CN1964720A - 阿尔茨海默病的转基因模型及其在治疗多种神经变性疾病中的应用 - Google Patents

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Abstract

根据本发明，证明了在阿尔茨海默病的转基因模型中，APP中经选择的突变例如Asp－＞Ala(D664A)突变(其防止在胱天蛋白酶切割位点处进行切割)防止海马突触丢失和齿状回萎缩，虽然这些突变不干扰Aβ的生成或淀粉样斑块的形成。因此，鉴于这些发现，开发出了用于鉴定阻断在APP的Asp664处的切割的药剂的方法，包括用于这种目的的转基因动物，以及应用它们治疗神经变性疾病的方法。

Description

阿尔茨海默病的转基因模型及其在治疗多种神经变性疾病中的应用
技术领域
[0001]本发明涉及阿尔茨海默病的非人转基因模型及其应用，包括鉴定可用于治疗阿尔茨海默病的化合物的方法、应用这样的化合物进行治疗的方法和类似方法。
背景技术
[0002]阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是最常见的痴呆症，其特征是老年斑(senile plaques)、神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles)和脑中突触和神经元的丢失。老年斑的主要蛋白成分是β-淀粉样肽(Aβ)，它是通过其前体β-淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein)(APP)的蛋白水解切割而产生的。淀粉样蛋白假说指出，Aβ启动了造成AD的级联事件。淀粉样蛋白毒性的精确机制尚不清楚，但是已经积累了突触是Aβ损害的早期易受攻击位点的证据(参见，例如，Selkoe，D.J.，Science 298：789-91(2002))。与此观点一致的是，脑中具有高水平Aβ的一些APP转基因小鼠在老年斑形成之前表现出突触丢失、行为改变和突触传递减弱(参见，Hsia，A.Y.et al.，Proc Natl Acad Sci USA 96：3228-33(1999)和Mucke et al.，J.Neurosci.20：4050-8(2000))。近来，已表明，APP也在Asp664(APP695编号)处被胱天蛋白酶(caspase)切割，胱天蛋白酶是介导凋亡的半胱氨酸蛋白酶(参见Gervais，F.G.et al.Cell 97：395-406(1999)和Lu，D.C.et al.Nat Med 6：397-404(2000))。这样的加工过程释放出细胞毒性的羧基端肽APP-C31；然而，还不清楚胱天蛋白酶对APP的加工在AD中可能起到的作用(如果有的话)。在通过胱天蛋白酶进行细胞质内切割之后产生细胞毒性肽的这种情形，与已经被说明的依赖性受体诸如DCC(在结肠直肠癌中被缺失)、RET(在转染期间被重排)和UNC5H1-3(不协调基因5同源物1-3)中发生的情形相似，这表明，APP可能作为依赖性受体而发挥功能(Bredesen et al，Physiological Reviews，press 2004)。
[0003]因此，使得能够研究蛋白酶例如胱天蛋白酶在此类神经变性疾病如阿尔茨海默病的发展中所起的作用的转基因模型的开发，将具有重要意义。此外，获得这样的转基因模型，将有助于对神经变性疾病的新的治疗的开发。
发明概述
[0004]根据本发明，证明了在阿尔茨海默病的转基因模型中，所选择的突变诸如APP中的Asp->Ala(D664A)突变(其防止在胱天蛋白酶切割位点处进行切割)既防止海马突触丢失又防止齿状回萎缩，虽然这些突变不干扰Aβ的生成或淀粉样斑块的形成。
[0005]因此，鉴于这些发现，开发出了用于鉴定阻断在APP的Asp664处的切割的药剂的方法，包括可用于此种目的的转基因动物，以及应用它们来治疗神经变性疾病的方法。在神经变性疾病如阿尔茨海默病的发展中进行早期干预，将有助于突触功能的恢复，并减少神经元网络的丢失，神经元网络的丢失是神经变性疾病的晚期阶段的特点。
附图说明
[0006]图1均涉及PDAPP和PDAPP(D664A)转基因小鼠的表征。
[0007]图1A图示了在制备PDAPP和PDAPP(D664A)转基因小鼠中应用的构建物的引出(derivation)。
[0008]图1B图示了在各种实验动物中对可溶性Aβ的检测。
[0009]图1C总结了不同实验动物中Aβ斑块的数目。
[0010]图1D图示了16月龄PDAPP(D664A)小鼠的经染色的脑切片，显示出Aβ斑块的存在。
[0011]图1E图示了在体内对APP在Asp664处进行的切割。使用对由在Asp664处对APP进行切割而产生的新表位具有特异性的抗体证明，与对照小鼠和PDAPP(D664A)小鼠相比，在PDAPP中的切割增加。
[0012]图2均说明D664A突变对突触丢失和齿状回萎缩的影响。
[0013]图2A总结了多种实验动物中突触前密度的定量。
[0014]图2B总结了海马总体积和其亚区域的体积，正如应用Imaris3D(BitplaneAG， Switzerland)三维重建所确定(参见图2C)和经卡瓦列里分析(Cavalieri analysis)所证实。
[0015]图2C显示了代表性PDAPP(红色)和B21(黄色)转基因小鼠的齿状回分子层的3D表而重建的正交面、矢状面和冠状面视图。
[0016]图3均说明D664A突变对基础突触传递的影响。
[0017]图3A示出了几个细胞外记录的场EPSPs，应用它们来评价3-7月龄杂合Tg和非Tg PDAPPJ20和PDAPP(D664A)B21小鼠的海马CA3和CA1细胞之间的基础突触传递强度。正如所述，非转基因小鼠和转基因小鼠在增加的刺激强度下的代表性场EPSPs被显示出来。注意在PDAPPJ20 Tg小鼠中，引发相对小的EPSP需要大的输入(参见带有放大的时间标度的插图：箭头指示出纤维群峰，它是被活化的轴突数目的间接度量)。
[0018]图3B示出了Tg和非Tg动物的EPSP起始斜率除以纤维群峰的幅度(数据针对非Tg同窝动物进行标准化)，正如所述。每个数据点代表了获自6-7只小鼠的17-22张切片的平均结果。统计学分析(ANOVA)表明了显著的群组效应(p＜0.0005)。Post-hoc Tukey检验证实，PDAPPJ20小鼠具有比所有其它组显著低的基础突触传递(p＜0.01)，而在其它组中彼此之间并没有显著不同。
[0019]图3C示出了双脉冲易化(paired-pulse facilitation)，其被表示为一对刺激诱发的fEPSPs的平均幅度的比值。数据在图中表示为均值+/-SEM。
[0020]图4均说明了D664A突变对PDAPP诱导的海马神经发生增强的影响。
[0021]图4A示出了对海马齿状回的颗粒下区中的增生细胞的BrdU标记。对十二个月对照(非-Tg)、PDAPP和PDAPP(D664A)小鼠腹膜内给予BrdU，持续3天，一周后处死。通过免疫组织化学方法检测被BrdU标记的细胞(黑点)。显示的图像代表4-6个动物/组。
[0022]图4B说明了BrdU标记的定量。显示的数据是平均细胞数目±SD(n＝4-6)；用学生t检验(Student′s t test)评价差异的显著性。
[0023]图5提供了通过卡瓦列里分析和三维重建得到的体积之间的关联。
发明详述
[0024]根据本发明，提供了非人转基因动物，其包含编码突变人β-淀粉样前体蛋白(APP)或APP样蛋白的核苷酸序列，其中所述突变人APP或APP样蛋白包括导致该突变人APP或APP样蛋白对在Asp664处的切割具有抵抗性的突变，并且其中编码该突变人APP或APP样蛋白的核苷酸序列被可操纵地连接到合适的启动子。
[0025]在本发明的一个方面，在Asp664处的切割是受蛋白酶诱导的。在本发明的目前的一个优选方面，在Asp664处的切割是受胱天蛋白酶诱导的。
[0026]在本发明的一个方面，突变人APP或APP样蛋白包括在残基664处的突变。本领域技术人员知道，事实上除天然Asp之外的在位点664处的任何残基都会降低蛋白酶如胱天蛋白酶在位点664处切割APP或APP样蛋白的能力。目前优选的位点664处的突变包括将天然Asp转变为Ala、Glu、Gln或者类似氨基酸。
[0027]在本发明的另一方面，突变人APP或APP样蛋白包括与残基664相邻的一个或多个突变，从而降低蛋白酶如胱天蛋白酶在位点664处切割APP或APP样蛋白的能力。
[0028]如本领域技术人员容易得知的，在产生本发明的转基因动物中应用的启动子可以是组成型活性的或诱导型的。合适的启动子是本领域技术人员公知的，包括能够识别T4、T3、Sp6和T7聚合酶的启动子，噬菌体λ的PR和PL启动子，大肠杆菌(E.coli)的trp启动子、recA启动子、热激启动子和lacZ启动子，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的α-淀粉酶和σ28-特异性启动子，芽孢杆菌(Bacillus)噬菌体的启动子，链霉菌(Streptomyces)启动子，噬菌体λ的int启动子，pBR322的β-内酰胺酶基因的bla启动子，和氯霉素乙酰转移酶基因的CAT启动子。原核启动子在Glick，J Ind.Microbiol. 1：277(1987)；Watson et al，MOLECULAR BIOLOGY OF THEGENE，4th Ed.，Benjamin Cummins(1987)；Ausubel et al，supra和Sambrook et al，supra有综述。
