MXPA06012302A - Modelos transgenicos de la enfermedad de alzheimer y usos de los mismos en el tratamiento de una variedad de enfermedades neurodegenerativas. - Google Patents

Modelos transgenicos de la enfermedad de alzheimer y usos de los mismos en el tratamiento de una variedad de enfermedades neurodegenerativas.

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MXPA06012302A
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Abstract

De conformidad con la presente invencion, se ha demostrado que las mutaciones tales como una mutacion Asp -> Ala (D664A) en APP (que previene la penetracion en el sitio de penetracion de la caspasa) previenen tanto la perdida sinaptica hipocampal y la atrofia giral dentada, incluso aunque dichas mutaciones no interfieran con la produccion de A?? o la formacion de las placas amiloides en un modelo transgenico de la enfermedad de Alzheimer. Por consiguiente, en vista de este hallazgo, se han desarrollado metodos para la identificacion de agentes que bloquean la penetracion de Asp664 de APP, incluyendo los animales transgenicos que son utiles para dicho proposito, asi como los metodos para el uso del mismo para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas.

Description

MODELOS TRANSGÉNICOS DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER Y USOS DE LOS MISMOS EN EL TRATAMIENTO DE UNA VARIEDAD DE ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a modelos transgénicos no humanos de la enfermedad de Alzheimer y usos de los mismos, incluyendo métodos para identificar los compuestos útiles para el tratamiento de Alzheimer, los métodos de tratamiento usando dichos compuestos y los similares.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La enfermedad de Alzheimer (AD), el desorden de demencia más común, se caracteriza por las placas seniles, marañas neurofibrilares y la pérdida de sinapsis y neuronas en el cerebro. El componente proteínico predominante de las placas seniles es el péptido ß amiloide (Aß), que se produce por la penetración proteolítica de su precursor, la proteína precursora ß-amiloide (APP). La hipótesis amiloide establece que el Aß inicia la cascada de los eventos que resultan en AD. El mecanismo preciso de la toxicidad amiloide no es claro, pero la evidencia ha acumulado que la sinapsis es un sitio tempranamente vulnerable para el daño Aß (ver por ejemplo Selkoe, D.J. en Science 298:789-91 (2002)). Consistente con esta idea, algunos ratones transgénicos APP con altos niveles de Aß en el cerebro mostraron pérdida de sinapsis, cambios de comportamiento y reducciones en la transmisión sináptica antes de la formación de las placas seniles (ver Hsia, A. Y. et al., en Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 96:3228-33 (1999) y Mucke et al., en J. Neurosci. 20:4050-8 (2000)). Recientemente, se ha demostrado que el APP también se penetra en Asp664 (numeración APP695) por las caspazas, las proteasas de cisteína que median la apoptosis (ver Gervais, F.G. et al. en Cell 97:395-406 (1999) y Lu, D.C. et al. en Nat. Med. 6:397-404 (2000)). Dicho procesamiento libera un péptido carboxiterminal citotóxico, APP-C31 ; sin embargo, el rol (si cualquiera) del procesamiento de la caspasa del APP que puede jugar en el AD es desconocido. Esta generación de un péptido citotóxico siguiendo la penetración intracitoplásmica por las caspazas es similar a la que se ha mostrado para ocurrir para la dependencia de los receptores tales como DCC (omitidos en el cáncer colorectal), RET (reacomodo durante la transfección) y UNC5H1-3 (gen no coordinado 5 homólogos 1-3), sugiriendo que la APP puede funcionar como un receptor de dependencia (Bredesen et al., Physiological Reviews, en prensa 2004).
Por consiguiente, el desarrollo de los modelos transgénicos que permiten la investigación en el rol de las proteasas, tales como las caspasas, que juegan un rol en el desarrollo de dichas enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer, serían de gran interés.
Además, la disponibilidad de dichos modelos transgénicos facilitarían el desarrollo de nuevos tratamiento de enfermedades neurodegenerativas.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN De conformidad con la presente invención, se demuestra que las mutaciones seleccionadas, tales como una mutación Asp - >Ala (D664A) en APP (que previene la penetración en el sitio de penetración de caspasa), previenen la pérdida sináptica hipocampal y la atrofia giral dentada, incluso a través de dichas mutaciones que no interfieren con la producción de Aß o la formación de placas de amiloide en un modelo transgénico de la enfermedad de Alzheimer.
Por consiguiente, en vista de este hallazgo, los métodos que se han desarrollado para la identificación de los agentes que bloquean la penetración de Asp664 de APP, incluyendo los animales transgénicos que son útiles para dicho propósito, así como los métodos para el uso de los mismos para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. La temprana intervención en el desarrollo de las enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer facilitarán la recuperación de la función de sináptica y reducen la pérdida de redes neuronales, una marca de estados avanzados de enfermedad neurodegenerativa.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las Figuras 1 A-E colectivamente están dirigidas a la caracterización de ratones transgénicos PDAPP y PDAPP (D664A), en donde: A = número de placas Aß B = IgG de conejo.
La Figura 1A ilustra la derivación de las construcciones empleadas en la preparación de ratones transgénicos PDAPP y PDAPP (D664A).
La Figura 1 B ilustra la detección del Aß soluble en varios animales de prueba.
La Figura 1C resume el número de placas Aß en varios animales de prueba.
La Figura 1D ¡lustra una sección cerebral marcada de un ratón PDAPP (D664A) de 16 meses de nacido, revelando la presencia de las placas Aß.
La Figura 1 E ilustra la penetración del APP en Asp664 en vivo. Un anticuerpo específico para el neo-epítope generado por la penetración de APP en Asp664 se usó para demostrar un incremento en la penetración en PDAPP en comparación a ambos controles y los ratones PDAPP (D664A).
Las Figuras 2 A-C colectivamente ilustran el efecto de la mutación D664A en la pérdida sináptica y la atrofia giral dentada, en donde: C = número de objeto medio/100 µm3 D = volumen (mm3).
La Figura 2A resume la cuantificación de las densidades pre-sinápticas en varios animales de prueba.
La Figura 2B resume los volúmenes hipocampal total y de subcampo, como se determinó por la reconstrucción tridimensional usando lmarls3D (Bitplane AG, Suiza) (ver la Figura 2C) y confirmada por el análisis Cavalieri.
La Figura 2C presenta vistas ortogonales, sagitales y coronarias de representaciones de superficie en 3D de la capa molecular giral dentada de ratones transgénicos B21 (amarillo) y PDAPP representativo (rojo).
Las Figuras 3 A-C colectivamente ilustran el efecto de la mutación D664A en la transmisión sináptica basal, en donde: E = amplificación FV de deslizamiento fEPSP.
La Figura 3A presenta varios EPSPs de campo extracelularmente registrado, que se usan para lograr la resistencia de la transmisión sináptica basal entre el hipocampo CA3 y las células CA1 de ratones PDAPP(D664A)B1 y PDAP J20 no Tg y Tg heter?zigo de 3-7 meses. Los EPSPs de campo representativos en el incremento de la resistencia al estímulo se muestran para los ratones no transgénicos y transgénicos como se indica. Notar que la entrada grande (ver que la inserción con escala de tiempo expandido: la flecha indica el torrente de la fibra, una medición indirecta del número de axones activados) necesaria para provocar un EPSP relativamente pequeño en los ratones PDAPPJ20 Tg.
La Figura 3B presenta las inclinaciones EPSP iniciales divididas por la amplitud del torrente de fibra para Tg y los animales no Tg como se Indica (los datos normalizados para las nodrizas no Tg). Cada punto de datos representa los resultados promedio de 17-22 rodajas obtenidas de 6-7 ratones. Los análisis estadísticos (ANOVA) revelaron un efecto grupal significante (p<0.0005). Las pruebas Turkey Post-hoc confirmó que los ratones PDAPPJ20 tienen transmisión sináptica basal significativamente menor que los otros grupos (p<0.01), mientras ningún grupo fue significativamente diferente de otro.
La Figura 3C representa la facilidad del pulso en pares, expresado como una proporción de amplitudes promedio de fEPSPs provocadas por un par de estímulos. Los datos se muestran en la figura como promedio +/-SEM.
Las Figuras 4 colectivamente ilustra el efecto de la mutación D664A en el mejoramiento PDAPP inducido de la neurogénesis hipocampal, en donde: F = células positivas BrdU.
La Figura 4A ilustra la marcación BrdU de las células de proliferación en la zona subgranlar del giro dentado hipocampal. Se les dio a ratones PDAPP (D664A) y PDAPP (no Tg) de control de doce meses BrdU intraperitoneal por 3 días y se sacrificaron 1 semana después. Las células marcadas por BrdU (puntos negros) se detectaron mediante inmunohistoquímica. Las imágenes mostradas son representativas de 4-6 animales por grupo.
La Figura 4B ilustra la cuantificación de la marcación BrdU. Los datos mostrados son conteos de células medias ± SD (n = 4-6); las pruebas de Student se usaron para probar la significancia de las diferencias.
La Figura 5 proporciona una correlación entre los volúmenes derivados por el análisis Cavalieri y por las reconstrucciones tridimensionales, en donde: G = cavalieri H = Imaris 3D.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN De conformidad con la presente invención, se proporcionan animales transgénicos no humanos que comprende la codificación de la secuencia de nucleótidos que codifican una proteína del precursor ß-amiloide humana mutante (APP) o la proteína como APP, en donde la APP humana mutante o la proteína como APP comprende una mutación que produce el APP humano mutante o la proteína como APP resistente a la penetración en Asp664 y en donde la codificación de la secuencia de nucleótidos de la proteína como APP o APP humana mutante se asocia operablemente con un promotor apropiado.
En un aspecto de la invención, la penetración en Asp664 es inducida por proteasa. En un aspecto actualmente preferido de la invención, la penetración en Asp 664 es caspasa inducida.
En un aspecto de la invención, las proteínas como APP o APP humanas mutantes comprenden una mutación en el residuo 664. Aquellos expertos en la técnica reconocerán que cualquier residuo virtualmente en posición 664, más que el Asp nativo, reducirá la habilidad de proteasas tales como caspasa desde la penetración APP o la proteína como APP en la posición 664. Las mutaciones actualmente preferidas en la posición 664 incluyen la conversión del Asp nativo para Ala, Glu, Gln o los similares.
En otro aspecto de la invención, el APP humano mutante o las proteínas como APP comprenden una o más mutaciones adyacentes para el residuo 664, por medio el cual se reduce la habilidad de las proteasas tal como la caspazas a partir de la penetración de la proteína como APP o APP en la posición 664.
Como se reconoce rápidamente por aquellos expertos en la técnica, los promotores empleados en la generación de animales de conformidad con la presente invención pueden ser constitutivamente activos o ¡nducibles. Los promotores apropiados son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica e incluyen los promotores capaces de reconocer las polimerasas T4, T3, Sp6 y T7, los promotores PR y PL de lambda bacteriófago, el trp, recA, golpe de calor y los promotores lacZ de E. coli, la a-amilasa y los promotores ^-específicos de B. subtilis, los promotores de los bacteriófagos de los promotores Bacillus, Streptomyces, el promotor int del bacteriófago lambda, el promotor bla del gen ß-lactamasa de pBR322 y el promotor CAT del transferasa acetil cloranfenicol . Los promotores procarióticos se revisaron por Glick, J. Ind. Microbiol. 1 :277 (1987); Watson et al., MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE, 4a. Ed., Benjamín Cummins (1987); Ausubel ef al., supra. Y Sambrook et al., supra.
