾病的可能预后的那些标志物。在一个另外的实施例中，将生物标志物相对于分类算法来比较或将其与参考量的从群组数据或被识别和/或临床诊断为患有神经疾病如AD的受试者获得的生物标志物进行比较。在一个特别优选实施例中，针对生物标志物值的该组相关系数是从通过对于Aβ具有特异性的临床放射性示踪剂诊断而确定患有AD的个体中获得。在一个另外的实施例中，所获得的该组相关系数提供新皮质淀粉样蛋白负荷的指示，该指示可提供所测试的受试者将发展AD或AD样疾病的可能性的预测解释。

在一个另外的实施例中，所评估的生物标志物可选自淀粉样蛋白β42以及载脂蛋白E（基因型）中的任何一种（在与至少再一种生物标志物相组合时，该生物标志物来自下组，该组包括皮质醇、IgM、IL-17、PPY、VCAM1、BLC以及其天然发生的变异体或片段），其中生物标志物水平被测量以便产生测量值，这些测量值可通过如在此描述的分类算法与从群组数据或被鉴别和/或临床诊断为AD的受试者获得的等效参考生物标志物的值进行比较。

在一个另外的实施例中，本发明的方法另外包括：包括获得该组生物样品的另外临床标志物值CDR或体重指数或两者，并且将这些值输入分类算法以便提供预测受试者将患有或发展AD的可能性的进一步增加的灵敏度和选择性。

11.数据分析

根据本发明，认为在此描述的用于预后、帮助诊断受试者发展AD的可能性的方法可使用能够实施前述方法的任何装置来实施。可使用的装置的实例包括但不限于电子计算装置，包括所有类型的计算机。当本专利描述的方法实施于计算机中时，可用于配置计算机来进行方法的步骤的计算机程序可包含于能够含有计算机程序的任何计算机可读介质中。可使用的计算机可读介质的实例包括但不限于磁盘、CD-ROM、DVD、ROM、RAM以及其他存储器以及计算机存储装置。可用于配置计算机来进行方法的步骤的计算机程序还可提供于电子网络上，例如互联网、万维网、内部网或其他网络。

在一个实例中，如在此描述的方法可实施于包括处理器以及计算机可读介质的系统中，这种计算机可读介质包括导致系统进行在本专利中描述的方法的步骤的程序代码构件。处理器可为能够进行用于实施这些方法所必需的操作的任何处理器。程序代码构件可为在系统上实施时可导致系统进行在本专利中描述的方法的步骤的任何代码。程序代码构件的实例包括但不限于进行本专利中描述的方法的指令，这些指令用高级计算机语言如C++、Java或Fortran编写；进行本专利中描述的方法的指令，这些指令用低级计算机语言如汇编语言来编写；或进行本专利中描述的方法的指令，这些指令处于计算机可进行形式如汇编以及连接机器语言。

检测相关生物标志物所产生的的数据可借助于可编程的数字计算机来分析。计算机程序分析数据以便指示所检测的生物标志物的数量，和任选地检测信号的强度以及每种生物标志物的所确定的分子质量。数据分析可包括确定生物标志物的信号强度和去除偏离预定统计分布的数据的步骤。例如，所观察到的峰可通过相对于一些参考来计算每个峰的高度来归一化。参考可以是仪器产生的背景噪声和化学品，如在尺度上设定为零的能量吸收分子。

计算机可将所得数据转化成各种格式以便显示。分析总体上涉及鉴别光谱中的代表分析物的信号的峰。峰选择可在视觉上完成，但是软件可作为可使峰检测自动化的工作的一部分获得。

12.监测AD进展

在一个另外的方面，本发明提供监测AD患者中的AD进展的方法。如在此针对定量数据（也被称为绝对测量）使用的患有“可疑AD”的个体是如下个体：(a)已经诊断患有AD或已经给出可能患有AD的诊断，并且(b)已经用简易精神状态检查（MMSE）（在福斯坦因等人1975中提及）来评价并且记分为25-28或在MMSE测试时将取得25-28的MMSE计分。因此，“可疑AD”是指MMSE记分为25-28和或在MMSE测试时将取得25-28的MMSE计分的个体中的AD。

参考水平可以是对于具体生物标志物被认为‘正常’的预定水平（例如，未诊断患有AD的年龄匹配和/或性别匹配个体的平均水平），或可以是具体患者的历史参考水平（例如，从来自同一个体的样品、但是在较早时间点获得的生物标志物水平）。也涵盖同时确定的参考水平（例如，得自包括所测试的样品的样品池的参考值）。因此，本发明提供监测AD患者中的AD进展的方法，该方法是通过获得来自生物样品例如像生物样品的该组生物标志物中的每个生物标志物的定量值，并且将测量值与参考值比较。例如，测量值的减小或增加指示或暗示（诊断或暗示诊断）AD患者中的AD的进展（例如，严重性增加）。在一个实例中，监测受试者或患者的AD病况可通过测量相关生物标志物的值来监测，以便确定如通过实际、预测或理论SUVR计分所确定的AD病况是否从大于SUVR1.5（指示可能阳性AD病况）变化至小于SUVR1.5（指示正常或可疑阴性AD病况）。在一个另外的实例中，可监测患者或受试者中的AD病况以便确定AD病况是否变得更差，以使得AD病况从小于SUVR1.5（指示正常或可疑阴性AD状态）变化的大于SUVR1.5（指示可能阳性AD状态）。还可认为SUVR1.1至1.3的变化所提供的指示可暗示受试者的疾病进展变得更差，或替代地从1.4至1.3的变化可指示受试者变得更好。

本发明的方法进一步提供由本发明的方法鉴别的相关生物标志物的值的监测并且基于一组预定相关系数或与所鉴别的生物标志物相关的预测模型来将这些值与受试者体内的预测量的新皮质淀粉样蛋白负荷关联。

一个或多个测量值与一个或多个参考值之间的比较结果用于诊断或帮助诊断AD，或监测AD患者中的AD进展。因此，如果这种比较指示一个或多个测量值与一个或多个参考值之间的暗示/指示AD的差异（即增加或降低），那么就帮助或进行了适当诊断。相反地，如果一个或多个测量水平与一个或多个参考水平之间的比较不指示暗示或指示AD诊断的差异，那么未帮助或进行适当诊断。