[0029]启动子区在长度和序列上变化，并且还可以包括序列特异性DNA结合蛋白的一个或多个DNA结合位点，和/或增强子或沉默子。示范性启动子包括CMV启动子或P5启动子，作为调控感兴趣的基因或编码序列的启动子。这样的启动子以及其突变是已知的，在本领域中有所描述(参见，例如，Hennighausen et al.，EMBOJ.，5，1367-1371(1986)；Lehner et al，J.Clin.Microbiol，29，2494-2502(1991)；Lang etal.，Nucleic Acids Res.，20，3287-95(1992)；Srivastava et al.，J.Virol.，45，555-564(1983)；Green et al.，J.Virol.，36，79-92(1980)；Kyostio et al.，supra)。然而，也可以应用其它启动子，如Ad2或Ad5主要晚期启动子和三联前导序列、劳斯肉瘤病毒(RSV)长末端重复序列和其它组成型启动子，如已在文献中描述的。例如，疱疹胸苷激酶启动子(Wagner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，78，144-145(1981))、金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster et al.，Nature，296，39-42(1982))、来自酵母或其它真菌的启动子元件如Gal 4启动子、醇脱氢酶启动子、磷酸甘油激酶启动子和碱性磷酸酶启动子都可以被应用。类似地，从哺乳动物细胞的基因组分离的启动子或从在这些细胞中生长的病毒(例如，Ad、SV40、CMV和类似物)分离的启动子都可以被应用。考虑用于本文的其它启动子包括肌动蛋白启动子、PDGF-β启动子、PrP(神经元特异性)启动子、神经元特异性烯醇酶启动子和类似启动子。
[0030]代替使用组成型启动子，启动子也优选地可以响应于适当的信号被上调和/或下调。例如，可以应用诱导型启动子如IL-8启动子，它对TNF或别的细胞因子具有反应性。适当的诱导型启动子系统的其它例子包括但不限于，金属硫蛋白诱导型启动子系统、细菌lac表达系统和T7聚合酶系统。进一步地，可以应用在不同的发育阶段被选择性激活的启动子(例如，球蛋白基因在胚胎和成人中被差异转录)。特别地，可以应用能够由外源性因子如四环素、天然激素如来源于昆虫的激素蜕皮素(或其合成的变体)或合成激素如RU486调节的启动子。这些启动子(和同样可以提供給细胞的伴随调节因子)在本领域中均有描述(参见，例如，Delort et al.，Human Gene Therapy 7，809-820(1996)；Clontech，CLONTECHniques，″Tet-Off.TMand Tet-On.TM Gene Expression Systems and Cell Lines″，Volume XI，No.3，2-5(1996年7月))。
[0031]另一选择是应用组织特异性启动子(即，优选地在特定组织中被激活并导致基因产物在其被活化的组织中表达的启动子)，如白蛋白或al-抗胰蛋白酶的肝细胞特异性启动子(Frain et al，Mol.Cell.Biol.10：991-999(1990)；Ciliberto et al，Cell 41：531-540(1985)；Pinkert et al.，Genes and Devel.，1，268-276(1987)；Kelsey et al，Genes and Devel.，1，161-171(1987))，在胰腺腺泡细胞中具有活性的弹性蛋白酶I基因调控区(例如，Swift et al.，Cell，38，639-646(1984)；MacDonald，Hepatology，7，425-515(1987))，在胰腺β细胞中具有活性的胰岛素基因调控区(Hanahan，Nature，315，115-122(1985))，在睾丸、乳腺、淋巴和肥大细胞中具有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒调控区(Leder et al.，Cell，45，485-495(1986))，在脑中的少突细胞中具有活性的髓磷脂碱蛋白基因调控区(Readhead et al.，Cell，48，703-712(1987))，和在下丘脑中具有活性的促性腺激素释放激素基因调控区(Mason et al.，Science，234，1372-1378(1986))。类似地，肿瘤特异性启动子诸如结肠癌的癌胚抗原(Schrewe et al.，Mol.CellBiol.10：2738-2748(1990))可以被用在载体中。根据本发明，可以通过诱变对任何启动子进行改变，只要其具有所需的结合能力和启动子强度。
[0032]如本领域技术人员容易得知的，宽范围的非人动物可以被用于制备本发明的转基因动物，包括啮齿动物、兔、猪和类似动物。根据本发明，目前优选的转基因动物是啮齿动物(例如，小鼠、大鼠和类似动物)，小鼠是特别优选的。
[0033]D664A突变——其不影响被培养的细胞中的Aβ生成(参见Soriano，S.，Lu，D.C.，Chandra，S.，Pietrzik，C.U.和Koo，E.H.J Biol Chem 276：29045-50(2001))，被导入人APP(hAPP)小基因(minigene)，所述基因携带瑞典(K670N，M671L)和印第安那(V717F)家族性AD突变，其位于PDGF β链启动子的下游。将这些动物在C57BL/6背景下杂交5至10代，并与具有相似遗传背景的PDAPP转基因小鼠比较(J9和J20品系(参见Hsia et al和Mucke，supra)。可以应用此基本方法制备出众多转基因品系，包括PDAPP(D664A)B21、PDAPP(D664A)B36、PDAPP(D664A)B157、PDAPP(D664A)B159、PDAPP(D664A)B184、PDAPP(D664A)B190、PDAPP(D664A)B204、PDAPP(D664A)DB210、PDAPP(D664A)DB226、PDAPP(D664A)DB228、PDAPP(D664A)DB230、PDAPP(D664A)DB239、PDAPP(D664A)DB240、PDAPP(D664A)DB241、PDAPP(D664A)DB242、PDAPP(D664A)DB243、PDAPP(D664A)DB244、PDAPP(D664A)DB245、PDAPP(D664A)DB250、PDAPP(D664A)DB254、PDAPP(D664A)DB264和类似品系。
[0034]在最初产生的六个转基因品系中，一个品系(PDAPP(D664A)B21)表现出与PDAPP J20品系均相似的APP表达、Aβ浓度和纤维Aβ斑块数目(参见图1A-1D)。另一个PDAPP(D664A)转基因品系，PDAPP(D664A)B157表现出比PDAPPJ9品系适度降低的APP表达水平(参见图1A)。选择这些转基因品系用于进一步研究。
[0035]为了评价Asp664的突变是否有效阻断在体内对hAPP的C端切割，用抗体对3月龄的PDAPP和PDAPP(D664A)小鼠的脑切片进行免疫染色，所述抗体特异识别在Asp664处切割APP后产生的C端新表位(APPNeo；参见Galvan，V.et al.，J Neurochem 82：283-94(2002))。虽然在PDAPP动物的海马神经元的细胞体和突起中检测到强的APPNeo免疫反应性，但是来自PDAPP(D664A)动物的切片中存在的免疫反应性水平与在任一转基因品系的非转基因同窝动物中观察到的免疫反应性水平无法区分(参见图1E)。
[0036]AD患者的认知功能减退程度与海马和前额叶皮层中的突触前囊泡蛋白突触泡蛋白(synaptophysin)的水平的变化密切相关(参见，例如，Terry，R.D.et al.，AnnNeurol 30：572-80(1991))。低水平的突触泡蛋白—推测其与突触损伤相关—与AD的最早阶段相关(参见，例如，Masliah，E.et al.，Neurology 56：127-9(2001))。PDAPP小鼠在斑块形成之前充分表现出降低数目的海马突触泡蛋白免疫反应性突触前密度(参见，例如，Hsia，A.Y.et al.，Proc NatlAcad Sci USA 96：3228-33(1999))。为了确定D664A突变在hAPP转基因小鼠的海马中的突触前元件的丢失中是否起作用，在8-10月龄的PDAPP、PDAPP(D664A)和对照小鼠中测定海马突触前密度、突触密度和齿状回体积，通过对“立体解剖(stereological dissector)”方法的修改来实施(参见实施例6和Hsia，A.Y.et al.，Proc Natl Acad Sci USA 96：3228-33 (1999))，因为这些参数代表了阿尔茨海默病中认知功能降低的关联。出乎意料地，虽然与其非转基因同窝动物相比，PDAPP小鼠表现出海马突触密度的显著降低，但是B21小鼠并非如此(参见图2A和2B)。另一个PDAPP(D664A)转基因品系B157产生同样的结果。