Las regiones del promotor varían en longitud y secuencia ya demás pueden comprender uno o más sitios de enlace de ADN para las proteínas de enlace del ADN de secuencia específico y/o un mejorador o silenciador. Los promotores ejemplarizadores incluyen el promotor CMV o un promotor P5 como un promotor para regular un gen o codificar la secuencia de interés. Dichos promotores, así como las mutaciones de los mismos, se conocen y se han descrito en la técnica (ver, por ejemplo, Hennughausen et al., EMBO J., 5, 1367-1371 (1986); Lehner et al., J. Clin. Microbiol., 29, 2494-2501 (1991); Lang et al., Nucleic Acids Res., 20, 3287-95 (1992); Srivastava et ai., J. Virol., 45, 555-564 (1983); Green et al., J. Virol., 36, 79-92 (1980); Kyostio et al., supra). Otros promotores, sin embargo también pueden emplearse tal como el promotor último principal Ad5 o Ad2 y el líder tripartita, la repetición terminal grande del virus sarcoma Rous (RSV) y otros promotores constitutivos tales como los que se han descrito en la literatura. Por ejemplo, el promotor cinasa timidina del herpes (Wagner et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 78, 144-145 (1981)), las secuencias reguladoras de los elementos promotores del gen metalotionina (Brinster et al., Nature 296, 39-42 (1982)) de la levadura u otros hongos tales como el promotor Gal 4, el promotor de alcohol dehidrogenasa, el promotor fosfoglicerol cinasa y el promotor fosfatasa alcalina pueden emplearse. Similarmente, pueden usarse los promotores aislados del genoma de las células de mamíferos o de virus que crecen en estas células (es decir, Ad, SV40, CMV y los similares). Los promotores adicionales contemplados para usarse en este documento incluyen el promotor actina, el promotor PDGF-ß, el promotor PrP (neuro-específico), promotor enolasa neuro-específico y los similares.
En lugar de usar un promotor constitutivo, el promotor también de preferencia puede ser ascendente y/o descendentemente regulado en respuesta a las señales apropiadas. Por ejemplo, un promotor inducible, tal como el promotor IL-8, que es responsable para TNF u otra citoquina puede emplearse. Otros ejemplos de promotores inducibles incluyen, pero no se limitan al sistema promotor inducible metalotionina, el sistema de expresión lac bacterial y el sistema T7 polimerasa. Además, pueden emplearse los promotores que pueden activarse selectivamente en diferentes estados de desarrollo (es decir, genes de globina se transcriben en embriones y adultos). En particular, un promotor que puede regularse por factores exógenos tales como tetraciclina, hormonas naturales tales como la hormona derivada de insectos, ecdisona (o variantes sintéticas de la misma) u hormona sintética tal como TU486 puede emplearse. Estos promotores (y los factores reguladores que la acompañan que similarmente pueden proporcionarse a la célula) se han descrito en la técnica (ver, por ejemplo Delort et al., Human Gene Therapy, 809-820; Clontech, CLONTECHniques, "Tet-Off™ y Tet-ON.™ Gene Expressions Systems and Cell Lines". Volumen XI, No. 3, 2-5 (Julio 1996)).
Otra opción es usar un promotor específico del tejido (es decir, un promotor que es preferiblemente activo en un tejido dado y los resultados en la expresión de un producto gen en los tejidos en donde se activan), tal como el promotor hepatocito-específico para la albúmina o a1-antitripsina (Frain et al., Mol. Cell. Biol.. 10:991-999 (1990); Ciliberto et al., Cell 41 : 531-540 (1985); Pinker et al., Genes and Devel., 1 , 268-276 (1987); Kelsey et al., Genes and Devel., 1 , 161-171 (1987)), la región de control de la elastasa I que está activa en las células acinares pancreáticas (es decir, Swift et al., Cell, 38, 639-646 (1984); MacDonald, Hepatology, 7, 425-515 (1987)), la región de control del gen de insulina que está activo en las células beta pancreáticas (Hanahan, Nature, 315, 115-122 (1985)), la región de control del virus del tumor mamario en ratones que es activo en las células de torre y linfoides, del pecho, testiculares (Leder et al., Cell 45, 485-495 (1986), la región de control del gen de proteína básica mielina que está activa en las células oligodendrocitas en el cerebro (Readhead et al., Cell, 48, 703-712 (1987)) y la región de control del gen de la hormona de liberación gonadotrópica que está activa en el hipotálamo (Masón et al., Science, 234, 1372-1378 (1986)). Similarmente, un promotor específico del tumor, tal como el antígeno carcinoembriónico para el carcinoma del colon (Schrewe et al., Mol. Cell Biol.. 10: 2738-2748 (1990)) pueden usarse en el vector. De conformidad con la invención, cualquier promotor puede alterarse mediante mutagénesis, de manera que tenga la capacidad de enlace deseada y la resistencia del promotor.
Como se reconoce rápidamente por aquellos expertos en la técnica, una amplia variedad de animales no humanos pueden emplearse para la preparación de los animales transgénicos de la invención, incluyendo roedores, conejos, cerdos y los similares. Los animales transgénicos actualmente preferidos de conformidad con la invención son los roedores (es decir, ratones, ratas y los similares), con los ratones siendo especialmente preferidos.
La mutación D664A, que no afecta la producción Aß en las células cultivadas (ver Soriano, S. Lu, D.C., Chandra, S., Pietrzik, CU. y Koo, E.H. en J Biol. Chem 276:29045-50 (2001)), se introdujo en un minigen (hAPP) APP humano que lleva las mutaciones AD familiares (V717F) de Indiana y (K670N, M671L) Sueca descendentes del promotor de la cadena ß PDGF. Estos animales se cruzaron en el fondo C57BL/6 para cinco a diez generaciones y se compararon a los ratones transgénicos PDAPP con un fondo genético similar (líneas J9 y J20 (ver Hsia et al., Mucke, supra). Numerosas líneas transgénicas pueden prepararse empleando este procedimiento básico, incluyendo PDAPP(D664A) B21 , PDAPP(D664A) B36, PDAPP(D664A) B157, PDAPP(D664A) B159, PDAPP(D664A) B184, PDAPP(D664A) B190, PDAPP(D664A) B204, PDAPP(D664A) DB210, PDAPP(D664A) DB226, PDAPP(D664A) DB228, PDAPP(D664A) DB230, PDAPP(D664A) DB239, PDAPP(D664A) DB240, PDAPP(D664A) DB241 , PDAPP(D664A) DB242, PDAPP(D664A) DB243, PDAPP(D664A) DB244, PDAPP(D644A) DB245, PDAPP(D644A) DB250, PDAPP(D664A) DB254, PDAPP(D664A) DB264 y los similares.
De las seis líneas transgénicas iniciales generadas, una línea (PDAPP (D664A) B21) demostraron la expresión APP, la concentración Aß y el número de placa Aß fibrilar que fueron todas similares a aquellas de la línea PDAPP J20 (ver las Figuras 1A-1 D). Una segunda línea transgénica PDAPP(D664A), PDAPP(D664A) B157, mostraron niveles de expresión APP moderadamente inferiores a aquellas de la línea PDAPP J9 (ver la Figura 1A). Estas líneas trasnsgénicas se seleccionaron para estudio posterior.
Para evaluar si la mutación de Asp664 efectivamente bloquean la penetración C-terminal del hAPP en vivo, las secciones cerebrales de ratones PDAPP(D664A) y PDAPP de tres meses de nacidos se inmunomarcaron con un anticuerpo que reconoce específicamente el neo-epítope C-terminal generado después de la penetración de APP en Asp664 (APPNeo; ver Galvan, V et al. en J Neurochem 82:283-94 (2002)). Mientras se detectó inmunoreactividad APPNeo fuerte en los cuerpos celulares y las proyecciones de neuronas hipocampales en animales PDAPP, los niveles de inmunoreactividad presentes en las secciones de los animales PDAPP (D664A) fueron indistinguibles de las observadas en las nodrizas no transgénicas de la línea transgénica (ver la Figura 1 E).
El grado de declinación cognitiva en los pacientes AD se correlacionan fuertemente con los cambios en los niveles de la sinaptofisina de la proteína de vesícula presináptica en la corteza prefrontal y el hipocampo (ver por ejemplo, Terry, R.D. et al. en Ann Neurol 30:572-80 (1991)). Los bajos niveles de sinaptofisina, presumiblemente asociados con la lesión sináptíca, se asociaron con los estados más tempranos de AD (ver, por ejemplo, Masliah, E. et al. en Neurology 56:127-9 (2001)). Los ratones PDAPP mostraron números disminuidos del pozo de las densidades presínápticas sinaptofisin-inmunoreactivas hipocampales antes de la formación de placas (ver, por ejemplo, Hsia, A. Y et al. en Proc Nati Acad Sci EUA 96:3228-33 (1999)). Para determinar si la mutación D664A tiene un rol en la pérdida de los elementos presinápticos en el hipocampo de los ratones transgénicos hAPP, las densidades presinápticas hipocampales, las densidades sinápticas y los volúmenes gírales dentados se determinaron en PDAPP , PDAPP(D664A) y los ratones de control en 8-10 mo por una modificación del método "disector estereológico" (ver el Ejemplo 6 y Hsia, A. Y. et al. en Proc Nati Acad Sci EUA 96:3228-33 (1999)), dado que los parámetros representan las correlaciones de las declinaciones cognitivas en la enfermedad de Alzheimer. Sorpresivamente, ya que los ratones PDAPP desplegaron una reducción marcada en las densidades sinápticas hipocampales en comparación con sus nodrizas no transgénicas, los ratones B21 no lo hicieron(ver las Figuras 2A y 2B). Una segunda línea transgénica PDAPP (D664A), B157, produjo resultados idénticos.
Similarmente, como se describió recientemente (ver Redwine, J. M., Kosofsky, B. Jacobs, R.E. Games, D., Reilly, J.F. Morrison, J, H. Young, W. G. y Bloom, F.E. en Proc Nati Acad Sci EUA 100:1381-6 (2003)), los ratones PDAPP mostraron volúmenes gírales dentados reducidos especialmente en la capa molecular, sin embargo no se observó pérdida significante en los ratones B21 (ver la Figura 2C).
Una disminución pronunciada en el volumen cortical es una de las características neuropatológicas esenciales de AD. Aunque no todos los modelos de ratones transgénicos de AD recapitulan esta característica particular de la enfermedad, se ha demostrado que los ratones PDAPP despliegan volúmenes gírales dentados reducidos en las edades relativamente tempranas (3-4 meses), especialmente en la capa molecular (ver, por ejemplo Dodart, J.C. et al. en Neurobiol Dis 7:71-85 (2000) y Redwine, J. M. et al. en Proc Nati Acad Sci EUA 100:1381-6 (2003)). Fue por lo tanto, de interés para determinar los volúmenes gírales dentados en PDAPP, PDAPP(D664A) y los animales de control a los 3 meses de edad por la reconstrucción tridimensional digital de las secciones NissI-marcadas y por el análisis Cavalieri manual. Se observó contracción giral dentada significante en los cerebros de los ratones PDAPP, pero no en los ratones PDAPP(D664A), ambos cuando se midieron por análisis Cavalieri manual (ver la Figura B) así como mediante la reconstrucción digital 3D (ver las Figuras 2C y 2D). Los volúmenes derivados por el análisis Cavalieri y por las reconstrucciones tridimensionales digitales fueron altamente correlacionadas (r2 = 0.72, p < 0.00001 , n = 25) (ver la Figura 5).