本发明现在将参考以下非限制实例来更充分地描述。

实例

实例1

1.样品收集和分析

1.1数据集

使用两个数据集。第一个集合是从澳大利亚成像、生物标志物以及生活方式（AIBL）研究获得。关于研究设计以及登记程序的详细信息已经加以讨论（埃利斯（Ellis）等人，2009）群组由1090名受试者组成（207名已经临床确定为阿兹海默氏病（AD），129名患有轻度认知障碍（MCI）并且754名是健康对照（HC）。273名受试者进行血液测量与成像（PiB-PET）两者。在18个月的时帧上，获取PET图像并且获得样品以便进行血液测量，然而血液测量仍有待测定。

第二个集合是从阿兹海默氏病神经成像倡议（ADNI）数据库（http://www.loni.ucla.edu/ADNI）获得。这些样品中的每一个已经进行基线血液测量并且在基线或十二月随访时进行了PET成像。关于ADNI研究的信息已经加以详述（穆勒等人，阿兹海默氏病神经成像倡议，北美神经成像学临床（Neuroimaging Clinics of North America），15,869,2005）。简单地说，在2003年，全美抗衰老协会（National Institute on Aging；NIA）、国家生物医学成像和生物工程研究所（National Institute of BiomedicalImaging and Bioengineering；NIBIB）、食品与药物管理局（Food and DrugAdministration；FDA），私人制药公司以及非营利组织发起ADNI，并且加利福尼亚大学VA医疗中心的医学博士迈克尔·沃·维纳（Michael W.Weiner）是主要研究者。

1.2血液

从第一群组的1090名受试者获得80ml空腹血液样品。在80ml血液样品中：将27ml转送至临床病理学实验室（墨尔本市的墨尔本健康公司（Melbourne Health），以及珀斯（Perth）的西澳大利亚大学的PathWest医药实验室（PathWest Laboratory Medicine WA））以便进行基线测试，包括全血液检查；将0.5ml转送以便进行载脂蛋白E基因分型并且将0.5ml全血存储于液氮中。

在室温下将从其余血液样品获得的血浆部分在1800g下离心15分钟，并且然后转移至聚丙烯管并且存储在液氮中直到分析时为止。将未允许进行任何冷冻-解冻循环的0.5ml等分部分装运至Rules-Based Medicine实验室（RBM；奥斯汀，得克萨斯（Austin,Texas），www.rulesbasedmedicine.com）以便使用可购得的多重luminex humandiscovery151MAP组来分析。所有测定根据CLIA标准来验证并且在分析时没有样品长于18个月。

如之前所述（吕（Lui）等人，2010），血浆Aβ是使用以下来测量：商业试剂盒（INNO-BIA血浆Aβ测定，根持（Innogenetics）公司）以及有充分文献证明的双重夹心ELISA技术（梅塔（Mehta）等人，2000；梅塔等人，2001；洛佩兹（Lopez）等人，2008）。简单地说，基于LuminexxMAP技术的INNO-BIA多重测定允许同时测量Aβ40以及Aβ42（模块A）或Aβ片段（Aβn-40以及Aβn-42；模块B）。两个模块根据制造商说明来操作，其中添加板间探针洗涤步骤。测定在Luminex xMAP读取器系统（Bio-Plex200系统，Bio-Rad）上读取。ELISA利用单克隆抗体6E10以及用于检测Aβ1-40以及Aβ1-42的两个不同生物素化多克隆抗体作为捕获组件。测定如所描述来进行（梅塔等人，2000）以及（洛佩兹等人，2008），其中吸光率测量值在450nm下收集（FluoroStar，BMG）。

如所描述，血浆总apoE以及同种型特异性（apoE4）水平是使用商业测定（ApoE4/Pan ApoE ELISA，MBL有限公司）来测量（古帕塔（Gupta），出版中）。简单地说，ELISA使用针对apoE的亲和性纯化多克隆抗体以及针对apoE4的单克隆抗体来以高灵敏度特异性地测量总apoE以及apoE4的量。样品在所提供的测定稀释剂溶液中1:500稀释，然后装载，并且标准物的工作浓度是用所提供的校准物的稀释液来制备，校准物以测定稀释剂溶液来1:10重构。将稀释的血浆样品或标准物装载至以抗人Pan-ApoE抗体涂布的微孔条并且在37℃下孵育60min，然后用洗涤溶液洗涤四次。在洗涤之后，添加100μl过氧化物酶轭合的抗ApoE4单克隆抗体或过氧化物酶轭合的抗ApoE多克隆抗体并且在37℃下孵育60min。然后添加过氧化物酶底物并且在37℃下进一步孵育30min。然后将酸停止液添加至每个孔以便终止酶反应，然后在450nm下使用BMG酶标仪来测量光密度（O.D.）。

对于第二群组，Human DiscoveryMAPTM组中的专属测定是由Rules-BasedMedicine实验室（RBM，奥斯汀，得克萨斯）来设计并且验证，许多分析物的血浆水平在UPenn专用临床单元以及中心中加以评价。所得数据从ADNI蛋白质组学数据库获得。基线临床病理学血液测量值也提供于ADNI临床数据库中。此数据涵盖验证在此提供的发现结果所必需的大多数分析物。

1.3PET成像

在分析血液的1090名受试者中，273名受试者经历PiB-PET成像。PiB成像方法已经加以详述（布吉（Bourgeat）等人，2010）。简要地说，使用具有PIZELAR氧正硅酸锗晶体检测器的Philips ADC Allegro全环断层摄影术。向参与者注射375+/-18MBq的11C-PiB并且扫描持续40-60分钟的注射后时期。此时段的PiB-PET标准化吸收值（SUV）针对全皮质来汇总以便给出总体新皮质SUV，并且然后相对于小脑皮质SUV来归一化，从而产生新皮质SUV比率（SUVR）。关于PiB-PET数据以及程序的进一步细节如下给出（罗维等人，衰老神经生物学（Neurobiology of Aging）31,1275-1283,2010）。