[0037]类似地，如近来所述(参见Redwine，J.M.，Kosofsky，B.，Jacobs，R.E.，Games，D.，Reilly，J.F.，Morrison，J.H.，Young，W.G.和Bloom，F.E.，Proc Natl Acad Sci USA100：1381-6(2003))，PDAPP小鼠表现出降低的齿状回体积，特别是在分子层；然而，在B21小鼠中没有观察到显著的丢失(参见图2C)。
[0038]皮层体积的显著降低是AD的基本神经病理学特征之一。虽然不是所有的AD转基因小鼠模型重现该疾病的此特定特征，已经显示，PDAPP小鼠在相对早期(3-4个月)表现出降低的齿状回体积，特别是在分子层(参见，例如，Dodart，J.C.et al.，Neurobiol Dis 7：71-85(2000)和Redwine，J.M.et al.，Proc Natl Acad Sci USA100：1381-6(2003))。因而，通过对尼式染色切片进行数字三维重建和通过人工卡瓦列里分析确定3月龄PDAPP、PDAPP(D664A)和对照动物的齿状回体积是有意义的。在PDAPP小鼠的脑中观察到明显的齿状回萎缩，但在PDAPP(D664A)小鼠中没有见到，二者都是通过人工卡瓦列里分析(参见图2B)以及数字3D重建(参见图2C和2D)确定的。由卡瓦列里分析和数字三维重建得到的体积是高度相关的(r2＝0.72，p＜0.00001，n＝25)(参见图5)。
[0039]考虑到APP转基因小鼠中的突触完整性，突触传递的功能检测是有意义的，因为突触数目的组织学测定可能过高估计脑中存在的功能性突触的数目。已显示，PDAPP小鼠中突触前结构的丢失伴随有基础突触传递的损害(参见Hsia，A.Y.et al.，Proc Natl Acad Sci USA 96：3228-33(1999))。为了确定在PDAPP(D664A)小鼠的海马中观察到的突触前密度的恢复是否相应于对突触功能的拯救，对来自3-7月龄的PDAPP、PDAPP(D664A)和对照小鼠脑的急性海马切片进行电生理记录。应用细胞外记录的兴奋性突触后电位(fEPSPs)来评价海马CA3细胞和CA1细胞之间的基础突触传递的强度。与在其它转基因APP品系中所报道的相似，在PDAPP小鼠中观察到基础突触传递(输入输出比)降低约40％，这表明突触传递明显受损。与之对照，在PDAPP(D664A)和非转基因同窝对照小鼠之间没有观察到突触传递有明显差异(参见图3A和3B)。与观察到的突触前密度数目的丢失相一致，在携带D664A突变的动物中，不存在在PDAPP小鼠中明显的电生理缺陷。此外，双脉冲易化—其与递质释放的概率负相关—在被检测的所有组之间无变化(参见图3C)，这表明PDAPP(D664A)小鼠与PDAPP转基因品系类似，在突触前功能上没有额外的缺陷。因此，很可能是PDAPP(D664A)小鼠中保留的突触前元件代表了功能性突触。
[0040]在患有AD的患者的海马和在PDAPP小鼠的脑中，神经发生增强(参见Jin，K.et al.，Proc Natl Acad Sci USA 101：343-7(2004))。因此，在急性和慢性神经疾病中，损伤诱导的神经发生可能有助于脑修复。为了评价D664A突变对PDAPP诱导的海马神经发生的影响，应用溴脱氧尿苷(BrdU)标记12月龄对照、PDAPP和PDAPP(D664A)小鼠中齿状回的颗粒下区(正常成年个体的神经发生和AD诱导的神经发生的主要部位)的增生细胞。在PDAPP小鼠中，BrdU标记细胞(它们中的大多数表达未成熟神经元的标志物蛋白，双皮质蛋白(doublecortin))的数目增加至对照水平的约两倍，但是此效应被D664A突变破坏(参见图4)。
[0041]总体而言，B21小鼠产生不能与PDAPP小鼠区分开来的Aβ和淀粉样沉积物，但是它们不表现出见于PDAPP动物中的海马突触密度或齿状回体积的特征性丢失。这些发现表明，胱天蛋白酶(或可能是非胱天蛋白酶或蛋白酶)对hAPP在Asp664处进行的切割使得出现hAPP转基因小鼠中的突触丢失和齿状回体积降低。这些现象说明，这种小鼠AD模型中的海马突触丢失和齿状回萎缩是由对APP在Asp664处进行的切割介导的，其或者独立于Aβ沉积或者是在Aβ生成的下游(参见Lu et al.，″Amyloid β-protein toxicity is mediated by the formation of amyloid-βprotein precursor complexes″，Annals of Neurology，in press)。进一步地，结果表明，在阿尔茨海默病的表型的这些表现中，APP的胞质内结构域起到关键作用。
[0042]此外，本文中示出的结果表明，在胱天蛋白酶切割位点带有突变Asp->Ala(D664A)—该突变防止在体内对hAPP在Asp664处进行切割—的APP转基因小鼠继续产生Aβ并表现出斑块沉积，但是没有出现表征PDAPP小鼠的表型的海马突触丢失或脑萎缩(PDAPP小鼠表现出突触传递的大大降低)。用本发明转基因小鼠进行的工作表明，在PDAPP(D664A)小鼠中，PDAPP小鼠的突触传递损害被完全恢复。
[0043]这些结果表明，对APP的C端切割导致AD小鼠模型中观察到的突触损害和体积丢失，这与对APP的C端切割牵涉AD发病机理一致。更重要的是，本文中显示的结果构成了遗传试验证据，其表明突触丢失和海马萎缩可以独立于Aβ的产生和沉积。
[0044]对APP的C端部分的切割可能影响APP所涉及的几种不同的细胞功能。本发明的转基因动物提供了检测影响突触丢失并作为神经变性疾病如AD的发病机理的早期阶段的基础的早期过程的独特机会。与对疾病进程晚期丢失的神经元网络的替换相比，在AD早期阶段突触功能的恢复更直接地得到保证。本文提出的对PDAPP(D664A)小鼠的观察结果与不和Aβ的产生或沉积直接相关的机理的存在相一致，所述机理对于小鼠的AD相关病理学是重要的，并且构成了用于药物发现的新的潜在靶标。如本文所提供的对在AD早期阶段起作用的机理的持续阐述，有助于对阻碍并潜在地终止或者甚至逆转早期AD中出现的突触退化的疗法的开发。
[0045]由于基因型、表型和与生活史相关的因素的缘故，与人类特定病理状态相关的标志物的鉴定被大大复杂化。在另一方而，虽然转基因动物模型提供了可以对这些变量进行控制的适当的试验体系，但是它们具有潜在的显著缺陷，即，在发育期间作为转基因表达的结果，潜在地出现生理反应或代偿机制的活化。因此，转基因动物和它们的非转基因同窝动物的比较可以产生有关变化的信息，所述变化是由于转基因本身的表达而不是由于模型动物的发病机理产生的。
[0046]通过防止对hAPP转基因的C端进行切割，PDAPP小鼠中的AD相关表型的基本特征在本发明转基因动物中被有效逆转。由于PDAPP和PDAPP(D664A)小鼠共有许多遗传相似性，即，1)它们从除A->C颠换之外相同的载体产生，2)它们共有相同的遗传背景，和3)它们以类似的水平表达人APP转基因，可以认为，在PDAPP和PDAPP(D664A)动物中，由于转基因本身的表达而产生的变化将是类似的。因此，在不存在混淆基因型、表型或环境变量的情况下(如动物是完全同类系的，并可以容易地在受控的环境中饲养和居住)，相对于非转基因同窝动物，比较在PDAPP小鼠中存在而在PDAPP(D664A)小鼠中不存在的变化(标志物)，使得能够明确鉴定出与AD的进展相关的标志物，以及它们与由转基因本身的表达所产生的那些标志物的区别。
[0047]来自PDAPP和PDAPP(D664A)品系的半合子转基因动物可以被产生，用作试验动物。具体地，可以产生同类系C57BL/6J背景的12只2月龄半合子转基因PDAPP和PDAPP(D664A)动物，以及12只非转基因同窝动物，从而产生汇合血清、脑提取物或其它感兴趣器官的提取物。
[0048]随后可以通过适当的方式，用上述动物产生样品，用于蛋白质组学研究或基因组学研究。鉴定来自转基因动物和非转基因动物的样品中存在的蛋白质或mRNAs和分析数据以确定哪些蛋白质在一个上述群体中独特地存在、不存在、丰度增加或降低，可以用标准技术如，例如，质谱、DNA微阵列杂交技术和类似技术进行。
[0049]根据本发明的又一方面，提供了鉴定可用于治疗神经变性疾病的化合物的方法，所述方法包括鉴定阻断胱天蛋白酶切割β-淀粉样前体蛋白(APP)以产生羧基端肽APP-C31的能力的化合物。
[0050]如本领域技术人员容易地知晓的，阻断胱天蛋白酶切割β-淀粉样前体蛋白(APP)产生羧基端肽APP-C31的能力的化合物可以用多种方法被鉴定，例如，通过在胱天蛋白酶存在的情况下使APP或APP样蛋白质与测试化合物接触，和监测APP-P31的形成，其中胱天蛋白酶不能诱导APP-P31产生提示了可用于治疗神经变性疾病的化合物。
