JP2002536294A - アルツハイマー病、中枢神経系の損傷および炎症性疾患を治療するための組成物ならびに方法 - Google Patents
アルツハイマー病、中枢神経系の損傷および炎症性疾患を治療するための組成物ならびに方法Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明はアルツハイマー病および炎症性成分が原因の他の疾患または症状（例えば、中枢神経系の損傷）を治療するための方法ならびに組成物に関する。特に、本発明はアルツハイマー病および炎症性成分が原因の他の疾患または症状に関与する前炎症性および神経毒性産物の産生を調節する薬剤を提供する。
Description
【０００１】 本発明は、認可番号1-PO1-AG08012のもとに米国立衛生研究所により一部支援
された研究においてなされたものである。米国政府は本発明に対して一定の権利
を有するものである。
された研究においてなされたものである。米国政府は本発明に対して一定の権利
を有するものである。
【０００２】発明の分野 本発明はアルツハイマー病および炎症性成分が原因の他の疾患または症状（例
えば、中枢神経系の損傷）を治療するための方法ならびに組成物に関する。特に
、本発明はアルツハイマー病や他の炎症性疾患に関与する前炎症性および神経毒
性産物の産生を調節する薬剤を提供する。
えば、中枢神経系の損傷）を治療するための方法ならびに組成物に関する。特に
、本発明はアルツハイマー病や他の炎症性疾患に関与する前炎症性および神経毒
性産物の産生を調節する薬剤を提供する。
【０００３】発明の背景 アルツハイマー病(AD)は記憶、行動、言語、視覚空間的技能が次第に損なわれ
て、最終的には死に至ることにより特徴づけられる複合的で複遺伝子性の神経変
性疾患である。傷害を受けている領域の病理学的特徴としては、細胞外のβアミ
ロイド沈着、細胞内の神経原繊維変化、シナプス欠損、広範なニューロン細胞死
が挙げられる。アルツハイマー病の原因と治療に関する研究は研究者達をおびた
だしい道へと導いてきた。多くのモデルが提唱されているけれども、ADの単一モ
デルはどれも、全ての神経病理学的知見ならびに発病への加齢の必要性を満足の
いくように説明するものではない。この病気の進行のメカニズムも同様に不明で
ある。相当数のヒト遺伝的証拠は、ヒトアミロイド前駆体タンパク質(APP)の産
生またはプロセシングの変化がこの病気の原因に関係していることを示している
。しかしながら、徹底的な研究により、ADは多数の異なる（おそらくは重複して
いる）病因による多要素疾患であることが判ってきた。
て、最終的には死に至ることにより特徴づけられる複合的で複遺伝子性の神経変
性疾患である。傷害を受けている領域の病理学的特徴としては、細胞外のβアミ
ロイド沈着、細胞内の神経原繊維変化、シナプス欠損、広範なニューロン細胞死
が挙げられる。アルツハイマー病の原因と治療に関する研究は研究者達をおびた
だしい道へと導いてきた。多くのモデルが提唱されているけれども、ADの単一モ
デルはどれも、全ての神経病理学的知見ならびに発病への加齢の必要性を満足の
いくように説明するものではない。この病気の進行のメカニズムも同様に不明で
ある。相当数のヒト遺伝的証拠は、ヒトアミロイド前駆体タンパク質(APP)の産
生またはプロセシングの変化がこの病気の原因に関係していることを示している
。しかしながら、徹底的な研究により、ADは多数の異なる（おそらくは重複して
いる）病因による多要素疾患であることが判ってきた。
【０００４】 今までのところ、米国ではアルツハイマー病が３番目に費用のかかる病気とな
っており、社会は毎年約1000億ドルを支払っている。アルツハイマー病は老人集
団において最も広く行き渡っている病気のひとつであり、社会の高齢化がすすむ
につれて、ますます重大になってくるだろう。ADに関係した費用には、ナーシン
グホームでの介護などの直接的医療費、家庭でのデイケアなどの直接的非医療費
、ゆくえ不明の患者および介護提供者の生産性などの間接的費用が含まれる。医
学的治療は、認知の衰退速度を遅くし、施設への収容を遅らせ、ケア提供者の時
間を短縮し、生活の質を向上させることにより経済的利益をもたらす可能性があ
る。薬物経済学的評価は、薬物治療がナーシングホーム入院、認知、介護提供者
の時間に及ぼす影響に関してポジティブな結果を明らかにしている。
っており、社会は毎年約1000億ドルを支払っている。アルツハイマー病は老人集
団において最も広く行き渡っている病気のひとつであり、社会の高齢化がすすむ
につれて、ますます重大になってくるだろう。ADに関係した費用には、ナーシン
グホームでの介護などの直接的医療費、家庭でのデイケアなどの直接的非医療費
、ゆくえ不明の患者および介護提供者の生産性などの間接的費用が含まれる。医
学的治療は、認知の衰退速度を遅くし、施設への収容を遅らせ、ケア提供者の時
間を短縮し、生活の質を向上させることにより経済的利益をもたらす可能性があ
る。薬物経済学的評価は、薬物治療がナーシングホーム入院、認知、介護提供者
の時間に及ぼす影響に関してポジティブな結果を明らかにしている。
【０００５】 これまでに試みられた治療戦略は神経伝達物質の補充または正常な脳構造の保
存を標的としてきたが、これらは短期間の病状緩和をもたらす可能性があるもの
の、ニューロンの変性および死を防止することはない。したがって、アルツハイ
マー病と関連したニューロンの変性および死を防止し、かつ長期的に症状を軽減
させる治療法の必要性が存在する。
存を標的としてきたが、これらは短期間の病状緩和をもたらす可能性があるもの
の、ニューロンの変性および死を防止することはない。したがって、アルツハイ
マー病と関連したニューロンの変性および死を防止し、かつ長期的に症状を軽減
させる治療法の必要性が存在する。
【０００６】発明の概要 本発明はアルツハイマー病および炎症性成分が原因の他の疾患または症状（例
えば、中枢神経系の損傷）を治療するための方法ならびに組成物に関する。特に
、本発明はアルツハイマー病や他の炎症性疾患に関与する前炎症性および神経毒
性産物の産生を調節する薬剤を提供する。
えば、中枢神経系の損傷）を治療するための方法ならびに組成物に関する。特に
、本発明はアルツハイマー病や他の炎症性疾患に関与する前炎症性および神経毒
性産物の産生を調節する薬剤を提供する。
【０００７】 本発明は、アルツハイマー病にかかっている被験者およびアルツハイマー病に
かかりやすい被験者からなる群より選択される被験者に、治療に有効な量のPPAR
γアゴニストを投与することを含む、前記被験者の治療方法を提供する。
かかりやすい被験者からなる群より選択される被験者に、治療に有効な量のPPAR
γアゴニストを投与することを含む、前記被験者の治療方法を提供する。
【０００８】 本発明はまた、中枢神経系の損傷をかかえている被験者に、治療に有効な量の
PPARγアゴニストを投与することを含む、前記被験者の治療方法を提供する。
PPARγアゴニストを投与することを含む、前記被験者の治療方法を提供する。
【０００９】 本発明はさらに、炎症性成分が原因の疾患にかかっている被験者および炎症性
成分が原因の疾患にかかりやすい被験者からなる群より選択される被験者に、治
療に有効な量のPPARγアゴニストを投与することを含む、前記被験者の治療方法
を提供する。いくつかの実施形態において、炎症性成分が原因の疾患はアルツハ
イマー病、発作、外傷性損傷および脊髄損傷からなる群より選択されるが、本発
明の方法は炎症性成分が原因となるあらゆる疾患の治療に使用できると考えられ
る。
成分が原因の疾患にかかりやすい被験者からなる群より選択される被験者に、治
療に有効な量のPPARγアゴニストを投与することを含む、前記被験者の治療方法
を提供する。いくつかの実施形態において、炎症性成分が原因の疾患はアルツハ
イマー病、発作、外傷性損傷および脊髄損傷からなる群より選択されるが、本発
明の方法は炎症性成分が原因となるあらゆる疾患の治療に使用できると考えられ
る。
【００１０】 本発明のいくつかの実施形態において、PPARγアゴニストはチアゾリジンジオ
ンからなるが、あらゆるPPARγリガンドおよび調節因子が本発明により意図され
る。いくつかの実施形態では、チアゾリジンジオンは、限定するものではないが
、トログリタゾン(troglitazone)、シグリタゾン(ciglitazone)、ピオグリタゾ
ン(pioglitazone)、BRL 49653、エンクリタゾン(englitazone)またはこれらの組
合せからなる。他の実施形態では、PPARγアゴニストは、限定するものではない
が、ドコサヘキサエン酸、プロスタグランジンJ2およびプロスタグランジンJ2類
似体（例えば、Δ12-プロスタグランジンJ2および15-デオキシ-Δ12,14-プロス
タグランジンJ2）からなる。
ンからなるが、あらゆるPPARγリガンドおよび調節因子が本発明により意図され
る。いくつかの実施形態では、チアゾリジンジオンは、限定するものではないが
、トログリタゾン(troglitazone)、シグリタゾン(ciglitazone)、ピオグリタゾ
ン(pioglitazone)、BRL 49653、エンクリタゾン(englitazone)またはこれらの組
合せからなる。他の実施形態では、PPARγアゴニストは、限定するものではない
が、ドコサヘキサエン酸、プロスタグランジンJ2およびプロスタグランジンJ2類
似体（例えば、Δ12-プロスタグランジンJ2および15-デオキシ-Δ12,14-プロス
タグランジンJ2）からなる。
【００１１】 本発明のいくつかの実施形態において、前記投与は経口投与であるが、あらゆ
る投与手段が想定される。いくつかの実施形態では、PPARγアゴニストの治療に
有効な量は約10mg/kg/日であるが、本発明では前記量より多いまたは少ない量も
考えられる。
る投与手段が想定される。いくつかの実施形態では、PPARγアゴニストの治療に
有効な量は約10mg/kg/日であるが、本発明では前記量より多いまたは少ない量も
考えられる。
【００１２】 本発明はまた、cox-2遺伝子のPPARγ介在遺伝子転写を改変する化合物（例え
ば、アゴニストおよびアンタゴニスト）の能力を測定する方法を提供し、この方
法は、１種以上の被験化合物、および1) PPARγ感受性cox-2調節エレメント、2)
プロモーターおよび3) 異種遺伝子を機能しうる順序で含むオリゴヌクレオチド
配列を含有するDNA構築物により形質転換された宿主細胞を用意すること；そし
て１種以上の被験化合物と該宿主細胞とを、該異種遺伝子の発現が１種以上の該
化合物に応答する条件下で接触させること；を含んでなる。いくつかの実施形態
では、この方法はステップb)における異種遺伝子の発現レベルと、該化合物の不
在下での該宿主細胞からの該遺伝子の発現レベルとを比較するステップをさらに
含む。本発明の１つの好ましい実施形態において、PPARγ感受性cox-2調節エレ
メントを含むオリゴヌクレオチド配列を含有するDNA構築物は配列番号１を含む
。
ば、アゴニストおよびアンタゴニスト）の能力を測定する方法を提供し、この方
法は、１種以上の被験化合物、および1) PPARγ感受性cox-2調節エレメント、2)
プロモーターおよび3) 異種遺伝子を機能しうる順序で含むオリゴヌクレオチド
配列を含有するDNA構築物により形質転換された宿主細胞を用意すること；そし
て１種以上の被験化合物と該宿主細胞とを、該異種遺伝子の発現が１種以上の該
化合物に応答する条件下で接触させること；を含んでなる。いくつかの実施形態
では、この方法はステップb)における異種遺伝子の発現レベルと、該化合物の不
在下での該宿主細胞からの該遺伝子の発現レベルとを比較するステップをさらに
含む。本発明の１つの好ましい実施形態において、PPARγ感受性cox-2調節エレ
メントを含むオリゴヌクレオチド配列を含有するDNA構築物は配列番号１を含む
。
【００１３】 本発明はさらに、COX-2発現を調節する方法を提供し、この方法は、１種以上
の、COX-2を発現する細胞、１種以上の該細胞においてPPARγを発現させる手段
、および１種以上のPPARγアゴニストを用意すること；そして１種以上の該細胞
中に、任意の順序で、PPARγを発現させる手段および１種以上のPPARγアゴニス
トを導入すること；を含んでなる。いくつかの実施形態では、１種以上のCOX-2
を発現する細胞が異常なレベルのCOX-2を発現する細胞を含む。
の、COX-2を発現する細胞、１種以上の該細胞においてPPARγを発現させる手段
、および１種以上のPPARγアゴニストを用意すること；そして１種以上の該細胞
中に、任意の順序で、PPARγを発現させる手段および１種以上のPPARγアゴニス
トを導入すること；を含んでなる。いくつかの実施形態では、１種以上のCOX-2
を発現する細胞が異常なレベルのCOX-2を発現する細胞を含む。
【００１４】定義 本発明の理解を容易にするために多数の用語および語句を下記に定義する。
【００１５】 本明細書に用いる「治療に有効な量」という用語は、患者に症状の回復または
生存の延長を生じさせる化合物量を意味する。治療に適切な効果は、疾患または
病状の1以上の症状をある程度緩和するか、または疾患または病状に関係した、
もしくはその原因である生理的な、または生化学的なパラメーターを部分的に、
もしくは完全に正常へと回復させる。
生存の延長を生じさせる化合物量を意味する。治療に適切な効果は、疾患または
病状の1以上の症状をある程度緩和するか、または疾患または病状に関係した、
もしくはその原因である生理的な、または生化学的なパラメーターを部分的に、
もしくは完全に正常へと回復させる。
【００１６】 本明細書に用いる「PPARγアゴニスト」という用語は、PPARγと組み合わせた
とき、該受容体に典型的なin vivoまたはin vitro反応（例えば、転写調節活性
）を直接もしくは間接的に刺激、もしくは増加する化合物または組成物を意味す
る。増加した反応は、当業者に公知の多種類のアッセイのいずれかにより測定で
きる。好ましいPPARγアゴニストは、チアゾリジンジオン化合物である。チアゾ
リジンジオン化合物には、トログリタゾン（troglitazone)、BRL 49653、ピオグ
リタゾン（pioglitazone)、シグリタゾン、WAY-120,744、エングリタゾン（engl
itazone）、AD 5075、ダーグリタゾン（darglitazone）、およびそれらの同族体
、類似体、誘導体、ならびに製薬上許容される塩があるが、これらに限定されな
い。
とき、該受容体に典型的なin vivoまたはin vitro反応（例えば、転写調節活性
）を直接もしくは間接的に刺激、もしくは増加する化合物または組成物を意味す
る。増加した反応は、当業者に公知の多種類のアッセイのいずれかにより測定で
きる。好ましいPPARγアゴニストは、チアゾリジンジオン化合物である。チアゾ
リジンジオン化合物には、トログリタゾン（troglitazone)、BRL 49653、ピオグ
リタゾン（pioglitazone)、シグリタゾン、WAY-120,744、エングリタゾン（engl
itazone）、AD 5075、ダーグリタゾン（darglitazone）、およびそれらの同族体
、類似体、誘導体、ならびに製薬上許容される塩があるが、これらに限定されな
い。
【００１７】 本明細書に用いる「調節エレメント」という用語は、１つの活性型転写調節タ
ンパク質、または活性型転写調節タンパク質を1つ以上含む複合体が、関連の遺
伝子または遺伝子群（異種遺伝子を含む）の発現を転写的にモジュレートするた
めに結合する、オリゴヌクレオチド配列の全体または一部分を含むデオキシリボ
ヌクレオチド配列を意味する。
ンパク質、または活性型転写調節タンパク質を1つ以上含む複合体が、関連の遺
伝子または遺伝子群（異種遺伝子を含む）の発現を転写的にモジュレートするた
めに結合する、オリゴヌクレオチド配列の全体または一部分を含むデオキシリボ
ヌクレオチド配列を意味する。
【００１８】 本明細書に用いる「転写調節タンパク質」という用語は、活性化した場合に、
本発明の調節エレメント/オリゴヌクレオチド配列に直接的に、もしくは転写調
節タンパク質の複合体または他のアダプタータンパク質を通じて間接的に結合し
、関連の遺伝子または遺伝子群の活性を転写的にモジュレートする、細胞質タン
パク質または核タンパク質を意味する。このように転写調節タンパク質は、本発
明のDNA調節エレメントに直接的に結合できる。または転写調節タンパク質は、
別のタンパク質と結合し、引き続き別のタンパク質が本発明のDNA調節エレメン
トに結合するか、または結合されることにより、間接的に調節エレメントに結合
できる。
本発明の調節エレメント/オリゴヌクレオチド配列に直接的に、もしくは転写調
節タンパク質の複合体または他のアダプタータンパク質を通じて間接的に結合し
、関連の遺伝子または遺伝子群の活性を転写的にモジュレートする、細胞質タン
パク質または核タンパク質を意味する。このように転写調節タンパク質は、本発
明のDNA調節エレメントに直接的に結合できる。または転写調節タンパク質は、
別のタンパク質と結合し、引き続き別のタンパク質が本発明のDNA調節エレメン
トに結合するか、または結合されることにより、間接的に調節エレメントに結合
できる。
【００１９】 本明細書に用いる「関連の遺伝子または遺伝子群の発現を転写的にモジュレー
トする」という用語は、該遺伝子または遺伝子群の転写率を変化させることを意
味する。
トする」という用語は、該遺伝子または遺伝子群の転写率を変化させることを意
味する。
【００２０】 本明細書に用いる「移植片」または「移植」という用語は、移植(grafting)、
埋め込み(implanting)、移植(transplanting)の際に使用する組織、ならびに身
体の1部分からの組織を他の部分へ転移すること、または1個体の組織を他の個体
へ転移すること、または身体内もしくは身体上に生体適合性の材料を導入するこ
とを意味する。「移植する」という用語は、身体の1部分からの組織を他の部分
へ、または他の個体へ移植（grafting）することを意味する。
埋め込み(implanting)、移植(transplanting)の際に使用する組織、ならびに身
体の1部分からの組織を他の部分へ転移すること、または1個体の組織を他の個体
へ転移すること、または身体内もしくは身体上に生体適合性の材料を導入するこ
とを意味する。「移植する」という用語は、身体の1部分からの組織を他の部分
へ、または他の個体へ移植（grafting）することを意味する。
【００２１】 本明細書に用いる「幹細胞」または「未分化細胞」という用語は、表現型およ
び遺伝子型的が同一の娘細胞、ならびに少なくとも1つの他の最終細胞型（例え
ば、最終分化細胞）を生じることができる自己更新細胞を意味する。
び遺伝子型的が同一の娘細胞、ならびに少なくとも1つの他の最終細胞型（例え
ば、最終分化細胞）を生じることができる自己更新細胞を意味する。
【００２２】 本明細書に用いる「中枢神経系」という用語は、硬膜内のすべての構造を意味
する。該構造には、脳および脊髄があるが、これらに限定されない。
する。該構造には、脳および脊髄があるが、これらに限定されない。
【００２３】 本明細書に用いる「宿主」および「被験者」という用語は、ヒトおよび非ヒト
動物（例えば、げっ歯類、節足動物、昆虫（例えば、双口類）、魚（例えば、ゼ
ブラフィッシュ）、非ヒト霊長類、ヒツジ、ウシ、反すう動物、ウサギ目、ブタ
、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、トリなど）を含む任意の動物（ただしこれらに限定
されない）を意味し、かかる動物は、特定の治療のレシピエントとなる。典型的
には、「宿主」、「患者」および「被験者」という用語は本明細書ではヒト被験
者に関して交換可能に用いられる。本明細書に使用する場合、「アルツハイマー
病にかかっている被験者」、「炎症性成分が原因の疾患にかかっている被験者」
および「中枢神経系損傷を患う被験者」という用語は、特定の疾患、損傷、また
は病状をそれぞれ有する、または有している可能性がある被験者を意味する。本
明細書に使用する「アルツハイマー病にかかりやすい被験者」および「炎症性成
分が原因の疾患にかかりやすい被験者」という用語は、特定の疾患、損傷、また
は病状を招くまたは発症するリスクがあるとして確認された被験者を意味する。
本明細書に使用する場合に、「炎症性成分が原因の疾患」という用語は、炎症性
要素に関連する疾患および病状を意味する。炎症性要素は、疾患または病状に関
連する症状、副作用、または原因となる事象を含みうる。炎症性成分が原因の疾
患には、発作、神経系の虚血性損傷、神経損傷（例えば、衝撃的な脳損傷、脊髄
損傷、神経系の外傷性損傷）、多発性硬化症および他の免疫媒介神経障害（例え
ば、ギヤン-バレー症候群およびその変異型、急性運動軸索神経障害（acute mot
or axonal neuropathy)、急性炎症脱髄性多発性神経障害（acute inflammatory
demyelinating polyneuropathy)およびフィッシャー症候群（Fisher Syndrome)
）、HIV/エイズ痴呆複合症および細菌性髄膜炎ならびにウイルス性髄膜炎がある
が、これらに限定されない。
動物（例えば、げっ歯類、節足動物、昆虫（例えば、双口類）、魚（例えば、ゼ
ブラフィッシュ）、非ヒト霊長類、ヒツジ、ウシ、反すう動物、ウサギ目、ブタ
、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、トリなど）を含む任意の動物（ただしこれらに限定
されない）を意味し、かかる動物は、特定の治療のレシピエントとなる。典型的
には、「宿主」、「患者」および「被験者」という用語は本明細書ではヒト被験
者に関して交換可能に用いられる。本明細書に使用する場合、「アルツハイマー
病にかかっている被験者」、「炎症性成分が原因の疾患にかかっている被験者」
および「中枢神経系損傷を患う被験者」という用語は、特定の疾患、損傷、また
は病状をそれぞれ有する、または有している可能性がある被験者を意味する。本
明細書に使用する「アルツハイマー病にかかりやすい被験者」および「炎症性成
分が原因の疾患にかかりやすい被験者」という用語は、特定の疾患、損傷、また
は病状を招くまたは発症するリスクがあるとして確認された被験者を意味する。
本明細書に使用する場合に、「炎症性成分が原因の疾患」という用語は、炎症性
要素に関連する疾患および病状を意味する。炎症性要素は、疾患または病状に関
連する症状、副作用、または原因となる事象を含みうる。炎症性成分が原因の疾
患には、発作、神経系の虚血性損傷、神経損傷（例えば、衝撃的な脳損傷、脊髄
損傷、神経系の外傷性損傷）、多発性硬化症および他の免疫媒介神経障害（例え
ば、ギヤン-バレー症候群およびその変異型、急性運動軸索神経障害（acute mot
or axonal neuropathy)、急性炎症脱髄性多発性神経障害（acute inflammatory
demyelinating polyneuropathy)およびフィッシャー症候群（Fisher Syndrome)
）、HIV/エイズ痴呆複合症および細菌性髄膜炎ならびにウイルス性髄膜炎がある
が、これらに限定されない。
【００２４】 本明細書に用いる「神経学的欠陥」という用語は、神経系を伴う、または神経
系に関する欠陥を意味する。神経系の組織または細胞の欠陥により引き起こされ
る神経学的欠陥もあれば、神経系に影響する組織または細胞の欠陥により起こる
神経学的欠陥もある。本明細書に使用する「神経学的欠陥のある哺乳動物」とい
う用語は、1つ以上の神経学的欠陥を有する哺乳動物を意味する。神経学的欠陥
が回復する場合には、宿主の状態が改善される。例えば、欠陥のある組織が、正
常の状態に部分的に、または完全にもどる場合、回復が起こり得る。しかし組織
が正常以下の状態のままであるが、他の点では、宿主に利益となるように変更さ
れる場合にも回復が起こり得る。
系に関する欠陥を意味する。神経系の組織または細胞の欠陥により引き起こされ
る神経学的欠陥もあれば、神経系に影響する組織または細胞の欠陥により起こる
神経学的欠陥もある。本明細書に使用する「神経学的欠陥のある哺乳動物」とい
う用語は、1つ以上の神経学的欠陥を有する哺乳動物を意味する。神経学的欠陥
が回復する場合には、宿主の状態が改善される。例えば、欠陥のある組織が、正
常の状態に部分的に、または完全にもどる場合、回復が起こり得る。しかし組織
が正常以下の状態のままであるが、他の点では、宿主に利益となるように変更さ
れる場合にも回復が起こり得る。
【００２５】 本明細書に用いる「障害」という用語は、創傷または外傷を意味し、または組
織での病理学的変化を意味する。
織での病理学的変化を意味する。
【００２６】 本明細書に用いる「非ヒト動物」という用語は、すべての非ヒト動物を意味す
る。該非ヒト動物には、脊椎動物（例えば、げっ歯類）、非ヒト霊長類、ヒツジ
、ウシ、反すう動物、ウサギ目、ブタ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、トリなどが含
まれるが、これらに限定されない。
る。該非ヒト動物には、脊椎動物（例えば、げっ歯類）、非ヒト霊長類、ヒツジ
、ウシ、反すう動物、ウサギ目、ブタ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、トリなどが含
まれるが、これらに限定されない。
【００２７】 本明細書に用いる「生物学的に活性な」という用語は、天然に存在する分子の
構造的、調節的、または生化学的機能を有するタンパク質または他の生物学的活
性分子（例えば、触媒RNA）を意味する。
構造的、調節的、または生化学的機能を有するタンパク質または他の生物学的活
性分子（例えば、触媒RNA）を意味する。
【００２８】 本明細書に用いる「アゴニスト」という用語は、生物学的活性分子と相互作用
する場合に、その生物学的活性分子の活性をモジュレートする生物学的活性分子
の変化（例えば、増強）を引き起こす分子を意味する。アゴニストには、タンパ
ク質、核酸、炭水化物、脂質、または生物学的活性分子と結合もしくは相互作用
する他のあらゆる分子が含まれるが、これらに限定されない。例えば、アゴニス
トは、RNAポリメラーゼと直接相互作用することにより、または転写因子もしく
はシグナル伝達経路を介して遺伝子転写活性を変更できる。
する場合に、その生物学的活性分子の活性をモジュレートする生物学的活性分子
の変化（例えば、増強）を引き起こす分子を意味する。アゴニストには、タンパ
ク質、核酸、炭水化物、脂質、または生物学的活性分子と結合もしくは相互作用
する他のあらゆる分子が含まれるが、これらに限定されない。例えば、アゴニス
トは、RNAポリメラーゼと直接相互作用することにより、または転写因子もしく
はシグナル伝達経路を介して遺伝子転写活性を変更できる。
【００２９】 本明細書に用いる「アンタゴニスト」もしくは「インヒビター」という用語は
、生物学的活性分子と相互作用する場合に、生物学的活性分子の生物学的活性を
ブロックまたはモジュレートする分子を意味する。アンタゴニストおよびインヒ
ビターには、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質または生物学的活性分子と結合
もしくは相互作用する他のあらゆる分子が含まれるが、これらに限定されない。
インヒビターおよびアンタゴニストは、完全な細胞、器官または生物の生物学に
影響を及ぼすことができる（例えば、ニューロンの変性および死を遅くしたり、
または防止するインヒビター）。
、生物学的活性分子と相互作用する場合に、生物学的活性分子の生物学的活性を
ブロックまたはモジュレートする分子を意味する。アンタゴニストおよびインヒ
ビターには、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質または生物学的活性分子と結合
もしくは相互作用する他のあらゆる分子が含まれるが、これらに限定されない。
インヒビターおよびアンタゴニストは、完全な細胞、器官または生物の生物学に
影響を及ぼすことができる（例えば、ニューロンの変性および死を遅くしたり、
または防止するインヒビター）。
【００３０】 本明細書に用いる「モジュレートする」という用語は、生物学的活性分子の生
物学的活性の変化を意味する。モジュレーションは活性の増加もしくは減少、結
合特性の変化、または生物学的活性分子の生物学的、機能的、もしくは免疫学的
性質の他のいかなる変化であっても良い。
物学的活性の変化を意味する。モジュレーションは活性の増加もしくは減少、結
合特性の変化、または生物学的活性分子の生物学的、機能的、もしくは免疫学的
性質の他のいかなる変化であっても良い。
【００３１】 本明細書に用いる「核酸分子」という用語は、DNAまたはRNAを含むが、これら
に限定されないあらゆる核酸含有分子を意味する。該用語には、DNAおよびRNAの
公知の塩基類似体を含む配列が包含される。DNAおよびRNAの公知の塩基類似体に
は、4-アセチルシトシン、8-ヒドロキシ-N6-メチルアデノシン、アジリジニルシ
トシン、プソイドイソシトシン、5-(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、
5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-
チオウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、
イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルアデニン、1-メチルプソイド
ウラシル、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メ
チルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-
メチルアデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキ
シアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルケオシン(mannosylqueosine)
、5'-メトキシカルボニルメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-
N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル
-5-オキシ酢酸、オキシブトキソシン(oxybutoxosine)、プソイドウラシル、ケオ
シン(queosine)、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル
、4-チオウラシル, 5-メチルウラシル、N-ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステ
ルおよび2,6-ジアミノプリンがあるが、これらに限定されない。
に限定されないあらゆる核酸含有分子を意味する。該用語には、DNAおよびRNAの
公知の塩基類似体を含む配列が包含される。DNAおよびRNAの公知の塩基類似体に
は、4-アセチルシトシン、8-ヒドロキシ-N6-メチルアデノシン、アジリジニルシ
トシン、プソイドイソシトシン、5-(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、
5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-
チオウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、
イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルアデニン、1-メチルプソイド
ウラシル、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メ
チルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-
メチルアデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキ
シアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルケオシン(mannosylqueosine)
、5'-メトキシカルボニルメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-
N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル
-5-オキシ酢酸、オキシブトキソシン(oxybutoxosine)、プソイドウラシル、ケオ
シン(queosine)、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル
、4-チオウラシル, 5-メチルウラシル、N-ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステ
ルおよび2,6-ジアミノプリンがあるが、これらに限定されない。
【００３２】 「遺伝子」という用語は、ポリペプチドもしくは前駆体の産生のために必要な
コード配列を含む核酸(例えばDNA)配列を意味する。そのポリペプチドは、完全
長のコード配列により、または完全長のもしくは断片の所望の活性もしくは機能
的性質(例えば、酵素活性、リガンド結合性、シグナル伝達など)が維持されてい
る限りにおいては、コード配列の任意の部分によりコードされ得る。該用語はま
た、構造遺伝子のコード領域、およびコード領域の5'末端および3'末端の両方で
末端から約1kb以上の距離でコード領域に近接した配列であって、その遺伝子が
完全長のmRNAの長さに対応するようなものも包含する。コード領域の5'末端に位
置し、かつmRNA上に存在する配列は、5'非翻訳配列と呼ぶ。コード領域の3'末端