基于以下假设：具有高大脑淀粉样蛋白负荷的人将继续发展AD并且淀粉样蛋白负荷是AD的区分因子，将成像个体划分成高淀粉样蛋白负荷组（PiB阳性，新皮质SUVR计分>=1.5）和低淀粉样蛋白负荷组（PiB阴性，新皮质SUVR计分<1.5），其中1.5的截止值在文献中得到广泛支持（杰克等人，柳叶刀神经学，9,119-128,2009）、（罗维等人，2010）。样品的人口统计学细分提供于表1中。

^*体重指数；^#国际身体活动调查表代谢当量四分位（International PhysicalActivity Questionnaire Metabolic Equivalency Quartiles）；^$通过标准方差分析（ANOVA）并且基于针对临床诊断来校正的顺序新皮质SUVR值来获得的P值。

表1-AIBL的成像参与者的人口统计学细分以及人口统计状态对于新皮质PiB-PET标准化更新值比率（SUVR）值的重要性。

第二群组的PET成像描述于亚古什特（Jagust）等人2010之中。出于验证目的，总新皮质SUVR计分估算为新皮层SUVR区域值的平均数。

2.统计算法。

2.1统计软件

分析使用R统计软件包（版本2.10，2009统计计算的R基础）来进行。缺失数据的插补使用mice（通过链方程的多重插补；版本2.4）来进行。变量选择和预测模型使用R包随机森林（版本4.5-34）来进行。接受者工作特征曲线（ROC）、灵敏度、专一性、精确度以及曲线下面积（AUC）值使用ROCR（版本1.0-4）来计算。人口统计学变量的探索性分析使用LIMMA（版本3.2.0）来实现。

图5简要地概述为了开发预测新皮质淀粉样蛋白负荷的多变量模型所采用的步骤。虽然单独标志物以前适用作为诊断工具，但是已经发现与单独单一标志物相比，标志物的组合提供更大灵敏度和专一性。为了使这种组合起作用，如以下描述的多变量模型已开发并且随后用作分类器或预测器，以便基于PiB-PET图像数据来产生SUVR计分。算法使用AIBL数据来确定，其中一些数据被分割以使得存在训练集和交叉验证（确认算法起作用）集以及进行实际预测的集。

所有相关变量，如淀粉样蛋白β42、载脂蛋白E、皮质醇、BLC、IgM、IL-17、胰多肽以及VCAM1以及临床痴呆评级（CDR）笔盒、体重指数，用于产生预测年龄校正的新皮质SUVR计分的适用“相关系数”的模型，如PiB-PET测量。任何这些生物标志物可为可变生物标志物特征标志的潜在候选物。对于AIBL群组，并且以ADNI数据来确认，确定具有以及没有临床标志物的5至8个这些变量的子集以便给出足够灵敏度和专一性以及最佳精确度。

清理1090名AIBL参与者的血液生物标志物数据以使得具有超过5%缺失数据的任何变量，或具有超过50%缺失数据的任何样品被去除。将数据对数转化并且缺失数据点使用通过链方程进行的多重插补来插补（阿祖尔（AZUR）等人，2011）。

表2-在提供个体患有AD或AD样疾病的可能性的指示中鉴别为相关的一组临床标志物

2.2步骤

[步骤1]。收集关于AIBL群组的成像受试者（其中有273名）的新皮质淀粉样蛋白负荷数据。这然后给出新皮质PiB-PETSUVR计分。新皮质SUVR计分是新皮质淀粉样蛋白负荷的定量测量。总体上并且在文献中广泛报告，具有大于1.5的新皮质SUVR计分的受试者被认为患有AD或处于发展AD的风险中。具有小于1.5的新皮质SUVR计分的那些受试者被认为是健康的并且不处于发展AD的风险中。因此，此处的目的是预测SUVR值（代表淀粉样蛋白负荷）并且从这些值来鉴别可能具有高新皮质淀粉样蛋白负荷的受试者，因此鉴别患有AD或处于发展AD的风险中的受试者（与未患有AD并且不处于发展它的风险中的那些受试者相反）。这通过在此实例中使用比PiB PET成像更便宜并且更容易的血液度量来实现。

虽然算法非常复杂，但是出于在此实例中说明相关性的目的，简单地，该相关性可描述为如Y=mX+c类型的公式，其中m和c是固定（数学推导）的，系数“相关系数”和X以及Y是变量。SUVR数据可形成Y变量。对于我们基于血液测量（表8）和人口统计学以及神经心理变量（表3）而获得数据的相同273名受试者，还获得血液数据“X”。应认识到公式不一定由此简单线性关系来表示，而将是复杂、多变量可能双峰的连续或不连续的公式。

性别	采样位置	社区参与	贫血状况
				年龄	婚姻状况	受教育年限
身体活动四分位	颅内容积	海马容积

表3-可附加至由血液数据获得的标志物数据集的所感兴趣的其他生物、人口统计学以及临床标志物的数据集。

[步骤2]为了提供训练集以及交叉验证步骤，将273名受试者划分成8个组并且提供训练集的交叉验证。如果可获得更多数据，此划分将是不必要的。

[步骤3]在8个组中，7个再次随机划分成3个组。这些组中的两个拟合至随机森林模型以便尝试在给出“X”值的情况下预测“Y”值。将此模型应用于第三组以便预测Y值，从而确定预测匹配实际测量的Y值的良好程度。还确定ROC/精确度分析以便检查拟合的模型预测第三组的良好程度。这再重复2次以使得所有三个组使其Y值基于其他两个组由模型来预测。并且此过程重复100次。基于这些300个随机森林模型中的精确度计分以及X变量的重要性，挑选上面一组X变量（约8个X变量）。另一随机森林模型仅使用所选择的X变量在7组数据上拟合。然后，将来自迄今为止备用的第8个集合的X数据用于预测此第八个集合的Y值。这再重复7次直到所有受试者用这种方式具有Y值预测。

[步骤4]将所有上述预测组合并且用于产生模型的精确度指标-图1。使用精确度度量并且观察8个最终模型中的每个中选定的变量，选择最终一组X变量。

[步骤5]使用所有273名受试者的此最终一组X变量的数据，产生最终随机森林模型，该最终模型限制固定系数（即m和c信息）。

[步骤6]最后，收集未成像的817名AIBL受试者的该组变量（选定的生物标志物和任选地临床标志物）的X数据。将所述数据输入最终随机森林模型以便获得非成像受试者的Y值（PiB_PET/SUVR计分）的预测。图2证明非成像受试者与成像参与者的实际测量Y值基于其临床诊断分组的比较。