[0051]可选地，阻断胱天蛋白酶切割β-淀粉样前体蛋白(APP)产生羧基端肽APP-C31的能力的化合物可以这样被鉴定：在胱天蛋白酶存在的情况下使APP或APP样蛋白(例如，APLP1或APLP2)与测试化合物接触，并筛选以找到切割的证据，所述证据选自切割产物的易位(translocation)、细胞死亡的诱导、萎缩的诱导、和突触丢失的诱导。APLP1和APLP2是APP蛋白家族的成员，统称为“APP样蛋白(APP-like proteins)”。然而，APP的γ和β-分泌酶切割所需的位点在APLP1或APLP2中并不是保守的。因此，这些分子不具有产生β-淀粉样肽的能力。然而，在APLP1和APLP2中，使得能够产生APP-C31的C端胱天蛋白酶切割位点是保守的。对于APLP1，P4-P1′位置将是VEVDP，对于APLP2，P4-P1′位置将是VEVDP，而在APP中，P4-P1′位置是VEVDA。这些序列，类似于APP中的那些序列，与前述的引发/顶点胱天蛋白酶(initiator/apical caspase)如胱天蛋白酶8和胱天蛋白酶9的胱天蛋白酶切割位点很好地配合。预测的APLP1-C31肽与APP-C31肽具有52％的同一性和77％的相似性，预测的APLP2-C31肽与APP-C31肽有71％的同一性和83％的相似性。
[0052]作为另一选择，在损伤(例如，Aβ、缺血、热休克、缺氧、葡萄糖剥夺、星形孢菌素和类似物)存在或不存在的情况下，表达APP、APLP1、APLP2或类似物的细胞可以被筛选，筛选阻断APP-C31生成的化合物(其中的后者可以应用特异性检测APP的羧基端切割产物的抗体进行分析，或者通过可选的方法如报告分子分析(reporter assay)、ELISA试验和类似方法进行分析)。
[0053]随后可以对上述筛选方法中鉴定出的化合物进行体内测试，例如，通过测试其在阿尔茨海默病动物模型(即，不带有Asp664->Ala突变的相同的转基因动物)中的效力和将其反应与本发明的Asp664->Ala突变转基因动物的反应相比较。
[0054]候选化合物可以从宽范围的来源得到，包括合成化合物或天然化合物文库。例如，对于随机和定向合成宽范围的有机化合物和生物分子，包括表达随机化的寡核苷酸和寡肽，许多方法是可以利用的。可选地，细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物文库是可以利用的或者可以容易地被产生。此外，容易通过传统的化学、物理和生物化学方法对天然或合成产生的文库和化合物进行修饰，并且可以用它们产生组合文库。已知的药物学制剂可以经历定向或随机化学修饰，如酰化、烷基化、酯化、酰胺化等，产生结构类似物。候选药剂也发现于生物分子中，包括肽、糖、脂肪酸类、固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、结构类似物或其组合和类似物。
[0055]根据本发明的又一方面，提供了治疗神经变性疾病的方法，所述方法包括，向需要的对象施用通过上述方法鉴定的有效量的一种或多种化合物。
[0056]如本文所用，“治疗”是指抑制或阻止疾病、病症或病理状态的进展，和/或引起疾病、病症或病理状态减轻、缓解或复原。本领域技术人员将理解，可以用多种方法学和试验评价疾病、病症或病理状态的进展，类似地，可以用多种方法学和试验评价疾病、病症或病理状态的减轻、缓解或复原。
[0057]实质上，在病因学上与淀粉样蛋白的形成和/或沉积相关的任何疾病都被考虑用于本发明的治疗方法。如本文所用，“神经变性疾病(neurodegenerativedisease)”是指病症如阿尔茨海默病、系统性老年淀粉样变性、朊病毒病(priondisease)、痒病、牛海绵状脑病、克-雅病(Creutzfeldt-Jakob Disease)、格-施-沙综合症(Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome)、II型糖尿病、成人发病糖尿病(adultonset diabetes)、胰岛素瘤、淀粉样蛋白A淀粉样变、AL淀粉样变、家族性淀粉样多发性神经病(familial amyloid polyneuropathy)(葡萄牙型、日本型和瑞典型)、家族性转甲蛋白淀粉样变、家族性地中海热、伴有荨麻疹和耳聋的家族性淀粉样神经病(familial amyloid nephropathy with urticaria and deafness)(穆-韦综合症)、遗传性非神经系统淀粉样变(hereditary non-neuropathic systemic amyloidosis)(家族性淀粉样多发性神经病III)、芬兰型家族性淀粉样变、家族性淀粉样心肌病(丹麦型)、孤立性心脏淀粉样变(isolated cardiac amyloid)、孤立性动脉淀粉样变、先天性(原发性)淀粉样变、骨髓瘤或巨球蛋白血症相关淀粉样变、与舍格伦综合症相关的原发性局限性皮肤结节淀粉样变、反应性(继发性)淀粉样变、伴有冰岛型淀粉样变的遗传性脑出血、与长期血液透析相关的淀粉样变、纤维蛋白原相关的遗传性肾脏淀粉样变、与甲状腺髓样癌相关的淀粉样变、溶菌酶相关的遗传性系统性淀粉样变和类似疾病。
[0058]淀粉样沉积物见于被诊断患有阿尔茨海默病的对象中，阿尔茨海默病是一种神经变性疾病，特征为脑皮质、皮质下区和海马的神经细胞萎缩，以及斑块、轴突营养障碍和神经原纤维缠结的存在。在阿尔茨海默病中，营养障碍或异常的轴突生长、突触丢失和神经原纤维缠结形成与疾病的严重程度密切相关。营养障碍的神经元在轴突的细胞质中特征性地含有丰富的电子致密的多层小体(multilaminar bodies)，并且具有突触连接的中断。营养障碍的神经元包绕淀粉样蛋白沉积物，从而形成遍布脑神经纤维网以及脑血管壁的老年斑。用于治疗阿尔茨海默病的本发明方法可以减轻或阻断神经细胞的萎缩，减轻或阻断老年斑或神经原纤维缠结的形成，以及类似作用，以至于疾病的进展被减慢或阻止。
[0059]淀粉样沉积物也见于被诊断患有II型糖尿病的患者的郎格罕岛中。沉积物含有淀粉样蛋白，其源自称作胰岛淀粉样多肽(IAPP)或胰淀素(amylin)的较大前体，在正常的动物中，其具有激素功能。IAPP由胰岛β细胞产生，对肝脏和横纹肌细胞摄取葡萄糖具有重要的作用。在具有人胰淀素的转基因并用高脂肪饮食喂养的转基因小鼠中，胰淀素的过量表达导致胰岛淀粉样沉积(参见Pathology，3rd ed.(1999)supra，p.1226)。本发明治疗患有II型糖尿病患者的郎格罕岛中的淀粉样沉积物的方法可以减少或防止淀粉样蛋白的形成，减少或防止淀粉样蛋白沉积为淀粉样沉积物和具有类似作用。
[0060]注意到有淀粉样沉积物的又一疾病是朊病毒病，它是一种海绵状脑病。朊病毒病是神经变性疾病，临床特征是进行性共济失调和痴呆，病理学特征是海绵状脑组织的空泡形成。淀粉样沉积物与已知为库鲁病的至少一种朊病毒病相关。在库鲁病中，约70％的朊病毒蛋白在细胞外累积，形成斑块，与之相比，正常朊病毒蛋白是被组成型表达的细胞表面糖蛋白(参见，Pathology，3.sup.rd ed.supra，pp.1492-1496)。本发明治疗朊病毒病的方法可以减少或防止淀粉样蛋白的产生，减少或防止淀粉样斑块的沉积，和具有类似作用。
[0061]注意到淀粉样沉积物的又一疾病是淀粉样蛋白A淀粉样变性。淀粉样蛋白A淀粉样变性是指源自表面上不相关的病症如慢性炎症性疾病、肿瘤形成疾病和遗传性疾病的淀粉样变性。淀粉样蛋白的沉积对基础的疾病状态而言是继发性的。前体分子是血清淀粉样蛋白A(SAA)，它是急性期反应物，在许多疾病中可以用作炎症的替代标志物。本发明治疗淀粉样蛋白A淀粉样变性的方法可以减少或防止淀粉样蛋白的产生，减少或防止淀粉样蛋白的前体产生，减少或防止产生活性淀粉样蛋白所需的几个步骤中的任一步骤，减少或防止淀粉样斑块的沉积，和具有类似作用。
[0062]注意到淀粉样沉积物的又一疾病是家族性转甲蛋白淀粉样变，它是家族性淀粉样多发性神经病(FAP)的最普遍形式。人淀粉样病症，家族性淀粉样多发性神经病、家族性淀粉样心肌病和老年系统性淀粉样变是由不溶性转甲蛋白(TTR)原纤维引起的，其沉积在外周神经和心脏组织中。转甲蛋白是同源四聚体血浆蛋白，参与甲状腺素和视黄醛的转运。最普通的产淀粉样蛋白的TTR变体是V30M-TTR，而L55P-TTR是与FAP的最具有攻击性形式有关的变体。本发明治疗转甲蛋白引起的淀粉样变的方法可以减少或防止淀粉样蛋白的产生，减少或防止前体生成淀粉样蛋白，减少或防止产生活性淀粉样蛋白所需的几个步骤中的任一步骤，减少或防止淀粉样斑块的沉积，和具有类似作用。
[0063]注意到淀粉样沉积物的又一疾病是AL淀粉样变。AL淀粉样变是与原发性免疫球蛋白产生疾病相关的一类疾病，所述原发性免疫球蛋白产生疾病包括原发性淀粉样变、浆细胞体液疾病、免疫母细胞性淋巴瘤、多发性骨髓瘤和类似疾病。原发性系统性AL(淀粉样蛋白轻链)淀粉样变是浆细胞疾病，其中淀粉样轻链蛋白的沉积引起进行性器官功能衰竭。原发性淀粉样变的预后通常不佳，存活中间数是1-2年。在局灶性和系统性AL淀粉样变中，前体蛋白都是免疫球蛋白轻链，其表现出相同方式的片段化和一级结构的改变。本发明治疗AL淀粉样蛋白引起的淀粉样变的方法可以减少或防止淀粉样蛋白的产生，减少或防止前体生成淀粉样蛋白，减少或防止产生活性淀粉样蛋白所需的几个步骤中的任一步骤，减少或防止淀粉样斑块的沉积，和具有类似作用。