または下流に位置し、かつmRNA上に存在する配列は3'非翻訳配列と呼ぶ。「遺伝
子」と言う用語は、cDNAおよび遺伝子のゲノム形態の両方を包含する。遺伝子の
ゲノム形態もしくはクローンは、「イントロン」、もしくは「介在領域」、もし
くは「介在配列」と呼ばれる非コード領域で遮断されたコード領域を含有する。
イントロンは、核RNA（hnRNA）に転写される遺伝子のセグメントである；イント
ロンはエンハンサーなどの調節エレメントを含んでいることもある。イントロン
は、核転写産物もしくは一次転写産物から除去もしくは「スプライスされて外さ
れる」；従ってイントロンはメッセンジャーRNA（mRNA）転写産物中には存在し
ない。mRNAは、翻訳の過程で発生期のポリペプチドのアミノ酸配列もしくは序列
を特定する機能を有する。
コード配列を含む核酸(例えばDNA)配列を意味する。そのポリペプチドは、完全
長のコード配列により、または完全長のもしくは断片の所望の活性もしくは機能
的性質(例えば、酵素活性、リガンド結合性、シグナル伝達など)が維持されてい
る限りにおいては、コード配列の任意の部分によりコードされ得る。該用語はま
た、構造遺伝子のコード領域、およびコード領域の5'末端および3'末端の両方で
末端から約1kb以上の距離でコード領域に近接した配列であって、その遺伝子が
完全長のmRNAの長さに対応するようなものも包含する。コード領域の5'末端に位
置し、かつmRNA上に存在する配列は、5'非翻訳配列と呼ぶ。コード領域の3'末端
または下流に位置し、かつmRNA上に存在する配列は3'非翻訳配列と呼ぶ。「遺伝
子」と言う用語は、cDNAおよび遺伝子のゲノム形態の両方を包含する。遺伝子の
ゲノム形態もしくはクローンは、「イントロン」、もしくは「介在領域」、もし
くは「介在配列」と呼ばれる非コード領域で遮断されたコード領域を含有する。
イントロンは、核RNA（hnRNA）に転写される遺伝子のセグメントである；イント
ロンはエンハンサーなどの調節エレメントを含んでいることもある。イントロン
は、核転写産物もしくは一次転写産物から除去もしくは「スプライスされて外さ
れる」；従ってイントロンはメッセンジャーRNA（mRNA）転写産物中には存在し
ない。mRNAは、翻訳の過程で発生期のポリペプチドのアミノ酸配列もしくは序列
を特定する機能を有する。
【００３３】 本明細書に用いる「遺伝子発現」という用語は、遺伝子の「転写」を介して（
すなわち、RNAポリメラーゼの酵素的作用を介して）遺伝子にコードされる遺伝
子情報をRNA（例えば、mRNA、rRNA、tRNA、またはsnRNA）に変換する過程、およ
びタンパク質をコードする遺伝子の場合は、mRNAの「翻訳」を介してタンパク質
に変換する過程を意味する。遺伝子発現は、この過程の多くの段階で調節できる
。「アップレギュレーション」または「活性化」は、遺伝子発現産物（すなわち
、RNAまたはタンパク質）の産生を増加する調節を意味し、一方「ダウンレギュ
レーション」または「抑制」は、産生を減少する調節を意味する。アップレギュ
レーションまたはダウンレギュレーションに関与する分子（例えば、転写因子）
は、しばしばそれぞれ「アクチベータ−」および「リプレッサー」と呼ばれる。
すなわち、RNAポリメラーゼの酵素的作用を介して）遺伝子にコードされる遺伝
子情報をRNA（例えば、mRNA、rRNA、tRNA、またはsnRNA）に変換する過程、およ
びタンパク質をコードする遺伝子の場合は、mRNAの「翻訳」を介してタンパク質
に変換する過程を意味する。遺伝子発現は、この過程の多くの段階で調節できる
。「アップレギュレーション」または「活性化」は、遺伝子発現産物（すなわち
、RNAまたはタンパク質）の産生を増加する調節を意味し、一方「ダウンレギュ
レーション」または「抑制」は、産生を減少する調節を意味する。アップレギュ
レーションまたはダウンレギュレーションに関与する分子（例えば、転写因子）
は、しばしばそれぞれ「アクチベータ−」および「リプレッサー」と呼ばれる。
【００３４】 本明細書で「アミノ酸配列」という用語が天然に存在するタンパク質分子のア
ミノ酸配列を意味して用いられる場合には、「アミノ酸配列」、および「ポリペ
プチド」もしくは「タンパク質」などの類似の用語は、そこで述べられているタ
ンパク質分子に関連する完全な、天然のアミノ酸配列に限定することを意味した
ものではない。
ミノ酸配列を意味して用いられる場合には、「アミノ酸配列」、および「ポリペ
プチド」もしくは「タンパク質」などの類似の用語は、そこで述べられているタ
ンパク質分子に関連する完全な、天然のアミノ酸配列に限定することを意味した
ものではない。
【００３５】 遺伝子のゲノム形態は、イントロンを含有することに加え、配列の5'末端およ
び3'末端の両方に位置する配列をも含むことができ、それはRNA転写産物上に存
在する。これらの配列は、「隣接」または「フランキング」配列もしくは領域と
呼ばれる(これらの隣接配列は、mRNA転写産物上に存在する非翻訳配列の5'側も
しくは3'側に位置する)。5'側隣接領域は、遺伝子の転写を調節する、もしくは
影響を与えるプロモーターおよびエンハンサーなどの調節配列を含有することが
できる。3'側隣接配列は転写の終了、転写後の切断、およびポリアデニル化を指
令する配列を含有することができる。
び3'末端の両方に位置する配列をも含むことができ、それはRNA転写産物上に存
在する。これらの配列は、「隣接」または「フランキング」配列もしくは領域と
呼ばれる(これらの隣接配列は、mRNA転写産物上に存在する非翻訳配列の5'側も
しくは3'側に位置する)。5'側隣接領域は、遺伝子の転写を調節する、もしくは
影響を与えるプロモーターおよびエンハンサーなどの調節配列を含有することが
できる。3'側隣接配列は転写の終了、転写後の切断、およびポリアデニル化を指
令する配列を含有することができる。
【００３６】 「野生型」という用語は、天然に存在する供給源から単離された場合の遺伝子
もしくは遺伝子産物の特徴を有する遺伝子もしくは遺伝子産物を意味する。野生
型遺伝子は、ある集団で最も頻繁に観察されるものであり、したがって遺伝子の
「正常」もしくは「野生型」形態と任意に称される。これに対して、「修飾型」
もしくは「変異体」 という用語は、野生型の遺伝子もしくは遺伝子産物と比較
した場合に、配列および/または機能的特性が修飾(すなわち、変更)されている
遺伝子もしくは遺伝子産物を意味する。天然に存在する変異体も単離しうること
は注記すべきである；それらは、野生型の遺伝子もしくは遺伝子産物と比較した
場合、特性が変更されているという事実により同定される。
もしくは遺伝子産物の特徴を有する遺伝子もしくは遺伝子産物を意味する。野生
型遺伝子は、ある集団で最も頻繁に観察されるものであり、したがって遺伝子の
「正常」もしくは「野生型」形態と任意に称される。これに対して、「修飾型」
もしくは「変異体」 という用語は、野生型の遺伝子もしくは遺伝子産物と比較
した場合に、配列および/または機能的特性が修飾(すなわち、変更)されている
遺伝子もしくは遺伝子産物を意味する。天然に存在する変異体も単離しうること
は注記すべきである；それらは、野生型の遺伝子もしくは遺伝子産物と比較した
場合、特性が変更されているという事実により同定される。
【００３７】 本明細書に用いる「オリゴヌクレオチド」という用語は、短い長さの1本鎖ポ
リヌクレオチド鎖を意味する。オリゴヌクレオチドは、典型的には長さ100残基
以下（例えば、15と50の間）であるが、しかし本明細書で用いる場合、該用語は
、より長いポリヌクレオチド鎖も包含することを意図している。オリゴヌクレオ
チドは、しばしばその長さによって呼ばれる。例えば、24残基のオリゴヌクレオ
チドは、「24-mer」と呼ばれる。オリゴヌクレオチドは、自己ハイブリダイズす
るかまたは他のポリヌクレオチドとハイブリダイズすることにより2次構造もし
くは3次構造を形成することができる。該構造には、2本鎖、ヘアピン、十字形、
ベンドおよび3本鎖があるが、これらに限定されない。
リヌクレオチド鎖を意味する。オリゴヌクレオチドは、典型的には長さ100残基
以下（例えば、15と50の間）であるが、しかし本明細書で用いる場合、該用語は
、より長いポリヌクレオチド鎖も包含することを意図している。オリゴヌクレオ
チドは、しばしばその長さによって呼ばれる。例えば、24残基のオリゴヌクレオ
チドは、「24-mer」と呼ばれる。オリゴヌクレオチドは、自己ハイブリダイズす
るかまたは他のポリヌクレオチドとハイブリダイズすることにより2次構造もし
くは3次構造を形成することができる。該構造には、2本鎖、ヘアピン、十字形、
ベンドおよび3本鎖があるが、これらに限定されない。
【００３８】 本明細書に用いる「ベクター」という用語は、DNAセグメントを一方の細胞か
ら他方へ転移する核酸分子に関して用いられる。「ビヒクル」という用語は、時
に「ベクター」と互換的に使用される。ベクターは、しばしばプラスミド、バク
テリオファージ、植物ウイルスもしくは動物ウイルスに由来する。
ら他方へ転移する核酸分子に関して用いられる。「ビヒクル」という用語は、時
に「ベクター」と互換的に使用される。ベクターは、しばしばプラスミド、バク
テリオファージ、植物ウイルスもしくは動物ウイルスに由来する。
【００３９】 本明細書に用いる「発現ベクター」という用語は、所望のコード配列ならびに
特定の宿主生物において機能的に連結された前記コード配列の発現に必要な適当
な核酸配列を含有する組換えDNA分子を意味する。原核生物における発現に必要
な核酸配列には、一般にプロモーター、オペレーター（任意）、およびリボソー
ム結合部位、ならびにしばしば他の配列が含まれる。真核細胞がプロモーター、
エンハンサー、ならびに終結およびポリアデニル化シグナルを利用することは公
知である。
特定の宿主生物において機能的に連結された前記コード配列の発現に必要な適当
な核酸配列を含有する組換えDNA分子を意味する。原核生物における発現に必要
な核酸配列には、一般にプロモーター、オペレーター（任意）、およびリボソー
ム結合部位、ならびにしばしば他の配列が含まれる。真核細胞がプロモーター、
エンハンサー、ならびに終結およびポリアデニル化シグナルを利用することは公
知である。
【００４０】 真核細胞の転写調節シグナルは、「プロモーター」および「エンハンサー」エ
レメントを含む。プロモーターとエンハンサーは、転写に関与する細胞性タンパ
ク質と特異的に相互作用するDNA配列の短いアレイからなる(T. Maniatisら, Sci
ence 236:1237[1987])。プロモーターおよびエンハンサーエレメントは、酵母、
昆虫および哺乳動物細胞の遺伝子を含めた種々の真核細胞供給源ならびにウイル
スから単離されている(類似の調節エレメント、すなわちプロモーターは原核細
胞中にも認められる)。特定のプロモーターおよびエンハンサーの選択は、目的
のタンパク質の発現のために用いられる細胞型に依存する。幾つかの真核細胞プ
ロモーターおよびエンハンサーは、広範囲の宿主に用いるが、一方その他のもの
は、細胞型の限定されたサブセットにおいてのみ機能的である(概説としてS. D.
Vossら, Trends Biochem. Sci., 11:287[1986]; およびT. Maniatisら, 同上
、を参照されたい)。例えば、SV40初期遺伝子エンハンサーは、多数の哺乳動物
種に由来する多様な細胞型中で顕著な活性を有し、哺乳動物細胞中でのタンパク
質の発現に広く用いられている(R. Dijkemaら, EMBO J., 4:761[1985])。広範囲
の哺乳動物細胞型中で活性するプロモーター/エンハンサーエレメントの例を他
に2つ挙げれば、ヒト伸長因子1α遺伝子からのもの(T. Uetsukiら, J. Biol. Ch
em., 264:5791 [1989]; D. W. Kimら, Gene 91:217 [1990]; およびS. Mizushim
aとS. Nagata, Nuc. Acids. Res., 18:5322 [1990])、ならびにラウス肉腫ウイ
ルス(C.M. Gormanら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777 [1982])およびヒト
サイトメガロウイルス(M. Boshartら, Cell 41:521 [1985])の長末端反復配列か
らのものである。幾つかのプロモーターエレメントは、組織特異的方法で遺伝子
発現を指令するのに役立つ。
レメントを含む。プロモーターとエンハンサーは、転写に関与する細胞性タンパ
ク質と特異的に相互作用するDNA配列の短いアレイからなる(T. Maniatisら, Sci
ence 236:1237[1987])。プロモーターおよびエンハンサーエレメントは、酵母、
昆虫および哺乳動物細胞の遺伝子を含めた種々の真核細胞供給源ならびにウイル
スから単離されている(類似の調節エレメント、すなわちプロモーターは原核細
胞中にも認められる)。特定のプロモーターおよびエンハンサーの選択は、目的
のタンパク質の発現のために用いられる細胞型に依存する。幾つかの真核細胞プ
ロモーターおよびエンハンサーは、広範囲の宿主に用いるが、一方その他のもの
は、細胞型の限定されたサブセットにおいてのみ機能的である(概説としてS. D.
Vossら, Trends Biochem. Sci., 11:287[1986]; およびT. Maniatisら, 同上
、を参照されたい)。例えば、SV40初期遺伝子エンハンサーは、多数の哺乳動物
種に由来する多様な細胞型中で顕著な活性を有し、哺乳動物細胞中でのタンパク
質の発現に広く用いられている(R. Dijkemaら, EMBO J., 4:761[1985])。広範囲
の哺乳動物細胞型中で活性するプロモーター/エンハンサーエレメントの例を他
に2つ挙げれば、ヒト伸長因子1α遺伝子からのもの(T. Uetsukiら, J. Biol. Ch
em., 264:5791 [1989]; D. W. Kimら, Gene 91:217 [1990]; およびS. Mizushim
aとS. Nagata, Nuc. Acids. Res., 18:5322 [1990])、ならびにラウス肉腫ウイ
ルス(C.M. Gormanら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777 [1982])およびヒト
サイトメガロウイルス(M. Boshartら, Cell 41:521 [1985])の長末端反復配列か
らのものである。幾つかのプロモーターエレメントは、組織特異的方法で遺伝子
発現を指令するのに役立つ。
【００４１】 本明細書に用いる「プロモーター/エンハンサー」という用語は、プロモータ
ーおよびエンハンサーの両方の機能(すなわちプロモーターエレメントおよびエ
ンハンサーエレメントにより提供される機能、これらの機能についての考察は上
述を参照されたい)を提供することのできる配列を含有するDNAのセグメントを意
味する。例えば、レトロウイルスの長末端反復配列は、プロモーターおよびエン
ハンサー機能の両方を含有する。エンハンサー/プロモーターは「内在性」、ま
たは「外来性」、もしくは「異種性」であり得る。「内在性」エンハンサー/プ
ロモーターは、ゲノム中の所定の遺伝子に天然に連結されているものである。「
外来性」もしくは「異種性」のエンハンサー/プロモーターは、連結されたエン
ハンサー/プロモーターにより遺伝子の転写が指令されるように、遺伝子操作(す
なわちクローニングおよび組換えのような分子生物学的技法)によりその遺伝子
に並ぶ位置に置かれたものである。
ーおよびエンハンサーの両方の機能(すなわちプロモーターエレメントおよびエ
ンハンサーエレメントにより提供される機能、これらの機能についての考察は上
述を参照されたい)を提供することのできる配列を含有するDNAのセグメントを意
味する。例えば、レトロウイルスの長末端反復配列は、プロモーターおよびエン
ハンサー機能の両方を含有する。エンハンサー/プロモーターは「内在性」、ま
たは「外来性」、もしくは「異種性」であり得る。「内在性」エンハンサー/プ
ロモーターは、ゲノム中の所定の遺伝子に天然に連結されているものである。「
外来性」もしくは「異種性」のエンハンサー/プロモーターは、連結されたエン
ハンサー/プロモーターにより遺伝子の転写が指令されるように、遺伝子操作(す
なわちクローニングおよび組換えのような分子生物学的技法)によりその遺伝子
に並ぶ位置に置かれたものである。
【００４２】 発現ベクターにおける「スプライシングシグナル」の存在は、しばしば組換え
転写産物の高レベル発現をもたらす。スプライシングシグナルは、RNAの一次転
写産物からのイントロンの除去を媒介し、スプライス供与部位および受容部位か
らなる(J. Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第二版, Co
ld Spring Harbor Laboratory Press, New York [1989], pp. 16.7-16.8)。一般
に使用するスプライス供与部位および受容部位は、SV40の16S RNA由来のスプラ
イス部位である。
転写産物の高レベル発現をもたらす。スプライシングシグナルは、RNAの一次転
写産物からのイントロンの除去を媒介し、スプライス供与部位および受容部位か
らなる(J. Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第二版, Co
ld Spring Harbor Laboratory Press, New York [1989], pp. 16.7-16.8)。一般
に使用するスプライス供与部位および受容部位は、SV40の16S RNA由来のスプラ
イス部位である。
【００４３】 真核細胞の組換えDNA配列の効率的な発現には、得られた転写産物の効率的な
終結およびポリアデニル化を指令するシグナルの発現が必要である。転写終結シ
グナルは、一般にポリアデニル化シグナルの下流で見られ、長さは数百ヌクレオ
チドである。本明細書で用いる「ポリA部位」または「ポリA配列」とは、新生RN
A転写産物の終結およびポリアデニル化の両方を指令するDNA配列を意味する。ポ
リAテイル（尾部）を欠いた転写産物は不安定であり、かつ急速に分解されるた
め、組換え転写産物を効率的にポリアデニル化することが望ましい。発現ベクタ
ーにおいて用いられるポリAシグナルは、「異種性」または「内在性」であって
よい。内在性ポリAシグナルは、ゲノムにおける所定の遺伝子のコード領域の3’
末端で本来見られるものである。異種性ポリAシグナルは、ある遺伝子から単離
され、別の遺伝子の3’側に配置されるものである。一般に使用される異種性ポ
リAシグナルは、SV40ポリAシグナルである。SV40ポリAシグナルは、237bp BamHI
/BcII制限断片上にあり、終結およびポリアデニル化の両方を指令する (J. Samb
rook, 前記, pp. 16.6-16.7)。
終結およびポリアデニル化を指令するシグナルの発現が必要である。転写終結シ
グナルは、一般にポリアデニル化シグナルの下流で見られ、長さは数百ヌクレオ
チドである。本明細書で用いる「ポリA部位」または「ポリA配列」とは、新生RN
A転写産物の終結およびポリアデニル化の両方を指令するDNA配列を意味する。ポ
リAテイル（尾部）を欠いた転写産物は不安定であり、かつ急速に分解されるた
め、組換え転写産物を効率的にポリアデニル化することが望ましい。発現ベクタ
ーにおいて用いられるポリAシグナルは、「異種性」または「内在性」であって
よい。内在性ポリAシグナルは、ゲノムにおける所定の遺伝子のコード領域の3’
末端で本来見られるものである。異種性ポリAシグナルは、ある遺伝子から単離
され、別の遺伝子の3’側に配置されるものである。一般に使用される異種性ポ
リAシグナルは、SV40ポリAシグナルである。SV40ポリAシグナルは、237bp BamHI
/BcII制限断片上にあり、終結およびポリアデニル化の両方を指令する (J. Samb
rook, 前記, pp. 16.6-16.7)。
【００４４】 また真核細胞発現ベクターは、「ウイルスレプリコン」または「ウイルスの複
製起点」も含有し得る。ウイルスレプリコンは、好適な複製因子を発現する宿主
細胞においてベクターの染色体外複製を可能にするウイルスDNA配列である。SV4
0またはポリオーマウイルスのいずれかの複製起点を含有するベクターは、好適
なウイルスT抗原を発現する細胞において多くの「コピー数」(104コピー/細胞ま
で)複製する。ウシパピローマウイルスまたはエプスタイン-バールウイルス由来
のレプリコンを含有するベクターは、「少ないコピー数」(〜100コピー/細胞)で
染色体外複製する。
製起点」も含有し得る。ウイルスレプリコンは、好適な複製因子を発現する宿主
細胞においてベクターの染色体外複製を可能にするウイルスDNA配列である。SV4
0またはポリオーマウイルスのいずれかの複製起点を含有するベクターは、好適
なウイルスT抗原を発現する細胞において多くの「コピー数」(104コピー/細胞ま
で)複製する。ウシパピローマウイルスまたはエプスタイン-バールウイルス由来
のレプリコンを含有するベクターは、「少ないコピー数」(〜100コピー/細胞)で
染色体外複製する。
【００４５】 「相同」という用語は、相補性の程度を意味する。これには部分的相同または
完全相同（すなわち同一）があり得る。部分的相補配列は、完全相補配列が、「
実質的に相同」という機能的な用語を用いて称される標的核酸とハイブリダイズ
するのを少なくとも部分的に阻害するものである。完全相補的配列の標的配列と
のハイブリダイゼーションの阻害については、低ストリンジェンシー条件下にて
ハイブリダイゼーションアッセイ（サザンまたはノーザンブロット法、溶液ハイ
ブリダイゼーションおよび類似法）を用いて試験し得る。実質的に相同な配列ま
たはプローブは、低ストリンジェンシー条件下にて完全に相同なものと標的との
結合（すなわち、ハイブリダイゼーション）について競合し、これを阻害する。
これは、低ストリンジェンシー条件が非特異的結合を可能とするようなものであ
るとは言えないまでも、低ストリンジェンシー条件には、2つの配列の互いの結
合が特異的（すなわち、選択的）な相互作用であることを必要とする。非特異的
結合の不在については、部分的な程度の相補性さえ欠く（例えば、約30%未満の
同一性）第2の標的を使用して試験し得る；非特異的結合の不在下では、プロー
ブは非相補的な第2の標的とはハイブリダイズしないであろう。
完全相同（すなわち同一）があり得る。部分的相補配列は、完全相補配列が、「
実質的に相同」という機能的な用語を用いて称される標的核酸とハイブリダイズ
するのを少なくとも部分的に阻害するものである。完全相補的配列の標的配列と
のハイブリダイゼーションの阻害については、低ストリンジェンシー条件下にて
ハイブリダイゼーションアッセイ（サザンまたはノーザンブロット法、溶液ハイ
ブリダイゼーションおよび類似法）を用いて試験し得る。実質的に相同な配列ま
たはプローブは、低ストリンジェンシー条件下にて完全に相同なものと標的との
結合（すなわち、ハイブリダイゼーション）について競合し、これを阻害する。
これは、低ストリンジェンシー条件が非特異的結合を可能とするようなものであ
るとは言えないまでも、低ストリンジェンシー条件には、2つの配列の互いの結
合が特異的（すなわち、選択的）な相互作用であることを必要とする。非特異的
結合の不在については、部分的な程度の相補性さえ欠く（例えば、約30%未満の
同一性）第2の標的を使用して試験し得る；非特異的結合の不在下では、プロー
ブは非相補的な第2の標的とはハイブリダイズしないであろう。
【００４６】 非常に多くの条件を使用して、低ストリンジェンシー条件を構成しうることは
、当技術分野では十分に公知であり、プローブの長さおよび種類（DNA、RNA、塩
基組成）および標的の種類（DNA、RNA、塩基組成、溶解状態で存在しているか、
または固定化されているかなど）をはじめとする要因、ならびに塩および他の成
分の濃度（例えばホルムアミド、デキストラン硫酸、ポリエチレングリコールの
存在または不在）を考慮して、ハイブリダイゼーション溶液を変え、前記に列挙
した条件とは異なるが同等である低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーショ
ン条件を得てもよい。さらに、当技術分野では高ストリンジェンシー条件下にて
ハイブリダイゼーションを促進する条件も公知である（例えばハイブリダイゼー
ションおよび／または洗浄ステップの温度を高めたり、ハイブリダイゼーション
溶液においてホルムアミドを使用するなど。下記の「ストリンジェンシー」の定
義を参照されたい）。
、当技術分野では十分に公知であり、プローブの長さおよび種類（DNA、RNA、塩
基組成）および標的の種類（DNA、RNA、塩基組成、溶解状態で存在しているか、
または固定化されているかなど）をはじめとする要因、ならびに塩および他の成
分の濃度（例えばホルムアミド、デキストラン硫酸、ポリエチレングリコールの
存在または不在）を考慮して、ハイブリダイゼーション溶液を変え、前記に列挙
した条件とは異なるが同等である低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーショ
ン条件を得てもよい。さらに、当技術分野では高ストリンジェンシー条件下にて
ハイブリダイゼーションを促進する条件も公知である（例えばハイブリダイゼー
ションおよび／または洗浄ステップの温度を高めたり、ハイブリダイゼーション
溶液においてホルムアミドを使用するなど。下記の「ストリンジェンシー」の定
義を参照されたい）。
【００４７】 cDNAまたはゲノムクローンのような2本鎖核酸配列に関して用いる場合、「実
質的に相同」という用語は、前記に記載した低ストリンジェンシー条件下にて2
本鎖核酸配列のいずれかまたは両方とハイブリダイズ可能な任意のプローブを意
味する。
質的に相同」という用語は、前記に記載した低ストリンジェンシー条件下にて2
本鎖核酸配列のいずれかまたは両方とハイブリダイズ可能な任意のプローブを意
味する。
【００４８】 遺伝子は、RNAの一次転写産物の種々のスプライシングにより産生される多様
なRNA種を産生し得る。同一遺伝子のスプライス変異体であるcDNAは、配列同一
性または完全相同性（両cDNA上に同一のエキソンまたは同一のエキソンの一部分
の存在を示す）を有する領域および完全非同一性（例えば、cDNA1上にはエキソ
ン「A」の存在を示し、cDNA2はその代わりにエキソン「B」を含有する）を有す
る領域を含有する。2つのcDNAは、配列同一性の領域を含有するため、両方とも
、両cDNAで見られる配列を含有する遺伝子全体または遺伝子の一部分に由来する
プローブとハイブリダイズするだろう；それゆえ2つのスプライス変異体は、該
プローブに対して、および互いに対して実質的に相同である。
なRNA種を産生し得る。同一遺伝子のスプライス変異体であるcDNAは、配列同一
性または完全相同性（両cDNA上に同一のエキソンまたは同一のエキソンの一部分
の存在を示す）を有する領域および完全非同一性（例えば、cDNA1上にはエキソ
ン「A」の存在を示し、cDNA2はその代わりにエキソン「B」を含有する）を有す
る領域を含有する。2つのcDNAは、配列同一性の領域を含有するため、両方とも
、両cDNAで見られる配列を含有する遺伝子全体または遺伝子の一部分に由来する
プローブとハイブリダイズするだろう；それゆえ2つのスプライス変異体は、該
プローブに対して、および互いに対して実質的に相同である。
【００４９】 1本鎖核酸配列に関して用いる場合、「実質的に相同」という用語は、前記に
記載の低ストリンジェンシー条件下にて1本鎖核酸配列とハイブリダイズ可能な
任意のプローブ（すなわち1本鎖核酸配列に相補的なもの）を意味する。
記載の低ストリンジェンシー条件下にて1本鎖核酸配列とハイブリダイズ可能な
任意のプローブ（すなわち1本鎖核酸配列に相補的なもの）を意味する。
【００５０】 本明細書に用いる「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的な核酸の
対合に関して用いられる。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーショ
ンの強さ（すなわち、核酸間の結合強度）は、核酸間の相補性の程度、関連する
条件のストリンジェンシー、形成されたハイブリッドのTm、および核酸内のG:C
比率などの因子により強い影響を受ける。構造的に相補的核酸の対合（pairing)
を含む単一の分子は「自己ハイブリダイズ」すると言われる。
対合に関して用いられる。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーショ
ンの強さ（すなわち、核酸間の結合強度）は、核酸間の相補性の程度、関連する
条件のストリンジェンシー、形成されたハイブリッドのTm、および核酸内のG:C
比率などの因子により強い影響を受ける。構造的に相補的核酸の対合（pairing)
を含む単一の分子は「自己ハイブリダイズ」すると言われる。
【００５１】 本明細書に用いる「Tm」という用語は、「融解温度」に関して用いられる。融
解温度は、2本鎖核酸分子の集団が1本鎖に半分が分離する温度である。核酸のTm の算出式については当技術分野で公知である。標準対照により示されるように、
核酸が1M NaCl水溶液中に存在する場合、Tm値の簡易推定値を式: Tm = 81.5+0.4
1（%G+C）により算出し得る（例えば、AndersonおよびYoung, Quantitative Fil
ter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization [1985]を参照されたい）
。他の参考文献では、Tmの算出に関して構造ならびに配列特性を考慮に入れたよ
り精巧な計算値が挙げられている。
解温度は、2本鎖核酸分子の集団が1本鎖に半分が分離する温度である。核酸のTm の算出式については当技術分野で公知である。標準対照により示されるように、
核酸が1M NaCl水溶液中に存在する場合、Tm値の簡易推定値を式: Tm = 81.5+0.4
1（%G+C）により算出し得る（例えば、AndersonおよびYoung, Quantitative Fil
ter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization [1985]を参照されたい）
。他の参考文献では、Tmの算出に関して構造ならびに配列特性を考慮に入れたよ
り精巧な計算値が挙げられている。
【００５２】 本明細書に用いる「ストリンジェンシー」という用語は、温度、イオン強度お
よび有機溶媒などの他の化合物の存在についての条件に関して用いられ、その条
件下では核酸ハイブリダイゼーションが行われる。「高ストリンジェンシー」条
件では、高頻度の相補的塩基配列を有する核酸断片間でのみ核酸塩基対合が起こ
る。このように遺伝学的に異なる生物由来の核酸では、相補的配列の頻度が一般
に低いため、「弱い」または「低い」ストリンジェンシー条件がしばしば必要で
ある。
よび有機溶媒などの他の化合物の存在についての条件に関して用いられ、その条
件下では核酸ハイブリダイゼーションが行われる。「高ストリンジェンシー」条
件では、高頻度の相補的塩基配列を有する核酸断片間でのみ核酸塩基対合が起こ
る。このように遺伝学的に異なる生物由来の核酸では、相補的配列の頻度が一般
に低いため、「弱い」または「低い」ストリンジェンシー条件がしばしば必要で
ある。
【００５３】 「増幅」は、鋳型特異性に関連する核酸複製の特殊な場合である。「増幅」は
、非特異的鋳型複製（すなわち、鋳型依存的であるが、特異的な鋳型に依存しな
い複製）と対比される。本明細書での鋳型特異性は、複製の忠実度（すなわち、
適当なポリヌクレオチド配列の合成）および（リボまたはデオキシリボ）ヌクレ
オチド特異性とは区別される。鋳型特異性は、「標的」特異性に関して記載され
ることが多い。標的配列は、それらが他の核酸から選別されることを要求される
という意味で「標的」である。増幅技術は、主としてこの選別をするために設計
されている。
、非特異的鋳型複製（すなわち、鋳型依存的であるが、特異的な鋳型に依存しな
い複製）と対比される。本明細書での鋳型特異性は、複製の忠実度（すなわち、
適当なポリヌクレオチド配列の合成）および（リボまたはデオキシリボ）ヌクレ
オチド特異性とは区別される。鋳型特異性は、「標的」特異性に関して記載され
ることが多い。標的配列は、それらが他の核酸から選別されることを要求される
という意味で「標的」である。増幅技術は、主としてこの選別をするために設計
されている。
【００５４】 鋳型特異性は、酵素を選択することでほとんどの増幅技術において達成される
。増幅酵素は、それらが用いられる条件下にて、核酸の不均質混合物中の特異的
核酸配列だけを処理するであろう酵素である。例えば、Qβレプリカーゼの場合
、MDV-1 RNAは、該レプリカーゼの特異的な鋳型である (D.L. Kacianら, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 69: 3038 [1972])。他の核酸は該増幅酵素により複製さ
れないだろう。同様に、T7 RNAポリメラーゼの場合、該増幅酵素はそれ自身のプ
ロモーターに対するストリンジェントな特異性を有する(M. Chamberlinら, Natu
re 228: 227 [1970])。T4 DNAリガーゼの場合、連結部位におけるオリゴヌクレ
オチドまたはポリヌクレオチド基質と鋳型間のミスマッチがある場合、該酵素は
2つのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを連結させないだろう(D.Y. W
uおよびR.B. Wallace, Genomics 4: 560 [1989])。最後に、TaqおよびPfuポリメ
ラーゼは、それらの高温で機能するという能力に基づいて、プライマーが結合し