En consideración de la integridad sináptica en los ratones APP, el examen funcional de la transmisión sináptica es de interés porque las determinaciones histológicas de los números sinápticos pueden sobreestimar el número de sinapsas funcionales presentes en el cerebro. Se ha demostrado que la pérdida de las estructuras presinápticas en los ratones PDAPP se acompaña por un daño en la transmisión sináptica basal (ver Hsia, A. Y. et al. en Proc Nati Acad Sci EUA 96:3228-33 (1999)). Para determinar si la restauración de las densidades presinápticas observadas en el hipocampo de los ratones PDAPP(D664A) corresponden a un rescate en la función sináptica, las lecturas electrofisiológicas se realizaron en las rebanadas hipocampales de 3-7mo, PDAPP, PDAPP(D664A) y los cerebros de los ratones de control. Las potencias post-sinápticas excitatorias extracelularmente registradas (fEPSPs) se usaron para valorar la resistencia de la transmisión sináptica basal entre el hipocampo CA3 y las células CA1. Como se ha reportado similarmente con otras líneas APP transgénicas, una disminución de -40% en la transmisión sináptica basal (proporción entrada-salida) se observó con los ratones PDAPP, indicando un daño significativo en la transmisión sináptica. En contraste, ninguna diferencia significante se observo en la transmisión sináptica entre PDAPP(D664A) y los ratones de control nodrizas no transgénicos (ver las Figuras 3A y 3B). Consistente con las pérdidas observadas en los números de densidad presináptica, las pérdidas electrofisiológicas aparentes en los ratones PDAPP no estuvieron presentes en los animales que llevan la mutación D664A. Adicionalmente, la facilidad de pulso emparejado, que se correlaciona inversamente con la probabilidad de la liberación del transmisor, no hubo cambios entre todos los grupos examinados (ver la Figura 3C) que sugiere que los ratones PDAPP(D664A), como las líneas transgénícas PDAPP no tienen defectos adicionales en la función presináptica. Además, es probable que los elementos presinápticos preservados en los ratones PDAPP (D664A) representan sinapsas funcionales.
La neurogénesis se incrementó en el hipocampo de los pacientes con AD (ver Jin, K. et al. (en Proc Nati Acad Sci EUA 101 :343-7 (2004)) y en los cerebros de los ratones PDAPP. Además, la neurogénesis por daño inducida puede contribuir al cerebro en la reparación de las enfermedades neurológicas crónicas y agudas. Para provocar el efecto de la mutación D664A en la neurogénesis hipocampal PDAPP inducida, se usó bromodeoxiuridina (BrdU) para marcar las células de proliferación en la zona subgranular del giro dentado (un sitio principal de adultos normales y con neurogénesis AD inducida) en 12 mo de control, ratones PDAPP y PDAPP(D664A). El número de células BrdU-marcadas (la mayoría de las cuales expresaron la proteína marcadora neuronal inmadura, doblecortina) se incremento a aproximadamente dos veces los niveles de control en los ratones PDAPP, pero este efecto se abolió por la mutación D664A (ver la Figura 4).
En resumen, los ratones B21 producen depósitos Aß y amiloides indistintamente de los ratones PDAPP, no despliegan la pérdida de características de la densidad sináptica hipocampal o de volumen giral dentado observadas en los animales PDAPP. Estos hallazgos sugieren que la penetración de hAPP en Asp664 por las caspasas (o posiblemente por las proteasas o la proteasa no caspasa) contribuye a la pérdida sináptica y la reducción de volumen giran dentado en los ratones transgénicos hAPP. Estas observaciones sostienen que la pérdida sináptica hipocampal y I atrofia dentada en este modelo de ratón de AD se median por la penetración APP en Asp664, independíente de la deposición Aß o el flujo descendente de la producción Aß (ver Lu et al., "Amyloid ß-protein toxicity is mediated by the formation of amyloid-ß protein precursor complexes" en Annals of Neurology, en press). Por lo tanto, los resultados indican que el dominio intracitoplásmico de APP juega un rol clave en estas manifestaciones del fenotipo de Alzheimer.
Además, los resultados presentados en este documento demuestran que los ratones APP transgénicos que llevan una mutación en el sitio de penetración caspasa Asp->Ala (D664A) que previene la penetración de hAPP en Asp664 in vivo continua para producir Aß y muestran la deposición de placas, no demuestran la pérdida sináptica hipocampal o el encogimiento cerebral que caracteriza al fenotipo de los ratones PDAPP (los ratones PDAPP mostraron una disminución profunda en la transmisión sináptica). El trabajo con los ratones transgénicos de la invención indican que el deterioro de transmisión sináptica de los ratones PDAPP se restablece completamente en los ratones PDAPP(D664A).
Estos resultados demuestran que la penetración C-terminal de APP contribuye al deterioro sináptico y la pérdida volumétrica observada en un modelo de ratón de AD y están consistentes con la penetración C-terminal de APP siendo involucradas en la patogénesis de AD. Lo más importante, los resultados presentes en este documento constituyen la evidencia experimental genética indicando el encogimiento hipocampal y la pérdida sináptica que puede ser independiente de la producción y deposición de Aß~.
La penetración de la porción C-terminal de APP es probable que afecte varias funciones celulares diferentes en las cuales el APP está involucrado. Los animales transgénicos de ia invención proporcionan una oportunidad única para examinar los procesos anteriores que afectan la pérdida sináptica y sobrepasan las etapas tempranas en la patogénesis de las enfermedades neurodegenerativas tales como AD. La recuperación de la función sináptica en las etapas tempranas de AD es un compromiso más directo lejano que el reemplazo de las redes neuronales perdidas en los estados tardíos en el progreso de la enfermedad. Las observaciones establecidas en este documento con los ratones PDAPP(D664A) están consistentes con la existencia de mecanismos no directamente asociados con la producción o deposición de Aß que son cruciales para la patología AD asociada en los ratones y que constituye blancos potenciales novedosos para el descubrimiento de la droga. La elucidación continuada de los mecanismos que operan en los estados tempranos del AD, como se proporciona en este documento, facilita el desarrollo de terapias que retardan y detienen potencialmente o incluso invierten el deterioro sináptico que ocurre en el AD temprano.
La identificación de marcadores asociados con una condición de patología dada en los humanos es significativamente complicada por la contribución de los factores genotípicos, fenotípico y relacionados con la historia de vida. Por otro lado mientras los modelos animales transgénicos proporcionan sistemas experimentales adecuados en los cuales estas variables pueden controlarse, tienen una desventaja potencialmente significante, es decir, la emergencia potencial de las respuestas fisiológicas o la activación de los mecanismos compensatorios como un resultado de la expresión del transgen durante el desarrollo. Además, la comparación de los animales transgénicos a sus nodrizas no transgénicas que pueden producir información acerca de los cambios que resultan de la expresión del transgen per se y no de la patogénesis de la enfermedad modelada.
Las características fundamentales del fenotipo AD asociado en los ratones PDAPP han sido efectivamente invertidas en los animales transgénicos de la invención mediante prevenir la penetración del término C del transgen hAPP. Dado que los ratones PDAPP y PDAPP(D664A) comparten muchas similitudes genéticas, es decir 1) generadas de vectores idénticos pero para una transversión A->C, 2) muestran el mismo antecedente genético y 3) expresan el transgen APP humano a los niveles comparables, uno esperaría que los cambios que elevados de la expresión transgen per se debería ser parecido en los animales PDAPP y PDAPP(D664A). Además, la comparación de cambios (marcadores) presentes en los ratones PDAPP, pero no presentes en los ratones PDAPP(D664A), relativos a las nodrizas no transgénicas, permite identificar ambiguamente a los marcadores asociados con el desarrollo de AD y su distinción que de ellos surja la expresión per se, en la ausencia del genotipo de confusión, variables fenotípicas o ambientales (como animales que son ampliamente congenióos y que pueden alimentarse rápidamente y alojarse en un ambiente controlado).
Los animales transgénicos hemizigous de la línea PDAPP y PDAPP(D664A) pueden generarse para usarse como animales experimentales. Específicamente, doce animales PDAPP transgénicos hemizigous y PDAPP(D664A) de 2 meses de nacidos congenióos en el antecedente C57BU6J, más 12 nodrizas no transgénicas, pueden generarse para producir el suero agrupado, los extractos cerebrales o los extractos de otros órganos de interés.
Los animales anteriormente descritos entonces pueden usarse para generar muestras, por medios apropiados para usarse en los estudios genómicos o proteómicos. La identificación de las proteínas o los mARNs presentes en las muestras de los animales no transgénicos y transgénicos y el análisis de los datos para determinar cuales proteínas están únicamente presentes, ausentes, incrementadas o disminuidas en abundancia en una de las poblaciones anteriormente descritas puede llevarse a cabo usando técnicas estándares, tales como por ejemplo, espectrometría de masa, técnicas de hibridación de micro serie de ADN y las similares.
De conformidad con un aspecto adicional de la presente invención, se proporcionan métodos para identificar los compuestos útiles para el tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas, dichos métodos comprendiendo los compuestos de identificación que bloquean la habilidad de la (s) caspasa (s) para penetrar la proteína del precursor ß-amiloide (APP) para producir el péptido carboxiterminal.
Como se reconocerá rápidamente por aquellos expertos en la técnica, los compuestos que bloquean la habilidad de la (s) caspasa (s) para penetrar la proteína del precursor ß-amiloide (APP) para producir el péptido carboxiterminal, APP-C31, puede identificarse en una variedad de formas, es decir, mediante contactar la proteína como APP o APP con el compuesto de prueba en la presencia de caspasa y monitorear la formación de APP-P31, en donde la falla de la caspasa induce la producción del APP-P31 que es indicador de un compuesto que es útil para el tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas.
Alternativamente, los compuestos que bloquean la habilidad de la caspasa para penetrar la proteína del precursor ß-amiloide (APP) para producir el péptido carboxiterminal, APP-C31 , puede identificarse por contactar las proteínas APP o como APP (es decir, APLP1 ó APLP2) con el compuesto de prueba en la presencia de caspasa y analizar la evidencia de penetración seleccionada del grupo que consiste de translocación del producto de penetración, la inducción de la muerte celular, la inducción de atrofia y la inducción de pérdida de sinapsa. El APLP1 y APLP2 son miembros de la familia APP de proteínas, colectivamente "proteínas como APP". Sin embargo, los sitios requeridos para la penetración ? y ß-secretasa de APP no se conservan en APLP1 o APLP2. Estas moléculas por lo tanto no tienen la capacidad para generar los péptidos como ß-amiloides. Sin embargo, el sitio de penetración de caspasa C-terminal que permite la generación de APP-C31 se conserva en APLP1 y APLP2. Para APLP1, las posiciones P4-P1' serían VEVDP y para APLP2, las posiciones P4-P1' serían VEVDP mientras en APP, las posiciones P4-P1' son VEVDA. Estas secuencias, como aquellas en APP, se ajustan bien con los sitios de penetración de caspasa anteriormente descritos para las caspasas apical/iniciadoras tal como la caspasa-8 y la caspasa-9. El péptido APLP1-C31 predicho es 52% idéntico y 77% similar al péptido APP-C31 y el péptido APLP2-C31 es 71 % idéntico y 83% similar al péptido APP-C31.