[0064]如本文所用，“施用(administering)”是指向对象提供治疗有效量的化合物，其中应用经口、舌下、静脉内、皮下、经皮、肌肉内、皮内、鞘内、硬膜外、眼内、颅内、吸入、经直肠、阴道内和类似施用方式。也考虑以乳膏剂、洗剂、片剂、胶囊、丸剂、可分散粉末、颗粒、栓剂、糖浆、酏剂、锭剂、注射液、无菌水溶液或非水溶液、悬浮液或乳剂、贴剂以及类似剂型的形式施用。活性成分可以和无毒的药学上可接受的载体混合，所述载体包括葡萄糖、乳糖、阿拉伯树胶、明胶、甘露醇、淀粉糊、三硅酸镁、云母、玉米淀粉、角蛋白、胶体硅石、马铃薯淀粉、尿素、葡聚糖和类似物质。
[0065]施用的优选路径将随着临床指征而变化。根据被治疗的患者的状态，剂量上的一些变化将必然发生，在任何情况下，医生会决定个别患者的适当剂量。在众多因素中，每单位剂量中的化合物的有效量取决于体重、生理情况和选择的接种方案。化合物的一个单位剂量是指，每次施用事件中应用的化合物的重量，其中不包括载体重量(当应用载体时)。
[0066]靶向输送系统如聚合物基质、脂质体和微球，可以增加需要治疗剂的部位处的治疗剂的有效浓度并降低治疗剂的不需要的效应。随着治疗剂的更有效输送，该药剂的全身浓度得以降低，原因是可以施用较少量的治疗剂同时产生相同或更好的治疗效果。增加治疗剂输送效率的可适用方法典型地着重于将靶向部分(targeting moiety)连接到治疗剂或连接到随后加载有治疗剂的载体。
[0067]通过应用载体如蛋白质、肽、多糖、合成聚合物、胶态颗粒(即，脂质体、囊或微团)、微乳剂、微球和纳米颗粒，多种药物输送系统被设计出来。含有俘获的药学上有用药剂的这些载体，意图于获得受控制的细胞特异性或组织特异性药物释放。
[0068]考虑用于本文的化合物可以以脂质体的形式施用。如本领域已知，脂质体通常从磷脂或其它脂类物质得到。脂质体通过分散在含水介质中的单层或多层水合液体结晶形成。能够形成脂质体的任何无毒的、生理上可接受的和可代谢的液体都可以被应用。本文所述的化合物处于脂质体形式时，除了本文所述的化合物之外，可以含有稳定剂、防腐剂、赋形剂和类似物质。优选的脂类是磷脂和磷脂酰胆碱(卵磷脂)，无论是天然的和合成的。形成脂质体的方法是本领域已知的(参见，例如，Prescott，Ed.，Methods in Cell Biology，Volume XIV，Academic Press，NewYork，N.Y.，(1976)，p 33 et seq.)
[0069]可以用几种输送途径避开血脑屏障将治疗剂输送到脑。这些途径利用鞘内注射、手术植入(Ommaya，Cancer Drug Delivery，1：169-178(1984)和美国专利5,222,982)、间质输注(Bobo et al，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，91：2076-2080(1994))和类似途径。这些策略通过直接施用于脑脊液(CSF)或脑实质(ECF)将药剂输送到CNS。
[0070]药物通过脑脊液向中枢神经系统的输送得以实现，例如，借助于被其发明者称作“奥马耶贮存物(Ommaya reservoir)”的硬膜下植入设备来实施。药物被注射进该设备，随后释放到包绕脑的脑脊液中。它可以定向于随后吸收药物的暴露的脑组织的特定区域。此吸收受到限制，原因是药物剂量不自由传播。用改良的设备给予药剂，通过该设备，贮存物(reservoir)被植入腹腔，注射的药物通过脑脊液(从脊柱采取并回到脊柱)运输到脑室空间。通过ω-3衍生，位点特异性生物分子复合物可以克服受限的吸收和治疗剂穿过脑组织的运动。
[0071]改进药剂向CNS的输送的另一策略是增加药剂通过血脑屏障的吸收(吸收和运输)和细胞对治疗剂的摄取(Broadwell，Acta Neuropathol.，79：117-128(1989)；Pardridge et al，J.Pharmacol.Experim.Therapeutics，255：893-899(1990)；Banks et al.，Progress in Brain Research，91：139-148(1992)；Pardridge，Fuel Homeostasis and theNervous System，ed.：Vranic et al.，Plenum Press，New York，43-53(1991))。通过改进药剂本身的渗透性或改变血脑屏障的特性，可以增强药剂穿过血脑屏障向脑的通行。因此，通过化学修饰增加药剂的脂溶性，和/或通过将药剂偶联到阳离子载体，或者通过将药剂共价偶联到能够运输药剂穿过血脑屏障的肽载体，可以协助药剂的通过。也已知肽转运载体是血脑屏障渗透化合物(美国专利5,268,164)。可用于输送到脑的具有亲脂特性的位点特异性大分子描述于美国专利6,005,004中。
[0072]其它例子(美国专利4,701,521和美国专利4,847,240)描述了将药剂共价结合到阳离子大分子载体的方法，所述载体以相对高的速率进入细胞。这些专利教导了，当生物分子被共价结合到阳离子树脂时，细胞对该生物分子的细胞摄取增强。
[0073]美国专利4,046,722公开了与阳离子聚合物共价结合的抗癌药，目的是将药物导向带有特定抗原的细胞。聚合物载体具有约5,000至500,000的分子量。可以用这种聚合物载体以靶向方式输送本文所述的化合物。
[0074]涉及通过酸敏感中间体(也称作间隔体)分子将药剂共价结合到阳离子树脂的进一步工作描述于美国专利4,631,190和美国专利5,144,011。各种间隔体分子如顺乌头酸，被共价连接到药剂和聚合物载体。在酸性轻度增加时，如在细胞的溶酶体中可能发生的，它们控制药剂从大分子载体释放。药物可以从分子偶联物中被选择性地水解并以其未修饰形式和活化形式被释放到细胞中。分子偶联物被转运到溶酶体，在该处它们在比机体或细胞中的其它区室或流体实质上更加酸性的pH下，在溶酶体酶的作用下被代谢。溶酶体的pH值被显示为约4.8，而在偶联物消化的起始阶段，pH可能低至3.8。
[0075]如本文所用，短语“治疗有效量”在用于描述考虑用于本发明实践的化合物时，是指足以提供足够高的循环浓度以便为其接受者提供有益效果的化合物剂量。对于任何特定患者，具体的治疗有效剂量水平将取决于许多因素，包括欲治疗的病症、病症的严重程度、所应用的具体化合物的活性、施用路径、具体化合物的清除率、治疗持续时间、与具体化合物联合应用或同时应用的药物、年龄、体重、性别、饮食和患者的一般健康状况，以及医学领域和科学中公知的类似因素。剂量水平典型地落入约0.001至100mg/kg/日的范围；优选在约0.05至10mg/kg/日的范围。
[0076]如本文所用，短语“接触”是指将化合物提供给细胞或细胞靶标。接触可以以固相、液相或气相发生，是指在细胞外和细胞内发生的事件。本领域技术人员将知道，可以通过许多施用方式将化合物在体内提供给细胞，包括经口、舌下、静脉内、皮下、透皮、肌肉内、皮内、鞘内、硬膜、眼内、颅内、吸入、经直肠、阴道内和类似的施用方式。
[0077]根据本发明的又一方面，提供了治疗神经变性疾病的方法，所述方法包括，阻断胱天蛋白酶切割β-淀粉样前体蛋白(APP)和/或APP样蛋白(例如，APLP1或APLP2)产生羧基端肽APP-C31的能力。
[0078]如本领域技术人员容易知道的，可以用多种方法阻断蛋白酶切割APP和/或Aβ的能力，例如，通过抗蛋白酶抗体、基于蛋白酶编码序列的反义核苷酸、肽、肽模拟物、核酶、干扰RNAs、蛋白酶拮抗剂、阻断蛋白酶切割APP和/或Aβ的胞质内区域的能力的小分子和类似物质。
[0079]例如，通过施用与编码多肽的mRNA结合并抑制该mRNA表达的反义分子，可以抑制本发明的突变APP的表达，包括过表达。可选地，可以用切割mRNA的核酶，以类似方式抑制表达。应用反义分子和核酶技术调控基因表达的一般方法，或用于以此方式表达外源基因的基因疗法的一般方法，是本领域公知的。这些方法中的每一种方法利用系统，如载体，其编码本发明的突变APP的反义分子或核酶转录物。
[0080]术语“核酶(ribozyme)”是指具有催化特性的一种或多种RNA的RNA结构。核酶通常表现出内切核酸酶、连接酶或聚合酶活性。核酶是介导许多RNA自我切割反应的结构性RNA分子。已经鉴定出多种类型的反式作用核酶，包括“锤头”型和“发夹”型，它们具有不同的二级结构。多种核酶已得到表征。参见，例如，美国专利5,246,921、5,225,347、5,225,337和5,149,796。已描述了包括具有催化活性的脱氧核糖(deoxyribo)和核糖寡核苷酸(ribooligonucleotides)的混合核酶。Perreault，et al，Nature，344：565-567(1990)。
[0081]如本文所用，“反义分子(antisense)”是指核酸分子或它们的衍生物，其在细胞条件下，与编码本发明的突变体APP的基因组DNA和/或细胞mRNA特异杂交，例如与其结合，以至于抑制该蛋白质的表达，例如，通过抑制转录和/或翻译来实现。结合可以是通过常规的碱基对互补，或者例如，在与DNA双链体结合的情况下，是通过双螺旋的大沟中的特异性相互作用实现。
[0082]在一个方面，反义构建物是体外产生的核酸，在将其导入细胞时，其可以抑制基因表达，所述抑制是通过与APP或APP样分子的mRNA和/或基因组序列杂交实现的，但是不限于此方式。