、それによって規定される配列に対し高い特異性を示すことが見出されている；
高温は、標的配列とのプライマーハイブリダイゼーションに有利であり、非標的
配列とのハイブリダイゼーションには有利でない熱力学条件をもたらす(H.A. Er
lich (編集), PCR Technology, Stockton Press [1989])。
。増幅酵素は、それらが用いられる条件下にて、核酸の不均質混合物中の特異的
核酸配列だけを処理するであろう酵素である。例えば、Qβレプリカーゼの場合
、MDV-1 RNAは、該レプリカーゼの特異的な鋳型である (D.L. Kacianら, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 69: 3038 [1972])。他の核酸は該増幅酵素により複製さ
れないだろう。同様に、T7 RNAポリメラーゼの場合、該増幅酵素はそれ自身のプ
ロモーターに対するストリンジェントな特異性を有する(M. Chamberlinら, Natu
re 228: 227 [1970])。T4 DNAリガーゼの場合、連結部位におけるオリゴヌクレ
オチドまたはポリヌクレオチド基質と鋳型間のミスマッチがある場合、該酵素は
2つのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを連結させないだろう(D.Y. W
uおよびR.B. Wallace, Genomics 4: 560 [1989])。最後に、TaqおよびPfuポリメ
ラーゼは、それらの高温で機能するという能力に基づいて、プライマーが結合し
、それによって規定される配列に対し高い特異性を示すことが見出されている；
高温は、標的配列とのプライマーハイブリダイゼーションに有利であり、非標的
配列とのハイブリダイゼーションには有利でない熱力学条件をもたらす(H.A. Er
lich (編集), PCR Technology, Stockton Press [1989])。
【００５５】 本明細書に用いる「増幅可能な核酸」という用語は、任意の増幅法により増幅
され得る核酸に関して用いられる。一般に「増幅可能な核酸」は、「サンプル鋳
型」を含んでなると考えられる。
され得る核酸に関して用いられる。一般に「増幅可能な核酸」は、「サンプル鋳
型」を含んでなると考えられる。
【００５６】 本明細書に用いる「サンプル鋳型」という用語は、「標的」の存在について分
析されるサンプル由来の核酸を意味する。それに対して、「バックグラウンド鋳
型」は、サンプル中に存在するまたはしないであろうサンプル鋳型以外の核酸に
関して用いられる。バックグラウンド鋳型は非常に多くの場合、偶然である。そ
のことは、キャリーオーバーの結果の可能性もあり、またはサンプルから取り去
って精製すべき核酸混在物質の存在によるものである可能性もある。例えば、検
出されるべき核酸以外の生物由来の核酸は試験サンプル中にバックグラウンドと
して存在する可能性がある。
析されるサンプル由来の核酸を意味する。それに対して、「バックグラウンド鋳
型」は、サンプル中に存在するまたはしないであろうサンプル鋳型以外の核酸に
関して用いられる。バックグラウンド鋳型は非常に多くの場合、偶然である。そ
のことは、キャリーオーバーの結果の可能性もあり、またはサンプルから取り去
って精製すべき核酸混在物質の存在によるものである可能性もある。例えば、検
出されるべき核酸以外の生物由来の核酸は試験サンプル中にバックグラウンドと
して存在する可能性がある。
【００５７】 本明細書に用いる「プライマー」という用語は、精製した制限酵素消化物の場
合のように天然に存在していようと、合成的に生成されたものであろうと、核酸
鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成を誘導する条件下（すなわち、ヌクレオ
チドおよびDNAポリメラーゼなどの誘導剤の存在下、および好適な温度とpH）に
おいた場合に、合成の開始点として作用できるオリゴヌクレオチドを意味する。
プライマーは、増幅の最大効率のために1本鎖であることが好ましいが、別に2本
鎖であってもよい。もし2本鎖である場合、伸長産物の調製に用いる前にまずプ
ライマーを処理してその鎖を分離する。プライマーは、オリゴデオキシリボヌク
レオチドであることが好ましい。プライマーは、誘導剤の存在下で伸長産物の合
成を開始させるのに十分な長さでなければならない。プライマーの正確な長さは
、温度、プライマー源および方法の使用を含む多くの要因に依存している。
合のように天然に存在していようと、合成的に生成されたものであろうと、核酸
鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成を誘導する条件下（すなわち、ヌクレオ
チドおよびDNAポリメラーゼなどの誘導剤の存在下、および好適な温度とpH）に
おいた場合に、合成の開始点として作用できるオリゴヌクレオチドを意味する。
プライマーは、増幅の最大効率のために1本鎖であることが好ましいが、別に2本
鎖であってもよい。もし2本鎖である場合、伸長産物の調製に用いる前にまずプ
ライマーを処理してその鎖を分離する。プライマーは、オリゴデオキシリボヌク
レオチドであることが好ましい。プライマーは、誘導剤の存在下で伸長産物の合
成を開始させるのに十分な長さでなければならない。プライマーの正確な長さは
、温度、プライマー源および方法の使用を含む多くの要因に依存している。
【００５８】 本明細書に用いる「プローブ」という用語は、精製した制限酵素消化物の場合
のように天然に存在していようと、合成的、組換え的にまたはPCR増幅により生
成されたものであろうと、目的の別のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズでき
るオリゴヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチド配列）を意味する。プローブは
、1本鎖であっても2本鎖であってもよい。プローブは、特定の遺伝子配列の検出
、同定および単離に有用である。本発明で用いるプローブはいずれも、限定する
ものではないが、酵素系（例えば、ELISAならびに酵素に基づく組織化学アッセ
イ）、蛍光系、放射性系および発光系を含む任意の検出系において検出可能であ
るように任意の「リポーター分子」で標識されることが企図される。本発明は、
特定の検出系または標識のいずれにも限定することを意図していない。
のように天然に存在していようと、合成的、組換え的にまたはPCR増幅により生
成されたものであろうと、目的の別のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズでき
るオリゴヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチド配列）を意味する。プローブは
、1本鎖であっても2本鎖であってもよい。プローブは、特定の遺伝子配列の検出
、同定および単離に有用である。本発明で用いるプローブはいずれも、限定する
ものではないが、酵素系（例えば、ELISAならびに酵素に基づく組織化学アッセ
イ）、蛍光系、放射性系および発光系を含む任意の検出系において検出可能であ
るように任意の「リポーター分子」で標識されることが企図される。本発明は、
特定の検出系または標識のいずれにも限定することを意図していない。
【００５９】 本明細書に用いる「標的」という用語は、プライマーが結合する核酸領域を意
味する。このように「標的」は、他の核酸配列から選別されることが求められる
。「セグメント」は、標的配列内の核酸領域として定義される。
味する。このように「標的」は、他の核酸配列から選別されることが求められる
。「セグメント」は、標的配列内の核酸領域として定義される。
【００６０】 本明細書に用いる「ポリメラーゼ連鎖反応」（「PCR」）という用語は、クロ
ーニングまたは精製なしにゲノムDNAの混合物中の標的配列のセグメント濃度を
高める方法を記載するK.B. Mullisの方法(参照により本明細書に組み入れられる
米国特許第4,683,195号、同第4,683,202号、および同第4,965,188号)を意味する
。標的配列を増幅するこの方法は、非常に過剰な2つのオリゴヌクレオチドプラ
イマーの所望の標的配列を含有するDNA混合物への導入、次いでDNAポリメラーゼ
の存在下での正確な連続した熱サイクルからなる。2つのプライマーは、2本鎖標
的配列の各鎖に相補的である。増幅をなし遂げるために混合物を変性させ、次い
でプライマーを標的分子内のそれらの相補的配列にアニーリングさせる。アニー
リングの後、プライマーをポリメラーゼを用いて伸長させて新しい1対の相補鎖
を形成する。変性、プライマーアニーリングおよびポリメラーゼ伸長ステップを
多数回繰り返し（すなわち、変性、アニーリングおよび伸長が1「サイクル」を
構成し、多数の「サイクル」が存在し得る）、所望の標的配列の増幅セグメント
を高濃度で得ることができる。所望の標的配列の増幅セグメントの長さは、互い
のプライマーの相対的な位置により求められ、従ってこの長さは、制御可能なパ
ラメーターである。該方法の反復態様により、該方法は「ポリメラーゼ連鎖反応
」（以下「PCR」）と呼ばれる。標的配列の所望の増幅セグメントが混合物中、
（濃度に関して）優位な配列となるため、それらは「PCR増幅された」と言われ
る。
ーニングまたは精製なしにゲノムDNAの混合物中の標的配列のセグメント濃度を
高める方法を記載するK.B. Mullisの方法(参照により本明細書に組み入れられる
米国特許第4,683,195号、同第4,683,202号、および同第4,965,188号)を意味する
。標的配列を増幅するこの方法は、非常に過剰な2つのオリゴヌクレオチドプラ
イマーの所望の標的配列を含有するDNA混合物への導入、次いでDNAポリメラーゼ
の存在下での正確な連続した熱サイクルからなる。2つのプライマーは、2本鎖標
的配列の各鎖に相補的である。増幅をなし遂げるために混合物を変性させ、次い
でプライマーを標的分子内のそれらの相補的配列にアニーリングさせる。アニー
リングの後、プライマーをポリメラーゼを用いて伸長させて新しい1対の相補鎖
を形成する。変性、プライマーアニーリングおよびポリメラーゼ伸長ステップを
多数回繰り返し（すなわち、変性、アニーリングおよび伸長が1「サイクル」を
構成し、多数の「サイクル」が存在し得る）、所望の標的配列の増幅セグメント
を高濃度で得ることができる。所望の標的配列の増幅セグメントの長さは、互い
のプライマーの相対的な位置により求められ、従ってこの長さは、制御可能なパ
ラメーターである。該方法の反復態様により、該方法は「ポリメラーゼ連鎖反応
」（以下「PCR」）と呼ばれる。標的配列の所望の増幅セグメントが混合物中、
（濃度に関して）優位な配列となるため、それらは「PCR増幅された」と言われ
る。
【００６１】 PCRでは、幾つかの異なる方法論（例えば標識プローブとのハイブリダイゼー
ション；ビオチン化プライマーを組み込んだ後のアビジン-酵素結合検出； 32P
標識したdCTPまたはdATPなどのデオキシヌクレオチド三リン酸の増幅セグメント
への組み込み）によりゲノムDNAの特定の標的配列の1コピーを検出可能なレベル
まで増幅することが可能である。ゲノムDNAに加え、任意のオリゴヌクレオチド
またはポリヌクレオチド配列も適当なプライマー分子のセットで増幅させること
ができる。特に、PCR方法創生された増幅セグメントは、それ自体が後に続くPCR
増幅の有効な鋳型である。
ション；ビオチン化プライマーを組み込んだ後のアビジン-酵素結合検出； 32P
標識したdCTPまたはdATPなどのデオキシヌクレオチド三リン酸の増幅セグメント
への組み込み）によりゲノムDNAの特定の標的配列の1コピーを検出可能なレベル
まで増幅することが可能である。ゲノムDNAに加え、任意のオリゴヌクレオチド
またはポリヌクレオチド配列も適当なプライマー分子のセットで増幅させること
ができる。特に、PCR方法創生された増幅セグメントは、それ自体が後に続くPCR
増幅の有効な鋳型である。
【００６２】 本明細書に用いる「PCR産物」、「PCR断片」および「増幅産物」という用語は
、変性、アニーリングおよび伸長のPCRステップを2サイクル以上終えた後に得ら
れた化合物の混合物を意味する。これらの用語は、1以上の標的配列の1以上のセ
グメントの増幅があった場合を包含する。
、変性、アニーリングおよび伸長のPCRステップを2サイクル以上終えた後に得ら
れた化合物の混合物を意味する。これらの用語は、1以上の標的配列の1以上のセ
グメントの増幅があった場合を包含する。
【００６３】 本明細書に用いる「増幅試薬」という用語は、プライマー、核酸鋳型および増
幅酵素を除いた、増幅に必要なそれらの試薬（デオキシリボヌクレオチド三リン
酸、バッファーなど）を意味する。典型的には、増幅試薬は他の反応成分ととも
に反応容器（試験管、マイクロウェルなど）に入れられ、収容される。
幅酵素を除いた、増幅に必要なそれらの試薬（デオキシリボヌクレオチド三リン
酸、バッファーなど）を意味する。典型的には、増幅試薬は他の反応成分ととも
に反応容器（試験管、マイクロウェルなど）に入れられ、収容される。
【００６４】 本明細書に用いる「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」という用語
は、細菌酵素を意味し、その各々は特異的ヌクレオチド配列でまたはその近くで
2本鎖DNAを切断する。
は、細菌酵素を意味し、その各々は特異的ヌクレオチド配列でまたはその近くで
2本鎖DNAを切断する。
【００６５】 本明細書に用いる「アンチセンス」という用語は、特定のDNAもしくはRNA配列
（例えば、mRNA）に相補的なDNAもしくはRNA配列に関して用いられる。細菌によ
る遺伝子調節に関連するアンチセンスRNA(「asRNA」)分子は、この定義内に含め
られる。アンチセンスRNAは、コード鎖の合成を可能にするウイルスプロモータ
ーに対して逆方向に目的遺伝子（群）をスプライスすることによる合成を含む任
意の方法によって産生し得る。いったん胚導入されれば、この転写された鎖は、
胚で産生した天然mRNAと結合し、2本鎖を形成する。次いでこれらの2本鎖は、mR
NAのさらなる転写かまたはその翻訳のいずれかをブロックする。この方法で突然
変異表現型が生成され得る。「アンチセンス鎖」という用語は、「センス」鎖に
相補的な核酸鎖に関して用いられる。(-)（すなわち、「負の」）の記載は、時
にアンチセンス鎖に関して用いられ、(+)の記載は、時にセンス（すなわち、「
正の」）鎖に関して用いられる。
（例えば、mRNA）に相補的なDNAもしくはRNA配列に関して用いられる。細菌によ
る遺伝子調節に関連するアンチセンスRNA(「asRNA」)分子は、この定義内に含め
られる。アンチセンスRNAは、コード鎖の合成を可能にするウイルスプロモータ
ーに対して逆方向に目的遺伝子（群）をスプライスすることによる合成を含む任
意の方法によって産生し得る。いったん胚導入されれば、この転写された鎖は、
胚で産生した天然mRNAと結合し、2本鎖を形成する。次いでこれらの2本鎖は、mR
NAのさらなる転写かまたはその翻訳のいずれかをブロックする。この方法で突然
変異表現型が生成され得る。「アンチセンス鎖」という用語は、「センス」鎖に
相補的な核酸鎖に関して用いられる。(-)（すなわち、「負の」）の記載は、時
にアンチセンス鎖に関して用いられ、(+)の記載は、時にセンス（すなわち、「
正の」）鎖に関して用いられる。
【００６６】 本明細書に用いる「機能的な組合せで」、「機能的な順で」および「機能的に
連結された」という用語は、所定の遺伝子の転写および／または所望のタンパク
質分子の合成を指令する能力のある核酸分子が、産生されるような方法における
核酸配列の結合を意味する。また、この用語は機能的タンパク質が産生されるよ
うな方法におけるアミノ酸配列の結合も意味する。
連結された」という用語は、所定の遺伝子の転写および／または所望のタンパク
質分子の合成を指令する能力のある核酸分子が、産生されるような方法における
核酸配列の結合を意味する。また、この用語は機能的タンパク質が産生されるよ
うな方法におけるアミノ酸配列の結合も意味する。
【００６７】 核酸に関連して用いられる場合の「単離された」という用語は、「単離された
オリゴヌクレオチド」または「単離されたポリヌクレオチド」の場合のように、
その天然供給源において一般にそれが関連している少なくとも1つの混在物質の
核酸から同定され、分離される核酸配列を意味する。単離された核酸は、天然で
見られるようなものとは異なる形態またはセッティングで存在する。それに対し
、単離されない核酸は、DNAおよびRNAのような核酸として、それらが天然に存在
している状態で見られる。例えば、所定のDNA配列（例えば、遺伝子）は、近隣
の遺伝子付近の宿主細胞の染色体上で見られる；特定のタンパク質をコードする
特定のmRNA配列のようなRNA配列は、多数のタンパク質をコードする他の多くのm
RNAとの混合物として細胞で見られる。しかし、所定のタンパク質をコードする
単離された核酸としては、例えば、一般に核酸が天然の細胞のものとは異なる染
色体上の位置にあるか、そうでなければ天然で見られるものとは異なる核酸配列
が隣接した、所定のタンパク質を発現する細胞中の核酸が挙げられる。単離され
た核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、1本鎖もしくは2本鎖の
形で存在し得る。単離された核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド
をタンパク質の発現に利用しようとする場合、オリゴヌクレオチドもしくはポリ
ヌクレオチドは、最低限のセンスまたはコード鎖を含んでいる（すなわち、オリ
ゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは1本鎖であり得る）が、センスおよび
アンチセンス鎖両方を含み得る（すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌク
レオチドは2本鎖であり得る）。
オリゴヌクレオチド」または「単離されたポリヌクレオチド」の場合のように、
その天然供給源において一般にそれが関連している少なくとも1つの混在物質の
核酸から同定され、分離される核酸配列を意味する。単離された核酸は、天然で
見られるようなものとは異なる形態またはセッティングで存在する。それに対し
、単離されない核酸は、DNAおよびRNAのような核酸として、それらが天然に存在
している状態で見られる。例えば、所定のDNA配列（例えば、遺伝子）は、近隣
の遺伝子付近の宿主細胞の染色体上で見られる；特定のタンパク質をコードする
特定のmRNA配列のようなRNA配列は、多数のタンパク質をコードする他の多くのm
RNAとの混合物として細胞で見られる。しかし、所定のタンパク質をコードする
単離された核酸としては、例えば、一般に核酸が天然の細胞のものとは異なる染
色体上の位置にあるか、そうでなければ天然で見られるものとは異なる核酸配列
が隣接した、所定のタンパク質を発現する細胞中の核酸が挙げられる。単離され
た核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、1本鎖もしくは2本鎖の
形で存在し得る。単離された核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド
をタンパク質の発現に利用しようとする場合、オリゴヌクレオチドもしくはポリ
ヌクレオチドは、最低限のセンスまたはコード鎖を含んでいる（すなわち、オリ
ゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは1本鎖であり得る）が、センスおよび
アンチセンス鎖両方を含み得る（すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌク
レオチドは2本鎖であり得る）。
【００６８】 本明細書に用いる「トランスジーン」という用語は、例えば外来遺伝子を新し
い受精卵または初期胚へ導入することにより、生物に配置される外来遺伝子を意
味する。「外来遺伝子」と言う用語は、実験操作により動物のゲノムに導入され
る任意の核酸（例えば、遺伝子配列）を意味し、導入された遺伝子が天然に存在
する遺伝子と同じ位置にない限り、その動物で見られる遺伝子配列を含み得る。
い受精卵または初期胚へ導入することにより、生物に配置される外来遺伝子を意
味する。「外来遺伝子」と言う用語は、実験操作により動物のゲノムに導入され
る任意の核酸（例えば、遺伝子配列）を意味し、導入された遺伝子が天然に存在
する遺伝子と同じ位置にない限り、その動物で見られる遺伝子配列を含み得る。
【００６９】 様々な発生段階にある胚性細胞は、トランスジェニック動物作製用のトランス
ジーンを導入するために用いることができる。種々の方法が、胚性細胞の発生段
階に応じて用いられる。接合子は、マイクロインジェクションの好ましい標的で
ある。マウスでは、オスの前核がおよそ直径20μmの大きさに達し、DNA溶液1〜2
ピコリットル(pl）の再現可能な注入を可能にする。遺伝子導入の標的としての
接合子の使用は、多くの場合に注入DNAが初めの卵割前に宿主ゲノムに組み込ま
れるであろうという点で顕著な利点を有する（Brinsterら, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 82: 4438-4442 [1985])。結果として、トランスジェニック非ヒト動物
の細胞すべてが、組み込まれたトランスジーンを有するであろう。概して、50％
の生殖細胞がトランスジーンを保有するので、このことは創始動物の子孫への該
トランスジーンの効率的な伝達においても反映されるであろう。接合子へのマイ
クロインジェクションは、本発明で実施する際にトランスジーンを組み込むため
の好適な方法である。米国特許第4,873191号が、接合子へのマイクロインジェク
ション方法を記載する；この特許の開示を、そのまま本明細書に組み入れる。
ジーンを導入するために用いることができる。種々の方法が、胚性細胞の発生段
階に応じて用いられる。接合子は、マイクロインジェクションの好ましい標的で
ある。マウスでは、オスの前核がおよそ直径20μmの大きさに達し、DNA溶液1〜2
ピコリットル(pl）の再現可能な注入を可能にする。遺伝子導入の標的としての
接合子の使用は、多くの場合に注入DNAが初めの卵割前に宿主ゲノムに組み込ま
れるであろうという点で顕著な利点を有する（Brinsterら, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 82: 4438-4442 [1985])。結果として、トランスジェニック非ヒト動物
の細胞すべてが、組み込まれたトランスジーンを有するであろう。概して、50％
の生殖細胞がトランスジーンを保有するので、このことは創始動物の子孫への該
トランスジーンの効率的な伝達においても反映されるであろう。接合子へのマイ
クロインジェクションは、本発明で実施する際にトランスジーンを組み込むため
の好適な方法である。米国特許第4,873191号が、接合子へのマイクロインジェク
ション方法を記載する；この特許の開示を、そのまま本明細書に組み入れる。
【００７０】 レトロウイルス感染もまた、トランスジーンの動物への導入に用いることがで
きる。発生中の胚を、胚盤胞期までin vitroで培養できる。この期間の間、卵割
球はレトロウイルス感染の標的となり得る（Janenich, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 73: 1260-1264 [1976])。卵割球の効率的な感染は、透明帯を除去する酵素
的処理により達成する（Hoganら, in Manipulating the Mouse Embryo, Cold Sp
ring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. [1986])。トランス
ジーンを導入するためのウイルスベクター系は、典型的にはトランスジーンを有
する複製欠損レトロウイルスである（D. Jahnerら, Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 82: 6927-693 [1985])。トランスフェクションは、ウイルス産生細胞の単層上
で卵割球を培養することにより容易にかつ効率的に達成される（Van der Putten
, 上記；Stewartら, EMBO J. 6: 383-388 [1987])。あるいは、感染は後期段階
で行うこともできる。ウイルスまたはウイルス産生細胞を卵割球中に注入できる
（D. Jahnerら, Nature 298: 623-628 [1982])。組込みは、トランスジェニック
動物を形成する細胞のサブセットにおいてのみ起こるので、多くの創始動物はト
ランスジーンのモザイクであろう。さらに創始動物は、一般に子孫において分離
するゲノム中の、異なる位置にトランスジーンの様々なレトロウイルス挿入物を
含んでいてもよい。加えて、低効率ではあるが、子宮内での妊娠中期胚へのレト
ロウイルス感染により、トランスジーンを生殖細胞系へ導入することも可能であ
る（Jahnerら,上記 [1982]）。さらに当技術分野で公知である、レトロウイルス
またはレトロウイルスベクターを用いて、トランスジェニック動物を作製する手
段には、レトロウイルス粒子またはレトロウイルスを産生するマイトマイシンC
処理細胞の、受精卵または初期胚の卵黄周囲腔へのマイクロインジェクションが
ある（PCT国際出願 WO 90/08832 [1990]、およびHaskell
およびBowen, Mol. Reprod. Dev., 40: 386 [1995])。
きる。発生中の胚を、胚盤胞期までin vitroで培養できる。この期間の間、卵割
球はレトロウイルス感染の標的となり得る（Janenich, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 73: 1260-1264 [1976])。卵割球の効率的な感染は、透明帯を除去する酵素
的処理により達成する（Hoganら, in Manipulating the Mouse Embryo, Cold Sp
ring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. [1986])。トランス
ジーンを導入するためのウイルスベクター系は、典型的にはトランスジーンを有
する複製欠損レトロウイルスである（D. Jahnerら, Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 82: 6927-693 [1985])。トランスフェクションは、ウイルス産生細胞の単層上
で卵割球を培養することにより容易にかつ効率的に達成される（Van der Putten
, 上記；Stewartら, EMBO J. 6: 383-388 [1987])。あるいは、感染は後期段階
で行うこともできる。ウイルスまたはウイルス産生細胞を卵割球中に注入できる
（D. Jahnerら, Nature 298: 623-628 [1982])。組込みは、トランスジェニック
動物を形成する細胞のサブセットにおいてのみ起こるので、多くの創始動物はト
ランスジーンのモザイクであろう。さらに創始動物は、一般に子孫において分離
するゲノム中の、異なる位置にトランスジーンの様々なレトロウイルス挿入物を
含んでいてもよい。加えて、低効率ではあるが、子宮内での妊娠中期胚へのレト
ロウイルス感染により、トランスジーンを生殖細胞系へ導入することも可能であ
る（Jahnerら,上記 [1982]）。さらに当技術分野で公知である、レトロウイルス
またはレトロウイルスベクターを用いて、トランスジェニック動物を作製する手
段には、レトロウイルス粒子またはレトロウイルスを産生するマイトマイシンC
処理細胞の、受精卵または初期胚の卵黄周囲腔へのマイクロインジェクションが
ある（PCT国際出願 WO 90/08832 [1990]、およびHaskell
およびBowen, Mol. Reprod. Dev., 40: 386 [1995])。
【００７１】 トランスジーン導入ための第3の標的細胞型は、胚性幹（ES)細胞である。ES細
胞は、適当な条件下にてin vitroで未着床胚を培養することにより得られる（Ev
ansら, Nature 292: 154-156 [1981]; Bradleyら, Nature 309: 255-258 [1984]
;Gosslerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9065-9069 [1985];およびRobert
sonら, Nature 322: 445-448 [1986])。トランスジーンは、当技術分野で公知の
多種の方法（リン酸カルシウム共沈降、プロトプラストもしくはスフェロプラス
ト融合、リポフェクション、およびDEAE-デキストラン媒介トランスフェクショ
ンを含める）によるDNAトランスフェクションにより、効率的にES細胞へ導入し
得る。またトランスジーンは、レトロウイルス媒介による形質導入により、また
はマイクロインジェクションによりES細胞へ導入してもよい。このようにトラン
スフェクトされたES細胞は、その後胚盤胞期の胚の分割腔に導入した後に胚を集
落形成し、得られたキメラ動物の生殖細胞系に寄与しうる（概説として、Jaenis
ch, Science 240: 1468-1474 [1988]を参照されたい）。分割腔へのトランスフ
ェクトされたES細胞導入の前に、トランスジーンを組み込んでいるES細胞を富化
するために、トランスジーンが選別手段を提供すると仮定して、トランスフェク
トされたES細胞を、そのような種々の選別プロトコールに課してもよい。あるい
は、ポリメラーゼ連鎖反応を、トランスジーンを組み込んでいるES細胞を選び出
すのに用いてもよい。この技術により、分割腔へ導入する前に適当な選別条件下
でトランスフェクトされたES細胞を増殖させる必要性が不要になる。
胞は、適当な条件下にてin vitroで未着床胚を培養することにより得られる（Ev
ansら, Nature 292: 154-156 [1981]; Bradleyら, Nature 309: 255-258 [1984]
;Gosslerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9065-9069 [1985];およびRobert
sonら, Nature 322: 445-448 [1986])。トランスジーンは、当技術分野で公知の
多種の方法（リン酸カルシウム共沈降、プロトプラストもしくはスフェロプラス
ト融合、リポフェクション、およびDEAE-デキストラン媒介トランスフェクショ
ンを含める）によるDNAトランスフェクションにより、効率的にES細胞へ導入し
得る。またトランスジーンは、レトロウイルス媒介による形質導入により、また
はマイクロインジェクションによりES細胞へ導入してもよい。このようにトラン
スフェクトされたES細胞は、その後胚盤胞期の胚の分割腔に導入した後に胚を集
落形成し、得られたキメラ動物の生殖細胞系に寄与しうる（概説として、Jaenis
ch, Science 240: 1468-1474 [1988]を参照されたい）。分割腔へのトランスフ
ェクトされたES細胞導入の前に、トランスジーンを組み込んでいるES細胞を富化
するために、トランスジーンが選別手段を提供すると仮定して、トランスフェク
トされたES細胞を、そのような種々の選別プロトコールに課してもよい。あるい
は、ポリメラーゼ連鎖反応を、トランスジーンを組み込んでいるES細胞を選び出
すのに用いてもよい。この技術により、分割腔へ導入する前に適当な選別条件下
でトランスフェクトされたES細胞を増殖させる必要性が不要になる。
【００７２】 「過剰発現」および「過剰発現する」という用語は、文法的に同等であり、mR
NAのレベルに関して用いられ、対照または非トランスジェニック動物の所定の組
織において典型的に観察されるより約3倍高い発現レベルを示す。mRNAのレベル
は、限定するものではないが、ノーザンブロット分析を含めた当業者に公知の多
数の技術のいずれかを用いて測定される。ノーザンブロットでは適当な対照を含
めて、解析する各組織から添加されるRNA量の差異を調節する。（例えば、各サ
ンプルに存在し、本質的に全組織に同一量で存在する豊富なRNA転写産物28S rRN
Aの量を、ノーザンブロットにおいて観察されるmRNA特異的シグナルを正規化、
または標準化する手段として用いることができる）。正確にスプライスされたト
ランスジーンRNAと大きさが一致するバンドに存在するmRNA量を定量する；トラ
ンスジーンプローブとハイブリダイズするRNAの他の少数種については、トラン
スジェニックmRNAの発現の定量化においては考慮されない。
NAのレベルに関して用いられ、対照または非トランスジェニック動物の所定の組
織において典型的に観察されるより約3倍高い発現レベルを示す。mRNAのレベル
は、限定するものではないが、ノーザンブロット分析を含めた当業者に公知の多
数の技術のいずれかを用いて測定される。ノーザンブロットでは適当な対照を含
めて、解析する各組織から添加されるRNA量の差異を調節する。（例えば、各サ
ンプルに存在し、本質的に全組織に同一量で存在する豊富なRNA転写産物28S rRN
Aの量を、ノーザンブロットにおいて観察されるmRNA特異的シグナルを正規化、
または標準化する手段として用いることができる）。正確にスプライスされたト
ランスジーンRNAと大きさが一致するバンドに存在するmRNA量を定量する；トラ
ンスジーンプローブとハイブリダイズするRNAの他の少数種については、トラン
スジェニックmRNAの発現の定量化においては考慮されない。
【００７３】 本明細書に用いる「トランスフェクション」という用語は、外来DNAの真核細