采用步骤4中的8个模型的预测Y值和步骤6中的非成像受试者的预测Y值，患者可根据SUVR计分（Y值）是否大于（或等于）1.5来归类，并且将那些受试者标记为预测患有高新皮质淀粉样蛋白负荷并且由此处于发展AD的风险中，或如果SUVR计分小于1.5并且因而预测具有低新皮质淀粉样蛋白负荷并且因而具有较小风险。基于基线以及18个月随访时的临床诊断，然后计算被预测具有高新皮质淀粉样蛋白负荷的每个分类/过渡组中的受试者的百分比，参见图3。

3.验证集（ADNI数据）。

收集74名ADNI参与者的5种血液标志物和人口统计学以及神经心理变量/标志物的数据以及PiB-PET计分。将X数据输入在以前实例中开发的最终随机森林模型，以便获得这些74名受试者的预测Y值。这些预测与实际测量值相比的精确度在图4中示出。

4.结果

4.1AIBL群组的预测

首先步骤4产生由图1a给出的接受者工作特征曲线（ROC），其中对于完整的模型，分别实现82.5%（标准偏差（SD）为0.891%）、84.6%（SD为0.870%）以及89.6（SD为0.932）的灵敏度、专一性以及曲线下面积（AUC）。没有来自模型的临床痴呆比率（CDR）值的生物标志物分别产生80.5%（SD为0.870%），82.5%（SD为1.70%）以及90.7（SD为1.76）的灵敏度、专一性以及AUC。预测的与实际的（如通过PiB-PET测量）新皮质SUVR的相关性由图1b给出，其中获得R2值为76.9%的良好相关性。

出于比较，图2展示ABIL群组中的成像参与者的实际新皮质SUVR以及AIBL群组的非成像参与者的预测新皮质SUVR，这些群组按照临床诊断来划分。

其次，相对于基线以及十八个月随访临床病况来评价预测的新皮质淀粉样蛋白负荷，参看图3。可以看出：在基线时，所有AD、87%MCI以及35%HC参与者被视为PiB阳性；在十八个月，99%AD、78%MCI以及34%HC参与者被视为PiB阳性；在十八个月过渡至AD的97%参与者被视为PiB阳性；并且88.0%的所有前向过渡参与者被视为PiB阳性。

4.2ADNI群组的预测

然后，ADNI参与者的新皮质SUVR水平根据相对于PiB-PET成像值来产生并且评价的模型来预测。结果的ROC由图4给出。对于完整的模型，分别实现74.1%、77.3%以及79.4%的灵敏度、专一性以及曲线下面积（AUC）。没有来自模型的CDR的生物标志物分别产生75.8%、75.6%以及78.4%的灵敏度、专一性以及AUC。

5.新的群组集

在临床实践中，患者将进行血液测量（可能测量表8中的生物标志物，或任何一种RBM标志物）。连同表8中的那些，测量可优选地包括基质金属肽酶2（MMP2）、AXL受体酪氨酸激酶（AXL）、肝细胞生长因子（HGF）、脂肪酸合酶（FAS）、葡萄糖、铬同位素52胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBP2）、Ca（校正）-钙、血清谷草酸转氨基酶（SGOT）、I.309细胞因子

测量可在微芯片上进行以使得进行单一分析。然后将结果输入随机森林模型，该模型可嵌入计算机程序中。临床医师、护士、医疗管理人员或全科医师将输入数据如受试者年龄

此随机森林模型然后将提供预测的y值。如果此预测的y值大于（或等于1.5），那么受试者将被视为患有或处于发展AD的风险中[计算机程序可以用风险=真或类似的来反应]。如果此预测的Y值小于1.5，那么受试者被视为未患有也不处于发展AD的风险中[计算机程序可以用风险=假或类似的来反应]。

计算机程序还可给出关于个体在量表上所处的位置的信息（作为所测量的群体的百分位或作为y值就所测量的最大值和最小值而论的百分位形式）。例如，在所述群体中可存在100人，并且此受试者具有的预测Y值高于37个人但是低于63个人，并且受试者可被认为处于第37百分位。或最小记录值可为0.9并且最大记录值可为3.3，受试者具有预测值1.3，因此被认为位于第16百分位。

如果进行个体的第二个测试，那么程序可提供一些类型的变化计分/监测信息。例如在时间点1，受试者可具有预测Y值1.3并且在时间点2，具有预测Y值1.4。变化计分因此是+0.1。[程序可以此来反应或可提供类似于以上讨论内容的百分位计分的变化-即受试者处于第37百分位但是现在处于第42百分位]。

实例2

1.1数据集

来自实例1中讨论的AIBL群组以及ADNI的相同样品用于此第二轮分析。

考虑到在临床环境使用某些标志物时可能遇到的困难-困难是由于它们的测定测量潜在不可靠、进行较棘手或太易变，所以如实例1中所使用的某些标志物在此第二轮分析中予以忽略。代替地，所感兴趣的四种其他生物标志物、人口统计学标志物以及临床标志物被附加至血液分析物；所包括的标志物是性别、ApoEε4携带者状态、受教育年限以及CDR笔盒。

针对这些四种标志物、年龄以及临床分类（HC、MCI或AD）而按照高低NAB来划分的两个成像（AIBL以及ADNI）数据集的人口统计学组成在表4中给出。使用χ2测试针对分类变量来评价高低NAB之间的人口统计学差异，应用连续变量的方差分析（ANOVA），这是由于应用曼-惠特尼U测试的CDR笔盒的非正规性。另外，针对这些四种标志物以及年龄而按照临床分类来划分的AIBL与ADNI成像群组以及AIBL非成像群组的人口统计学组成在表6中给出。