[0083]反义方法可以涉及设计与APP或APP样mRNA互补的寡核苷酸(或是DNA或是RNA)。这些反义寡核苷酸将与APP或APP样mRNA转录物结合并防止翻译。
[0084]虽然优选完全互补，但这不是必须的。如本文所指，与RNA的一部分“互补”的序列意味着具有能够与该RNA杂交形成稳定双链体的足够互补性的序列；在双链反义核酸的情况下，可以测试双链体DNA的一条单链，或可以分析三链体的形成。杂交的能力将取决于互补程度和反义核酸的长度。一般而言，杂交核酸越长，它可能含有的与RNA的碱基错配越多，但仍然形成稳定双链体(或三链体，当情形可能如此时)。通过应用标准方法测定杂交复合物的熔点，本领域技术人员可以确定错配的可容忍程度。
[0085]应用反义分子、核酶技术和RNAi技术调控基因表达的一般方法，或用于以此方式表达外源基因的基因治疗方法的一般方法，是本领域公知的。这些方法中的每一种都利用系统如载体，其编码反义分子或APP或APP样多肽的核酶转录物。术语“RNAi”代表RNA干扰。在本领域中，此术语被理解为包括应用可以使基因沉默的RNA分子的技术。参见，例如，McManus，et al.Nature ReviewsGenetics 3：737(2002)。在本申请中，术语“RNAi”包括分子如短干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、小的短时RNA(stRNA)。一般而言，RNA干扰由双链RNA与基因的相互作用而产生。
[0086]一般地，与信息的5’端互补的寡核苷酸，例如位于AUG起始密码子上游并包括AUG起始密码子的5’非翻译序列，应该对抑制翻译最为有效。然而，已经显示，与mRNAs的3’非翻译序列互补的序列对抑制mRNAs的翻译也是有效的。(Wagner，R.(1994)Nature 372：333)。与mRNA编码区互补的反义寡核苷酸是效率较低的翻译抑制物，但是可以应用于本发明。不论是否被设计为与APP或APP样多肽mRNA的5’、3’或编码区杂交，反义核酸都应该是至少六个核苷酸的长度，并且优选地是约100个以下，更优选地是约50或30个核苷酸以下的长度。典型地，它们应该是10至25个核苷酸之间的长度。这样的原则将告知实施者选择适当的寡核苷酸。在优选实施方案中，反义序列从这样的寡核苷酸序列中选择，所述寡核苷酸包括编码APP或APP样多肽的核酸序列中的约10-30个、更优选地15-25个连续核苷酸碱基；由编码APP或APP样多肽的核酸序列中的约10-30个、更优选地15-25个连续核苷酸碱基组成；或基本上由编码APP或APP样多肽的核酸序列中的约10-30个、更优选地15-25个连续核苷酸碱基组成。
[0087]应用这样的序列，可以设计出反义寡核苷酸。这种反义寡核苷酸将被施用于表达APP或APP样多肽的细胞，并且靶RNA或蛋白质的水平与内部对照RNA或蛋白质的水平将被比较。用反义寡核苷酸得到的结果也将与用适当的对照寡核苷酸得到的结果相比较。优选的对照寡核苷酸是与测试寡核苷酸的长度大约相同的寡核苷酸。使得靶RNA或蛋白质的水平降低的那些反义寡核苷酸将被选择。
[0088]寡核苷酸可以是DNA或RNA或其嵌合混合物或衍生物或修饰形式，它们是单链或双链的。可以在碱基部分、糖部分或磷酸骨架处对寡核苷酸进行修饰，例如，以改进分子的稳定性、杂交等。寡核苷酸可以包括其它附加基团如肽(例如，用于靶向于体内的宿主细胞受体)或协助转运穿过细胞膜(参见，例如，Letsinger et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.86：6553-6556；Lemaitre et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci USA 84：648-652；PCT公布号WO 88/09810，1988年12月15日公布)或血脑屏障(参见，例如，PCT公布号WO 89/10134，1988年4月25日公布)的药剂，触发杂交的切割剂(参见，例如，Krol et al.(1988)BioTechniques 6：958-976)或嵌合剂(参见，例如，Zon(1988)Pharm.Res.5：539-549)。为此，寡核苷酸可以与另一分子偶联，例如，肽、杂交触发交联剂、转运剂、杂交触发切割剂等。
[0089]反义寡核苷酸可以包括至少一种修饰的碱基部分，所述部分选自诸如5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶和5-(羧基羟基乙基)尿嘧啶。反义寡核苷酸也可以包括至少一种修饰的糖部分，选自但不限于阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖。
[0090]在又一实施方案中，反义寡核苷酸包括至少一种修饰的磷酸骨架，选自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代磷酰胺酯、氨基磷酸酯、磷酰二胺酯、甲基磷酸酯、和烷基磷酸三酯和formacetal或其类似物(也参见美国专利号5,176,996；5,264,564和5,256,775)。
[0091]在又一实施方案中，反义寡核苷酸是α-异头寡核苷酸。α-异头寡核苷酸和互补RNA形成特异双链杂合体，其中，与通常的β单元相反，这些链彼此平行排列(Gautier et al.(1987)Nucl.Acids Res.15：6625-6641)。所述寡核苷酸是2’-O-甲基核糖核苷酸(Inoue et al.(1987)Nucl.Acids Res.15：6131-6148)或嵌合的RNA-DNA类似物(Inoue et al.(1987)FEBS Lett.215：327-330)。
[0092]也适宜的是肽基核酸，其为多肽如聚丝氨酸、聚苏氨酸等，包括含有多种氨基酸的共聚物，在侧链部位取代有核酸(T、A、G、C、U)。这种聚合物链能够以与天然DNA/RNA相同的方式通过互补碱基杂交。可选地，本发明的反义构建物可以被输送，例如，作为表达质粒或载体输送，当在细胞中转录时，它们产生与编码本发明的激酶多肽的细胞mRNA的至少一个独特部分互补的RNA。
[0093]虽然可以应用与APP或APP样多肽编码区序列互补的反义核苷酸，但是最优选与被转录的非翻译区互补的那些核苷酸。
[0094]根据本发明的又一方面，提供了防止海马突触丢失的方法，所述方法包括阻断胱天蛋白酶或其它蛋白酶切割β-淀粉样前体蛋白(APP)和/或APP样蛋白(例如，APLP1或APLP2)的能力。
[0095]如上所指出，蛋白酶切割APP和/或APP样蛋白(例如，APLP1或APLP2)的能力可以通过多种方法被阻断，例如，通过抗蛋白酶抗体、基于蛋白酶编码序列的反义核苷酸、肽、肽模拟物、核酶、干扰RNAs、蛋白酶拮抗剂、阻断蛋白酶切割APP和/或APP样蛋白(例如，APLP1或APLP2)的胞质内区域的能力的小分子和类似物质。
[0096]根据本发明的又一方面，提供了防止齿状回萎缩的方法，所述方法包括阻断胱天蛋白酶或其它蛋白酶切割β-淀粉样前体蛋白(APP)和/或APP样蛋白(例如，APLP1或APLP2)的能力。
[0097]如上所指出，蛋白酶切割APP和/或APP样蛋白(例如，APLP1或APLP2)的能力可以通过多种方法被阻断，例如，通过抗蛋白酶抗体、基于蛋白酶编码序列的反义核苷酸、肽、肽模拟物、核酶、干扰RNAs、蛋白酶拮抗剂、阻断蛋白酶切割APP和/或Aβ的胞质内区域的能力的小分子和类似物质。
[0098]根据本发明的又一方面，提供了治疗神经变性疾病的基因治疗方法，所述方法包括将突变导入β-淀粉样前体蛋白(APP)以防止胱天蛋白酶介导的对其的切割。
[0099]事实上，进展导致了已展示出积极的初步结果的人类基因治疗的实践方法(综述于Miller，Nature 357：455-460，1992)。基因治疗的基本知识描述于Mulligan(Science 260：926-931，1993)。
[0100]因此，在一个实施方案中，含有突变APP编码序列的表达载体被插入细胞中，使细胞离体生长，然后大量输入患者。
[0100]根据本发明，基因治疗可以包括使用靶向于神经细胞的含有突变APPcDNA的腺病毒，通过植入基因工程细胞来系统性表达突变APP，用突变APP编码病毒进行注射，将裸突变APP DNA注射入合适的组织，和类似程序。
[0101]可以用衍生自病毒如逆转录病毒、天花病毒、腺病毒、腺相关病毒、肝炎病毒、几种RNA病毒或牛乳头瘤病毒的表达载体，将编码根据本发明的突变体APP的核苷酸序列(例如cDNA)输送到靶细胞群(例如神经细胞)。可以用本领域技术人员公知的方法构建含有编码序列的重组病毒载体(Maniatis et al.，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.，1989；Ausubel etal.，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates and WileyInterscience，N.Y.，1989)。可选地，可以将编码蛋白质序列的重组核酸分子用作裸DNA或用于重建系统中，例如，脂质体或其它脂类系统，用于输送到靶细胞(例如，Felgner et al.，Nature 337：387-8，1989)。存在将质粒DNA定向转入细胞中的几种其它方法，它们可用于人类基因治疗，并涉及通过将质粒DNA复合到蛋白质，使DNA靶向于细胞上的受体(Miller，supra)。