Como otra alternativa, las células que expresan APP, APLP1 , APLP2 o los similares, pueden analizarse en la presencia o ausencia de insulto (es decir, Aß, isquemia, shock por calor, hipoxia, deprivación de glucosa, estaurosporina y los similares), para los compuestos que bloquean la producción de APP-C31 (lo último del cual puede examinarse mediante usar un anticuerpo que detecta específicamente el producto de penetración carboxiterminal de APP, o mediante los métodos tales como la prueba de reporte, la prueba ELISA y las similares).
Los compuestos identificados en los métodos de análisis anteriormente descritos entonces pueden probarse in vivo, es decir mediante testificar la eficacia de los mismos en un modelo animal de la enfermedad de Alzheimer (es decir, el mismo transgénico sin la mutación Asp664->Ala) y comparando la respuesta a esa de una invención Asp664.>Ala de un animal transgénico mutante.
Los compuestos candidatos pueden obtenerse de una amplia variedad de fuentes incluyendo las bibliotecas de compuestos naturales o sintéticos. Por ejemplo, los numerosos medios están disponibles para síntesis dirigidas y aleatorias de una amplia variedad de compuestos orgánicos y biomoléculas, incluyendo la expresión de oligonucleótidos y oligopéptidos aleatorizados. Alternativamente, las bibliotecas de compuestos naturales en la forma de extractos fúngicos, bacteriales, de plantas y de animales están disponibles o se producen rápidamente. Adicionalmente, las bibliotecas producidas natural o sintéticamente y los compuestos que se modifican rápidamente a través de medios químicos, físicos y bioquímicos y pueden usarse para producir bibliotecas combinatorias. Los agentes farmacológicos conocidos pueden someterse a modificaciones químicas aleatorias o dirigidas, tales como acilación, alquilación, esterificación, amidificación, etc., para producir análogos estructurales. Los agentes candidatos también se encuentran entre las biomoléculas que incluyen péptidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estructurales o combinaciones de los mismos y los similares.
De conformidad con un aspecto adicional de la presente invención, se proporcionan métodos para tratar las enfermedades neurodegenerativas, dichos métodos comprendiendo la administración de una cantidad efectiva de uno o más compuestos identificados por los métodos anteriormente descritos a un sujeto en necesidad del mismo.
Como se usa en este documento, "tratar" se refiere a inhibir o detener el desarrollo de una enfermedad, desorden o condición y/o causar la reducción, remisión o regresión de una enfermedad, desorden o condición. Aquellos expertos en técnica entenderán que varias metodologías y pruebas pueden usarse para valorar el desarrollo de la enfermedad, desorden o condición y similarmente, varias metodologías y pruebas pueden usarse para valorar la reducción, remisión o regresión de una enfermedad, desorden o condición.
Esencialmente, cualquier enfermedad que es etiológicamente unida a la formación y/o deposición de amiloide se contempla para el tratamiento de conformidad con la presente invención. Como se usa en este documento, "enfermedad neurodegenerativa" se refiere a un desorden tal como la enfermedad de Alzheimer, amiloidosis senil sistémica, enfermedad anterior, purito lumbar, encefalopatía espongiforme bovina, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, Síndrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker, diabetes tipo II, diabetes de inicio en adultos, insulinoma, amiloidosis amiloide A, amiloidosis Al, polineuropatía amiloide familiar (tipos Portugués, Japonés y Suizo), amiloidosis trans-retina familiar, Fiebre Mediterránea familiar, nefropatía amiloide familiar con urticaria y sordera (síndrome Muckle-Wells), amiloidosis sístémica no neuropática hederitaria (polineuropatía amíloide familiar lll), amiloidosis familiar de tipo Terminal, cardiomiopatía amiloide familiar (tipo Danesa), amiloide cardiaca aislada, amiloidosis atrial aislada, amiloidosis (primaria) idiopática, mieloma o amiloidosis macroglobulinemia asociada, amiloidosis nodular cutánea localizada primaria asociada con síndrome de Sjogren, amiloidosis (secundaria) reactiva, hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis de tipo de Islandia, amiloidosis asociada con hemodiálisis a largo plazo, amiloidosis renal hereditaria fibrinogen asociada, amiloidosis asociada con carcinoma medular de la tiroides, amiloidosis sistémica hereditaria asociada con la lisozima y las similares.
Los depósitos amiloides se encuentran en sujetos diagnosticados con la enfermedad del Alzheimer, una enfermedad neurodegenerativa caracterizada por la atrofia de las células nerviosas en la corteza cerebral, áreas subcorticales e hipocampo y la presencia de placas, neuritas distróficas y marañas neurofibrilares. En la enfermedad de Alzheimer, el crecimiento neurita aberrante o distrófico, pérdida de la sinapsa y la formación de marañas neurofibrilares se correlacionan fuerte con la severidad de la enfermedad. Las neuronas distróficas contienen característicamente abundantes cuerpos multilaminares electrodensos en el citoplasma de las neuritas y tienen la interrupción en las uniones sinápticas. Las neuronas distróficas circundan los depósitos de amiloides, por lo tanto, formando las placas seniles ubicadas a través del neruopilo cerebral así como en las paredes de los vasos sanguíneos cerebrales. Los métodos de la invención para tratar la enfermedad de Alzheimer puede reducir o bloquear la atrofia de las células nerviosas, reducir o bloquear la formación de las placas, seniles o las marañas neurofibrilares y los similares, tal como el desarrollo de la enfermedad es lento o se detiene.
Los depósitos amiloides también se encuentran en las isletas de Langerhans en pacientes diagnosticados con diabetes tipo II. Los depósitos contienen una proteína amiloide que se deriva de un polipéptido amiloide de la isleta llamada precursor más grande (IAPP) o amilina que en animales normales tiene un rol hormonal. El 1APP se produce mediante las células beta de las isletas y tiene un efecto profundo en la ingesta de glucosa por el hígado y las células musculares estriadas. En los ratones transgénicos que tienen un transgen para la amilina humana y que se alimentan con una dieta alta en grasas, la sobre producción de la amilina conduce a la deposición de amiloides en la isleta (ver Pathology, 3era. Edición (1999) supra, p. 1226). Los métodos de la invención para tratar los depósitos amiloides en las ¡sletas de Langerhans en pacientes que tiene diabetes tipo II puede reducir o prevenir la formación de proteína amiloide, reducir o prevenir la deposición de proteína amiloide en los depósitos amiloides y los similares.
Aún otra enfermedad en donde los depósitos amiloides se notan es la enfermedad de prion, un tipo de encefalopatía espongiforme. Las enfermedades de prion son condiciones neurodegenerativas caracterizadas clínicamente por ataxia y demencia progresiva y patológicamente por vacuolización de tejido cerebral espongiforme. Los depósitos amiloides se asocian con al menos una enfermedad de prion conocida cono kuru. En kuru, aproximadamente 70% de la proteína prion se acumula extracelularmente para formar placas, en contraste a la proteína prion normal que es una glicoproteína de superficie celular expresada constitutivamente (ver Pathology, 3. su. rd. ed. supra pp. 1492-1496). Los métodos de la invención para el tratamiento de la enfermedad de prion pueden reducir o prevenir la producción de proteína amiloide, reducir o prevenir la deposición de placas amiloides y las similares.
Aún otra enfermedad en donde los depósitos amiloides se notan es la amiloidosis A amiloide. Las amiloidosas A amiloide se refieren a las amiloidosas de enfermedades parecidas no relacionadas tales como las enfermedades inflamatoria crónicas, enfermedades neoplásicas y enfermedades hederitarias. La deposición de la proteína amiloide es secundara para la condición sobrelapando la enfermedad. La molécula precursora es amiloide en suero A (SAA), un reactivo de fase aguda que puede usarse como un marcador sustituto de inflamación en muchas enfermedades. Los métodos de la invención para tratar la amiloidosis A amiloide pueden reducir o prevenir la producción de proteína amiloide, reducir o prevenir la producción del precursor para la proteína amiloide, prevenir o reducir cualquiera de las varia etapas necesarias para generar una proteína amiloide activa, reducir o prevenir la deposición de las placas amiloides y las similares.
Aun otra enfermedad en donde los depósitos amiloides se notan es la amiloidosis transtiretina familiar que es la forma más común de la Polineuropatía Amiloidótica Familiar (FAP). Las enfermedades amiloides humanas, la polineuropatía amiloide familiar, cardiomiopatía amiloide familiar y la amiloidosis sistémica senil, se causan por fibrilos transtiretina insoluble (TTR), que se depositan en los nervios periféricos y el tejido coronario. La transtiretina es una proteína plasma homotetramérica implicada en el transporte de tiroxina y retinol. La variante TTR amiloidogénica más común es V30M-TTR, mientras L55P-TTR es la variante asociada con la forma más agresiva de FAP. Los métodos de la invención para tratar las amiloidosas causadas por la transtiretina pueden reducir o prevenir la producción de proteína amiloide, reducir o prevenir la producción del precursor para la proteína amiloide, prevenir o reducir cualquiera de una de las etapas necesarias para generar una proteína amiloide activa, reducir o prevenir la deposición de placas amiloides y las similares.
Una enfermedad adicional en donde los depósitos amiloides se notan es amiloidosís AL. La amiloidosis AL es una clase de enfermedades relacionadas a una enfermedad primaria de producción inmunoglobulina que incluye amiloidosis primaria, discrasia celular de plasma, linfoma imunoblástico, mieloma múltiple y los similares. La amiloidosis AL sistémica primaria (amiloide de cadena ligera) es un enfermedad de células en plasma en la cual las deposiciones de la proteína de cadena ligera amiloide causan falla orgánica progresiva. La prognosis de amiloidosis primaria es generalmente pobre, con una supervivencia media de 1-2 años. La proteína precursora es una cadena ligera de inmunoglobulina localizada en la amiloidosis AL sistémica y localizada que muestra el mismo patrón de fragmentación y cambios de estructura primaria. Los métodos de la invención para tratar las amiloídosas causadas por las proteínas amiloides AL pueden reducir o prevenir la producción de proteína amiloide, reducir o prevenir la producción del precursor de la proteína amiloide, prevenir o reducir cualquiera de una de las varias etapas necesarias para generar una proteína amiloide activa, reducir o prevenir la deposición de placas amiloides y las similares.
Como se usa en este documento, "administrar" se refiere a proporcionar una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto a un sujeto usando administración oral, sublingual, intravenosa, subcutánea, transcutánea, intramuscular, intracutánea, intratecal, epidural, intraocular, intracraneal, por inhalación, rectal, vaginal y la administración similar. La administración en la forma de cremas, lociones, tabletas, cápsulas, granulos, polvos dispersables, granulos, supositorios, jarabes, elíxires, pastillas, soluciones inyectables, soluciones estériles acuosas o no acuosas, suspensiones o emulsiones, parches y los similares también se contemplan. Los ingredientes activos pueden componerse con portadores farmacéuticamente no tóxicos incluyendo glucosa, lactosa, goma de acacia, gelatina, manitol, pasta de almidón, trisilicato de magnesio, talco, almidón de maíz, queratina, sílice coloidal, almidón de papa, urea, dextranos y los similares.
La ruta de administración preferida variará con la indicación clínica. Alguna variación en la dosis ocurrirá necesariamente dependiendo de la condición del paciente siendo tratado y el médico en cuyo caso determinará la dosis apropiada para el paciente individual. La cantidad efectiva del compuesto por dosis unitaria depende entre otras cosas, del peso corporal, la fisiología y el régimen de inoculación seleccionado. Una dosis unitaria del compuesto se refiere al peso del compuesto empleado para la administración incluyo sin el peso del portador (cuando el portador se usa).