胞への導入を意味する。トランスフェクションは、当技術分野で公知の種々の手
段（リン酸カルシウム-DNA共沈降、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクショ
ン、ポリブレン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロ
インジェクション、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、
レトロウイルス感染、およびバイオリスティックス (biolistics)を含める）に
より達成され得る。
胞への導入を意味する。トランスフェクションは、当技術分野で公知の種々の手
段（リン酸カルシウム-DNA共沈降、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクショ
ン、ポリブレン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロ
インジェクション、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、
レトロウイルス感染、およびバイオリスティックス (biolistics)を含める）に
より達成され得る。
【００７４】 「安定したトランスフェクション」または「安定してトランスフェクトされた
」という用語は、外来DNAのトランスフェクトされた細胞ゲノムへの導入および
組込みを意味する。「安定したトランスフェクト体」という用語は、外来DNAを
ゲノムDNAに安定的に組み込んだ細胞を意味する。
」という用語は、外来DNAのトランスフェクトされた細胞ゲノムへの導入および
組込みを意味する。「安定したトランスフェクト体」という用語は、外来DNAを
ゲノムDNAに安定的に組み込んだ細胞を意味する。
【００７５】 「一過性トランスフェクション」または「一過性にトランスフェクトされた」
という用語は、外来DNAをトランスフェクトされた細胞ゲノムに組み込むことが
できない場合の外来DNAの細胞への導入を意味する。外来DNAは、数日間トランス
フェクトされた細胞の核に維持される。この間、外来DNAは染色体において内在
性遺伝子の発現を制御する調節制御に課される。「一過性トランスフェクト体」
という用語は、外来遺伝子を取り込んだが、この外来DNAを組み込むことができ
なかった細胞を意味する。
という用語は、外来DNAをトランスフェクトされた細胞ゲノムに組み込むことが
できない場合の外来DNAの細胞への導入を意味する。外来DNAは、数日間トランス
フェクトされた細胞の核に維持される。この間、外来DNAは染色体において内在
性遺伝子の発現を制御する調節制御に課される。「一過性トランスフェクト体」
という用語は、外来遺伝子を取り込んだが、この外来DNAを組み込むことができ
なかった細胞を意味する。
【００７６】 「リン酸カルシウム共沈降」という用語は、核酸を細胞へ導入するための技術
を意味する。核酸がリン酸カルシウム-核酸共沈降物として現れる場合、細胞に
よる核酸の取り込みが増大する。Grahamおよびvan der Ebの原型の技術(Graham
およびvan der Eb, Virol., 52: 456 [1973])は、細胞の特定の型に対して条件
を最適化するために幾つかのグループにより改良された。当技術分野では、これ
らの多くの改良は周知である。
を意味する。核酸がリン酸カルシウム-核酸共沈降物として現れる場合、細胞に
よる核酸の取り込みが増大する。Grahamおよびvan der Ebの原型の技術(Graham
およびvan der Eb, Virol., 52: 456 [1973])は、細胞の特定の型に対して条件
を最適化するために幾つかのグループにより改良された。当技術分野では、これ
らの多くの改良は周知である。
【００７７】 本明細書に用いる「選択マーカー」という用語は、他の場合には必須栄養素で
あろうものを欠いた培地で、増殖する能力を与える酵素活性をコードする遺伝子
（例えば、酵母細胞のHIS3遺伝子）の使用を意味する；さらに選択マーカーは、
選択マーカーを発現する細胞にある抗生物質または薬剤に対する耐性を付与し得
る。選択マーカーは、「優性」であり得る；優性な選択マーカーは、任意の真核
細胞系において検出され得る酵素活性をコードする。優性な選択マーカーの例と
しては、哺乳動物細胞に薬剤G418耐性を与える細菌アミノグリコシド3'ホスホト
ランスフェラーゼ遺伝子（neo遺伝子とも呼ばれる）、抗生物質ヒグロマイシン
耐性を与える細菌ヒグロマイシンGホスホトランスフェラーゼ(hyg)遺伝子、およ
びミコフェノール酸の存在下で増殖する能力を与える細菌キサンチン-グアニン
ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（gpt遺伝子とも呼ばれる）がある。
他の選択マーカーは、関連した酵素活性を欠く細胞系とともに使用しなければな
らないという点で優性ではない。非優性選択マーカーの例としては、tk-細胞系
とともに使用されるチミジンキナーゼ(tk)遺伝子、CAD欠失細胞とともに使用さ
れるCAD遺伝子およびhprt-細胞系とともに使用される哺乳動物ヒポキサンチン-
グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(hprt)遺伝子がある。哺乳動物細胞
系の選択マーカーの使用についての概説は、Sambrook, J.ら, Molecular Clonin
g: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New
York (1989), pp. 16.9-16.15に示されている。
あろうものを欠いた培地で、増殖する能力を与える酵素活性をコードする遺伝子
（例えば、酵母細胞のHIS3遺伝子）の使用を意味する；さらに選択マーカーは、
選択マーカーを発現する細胞にある抗生物質または薬剤に対する耐性を付与し得
る。選択マーカーは、「優性」であり得る；優性な選択マーカーは、任意の真核
細胞系において検出され得る酵素活性をコードする。優性な選択マーカーの例と
しては、哺乳動物細胞に薬剤G418耐性を与える細菌アミノグリコシド3'ホスホト
ランスフェラーゼ遺伝子（neo遺伝子とも呼ばれる）、抗生物質ヒグロマイシン
耐性を与える細菌ヒグロマイシンGホスホトランスフェラーゼ(hyg)遺伝子、およ
びミコフェノール酸の存在下で増殖する能力を与える細菌キサンチン-グアニン
ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（gpt遺伝子とも呼ばれる）がある。
他の選択マーカーは、関連した酵素活性を欠く細胞系とともに使用しなければな
らないという点で優性ではない。非優性選択マーカーの例としては、tk-細胞系
とともに使用されるチミジンキナーゼ(tk)遺伝子、CAD欠失細胞とともに使用さ
れるCAD遺伝子およびhprt-細胞系とともに使用される哺乳動物ヒポキサンチン-
グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(hprt)遺伝子がある。哺乳動物細胞
系の選択マーカーの使用についての概説は、Sambrook, J.ら, Molecular Clonin
g: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New
York (1989), pp. 16.9-16.15に示されている。
【００７８】 本明細書に用いる「精製された」または「精製する」という用語は、サンプル
から混在物質を除去することを意味する。例えば、抗体は混在している非免疫グ
ロブリンタンパク質の除去により精製される；またそれらは、標的分子と結合し
ない免疫グロブリンの除去によっても精製される。非免疫グロブリンタンパク質
の除去および／または標的分子と結合しない免疫グロブリンの除去の結果として
、サンプル中の標的反応性免疫グロブリンのパーセントが増加する。別の例では
、組換えポリペプチドを細菌宿主細胞で発現させ、宿主細胞タンパク質を除去し
て、該組換えポリペプチドを精製する；それによって組換えポリペプチドのパー
セントがサンプル中で増加する。
から混在物質を除去することを意味する。例えば、抗体は混在している非免疫グ
ロブリンタンパク質の除去により精製される；またそれらは、標的分子と結合し
ない免疫グロブリンの除去によっても精製される。非免疫グロブリンタンパク質
の除去および／または標的分子と結合しない免疫グロブリンの除去の結果として
、サンプル中の標的反応性免疫グロブリンのパーセントが増加する。別の例では
、組換えポリペプチドを細菌宿主細胞で発現させ、宿主細胞タンパク質を除去し
て、該組換えポリペプチドを精製する；それによって組換えポリペプチドのパー
セントがサンプル中で増加する。
【００７９】 「ウエスタンブロット」という用語は、ニトロセルロースのような支持体また
は膜上へ固定されたタンパク質（群）（またはポリペプチド）を解析することを
意味する。タンパク質をアクリルアミドゲル上で移動させてタンパク質を分離し
た後、タンパク質をゲルから固相支持体（例えば、ニトロセルロースまたはナイ
ロン膜）へ転写させる。次いで固定されたタンパク質を目的の抗原に対して反応
性を有する抗体に暴露する。抗体の結合は、放射性標識した抗体の使用を含む様
々な方法により検出され得る。
は膜上へ固定されたタンパク質（群）（またはポリペプチド）を解析することを
意味する。タンパク質をアクリルアミドゲル上で移動させてタンパク質を分離し
た後、タンパク質をゲルから固相支持体（例えば、ニトロセルロースまたはナイ
ロン膜）へ転写させる。次いで固定されたタンパク質を目的の抗原に対して反応
性を有する抗体に暴露する。抗体の結合は、放射性標識した抗体の使用を含む様
々な方法により検出され得る。
【００８０】 本明細書に用いる「抗原決定基」という用語は、特定の抗体と接触する抗原の
その部分（すなわちエピトープ）を意味する。宿主動物の免疫化にタンパク質ま
たはタンパク質の断片が用いられる場合、タンパク質の多くの領域が、タンパク
質の所定の領域または三次元構造と特異的に結合する抗体の産生を誘導し得る；
これらの領域または構造を抗原決定基と呼ぶ。抗体との結合に関し、抗原決定基
は完全抗原（すなわち免疫応答を導き出すために用いられる「免疫原」）と競合
し得るものである。
その部分（すなわちエピトープ）を意味する。宿主動物の免疫化にタンパク質ま
たはタンパク質の断片が用いられる場合、タンパク質の多くの領域が、タンパク
質の所定の領域または三次元構造と特異的に結合する抗体の産生を誘導し得る；
これらの領域または構造を抗原決定基と呼ぶ。抗体との結合に関し、抗原決定基
は完全抗原（すなわち免疫応答を導き出すために用いられる「免疫原」）と競合
し得るものである。
【００８１】 「特異的結合」または「特異的に結合すること」という用語は、抗体とタンパ
ク質またはペプチドとの相互作用に関して用いられる場合、相互作用がタンパク
質の特定の構造（すなわち、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存してい
ることを意味する；言い換えると、抗体は一般にタンパク質よりむしろ特異的な
タンパク質構造を認識し、それと結合する。例えば、抗体がエピトープ「A」に
特異的である場合、標識した「A」および該抗体を含む反応物においては、エピ
トープA（または遊離の標識されていないA）を含有するタンパク質の存在により
、抗体と結合する標識Aの量が減少するであろう。
ク質またはペプチドとの相互作用に関して用いられる場合、相互作用がタンパク
質の特定の構造（すなわち、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存してい
ることを意味する；言い換えると、抗体は一般にタンパク質よりむしろ特異的な
タンパク質構造を認識し、それと結合する。例えば、抗体がエピトープ「A」に
特異的である場合、標識した「A」および該抗体を含む反応物においては、エピ
トープA（または遊離の標識されていないA）を含有するタンパク質の存在により
、抗体と結合する標識Aの量が減少するであろう。
【００８２】 本明細書に用いる「細胞培養」という用語は、任意のin vitro細胞培養を意味
する。連続細胞系（例えば、不死化(immortal)表現型）、一次細胞培養、有限細
胞系（例えば、非形質転換細胞）およびin vitroで保持された任意の他の細胞集
団がこの用語内に含まれる。
する。連続細胞系（例えば、不死化(immortal)表現型）、一次細胞培養、有限細
胞系（例えば、非形質転換細胞）およびin vitroで保持された任意の他の細胞集
団がこの用語内に含まれる。
【００８３】 用いられる「真核生物」という用語は、「原核生物」と区別できる生物を意味
する。該用語は、通例の真核生物の特徴（例えば、核膜で区切られ、中には染色
体がある本当の意味での核および膜結合細胞小器官の存在）、および真核生物に
一般に観察される他の特徴を示す細胞を有する、すべての生物を包含することを
意図している。
する。該用語は、通例の真核生物の特徴（例えば、核膜で区切られ、中には染色
体がある本当の意味での核および膜結合細胞小器官の存在）、および真核生物に
一般に観察される他の特徴を示す細胞を有する、すべての生物を包含することを
意図している。
【００８４】 本明細書に用いる「in vitro」という用語は、人工的な環境および人工的な環
境内で起こる過程または反応を意味する。in vitro環境は、試験管および細胞培
養からなるが、これらに限定されない。「in vivo」という用語は、天然の環境
（例えば、動物または細胞）および天然の環境内で起こる過程または反応を意味
する。
境内で起こる過程または反応を意味する。in vitro環境は、試験管および細胞培
養からなるが、これらに限定されない。「in vivo」という用語は、天然の環境
（例えば、動物または細胞）および天然の環境内で起こる過程または反応を意味
する。
【００８５】 「試験化合物」または「被験化合物」という用語は、生体機能の疾患、病気、
不健康または障害を治療または予防するために用いる任意の化学種、医薬、薬剤
およびそれに対応する物を意味する。試験化合物には、公知の治療用化合物およ
び潜在的な治療用化合物の両方が含まれる。本発明のスクリーニング方法を用い
たスクリーニングにより、試験化合物が治療上有効であることを調べることがで
きる。「公知の治療用化合物」とは、かかる治療または予防において有効である
ことが示されている（例えば動物実験またはヒトへの投与による予備試験による
）治療用化合物を意味する。
不健康または障害を治療または予防するために用いる任意の化学種、医薬、薬剤
およびそれに対応する物を意味する。試験化合物には、公知の治療用化合物およ
び潜在的な治療用化合物の両方が含まれる。本発明のスクリーニング方法を用い
たスクリーニングにより、試験化合物が治療上有効であることを調べることがで
きる。「公知の治療用化合物」とは、かかる治療または予防において有効である
ことが示されている（例えば動物実験またはヒトへの投与による予備試験による
）治療用化合物を意味する。
【００８６】 本明細書に用いる「サンプル」という用語は、その最も広い意味で用いられる
。一つの意味として、該用語は、薬剤および治療用化合物を意味し得る。別の意
味では、任意の供給源から得られた検体または培養物、ならびに生物学的サンプ
ルおよび環境的サンプルを含むことを意味する。生物学的サンプルは、動物（ヒ
トを含めて）から得ることができ、液体、固体、組織および気体を包含する。生
物学的サンプルは、血液産物（例えば、血漿、血清など）を含む。環境的サンプ
ルは、環境物質（例えば、表面物質、土壌、水）および工業用サンプルを含む。
これらの例は、本発明に適用できるサンプルの種類を限定するものとして解釈さ
れるべきでない。
。一つの意味として、該用語は、薬剤および治療用化合物を意味し得る。別の意
味では、任意の供給源から得られた検体または培養物、ならびに生物学的サンプ
ルおよび環境的サンプルを含むことを意味する。生物学的サンプルは、動物（ヒ
トを含めて）から得ることができ、液体、固体、組織および気体を包含する。生
物学的サンプルは、血液産物（例えば、血漿、血清など）を含む。環境的サンプ
ルは、環境物質（例えば、表面物質、土壌、水）および工業用サンプルを含む。
これらの例は、本発明に適用できるサンプルの種類を限定するものとして解釈さ
れるべきでない。
【００８７】発明の一般的説明 本発明はアルツハイマー病および炎症性成分が原因の他の疾患または症状(例
えば、中枢神経系の損傷)を治療するための方法ならびに組成物に関する。特に
、本発明はアルツハイマー病、および炎症性成分が原因の他の疾患または症状、
そのようなものとしては限定はされないが、発作、神経系への虚血性ダメージ、
神経外傷(例えば、打撃性脳損傷、脊髄損傷、および神経系への外傷性ダメージ)
、多発性硬化症ならびにその他の免疫が介在する神経障害(例えば、ギランバレ
ー症候群およびその変異型、急性運動神経軸索障害、急性炎症性脱髄性多発神経
障害、ならびにフィッシャー症候群)、HIV/AIDS痴呆複合症、ならびに細菌性お
よびウイルス性髄膜炎が挙げられるが、そのような疾患または症状に関与する前
炎症性および神経毒性産物の産生を調節する薬剤を提供する。
えば、中枢神経系の損傷)を治療するための方法ならびに組成物に関する。特に
、本発明はアルツハイマー病、および炎症性成分が原因の他の疾患または症状、
そのようなものとしては限定はされないが、発作、神経系への虚血性ダメージ、
神経外傷(例えば、打撃性脳損傷、脊髄損傷、および神経系への外傷性ダメージ)
、多発性硬化症ならびにその他の免疫が介在する神経障害(例えば、ギランバレ
ー症候群およびその変異型、急性運動神経軸索障害、急性炎症性脱髄性多発神経
障害、ならびにフィッシャー症候群)、HIV/AIDS痴呆複合症、ならびに細菌性お
よびウイルス性髄膜炎が挙げられるが、そのような疾患または症状に関与する前
炎症性および神経毒性産物の産生を調節する薬剤を提供する。
【００８８】 本発明はさらに、薬剤スクリーニング、および炎症応答に関与する細胞性およ
び分子機構において役割を果たす因子を同定し特性評価するための組成物および
方法を提供する。特に、本発明は、シクロオキシゲナーゼ−2の調節、およびシ
クロオキシゲナーゼ−2を調節するもしくはシクロオキシゲナーゼ−2によって調
節されるシグナル伝達経路に関与する因子を同定し特性評価するための方法と組
成物を提供する。
び分子機構において役割を果たす因子を同定し特性評価するための組成物および
方法を提供する。特に、本発明は、シクロオキシゲナーゼ−2の調節、およびシ
クロオキシゲナーゼ−2を調節するもしくはシクロオキシゲナーゼ−2によって調
節されるシグナル伝達経路に関与する因子を同定し特性評価するための方法と組
成物を提供する。
【００８９】 本発明の多数の態様を本明細書ではアルツハイマー病をモデルとして用いて説
明している。当業者であれば、炎症性成分が関与する広範な疾患と症状の治療お
よび調節に対してこれらの実施例が一般的に応用可能であることは理解されよう
。
明している。当業者であれば、炎症性成分が関与する広範な疾患と症状の治療お
よび調節に対してこれらの実施例が一般的に応用可能であることは理解されよう
。
【００９０】 上述のとおり、アルツハイマー病に対して用いられてきた治療上の処置方策は
神経伝達物質の置換、もしくは正常脳構造の保持に焦点があてられていたが、こ
れらは短期間の病状の軽減を与える可能性はあるが神経の変性および死は防止し
ないものである。アルツハイマー病に対するより有効な治療法の必要性に応じて
、本発明は神経細胞の変性および死を炎症過程の調節によって防ぐ方法を提供す
るものである。
神経伝達物質の置換、もしくは正常脳構造の保持に焦点があてられていたが、こ
れらは短期間の病状の軽減を与える可能性はあるが神経の変性および死は防止し
ないものである。アルツハイマー病に対するより有効な治療法の必要性に応じて
、本発明は神経細胞の変性および死を炎症過程の調節によって防ぐ方法を提供す
るものである。
【００９１】 AD脳で炎症性サイトカインが高レベルで存在すること、および多数の急性期産
物の存在が報告されている。しかし本発明以前にはこれらの炎症過程の基礎とな
る分子機構については十分には特性評価されておらず、関連する神経細胞の変性
および死を防止するための安全で予防的な療法は開発されていなかった。
物の存在が報告されている。しかし本発明以前にはこれらの炎症過程の基礎とな
る分子機構については十分には特性評価されておらず、関連する神経細胞の変性
および死を防止するための安全で予防的な療法は開発されていなかった。
【００９２】 ADの病理学的な第1の特徴は糸状アミロイドの細胞外沈着およびそれが老人斑
中にぎっしり詰まっていることである。老人斑はアミロイド斑に近接するミクロ
グリアおよび星状細胞の双方の活性化に関与する複雑な細胞性反応の中心である
。ミクログリアは老人斑中に最も大量かつ顕著に見られる細胞性成分である。老
人斑と会合したミクログリアは「反応性の」もしくは「活性化された」表現型を
呈し、分枝状の形状を有しその突起が老人斑を包んでまとわりつく。ミクログリ
アは脳内の主たる免疫細胞であり、単球細胞系統に由来し、形態学的および機能
的にはマクロファージと識別し得ない。マクロファージと同様に、ミクログリア
は「反応性の」表現型の獲得によって種々の刺激に応答し、MHCクラスII抗原、C
D45、補体受容体CR3およびCR4、免疫グロブリン受容体FcγRIおよびFcγRII、な
らびにICAM-1などの多数の細胞表面分子の発現の増加がその証拠となる。活性化
ミクログリアは、活性化マクロファージと同様に、特にα−抗キモトリプシン、
α−抗トリプシン、血清アミロイドP、C反応性タンパク質、および補体系成分を
含む広範な急性期タンパク質を分泌する(McGeerとRogers, Neurology 42:447[19
92])。重要なことは、ミクログリアの活性化が前炎症性サイトカインであるIL-1
β、IL-6、およびTNF-α、ならびにマクロファージ走化性タンパク質−1の合成
と分泌をもたらすことである。
中にぎっしり詰まっていることである。老人斑はアミロイド斑に近接するミクロ
グリアおよび星状細胞の双方の活性化に関与する複雑な細胞性反応の中心である
。ミクログリアは老人斑中に最も大量かつ顕著に見られる細胞性成分である。老
人斑と会合したミクログリアは「反応性の」もしくは「活性化された」表現型を
呈し、分枝状の形状を有しその突起が老人斑を包んでまとわりつく。ミクログリ
アは脳内の主たる免疫細胞であり、単球細胞系統に由来し、形態学的および機能
的にはマクロファージと識別し得ない。マクロファージと同様に、ミクログリア
は「反応性の」表現型の獲得によって種々の刺激に応答し、MHCクラスII抗原、C
D45、補体受容体CR3およびCR4、免疫グロブリン受容体FcγRIおよびFcγRII、な
らびにICAM-1などの多数の細胞表面分子の発現の増加がその証拠となる。活性化
ミクログリアは、活性化マクロファージと同様に、特にα−抗キモトリプシン、
α−抗トリプシン、血清アミロイドP、C反応性タンパク質、および補体系成分を
含む広範な急性期タンパク質を分泌する(McGeerとRogers, Neurology 42:447[19
92])。重要なことは、ミクログリアの活性化が前炎症性サイトカインであるIL-1
β、IL-6、およびTNF-α、ならびにマクロファージ走化性タンパク質−1の合成
と分泌をもたらすことである。
【００９３】 AD脳においてはミクログリアと老人斑との会合が、アミロイド沈着に対する最
も顕著で常に見られる細胞性反応である(Cotmanら, Neurobiol. Aging 17:723[1
996]; Itagakiら, J. Neuroimmunol. 24:173[1989]; およびMiyazonoら, Am. J.
Path. 139:589[1991])。老人斑と会合したミクログリアは反応性の表現型を呈
し、分枝状の形態をとり、その突起で老人斑を包み込む(Itagakiら, 上述の文献
; Fukumotoら, Neurodegen 5:13[1996]; Mannら, Acta Neuropath. 90:472[1995
]; およびPerlmutterら, Neurosci. Lett. 119:32[1990])。アミロイド前駆体タ
ンパク質(APP)の変異型を発現しているトランスジェニックマウスでは、アミロ
イド斑形成に引き続き活性化ミクログリアがその斑のコアの内部におよび近接し
て出現することは重要な意義を有する(Borcheltら, Neuron 19:939[1997]; Stur
chler-Pierraら, Proc. Natl. Acad. Sci. 94:13287[1997]; Frautschyら, Am.
J. Pathol. 152:307[1998]; およびMasliahら, J. Neurosci. 16:5795[1996])。
さらに、Aβを直接的に脳内に注射した動物モデルでは、ミクログリアのアミロ
イド沈着への補強を誘発しその活性化を介在するためにはAβ単独で十分である(
Weldonら, J. Neurosci.18:2161[1998]。従って、ヒトおよびマウスの双方にお
いて、豊富かつ反応性のミクログリアが存在することは脳内のアミロイド沈着に
対する不変の応答である。
も顕著で常に見られる細胞性反応である(Cotmanら, Neurobiol. Aging 17:723[1
996]; Itagakiら, J. Neuroimmunol. 24:173[1989]; およびMiyazonoら, Am. J.
Path. 139:589[1991])。老人斑と会合したミクログリアは反応性の表現型を呈
し、分枝状の形態をとり、その突起で老人斑を包み込む(Itagakiら, 上述の文献
; Fukumotoら, Neurodegen 5:13[1996]; Mannら, Acta Neuropath. 90:472[1995
]; およびPerlmutterら, Neurosci. Lett. 119:32[1990])。アミロイド前駆体タ
ンパク質(APP)の変異型を発現しているトランスジェニックマウスでは、アミロ
イド斑形成に引き続き活性化ミクログリアがその斑のコアの内部におよび近接し
て出現することは重要な意義を有する(Borcheltら, Neuron 19:939[1997]; Stur
chler-Pierraら, Proc. Natl. Acad. Sci. 94:13287[1997]; Frautschyら, Am.
J. Pathol. 152:307[1998]; およびMasliahら, J. Neurosci. 16:5795[1996])。
さらに、Aβを直接的に脳内に注射した動物モデルでは、ミクログリアのアミロ
イド沈着への補強を誘発しその活性化を介在するためにはAβ単独で十分である(
Weldonら, J. Neurosci.18:2161[1998]。従って、ヒトおよびマウスの双方にお
いて、豊富かつ反応性のミクログリアが存在することは脳内のアミロイド沈着に
対する不変の応答である。
【００９４】 本発明の組成物と方法はAβに対するミクログリアの様々な応答を阻害するた
めの方法を提供する。例えば、本発明は広範な炎症性応答(例えば、単球および
ミクログリア中におけるAβが誘発する広範な炎症性応答)を抑制する薬剤を提供
する。これらの薬剤(例えば、PPARγアゴニスト)は転写因子であるPPARγと相互
作用することが示されている。本発明はまた、PPARγアゴニストがシクロオキシ
ゲナーゼ−2(COX-2)およびサイトカインであるTNF-αおよびIL-6の発現をブロッ
クし、神経毒性産物の分泌を阻害することを示している。本発明以前には、炎症
性疾患におけるPPARγおよびPPARγエフェクターの治療効果は探索されていなか
った。従って、本発明はアルツハイマー病および炎症性成分が原因の他の疾患ま
たは症状を治療するための新規の治療方法を提供するものである。
めの方法を提供する。例えば、本発明は広範な炎症性応答(例えば、単球および
ミクログリア中におけるAβが誘発する広範な炎症性応答)を抑制する薬剤を提供
する。これらの薬剤(例えば、PPARγアゴニスト)は転写因子であるPPARγと相互
作用することが示されている。本発明はまた、PPARγアゴニストがシクロオキシ
ゲナーゼ−2(COX-2)およびサイトカインであるTNF-αおよびIL-6の発現をブロッ
クし、神経毒性産物の分泌を阻害することを示している。本発明以前には、炎症
性疾患におけるPPARγおよびPPARγエフェクターの治療効果は探索されていなか
った。従って、本発明はアルツハイマー病および炎症性成分が原因の他の疾患ま
たは症状を治療するための新規の治療方法を提供するものである。
【００９５】詳細な説明 本発明はアルツハイマー病および炎症性成分が原因の他の疾患または症状(例
えば、中枢神経系の損傷)を治療するための方法および組成物に関する。特に、
本発明はアルツハイマー病およびその他の炎症性疾患に関与する前炎症性および
神経毒性産物の産生を調節する薬剤を提供する。本発明の治療用薬剤はPPARγリ
ガンド(例えばPPARγアゴニスト)を含んでなる。本発明を実施するためにその機
構を理解することは必要ではなく、本発明がその機構によって限定されることは
意図していないが、本発明の治療用薬剤がPPARγ活性を変え、それに続いてPPAR
γによる遺伝子発現を調節することによって前炎症性および神経毒性産物の産生
を調節すると考えられる。
えば、中枢神経系の損傷)を治療するための方法および組成物に関する。特に、
本発明はアルツハイマー病およびその他の炎症性疾患に関与する前炎症性および
神経毒性産物の産生を調節する薬剤を提供する。本発明の治療用薬剤はPPARγリ
ガンド(例えばPPARγアゴニスト)を含んでなる。本発明を実施するためにその機
構を理解することは必要ではなく、本発明がその機構によって限定されることは
意図していないが、本発明の治療用薬剤がPPARγ活性を変え、それに続いてPPAR
γによる遺伝子発現を調節することによって前炎症性および神経毒性産物の産生
を調節すると考えられる。
【００９６】 PPARは、構造的にステロイドおよびレチノイン酸受容体ファミリーと関連する
、脂質によって活性化されるDNA結合タンパク質である(Lembergerら, Annu. Rev
. Cell Dev. Biol. 12:335[1996])。その受容体の活性化型は、PPREと称される
配列特異的プロモーターエレメントと結合し、遺伝子発現を転写の段階で調節す
る(Ricoteら, Nature 391:79[1998])。PPARには3種類のアイソフォーム(PPARα
、γ、およびδ)があり、それらは示差的に発現される。この受容体ファミリー
の天然のリガンドは脂肪酸および脂質代謝物であり、PPARファミリーの各メンバ
ーとともに、明白なパターンのリガンド特異性を示す。
、脂質によって活性化されるDNA結合タンパク質である(Lembergerら, Annu. Rev
. Cell Dev. Biol. 12:335[1996])。その受容体の活性化型は、PPREと称される
配列特異的プロモーターエレメントと結合し、遺伝子発現を転写の段階で調節す
る(Ricoteら, Nature 391:79[1998])。PPARには3種類のアイソフォーム(PPARα
、γ、およびδ)があり、それらは示差的に発現される。この受容体ファミリー
の天然のリガンドは脂肪酸および脂質代謝物であり、PPARファミリーの各メンバ
ーとともに、明白なパターンのリガンド特異性を示す。
【００９７】I. 本発明の治療用薬剤 本発明は、PPARγを調節する薬剤(例えばPPARγアゴニスト)が、アルツハイマ
ー病およびその他の炎症性疾患(例えば、中枢神経系の損傷)に関与する前炎症性
および神経毒性産物の産生を調節する治療用の組成物を提供することを示す。そ
のような薬剤としては、限定はされないが、プロスタグランディンJ２(PGJ２)お
よびその類似体(例えば、Δ１２-プロスタグランディンJ２および15-デオキシ-
Δ12, 14-プロスタグランディンJ２)、プロスタグランディンD２ファミリーのメ
ンバーの化合物、ドコサヘキサエン酸(DHA)、およびチアゾリジンジオン(例えば
、シグリタゾン、トログリタゾン、ピオグリタゾン、およびBRL49653)が挙げら
れる。ほとんどのPPARγアゴニストが経口投与後に実質的なバイオアベイラビリ
ティーを示しその使用に伴う毒性がほとんどもしくは全くないことは重要なこと
である(例えば、SaltielとOlefsky, Diabetes 45:1661[1996]; Wangら, Br. J.
Pharmacol. 122:1405[1997]; およびOakesら, Metabolism 46:935[1997]を参照
せよ)。本発明は、既知のもしくは将来同定されるであろうPPARγアゴニストの
いかなるものも本発明で用いることができるであろうと予想する。
ー病およびその他の炎症性疾患(例えば、中枢神経系の損傷)に関与する前炎症性
および神経毒性産物の産生を調節する治療用の組成物を提供することを示す。そ
のような薬剤としては、限定はされないが、プロスタグランディンJ２(PGJ２)お
よびその類似体(例えば、Δ１２-プロスタグランディンJ２および15-デオキシ-
Δ12, 14-プロスタグランディンJ２)、プロスタグランディンD２ファミリーのメ
ンバーの化合物、ドコサヘキサエン酸(DHA)、およびチアゾリジンジオン(例えば
、シグリタゾン、トログリタゾン、ピオグリタゾン、およびBRL49653)が挙げら
れる。ほとんどのPPARγアゴニストが経口投与後に実質的なバイオアベイラビリ
ティーを示しその使用に伴う毒性がほとんどもしくは全くないことは重要なこと
である(例えば、SaltielとOlefsky, Diabetes 45:1661[1996]; Wangら, Br. J.