[0102]简单地通过微注射方法将微量DNA注射入细胞核，可以以最简单的形式进行基因转移(Capecchi，Cell 22：479-88，1980)。一旦重组基因被导入细胞，它们可以被细胞正常的转录和翻译机制识别，并且基因产物将被表达。其它方法也被尝试将DNA导入更多的细胞中。这些方法包括：转染，其中DNA用磷酸钙沉淀并通过胞吞作用被纳入细胞(Chen et al.，MoI. Cell Biol.7：2745-52，1987)；电穿孔，其中细胞被暴露于高电压脉冲下，以便在细胞膜中引入孔洞(Chu et al.，Nucleic AcidsRes.15：1311-26，1987)；脂转染/脂质体融合，其中DNA被包装在与靶细胞融合的亲脂性载体中(Felgner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.84：7413-7417，1987)；和应用与小的射弹结合的DNA进行粒子轰击(Yang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.87：9568-9572，1990)。将DNA导入细胞的另一方法是将DNA偶联到经化学修饰的蛋白质上。
[0103]也已经显示，腺病毒蛋白质能够使胞内体(endosomes)变不稳定并增强DNA的细胞摄取。将腺病毒与含DNA复合物的溶液混合，或者应用蛋白交联剂将DNA与共价连接于腺病毒的聚赖氨酸结合，充分改进了重组基因的摄取和表达(Curiel et al.，Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.，6：247-52，1992)。
[0104]如本文所用，“基因转移”意味着将外源核酸分子导入细胞的过程。基因转移普遍地被进行，以便能够表达由该基因编码的特定产物。产物可以包括蛋白质、多肽、反义DNA或RNA、或酶促活性的RNA。基因转移可以在培养的细胞中进行，或通过直接给予动物而进行。一般地，基因转移涉及核酸通过非特异性相互作用或受体介导的相互作用与靶细胞接触，核酸通过膜或胞吞作用摄取进入细胞，和核酸从胞浆膜或胞内体释放入细胞质的过程。此外，表达可能需要核酸移动进入细胞核并结合到合适的核因子以便转录。
[0105]如本文所用，“基因治疗”是基因转移的一种形式，被包括在本文所用的基因转移的定义中，具体而言，是指在体内或体外进行基因转移以从细胞表达治疗产物。基因转移可以离外对细胞实施，随后将细胞移植到患者，或者可以将核酸或核酸-蛋白复合物直接施用于患者来实施。
[0106]在另一优选实施方案中，提供了具有编码突变体APP的核酸序列的载体，其中所述的核酸序列仅在特定组织中被表达。实现组织特异性基因表达的方法列举在国际公布号WO 93/09236中，其在1992年11月3日提交并在1993年5月13日公布。
[0107]在上面列出的所有前述载体中，本发明的又一方面是，载体中包含的核酸序列可以包括对全部核酸序列或一些核酸序列的添加、缺失或修饰，如上所定义。
[0108]现在将参照下列非限制性实施例更加详细地描述本发明。
实施例1
PDAPP(D664A)突变的产生
[0109]将G至C的点突变引入带有瑞典型和印地安那型突变的PDGF β链启动子驱动的hAPP小基因(minigene)(参见Hsia et al，supra)，其将Asp664(APP695编号)变为Ala(PDAPP(D664A))。该突变通过测序和等位基因特异性扩增得以确认。
实施例2
转基因小鼠的产生
[0110]如前所述进行PDAPP(D664A)转基因的微注射，通过PCR鉴定转基因创始物(transgenic founders)，并选择用于本研究的PDAPP(D664)B21品系(参见Li，Y.，Carlson，E.，Murakami，K.，Copin，J.C.，Luche，R.，Chen，S.F.，Epstein，CJ.and Chan，P.H.，J Neurosci Methods 89，49-55(1999))，基本上如下进行。
[0111]将2ng/μl线性化的、不含载体序列的纯化人PDAPP(D664A)转基因DNA的溶液微注射入1天龄的B6D2F1/J卵的雄原核中，并在24小时后转入假孕CD1代孕母体中。通过PCR对创始者进行鉴定，其中应用特异于hAPP转基因的引物：
GGTGAGTTTGTAAGTGATGCC(SEQ ID NO：1)，和
TCTTCTTCTTCCACCTCAGC(SEQ ID NO：2)，
和特异于小鼠PKR基因的引物：
CAGGCCACTGGGAGGAAAAATG(SEQ ID NO：3)，和
ACCTTCTGTCATGTGGAGGTCC(SEQ ID NO：4)。
[0112]用相同方法制备的其它转基因品系，包括PDAPP(D664A)B36、PDAPP(D664A)B157、PDAPP(D664A)B159、PDAPP(D664A)B184、PDAPP(D664A)B190、PDAPP(D664A)B204、PDAPP(D664A)DB210、PDAPP(D664A)DB226、PDAPP(D664A)DB228、PDAPP(D664A)DB230、PDAPP(D664A)DB239、PDAPP(D664A)DB240、PDAPP(D664A)DB241、PDAPP(D664A)DB242、PDAPP(D664A)DB243、PDAPP(D664A)DB244、PDAPP(D664A)DB245、PDAPP(D664A)DB250、PDAPP(D664A)DB254、PDAPP(D664A)DB264和类似品系。
[0113]通过与C57BL/6J品种(Charles River Laboratories)杂合交配，转基因品系得以维持。所有的转基因动物就该转基因而言是杂合的，应用非转基因同窝动物作为对照。应用抗APP 5A3/1G7单克隆抗体，通过免疫沉淀随后通过蛋白质印迹检测脑匀浆中的人和小鼠APP(参见Soriano et al，supra)。
实施例3
可溶性Aβ的检测
[0114]脑中的Aβ水平是从CHAPS可溶性裂解物中测定的，其中应用识别Aβ肽的残基1-12的26D6抗APP单克隆抗体，通过免疫沉淀随后通过蛋白质印迹检测。在N-二羟乙基甘氨酸-尿素SDS-PAGE凝胶上对免疫沉淀物进行分级分离，分离出Aβ40和Aβ42种类(参见Weggen，et al，Nature 414：212-6(2001))。APP是从CHAPS脑裂解物的免疫印迹而来的，其中应用CT15，其为识别APP的C端的多克隆抗体。在沉积聚集的Aβ肽之前，所有的动物都是年龄匹配的，在3-4月龄之间。
实施例4
Aβ沉积物的定量
[0115]用如前述的3D6抗体对50微米厚的杂合PDAPP和PDAPP(D664A)B21小鼠的振荡切片机脑切片进行染色(参见Wyss-Coray，T.，Masliah，E.，Mallory，M.，McConlogue，L.，Johnson-Wood，K.，Lin，C.and Mucke，L.，Nature 389：603-6(1997)。鉴定总海马Aβ斑块，并由不知道品系和基因型的研究者计数。数据表示为均值+/-SD。
实施例5
在体内在Asp664处对APP进行的切割
[0116]应用特异于在Asp664处切割APP所产生的新表位的抗体(参见Galvan etal.，J Neurochem 82：283-94(2002))，证明了与对照组和PDAPP(D664A)相比，在PDAPP小鼠中的切割增加。
实施例6
突触前密度的定量
[0117]为了确定突触前末梢的完整性，用α-突触泡蛋白抗体(10μg/ml，Chemicon)对来自杂合雌性PDAPP和PDAPP(D664A)小鼠脑的50μm振荡切片机切片进行染色，随后用荧光素异硫氰酸酯偶联的猴抗小鼠IgG(1∶400，Vector Laboratories)染色，用碘化丙啶进行复染，应用使用了100×物镜和2.7×数字变焦的激光扫描共聚焦显微镜(Nikon PCM-2000)进行成像。CA1辐射层中的突触泡蛋白免疫反应活性突触前末梢的三维数值密度(表示为每mm3的目标数)是通过对经修改的立体解剖方法来测定的[参见Hsai，A.Y.et al.(1999)Proc.Nat.Acad.Sci.USA，96：3228-3233]。
[0118]对于每一动物，以2070 PMT增益获得六个1024×1024像素的(45μm×45μm)的单色共聚焦图像。以相同的x和y座标得到另外一组六个匹配的共聚焦图像，但是是在获得第一共聚焦图像的平面之下0.9μm的平面(z＝-0.90μm)，以2100PMT增益获得，以便用Simple PCI软件(Compix，Inc.)对光漂白进行校正。为了减少由于每一区域中对应于神经元突起的未染色区比例的变化在测定中带来的可变性，从每对图像的最亮区域收集两个10μm×10μm的亚区域，避开突起所占据的区域。处于不同z座标的这对10μm×10μm的亚区域中的每一个图像被伪色为红色和绿色并叠加。用Photoshop对得到图像的模糊处进行校正，用Simple PCI对两个平面之间的被免疫标记的目标(黄色)的数目进行计数。对于每个对象，每只小鼠取六个系列的海马切片，由随机隔开的12个此类解剖者获取目标数(避免解剖者之间的重叠)，取它们的平均值，并将其用于随后的统计学分析(参见图2B和2C)。