Los sistemas de liberación blancos, tales como matrices de polímero, líposomas y microesferas pueden incrementar la concentración efectiva de un agente terapéutico en el sitio en donde el agente terapéutico es necesario y disminuye los efectos indeseados del agente terapéutico. Con liberación más eficiente de un agente terapéutico, las concentraciones sistémicas del agente se reducen debido a las cantidades menores del agente terapéutico que pueden administrarse mediante la acumulación de los mismos o de resultados terapéuticos mejores. Las metodologías aplicables a la eficiencia de liberación incrementada de los agentes terapéuticos típicamente se enfocan en la unión a una porción blanco para el agente terapéutico o a un portador que subsecuentemente está cargado con un agente terapéutico.
Varios sistemas de liberación de drogas se han diseñado mediante el uso de portadores tales como proteínas, péptidos, polisacáridos, polímeros sintéticos, partículas coloidales (es decir, liposomas, vesículas o miscelas), microemulsiones, microesferas y nanopartículas. Estos portadores, que contienen agentes farmacéuticamente útiles atrapados, se intenta que logren la liberación controlada de la droga en el tejido específico o en la célula específica.
Los compuestos contemplados para usarse en este documento pueden administrarse en la forma de liposomas. Como se conoce en la técnica, las liposomas generalmente se derivan de fosfolípidos u otras sustancias lípidas. Las liposomas se forman por cristales líquidos hidratados multi-lamelares o mono lamelares que se dispersan en un medio acuoso. Cualquier lípido metabolizable y fisiológicamente aceptable no tóxico capaz de formar liposomas puede usarse. Los compuestos descritos en este documento, cuando en la forma de liposoma pueden contener, además a los compuestos descritos en este documento, estabilizadores, excipientes y los similares. Los lípidos preferidos son los fosfolípidos y las colinas fosfatidilo (lecitinas), ambos naturales y sintéticos. Los métodos para formar las liposomas se conocen en la técnica. (Ver, por ejemplo Prescotr, Ed., Methods in Cell Biology, Volumen XIV, Academic Press, Nueva York N.Y., (1976), p 33 et sec).
Varios avances de liberación pueden usarse para liberar los agentes terapéuticos al cerebro mediante circunvenir la barrera cerebral sanguínea. Dichos avances usan inyecciones ntratecales, implantes quirúrgicos (Ommaya, Cáncer Drug Delivery, 1 : 169-178 (1984) y la Patente Norteamericana No. 5,222,982), infusión intersiticial (Bobo et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA., 91 : 2076-2080 (1994)) y los similares. Estas estrategias liberan un agente al SNC mediante administración directa en el fluido cerebroespinal (CSF) o en el parenquima cerebral (ECF).
La liberación de la droga al sistema nervioso central a través del fluido cerebroespinal se logra, por ejemplo, por medio de un dispositivo subduralmente implantable llamado después por su inventor "depósito Ommaya". La droga se inyecta en el dispositivo y subsecuentemente se libera en el fluido cerebroespinal circundando el cerebro. Puede dirigirse hacia áreas específicas del tejido cerebral expuesto que entonces absorben la droga. Esta absorción se limita dado que la droga no corre libremente. Un dispositivo modificado, en donde el depósito se implanta en la cavidad abdominal y la droga inyectada se transporta mediante el fluido cerebroespinal (tomado de y regresado a la espina) al espacio ventricular del cerebro, se usa para la administración del agente. A través de la derivación de omega 3, los complejos biomoleculares de sitio específico pueden superar la absorción limitada y el movimiento de los agentes terapéuticos a través del tejido cerebral.
Otra estrategia para mejorar la liberación del agente mejorado al SNC es mediante incrementar la absorción del agente (absorción y transporte) a través de la barrera cerebral sanguínea y la ingesta del agente terapéutico por las células (Broadwell, Acta Neuropathol., 79: 117-128 (1989); Pardridge et al., J. Pharmacol. Experim. Therapeutics, 255: 893-899 (1990); Banks et al., Progress in Brain Research, 91 : 139-148 (1992); Pardridge, Fuel Homeostasis and the Nervous System, ed., Vraníc et al., Plenum Press, Nueva York, 43-53 (1991 )). El paso de los agentes a través de la barrera cerebral sanguínea al cerebro puede mejorarse mediante mejorar la permeabilidad del agente por sí mismo o mediante alterar las características de la barrera cerebral sanguínea. Además, el paso del agente puede facilitarse mediante incrementar su solubilidad lípida a través de la modificación química, y/o mediante su acoplamiento a un portador catiónico o mediante su acoplamiento covalente a un vector péptido capaz de transportar el agente a través de la barrera cerebral sanguínea. Los vectores de transporte péptldo también se conocen como compuestos permeabilizantes de barrera cerebral sanguínea (Patente Norteamericana No. 5,268,164). Las macromolécülas de sitio específicas con características lipofílicas útiles para la liberación al cerebro se describen en la Patente Norteamericana No. 6,005,004.
Otros ejemplos (Patente Norteamericana No. 4,701 ,521 y Patente Norteamericana No. 4,847,240) describen un método para enlazar covalentemente un agente a un portador macromolecular catiónico el cual ingresa en las células en proporciones relativamente altas. Estas patentes enseñan el mejoramiento en la ingesta celular de las bio-moléculas en las células cuando se unen covalentemente a las resinas catiónicas.
La Patente Norteamericana No. 4,046,722 describe las drogas anti-cáncer covalentemente unidas a los polímeros catiónicos para el propósito de dirigirlas a las células que soportan los antígenos específicos. Los portadores poliméricos tienen pesos moleculares de aproximadamente 5,000 a 500,000. Dichos portadores poliméricos pueden emplearse para liberar los compuestos descritos en este documento en una manera de blanco.
Además el trabajo involucra la unión covalente de un agente a un polímero catiónico a través de una molécula intermediaria sensible al ácido (también conocido como un espaciador), se describe en la Patente Norteamericana No. 4,631,190 y Patente Norteamericana No. 5,144,011. Varias moléculas espadadoras, tales como el ácido cis-aconítico, son unidas al agente y al portador polimérico. Ellas controlan la liberación del agente del portador macromolecular cuando se someten a un incremento suave en acidez, tal como probablemente ocurre dentro de una lisosoma de la célula. La droga puede hidrolizarse selectivamente del conjugado molecular y liberado en la célula en su forma no uniforme y activa. Los conjugados moleculares se transportan a las lísosomas, en donde se metabolizan bajo la acción de las enzimas lisosomales en un pH sustancialmente más ácido que otros compartimientos o fluidos dentro de una célula o cuerpo. El pH de una lisosoma se muestra para ser aproximadamente 4.8, mientras durante el estado inicial de la digestión del conjugado, el pH es posiblemente tan bajo como 3.8.
Como se emplea en este documento, la frase "cantidad terapéuticamente efectiva", cuando se usa en referencia a los compuestos contemplados para usarse en la práctica de la presente invención, se refiere a una dosis del compuesto suficiente para proporcionar la circulación de las concentraciones lo suficientemente altas para impartir un efecto benéfico en el receptor del mismo. El nivel de dosis terapéuticamente efectivo especifico de cualquier paciente particular dependerá de una amplia variedad de factores incluyendo la enfermedad que se está tratando, la severidad de la enfermedad, la actividad del compuesto específico usado, la ruta de administración, la proporción de la claridad del compuesto especifico, la duración del tratamiento, las drogas usadas en combinación o coincidentes con el compuesto específico, la edad, el peso corporal, el sexo, la dieta y la salud en general del paciente y los factores similares bien conocidos en las artes médicas y ciencias. Los niveles de dosis típicamente caen en el rango de desde aproximadamente 0.001 a más de 100 mg/kg/día con los niveles en el rango de aproximadamente 0.05 a más de 10 mg/kg/día siendo preferidos.
Como se usa en este documento, la frase "contactar" se refiere a proporcionar compuestos a las células o blancos celulares. Contactar puede llevarse a cabo en la fase líquida, sólida o gaseosa y se refiere a eventos que se llevan a cabo extracelularmente e intracelularmente. Aquellos expertos en la técnica reconocerán que proporcionar compuestos a las células in vivo puede llevarse a cabo por numerosos modos de administración, incluyendo oral, sublingual, intravenosa, subcutánea, transcutánea, intramuscular, intracutánea, intratecal, epidural, intraocular, intracraneal, por inhalación, rectal, vaginal y los similares.
De conformidad con otro aspecto de la presente invención, se proporcionan métodos para tratar las enfermedades neurodegenerativas, dicho método comprende bloquear la habilidad de la proteasa para penetrar la proteína del precursor ß-amiloide (APP) y/o las proteínas como APP (es decir APLP1 o APLP2) para producir el péptido carboxiterminal APP-C31.
Como se reconocerá rápidamente por aquellos expertos en la técnica, la habilidad de la proteasa para penetrar APP y/o Aß pueden bloquearse en una amplia variedad de formas, es decir, mediante los anticuerpos anti-proteasa, nucleótidos antisentido basados en la secuencia de codificación de proteasa, los péptidos, los peptidomiméticos, las ribosomas, los ARNs de interferencia, los antagonistas de proteasa, las moléculas pequeñas con el bloqueo de la habilidad de proteasas para penetrar la región intracistoplásmica de APP y/o Aß y las similares.
Por ejemplo, la expresión incluyendo la sobre expresión de un APP de conformidad con la presente invención puede inhibirse mediante la administración de una molécula antisentido que inhibe a e inhibe la expresión del mARN que codifica al polipéptido. Alternativamente, la expresión puede inhibirse en una manera análoga usando una ribosima que penetra el mARN. Los métodos generales para usar la tecnología de antisentido y ribosima para controlar la expresión del gen o de los métodos de terapia del gen para la expresión de un gen exógeno en esta manera bien conocida en la técnica. Cada uno de los métodos usa un sistema, tal como un vector, que codifica una transcripción de ribosoma o antisentido de un APP mutante de conformidad con la presente invención.
El término "ribosima" se refiere a una estructura de ARN de uno o más ARNs que tienen propiedades catalíticas. Las ribosimas generalmente exhiben endonucleasas, ligasas o actividad polimerasa. Las ribosimas son moléculas ARN estructurales que median un número de reacciones de auto-penetración de ARN. Se han identificado varios tipos de ribosimas de trans-actuación, incluyen los tipos "hammerhead" y "hairpin" que tienen diferentes estructuras secundarias. Una variedad de ribosimas se ha caracterizado. Ver, por ejemplo las Patentes Norteamericanas Nos. 5,246,921 , 5,225,347, 5,225,337 y 5,149,796. Las ribosimas mezcladas comprenden deoxiribo y ribooligonucleótidos con la actividad catalítica que se ha descrito. Perreault, eí al., Nature, 344:565-567 (1990).
Como se usa en este documento, "antisentido" se refiere a moléculas de ácido o sus derivados que especialmente hibridan, es decir, se unen bajo condiciones celulares, con el ADN genómico y/o el mARN celular que codifica un APP mutante de conformidad con la presente invención, de manera que inhibe la expresión de esa proteína, por ejemplo, mediante inhibir la transcripción y/o traducción. El enlace puede ser complementariamente el par de base convencional o por ejemplo, en el caso del enlace a los ADN dobles, a través de interacciones específicas en la ranura principal de la doble hélice.