Pharmacol. 122:1405[1997]; およびOakesら, Metabolism 46:935[1997]を参照
せよ)。本発明は、既知のもしくは将来同定されるであろうPPARγアゴニストの
いかなるものも本発明で用いることができるであろうと予想する。
【００９８】 本発明を実施するために有用な化合物、およびそれらの化合物を製する方法は
、WO91/07107; WO92/02520; WO94/01433; WO89/08651; WO96/33724; 米国特許第
4,287,200号; 第4,340,605号; 第4,438,141号; 第4,444,779号; 第4,461,902号;
第4,572,912号; 第4,687,777号; 第4,703,052号; 第4,725,610号; 第4,873,255
号; 第4,897,393号; 第4,897,405号; 第4,918,091号; 第4,948,900号; 第5,002,
953号; 第5,061,717号; 第5,120,754号; 第5,132,317号; 第5,194,443号; 第5,2
23,522号; 第5,232,925号; 第5,260,445号; および第5,814,647号に開示されて
いる。これらの公表物の開示事項は本明細書中に参照によりその全体を組み込む
こととする。
、WO91/07107; WO92/02520; WO94/01433; WO89/08651; WO96/33724; 米国特許第
4,287,200号; 第4,340,605号; 第4,438,141号; 第4,444,779号; 第4,461,902号;
第4,572,912号; 第4,687,777号; 第4,703,052号; 第4,725,610号; 第4,873,255
号; 第4,897,393号; 第4,897,405号; 第4,918,091号; 第4,948,900号; 第5,002,
953号; 第5,061,717号; 第5,120,754号; 第5,132,317号; 第5,194,443号; 第5,2
23,522号; 第5,232,925号; 第5,260,445号; および第5,814,647号に開示されて
いる。これらの公表物の開示事項は本明細書中に参照によりその全体を組み込む
こととする。
【００９９】 前述の効果を有する薬剤としては下記の式の化合物が個人を治療するのに有用
である。本発明のいくつかの実施形態においては、治療用薬剤は図15の式Iの化
合物［式中、R１およびR２は同じかもしくは異なり、その各々は水素原子、もし
くはC１-C５アルキル基を表し；R３は水素原子、C１-C６脂肪族アシル基、脂環
式アシル基、芳香族アシル基、ヘテロ環式アシル基、araliphaticアシル基、(C
１-C６アルコキシ)カルボニル基、またはアラルキルオキシカルボニル基を表し
；R４とR５は同じかもしくは異なり、各々は水素原子、C１-C５アルキル基もし
くはC１-C５アルコキシ基、またはR４とR５は共同してC１-C５アルキレンジオキ
シ基を表し；nは1、2、または3；Wは-CH２-、＞CO、もしくはCH-OR６基を表し(
ここでR６は、R３で定義した原子もしくは基のうち任意のものであってもよく、
それはR3と同じであっても異なるものであってもよい)；そしてYおよびZは同じ
ものでも異なるものでもよく、その各々は酸素原子、もしくはイミノ(=NH)基を
表す］；および製薬上許容されるその塩を含む。 本発明のいくつかの実施形態においては、治療用薬剤は図15の式IIの化合物
［式中R１１は置換された、もしくは置換されていないアルキル、アルコキシ、
シクロアルキル、フェニルアルキル、フェニル、芳香族アシル基、窒素、酸素、
およびイオウからなる群から選択された1もしくは2個のヘテロ原子を含んでいる
5-、もしくは6-員の複素環基、または図15に示す式の基(すなわち、「R１１に用
いうる式」と表示した基)であって、式中、R１３およびR１４は同じかもしくは
異なり、その各々は低級アルキル(あるいは、R１３およびR１４はお互いに直接
、もしくは窒素、酸素、およびイオウからなるヘテロ原子で隔てて、組み合わさ
れ5員環もしくは6員環を形成する)；そして、式中、L１およびL２は同じかもし
くは異なり、その各々は水素もしくは低級アルキルであるか、またはL１およびL ２ は組み合わさってアルキレン基を形成する］、または製薬上許容されるその塩
を含む。
である。本発明のいくつかの実施形態においては、治療用薬剤は図15の式Iの化
合物［式中、R１およびR２は同じかもしくは異なり、その各々は水素原子、もし
くはC１-C５アルキル基を表し；R３は水素原子、C１-C６脂肪族アシル基、脂環
式アシル基、芳香族アシル基、ヘテロ環式アシル基、araliphaticアシル基、(C
１-C６アルコキシ)カルボニル基、またはアラルキルオキシカルボニル基を表し
；R４とR５は同じかもしくは異なり、各々は水素原子、C１-C５アルキル基もし
くはC１-C５アルコキシ基、またはR４とR５は共同してC１-C５アルキレンジオキ
シ基を表し；nは1、2、または3；Wは-CH２-、＞CO、もしくはCH-OR６基を表し(
ここでR６は、R３で定義した原子もしくは基のうち任意のものであってもよく、
それはR3と同じであっても異なるものであってもよい)；そしてYおよびZは同じ
ものでも異なるものでもよく、その各々は酸素原子、もしくはイミノ(=NH)基を
表す］；および製薬上許容されるその塩を含む。 本発明のいくつかの実施形態においては、治療用薬剤は図15の式IIの化合物
［式中R１１は置換された、もしくは置換されていないアルキル、アルコキシ、
シクロアルキル、フェニルアルキル、フェニル、芳香族アシル基、窒素、酸素、
およびイオウからなる群から選択された1もしくは2個のヘテロ原子を含んでいる
5-、もしくは6-員の複素環基、または図15に示す式の基(すなわち、「R１１に用
いうる式」と表示した基)であって、式中、R１３およびR１４は同じかもしくは
異なり、その各々は低級アルキル(あるいは、R１３およびR１４はお互いに直接
、もしくは窒素、酸素、およびイオウからなるヘテロ原子で隔てて、組み合わさ
れ5員環もしくは6員環を形成する)；そして、式中、L１およびL２は同じかもし
くは異なり、その各々は水素もしくは低級アルキルであるか、またはL１およびL ２ は組み合わさってアルキレン基を形成する］、または製薬上許容されるその塩
を含む。
【０１００】 本発明のいくつかの実施形態においては、治療用薬剤は図15の式IIIの化合物
［式中、R１５およびR１６は独立に水素、1個〜6個の炭素原子を含有する低級ア
ルキル、1個〜6個の炭素原子を含有するアルコキシ、ハロゲン、エチニル、ニト
リル、メチルチオ、トリフルオロメチル、ビニル、ニトロ、もしくはハロゲンで
置換されたベンジルオキシであり、ｎは0〜4である］；または製薬上許容される
それらの塩を含む。
［式中、R１５およびR１６は独立に水素、1個〜6個の炭素原子を含有する低級ア
ルキル、1個〜6個の炭素原子を含有するアルコキシ、ハロゲン、エチニル、ニト
リル、メチルチオ、トリフルオロメチル、ビニル、ニトロ、もしくはハロゲンで
置換されたベンジルオキシであり、ｎは0〜4である］；または製薬上許容される
それらの塩を含む。
【０１０１】 本発明のいくつかの実施形態においては、治療用薬剤は図15の式IVの化合物［
式中、点線は結合もしくは結合がないことを示す；Vは−H＝CH−、−N＝CH−、
−CH＝N−、もしくはSであり；DはCH２、CHOH、CO、C＝NOR１７、もしくはCH＝C
Hであり；XはS、O、NR１８、−CH＝N、もしくは−N＝CHであり；YはCHもしくはN
であり；Zは水素、(C１−C７)アルキル、(C１−C７)シクロアルキル、フェニル
、ナフチル、ピリジル、フリル、チエニル、または同じかもしくは異なる基（(C １ −C３)アルキル、トリフルオロメチル、(C１−C３)アルコキシ、フルオロ、ク
ロロ、もしくはブロモ）によって1カ所もしくは2カ所が置換されたフェニルであ
り、Z１は水素もしくは(C１−C３)アルキルであり；R１７およびR１８は各々独
立に水素もしくはメチルであり；nは1、2、もしくは3である］、製薬上許容され
るそれらの陽イオン性塩、またはその化合物が塩基性窒素を含有している場合に
は製薬上許容される酸付加塩を含む。
式中、点線は結合もしくは結合がないことを示す；Vは−H＝CH−、−N＝CH−、
−CH＝N−、もしくはSであり；DはCH２、CHOH、CO、C＝NOR１７、もしくはCH＝C
Hであり；XはS、O、NR１８、−CH＝N、もしくは−N＝CHであり；YはCHもしくはN
であり；Zは水素、(C１−C７)アルキル、(C１−C７)シクロアルキル、フェニル
、ナフチル、ピリジル、フリル、チエニル、または同じかもしくは異なる基（(C １ −C３)アルキル、トリフルオロメチル、(C１−C３)アルコキシ、フルオロ、ク
ロロ、もしくはブロモ）によって1カ所もしくは2カ所が置換されたフェニルであ
り、Z１は水素もしくは(C１−C３)アルキルであり；R１７およびR１８は各々独
立に水素もしくはメチルであり；nは1、2、もしくは3である］、製薬上許容され
るそれらの陽イオン性塩、またはその化合物が塩基性窒素を含有している場合に
は製薬上許容される酸付加塩を含む。
【０１０２】 本発明のいくつかの実施形態においては、治療用薬剤は図15の式Vの化合物［
式中、点線は結合もしくは結合がないことを示す；AおよびBは各々独立にCHもし
くはNで、AもしくはBがNである場合には他方はCHであるという条件があり；X１
はS、SO、SO２、CH２、CHOH、もしくはCOであり；nは0もしくは1であり；Y１はC
HR２０もしくはR２１で、nが1でY１がNR２１の場合にはX１がSO２もしくはCOで
あるという条件があり；Z２はCHR２２、CH２CH２、環状C２H２O、CH＝CH、OCH２ 、SCH２、SOCH２、もしくはSO２CH２であり；R１９、R２０、R２１、およびR２
２は各々独立に水素もしくはメチルであり；X２およびX３は各々独立に水素、メ
チル、トリフルオロメチル、フェニル、ベンジル、ヒドロキシ、メトキシ、フェ
ノキシ、ベンジロキシ、ブロモ、クロロ、もしくはフルオロである］、それらの
製薬上許容される陽イオン性塩、またはAもしくはBがNの場合には製薬上許容さ
れる酸付加塩を含む。
式中、点線は結合もしくは結合がないことを示す；AおよびBは各々独立にCHもし
くはNで、AもしくはBがNである場合には他方はCHであるという条件があり；X１
はS、SO、SO２、CH２、CHOH、もしくはCOであり；nは0もしくは1であり；Y１はC
HR２０もしくはR２１で、nが1でY１がNR２１の場合にはX１がSO２もしくはCOで
あるという条件があり；Z２はCHR２２、CH２CH２、環状C２H２O、CH＝CH、OCH２ 、SCH２、SOCH２、もしくはSO２CH２であり；R１９、R２０、R２１、およびR２
２は各々独立に水素もしくはメチルであり；X２およびX３は各々独立に水素、メ
チル、トリフルオロメチル、フェニル、ベンジル、ヒドロキシ、メトキシ、フェ
ノキシ、ベンジロキシ、ブロモ、クロロ、もしくはフルオロである］、それらの
製薬上許容される陽イオン性塩、またはAもしくはBがNの場合には製薬上許容さ
れる酸付加塩を含む。
【０１０３】 本発明のいくつかの実施形態においては、治療用薬剤は図15の式VIの化合物、
もしくは製薬上許容されるその塩であって、式中、R２３は、1〜6個の炭素原子
を有するアルキル、3〜7個の炭素原子を有するシクロアルキル、フェニル、また
はモノ置換もしくはジ置換のフェニルでその置換基が独立に炭素原子1〜6個のア
ルキル、炭素原子1〜3個のアルコキシ、ハロゲン、もしくはトリフルオロメチル
であるものである。
もしくは製薬上許容されるその塩であって、式中、R２３は、1〜6個の炭素原子
を有するアルキル、3〜7個の炭素原子を有するシクロアルキル、フェニル、また
はモノ置換もしくはジ置換のフェニルでその置換基が独立に炭素原子1〜6個のア
ルキル、炭素原子1〜3個のアルコキシ、ハロゲン、もしくはトリフルオロメチル
であるものである。
【０１０４】 本発明のいくつかの実施形態においては、治療用薬剤は図15の式VIIの化合物
、またはその互変異性体および/もしくはそれらの製薬上許容される塩、および/
もしくはその製薬上許容される溶媒和物を含み、式中、A２はアルキル基、置換
されているかもしくはされていないアリール基、またはアルキレンもしくはアリ
ール部分が置換されているもしくはされていないアラルキル基であり；A３は任
意で合計3カ所までの置換を有するベンゼン環を表し；R２４は水素原子、アルキ
ル基、アシル基、アルキルもしくはアリール部分が置換されているもしくはされ
ていないアラルキル基、または置換されているもしくはされていないアリール基
であり；またはA２はR２４とともに置換されたもしくはされていないC２−３ポ
リメチレン基を表し、このポリメチレン基の任意の置換基はアルキル、もしくは
アリールであるか、または近接する置換基がその置換基が付くメチレンの炭素原
子と共に、置換されたもしくはされていないフェニレン基を形成する；R２５お
よびR２６は各々独立に水素を示すか、またはR２５およびR２６は共にある結合
を表し；X４はOもしくはSを表し；ならびにnは2〜6の範囲の整数を示す。
、またはその互変異性体および/もしくはそれらの製薬上許容される塩、および/
もしくはその製薬上許容される溶媒和物を含み、式中、A２はアルキル基、置換
されているかもしくはされていないアリール基、またはアルキレンもしくはアリ
ール部分が置換されているもしくはされていないアラルキル基であり；A３は任
意で合計3カ所までの置換を有するベンゼン環を表し；R２４は水素原子、アルキ
ル基、アシル基、アルキルもしくはアリール部分が置換されているもしくはされ
ていないアラルキル基、または置換されているもしくはされていないアリール基
であり；またはA２はR２４とともに置換されたもしくはされていないC２−３ポ
リメチレン基を表し、このポリメチレン基の任意の置換基はアルキル、もしくは
アリールであるか、または近接する置換基がその置換基が付くメチレンの炭素原
子と共に、置換されたもしくはされていないフェニレン基を形成する；R２５お
よびR２６は各々独立に水素を示すか、またはR２５およびR２６は共にある結合
を表し；X４はOもしくはSを表し；ならびにnは2〜6の範囲の整数を示す。
【０１０５】 本発明のいくつかの実施形態においては、治療用薬剤は図15の式VIIIの化合物
、またはその互変異性体および/もしくはその製薬上許容される塩、および/もし
くはその製薬上許容される溶媒和物からなり、式中、R２７およびR２８は各々独
立にアルキル基、置換されているもしくはされていないアリール基、またはアリ
ールもしくはアルキル部分が置換されているかもしくはされていないアラルキル
基であり；またはR２７はR２８と共同して結合基を表し、その結合基は場合によ
り、置換されたメチレン基、またはOもしくはS原子からなり、メチレン基の任意
の置換基としてはアルキル、アリール、もしくはアラルキル、または近接するメ
チレン基の置換基はその置換基が付いている炭素原子と共に置換されているもし
くはされていないフェニレン基を形成し；R２９およびR３０は各々水素を示すか
またはR２９とR３０は共にある結合を表し；A３は任意で合計3カ所までの置換の
あるベンゼン環であり；X５はOもしくはSを表し；nは2〜6の範囲の整数を示す。
、またはその互変異性体および/もしくはその製薬上許容される塩、および/もし
くはその製薬上許容される溶媒和物からなり、式中、R２７およびR２８は各々独
立にアルキル基、置換されているもしくはされていないアリール基、またはアリ
ールもしくはアルキル部分が置換されているかもしくはされていないアラルキル
基であり；またはR２７はR２８と共同して結合基を表し、その結合基は場合によ
り、置換されたメチレン基、またはOもしくはS原子からなり、メチレン基の任意
の置換基としてはアルキル、アリール、もしくはアラルキル、または近接するメ
チレン基の置換基はその置換基が付いている炭素原子と共に置換されているもし
くはされていないフェニレン基を形成し；R２９およびR３０は各々水素を示すか
またはR２９とR３０は共にある結合を表し；A３は任意で合計3カ所までの置換の
あるベンゼン環であり；X５はOもしくはSを表し；nは2〜6の範囲の整数を示す。
【０１０６】 本発明のいくつかの実施形態においては、治療用薬剤は図15の式IXの化合物、
またはその互変異性体および/もしくはその製薬上許容される塩、および/もしく
はその製薬上許容される溶媒和物からなり、式中、A５は置換されたもしくはさ
れていない芳香族複素環基を表し；A６は合計で5個までの置換基を有するベンゼ
ン環を表し；X６はO、S、もしくはNR３２を表し、R３２は水素原子、アルキル基
、アシル基、アラルキル基（アラルキル基はアリール部分が置換されたもしくは
されていないものである）、または置換されたもしくはされていないアリール基
を表し；Y２はOもしくはSを表し；R３１はアルキル、アラルキル、もしくはアリ
ール基を表し；nは2〜6の範囲の整数を表す。適切な芳香族複素環基は、置換さ
れたもしくはされていない、単環もしくは縮合環の、4個以内のヘテロ原子から
なる芳香族複素環基であり、該ヘテロ原子は酸素、イオウ、もしくは窒素から選
択される。好ましい芳香族複素環基としては、4〜7個の、好ましくは5〜6個の環
の構成原子を有する、置換されたもしくはされていない単環の芳香族複素環基を
含む。とりわけ、その芳香族複素環基は1、2、もしくは3個のヘテロ原子、特に1
もしくは2個の、酸素、イオウ、もしくは窒素から選択されるヘテロ原子を含む
。A５の適切な意味としてはそれが5員環の芳香族複素環基を表す場合にはチアゾ
リルおよびオキサゾイル、とりわけオキサゾイルが挙げられる。A６の適切な意
味はそれが6員環の芳香族複素環基を表す場合にはピリジルもしくはピリミジニ
ルを含む。適切なR３１としてはアルキル基、特にC１−６アルキル基(例えば、
メチル基)が挙げられる。好ましくはA５は図15の式IXの下の式(a)、(b)、または
(c)に表した部分を示し、式中、R３３およびR３４は各々独立に水素原子、アル
キル基、または置換されたもしくはされていないアリール基またはR３３とR３４ の各々が近接する炭素原子に付けられている場合には、R３３とR３４はそれらが
付けられている炭素原子と共同してベンゼン環を形成し、そのベンゼン環中でR
３３およびR３４で共同して表されている各炭素原子は置換されていてもされて
いなくてもよく：式(a)の部分においてX７は酸素もしくはイオウを表している。
本発明の好ましい1実施形態においては、R３３およびR３４は共に図15の式IXの
下に記載の式(d)の部分を示し、その式中でR３５およびR３６は各々独立に水素
、ハロゲン、置換されたもしくはされていないアルキル、またはアルコキシを表
す。
またはその互変異性体および/もしくはその製薬上許容される塩、および/もしく
はその製薬上許容される溶媒和物からなり、式中、A５は置換されたもしくはさ
れていない芳香族複素環基を表し；A６は合計で5個までの置換基を有するベンゼ
ン環を表し；X６はO、S、もしくはNR３２を表し、R３２は水素原子、アルキル基
、アシル基、アラルキル基（アラルキル基はアリール部分が置換されたもしくは
されていないものである）、または置換されたもしくはされていないアリール基
を表し；Y２はOもしくはSを表し；R３１はアルキル、アラルキル、もしくはアリ
ール基を表し；nは2〜6の範囲の整数を表す。適切な芳香族複素環基は、置換さ
れたもしくはされていない、単環もしくは縮合環の、4個以内のヘテロ原子から
なる芳香族複素環基であり、該ヘテロ原子は酸素、イオウ、もしくは窒素から選
択される。好ましい芳香族複素環基としては、4〜7個の、好ましくは5〜6個の環
の構成原子を有する、置換されたもしくはされていない単環の芳香族複素環基を
含む。とりわけ、その芳香族複素環基は1、2、もしくは3個のヘテロ原子、特に1
もしくは2個の、酸素、イオウ、もしくは窒素から選択されるヘテロ原子を含む
。A５の適切な意味としてはそれが5員環の芳香族複素環基を表す場合にはチアゾ
リルおよびオキサゾイル、とりわけオキサゾイルが挙げられる。A６の適切な意
味はそれが6員環の芳香族複素環基を表す場合にはピリジルもしくはピリミジニ
ルを含む。適切なR３１としてはアルキル基、特にC１−６アルキル基(例えば、
メチル基)が挙げられる。好ましくはA５は図15の式IXの下の式(a)、(b)、または
(c)に表した部分を示し、式中、R３３およびR３４は各々独立に水素原子、アル
キル基、または置換されたもしくはされていないアリール基またはR３３とR３４ の各々が近接する炭素原子に付けられている場合には、R３３とR３４はそれらが
付けられている炭素原子と共同してベンゼン環を形成し、そのベンゼン環中でR
３３およびR３４で共同して表されている各炭素原子は置換されていてもされて
いなくてもよく：式(a)の部分においてX７は酸素もしくはイオウを表している。
本発明の好ましい1実施形態においては、R３３およびR３４は共に図15の式IXの
下に記載の式(d)の部分を示し、その式中でR３５およびR３６は各々独立に水素
、ハロゲン、置換されたもしくはされていないアルキル、またはアルコキシを表
す。
【０１０７】 本発明のいくつかの実施形態においては、治療用薬剤は図15の式Xの化合物、
またはその互変異性体および/もしくはその製薬上許容される塩、および/もしく
はその製薬上許容される溶媒和物からなり、式中、A７は置換されたもしくはさ
れていないアリール基を表し；A８は合計で5個までの置換基を有するベンゼン環
を表し；X８はO、S、もしくはNR３９を表し、ここでR３９は水素原子、アルキル
基、アシル基、アラルキル基（アラルキル基はアリール部分が置換されたもしく
はされていないものである）、または置換されたもしくはされていないアリール
基を表し；Y３はOもしくはSを表し；R３７は水素を表し；R３８は水素もしくは
アルキル、アラルキル、もしくはアリール基を表し、またはR３７はR３８と共同
して1つの結合を表し；nは2〜6の範囲の整数を表す。
またはその互変異性体および/もしくはその製薬上許容される塩、および/もしく
はその製薬上許容される溶媒和物からなり、式中、A７は置換されたもしくはさ
れていないアリール基を表し；A８は合計で5個までの置換基を有するベンゼン環
を表し；X８はO、S、もしくはNR３９を表し、ここでR３９は水素原子、アルキル
基、アシル基、アラルキル基（アラルキル基はアリール部分が置換されたもしく
はされていないものである）、または置換されたもしくはされていないアリール
基を表し；Y３はOもしくはSを表し；R３７は水素を表し；R３８は水素もしくは
アルキル、アラルキル、もしくはアリール基を表し、またはR３７はR３８と共同
して1つの結合を表し；nは2〜6の範囲の整数を表す。
【０１０８】 本発明のいくつかの実施形態においては、治療用薬剤は図15の式XIの化合物、
またはその互変異性体および/もしくはその製薬上許容される塩、および/もしく
はその製薬上許容される溶媒和物からなり、式中、A１は置換されたもしくはさ
れていない芳香族複素環基を表し；R１は水素原子、アルキル基、アシル基、ア
ラルキル基（アラルキル基はアリール部分が置換されたもしくはされていないも
のである）または置換されたもしくはされていないアリール基を表し；A２は合
計で5個までの置換基を有するベンゼン環を表し；nは2〜6までの範囲の整数を表
す。適切な芳香族複素環基は、置換されたもしくはされていない、単環もしくは
縮合環の、4個以内のヘテロ原子からなる芳香族複素環基であり、各環内のヘテ
ロ原子は酸素、イオウ、もしくは窒素から選択される。好ましい芳香族複素環基
としては、4〜7個の、好ましくは5〜6個の環の構成原子を有する、置換されたも
しくはされていない単環の芳香族複素環基を含む。とりわけ、その芳香族複素環
基は1、2、もしくは3個のヘテロ原子、特に1もしくは2個の、酸素、イオウ、も
しくは窒素から選択されるヘテロ原子を含む。A１の適切な意味としてはそれが5
員環の芳香族複素環基を表す場合にはチアゾリルおよびオキサゾイル、とりわけ
オキサゾイルが挙げられる。A１の適切な意味はそれが6員環の芳香族複素環基を
表す場合にはピリジルもしくはピリミジニルが挙げられる。
またはその互変異性体および/もしくはその製薬上許容される塩、および/もしく
はその製薬上許容される溶媒和物からなり、式中、A１は置換されたもしくはさ
れていない芳香族複素環基を表し；R１は水素原子、アルキル基、アシル基、ア
ラルキル基（アラルキル基はアリール部分が置換されたもしくはされていないも
のである）または置換されたもしくはされていないアリール基を表し；A２は合
計で5個までの置換基を有するベンゼン環を表し；nは2〜6までの範囲の整数を表
す。適切な芳香族複素環基は、置換されたもしくはされていない、単環もしくは
縮合環の、4個以内のヘテロ原子からなる芳香族複素環基であり、各環内のヘテ
ロ原子は酸素、イオウ、もしくは窒素から選択される。好ましい芳香族複素環基
としては、4〜7個の、好ましくは5〜6個の環の構成原子を有する、置換されたも
しくはされていない単環の芳香族複素環基を含む。とりわけ、その芳香族複素環
基は1、2、もしくは3個のヘテロ原子、特に1もしくは2個の、酸素、イオウ、も
しくは窒素から選択されるヘテロ原子を含む。A１の適切な意味としてはそれが5
員環の芳香族複素環基を表す場合にはチアゾリルおよびオキサゾイル、とりわけ
オキサゾイルが挙げられる。A１の適切な意味はそれが6員環の芳香族複素環基を
表す場合にはピリジルもしくはピリミジニルが挙げられる。
【０１０９】 本発明のいくつかの実施形態においては、治療用薬剤は図15の式XIIおよびXII
Iの化合物、もしくはそれらの製薬上許容される塩からなり、式中、点線は結合
もしくは結合がないことを示し；Rは3〜7個の炭素原子を有するシクロアルキル
、ナフチル、チエニル、フリル、フェニルもしくは置換されたフェニル（ここで
置換基は1〜3個の炭素原子を有するアルキル、1〜3個の炭素原子を有するアルコ
キシ、トリフルオロメチル、クロロ、フルオロ、またはビス(トリフルオロメチ
ル)である）；R１は1〜3個の炭素原子を有するアルキルであり；XはOもしくはC
＝O；AはOもしくはS；BはNもしくはCHである。
Iの化合物、もしくはそれらの製薬上許容される塩からなり、式中、点線は結合
もしくは結合がないことを示し；Rは3〜7個の炭素原子を有するシクロアルキル
、ナフチル、チエニル、フリル、フェニルもしくは置換されたフェニル（ここで
置換基は1〜3個の炭素原子を有するアルキル、1〜3個の炭素原子を有するアルコ
キシ、トリフルオロメチル、クロロ、フルオロ、またはビス(トリフルオロメチ
ル)である）；R１は1〜3個の炭素原子を有するアルキルであり；XはOもしくはC
＝O；AはOもしくはS；BはNもしくはCHである。
【０１１０】 本発明のいくつかの実施形態は化合物IからXIIIの化合物のアルツハイマー病
ならびに炎症性成分が関与する疾患と症状の治療のための使用を含んでいる。こ
れらの化合物を本明細書ではチアゾリジン誘導体と呼ぶ。必要に応じて、チアゾ
リジン誘導体の具体的名称が用いられ、そのようなものとしては、トログリタゾ
ン、シグリタゾン、ピオグリタゾン、およびBRL49653が挙げられる。
ならびに炎症性成分が関与する疾患と症状の治療のための使用を含んでいる。こ
れらの化合物を本明細書ではチアゾリジン誘導体と呼ぶ。必要に応じて、チアゾ
リジン誘導体の具体的名称が用いられ、そのようなものとしては、トログリタゾ
ン、シグリタゾン、ピオグリタゾン、およびBRL49653が挙げられる。
【０１１１】 好ましい化合物群は式XIのものであって、式中、点線は結合がないことを表し
、R１はメチル、XはO、およびAはOのものである。この化合物群の中で特に好ま
しいものは、式中、Rがフェニル、2-ナフチル、および3,5-ビス(トリフルオロメ
チル)フェニルであるような化合物である。好ましい化合物の別の1群としては式
XIIIのものであって、式中、点線は結合がないことを表し、R１はメチルであり
、AはOのものである。この化合物群中で特に好ましいものは、式中、BがCH、Rは
フェノール、p-トリル、m-トリル、シクロヘキシル、および2-ナフチルのもので
ある。本発明の別の実施形態においては、BはNでRはフェニルである。
、R１はメチル、XはO、およびAはOのものである。この化合物群の中で特に好ま
しいものは、式中、Rがフェニル、2-ナフチル、および3,5-ビス(トリフルオロメ
チル)フェニルであるような化合物である。好ましい化合物の別の1群としては式
XIIIのものであって、式中、点線は結合がないことを表し、R１はメチルであり
、AはOのものである。この化合物群中で特に好ましいものは、式中、BがCH、Rは
フェノール、p-トリル、m-トリル、シクロヘキシル、および2-ナフチルのもので
ある。本発明の別の実施形態においては、BはNでRはフェニルである。
【０１１２】 さらに別の実施形態においては、本発明は式IからXIIIを含む、少なくとも1つ
の組成物の有効量を単位剤形で投与するのに適した医薬組成物の使用方法を提供
する。また別の実施形態においては、組成物はさらに製薬上許容される担体を含
む。
の組成物の有効量を単位剤形で投与するのに適した医薬組成物の使用方法を提供
する。また別の実施形態においては、組成物はさらに製薬上許容される担体を含
む。
【０１１３】 本発明の組成物の具体的な例としては、限定はされないが次のものを挙げるこ
とができる：(＋)-5[[4-[3,4-ジヒドロ-6-ヒドロキシ-2,5,7,8-テトラメチル-2H
-1-ベンゾピラン-2-イル]メトキシ]フェニル]メチル]-2,4-チアゾリジンジオン(
トログリタゾン)；4-(2-ナフチルメチル)-1,2,3,5-オキサチアジアゾール-2-オ
キシド；5-[4-[2-[N-(ベンゾキシアゾール-2-イル)-N-メチルアミノ]エトキシ]
ベンジル]-5-メチルチアゾリジン-2,4-ジオン；5-[4-[2-[2,4-ジオキソ-5-フェ
ニルチアゾリジン-3-イル)エトキシ]ベンジル]チアゾリジン-2,4-ジオン；5-[4-
[2-[N-メチル-N-(フェノキシカルボニル)アミノ]エトキシ]ベンジル]チアゾリジ
ン-2,4-ジオン；5-[4-(2-フェノキシエトキシ)ベンジル]チアゾリジン-2,4-ジオ
ン；5-[4-[2-(4-クロロフェニル)エチルスルホニル]ベンジル]チアゾリジン-2,4
-ジオン；5-[4-[3-(5-メチル-2-フェニルオキサゾール-4-イル)プロピオニル]ベ
ンジル]チアゾリジン-2,4-ジオン；5-[4-[(1-メチルシクロヘキシル)メトキシ]
ベンジル]チアジアゾリジン-2,4-ジオン(シグリタゾン)；5-[[4-(3-ヒドロキシ-
1-メチルシクロヘキシル)メトキシ]ベンジル]チアジアゾリジン-2,4-ジオン；5-
[4-[2-(5-メチル-2-フェニルオキサゾール-4-イル)エトキシ]ベンジル]チアジゾ
リジオン-2,4-ジオン；5-[4-[2-(5-エチルピリジン-2-イル)エトキシル]ベンジ
ル]チアジアゾリジン-2,4-ジオン(ピオグリタゾン)；5-[(2-ベンジル-2,3-ジヒ
ドロベンゾピラン)-5-イルメチル]チアジアゾリン-2,4-ジオン(エングリタゾン)
；5-[[2-(2-ナフチルメチル)ベンゾキサゾール]-5-イルメチル]チアジアゾリン-
2,4-ジオン；5-[4-[2-(3-フェニルウレイド)エトキシル]ベンジル]チアジアゾリ
ン-2,4-ジオン；5-[4-[2-[N-(ベンゾキサゾール-2-イル)-N-メチルアミノ]エト
キシ]ベンジル]チアジアゾリン-2,4-ジオン；5-[4-[3-(5-メチル-2-フェニルオ
キサゾール-4-イル)プロピオ ニル]ベンジル]チアジアゾリン-2,4-ジオン；5-[2-(5-メチル-2-フェニルオキサ
ゾール-4-イルメチル)ベンゾフラン-5-イルメチル]-オキサゾリジン-2,4-ジオン
；5-[4-[2-[N-メチル-N-(2-ピリジル)アミノ]エトキシ]ベンジル]チアゾリジン-
2,4-ジオン(BRL49653)；および5-[4-[2-[N-(ベンゾキサゾール-2-イル)-N-メチ
ルアミノ]エトキシ]ベンジル]-オキサゾリジン-2,4-ジオン。
とができる：(＋)-5[[4-[3,4-ジヒドロ-6-ヒドロキシ-2,5,7,8-テトラメチル-2H
-1-ベンゾピラン-2-イル]メトキシ]フェニル]メチル]-2,4-チアゾリジンジオン(
トログリタゾン)；4-(2-ナフチルメチル)-1,2,3,5-オキサチアジアゾール-2-オ
キシド；5-[4-[2-[N-(ベンゾキシアゾール-2-イル)-N-メチルアミノ]エトキシ]
ベンジル]-5-メチルチアゾリジン-2,4-ジオン；5-[4-[2-[2,4-ジオキソ-5-フェ
ニルチアゾリジン-3-イル)エトキシ]ベンジル]チアゾリジン-2,4-ジオン；5-[4-
[2-[N-メチル-N-(フェノキシカルボニル)アミノ]エトキシ]ベンジル]チアゾリジ
ン-2,4-ジオン；5-[4-(2-フェノキシエトキシ)ベンジル]チアゾリジン-2,4-ジオ
ン；5-[4-[2-(4-クロロフェニル)エチルスルホニル]ベンジル]チアゾリジン-2,4
-ジオン；5-[4-[3-(5-メチル-2-フェニルオキサゾール-4-イル)プロピオニル]ベ