实施例7
体积测定
[0119]借助于合适的图谱，限定出海马齿状回(DG)和分子层(ML)(参见Paxinos，G.，Franklin K.B.J.“The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates”Academic Press(2001)，San Diego)。应用Imaris3D(Bitplane AG，Switzerland)经三维重建确定总海马体积和亚区域的体积(参见图2C)并用卡瓦列里分析确认(参见图2B)。
[0120]为了用Imaris3D(Bitplane)和人工卡瓦列里分析确定体积，借助于合适的图谱，画出骤冷小鼠脑的40μm尼式染色切片的一分为四的系统随机系列2×图像中的每个海马半球、齿状回(DG)和分子层(ML)亚区域的边界(对应于25只100天的杂合转基因雄性或非转基因雄性同窝动物)，分别在与伞部和胼胝体的灰质/白质边界、在分子层和腔隙分子的边界以及多形层与丘脑的边界画出[参见Paxinos，G.andFranklin，K.B.J.，(2001)Academic Press，San Diego，CA]。海马下托被排除。在每一样品中，最后的切片被定义为显示有胼胝体纤维的连续束的最后切片。对于Imaris3D体积测定，用Align application(Bitplane)对切片进行比对，在需要时人工调整得到的系列切片。应用3.3μm×3.3μm×160μm的像素尺寸(voxel-size)进行所有随后的3D重建和体积测定。为了应用卡瓦列里原理估计体积，将200μm的栅格覆盖在样品的每个切片的1280×1024像素图像上，对样品中的每个切片，计算每个海马半球、齿状回和分子层亚区内的栅格交叉数目。按照以前所述计算体积(参见Gonzalez-Lima，F.，Berndt，J.D.，Valla，J.E.，Games，D.and Reiman，E.M.Neuroreport 12，2375-9(2001))。
[0121]卡瓦列里分析和Imaris 3D重建得到的体积是高度相关的(r2＝0.72，p＜0.00001，n＝25)。在品系或基因型之间没有发现总体重或脑重量有明显差异。对于所有的试验，小鼠和脑组织样品被给予代码，至于品系和基因型研究者并不知情。数据表示为均值+/-SD。显著性(p＜0.05)是通过学生t检验(假设方差相等)或皮尔逊相关系数检验，随后通过回归分析游程检验确定的。
实施例8
体外切片电生理学
[0122]水平海马切片(400μm)从3-7月龄的PDAPPJ20、PDAPP(D664A)B21和非转基因同窝对照小鼠(J20小鼠被选择用来与B21比较，因为它们表达相似水平的APP转基因)制得。用标准方法制备切片(参见，例如，Contractor，A.et al.J Neurosci23：422-9(2003))。简言之，用异氟烷麻醉动物并断头。移走脑，在冰冷的蔗糖人造CSF(ACSF)下切片，所述人造脑脊液含有85mM NaCl、2.5mM KCl、1.25mMNaH2PO4、25mM NaHCO3、25mM葡萄糖、75mM蔗糖、0.5mM CaCl2和4mMMgCl2，并用还含有10μM D，L-APV和100μM犬尿喹啉酸的95％O2和5％CO2进行平衡。在记录之前，在室温下温育切片至少1小时，在标准ACSF中进行，所述ACSF含有：125mM NaCl、2.4mM KCl、1.2mM NaH2PO4、25mM NaHCO3、25mM葡萄糖、1mM CaCl2和2mM MgCl2。在记录期间，用含有2mM CaCl2和1mM MgCl2的ACSF持续灌注切片。
[0123]用注满细胞外液的玻璃记录管(尖端电阻是2-3MOhm)，在海马CA1区的辐射层记录细胞外场电位(fEPSPs)。使用通有恒定电流的同心双极电极记录响应于Schaffer侧支/联合通路刺激的诱发fEPSPs。基础突触传递通过比较记录的fEPSPs的输入和输出关联而被测定(Hsia et al)；输入为纤维群峰的峰幅度，输出为fEPSP的起始斜率。对于每一动物，测定纤维群峰(FV)幅度和fEPSP反应的起始斜率，刺激范围为5-800μA，对这两种值绘制反应曲线。随后通过用fEPSP的斜率除以FV 隔度(从沿着反应曲线上的线性部分的各点)并取得平均值，计算输入输出关联。用40ms的刺激间间隔引发双脉冲易化，比值测定为fEPSP(2)的峰值/fEPSP(1)的峰值。用单因素方差分析(ANOVA)并接着用Tukey post-hoc检验来分析结果。
实施例9
神经发生
[0124]将BrdU(50mg/kg)溶解在盐水中并以8小时间隔每日两次腹膜内给予，持续3日，1周后处死小鼠。用小鼠单克隆抗BrdU(Roche，2μg/ml)和生物素化的山羊抗小鼠IgG(Vector，1∶200)对脑切片染色，用二氨基联苯胺和H2O2对染色显色。在每一小鼠的间隔200μm的5-7、50-μm冠状切片中，在不知内情的情况下计数齿状回中的BrdU阳性细胞。在带有Magnifire数字照相机的NikonE800显微镜上，在高倍率下对细胞进行计数，图像显示在计算机监视器上。结果表示为每一切片的BrdU阳性细胞的平均数。
[0125]尽管参照一些优选实施方案详细描述了本发明，应该理解，其修改和变化包含在其描述和要求的精神和范围内。

Claims (21)

1.非人转基因动物，其包含编码突变型人β淀粉样前体蛋白(APP)或APP样蛋白的核苷酸序列，其中所述突变型人APP或APP样蛋白包括使得所述突变型人APP或APP样蛋白对Asp664处的切割具有抵抗性的突变，并且其中编码所述突变体APP或APP样蛋白的所述核苷酸序列可操纵地与适当的启动子连接。
2.权利要求1所述的转基因动物，其中在Asp664处的切割是胱天蛋白酶诱导的。
3.权利要求1所述的转基因动物，其中所述突变型人APP或APP样蛋白包括在残基664处的突变。
4.权利要求3所述的转基因动物，其中所述在残基664处的突变将Asp改变为Ala、Glu或Gln。
5.权利要求1所述的转基因动物，其中所述突变型人APP或APP样蛋白包括邻近残基664的突变。
6.权利要求1所述的转基因动物，其中所述启动子是具有组成型活性的。
7.权利要求6所述的转基因动物，其中所述启动子选自肌动蛋白启动子、PDGF-β启动子、PrP(神经元特异性)启动子和神经元特异性烯醇酶启动子。
8.权利要求1所述的转基因动物，其中所述启动子是诱导型的。
9.权利要求8所述的转基因动物，其中所述启动子选自Tet-on、Tet-off、RU486诱导型启动子系统和蜕皮素诱导型启动子系统。
10.权利要求1所述的转基因动物，其中所述动物选自啮齿动物、兔和猪。
11.权利要求1所述的转基因动物，其中所述动物是啮齿动物。
12.权利要求1所述的转基因动物，其中所述动物是小鼠。
13.治疗神经变性疾病的方法，所述方法包括阻断蛋白酶切割β淀粉样前体蛋白(APP)和/或β淀粉样蛋白(Aβ)产生羧基端肽APP-C31的能力。
14.权利要求13的方法，其中所述蛋白酶切割APP和/或Aβ的能力是被抗蛋白酶抗体、基于蛋白酶编码序列的反义核苷酸、肽、肽模拟物、核酶、干扰RNAs、蛋白酶拮抗剂、或阻断蛋白酶切割APP和/或Aβ的胞质内区域的能力的小分子阻断的。
15.防止海马突触丢失的方法，所述方法包括阻断胱天蛋白酶切割β淀粉样前体蛋白(APP)的能力。
16.防止齿状回萎缩的方法，所述方法包括阻断胱天蛋白酶切割β淀粉样前体蛋白(APP)的能力。
17.鉴定用于治疗神经变性疾病的化合物的方法，所述方法包括鉴定阻断蛋白酶切割β淀粉样前体蛋白(APP)产生羧基端肽APP-C31的能力的化合物。
18.权利要求17所述的方法，其中阻断胱天蛋白酶切割β淀粉样前体蛋白(APP)产尘羧基端肽APP-C31的能力的化合物是通过在胱天蛋白酶存在的情况下使APP或APP样蛋白与测试化合物接触，和监测APP-P31的形成而被鉴定的，其中胱天蛋白酶不能诱导APP-P31产生提示了用于治疗神经变性疾病的化合物。
19.权利要求17所述的方法，其中阻断胱天蛋白酶切割β淀粉样前体蛋白(APP)产生羧基端肽APP-C31的能力的化合物是通过在胱天蛋白酶存在的情况下使APP或APP样蛋白与测试化合物接触，和筛选切割证据而被鉴定的，所述证据选自切割产物的易位、细胞死亡的诱导、萎缩的诱导和突触丢失的诱导。
20.用于治疗神经变性疾病的方法，所述方法包括向需要的对象施用有效量的通过权利要求17所述的方法鉴定出的化合物。
21.用于治疗神经变性疾病的基因治疗方法，所述方法包括将突变导入β淀粉样前体蛋白(APP)，以至于防止胱天蛋白酶介导的对APP的切割。
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Open date: 20070516