表4-AIBL以及ADNI成像子群组的人口统计学以及临床组成

1.2数据集质量控制

将由57种病理学血液分析物以及169种血浆分析物（151种来自MyriadRBM xMapdiscovery组版本一，13种是金属、APOE水平、针对Aβ_1-40以及Aβ_1-42的基于根特和梅塔的ELISA）组成的AIBL数据集清理以使得具有超过5%缺失数据的任何变量，或具有超过50%缺失数据的任何样品得以去除。这对于1090名AIBL受试者可产生176种血液分析物（53个病理学、111种是MyriadRBM、7种是金属、APOE水平、根特和梅塔Aβ_1-40以及Aβ_1-42；在表7A-E中列出）的工作数据集，在这些受试者中273名经历PiB-PET成像

1.3单变量分析

176种血液分析物还使用协方差分析（ANCOVA）来评价，以便观察其浓度在具有高与低NAB的参与者之间是否不同。结果针对年龄、部位、性别以及ApoEε4携带者状态来校正（通过将这些变量包含在分析中）并且为了最小化任何假阳性结果，将p值针对假发现率（FDR）来调整。其次，176种血液分析物针对与连续SUVR变量的相关性使用多重线性回归分析来评价（再次针对年龄、部位、性别、ApoEε4携带者状态来校正并且p值针对FDR来调整）。

1.4多变量分析

对于273名成像AIBL参与者，将176种血液分析物以及以上列出的四种其他标志物（性别、ApoEε4携带者状态、受教育年限以及CDR笔盒）用于变量选择以及模型产生程序，以便预测年龄校正的新皮质SUVR值，如通过PiB-PET来测量。将来自未经历图像分析的AIBL参与者（并且来自所有ADNI参与者）的数据在此阶段留出。

三种算法用于变量选择以便获得一组提供信息的生物标志物：1)实施随机森林（RF）分析以便确定与连续SUVR变量相关联的血液生物标志物，2)具有与个人相关特征选择过滤器相关的径向基函数（rbf）核的支持向量回归（SVR）也得以实施以便确定与连续SUVR变量相关联的血液生物标志物，以及3)具有与信号噪声比特征选择相关的rbf核的支持向量机（SVM）分析得以实施以便查找在高低NAB组之间差异表达的生物标志物。

在所有多变量分析中，出于变量选择目的，使用重复100次的三折交叉验证。对于三个算法中的每一个，考虑给出最高性能统计的多个最小组变量。使用三个相应变量组的模型用于进行NAB预测，再次出于报道性能统计的目的来使用100次三折交叉验证。对于关于连续SUVR变量来开发的两个模型，再次出于报道性能统计目的，基于相关截止值将所得SUVR预测划分成预测的高或低NAB。对于三个组中的每一个，计算具有标准偏差（SD）的灵敏度、专一性以及曲线下面积（AUC）性能指标。然后，针对给出较好性能指标的一组变量，基于所有273个样品来产生最终模型。然后，应用此模型来预测非成像AIBL样品以及ADNI样品的高或低NAB。再次评价性能，对于ADNI验证集，此举使用灵敏度、专一性以及AUC统计。由于没有关于非成像AIBL样品的任何实际NAB信息，因此将每个临床诊断组中的预测具有高NAB的那些样品的百分比与成像样品的百分比以及文献来进行比较。

1.5统计软件

如前所述，分析使用R统计软件包来进行。缺失数据的插补使用通过链方程进行的多重插补来进行（mice）（凡·布伦（van Buuren）·S,古修伊斯-奥德霍伦（Groothuis-Oudshoorn K.）·K，mice：在R中的通过链方程的多变量插补（Multivariate Imputationby Chained Equations in R），统计软件杂志（Journal of Statistical Software）2011;45:1-67）。单价以及多元回归分析使用rms（小哈勒尔（Harrell Jr FE）·FE，rms：回归建模策略（Regression Modeling Strategies），2012）、car（福克斯（Fox）·J，桑福德（Sandford），{R}回归指南（Companion to Applied Regression）：塞奇（Sage）2011）以及MASS（维纳布尔斯（Venables WNR）·VNR,B.D.使用S的现代应用统计（Modern AppliedStatistics with S）第四版：施普林格（Springer），2002）包。随机森林变量选择以及预测模型使用随机森林包来进行（廖·埃·马修（Liaw A,Matthew），通过随机森林分类以及回归（lassification and Regression by randomForest），见：R新闻（R News），2002：18-22）SVM/R用e1071包来进行（迪米崔亚多（Dimitriadou）·E、库特里奇（KurtLeisch）、弗里德里希·迈耶（FriedrichMeyer）、大卫·怀因葛索（DavidWeingessel）、安德烈亚斯（Andreas），e1071：统计部分的杂项函数（Misc Functions of the Department of Statistic）2011）。接受者工作特征曲线（ROC）、灵敏度、专一性、精确度以及曲线下面积（AUC）值使用ROCR来计算（思恩（Sing）·T、奥利弗·毕伦温科（OliverBeerenwinkel）、妮可·伦盖威尔（NikoLengauer）、托马斯（Thomas），ROCR：评分分类器的性能的可视化（Visualizing theperformance of scoring classifiers）2009）。

2.结果

2.1人口统计学状况

表4描述273名成像AIBL参与者以及82名成像ADNI参与者的人口统计学组成。可以看出在AIBL与ADNI的高NAB组中存在MCI以及AD受试者的的集中。在AIBL高NAB组中也存在老年人以及ApoEε4携带者的集中。

2.2高低NAB之间的基于血液的分析物差异

表5详述两个NAB组的年龄、性别、部位以及基于血液的分析物的ApoEε4携带者状态调整平均值。平均值的差异使用ANCOVA来评价。在调整假发现率之后，五种分析物示出在NAB组之间有显著差异：发现免疫球蛋白1（IgM1）以及游离甲状腺素（FT4）在高NAB组中较低（分别为p=0.019以及0.009），同时巨噬细胞炎症蛋白1α（MIP1α）、胰多肽（PPY）以及血管细胞粘附蛋白（VCAM1）都发现在高NAB组中升高（分别为p=0.027、0.01以及0.01）。这支持以下事实：一个生物标志物组可用来确定与SUV的相关性。