ンジル]チアゾリジン-2,4-ジオン；5-[4-[(1-メチルシクロヘキシル)メトキシ]
ベンジル]チアジアゾリジン-2,4-ジオン(シグリタゾン)；5-[[4-(3-ヒドロキシ-
1-メチルシクロヘキシル)メトキシ]ベンジル]チアジアゾリジン-2,4-ジオン；5-
[4-[2-(5-メチル-2-フェニルオキサゾール-4-イル)エトキシ]ベンジル]チアジゾ
リジオン-2,4-ジオン；5-[4-[2-(5-エチルピリジン-2-イル)エトキシル]ベンジ
ル]チアジアゾリジン-2,4-ジオン(ピオグリタゾン)；5-[(2-ベンジル-2,3-ジヒ
ドロベンゾピラン)-5-イルメチル]チアジアゾリン-2,4-ジオン(エングリタゾン)
；5-[[2-(2-ナフチルメチル)ベンゾキサゾール]-5-イルメチル]チアジアゾリン-
2,4-ジオン；5-[4-[2-(3-フェニルウレイド)エトキシル]ベンジル]チアジアゾリ
ン-2,4-ジオン；5-[4-[2-[N-(ベンゾキサゾール-2-イル)-N-メチルアミノ]エト
キシ]ベンジル]チアジアゾリン-2,4-ジオン；5-[4-[3-(5-メチル-2-フェニルオ
キサゾール-4-イル)プロピオ ニル]ベンジル]チアジアゾリン-2,4-ジオン；5-[2-(5-メチル-2-フェニルオキサ
ゾール-4-イルメチル)ベンゾフラン-5-イルメチル]-オキサゾリジン-2,4-ジオン
；5-[4-[2-[N-メチル-N-(2-ピリジル)アミノ]エトキシ]ベンジル]チアゾリジン-
2,4-ジオン(BRL49653)；および5-[4-[2-[N-(ベンゾキサゾール-2-イル)-N-メチ
ルアミノ]エトキシ]ベンジル]-オキサゾリジン-2,4-ジオン。
【０１１４】 本発明の別の実施形態においては、治療用薬剤は図16に示す構造を有する化合
物を含み、その構造中でAは水素もしくは環のαもしくはβの位置の脱離基から
選択されたものであるか、または環のCαとCβの間に二重結合がある場合にはA
は存在せず；Xはアルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアル
ケニル、アルキル、もしくは2〜15個までの範囲の炭素原子を有する置換された
アルキニル基であり；Yはアルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換さ
れたアルケニル、アルキニル、もしくは2〜15個までの範囲の炭素原子を有する
置換されたアルキニル基である。本明細書で用いられている「脱離基」という用
語は前駆体化合物から、例えば、E2脱離条件下での求核性置換などによって、お
よび類似の方法によって容易に除去することのできる官能基を意味する。例とし
ては、限定はされないが、ヒドロキシ基、アルコキシ基、トシラート、ブロシラ
ート（brosylate）、ハロゲンなどが挙げられる。
物を含み、その構造中でAは水素もしくは環のαもしくはβの位置の脱離基から
選択されたものであるか、または環のCαとCβの間に二重結合がある場合にはA
は存在せず；Xはアルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアル
ケニル、アルキル、もしくは2〜15個までの範囲の炭素原子を有する置換された
アルキニル基であり；Yはアルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換さ
れたアルケニル、アルキニル、もしくは2〜15個までの範囲の炭素原子を有する
置換されたアルキニル基である。本明細書で用いられている「脱離基」という用
語は前駆体化合物から、例えば、E2脱離条件下での求核性置換などによって、お
よび類似の方法によって容易に除去することのできる官能基を意味する。例とし
ては、限定はされないが、ヒドロキシ基、アルコキシ基、トシラート、ブロシラ
ート（brosylate）、ハロゲンなどが挙げられる。
【０１１５】 本発明の治療用薬剤(例えば、図15の式I−XIIIに記載の化合物)はさらに製薬
上許容される酸付加および/もしくは塩基性塩の双方を形成することができる。
これらの形態の全てが本発明の範囲内に含まれる。
上許容される酸付加および/もしくは塩基性塩の双方を形成することができる。
これらの形態の全てが本発明の範囲内に含まれる。
【０１１６】 本発明の製薬上許容される酸付加塩としては、限定はされないが、塩酸、硝酸
、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、フッ化水素酸、亜リン酸などの無
毒な無機酸に由来する塩、ならびに脂肪族モノ-およびジカルボン酸、フェニル
で置換されたアルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、アルカン二酸、芳香族酸、脂
肪族および芳香族スルホン酸などの無毒の有機酸から由来する塩が挙げられる。
そのような塩としては硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、ビス亜硫酸塩
bissulfite、硝酸塩、リン酸塩、一水素リン酸塩、二水素リン酸塩、メタリン酸
塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、
プロピオン酸塩、カプリル酸塩、イソブチル酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コ
ハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、malcate、マンデル酸塩(
mandelate)、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息
香酸塩、フタル酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、フェニル
酢酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩な
どが挙げられる。また、アルギニンなどのアミノ酸の塩、ならびにグルコン酸塩
、ガラクツロン酸塩、およびn-メチルグルカミンなども包含される(例えば、Ber
geら, J. Pharm. Science 66:1[1977]を参照せよ)。
、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、フッ化水素酸、亜リン酸などの無
毒な無機酸に由来する塩、ならびに脂肪族モノ-およびジカルボン酸、フェニル
で置換されたアルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、アルカン二酸、芳香族酸、脂
肪族および芳香族スルホン酸などの無毒の有機酸から由来する塩が挙げられる。
そのような塩としては硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、ビス亜硫酸塩
bissulfite、硝酸塩、リン酸塩、一水素リン酸塩、二水素リン酸塩、メタリン酸
塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、
プロピオン酸塩、カプリル酸塩、イソブチル酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コ
ハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、malcate、マンデル酸塩(
mandelate)、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息
香酸塩、フタル酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、フェニル
酢酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩な
どが挙げられる。また、アルギニンなどのアミノ酸の塩、ならびにグルコン酸塩
、ガラクツロン酸塩、およびn-メチルグルカミンなども包含される(例えば、Ber
geら, J. Pharm. Science 66:1[1977]を参照せよ)。
【０１１７】 塩基性化合物の酸付加塩は、遊離塩基形態のものを十分量の所望の酸と接触さ
せることによって従来法で塩を生成させて調製される。遊離塩基形態のものは、
従来法もしくは上述の方法でその塩形態のものを塩基と接触させ遊離塩基を単離
することにより再生することができる。遊離塩基形態のものはその塩形態のもの
とは極性溶媒への溶解性などの特定の物理的特性においていくらか異なるが、素
その他の点では、本発明の目的では塩はそれの遊離塩基と同等である。
せることによって従来法で塩を生成させて調製される。遊離塩基形態のものは、
従来法もしくは上述の方法でその塩形態のものを塩基と接触させ遊離塩基を単離
することにより再生することができる。遊離塩基形態のものはその塩形態のもの
とは極性溶媒への溶解性などの特定の物理的特性においていくらか異なるが、素
その他の点では、本発明の目的では塩はそれの遊離塩基と同等である。
【０１１８】 製薬上許容される塩基付加塩はアルカリ金属およびアルカリ土類金属または有
機アミンなどの金属もしくはアミンを用いて形成される。陽イオンとして用いら
れる金属の例としては、限定はされないが、ナトリウム、カリウム、マグネシウ
ム、カルシウムなどが挙げられる。適切なアミンの例としては、限定はされない
が、N２N'-ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノ
ールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、N-メチルグルカミン
、およびプロカインが挙げられる(例えば、Bergeら, J. Pharm. Science 66:1[1
977]を参照せよ)。
機アミンなどの金属もしくはアミンを用いて形成される。陽イオンとして用いら
れる金属の例としては、限定はされないが、ナトリウム、カリウム、マグネシウ
ム、カルシウムなどが挙げられる。適切なアミンの例としては、限定はされない
が、N２N'-ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノ
ールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、N-メチルグルカミン
、およびプロカインが挙げられる(例えば、Bergeら, J. Pharm. Science 66:1[1
977]を参照せよ)。
【０１１９】 酸性化合物の塩基付加塩は、遊離酸形態のものを十分量の所望の塩基と接触さ
せ、従来法で塩を生成させることによって調製される。遊離酸形態のものは、従
来法もしくは上述の方法でその塩形態を酸と接触させ遊離酸を単離することによ
り再生することができる。遊離酸形態のものはその塩形態のものと極性溶媒への
溶解性などの特定の物理的特性においていくらか異なるが、その他の点で本発明
の目的では、塩はそれの遊離酸と同等である。
せ、従来法で塩を生成させることによって調製される。遊離酸形態のものは、従
来法もしくは上述の方法でその塩形態を酸と接触させ遊離酸を単離することによ
り再生することができる。遊離酸形態のものはその塩形態のものと極性溶媒への
溶解性などの特定の物理的特性においていくらか異なるが、その他の点で本発明
の目的では、塩はそれの遊離酸と同等である。
【０１２０】 本発明の化合物のある種のものは溶媒和していない形態のものおよび溶媒和し
た形態のもので存在することができ、そのようなものとしては、限定はされない
が、水和した形のものが挙げられる。通常は、水和を含む溶媒和した形のものは
そうでない形のものと同等で、本発明の範囲内に包含されることを意図している
。本発明の化合物のある種のものは1個以上のキラル中心を有し、各中心は異な
る立体配置で存在しうる。従って、その化合物は立体異性体を形成することがで
きる。本明細書では限られた数の分子式によってそれら全てを代表させているが
、本発明は、個々の単離した異性体およびラセミ体を含むそれらの混合物の双方
の使用を含んでいる。その化合物を調製する際に立体特異的な合成技法が行われ
る場合、もしくは光学活性化合物が出発材料として用いられる場合には、個々の
異性体を直接的に調製することができる。しかし、異性体の混合物が調製されれ
ば、個々の異性体は従来の分離技法で得ることができ、またはその混合物はその
まま用いることができる。
た形態のもので存在することができ、そのようなものとしては、限定はされない
が、水和した形のものが挙げられる。通常は、水和を含む溶媒和した形のものは
そうでない形のものと同等で、本発明の範囲内に包含されることを意図している
。本発明の化合物のある種のものは1個以上のキラル中心を有し、各中心は異な
る立体配置で存在しうる。従って、その化合物は立体異性体を形成することがで
きる。本明細書では限られた数の分子式によってそれら全てを代表させているが
、本発明は、個々の単離した異性体およびラセミ体を含むそれらの混合物の双方
の使用を含んでいる。その化合物を調製する際に立体特異的な合成技法が行われ
る場合、もしくは光学活性化合物が出発材料として用いられる場合には、個々の
異性体を直接的に調製することができる。しかし、異性体の混合物が調製されれ
ば、個々の異性体は従来の分離技法で得ることができ、またはその混合物はその
まま用いることができる。
【０１２１】 さらに、式IからXIIIの化合物のチアゾリデンもしくはオキサゾリデン部分は
互変異性体形態で存在することができ、本発明の一部をなすことを意図している
。
互変異性体形態で存在することができ、本発明の一部をなすことを意図している
。
【０１２２】 本発明の化合物から医薬組成物を調製するためには、製薬上許容される担体は
適切なものであればどのような形態でもよい(例えば、個体、液体、ゲル、その
他)。固体製剤としては、限定はされないが、粉末、錠剤、丸剤、カプセル剤、
カシェ剤、坐剤、および分散しうる顆粒剤が挙げられる。固体担体は1種以上の
物質とすることができ、それはまた希釈剤、香料、結合剤、保存剤、錠剤崩壊剤
、もしくは被包化物質としても作用する。本発明は治療用組成物の投与のための
種々の技法を包含している。適切な投与経路としては、限定はされないが、経口
、直腸、経皮、経膣、経粘膜、もしくは経腸投与；筋肉内、皮下、髄内注射、な
らびに鞘内、直接的心室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、もしくは眼内注射などの
非経口投与が特に挙げられる。本発明がいずれか特定の投与経路に限定されるこ
とは意図していない。
適切なものであればどのような形態でもよい(例えば、個体、液体、ゲル、その
他)。固体製剤としては、限定はされないが、粉末、錠剤、丸剤、カプセル剤、
カシェ剤、坐剤、および分散しうる顆粒剤が挙げられる。固体担体は1種以上の
物質とすることができ、それはまた希釈剤、香料、結合剤、保存剤、錠剤崩壊剤
、もしくは被包化物質としても作用する。本発明は治療用組成物の投与のための
種々の技法を包含している。適切な投与経路としては、限定はされないが、経口
、直腸、経皮、経膣、経粘膜、もしくは経腸投与；筋肉内、皮下、髄内注射、な
らびに鞘内、直接的心室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、もしくは眼内注射などの
非経口投与が特に挙げられる。本発明がいずれか特定の投与経路に限定されるこ
とは意図していない。
【０１２３】 注射用として、本発明の薬剤は水溶液中、好ましくは生理学的に両立しうるバ
ッファー、例えばHank's溶液、リンゲル液、もしくは生理的食塩水バッファー中
に製剤化することができる。経粘膜投与のためにはその浸透すべきバリアに適切
な浸透剤が製剤中に用いられる。そのような浸透剤は当業界では一般的に知られ
ている。
ッファー、例えばHank's溶液、リンゲル液、もしくは生理的食塩水バッファー中
に製剤化することができる。経粘膜投与のためにはその浸透すべきバリアに適切
な浸透剤が製剤中に用いられる。そのような浸透剤は当業界では一般的に知られ
ている。
【０１２４】 粉末剤では、担体は微細化した固体で、それは微細化した活性成分との混合物
中にある。錠剤では、活性成分は必要な結合特性を有し担体と適切な比率で混合
され、所望のサイズおよび形に成型される。
中にある。錠剤では、活性成分は必要な結合特性を有し担体と適切な比率で混合
され、所望のサイズおよび形に成型される。
【０１２５】 これらの粉末と錠剤は好ましくは活性化合物を5もしくは10%〜約70%まで含有
する。適切な担体としては、限定はされないが、炭酸マグネシウム、ステアリン
酸マグネシウム、タルク、ショ糖、乳糖、ペクチン、デキストリン、デンプン、
ゼラチン、トラガカンタ、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナト
リウム、低融点ロウ、カカオ脂などがその他の実施形態のなかで特に挙げられる
(例えば、固体、ゲル、および液体の形状で)。「調製」という用語は、活性化合
物を担体としての被包材料を用いて製剤化してカプセル剤を提供することをも包
含しており、そのカプセル中で活性化合物はその他の担体と共に、もしくはその
他の担体なしで、ある担体によって取り囲まれ、それによって活性化合物は担体
と会合している。同様に、カシェ剤およびトローチ剤も含まれる。錠剤、粉末、
カプセル剤、丸剤、カシェ剤、およびトローチ剤は経口投与に適した固体剤形と
して用いることができる。
する。適切な担体としては、限定はされないが、炭酸マグネシウム、ステアリン
酸マグネシウム、タルク、ショ糖、乳糖、ペクチン、デキストリン、デンプン、
ゼラチン、トラガカンタ、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナト
リウム、低融点ロウ、カカオ脂などがその他の実施形態のなかで特に挙げられる
(例えば、固体、ゲル、および液体の形状で)。「調製」という用語は、活性化合
物を担体としての被包材料を用いて製剤化してカプセル剤を提供することをも包
含しており、そのカプセル中で活性化合物はその他の担体と共に、もしくはその
他の担体なしで、ある担体によって取り囲まれ、それによって活性化合物は担体
と会合している。同様に、カシェ剤およびトローチ剤も含まれる。錠剤、粉末、
カプセル剤、丸剤、カシェ剤、およびトローチ剤は経口投与に適した固体剤形と
して用いることができる。
【０１２６】 坐剤の調製には、本発明のいくつかの実施形態においては、低融点のロウ例え
ば脂肪酸グリセリドまたはカカオ脂の混合物をまず溶融し、活性化合物を均一に
、例えば攪拌によって、その中に分散する。次いで溶融した均一な混合物を都合
のよいサイズの型に注ぎ込み、冷却して投与に適切な形態に固化させる。
ば脂肪酸グリセリドまたはカカオ脂の混合物をまず溶融し、活性化合物を均一に
、例えば攪拌によって、その中に分散する。次いで溶融した均一な混合物を都合
のよいサイズの型に注ぎ込み、冷却して投与に適切な形態に固化させる。
【０１２７】 液状の製剤としては、限定はされないが、溶液剤、懸濁剤、および乳剤(例え
ば、水もしくは水プロピレングリコール溶液)が挙げられる。非経口注射用には
、本発明のいくつかの実施形態においては、液状製剤がポリエチレングリコール
水溶液中の溶液として製剤化される。経口投与に適する水性溶液は活性化合物を
水に溶解し、適切な着色剤、香料、ならびに安定化剤および増粘剤を所望により
添加することによって調製することができる。経口投与に適する水性懸濁液は微
細なものとした活性化合物を粘性材料、例えば天然もしくは合成ゴム、樹脂、メ
チルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、およびその他の既知
の懸濁剤などと共に水中に分散することによって製造することができる。
ば、水もしくは水プロピレングリコール溶液)が挙げられる。非経口注射用には
、本発明のいくつかの実施形態においては、液状製剤がポリエチレングリコール
水溶液中の溶液として製剤化される。経口投与に適する水性溶液は活性化合物を
水に溶解し、適切な着色剤、香料、ならびに安定化剤および増粘剤を所望により
添加することによって調製することができる。経口投与に適する水性懸濁液は微
細なものとした活性化合物を粘性材料、例えば天然もしくは合成ゴム、樹脂、メ
チルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、およびその他の既知
の懸濁剤などと共に水中に分散することによって製造することができる。
【０１２８】 また、使用の直前に経口投与用の液状製剤に転換することを意図した固体製剤
も含まれる。そのような液状品としては溶液剤、懸濁剤、および乳剤が挙げられ
る。これらの製剤は活性化合物に加えて、着色剤、香料、安定化剤、バッファー
、人工および天然甘味料、分散剤、増粘剤、可溶化剤およびその他同種のものを
含有することができる。
も含まれる。そのような液状品としては溶液剤、懸濁剤、および乳剤が挙げられ
る。これらの製剤は活性化合物に加えて、着色剤、香料、安定化剤、バッファー
、人工および天然甘味料、分散剤、増粘剤、可溶化剤およびその他同種のものを
含有することができる。
【０１２９】 これらの医薬製剤は好ましくは単位剤形である。そのような形態では製剤はさ
らに、適切な量の活性化合物を含有する単位用量に再分割される。その単位剤形
は包装された製剤とすることができ、そのパッケージには、例えば小分包化した
錠剤、カプセル剤、およびバイアル瓶もしくはアンプル内の粉末などの、別々の
量の製剤が含有されている。単位剤形はまた、カプセル剤、錠剤、カシェ剤、も
しくはトローチ剤それ自体とすることができ、これらの任意のものが適当な数で
パッケージされた形態のものとすることができる。
らに、適切な量の活性化合物を含有する単位用量に再分割される。その単位剤形
は包装された製剤とすることができ、そのパッケージには、例えば小分包化した
錠剤、カプセル剤、およびバイアル瓶もしくはアンプル内の粉末などの、別々の
量の製剤が含有されている。単位剤形はまた、カプセル剤、錠剤、カシェ剤、も
しくはトローチ剤それ自体とすることができ、これらの任意のものが適当な数で
パッケージされた形態のものとすることができる。
【０１３０】 単位剤形中の活性化合物の量は変えることができ、または0.1mg〜100mgまで、
好ましくは0.5mg〜100mgの範囲に活性化合物の特定の用途および活性化合物の力
価に従って調節することができる。所望により、該組成物は他の両立しうる治療
用薬剤を含有することもできる。医薬組成物を調製する一般的方法についてはRe
mington's Pharmaceutical Science, E.W.Martin編, Mack Publishing Co., 米
国ペンシルベニア州(1990)に述べられている。
好ましくは0.5mg〜100mgの範囲に活性化合物の特定の用途および活性化合物の力
価に従って調節することができる。所望により、該組成物は他の両立しうる治療
用薬剤を含有することもできる。医薬組成物を調製する一般的方法についてはRe
mington's Pharmaceutical Science, E.W.Martin編, Mack Publishing Co., 米
国ペンシルベニア州(1990)に述べられている。
【０１３１】 臨床上の特徴の評価および個々の患者に対する適切な治療レジメンの設計は究
極的には処方医の責任である。処方医の患者評価の一部として、担当医は毒性も
しくは臓器機能不全により、いつどのような方法で投与を終了し、中断し、もし
くは調整するかを承知していると考えられる。逆に、担当医は、臨床的応答が不
十分な状況下では毒性を避けつつ治療をより高いレベルへと調節することも知っ
ている。対象とする障害の管理において投与量の大きさは治療しようとする病状
の重篤度、患者の個々の生理学的、生化学的その他の条件、および投与経路によ
って異なる。病状の重篤度は、例えば、部分的には標準的な予後評価法によって
評価することができる。さらに、用量および投与頻度も、年齢、体重、性別、お
よび個々の患者の治療への応答によって変わってくる。
極的には処方医の責任である。処方医の患者評価の一部として、担当医は毒性も
しくは臓器機能不全により、いつどのような方法で投与を終了し、中断し、もし
くは調整するかを承知していると考えられる。逆に、担当医は、臨床的応答が不
十分な状況下では毒性を避けつつ治療をより高いレベルへと調節することも知っ
ている。対象とする障害の管理において投与量の大きさは治療しようとする病状
の重篤度、患者の個々の生理学的、生化学的その他の条件、および投与経路によ
って異なる。病状の重篤度は、例えば、部分的には標準的な予後評価法によって
評価することができる。さらに、用量および投与頻度も、年齢、体重、性別、お
よび個々の患者の治療への応答によって変わってくる。
【０１３２】II. 治療薬の活性 上記治療薬は、アルツハイマー病および炎症性成分が原因の疾患または症状、
例えば発作、虚血による神経系の障害、神経傷害（例えば衝撃による脳の障害、
脊髄損傷、および神経系の外傷性障害など）、多発性硬化症、および他の免疫に
関わる神経障害（例えばギヤン‐バレー症候群およびその変種、急性運動軸索神
経障害、急性炎症性脱髄性多発性神経炎、およびフィッシャー症候群など）、HI
V/エイズ痴呆、ならびに細菌性、寄生生物性、真菌性、およびウイルス性の髄膜
炎および脳炎を含む（ただしこれらに限定されない）疾患および症状の治療に有
用である。以下の説明は、該治療薬の活性を示す実施例を提供する。
例えば発作、虚血による神経系の障害、神経傷害（例えば衝撃による脳の障害、
脊髄損傷、および神経系の外傷性障害など）、多発性硬化症、および他の免疫に
関わる神経障害（例えばギヤン‐バレー症候群およびその変種、急性運動軸索神
経障害、急性炎症性脱髄性多発性神経炎、およびフィッシャー症候群など）、HI
V/エイズ痴呆、ならびに細菌性、寄生生物性、真菌性、およびウイルス性の髄膜
炎および脳炎を含む（ただしこれらに限定されない）疾患および症状の治療に有
用である。以下の説明は、該治療薬の活性を示す実施例を提供する。
【０１３３】 本発明の開発中に、実験により、PPARγアゴニストがAβ-刺激誘導型マクロフ
ァージ分化を遮断することが示された（例えば実施例２を参照されたい）。さら
に、PPARγアゴニストは、ミクログリアにより媒介される星状細胞の活性化を遮
断し、単球により媒介される神経毒性を予防した（例えば実施例３および４を参
照されたい）。Aβまたは他の免疫刺激によるミクログリアの活性化の１つの結
果として、サイトカイン産生が刺激される。本発明のPPARγアゴニストは、サイ
トカインであるインターロイキン-6（IL-6）およびTNF-αの発現を阻害すること
が分かった（例えば実施例５を参照されたい）。また、PPARγアゴニストは、CO
X-2の発現も阻害した（例えば実施例６を参照されたい）。これらの観察結果は
、本発明の治療薬が、アルツハイマーおよび他の炎症性疾患におけるCOX-2の作
用を抑制するための新規治療法を提供することを示した。
ァージ分化を遮断することが示された（例えば実施例２を参照されたい）。さら
に、PPARγアゴニストは、ミクログリアにより媒介される星状細胞の活性化を遮
断し、単球により媒介される神経毒性を予防した（例えば実施例３および４を参
照されたい）。Aβまたは他の免疫刺激によるミクログリアの活性化の１つの結
果として、サイトカイン産生が刺激される。本発明のPPARγアゴニストは、サイ
トカインであるインターロイキン-6（IL-6）およびTNF-αの発現を阻害すること
が分かった（例えば実施例５を参照されたい）。また、PPARγアゴニストは、CO
X-2の発現も阻害した（例えば実施例６を参照されたい）。これらの観察結果は
、本発明の治療薬が、アルツハイマーおよび他の炎症性疾患におけるCOX-2の作
用を抑制するための新規治療法を提供することを示した。
【０１３４】 COX-2遺伝子は極初期遺伝子であり、その転写活性化は、まだ特徴付けられて
いないシグナル伝達経路を介して媒介される（Smithら, J. Biol. Chem. 271: 3
3157[1996]）。ミクログリアおよびマクロファージにおけるリポ多糖（LPS）刺
激によるCOX-2誘導については調査されており、これらの研究により、その発現
にはNF-κBが必要であることが確立された（Bauerら, Eur. J. Biochem. 243: 7
26[1997]；およびHwangら, Biochem Pharmacol 54:87[1997]）。これは、他の細
胞系から得たデータと一致する（Inoueら, J. Biol. Chem. 270: 24965[1995]；
およびYamamotoら, J. Biol. Chem. 270: 31315[1995]）。COX-2プロモーターは
必須cAMP応答配列（CRE）を含む多数の正の調節エレメントを保持しているが、N
F-κBの必要性以外に、本発明以前には、COS-2発現がどのように調節されるのか
、およびどのシグナル伝達経路がこの遺伝子のプロモーターに影響を与えるのか
ということは、はっきりしていなかった。さらに、本発明は、COX-2プロモータ
ーで同定された第１の負の作用を持つエレメントを提供する。
いないシグナル伝達経路を介して媒介される（Smithら, J. Biol. Chem. 271: 3
3157[1996]）。ミクログリアおよびマクロファージにおけるリポ多糖（LPS）刺
激によるCOX-2誘導については調査されており、これらの研究により、その発現
にはNF-κBが必要であることが確立された（Bauerら, Eur. J. Biochem. 243: 7
26[1997]；およびHwangら, Biochem Pharmacol 54:87[1997]）。これは、他の細
胞系から得たデータと一致する（Inoueら, J. Biol. Chem. 270: 24965[1995]；
およびYamamotoら, J. Biol. Chem. 270: 31315[1995]）。COX-2プロモーターは
必須cAMP応答配列（CRE）を含む多数の正の調節エレメントを保持しているが、N
F-κBの必要性以外に、本発明以前には、COS-2発現がどのように調節されるのか
、およびどのシグナル伝達経路がこの遺伝子のプロモーターに影響を与えるのか
ということは、はっきりしていなかった。さらに、本発明は、COX-2プロモータ
ーで同定された第１の負の作用を持つエレメントを提供する。
【０１３５】 さらに、本発明の開発中に行った実験は、単球およびマクロファージのAβ処
理によって、COX-2発現の誘導が速くなり且つ持続されることを示した（例えば
実施例６および７を参照されたい）。重要なことに、これらの実験により、ホル
ボールエステルによるCOX-2の誘導が、cis作用性プロモーターエレメントに対す
るPPARγアゴニストの作用によって大きく阻害されることが示された。COX-2発
現がPPARγアゴニストによってその阻害性プロモーターエレメントに対する作用
により阻害されるという知見は、前炎症性物質（例えばプロスタグランジンE2な
ど）の合成を阻害するための他の治療選択肢を提供する。
理によって、COX-2発現の誘導が速くなり且つ持続されることを示した（例えば
実施例６および７を参照されたい）。重要なことに、これらの実験により、ホル
ボールエステルによるCOX-2の誘導が、cis作用性プロモーターエレメントに対す
るPPARγアゴニストの作用によって大きく阻害されることが示された。COX-2発
現がPPARγアゴニストによってその阻害性プロモーターエレメントに対する作用
により阻害されるという知見は、前炎症性物質（例えばプロスタグランジンE2な
ど）の合成を阻害するための他の治療選択肢を提供する。
【０１３６】 また、本発明の開発中に行われた実験は、PPARγアゴニストがAβに対するミ
クログリアの多様な応答を強力に阻害することも示した。このように、これらの
物質は、アルツハイマー病および有意な炎症性成分が原因の他の疾患（中でも例
えば発作、外傷性損傷、および脊髄損傷など）の治療における治療薬として有用
であることが分かった。上記のように、PPARγアゴニストの多くは、経口投与後
に十分なバイオアベイラビリティを示し、これらの使用に伴う毒性を殆どまたは
全く持たない（例えばSaltielおよびOlefsky, Diabete 45: 1661[1996]；Wangら
, Br. J. Pharmacol. 122:1405[1997]；およびOakesら, Metabolism 46: 935[19
97]を参照されたい）。このように、本発明は、アルツハイマー病および炎症性
成分が原因の他の疾患または症状における進行性の神経変性過程を和らげるため
の方法および組成物を提供する。しかし、本発明は特定のメカニズムに限定され
るものではない。実際に、本発明を実施するためにこのようなメカニズムの理解
は必要ではない。
クログリアの多様な応答を強力に阻害することも示した。このように、これらの
物質は、アルツハイマー病および有意な炎症性成分が原因の他の疾患（中でも例
えば発作、外傷性損傷、および脊髄損傷など）の治療における治療薬として有用
であることが分かった。上記のように、PPARγアゴニストの多くは、経口投与後