En un aspecto, la construcción anti-sentido es un ácido nucleico que se genera ex vivo y que, cuando se introduce en la célula, puede inhibir la expresión del gen por, sin límite, la hibridación con el mARN y/o las secuencias genómicas de una molécula APP o como APP.
Los avances antisentido pueden involucrar el diseño de oligonucleótidos (es decir ADN o ARN) que son complementarios al APP o al mARN como APP. Los oligonucleótidos antisentido se unirán a las transcripciones de mARN como APP o APP y prevendrán la traducción.
Aunque se prefiere el complementario absoluto, no se requiere. Una secuencia "complementaria" para una porción de un ARN, como se refiere en este documento, significa una secuencia que tiene suficiente complementario para ser capaz de hibridarse con el ARN, formando un doble estable, en el caso de ácidos nucleicos antisentido de doble hebra, una hebra del ADN doble además puede probarse, o la formación triple puede probarse. La habilidad para hibridar dependerá del grado complementario y la longitud del ácido nucleico antisentido. Generalmente, entre más grande es la hibridación del ácido nucleico, mayores son los errores de base con un ARN que puede contener y aún formar un doble estable (o triple como el caso puede ser). Un experto en la técnica puede comprobar un grado tolerable de error mediante el uso de procedimientos estándares para determinar el punto de fusión del complejo hibridado.
Los métodos generales de uso antísentido, la tecnología de ribosima y la tecnología ARNi para controlar la expresión del gen o de los métodos de terapia por genes para la expresión de un gen exógeno en esta manera son bien conocidos en la técnica. Cada uno de estos métodos usan un sistema, tal como un vector, que codifica una transcripción antisentido o ribosima de un APP o polipéptido como APP. El término "ARNi" permanece para la ¡nterferencia ARN. Este término se entiende en la técnica que abarca la tecnología usando las moléculas de ARN que pueden silenciar los genes. Ver por ejemplo, McManus, et al. Nature Reviews Genetics 3:737 (2002). En esta aplicación, el término "ARNi" abarca las moléculas tales como el ARN de interferencia corta (siARN), microARNs (miran), ARN pequeño temporal (stARN). Generalmente hablando, la interferencia de ARN resulta de la interacción del ARN de doble hebra con los genes.
En general, los oligonucleótidos que son complementarios para el extremo 5' del mensaje, es decir la secuencia no traducida 5' a más de e incluyendo el codón de iniciación AUG, deberá trabajar más eficientemente en la traducción de la inhibición. Sin embargo, las secuencias complementarias para las secuencias no traducidas 3' de mARNs han mostrado ser efectivas en la inhibición de la traducción de los mARNs. (Wagner, R. (1994) Nature 372:333). Los oligonucleótidos antisentido complementarios para las regiones de codificación mARN son inhibidores menos eficientes de traducción podrían usarse de conformidad con la invención. Si se designa para hibridar la región de codificación 5', 3' de APP o el mARN polipéptido como APP, los ácidos nucleicos antisentido deberían ser menos de seis nucleótidos en longitud y de preferencia menos de aproximadamente 100 y más preferiblemente menos de aproximadamente 50 ó 30 nucleótidos en longitud. Típicamente deberán ser entre 10 y 25 nucleótidos en longitud. Dichos principios informarán al practicante en la selección de los oligonucleótidos apropiados. En las modalidades preferidas, la secuencia antisentido se selecciona de una secuencia de oligonucleótido que comprende, consiste de o consiste esencialmente de aproximadamente 10-30 y más preferiblemente 15-25, bases de nucleótidos contiguas de una secuencia de ácido nucleico que codifica el APP o el polipéptido como APP.
Usando dichas secuencias, los oligonucleótidos antisentido pueden designarse. Dichos oligonucleótidos antisentido se administrarían a las células que expresan APP o el polipéptido como APP y los niveles del ARN blanco o la proteína con ella de un ARN de control interno o la proteína se podrían comparar. Los resultados obtenidos usando el oligonucleótido antisentido también se compararían con aquellos obtenidos usando un oligonucleótido de control apropiado. Un oligonucleótido de control preferido es un oligonucleótido de aproximadamente la misma longitud como el oligonucleótido de prueba. Aquellos oligonucleótidos antisentido resultando en una reducción en los niveles de ARN blanco o la proteína podría seleccionarse.
Los oligonucleótidos pueden ser ADN o ARN o mezclas quiméricas o derivados o versiones modificadas de los mismos, de una sola hebra o de doble hebra. El oligonucleótido puede modificarse en la porción base, la porción de azúcar o la columna de fosfato, por ejemplo para mejorar la estabilidad de la molécula, hibridación, etc. El oligonucleótido puede incluir otros grupos adjuntados tales como los péptidos (es decir para marcar los receptores celulares del huésped en vivo) o los agentes que facilitan el transporte a través de las membranas celulares (ver por ejemplo, Letsinger ef al. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 86:6553-6556; Lemaitre eí al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 84:648-652; Publicación de PCT No. WO 88/09810, publicada el 15 de Diciembre, 1988) o la barrera cerebral sanguínea (ver por ejemplo, la Publicación de PCT No. WO 89/10134, publicada el 25 de Abril, 1988), los agentes de penetración de hibridación activada (Ver, por ejemplo Krol ef al. (1988) BioTechniques 6:958-976) o los agentes de intercalación. (Ver por ejemplo Zon (1988) Pharm. Res. 5:539-549). A este extremo, el oligonucleótido puede conjugarse a otra molécula, es decir, un péptido, la hibridación activa el agente de reticulación, el agente de transporte, el agente de penetración hibridación activado, etc.
El oligonucleótido antísentido puede comprender al menos una porción de base modificada que se selecciona de las porciones tales como 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-clorouracil, 5-yodouracil, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina y 5-(carboxihidroxietil)uracil. El oligonucleótido antisentido también puede comprender al menos una porción de azúcar modificada seleccionada del grupo que incluye pero no se limita a arabinosa, 2-fluoroarabinosa, xilulosa y hexano.
En aún otra modalidad, el oligonucleótido antisentido comprende al menos una columna de fosfato modificado seleccionado del grupo que consiste de una fosforotioato, un fosforoditioato, un fosforamidotioato, un fosforamidato, un fosfordiamidato, un metilfosfonato, un alquil fosfotriéster y un formacetal o análogo del mismo. (Ver también, las Patentes Norteamericanas Nos. 5,176,996; 5,264,564 y 5,256,775.
En aún otra modalidad, el oligonucleótido antisentido es un ollgonucleótido a-anomérico. Un oligonucleótido a-anomérico forma híbridos de doble hebra específicos con el ARN complementario en el cual, contrario a las unidades ß usuales, las hebras corren paralelas una con otra (Gautier ef al. (1987) Nucí. Acids. Res. 15:6625-6641). El oligonucleótido es un 2'-0- metilribonucleótido (Inoue ef al. (1987) Nucí. Acids Res. 15:6131-6148) o un análogo AND-ARN quimérico (Inoue et al., (1987) FEBS Lett. 215:327-330).
También son apropiados los ácidos nucleicos peptidilo, que son polipéptidos tales como poliserina, politreonina, etc., incluyendo copolímeros que contienen varios aminoácidos, que se sustituyen en las posiciones de cadena lateral con los ácidos nucleicos (T,A,G,C,U). Las cadenas de dichos polímeros son capaces de hibridar a través de las bases complementarias en la misma manera como el ADN/ARN natural. Alternativamente, una construcción antisentido de la presente invención puede enviarse, por ejemplo, como un plásmido de expresión o vector, que cuando se transcribe en la célula, produce el ARN complementario para al menos una única porción del mARN celular que codifica un polipéptido cinasa de la invención.
Mientras los nucleótidos antisentido complementarios para el APP o el polipéptido como APP de la secuencia de la región de codificación pueden usarse, aquellos complementarios para la región no traducida transcrita son los más preferidos.
De conformidad con otro aspecto de la presente invención, se proporcionan métodos para prevenir la pérdida hipocampal sináptica, dichos métodos comprendiendo el bloqueo de la habilidad de la caspasa u otras proteasas para penetrar la proteína del precursor ß-amilolde (APP) y/o las proteínas como APP (es decir, APLP1 o APLP2).
Como se anotó anteriormente, la habilidad de la proteasa para penetrar el APP y/o las proteínas como APP (es decir APLP1 o APLP2) puede bloquearse en una variedad de formas, es decir, mediante los anticuerpos anti-proteasa, nucleótidos antisentido basados en la secuencia de codificación proteasa, péptidos, peptidomiméticos, ribosimas, ARNs de interferencia, los antagonistas proteasa, moléculas pequeñas que bloquean la habilidad de las proteasa para penetrar la región intracitoplásmica de APP y/o las proteínas como APP (es decir APLP1 o APLP2) y las similares.
De conformidad con un aspecto adicional de la presente invención, se proporcionan métodos para prevenir la atrofia giral dentada, dichos métodos comprendiendo bloquear la habilidad de la caspasa u otras proteasas para penetrar la proteína del precursor ß-amiloide (APP) y/o las proteínas como APP (es decir APLP1 o APLP2).
Como se anotó anteriormente, la habilidad de la proteasa para penetrar el APP y/o las proteínas como APP (es decir, APLP1 o APLP2) pueden bloquearse en una variedad de formas, es decir, mediante los anticuerpos anti-proteasa, nucleótidos antisentido basados en la secuencia de codificación de la proteasa, los péptidos, los peptidomiméticos, las ribosimas, los ARNs de interferencia, los antagonistas de proteasa, las moléculas pequeñas que bloquean la habilidad de las proteasas para penetrar la región intracistoplásmica de APP y/o Aß y los similares.
De conformidad con otro aspecto de la presente invención, se proporcionan métodos de terapia de genes para tratar las enfermedades neurodegenerativas, dichos métodos comprendiendo la introducción de una mutación en la proteína del precursor ß-amiloide (APP) para así prevenir la penetración del mismo mediada por la caspasa.
En efecto, los avances han resultado en avances prácticos para la terapia con genes humanos que han demostrado resultados iniciales positivos (revisado en Miller, Nature 357:455-460, 1992). La ciencia básica de la terapia por genes se describe en Mulligan (Science 260:926-931 , 1993).
Además, en una modalidad, un vector de expresión conteniendo una secuencia de codificación APP mutante se insertó en las células, las células se cultivaron in vitro y posteriormente se infundieron en números grandes en los pacientes.
La terapia por genes de conformidad con la presente invención puede involucrar el uso de un adenovirus que contienen cADN APP mutante señalado para las células neurales, la expresión sistémica del APP mutante mediante la implantación de las células trabajadas, la inyección con el virus de codificación APP mutante, la inyección de ADN APP mutante en los tejidos apropiados y los similares.
Los vectores de expresión derivados de los virus tales como retrovirus, virus de vacuna, adenovirus, virus adeno-asociado, virus del herpes, virus de ARN severos o virus del papiloma humano, pueden usarse para la liberación de las secuencias de nucleótidos (es decir cADN) que codifican el APP mutante de conformidad con la invención en la población celular blanco (es decir, células neurales). Los métodos que son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica pueden usarse para construir los vectores virales recombinantes que contienen las secuencias de codificación (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1989; Ausubel ef al., Current Protocols en Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. 1989). Alternativamente, las moléculas de ácido nucleico recombinantes que codifican las secuencias de proteína pueden usarse como ADN desnudo o en un sistema reconstituido, es decir, las liposomas u otros sistemas lípidos para la liberación de las células blanco (es decir, Felger et al., Nature 337:387-8, 1989). Varios otros métodos para la transferencia directa del ADN del plásmido en las células existe para usarse en la terapia por genes humanos e involucra la señalación del ADN para los receptores en las células mediante acomplejar el ADN del plásmido a las proteínas (Miller, supra).