表5-应用于AIBL与ADNI成像子群组的交叉验证的随机森林预测模型的功效的ROC

2.3连续SUVR与基于血液的分析物之间的相关性

基于血液的蛋白质标志物的包括年龄、ApoEε4携带者状态以及NAB（高、低）的多元回归分析显示：在临床病理学数据内，仅估计的肾小球滤过率（eGFR）示出为正相关（p=0.002)；在RBM数据集内，EN RAGE示出NAB与ApoEε4携带者状态之间的显著相互作用（分别为p=0.003以及p=0.022），其中ε4非携带者高NAB示出显著正相关，而ε4非携带者低NAB示出负相关。对于SGOT观察到类似结果，NAB与ApoEε4携带者状态之间存在显著相互作用（分别为p=0.007以及p=0.019），ε4非携带者高NAB示出显著正相关。在针对FDR调整之后，没有发现血液标志物与连续SUVR之间的其他相关性。

通过临床诊断来划分的AIBL成像数据

通过临床诊断来划分的AIBL非成像数据

通过临床诊断来划分的ADNI成像数据

表6-来自通过临床诊断健康对照（HC）、轻度认知障碍（MCI）以及AD划分的AIBL成像数据，通过临床诊断健康对照（HC）、轻度认知障碍（MCI）以及AD划分的AND非成像数据、以及通过临床诊断划分的ADNI成像数据的人口统计状况以及性状。

2.4多变量分析

2.4.1生物标记物识别

使用三种算法，总共十一种血液分析物鉴别为适用于预测高与低NAB。RF模型鉴别出七种分析物（β淀粉样蛋白1-42（Aβ_1-42）、ApoEε4携带者状态、B-淋巴细胞化学引诱物（BLC）、IgM1、白介素17（IL17）、PPY以及VCAM1），SVR模型鉴别出四种分析物（ApoEε4携带者状态、胰岛素样生长因子结合蛋白2（IGF BP2）、PPY以及VCAM1），并且SVM模型鉴别出六种分析物（血管生成素2（ANGPT2）、ApoEε4携带者状态、CD40蛋白质（CD40）、C-反应蛋白（CRP）、IGF BP2、PPY）。在所鉴别的分析物之间存在一些重叠，其中PPY以及ApoEε4携带者状态由所有三种算法来鉴别，参见图6A。这些分析物中的三种（IgM1、PPY以及VCAM1）也使用ANCOVA来鉴别为在NAB组之间显著不同。

2.4.2性能统计

交叉验证的RF模型实现79.5%灵敏度（SD=1.3%）和81.4%专一性（SD=1.2%），交叉验证的SVR模型分别实现41.0%（SD=0%）以及73.6%（SD=0%）的灵敏度以及专一性，并且SVM模型分别实现81.0%（SD=1.8%）以及74.0%（SD=1.6%）的灵敏度以及专一性。为最佳进行模型RF，构建四个单独模型来示出通过包含基于血液的生物标志物来添加的值。模型1（M1）：基于血液的标志物、ApoE基因型、年龄以及CDR笔盒（AUC为87.6%）；模型2（M2）：基于血液的标志物、ApoE基因型以及年龄（AUC为83.9%）；模型3（M3）：年龄、ApoE基因型以及CDR笔盒（AUC为78.3%）；模型4（M4）：年龄以及ApoE基因型（AUC=70.2%）。可以看出添加基于血液的标志物至模型导致性能增加9%（M1比较M3）以及几乎14%（M2比较M4）。包含神经心理学度量CDR笔盒可改进模型10%（M1比较M2）以及4%（M3比较M4）。完整的性能统计由表5以及图6B来给出。

2.4.3应用于ADNI验证样品

遗憾的是没有ADNI群组的IL17的测量，因此来自AIBL群组的中值IL17测量取代82个ADNI样品中的每一个。然后，使用AIBL样品产生的四个RF模型（M1:M4）应用于ADNI验证数据集以便预测高或低NAB，性能统计由表5以及图6C给出。可以看出M4在应用于ADNI群组时实现84.7%AUC。

表7(a)-RBM组。年龄、性别以及ApoEε4携带者状态针对来自标准临床病理学组的分析物调整低PiB负荷者（<1.3SUVR）以及高PiB负荷者（>=1.3SUVR）的边际平均值（SD）。p值是ANCOVA p值并且调整（adjusted）（调整（adj））的p值是针对假发现率（FDR）来调整。

表7(b)-临床病理学组。年龄、性别以及ApoEε4携带者状态针对来自标准临床病理学组的分析物调整低PiB负荷者（<1.3SUVR）以及高PiB负荷者（>=1.3SUVR）的边际平均值（SD）。p值是ANCOVA p值并且调整的p值是针对假发现率（FDR）来调整。

表7(c)-金属组。年龄、性别以及ApoEε4携带者状态针对来自金属组学组的分析物调整低PiB负荷者（<1.3SUVR）以及高PiB负荷者（>=1.3SUVR）的边际平均值(SD)。p值是ANCOVA p值并且调整的p值是针对假发现率（FDR）来调整。

表7(d)-血浆Aβ测量。年龄、性别以及ApoEε4携带者状态调整低PiB负荷者（<1.3SUVR）以及高PiB负荷者（>=1.3SUVR）的来自Innogentics平台（Inno）以及梅塔夹心ELISA（梅塔）的Aβ40、42测量的边际平均值（SD）。p是ANCOVA p值并且调整的p是针对假发现率（FDR）来调整的p。

表7(e)-如通过ELISA测量的血浆ApoE。年龄、性别以及ApoEε4携带者状态调整低PiB负荷者（<1.3SUVR）以及高PiB负荷者（>=1.3SUVR）的边际平均值（SD）。

表8-可用于提供个体患有AD或AD样疾病的可能性的指示的可能生物标志物的列表，包括肽、多肽、蛋白质、寡核苷酸、其片段和/或其他标志物，如金属、代谢物或维生素等等。具有星号的那些标志物是指Rules Based Medicine实验室（RBM）测量值。

2.4.4应用于非成像AIBL样品

整个RF模型（M4）应用于未经历成像方案的817名AIBL参与者，以便预测其预期NAB。所有AD、87%的MCI以及35%的HC参与者被预测具有高NAB，这与AIBL成像群组通过成像方案有98%AD、69%MCI以及34%HC被视为具有高NAB相当（图7）。