に十分なバイオアベイラビリティを示し、これらの使用に伴う毒性を殆どまたは
全く持たない（例えばSaltielおよびOlefsky, Diabete 45: 1661[1996]；Wangら
, Br. J. Pharmacol. 122:1405[1997]；およびOakesら, Metabolism 46: 935[19
97]を参照されたい）。このように、本発明は、アルツハイマー病および炎症性
成分が原因の他の疾患または症状における進行性の神経変性過程を和らげるため
の方法および組成物を提供する。しかし、本発明は特定のメカニズムに限定され
るものではない。実際に、本発明を実施するためにこのようなメカニズムの理解
は必要ではない。
【０１３７】 本発明の方法および組成物の一般的な適用性をさらに示すために、中枢神経系
損傷を治療する、特に炎症を治療して損傷後の２次障害を防ぐこれらの能力を立
証するための実験を行った。長い間、哺乳動物の中枢神経系（CNS）への損傷は
永久的な能力障害につながると認識されていた。最も重要であるが未だ十分に理
解されていないCNS損傷の結果の１つは、脳および脊髄の損傷にみられる独特の
進行性である。多年にわたりCNS損傷の研究分野を悩ましてきたこの問題は、CNS
の外傷後に２次的事象として起こる連続的な壊死および腔または嚢の発生である
。このような空洞化は、小さな初期の病巣から発達して、損傷の元の領域から吻
側および尾側に広がる大きな空洞へと進行する（Balentine, Lab. Invest. 39:
236[1978]）。研究者らは、空洞化および中心壊死は虚血性損傷（Balentine(前
掲)）、出血症（Duckerら, J. Neurosurg. 35:700[1971]；およびWallaceら, Su
rg. Neurol. 27: 209[1987]）、神経リゾチーム活性（Kaoら, J. Neurosurg 46:
757[1977]）または血清蛋白の血液脳関門の通過（FitchおよびSilver, Exp. Neu
ro. 148: 587[1997]）に関係があるという仮設を立てたが、多くの証拠は、この
病理過程にとってマクロファージの浸潤および炎症がキーとなることを指摘して
いる（Blight, Neuroscience 60: 263[1994]; Szezepanikら, Neuroscience 70:
57[1996]; FitchおよびSilver(前掲)；およびZhangら, Exp. Neurology 143: 1
41[1997]）。これは、軸索再生が起こるのに適した細胞基質を無細胞嚢が持たな
いので、さらなる研究の重要な治療的目標である（Guthら, Exp. Neurol. 88:1[
198]）。さらに、この炎症性反応は、サイトカイン、特にTNF-α、IL-1βおよび
IL-6の局所的な合成および分泌も伴う。
損傷を治療する、特に炎症を治療して損傷後の２次障害を防ぐこれらの能力を立
証するための実験を行った。長い間、哺乳動物の中枢神経系（CNS）への損傷は
永久的な能力障害につながると認識されていた。最も重要であるが未だ十分に理
解されていないCNS損傷の結果の１つは、脳および脊髄の損傷にみられる独特の
進行性である。多年にわたりCNS損傷の研究分野を悩ましてきたこの問題は、CNS
の外傷後に２次的事象として起こる連続的な壊死および腔または嚢の発生である
。このような空洞化は、小さな初期の病巣から発達して、損傷の元の領域から吻
側および尾側に広がる大きな空洞へと進行する（Balentine, Lab. Invest. 39:
236[1978]）。研究者らは、空洞化および中心壊死は虚血性損傷（Balentine(前
掲)）、出血症（Duckerら, J. Neurosurg. 35:700[1971]；およびWallaceら, Su
rg. Neurol. 27: 209[1987]）、神経リゾチーム活性（Kaoら, J. Neurosurg 46:
757[1977]）または血清蛋白の血液脳関門の通過（FitchおよびSilver, Exp. Neu
ro. 148: 587[1997]）に関係があるという仮設を立てたが、多くの証拠は、この
病理過程にとってマクロファージの浸潤および炎症がキーとなることを指摘して
いる（Blight, Neuroscience 60: 263[1994]; Szezepanikら, Neuroscience 70:
57[1996]; FitchおよびSilver(前掲)；およびZhangら, Exp. Neurology 143: 1
41[1997]）。これは、軸索再生が起こるのに適した細胞基質を無細胞嚢が持たな
いので、さらなる研究の重要な治療的目標である（Guthら, Exp. Neurol. 88:1[
198]）。さらに、この炎症性反応は、サイトカイン、特にTNF-α、IL-1βおよび
IL-6の局所的な合成および分泌も伴う。
【０１３８】 損傷後に中枢神経系（CNS）で起こる炎症性反応は、主に２つの成分、つまり
内因性ミクログリアの活性化、ならびに骨髄由来マクロファージおよび末梢血流
からの他の炎症性細胞の漸増で構成される。多くの研究者らは、損傷に対するこ
の反応が、CNS内の２次障害に貢献すると考えている（例えばBlight, Neuroscie
nce 60: 263[1994]を参照されたい）。また、ミクログリアサイトカインは、損
傷後の神経系の機能障害の原因となりうるものであると示唆されてきており（Gi
ulianら, J. Neurosci. 9:4116[1989]）、また好中球は、CNS損傷の後に壊死お
よび炎症を促進し得る（MeansおよびAnerson, J. Neuropathol. Exp. Neurol. 4
2: 707[1983]）。ミクログリアは、ニューロンを殺すことができる細胞毒性因子
を放出することができ（Banatiら, Glia 7:111[1993]；およびGiulian, Glia 7:
102[1993]）、また、既存のニューロンの繋がりを切断し、損傷の周りの領域に
存在するニューロンを破壊する役割を担うと示唆されてきた（Giulianら、Neuro
chem. Int. 25: 227[1994]；およびGiulianら、Dev. Neurosci. 16: 128[1994]
）。多くの著者は、CNSへの２次障害を食い止める１つの方法としてミクログリ
ア/マクロファージの分泌活性を改変するための治療薬の使用を主張してきた（
例えばGiulianおよびLachman, Science 228:497[1985]；Giulianら, [1989]（前
掲）；Banatiら（前掲）；Guthら, Expl. Neurol. 126: 76[1994]；Guthら, Pro
c. Natl. Acad. Sci. 91: 12308[1994]；およびZhangら（前掲）を参照されたい
）。
内因性ミクログリアの活性化、ならびに骨髄由来マクロファージおよび末梢血流
からの他の炎症性細胞の漸増で構成される。多くの研究者らは、損傷に対するこ
の反応が、CNS内の２次障害に貢献すると考えている（例えばBlight, Neuroscie
nce 60: 263[1994]を参照されたい）。また、ミクログリアサイトカインは、損
傷後の神経系の機能障害の原因となりうるものであると示唆されてきており（Gi
ulianら, J. Neurosci. 9:4116[1989]）、また好中球は、CNS損傷の後に壊死お
よび炎症を促進し得る（MeansおよびAnerson, J. Neuropathol. Exp. Neurol. 4
2: 707[1983]）。ミクログリアは、ニューロンを殺すことができる細胞毒性因子
を放出することができ（Banatiら, Glia 7:111[1993]；およびGiulian, Glia 7:
102[1993]）、また、既存のニューロンの繋がりを切断し、損傷の周りの領域に
存在するニューロンを破壊する役割を担うと示唆されてきた（Giulianら、Neuro
chem. Int. 25: 227[1994]；およびGiulianら、Dev. Neurosci. 16: 128[1994]
）。多くの著者は、CNSへの２次障害を食い止める１つの方法としてミクログリ
ア/マクロファージの分泌活性を改変するための治療薬の使用を主張してきた（
例えばGiulianおよびLachman, Science 228:497[1985]；Giulianら, [1989]（前
掲）；Banatiら（前掲）；Guthら, Expl. Neurol. 126: 76[1994]；Guthら, Pro
c. Natl. Acad. Sci. 91: 12308[1994]；およびZhangら（前掲）を参照されたい
）。
【０１３９】 外傷後のCNSにおけるこの２次障害は、しばしば進行性の壊死および嚢の空洞
化を招き、損傷のサイズおよび程度の大幅な拡大につながり得る。進行性壊死の
拡大を食い止めることができるか否かを測定するために、動物モデルにおいて様
々な抗炎症剤がテストされてきた（Zhangら（前掲））。本発明の開発中に行っ
た実験は、PPARγアゴニストが嚢の空洞化の予防に有用であり、CNS損傷後の臨
床結果を改善するための手段を提供することを示す。
化を招き、損傷のサイズおよび程度の大幅な拡大につながり得る。進行性壊死の
拡大を食い止めることができるか否かを測定するために、動物モデルにおいて様
々な抗炎症剤がテストされてきた（Zhangら（前掲））。本発明の開発中に行っ
た実験は、PPARγアゴニストが嚢の空洞化の予防に有用であり、CNS損傷後の臨
床結果を改善するための手段を提供することを示す。
【０１４０】 本発明の開発中に行った実験は、活性化マクロファージまたは非活性化マクロ
ファージを導入した時のコンフルエントな単層における星状細胞の反応（神経系
における外傷の後に起こる事象の順番に似た反応）を比較するために、進行性壊
死の組織培養モデルを用いた（例えば実施例８を参照されたい）。外傷後にin v
ivoで見られるように、本発明のモデルは、２つの主な細胞型を直接的に接触お
よび相互作用をさせる。各細胞型の生細胞および死細胞の数を定量的に測定し、
各培養物について「培養腔」のサイズを測定した。これらの腔は、細胞を全く含
まない培養物の領域（すなわち、もともと星状細胞の集密的単層によって覆われ
ていたが後に細胞が無くなった領域）として観測された。これは、脳または骨髄
の損傷後に起こる進行性壊死の結果生じる嚢腔において見られる無星状細胞領域
に似ている。これらの腔は、星状細胞の死、星状細胞の移出、または両プロセス
の様々な組合せによって生じ得る。
ファージを導入した時のコンフルエントな単層における星状細胞の反応（神経系
における外傷の後に起こる事象の順番に似た反応）を比較するために、進行性壊
死の組織培養モデルを用いた（例えば実施例８を参照されたい）。外傷後にin v
ivoで見られるように、本発明のモデルは、２つの主な細胞型を直接的に接触お
よび相互作用をさせる。各細胞型の生細胞および死細胞の数を定量的に測定し、
各培養物について「培養腔」のサイズを測定した。これらの腔は、細胞を全く含
まない培養物の領域（すなわち、もともと星状細胞の集密的単層によって覆われ
ていたが後に細胞が無くなった領域）として観測された。これは、脳または骨髄
の損傷後に起こる進行性壊死の結果生じる嚢腔において見られる無星状細胞領域
に似ている。これらの腔は、星状細胞の死、星状細胞の移出、または両プロセス
の様々な組合せによって生じ得る。
【０１４１】 図17のグラフは、マクロファージの活性化および抗炎症性PPARγアゴニストを
用いた治療による、星状細胞-マクロファージ共培養物における変化の定量的分
析を示す。各治療カテゴリーは、適切な薬物またはビヒクルで処理した非活性化
マクロファージ対照（各対照群の平均を1に設定）と比べて表されている。アス
タリスクは、分散分析（ANOVA）のためのFisher’s PLSD法によって、プールし
た「対照：非活性化マクロファージ」群に対する統計的有意差（p<0.5）を示す
。図17に示すように、活性化されたマクロファージは、CNS損傷後に見られる空
洞の発生に良く似た変化を星状細胞培養物において誘導した。顕微鏡視野あたり
の星状細胞消失領域は、無処置（ビヒクル）の活性化マクロファージによって有
意に増加し、これは、in vivo CNS損傷後に見られる空洞化に似ている。活性化
マクロファージのインドメタシン処置（100μM）は、対照レベルと比べて培養腔
面積のこの増加を妨げなかった。対照的に、活性化マクロファージのプロスタグ
ランジンJ2処置（10μM）およびシグリタゾン処置（50μM）は、星状細胞培養物
と相互作用しながら、非活性化マクロファージを用いたこれらの対照レベルに比
べて培養腔面積の増加を完全に止めた。プロスタグランジンJ2の場合、視野あた
りの培養物空洞化の平均サイズは、対照レベルに維持された（すなわち腔サイズ
の増加は妨げられた）が、シグリタゾンは、視野あたりの腔のサイズを対照の腔
サイズより大幅に小さくした。
用いた治療による、星状細胞-マクロファージ共培養物における変化の定量的分
析を示す。各治療カテゴリーは、適切な薬物またはビヒクルで処理した非活性化
マクロファージ対照（各対照群の平均を1に設定）と比べて表されている。アス
タリスクは、分散分析（ANOVA）のためのFisher’s PLSD法によって、プールし
た「対照：非活性化マクロファージ」群に対する統計的有意差（p<0.5）を示す
。図17に示すように、活性化されたマクロファージは、CNS損傷後に見られる空
洞の発生に良く似た変化を星状細胞培養物において誘導した。顕微鏡視野あたり
の星状細胞消失領域は、無処置（ビヒクル）の活性化マクロファージによって有
意に増加し、これは、in vivo CNS損傷後に見られる空洞化に似ている。活性化
マクロファージのインドメタシン処置（100μM）は、対照レベルと比べて培養腔
面積のこの増加を妨げなかった。対照的に、活性化マクロファージのプロスタグ
ランジンJ2処置（10μM）およびシグリタゾン処置（50μM）は、星状細胞培養物
と相互作用しながら、非活性化マクロファージを用いたこれらの対照レベルに比
べて培養腔面積の増加を完全に止めた。プロスタグランジンJ2の場合、視野あた
りの培養物空洞化の平均サイズは、対照レベルに維持された（すなわち腔サイズ
の増加は妨げられた）が、シグリタゾンは、視野あたりの腔のサイズを対照の腔
サイズより大幅に小さくした。
【０１４２】 これらの結果は、PPARγアゴニストがCNS損傷に伴う進行性壊死における活性
化マクロファージの破壊的影響を効果的に遮断することができることを、定性的
および定量的に示す。また、これらの結果は、本発明の方法および組成物（例え
ばPPARγアゴニスト）が、最初の外傷の重篤度が増す中で２次障害につながるよ
うな炎症性続発症を防ぐために、骨髄および脳の損傷のin vivo治療において重
要な治療的用途に用いられることも示す。
化マクロファージの破壊的影響を効果的に遮断することができることを、定性的
および定量的に示す。また、これらの結果は、本発明の方法および組成物（例え
ばPPARγアゴニスト）が、最初の外傷の重篤度が増す中で２次障害につながるよ
うな炎症性続発症を防ぐために、骨髄および脳の損傷のin vivo治療において重
要な治療的用途に用いられることも示す。
【０１４３】 以下の説明は、本発明の幾つかの臨床適用のための用量および治療条件を評価
するためのテストモデルを提供する。これらの実施例は、一連の適用とこのよう
な治療において使用される一般的手順を示すために提供されるが、本発明の用途
をこれらの具体的な実施例に限定することを意図するものではない。当業者であ
れば、これらの手順が様々な臨床適用に広く応用できることが分かるであろう。
選択されたモデルおよび治療の実施に関して、本発明の精神から逸脱することな
く、変化を加えることができることを理解されたい。
するためのテストモデルを提供する。これらの実施例は、一連の適用とこのよう
な治療において使用される一般的手順を示すために提供されるが、本発明の用途
をこれらの具体的な実施例に限定することを意図するものではない。当業者であ
れば、これらの手順が様々な臨床適用に広く応用できることが分かるであろう。
選択されたモデルおよび治療の実施に関して、本発明の精神から逸脱することな
く、変化を加えることができることを理解されたい。
【０１４４】A. 多発性硬化症および免疫性神経障害 本発明の治療薬を用いた治療薬は、多発性硬化症および免疫性神経障害の動物
疾患モデルに使用することができると考えられる。多発性硬化症（MS）、ギヤン
‐バレー症候群、および同類の自己免疫疾患の主な動物モデルは、げっ歯類実験
的自己免疫性神経障害（EAN）である（例えばGauppら, J. Neuroimmunol. 79:12
9[1997]；およびHoら, Ann. Rev. Neurosci. 21: 187[1998]を参照されたい）。
疾患モデルに使用することができると考えられる。多発性硬化症（MS）、ギヤン
‐バレー症候群、および同類の自己免疫疾患の主な動物モデルは、げっ歯類実験
的自己免疫性神経障害（EAN）である（例えばGauppら, J. Neuroimmunol. 79:12
9[1997]；およびHoら, Ann. Rev. Neurosci. 21: 187[1998]を参照されたい）。
【０１４５】 このように、幾つかの実施形態において、本発明の方法および組成物は、臨床
的および病理的マーカーを抑制するPPARγアゴニストの効力を測定するために使
用することができる。EANは、猛烈な脱髄、臨床的神経脱落および麻痺を引き起
こし、これはあきらかにリンパ球、マクロファージおよび単球の活性化ならびに
これに伴うサイトカイン発現の誘導によるものである。前炎症性サイトカインは
疾患の主な病理学的特徴に関連しており、これらの発現の阻害は、この病理的影
響の強さおよび臨床結果を低減させると考えられる。
的および病理的マーカーを抑制するPPARγアゴニストの効力を測定するために使
用することができる。EANは、猛烈な脱髄、臨床的神経脱落および麻痺を引き起
こし、これはあきらかにリンパ球、マクロファージおよび単球の活性化ならびに
これに伴うサイトカイン発現の誘導によるものである。前炎症性サイトカインは
疾患の主な病理学的特徴に関連しており、これらの発現の阻害は、この病理的影
響の強さおよび臨床結果を低減させると考えられる。
【０１４６】 常染色体優性遺伝子がMHC遺伝子クラスターにリンクしているためルイスラッ
トはEAEにかかりやすいので、EAEのルイスラットモデルを用いた実験が考えられ
る（Zhuら, J. Neuroimmunol. 84:40[1998]；およびMartineyら, J. Immunol. 1
60: 5588[1998]）。これらの実験では、フロイントの完全アジュバント中の末梢
神経系ミエリンでルイスラットを免疫する。その後、これらのラットは末梢肢節
虚弱を発症し、これは進行すると最終的に麻痺となる。神経脱落は、0〜5段階で
評価し、0は脱落が観察されなかったことを示し、5は完全な麻痺を示す。臨床的
機能障害の開始時刻および重篤度を45日日にわたり評価する。この期間の間を通
して、脳および骨髄の両方に由来するTNF-α、IL-1βおよびIL-6mRNAレベルの準
定量的な（semi-quantitative）分析のためのRT-PCRを用いて、サイトカインの
発現を評価する。これらの動物に、PPARγアゴニスト、トログリタゾン（レズリ
ン）（10〜50mg/kg）、ドコサヘキサン酸（100mg/kg）およびインドメタシン（2
mg/kg）、またはビヒクル（対照）を経口投与する。実験の第１組は、免疫時か
ら始まって45日の評価期間の間、治療薬により動物を治療する。最初の実験の後
、治療薬の用量を再評価し、症状の発症時まで薬物投与を遅らせて実験を行う。
トはEAEにかかりやすいので、EAEのルイスラットモデルを用いた実験が考えられ
る（Zhuら, J. Neuroimmunol. 84:40[1998]；およびMartineyら, J. Immunol. 1
60: 5588[1998]）。これらの実験では、フロイントの完全アジュバント中の末梢
神経系ミエリンでルイスラットを免疫する。その後、これらのラットは末梢肢節
虚弱を発症し、これは進行すると最終的に麻痺となる。神経脱落は、0〜5段階で
評価し、0は脱落が観察されなかったことを示し、5は完全な麻痺を示す。臨床的
機能障害の開始時刻および重篤度を45日日にわたり評価する。この期間の間を通
して、脳および骨髄の両方に由来するTNF-α、IL-1βおよびIL-6mRNAレベルの準
定量的な（semi-quantitative）分析のためのRT-PCRを用いて、サイトカインの
発現を評価する。これらの動物に、PPARγアゴニスト、トログリタゾン（レズリ
ン）（10〜50mg/kg）、ドコサヘキサン酸（100mg/kg）およびインドメタシン（2
mg/kg）、またはビヒクル（対照）を経口投与する。実験の第１組は、免疫時か
ら始まって45日の評価期間の間、治療薬により動物を治療する。最初の実験の後
、治療薬の用量を再評価し、症状の発症時まで薬物投与を遅らせて実験を行う。
【０１４７】B. 発作および虚血性脳損傷 前炎症性サイトカインは、発作および他の虚血性脳損傷を伴う進行性の神経病
理学的変化において重大な役割を担う（SharmaおよびKumar, Metab. Brain Dis.
13:1[1998]；およびRothwellら, J. Clin. Invest. 100: 2648[1998]）。脳内
に虚血が起こると、脳内の神経病理学的変化にメカニズム上関連する様々なサイ
トカイン（特にIL-1β、TNF-αおよびIL-6）の発現が誘導される。虚血の臨床的
および解剖学的続発症を緩和するためにサイトカインの作用を阻害する実験的治
療が報告されている。
理学的変化において重大な役割を担う（SharmaおよびKumar, Metab. Brain Dis.
13:1[1998]；およびRothwellら, J. Clin. Invest. 100: 2648[1998]）。脳内
に虚血が起こると、脳内の神経病理学的変化にメカニズム上関連する様々なサイ
トカイン（特にIL-1β、TNF-αおよびIL-6）の発現が誘導される。虚血の臨床的
および解剖学的続発症を緩和するためにサイトカインの作用を阻害する実験的治
療が報告されている。
【０１４８】 げっ歯類の発作モデルを使用する実験が考えられる。このモデルでは、成体Sp
rague-Dawleyラットにおいて熱凝固により中大脳動脈（MCA）を閉塞させる。次
に、14日間以上の様々な間隔後にこれらの動物を解剖する（Hillhouseら, Neuro
sci. Lett. 249: 177[1997]）。脳を切片に分け、梗塞部分および脳浮腫を評価
し、梗塞自体の中、該梗塞の周辺領域および虚血の影響を受けない領域における
IL-1β、TNF-α、およびIL-6のmRNAレベルを、RT-PCRによって測定する（Sharma
およびKumar(前掲)）。最初の研究において、実験前の一週間および虚血後期間
を通して、PPARγアゴニストであるインドメタシン（2mg/kg）、ドコサヘキサン
酸（100mg/kg）、トログリタゾン（10〜50mg/kg）、またはビヒクル（対照）を
用いて動物を毎日（経口投与により）処理する。また、MCA閉塞の直後にPPARγ
アゴニストを与えた動物においてフォローアップ実験を行う。これらの動物を、
最初の４時間は１時間毎に、および72時間のあいだ24時間毎に、モニターする。
rague-Dawleyラットにおいて熱凝固により中大脳動脈（MCA）を閉塞させる。次
に、14日間以上の様々な間隔後にこれらの動物を解剖する（Hillhouseら, Neuro
sci. Lett. 249: 177[1997]）。脳を切片に分け、梗塞部分および脳浮腫を評価
し、梗塞自体の中、該梗塞の周辺領域および虚血の影響を受けない領域における
IL-1β、TNF-α、およびIL-6のmRNAレベルを、RT-PCRによって測定する（Sharma
およびKumar(前掲)）。最初の研究において、実験前の一週間および虚血後期間
を通して、PPARγアゴニストであるインドメタシン（2mg/kg）、ドコサヘキサン
酸（100mg/kg）、トログリタゾン（10〜50mg/kg）、またはビヒクル（対照）を
用いて動物を毎日（経口投与により）処理する。また、MCA閉塞の直後にPPARγ
アゴニストを与えた動物においてフォローアップ実験を行う。これらの動物を、
最初の４時間は１時間毎に、および72時間のあいだ24時間毎に、モニターする。
【０１４９】C. 外傷による脳および脊髄の損傷 神経系への外傷的損傷（脳および脊髄の衝撃および貫通による損傷を含む）は
、前炎症性サイトカインの局所的合成および分泌を引き起こす。サイトカインの
レベルの上昇は、外傷的損傷に伴う病理学的変化を開始および変化させることが
分かっている。特に、TNF-α、IL-1β、およびIL-6のレベルは、損傷後に星状細
胞およびミクログリアからこれらが放出される結果、有意に増大することが分か
っている。神経系への外傷的損傷に伴う２次変化の多くは、この免疫性２次変性
反応に関連していた。
、前炎症性サイトカインの局所的合成および分泌を引き起こす。サイトカインの
レベルの上昇は、外傷的損傷に伴う病理学的変化を開始および変化させることが
分かっている。特に、TNF-α、IL-1β、およびIL-6のレベルは、損傷後に星状細
胞およびミクログリアからこれらが放出される結果、有意に増大することが分か
っている。神経系への外傷的損傷に伴う２次変化の多くは、この免疫性２次変性
反応に関連していた。
【０１５０】 本発明の幾つかの実施形態において、実験は、十分確立された骨髄挫傷損傷モ
デルを用いて、PPARγアゴニストが腔サイズの削減および外傷からの行動回復の
改善において及ぼす影響を測定する。１つの実施形態において、これらの実験は
、嚢の空洞化につながり得る直接的な損傷のモデルを提供するNYU Weight-Drop
デバイスを使用する（例えばConstantiniおよびYoung, J. Neurosurg. 80: 97[1
994]；およびBassoら, Exp. Neuro. 139: 244[1996]を参照されたい）。この装
置は、4段階の傷害重篤度で、標準化された再現可能な挫傷による損傷を脊髄に
与える。これらの実験において、成体Sprague-Dawleyラットを4つのグループに
分け、各々に4段階の重篤度の挫傷による損傷を脊髄に与える。実験的な損傷を
与えた日から、対照動物にはビヒクルのみを毎日経口投与し、実験グループには
、PPARγアゴニストであるドコサヘキサン酸（100mg/kg）、トログリタゾン（10
〜50mg/kg）、またはインドメタシン（2mg/kg）を毎日経口投与する。これらの
動物の行動的回復を、Basso、BeattieおよびBresnahanスケール（BBBスケール）
に基づいて、後脚の機能をモニターする0〜21スケールで、6週間にわたり毎週評
価する（Bassoら（前掲））。各グループから数匹の動物を24時間、48時間およ
びその後毎週犠牲にし、組織学的評価、ならびに病巣サイズ、腔サイズ、および
軸索変性変化の定量を行う。脊髄の障害領域、該障害のすぐ周辺の領域、および
損傷から離れた領域における炎症性サイトカインTNF-α、IL-1βおよびIL-6のレ
ベルを、損傷後１日、14日および42日目にRT-PCRによって評価する。
デルを用いて、PPARγアゴニストが腔サイズの削減および外傷からの行動回復の
改善において及ぼす影響を測定する。１つの実施形態において、これらの実験は
、嚢の空洞化につながり得る直接的な損傷のモデルを提供するNYU Weight-Drop
デバイスを使用する（例えばConstantiniおよびYoung, J. Neurosurg. 80: 97[1
994]；およびBassoら, Exp. Neuro. 139: 244[1996]を参照されたい）。この装
置は、4段階の傷害重篤度で、標準化された再現可能な挫傷による損傷を脊髄に
与える。これらの実験において、成体Sprague-Dawleyラットを4つのグループに
分け、各々に4段階の重篤度の挫傷による損傷を脊髄に与える。実験的な損傷を
与えた日から、対照動物にはビヒクルのみを毎日経口投与し、実験グループには
、PPARγアゴニストであるドコサヘキサン酸（100mg/kg）、トログリタゾン（10
〜50mg/kg）、またはインドメタシン（2mg/kg）を毎日経口投与する。これらの
動物の行動的回復を、Basso、BeattieおよびBresnahanスケール（BBBスケール）
に基づいて、後脚の機能をモニターする0〜21スケールで、6週間にわたり毎週評
価する（Bassoら（前掲））。各グループから数匹の動物を24時間、48時間およ
びその後毎週犠牲にし、組織学的評価、ならびに病巣サイズ、腔サイズ、および
軸索変性変化の定量を行う。脊髄の障害領域、該障害のすぐ周辺の領域、および
損傷から離れた領域における炎症性サイトカインTNF-α、IL-1βおよびIL-6のレ
ベルを、損傷後１日、14日および42日目にRT-PCRによって評価する。
【０１５１】D. アルツハイマー病患者におけるPPARγアゴニストの臨床学的評価 罹患した患者におけるその病気の進行を測定する臨床実験において、PPARγア
ゴニストの効力を評価する。例えば、１組の実験において、n-3脂肪酸、ドコサ
ヘキサン酸、およびチアゾリジンジオンであるトログリタゾン（レズリン）を二
重盲検、プラセボコントロール、無作為試験でテストする。
ゴニストの効力を評価する。例えば、１組の実験において、n-3脂肪酸、ドコサ
ヘキサン酸、およびチアゾリジンジオンであるトログリタゾン（レズリン）を二
重盲検、プラセボコントロール、無作為試験でテストする。
【０１５２】 主な患者登録基準は、他の中枢神経系疾患を持たない中程度の重篤度のアルツ
ハイマー病（臨床学的重篤度＝2）に罹り、精神活性薬物の投与を受けず、自宅
で生活している患者である。2年間にわたり、一次および２次予後測定の両方を
用いて患者を診察することにより、病気の進行速度を評価する。臨床学的評価は
、3ヶ月間隔で行う。一次予後測定は、死亡時期、特殊施設への収容、Blessed D
ementia Scaleを用いて測定される3つの基本的な日常活動の内の２つを行う能力
の喪失（例えばHeunら, Int. J. Geriatr. Psychiatry 13:368[1998]を参照され
たい）、および重い臨床痴呆（臨床痴呆等級=3）を含む。２次予後測定は、認識
力（精神状態のミニ検査およびアルツハイマー病評価スケール[例えばRogersら,
Arch. Intern. Med. 158: 1021(1998)]）、および行動（痴呆についての行動等
級スケール[例えばHeunら(前掲)を参照されたい]）、および機能の測定を含む。
機能は、道具を使った行動（例えばリストを覚えたりお金を扱ったり等）および
基本的な行動（例えば食べる、トイレを使う、身だしなみを整える等）によって
評価する。
ハイマー病（臨床学的重篤度＝2）に罹り、精神活性薬物の投与を受けず、自宅
で生活している患者である。2年間にわたり、一次および２次予後測定の両方を
用いて患者を診察することにより、病気の進行速度を評価する。臨床学的評価は
、3ヶ月間隔で行う。一次予後測定は、死亡時期、特殊施設への収容、Blessed D
ementia Scaleを用いて測定される3つの基本的な日常活動の内の２つを行う能力
の喪失（例えばHeunら, Int. J. Geriatr. Psychiatry 13:368[1998]を参照され
たい）、および重い臨床痴呆（臨床痴呆等級=3）を含む。２次予後測定は、認識
力（精神状態のミニ検査およびアルツハイマー病評価スケール[例えばRogersら,
Arch. Intern. Med. 158: 1021(1998)]）、および行動（痴呆についての行動等
級スケール[例えばHeunら(前掲)を参照されたい]）、および機能の測定を含む。
機能は、道具を使った行動（例えばリストを覚えたりお金を扱ったり等）および
基本的な行動（例えば食べる、トイレを使う、身だしなみを整える等）によって
評価する。
【０１５３】 患者にはDHA（6mg/日）を経口投与により与えた。この用量は、十分耐量範囲
内であることが証明されており、この用量での脂肪酸の代謝について多くのデー
タが文書化されている（Nelsonら, Lipids 32: 1137[1997]）。400mg/日の用量
でトログリタゾン（レズリン）をテストする。この用量は、糖尿病適用に推奨さ
れるものであり、この病気の進行実験の設計は、アルツハイマー病に対するビタ
ミンEの効果についての過去の研究において実証済みである（Sanoら, New Engl.
J. Med. 336: 1216[1997]）。
内であることが証明されており、この用量での脂肪酸の代謝について多くのデー
タが文書化されている（Nelsonら, Lipids 32: 1137[1997]）。400mg/日の用量
でトログリタゾン（レズリン）をテストする。この用量は、糖尿病適用に推奨さ
れるものであり、この病気の進行実験の設計は、アルツハイマー病に対するビタ
ミンEの効果についての過去の研究において実証済みである（Sanoら, New Engl.