En esta forma más simple, la transferencia de genes puede realizarse mediante inyectar simplemente las cantidades diminutas de ADN en el núcleo de una célula, a través de un proceso de microinyección (Capecchi, Cell 22:479-88, 1980). Una vez que los genes recombinantes se introducen en una célula, ellos pueden reconocerse mediante la maquinaria normal de la célula para la transcripción y la traducción y un producto de gen se expresará. Otros métodos también se han intentado para la introducción del ADN en números más grandes de células. Estos métodos incluyen: transfección en donde el ADN se precipita con fosfato de calcio y se toman en las células mediante pinocitósis (Chen et al., Mol. Cell Biol. 7:2745-52, 1987); electroporación, en donde las células se exponen a grandes pulsos de voltaje para introducir agujeros en la membrana (Chu ef al., Nucleic Acids Res. 15:1311-26, 1987); fusión de lipofección/liposoma, en donde ADN se empaca en las vesículas lipofílicas que se fusionan con una célula blanco (Flegner eí al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA. 84:7413-7417, 1987) y el bombardeo de partículas usando el enlace de ADN para los proyectiles pequeños (Yang et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 87:9568-9572, 1990). Otro método para la introducción del ADN a las células es acoplar el ADN a las proteínas químicamente modificadas.
También se ha observado que las proteínas del adenovirus son capaces de desestabilizar las endosomas y mejorar la ingesta de ADN en las células. La mezcla de adenovirus a las soluciones que contienen complejos de ADN o el enlace del ADN a la polilisina covalentemente unida al adenovirus usando los agentes de reticulación de la proteína mejora sustancíalmente la ingesta y la expresión del gen recombinante (Curiel ef al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 6:247-52, 1992).
Como se usa en este documento, "transferencia de gen" significa el proceso de introducir una molécula de ácido nucleico extraña en una célula. La transferencia de gen se realiza comúnmente para habilitar la expresión de un producto particular codificado por el gen. El producto puede incluir una proteína, polipéptido, ADN antisentido o ARN o ARN enzimáticamente activo. La transferencia de gen puede realizarse en las células cultivadas o medíante la administración directa en los animales. Generalmente la transferencia de genes involucra el proceso de contacto del ácido nucleico con una célula blanco por las interacciones mediadas por el receptor o no específico, la ingesta del ácido nucleico en la célula a través de la membrana o mediante endocitosis y la liberación del ácido nucleico en el citoplasma de la membrana del plasma o endosoma. La expresión puede requerir además, el movimiento del ácido nucleico en el núcleo de la célula y enlazarse a los factores nucleares apropiados para la transcripción.
Como se usa en este documento "terapia por genes" es una forma de una transferencia de genes y se incluye dentro de la definición de transferencia de genes como se usa en este documento y especialmente se refiere a la transferencia de genes que expresa un producto terapéutico de una célula in vivo o in vitro. La transferencia de genes puede realizarse ex vivo en las células que posteriormente se transplantan en un paciente o puede realizarse mediante la administración directa del ácido nucleico o el complejo de proteína de ácido nucleico en el paciente.
En otra modalidad preferida, un vector que tiene secuencias de ácido nucleico que codifican un APP mutante se proporciona, en el cual la secuencia de ácido nucleico se expresa solamente en el tejido específico. Los métodos para lograr la expresión del gen de tejido específico se establecen en la Publicación Internacional No. WO 93/09236, presentada el 3 de Noviembre, 1992 y publicada el 13 de Mayo, 1993. * En todos los vectores precedentes establecidos anteriormente, un aspecto adicional de la invención es que la secuencia de ácido nucleico contenida en el vector puede incluir adiciones, omisiones o modificaciones para algo o toda la secuencia del ácido nucleico, como se definió anteriormente.
La invención ahora se describirá en mayor detalle con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.
EJEMPLO 1 Generación de la Mutación PDAPP (D664A) Una mutación el punto A G a C se introdujo en el promotor de cadena ß PDGF que lleva el minigen hAPP que porta las mutaciones Indiana y de Suiza (ver Hsia et al, supra) que cambia el Asp664 (número APP695) a Ala (PDAPP(D664A)). La mutación fue confirmada por la secuencia y mediante la especificación alelo específico.
EJEMPLO 2 Generación de ratones transqénicos La microinyección del transgen PDAPP(D664A), la identificación de los creadores transgénicos mediante PCR y la selección de la línea PDAPP(D664) B21 para usarse en el presente estudio se llevaron a cabo como se describió previamente (ver Li, Y., Carlson, E., Murakami, K., Copin, J.C. Luche, R., Chen, S.F., Epstein, C.J. y Chan, P.H. en J. Neurosci Methods 89, 49-55 (1999)), que sustancialmente procedió como sigue. Una solución de 2 ng/µl de PDAPP humano purificado lineal (D664A), el ADN transgen libre de las secuencias del vector se microinyectaron en los pronúcleos macho de huevos de 1 día B6D2F1/J y se transfirieron en las madres adoptivas CD1 pseudopreñadas 24 horas después. La identificación de los creadores se hizo mediante PCR usando los iniciadores específicos para el transgen hAPP: GGTGAGTTTGTAAGTGATGCC (SEC ID NO:1) y TCTTCTTCTTCCACCTCAGC (SEC ID NO:2), y los iniciadores específicos para el gen de PKR de ratón: CAGGCCACTGGGAGGAAAAATG (SEC ID NO:3) Y ACCTTCTGTCATGTGGAGGTCC (SEC ID NO:4).
Las líneas transgénicas adicionales preparadas por el mismo procedimiento incluyen PDAPP(D664A) B36, PDAPP(D664A) B157 PDAPP(D664A) B159, PDAPP(D664A) B184, PDAPP(D664A) B190, PDAPP(D664A) B204, PDAPP(D664A) DB210, PDAPP (D664A) DB226, PDAPP (D664A) DB228, PDAPP(D664A) DB230, PDAPP(D664A) DB239, PDAPP(D664A) DB240, PDAPP(D664A) DB241, PDAPP(D664A) DB242, PDAPP(D664A) DB243, PDAPP(D664A) DB244, PDAPP(D664A) DB245, PDAPP(D664A) DB250, PDAPP(D664A) DB254, PDAPP(D664A) DB264 y los similares.
Las líneas transgénicas se mantuvieron por los cruces heterozigous con los alimentadores C57BU6J (Charles River Laboratories). Todos los animales transgénicos fueron heterozigous con respecto al transgen y los sustitutos no transgénicos se usaron como controles. El APP de ratón y de humano se detectaron en los homogenatos cerebrales mediante Inmunoprecipitación seguido por la hibridación Western usando el anticuerpo anti-APP 5a3/1G7 monoclonal (ver Soriano et al, supra).
EJEMPLO 3 Detección de AS soluble Los niveles Aß se probaron a partir de lisatos solubles CHAPS mediante Inmunoprecipitación seguido por la hibridación Western con el anticuerpo monoclonal anti-APP 26D6 que reconoce los residuos 1-12 del péptido Aß. Los inmunoprecipitados se fraccionaron en geles SDS-PAGE de urea bicina para fraccionar las especies Aß 40 y 42 (ver Weggen, et al, en Nature 414:212-6 (2001)). El APP se inmunohibrido de los lisatos cerebrales CHAPS con CT15, un anticuerpo policlonal que reconoce el término C de APP. Todos loa animales fueron igualado respecto a la edad, entre 3-4 semanas de nacidos antes de la deposición de los péptidos Aß agregados.
EJEMPLO 4 Cuantificación de los depósitos Aß Las secciones cerebrales de cincuenta micrones de vibratome de ratones PDAPP heterozigous y PDAPP(D664A) B21 se marcaron con el anticuerpo 3D6 como se describió previamente (ver Wyss-Coray R., Masliah, E., Mallory, M., McConlogue, L., Johnson-Wood, K., Lin, C y Mucke, L. en Nature 389-603-6 (1997). Las placas Aß hipocampales se identificaron y se contaron por los investigadores Ignorantes con respecto al cerebro y el genotipo. Los datos se expresaron como media +/- SD.
EJEMPLO 5 Penetración de APP en Asp664 in vivo Un anticuerpo específico para el neo-epítope generado por la penetración de APP en Asp664 (ver Galvan et al., en J Neurochem 82:283-94 (2002)) se usó para demostrar un incremento en la penetración en los ratones PDAPP en comparación con ambos controles y el PDAPP(D664A).
EJEMPLO 6 Cuantificación de las densidades presinápticas Para determinar la integridad de las terminales presinápticas, secciones de vibratome de 50 µm de los cerebros de ratones hembra PDAPP y PDAPP(D664A) heterozigous se marcaron con anticuerpos a-sinaptofsin (10 µg/ml, Chemicon) seguido por anti-ratón IgG de burro isotiocianato conjugado fluoresceína (1 :400, Vector Laboratories), contra marcados con yoduro de propidio y se formó una imagen con un microscopio cofocal de digitalización láser (Nikon PCM-200) usando un objetivo 100X y un aumento digital 2.7X. Las densidades tridimensionales numéricas (expresadas como el número de objetos por mm3) de las terminales presinápticas sinaprofisina-inmunoreactivas en radio de estrato CA1 se determinaron mediante una modificación del método disector estereológico [ver Hsai, A. Y. et al. (1999) Proc. Nati. Acad Sci. EUA, 96:3228-3233].
Para cada animal, seis imágenes confocales monocromáticas de 1024 x 1024 píxeles (45 µm x 45 µm) se obtuvieron en la ganancia 2070 PMT. Un juego adicional de seis pares de imágenes confocales se capturaron en las mismas coordenadas x y y pero en un plano de 0.9 µm abajo del plano de adquisición de la primer imagen confocal (z = 0.90 µm) en la ganancia 2100 PMT para corregir el foto blanqueado usando el software Simple PCl (Compix, Inc.). Para reducir la variabilidad introducida en las mediciones mediante las variaciones en la proporción de las regiones no marcadas correspondientes a los procesos neuronales en cada campo, dos subcampos de 10 µm x 10 µm se colectaron del área más brillante de cada par de imágenes, evitando las áreas ocupadas por los procesos. Cada imagen en el par de los subcampos de 10 µm x 10 µm en diferentes coordenadas z se pseudocolorearon de rojo y verde y se sobreimpusieron. Las imágenes resultantes se corrigieron por manchas usando Photoshop y el número de objetos inmunomarcados atravesando ambos planos (amarillo) se contaron usando el PCl Simple. Las cuentas de objetos obtenidas de 12 de dichos disectores espaciados aleatoriamente a través de seis secciones hipocampales seriales por ratón (evitando traslaparlos entre los disectores) se promediaron para cada sujeto y se usaron para análisis estadísticos subsecuentes (ver las Figuras 2B y 2C).
EJEMPLO 7 Determinaciones de volumen El giro dentado hipocampal (DG) y la capa molecular (ML) se definieron con la ayuda de un atlas apropiado (ver Paxinos, G. Frankiin K.B.J. "The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates" Academic Press (2001), San Diego). Los volúmenes del subcampo e hipocampal total se determinaron mediante la reconstrucción tridimensional usando lmaris3D (Bitplane AG, Suiza) (ver la Figura 2C) y confirmados por el análisis Cavalieri (ver la Figura 2B).