5.结论

根据如上所述分析来确定另外的生物标志物列表，即：年龄、Aβ_1-42、ApoE基因型、BLC、IgM1、IL17、PPY以及VCAM1。包含基于临床的认知计分、CDR笔盒可稍微改进灵敏度以及专一性。对于评价高NAB与低NAB分别实现79.6%以及82.4%的灵敏度以及专一性。当此模型应用于ADNI群组时，产生合理预测，灵敏度以及专一性分别为78.3%以及76.3%。然后，此模型也应用于非成像AIBL参与者以便预测个别临床诊断组的具有高NAB的个体的百分比（图7）。该模型预测100%的AD、60%-75%的MCI以及20%-35%的HC具有高NAB，这文献预测百分比相当。

使用不同组的生物标志物（年龄、ApoE基因型、ANGPT-2、CD40、CRP、PPY以及IGF-BP2），支持向量机模型的使用示出类似、稍微降低的性能统计。随机森林与SVM模型之间的仅有的重叠生物标志物是年龄、ApoE基因型以及PPY。

随机森林与SVM模型的仅有的共用的基于血液的生物标志物是胰多肽（PPY）。虽然PPY水平与年龄正相关，但是此处在针对年龄来调整之后，观察到高NAB组中的显著增加。

虽然以前报告的基于血液的度量示出在AD患者与老龄匹配对照之间进行区分的良好功效，但是此处呈现的结果鉴别出基于血液的度量，这些度量能够以高精度来估计个体中的NAB的水平。因为NAB代表大脑中的淀粉样蛋白负荷，它的积聚被认为是AD级联中的早期事件，所以该组可提供早得多的基于血液的疾病鉴别。

鉴于NAB是进展至AD的预测物的广泛支持的假设以及此处呈现的发现结果可加以验证并且针对合适介质格式化以便用于广泛应用，由此可见这项工作可为开发经济筛选早期检测处于发展AD的风险中的个体的第一步骤，从而允许使用最佳治疗以及干预策略。这类测试也可进而证明进一步的验证性测试如PET成像或CSF测量是合理的。

虽然本发明的上述书面描述使得本领域普通技术人员能够作出并且使用其目前被认为的最佳模式，但是本领域普通技术人员应了解并且认识到在的此具体实施例、方法以及实例的变化形式、组合以及等效物的存在。因此，本发明应不受以上描述的实施例、方法以及实例的限制，而是受如在此广泛描述的本发明的范围以及精神内的所有实施例以及方法的限制。

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Claims (48)

1.用于测量生物标志物的试剂和用于测量β淀粉样蛋白水平的试剂在制备用于预测受试者发展神经疾病的风险的诊断试剂盒中的用途，当所述诊断试剂盒被使用时，包括下列步骤：

a)计算机产生用于关联新皮质β淀粉样蛋白水平的一组相关系数，所述产生包括：

i)将一种分类算法应用于来自群组数据集的多个生物标志物值，所述群组数据集包括临床上被确定为具有与升高的β淀粉样蛋白水平有关的神经疾病的样品，提供多个预定的经过验证的样品；和

ii)将该分类算法应用于从步骤i)的相同多个预定的经过验证的样品中获得的多个β淀粉样蛋白水平；

其中对所述群组数据集应用该分类算法通过将生物标志物与β淀粉样蛋白水平相关联产生了与所述β淀粉样蛋白水平有关的一组相关系数；

b)获得体外测试生物样品；

c)从该测试生物样品确定多个生物标志物值，其中该多个生物标志物对应于在获得该组相关系数中所确定的那些生物标志物；

d)将一种分类算法应用于步骤c)确定的生物标志物值并且将其与步骤a)的该组相关系数相关联以得出该测试生物样品的理论β淀粉样蛋白水平。

2.根据权利要求1所述的用途，其中在产生该组相关系数之前，i)的多个生物标志物值和ii)的多个β淀粉样蛋白水平使用通过链方程进行的多重插补(MICE)来插补以标准化数据。

3.根据权利要求1所述的用途，其中该分类算法经历交叉验证分析。

4.根据权利要求1所述的用途，其中该分类算法还应用于在产生一组相关系数中从i)和ii)中确定的相同多个预定的经过验证的样品中获得的临床标志物数据。

5.根据权利要求4所述的用途，其中该临床标志物数据包括临床痴呆评级或体重指数、年龄或CDR笔盒。

6.根据权利要求5所述的用途，其中这些临床标志物选自表2或表3中所列的临床标志物。

7.根据权利要求1所述的用途，其中这些生物标志物选自表8中所列的生物标志物。

8.根据权利要求7所述的用途，其中这些生物标志物中的两种是淀粉样蛋白β42和载脂蛋白E或其天然存在的变体。

9.根据权利要求7所述的用途，其中另外的生物标志物选自下组，该组包括BLC、皮质醇、IgM、胰多肽、VCAM1和/或IL-17，或其天然发生的变异体。

10.根据权利要求1所述的用途，其中该多个生物标志物形成指示理论新皮质淀粉样蛋白负荷的生物标志物特征标志。

11.根据权利要求1所述的用途，其中该测试生物样品是一种生物流体。

12.如权利要求11所述的用途，其中该生物流体是血液、血浆、血清、尿液或脑脊髓液。

13.根据权利要求1所述的用途，其中所述β淀粉样蛋白水平与淀粉样蛋白斑形成疾病有关。

14.根据权利要求13所述的用途，其中所述淀粉样蛋白斑形成疾病是阿兹海默氏病(AD)。

15.根据权利要求1所述的用途，其中所述β淀粉样蛋白水平通过使用淀粉样蛋白特异性放射性示踪剂来扫描分析而临床上确定。

16.根据权利要求15所述的用途，其中所述放射性示踪剂是PiB或F-18AV-45。

17.如权利要求1所述的用途，其中通过ROC或AUC来分析步骤d)的该组相关系数。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的用途，其中该分类算法选自下组，该组由以下各项组成：随机森林、变量重要性度量、线性判别分析(LDA)、对角线线性判别分析(DLDA)、对角线二次判别分析(DQDA)、支持向量机(SVM)、支持向量回归(SVR)、神经网络、协方差分析(ANCOVA)和k-最近邻居法。

19.根据权利要求18所述的用途，其中所述分类算法是随机森林。

20.用于测量生物标志物的试剂和用于测量β淀粉样蛋白水平的试剂在制备用于预测受试者发展神经疾病的风险的诊断试剂盒中的用途，当所述诊断试剂盒被使用时，包括下列步骤：

a)通过将一种分类算法用于来自群组数据集的多个生物标志物值和多个β淀粉样蛋白水平值产生一组相关系数，所述群组数据集包括临床上被确定为具有与升高的β淀粉样蛋白水平有关的神经疾病的样品，提供多个预定的经过验证的样品；

b)获得体外测试生物样品；

c)在b)的该测试生物样品中，确定a)的每一个生物标志物的值；

d)将结合了该组相关系数的分类算法应用于从步骤c)确定的值，从而得出理论β淀粉样蛋白水平；

e)根据步骤d)的理论β淀粉样蛋白水平确定对神经疾病病况的分类，其中该β淀粉样蛋白的理论水平预测受试者发展神经疾病的风险。

21.根据权利要求20所述的用途，其中在产生该组相关系数之前，a)的多个生物标志物的值和a)的多个β淀粉样蛋白水平使用通过链方程进行的多重插补(MICE)来插补以标准化数据。

22.根据权利要求20所述的用途，其中该分类算法经历交叉验证分析。

23.根据权利要求20所述的用途，其中该分类算法还应用于在产生一组相关系数中从步骤a)中确定的相同多个预定的经过验证的样品中获得的临床标志物数据。

24.根据权利要求20所述的用途，其中该临床标志物数据包括临床痴呆评 级或体重指数、年龄或CDR笔盒。

25.根据权利要求23所述的用途，其中用于该临床标志物数据的临床标志物选自表2或表3中所列的临床标志物。

26.根据权利要求20所述的用途，其中这些生物标志物选自表8中所列的生物标志物。

27.根据权利要求26所述的用途，其中所述生物标志物中的两种是淀粉样蛋白β42和载脂蛋白E或其天然发生的变异体。

28.根据权利要求27所述的用途，其中另外的生物标志物选自下组，该组包括BLC、皮质醇、IgM、胰多肽、VCAM1和/或IL-17或其天然发生的变异体。

29.根据权利要求20所述的用途，其中该多个生物标志物形成指示理论新皮质淀粉样蛋白负荷的生物标志物特征标志。

30.根据权利要求20所述的用途，其中该多个预定的经过验证的样品包括临床确定为患与升高的淀粉样蛋白水平相关的神经疾病的样品。

31.根据权利要求30所述的用途，其中该神经疾病是淀粉样蛋白斑形成疾病。

32.根据权利要求31所述的用途，其中所述淀粉样蛋白斑形成疾病是阿兹海默氏病(AD)。

33.根据权利要求31所述的用途，其中所述疾病是阿兹海默氏病(AD)。

34.根据权利要求20所述的用途，其中β淀粉样蛋白负载得分通过使用放射性示踪剂的扫描分析而被临床上确定。

35.根据权利要求34所述的用途，其中该放射性示踪剂是PiB或F-18AV-45。

36.根据权利要求20所述的用途，其中该多个预定的经过验证的样品从一种生物流体中获得。

37.根据权利要求36所述的用途，其中该生物流体是血液、血浆、血清、 尿液或脑脊髓液。

38.根据权利要求20所述的用途，其中通过ROC或AUC来分析步骤d)中的该组相关系数。

39.根据权利要求20至38中任一项所述的用途，其中该分类算法选自下组，该组包括：随机森林、变量重要性度量、线性判别分析(LDA)、对角线线性判别分析(DLDA)、对角线二次判别分析(DQDA)、支持向量机(SVM)、支持向量回归(SVR)、神经网络、协方差分析(ANCOVA)和k-最近邻居法。

40.如权利要求39所述的用途，其中该分类算法是随机森林。

41.一种用于获得体外测试样品中的理论β淀粉样蛋白水平以关联受试者的理论β淀粉样蛋白水平的计算机系统，该系统包括：

i)被输入一组相关系数的模块，该组相关系数通过以下步骤产生：

a)将一种分类算法应用于来自群组数据集的多个生物标志物值，所述群组数据集包括临床上被确定为具有与升高的β淀粉样蛋白水平有关的神经疾病的样品，提供多个预定的经过验证的样品；和

b)将该分类算法应用于从a)的相同多个预定的经过验证的样品中获得的多个β淀粉样蛋白水平；

其中对所述群组数据集应用该分类算法产生了一组相关系数，该组相关系数能够通过将生物标志物与β淀粉样蛋白水平相关联而预测这些β淀粉样蛋白水平并进一步预测该受试者发展神经疾病的风险；

ii)用于接收来自该受试者的测试生物样品的部件；

iii)用于从该测试生物样品确定多个生物标志物的值的模块，其中该多个生物标志物对应于获得该组相关系数中所确定的那些生物标志物；

iv)用于将一种分类算法应用于步骤iii)确定的这些生物标志物值并且将其与该组相关系数相关联以得出该受试者体内的一种理论β淀粉样蛋白水平的模块；

其中该理论β淀粉样蛋白水平与该受试者发展一种神经疾病的风险相关 联。

42.如权利要求41所述的计算机系统，其中通过ROC或AUC来分析步骤iv)的该组相关系数。

43.根据权利要求41所述的计算机系统，其中临床标志物数据是从该受试者获得的。

44.根据权利要求41所述的计算机系统，其中该测试生物样品是一种生物流体。

45.如权利要求41所述的计算机系统，其中该生物流体是血液、血浆、血清、尿液或脑脊髓液。

46.根据权利要求41所述的计算机系统，其中这些生物标志物选自表8中列出的生物标志物。

47.根据权利要求41所述的计算机系统，其中这些生物标志物中的两种是淀粉样蛋白β42和载脂蛋白E或其天然发生的变异体。

48.根据权利要求41所述的计算机系统，其中另外的生物标志物选自下组，该组包括BLC、皮质醇、IgM、胰多肽、VCAM1和/或IL-17或其天然发生的变异体。