Para las determinaciones de volumen usando Imaris 3D (Bitplane) y el análisis de Cavalieri manual, el borde de cada hemi-hipocampo, el giro dentado (DG) y los subcampos de capa molecular (ML) en una serie aleatoria sistemática de 1 en 4 de las imágenes 2X de secciones de 40 µm de Nissl-manchado de cerebros de ratón congelados partidos (correspondientes a veinticinco nodrizas macho no transgénícos o machos transgénicos heterozigous de 100 días) se retiró en el borde sujeto gris/blanco con la fimbria y el cuerpo calloso en el borde de la capa molecular y el lacunoso molecular y la capa polimorfa y el tálamo, respectivamente con la ayuda de un atlas apropiado [ver Paxinos, G y Frankiin, K.B.J., (2001) Academic Press, San Diego, CA]. Se excluyó el subiculo. En cada ejemplo, la última sección se definió como la última sección que muestra un tracto continuo de las fibras del cuerpo calloso. Para las determinaciones del volumen 3D Imaris, las secciones se alinearon usando la aplicación Alineación (Bitplane) y las series resultantes se ajustaron manualmente cuando fue necesario. Un voxel del tamaño de 3.3 µm x 3.3 µx 160 µm se usó para todas las reconstrucciones de 3D subsecuentes y las mediciones de volumen. Para la estimación del volumen usando el principio Cavalieri, una red de 200 µm se traslapó en una imagen de píxel de 1280 x 1024 de cada sección en la muestra y el número de red cruzando dentro de cada semi-hipocampo, el giro dentado y los subcampos de capa molecular se contaron para cada sección en la muestra. Los volúmenes se calcularon como se describió previamente (ver Gonzalez-Lima, F., Berndt, J.D., Valla, J.E., Games, D y Reiman, E.M. en Neuroreport 12, 2375-9 (2001 )).
Los volúmenes derivados por el análisis Cavalieri y las reconstrucciones Imaris 3D se correlacionaron ampliamente (r2 = 0.72, p < 0.00001, n=25). Ninguna diferencia significante se encontró en el peso corporal toral o el peso del cerebro entre las hebras o los genotipos. Para todos los experimentos, las muestras de tejido cerebral y de ratón se codificaron para cegar a los investigadores con respecto a las hebras y el genotipo. Los datos se expresan como media +/-SD. La significancia (p <0.05) se determinó mediante la prueba de Student (asumiendo la varianza igual) o la prueba de coeficiente de correlación Pearson seguida por la prueba de carrera para los análisis de regresión.
EJEMPLO 8 Electrofisioloqía de Rodajas In Vitro Las rebanadas hipocampales horizontales (400 µm) se hicieron de ratones de control nodrizas no transgénicos, B21 PDAPP(D664A) y PDAPPJ20 de 3-7 meses (los ratones J20 se seleccionaron para compararse a los B21 dado que expresaron niveles similares de transgen APP). Las rodajas se separaron usando métodos estándar (ver, por ejemplo, Contractor, A et al., en J. Neurosci 23:422-9 (2003)). Brevemente los animales se anestesiaron con isoflurano y se decapitaron. Los cerebros se removieron y se rebanaron dado bajo sucrosa fría helada con rebanadas artificiales de CSF (ACSF) conteniendo: 85 mM NaCI, 2.5 mM KCl, 1.25 mM de NaH2P04, 25 mM NaHC03, 25 mM de glucosa, 75 mM de sucrosa, 0.5 mM de CaCI2 y 4 mM de MgCI2 y se equilibraron con 95% de 02 y 5% de C02 que también contuvo 10 µM de D.L-APV y 100 µM de quinurenato. Antes de la redodificación, las rodajas se incubaron a temperatura ambiente por al menos 1 hora en un ACSF estándar conteniendo: 125 mM NaCI, 2.4 mM KCl, 1.2 mM de NaH2P0 , 25 mM de NaHC03, 25 mM de glucosa, 1 mM de CaCI2 y 2 mM de MgCI2. Durante los registros, las rodajas se introdujeron continuamente con ACSF conteniendo 2 mM de CaCI2 y 1mM de MgCI2.
Los potenciales de campo extracelulares (fEPSPs) se registraron en el radiato estratio de la región CA1 del hipocampo usando una pipeta de registro de cristal llena con solución extracelular (resistencia de punta 2-3 Mohm). Los fEPSPs provocados se registraron en respuesta a la estimulación de la ruta conmisural/colateral Schaffer usando una corriente constante de paso de electrodos bipolares concéntricos. La transmisión sináptica basal se midió mediante la comparación de la relación entrada y salida de los fEPSPs registrados (Hsia et al), la entrada fue el pico de amplitud para la descarga de fibra, la salida fue la inclinación inicial de fEPSP. Para cada animal la amplitud de descarga de fibra (FV) y la inclinación inicial de las respuestas fEPSP para un rango de estimulación de 5-800 µA se midió y una curva de respuesta generada para ambos valores. La relación de entrada salida posteriormente se calculó mediante dividir la inclinación de fEPSP mediante la amplitud FV (de cada punto a lo largo de la porción lineal en la curva de respuesta) y tomando el valor promedio. La facilidad del puso par se provocó usando un intervalo inter-estímulo de 40 ms y la proporción medida como la amplitud de pico de fEPSP (2)/fEPSP(1). Los resultados se analizaron usando un análisis de una vía de la varianza (ANOVA) seguida porlas pruebas de Turkey post-hoc.
EJEMPLO 9 Neuroqénesis El BrdU (50 mg/kg) se disolvió en solución salina y se dio i.p. dos veces al día en intervalos de 8 horas por 3 días consecutivos y los ratones se mataron una semana después. Las secciones de cerebro se marcaron con anti-BrdU monoclonal de ratón (Roche, 2 µg/ml) e IgG anti-ratón de cabra biotinilado (Vector 1 :200) y el mareaje se visualizó con diaminobencidina y H202. Las células positivas BrdU en el giro dentado se contaron cegadamente en 5-7, 50 µm de las secciones coronales por ratón, se espaciaron 200 µm aparte. Las células se contaron bajo alto poder en un microscopio Nikon E800 con cámara digital Magnifire y la imagen se desplegó en un monitor de computadora. Los resultados se expresaron como el número promedio de células BrdU positivas por sección.
Mientras la invención se ha descrito en detalle con referencia a ciertas modalidades de la misma, se entenderá que las modificaciones y variaciones están dentro del alcance y espíritu de la misma como se describió y se reclama.

Claims (21)

REIVINDICACIONES
1. Un animal transgénico no humano que comprende secuencias de nucleótidos que codifican una proteína del precursor ß-amiloide humano mutante (APP) o proteína como APP, en donde dicho APP humano mutante o proteína como APP comprende una mutación que produce dicho APP humano mutante o proteína como APP resistente para penetrar en Asp664 y en donde dicha secuencia de nucleótido que codifica a dicho APP humano mutante o proteína como APP se asocia operablemente con un promotor apropiado.
2. El animal transgénico de conformidad con la reivindicación 1 , en donde la penetración Asp664 es capasa inducida.
3. El animal transgénico de conformidad con la reivindicación 1 , en donde dicho APP humano mutante o proteína como APP comprende una mutación en el residuo 664.
4. El animal transgénico de conformidad con la reivindicación 3, en donde la mutación en el residuo 664 cambia Asp a Ala, Glu o Gln.
5. El animal transgénico de conformidad con la reivindicación 1, en donde dicho APP humano mutante o proteína como APP comprende una mutación adyacente al residuo 664.
6. El animal transgénico de conformidad con la reivindicación 1, en donde dicho promotor es constitutivamente activo.
7. El animal transgénico de conformidad con la reivindicación 6, en donde dicho promotor se selecciona del grupo que consiste del promotor de actina, el promotor PDGF-ß, el promotor PrP (neuron-específico) y el promotor enolasa neuron específico.
8. El animal transgénico de conformidad con la reivindicación 1 , en donde dicho promotor es inducible.
9. El animal transgénico de conformidad con la reivindicación 8, en donde dicho promotor se selecciona del grupo que consiste del sistema del promotor Tet-on, Tet-off, RU486-inducible y el sistema del promotor ecdisone-inducible.
10. El animal transgénico de conformidad con la reivindicación 1, en donde dicho animal se selecciona del grupo que consiste de roedores, conejos y cerdos.
11. El animal transgénico de conformidad con la reivindicación 1 , en donde dicho animal es un roedor.
12. El animal transgénico de conformidad con la reivindicación 1, en donde dicho animal es un ratón.
13. Un método para tratar enfermedades neurodegenerativas, dicho método comprendiendo bloquear la habilidad de la proteasa para penetrar la proteína del precursor ß-amiloide (APP) y/o la proteína ß-amiloide (Aß) para producir el péptido carboxiterminal, APP-C31.
14. El método de conformidad con la reivindicación 13, en donde la habilidad de la proteasa para penetrar APP y/o Aß se bloquea por los anticuerpos anti-proteasa, los nucleótidos antisentido basado en la secuencia de codificación proteasa, los péptidos, los peptidomiméticos, las ribosimas, los ARNs de interferencia, los antagonistas proteasa o las moléculas pequeñas que bloquean la habilidad de las proteasas para penetrar la región intracitoplásmica de APP y/o Aß.
15. Un método para prevenir ia pérdida sináptica hipocampal, dicho método comprendiendo el bloqueo de la habilidad de la caspasa para penetrar la proteína del precursor ß-amiloide (APP).
16. Un método para prevenir la atrofia giral dentada, dicho método comprendiendo el bloqueo de la habilidad de la caspasa para penetrar la proteína del precursor ß-amiloide (APP).
17. Un método para identificar los compuestos útiles para el tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas, dicho método comprendiendo identificar los compuestos que bloquean la habilidad de la caspasa para penetrar la proteína del precursor ß-amiloide (APP) para producir el péptido carboxiterminal, APP-31.
18. El método de conformidad con la reivindicación 17, en donde los compuestos que bloquean la habilidad de la caspasa para penetrar la proteína del precursor ß-amiloide (APP) para producir el péptido carboxiterminal, APP-C31 se identifican mediante contactar APP o la proteína como APP con el compuesto de prueba en la presencia de la caspasa y monitoreando la formación de APP-P31 , en donde la falla de caspasa para inducir la producción de APP-P31 es indicativa de un compuesto que es útil para el tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas.
19. El método de conformidad con la reivindicación 17, en donde los compuestos que bloquean la habilidad de la caspasa para bloquear la proteína del precursor ß-amiloide (APP) para producir el péptido carboxiterminal, APP-C31, se identifican mediante contactar APP o la proteína como APP con el compuesto de prueba en la presencia de caspasa y analizado para evidencia de la penetración seleccionado del grupo que consiste del producto de penetración, la inducción de la muerte celular, la inducción de atrofia y la inducción de la pérdida de sinapsa.
20. Un método para tratar las enfermedades neurodegenerativas, dicho método comprendiendo administrar una cantidad efectiva de un compuesto identificado por el método de la reivindicación 17 a un sujeto en necesidad del mismo.
21. Un método de terapia por genes para tratar las enfermedades neurodegenerativas, dicho método comprendiendo introducir una mutación en la proteína del precursor ß-amiloide (APP) de manera que se prevenga la penetración mediada por la caspasa del mismo.
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