J. Med. 336: 1216[1997]）。
【０１５４】 動物およびヒト実験におけるPPARγアゴニストの効力をテストするための他の
方法は、当分野において公知であり（例えばJohnsonら, Ann. Pharma. 32: 337[
1998]；Loiら, J. Clin. Pharmacol. 37: 1038[1997]；Suterら, Diabetes Care
15:193[1992]；Ogiharaら, Am. J. Hypertens. 8:316[1995]；Iwamotoら, Diab
etes Care 19: 151[1996]；Iwamotoら, Diabetes Care 14: 1083[1991]；Nolan
ら, N. Engl. J. Med. 331: 1188[1994]；Antonucciら,Diabetes Care 20:188[1
997]；およびGhazziら, Diabetes 46: 433[1997]を参照されたい）、本発明によ
り考慮される。
方法は、当分野において公知であり（例えばJohnsonら, Ann. Pharma. 32: 337[
1998]；Loiら, J. Clin. Pharmacol. 37: 1038[1997]；Suterら, Diabetes Care
15:193[1992]；Ogiharaら, Am. J. Hypertens. 8:316[1995]；Iwamotoら, Diab
etes Care 19: 151[1996]；Iwamotoら, Diabetes Care 14: 1083[1991]；Nolan
ら, N. Engl. J. Med. 331: 1188[1994]；Antonucciら,Diabetes Care 20:188[1
997]；およびGhazziら, Diabetes 46: 433[1997]を参照されたい）、本発明によ
り考慮される。
【０１５５】III. 薬物のスクリーニングおよび疾患の分子調節 本発明は、COX-2発現を制御する、COS-2発現に影響を及ぼす因子を同定する（
例えば薬物スクリーニング法）、およびCOS-2の過剰発現または過小発現に伴う
病状に関係のあるシグナル伝達経路を同定および制御するための、新規調節配列
を提供する。特に、本発明は、本発明の開発中に同定されたPPARγエンハンサー
を用いる方法および組成物を提供する。上記炎症性の疾患および症状の他に、本
発明の方法および組成物は、COX-2発現によって影響を受ける様々な生理学的事
象および細胞事象に利用できる。このような事象としては特に、ホルモンシグナ
ル伝達、成長因子シグナル伝達、結腸直腸癌等の癌（例えばFranzeseら, Melano
ma Res. 8:323[1998]を参照されたい）、視力（例えばCamrasら, Opthamology 1
03, 1916[1996]を参照されたい）、睡眠/覚醒サイクル（例えばScrammellら, Pr
oc. Natl. Acad. Sci., 95:7754[1998]を参照されたい）、血小板凝集（例えばW
u, J. Formos, Med. Assoc. 95, 661[1996]を参照されたい）、黄体融解（例え
ばTsaiおよびWiltbank, Biol. Reprod. 57, 1016[1997]を参照されたい）、細胞
の分化および発生、慢性関節リウマチや変形性関節症（Vaneら, Ann. Rev. Phar
m. Tox. 38:97[1998]）、ならびに痛覚過敏、異痛症および過温症（Kaufmannら,
Prostaglandins 54:601[1997]）が挙げられるが、これらに限定されない。
例えば薬物スクリーニング法）、およびCOS-2の過剰発現または過小発現に伴う
病状に関係のあるシグナル伝達経路を同定および制御するための、新規調節配列
を提供する。特に、本発明は、本発明の開発中に同定されたPPARγエンハンサー
を用いる方法および組成物を提供する。上記炎症性の疾患および症状の他に、本
発明の方法および組成物は、COX-2発現によって影響を受ける様々な生理学的事
象および細胞事象に利用できる。このような事象としては特に、ホルモンシグナ
ル伝達、成長因子シグナル伝達、結腸直腸癌等の癌（例えばFranzeseら, Melano
ma Res. 8:323[1998]を参照されたい）、視力（例えばCamrasら, Opthamology 1
03, 1916[1996]を参照されたい）、睡眠/覚醒サイクル（例えばScrammellら, Pr
oc. Natl. Acad. Sci., 95:7754[1998]を参照されたい）、血小板凝集（例えばW
u, J. Formos, Med. Assoc. 95, 661[1996]を参照されたい）、黄体融解（例え
ばTsaiおよびWiltbank, Biol. Reprod. 57, 1016[1997]を参照されたい）、細胞
の分化および発生、慢性関節リウマチや変形性関節症（Vaneら, Ann. Rev. Phar
m. Tox. 38:97[1998]）、ならびに痛覚過敏、異痛症および過温症（Kaufmannら,
Prostaglandins 54:601[1997]）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５６】 シクロオキシゲナーゼ-2（シクロオキシゲナーゼ酵素の誘導可能な形態）は、
プロスタグランジンの病理学的作用（炎症性物質、ホルモン、成長因子およびサ
イトカイン等の物質に応答して該酵素の急速な誘導が起こる）に主に関係する。
このように、COX-2の選択的インヒビターは、従来の非ステロイド系抗炎症薬に
似た抗炎症作用、解熱作用、および鎮痛作用の特性を有するであろうし、また付
け加えて、ホルモンにより誘導される子宮収縮を阻害し、潜在的な抗癌作用を有
するであろうが、メカニズムに基づく幾つかの副作用（例えばCOX-1の阻害によ
り引き起こされる副作用）を誘導する能力は低い。特に、好適な実施形態におい
て、このような化合物は、胃腸毒性の可能性が低く、腎臓への副作用の可能性が
低く、出血時間に及ぼす影響が少なく、また幾つかの実施形態において、おそら
くアスピリン感受性喘息の被験者における喘息発作を誘導する可能性が低い。
プロスタグランジンの病理学的作用（炎症性物質、ホルモン、成長因子およびサ
イトカイン等の物質に応答して該酵素の急速な誘導が起こる）に主に関係する。
このように、COX-2の選択的インヒビターは、従来の非ステロイド系抗炎症薬に
似た抗炎症作用、解熱作用、および鎮痛作用の特性を有するであろうし、また付
け加えて、ホルモンにより誘導される子宮収縮を阻害し、潜在的な抗癌作用を有
するであろうが、メカニズムに基づく幾つかの副作用（例えばCOX-1の阻害によ
り引き起こされる副作用）を誘導する能力は低い。特に、好適な実施形態におい
て、このような化合物は、胃腸毒性の可能性が低く、腎臓への副作用の可能性が
低く、出血時間に及ぼす影響が少なく、また幾つかの実施形態において、おそら
くアスピリン感受性喘息の被験者における喘息発作を誘導する可能性が低い。
【０１５７】 従って、本発明の目的は、COX-2およびCOX-2活性の強力なインヒビターである
薬理学的物質の同定および評価に適したアッセイ（方法）ならびに物質（組成物
）を提供することである。また、本発明の目的は、COX-1およびCOX-1活性よりも
COX-2およびCOX-2活性を優先的にまたは選択的に阻害する薬理学的物質を同定お
よび評価するためのアッセイならびに物質を提供することである。
薬理学的物質の同定および評価に適したアッセイ（方法）ならびに物質（組成物
）を提供することである。また、本発明の目的は、COX-1およびCOX-1活性よりも
COX-2およびCOX-2活性を優先的にまたは選択的に阻害する薬理学的物質を同定お
よび評価するためのアッセイならびに物質を提供することである。
【０１５８】 以下に開示されるのは、PPARγおよびCOX-2のシグナル伝達経路ならびに細胞
応答に関与する化合物のスクリーニングに適した例示的なアッセイである。これ
らのアッセイにより候補化合物をテストすることができる。本発明は例示された
アッセイの使用に限られず、当業者に公知の他のアッセイを使用してもよい。
応答に関与する化合物のスクリーニングに適した例示的なアッセイである。これ
らのアッセイにより候補化合物をテストすることができる。本発明は例示された
アッセイの使用に限られず、当業者に公知の他のアッセイを使用してもよい。
【０１５９】 本発明のアッセイのベースとなるのは、cox-2遺伝子の5’側-調節領域の一部
を含む調節エレメントを介したPPARγによるcox-2の転写調節である。特に、本
発明は、図18に示すPPARγ応答性調節エレメントを含むヒトcox-2プロモーター
の2.4kb部分（配列番号１）を含む核酸分子を提供する（Genbank受け入れ番号：
U20548）。本発明は、本発明のPPARγ応答性調節エレメントまたはその機能的類
似体を含むのであれば、cox-2プロモーターのより大きな部分や小さな部分の使
用も想定する。本明細書中に開示される方法や当分野で公知の方法などの方法を
用いて、連結された遺伝子に対して調節活性を与えるcox-2プロモーターの活性
断片を同定する。例えば、上記ヒトcox-2プロモーターの2.4kb部分の欠失突然変
異体を構築し、残りの部分の、連結された遺伝子に対して調節活性（例えばPPAR
γ応答性調節活性）を与える能力について分析する。プロモーターの一部を調製
するための方法（例えば5’側もしくは3’側の欠失または中間欠失）は当分野で
は周知であり、例えば天然の制限部位もしくは人工的な制限部位の使用、ヌクレ
アーゼ消化、またはオリゴヌクレオチド特異的「ループアウト」突然変異誘発法
が含まれる。さらに、cox-2プロモーターの小さな部分を相補的な合成オリゴヌ
クレオチドのアニーリングにより構築する。所望であれば、活性の低下により調
節領域を同定するために、プロモーター領域を突然変異により改変する（例えば
部位特異的突然変異誘発）。連結遺伝子に対する調節活性を与える能力を変えな
い改変を含む、改変されたcox-2プロモーターまたはその改変活性断片は、「cox
-2プロモーター」の意味に含まれる。
を含む調節エレメントを介したPPARγによるcox-2の転写調節である。特に、本
発明は、図18に示すPPARγ応答性調節エレメントを含むヒトcox-2プロモーター
の2.4kb部分（配列番号１）を含む核酸分子を提供する（Genbank受け入れ番号：
U20548）。本発明は、本発明のPPARγ応答性調節エレメントまたはその機能的類
似体を含むのであれば、cox-2プロモーターのより大きな部分や小さな部分の使
用も想定する。本明細書中に開示される方法や当分野で公知の方法などの方法を
用いて、連結された遺伝子に対して調節活性を与えるcox-2プロモーターの活性
断片を同定する。例えば、上記ヒトcox-2プロモーターの2.4kb部分の欠失突然変
異体を構築し、残りの部分の、連結された遺伝子に対して調節活性（例えばPPAR
γ応答性調節活性）を与える能力について分析する。プロモーターの一部を調製
するための方法（例えば5’側もしくは3’側の欠失または中間欠失）は当分野で
は周知であり、例えば天然の制限部位もしくは人工的な制限部位の使用、ヌクレ
アーゼ消化、またはオリゴヌクレオチド特異的「ループアウト」突然変異誘発法
が含まれる。さらに、cox-2プロモーターの小さな部分を相補的な合成オリゴヌ
クレオチドのアニーリングにより構築する。所望であれば、活性の低下により調
節領域を同定するために、プロモーター領域を突然変異により改変する（例えば
部位特異的突然変異誘発）。連結遺伝子に対する調節活性を与える能力を変えな
い改変を含む、改変されたcox-2プロモーターまたはその改変活性断片は、「cox
-2プロモーター」の意味に含まれる。
【０１６０】 本発明のDNA構築物のオリゴヌクレオチド配列は、PPARγ応答性調節エレメン
トのみを含むか、またはさらに隣接するヌクレオチド配列を含むことができる。
また、本発明のDNA構築物のオリゴヌクレオチド配列成分は、PPARγ応答性調節
エレメントの２以上の「ユニット」からなる多量体を含んでいてもよい。プロモ
ーターや異種遺伝子を含む本発明のDNA構築物に使用する場合、該調節エレメン
トの多量体は、PPARγまたは他のシグナル伝達分子に応答して、そのDNA構築物
からの該遺伝子の発現を促進する。
トのみを含むか、またはさらに隣接するヌクレオチド配列を含むことができる。
また、本発明のDNA構築物のオリゴヌクレオチド配列成分は、PPARγ応答性調節
エレメントの２以上の「ユニット」からなる多量体を含んでいてもよい。プロモ
ーターや異種遺伝子を含む本発明のDNA構築物に使用する場合、該調節エレメン
トの多量体は、PPARγまたは他のシグナル伝達分子に応答して、そのDNA構築物
からの該遺伝子の発現を促進する。
【０１６１】 レポータープラスミドなどの本発明の組換えDNA構築物は、従来の分子生物学
、微生物学、および当業者に周知である遺伝子組換技法を用いて構築される。こ
のような技法は、Maniatisら（Maniatisら, “Molecular Cloning: A Laborator
y Manual”[1982]）およびAusubel（Ausubel, “Current Protocols in Molecul
ar Biology,” Wiley, New York[1994]）等の文献に詳しく説明されており、こ
れらの文献の開示内容は本明細書中に参考として組み込まれる。COX-2発現ベク
ターを構築しこれを使用する方法および組成物は、米国特許第5,543,297号に記
載されており、当該特許は全て本明細書中に参考として組み込まれる。
、微生物学、および当業者に周知である遺伝子組換技法を用いて構築される。こ
のような技法は、Maniatisら（Maniatisら, “Molecular Cloning: A Laborator
y Manual”[1982]）およびAusubel（Ausubel, “Current Protocols in Molecul
ar Biology,” Wiley, New York[1994]）等の文献に詳しく説明されており、こ
れらの文献の開示内容は本明細書中に参考として組み込まれる。COX-2発現ベク
ターを構築しこれを使用する方法および組成物は、米国特許第5,543,297号に記
載されており、当該特許は全て本明細書中に参考として組み込まれる。
【０１６２】 本発明の幾つかの実施形態において、本発明の組換えDNA組成物または構築物
は、ヌクレオチドの所望のセットで構成され得る異種遺伝子を含む。このような
異種遺伝子の例としては、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフ
ェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌された胎盤アルカリホスファター
ゼ、ヒト成長ホルモン、tPA、グリーン蛍光タンパク質、およびインターフェロ
ンの構造遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の構築物および
方法に使用できる異種遺伝子のより詳しいリストについては、Beaudet（Beaudet
, Am. J. Hum. Gen. 37: 386[1985]）を参照されたい。
は、ヌクレオチドの所望のセットで構成され得る異種遺伝子を含む。このような
異種遺伝子の例としては、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフ
ェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌された胎盤アルカリホスファター
ゼ、ヒト成長ホルモン、tPA、グリーン蛍光タンパク質、およびインターフェロ
ンの構造遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の構築物および
方法に使用できる異種遺伝子のより詳しいリストについては、Beaudet（Beaudet
, Am. J. Hum. Gen. 37: 386[1985]）を参照されたい。
【０１６３】 好ましくは、異種遺伝子は、本発明のプロモーターおよび調節エレメント/オ
リゴヌクレオチド配列を介した転写調節を評価するために用いることができる遺
伝子産物を生じるレポーター遺伝子を含む。このレポーター遺伝子が発現される
と、簡単に検出することができるレポーター産物（例えばタンパク質）が形成さ
れる。本発明の１つの実施形態において、レポーター分子の存在は、該レポータ
ー分子に特異的に結合することができる抗体または抗体フラグメントを用いて検
出される。他の実施形態において、β-ガラクトシダーゼやルシフェラーゼ等の
レポーターは、酵素的または免疫学的にアッセイされる。
リゴヌクレオチド配列を介した転写調節を評価するために用いることができる遺
伝子産物を生じるレポーター遺伝子を含む。このレポーター遺伝子が発現される
と、簡単に検出することができるレポーター産物（例えばタンパク質）が形成さ
れる。本発明の１つの実施形態において、レポーター分子の存在は、該レポータ
ー分子に特異的に結合することができる抗体または抗体フラグメントを用いて検
出される。他の実施形態において、β-ガラクトシダーゼやルシフェラーゼ等の
レポーターは、酵素的または免疫学的にアッセイされる。
【０１６４】 幾つかの実施形態において、本発明の組換え分子は、レポーター細胞を産生す
るのに適した宿主細胞中に導入される。COX-2発現に適した宿主細胞は、米国特
許第5,543,297号に記載されている。本明細書中のスクリーニングアッセイに使
用される宿主細胞は一般には哺乳動物細胞であり、好ましくはヒト細胞系である
。またスクリーニングアッセイには哺乳動物以外の細胞系を使用することもでき
、例えばショウジョウバエ属（SL-2やKcなど）および酵母株（S. cerevisiaeお
よびS. pombeなど）だけでなく、他の細胞（例えば線虫類細胞など）が挙げられ
るが、これらに限定されない。
るのに適した宿主細胞中に導入される。COX-2発現に適した宿主細胞は、米国特
許第5,543,297号に記載されている。本明細書中のスクリーニングアッセイに使
用される宿主細胞は一般には哺乳動物細胞であり、好ましくはヒト細胞系である
。またスクリーニングアッセイには哺乳動物以外の細胞系を使用することもでき
、例えばショウジョウバエ属（SL-2やKcなど）および酵母株（S. cerevisiaeお
よびS. pombeなど）だけでなく、他の細胞（例えば線虫類細胞など）が挙げられ
るが、これらに限定されない。
【０１６５】 転写調節タンパク質（例えばPPARγ）を調節（例えば活性化または抑制）する
ことができる分子を含むことが疑われる化合物またはサンプルを用いて、これら
のレポーター細胞を処理する。所望のインキュベーションが完了したら、レポー
ター産物が存在するか否かについて細胞をアッセイする。対照サンプルと比較し
たレポーター産物のレベルは、cox-2 PPARγ感受性調節エレメントを介して転写
を調節する試験化合物の能力を示す。また、公知のPPARγアゴニストの存在下ま
たは不在下で、PPARγのレベルを変えて（例えばPPARγ発現ベクターの導入、PP
ARγとへテロダイマー化して調節エレメントに結合するその能力を変化させたタ
ンパク質の導入、または天然のPPARγ発現を誘導する化合物の導入によってレベ
ルを変えて）実験を行う。このような実験は、PPARγにより誘導されるCOX-2発
現の調節を刺激するまたは該調節と拮抗する試験化合物の能力を同定する。
ことができる分子を含むことが疑われる化合物またはサンプルを用いて、これら
のレポーター細胞を処理する。所望のインキュベーションが完了したら、レポー
ター産物が存在するか否かについて細胞をアッセイする。対照サンプルと比較し
たレポーター産物のレベルは、cox-2 PPARγ感受性調節エレメントを介して転写
を調節する試験化合物の能力を示す。また、公知のPPARγアゴニストの存在下ま
たは不在下で、PPARγのレベルを変えて（例えばPPARγ発現ベクターの導入、PP
ARγとへテロダイマー化して調節エレメントに結合するその能力を変化させたタ
ンパク質の導入、または天然のPPARγ発現を誘導する化合物の導入によってレベ
ルを変えて）実験を行う。このような実験は、PPARγにより誘導されるCOX-2発
現の調節を刺激するまたは該調節と拮抗する試験化合物の能力を同定する。
【０１６６】 一般に、本発明のアッセイは、活性化もしくは抑制された調節タンパク質（例
えばPPARγ）を介して遺伝子転写を誘導するシグナル伝達分子のアゴニストおよ
びアンタゴニストを検出する。本明細書中で使用される「遺伝子転写のアゴニス
トまたはアンタゴニスト」とは、シグナル伝達経路の中の任意の地点において、
１以上の転写調節タンパク質の活性化および該タンパク質のDNA調節エレメント
への結合によるシグナル伝達分子と細胞表面受容体との相互作用（最終的な結果
としてcox-2遺伝子の転写がモジュレートされる）に干渉する化合物を含む。さ
らに、本明細書中に使用される「遺伝子転写のアゴニストおよびアンタゴニスト
」とは、このようなアゴニストまたはアンタゴニストの特徴を有する公知の化合
物の促進物質(potentiator)も含む。
えばPPARγ）を介して遺伝子転写を誘導するシグナル伝達分子のアゴニストおよ
びアンタゴニストを検出する。本明細書中で使用される「遺伝子転写のアゴニス
トまたはアンタゴニスト」とは、シグナル伝達経路の中の任意の地点において、
１以上の転写調節タンパク質の活性化および該タンパク質のDNA調節エレメント
への結合によるシグナル伝達分子と細胞表面受容体との相互作用（最終的な結果
としてcox-2遺伝子の転写がモジュレートされる）に干渉する化合物を含む。さ
らに、本明細書中に使用される「遺伝子転写のアゴニストおよびアンタゴニスト
」とは、このようなアゴニストまたはアンタゴニストの特徴を有する公知の化合
物の促進物質(potentiator)も含む。
【０１６７】 好適な実施形態において、アゴニストは、トランスフェクトした宿主細胞を化
合物または化合物の混合物と接触させ、その一定時間経過後に、処理した細胞内
の遺伝子発現のレベル（例えばレポーター産物のレベル）を測定することにより
、検出される。次にこの発現レベルを該化合物の不在下における発現レベルと比
較する。遺伝子発現のレベルにおいて差がある場合、この差は目的の化合物が公
知のアゴニストシグナル伝達分子（例えば公知のPPARγアゴニスト）と類似した
様式で細胞内の転写調節タンパク質の活性化を拮抗することを示す。さらに、処
理した細胞と未処理の細胞との間で発現されるレポーター産物のレベルの大きさ
は、転写調節タンパク質経路を介する遺伝子転写のアゴニストとしての前記化合
物の強さを相対的に示す。
合物または化合物の混合物と接触させ、その一定時間経過後に、処理した細胞内
の遺伝子発現のレベル（例えばレポーター産物のレベル）を測定することにより
、検出される。次にこの発現レベルを該化合物の不在下における発現レベルと比
較する。遺伝子発現のレベルにおいて差がある場合、この差は目的の化合物が公
知のアゴニストシグナル伝達分子（例えば公知のPPARγアゴニスト）と類似した
様式で細胞内の転写調節タンパク質の活性化を拮抗することを示す。さらに、処
理した細胞と未処理の細胞との間で発現されるレポーター産物のレベルの大きさ
は、転写調節タンパク質経路を介する遺伝子転写のアゴニストとしての前記化合
物の強さを相対的に示す。
【０１６８】 あるいは、このようなトランスフェクトされた細胞を用いて、公知のアゴニス
トのアンタゴニストを同定する。これらのアッセイのこのような好適な実施形態
において、目的の化合物を固定濃度に維持された１以上の公知のアゴニストと一
緒に宿主細胞に接触させる。その化合物が宿主細胞における遺伝子発現のレベル
を、化合物の不在下で且つ公知のアゴニストの存在下で宿主細胞中で観察される
レベルよりどれだけ低く抑制するかの程度は、このような化合物のアンタゴニス
ト特性の指標および相対的な強さを提供する。
トのアンタゴニストを同定する。これらのアッセイのこのような好適な実施形態
において、目的の化合物を固定濃度に維持された１以上の公知のアゴニストと一
緒に宿主細胞に接触させる。その化合物が宿主細胞における遺伝子発現のレベル
を、化合物の不在下で且つ公知のアゴニストの存在下で宿主細胞中で観察される
レベルよりどれだけ低く抑制するかの程度は、このような化合物のアンタゴニス
ト特性の指標および相対的な強さを提供する。
【０１６９】 本発明の幾つかの実施形態において、スクリーニングアッセイはin vivoで行
われる。マウスなどの動物は、化合物を投与することができる主なスクリーニン
グビヒクルとして使用することができ、および栄養補給、体重、サイトカインmR
NAのレベル（例えばTNF-α、IL-1βおよびIL-6 のmRNAレベルなど）、COX-2 mRN
Aもしくはタンパク質の産生のレベル、またはCOX-2活性レベル（例えば米国特許
第5,543,297号）などのパラメータを他の適当な対照と共に測定して、COX-2タン
パク質、mRNAまたは活性における変化を効率的に評価することができる。他の実
施形態において、cox-2 PPARγ応答性5’側調節領域に機能的に連結されたレポ
ーター遺伝子またはcox-2 cDNA（Genbank受け入れ番号AF044206、U20548およびU
04636）を、標準的なトランスジェニック手法を用いて動物に導入し、外来DNAを
発現させる。
われる。マウスなどの動物は、化合物を投与することができる主なスクリーニン
グビヒクルとして使用することができ、および栄養補給、体重、サイトカインmR
NAのレベル（例えばTNF-α、IL-1βおよびIL-6 のmRNAレベルなど）、COX-2 mRN
Aもしくはタンパク質の産生のレベル、またはCOX-2活性レベル（例えば米国特許
第5,543,297号）などのパラメータを他の適当な対照と共に測定して、COX-2タン
パク質、mRNAまたは活性における変化を効率的に評価することができる。他の実
施形態において、cox-2 PPARγ応答性5’側調節領域に機能的に連結されたレポ
ーター遺伝子またはcox-2 cDNA（Genbank受け入れ番号AF044206、U20548およびU
04636）を、標準的なトランスジェニック手法を用いて動物に導入し、外来DNAを
発現させる。
【０１７０】 例えば、本発明の１つの実施形態において、トランスジェニックマウスは、上
記ヒトcox-2プロモーターの2.4kb部分の調節制御下で受精卵に所望の異種レポー
ター遺伝子を含む構築物を注入することによって産生される。この構築物は、Br
insterらの手法（Brinsterら, Proc. Natl. Acad. Sci., 82: 4438[1985]）によ
りマウスの受精卵の中にマイクロインジェクション法により注入される。所望の
投与法を用いてトランスジェニック動物を試験化合物で処理し、組織を収穫して
、レポーター遺伝子の発現について試験して、発現を変更する該試験化合物の能
力を、その試験化合物を与えていない対照動物と比べて測定する。アゴニストお
よびアンタゴニストは、PPARγ感受性調節エレメントを用いてレポーター発現を
増減するこれらの能力により同定される。
記ヒトcox-2プロモーターの2.4kb部分の調節制御下で受精卵に所望の異種レポー
ター遺伝子を含む構築物を注入することによって産生される。この構築物は、Br
insterらの手法（Brinsterら, Proc. Natl. Acad. Sci., 82: 4438[1985]）によ
りマウスの受精卵の中にマイクロインジェクション法により注入される。所望の
投与法を用いてトランスジェニック動物を試験化合物で処理し、組織を収穫して
、レポーター遺伝子の発現について試験して、発現を変更する該試験化合物の能
力を、その試験化合物を与えていない対照動物と比べて測定する。アゴニストお
よびアンタゴニストは、PPARγ感受性調節エレメントを用いてレポーター発現を
増減するこれらの能力により同定される。
【０１７１】 このように、本発明は、該DNA構築物のPPARγ感受性調節エレメントおよび本
発明のトランスフェクトされた宿主細胞を用いてcox-2遺伝子転写のアゴニスト
およびアンタゴニストをアッセイするための方法および組成物を提供する。さら
に、これらの方法および組成物を用いて発見されたアゴニストおよびアンタゴニ
スト化合物は、様々なCOX-2調節機能の介入において医薬として機能し得る。上
記PPARγアゴニストのほかに、これらの化合物は、cox-2を発現することができ
る被験者の細胞中に該化合物を導入してcox-2の発現およびこれに関連する生理
学的機能を調節する方法において使用することができる。PPARγがその細胞の中
において十分に発現されない場合は、望ましければPPARγ発現を刺激または提供
する化合物（例えばPPARγ発現構築物およびPPARγ発現を刺激する物質など）と
共に該化合物を導入してもよい。例えば、望ましくないCOX-2発現により病気に
かかった細胞において、本発明の治療化合物を導入してCOX-2発現のPPARγ誘導
型抑制を容易にする。実際に、本発明は、PPARγが関与するメカニズムを介して
COX-2発現を調節する化合物を用いてCOX-2発現細胞をターゲッティングするため
の、今まで認識されていない手段を提供する。
発明のトランスフェクトされた宿主細胞を用いてcox-2遺伝子転写のアゴニスト
およびアンタゴニストをアッセイするための方法および組成物を提供する。さら
に、これらの方法および組成物を用いて発見されたアゴニストおよびアンタゴニ
スト化合物は、様々なCOX-2調節機能の介入において医薬として機能し得る。上
記PPARγアゴニストのほかに、これらの化合物は、cox-2を発現することができ
る被験者の細胞中に該化合物を導入してcox-2の発現およびこれに関連する生理
学的機能を調節する方法において使用することができる。PPARγがその細胞の中
において十分に発現されない場合は、望ましければPPARγ発現を刺激または提供
する化合物（例えばPPARγ発現構築物およびPPARγ発現を刺激する物質など）と
共に該化合物を導入してもよい。例えば、望ましくないCOX-2発現により病気に
かかった細胞において、本発明の治療化合物を導入してCOX-2発現のPPARγ誘導
型抑制を容易にする。実際に、本発明は、PPARγが関与するメカニズムを介して
COX-2発現を調節する化合物を用いてCOX-2発現細胞をターゲッティングするため
の、今まで認識されていない手段を提供する。
【０１７２】実験 以下の実施例は、本発明のある好適な実施形態および態様を示説しさらに例証
するために提供されるが、本発明の範囲を限定するものではない。
するために提供されるが、本発明の範囲を限定するものではない。
【０１７３】 以下の実験の開示において、以下の略語が使用される：N(正常)；M（モル濃度
）；mM（ミリモル濃度）：μM（マイクロモル濃度）；mol（モル）：mmol（ミリ
モル）；μmol（マイクロモル）：nmol（ナノモル）；pmol（ピコモル）；g（グ
ラム）；mg（ミリグラム）；μg（マイクログラム）；ng（ナノグラム）；lまた
はL（リットル）；ml（ミリリットル）；μl（マイクロリットル）；cm（センチ
メートル）；mm（ミリメートル）；μm（マイクロメートル）；nm（ナノメート
ル）；℃（摂氏℃）；Sigma（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）。
）；mM（ミリモル濃度）：μM（マイクロモル濃度）；mol（モル）：mmol（ミリ
モル）；μmol（マイクロモル）：nmol（ナノモル）；pmol（ピコモル）；g（グ
ラム）；mg（ミリグラム）；μg（マイクログラム）；ng（ナノグラム）；lまた
はL（リットル）；ml（ミリリットル）；μl（マイクロリットル）；cm（センチ
メートル）；mm（ミリメートル）；μm（マイクロメートル）；nm（ナノメート
ル）；℃（摂氏℃）；Sigma（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）。
【０１７４】 後述の実施例においては以下の材料およびプロトコールを使用した。
【０１７５】A. 材料 抗ホスホチロシン抗体4G10はUpstate Biotechnology Incorporated（Lake Pla
cid, NY）から得た。抗COX-2抗体はTransduction Laboratories（Lexington, KY
）から得た。抗GFAP抗体はAccurate Chemical & Scientific Corporation（West
bury, NY）から得た。ヤギ抗マウスF(ab)2は、Cappel（West Chester, PA）から
得た。アフィニティー精製した西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス
抗体およびヤギ抗ウサギ抗体は、Boehringer Mannheim（Indianapolis, IN）か
ら購入した。ヒトβアミロイドのアミノ酸25〜35および1〜40に対応するペプチ
ドは、Bachem（Philadelphia, PA）から購入した。β-アミロイドペプチドは滅
菌dH2O中に再懸濁した。凍結乾燥ペプチドを滅菌蒸留水の中で再構成した後、37
℃にて1週間インキュベートすることにより、筋原線維βアミロイド1〜40を調製
した。LPS、TPAおよびコンカナバリンA（Con A）をSigmaから購入した。シグリ
タゾンは、Biomol（Plymouth Meeting, PA）から得た。DHAおよびプロスタグラ
ンジンJ2は、Calbiochem（San Diego, CA）から入手した。
cid, NY）から得た。抗COX-2抗体はTransduction Laboratories（Lexington, KY
）から得た。抗GFAP抗体はAccurate Chemical & Scientific Corporation（West
bury, NY）から得た。ヤギ抗マウスF(ab)2は、Cappel（West Chester, PA）から
得た。アフィニティー精製した西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス
抗体およびヤギ抗ウサギ抗体は、Boehringer Mannheim（Indianapolis, IN）か
ら購入した。ヒトβアミロイドのアミノ酸25〜35および1〜40に対応するペプチ
ドは、Bachem（Philadelphia, PA）から購入した。β-アミロイドペプチドは滅
菌dH2O中に再懸濁した。凍結乾燥ペプチドを滅菌蒸留水の中で再構成した後、37
℃にて1週間インキュベートすることにより、筋原線維βアミロイド1〜40を調製
した。LPS、TPAおよびコンカナバリンA（Con A）をSigmaから購入した。シグリ
タゾンは、Biomol（Plymouth Meeting, PA）から得た。DHAおよびプロスタグラ
ンジンJ2は、Calbiochem（San Diego, CA）から入手した。
【０１７６】B. 組織培養 5％CO2中で、10％熱不活化ウシ胎児血清（FCS）、5×10-5M 2-メルカプトエタ
ノール、5mM HEPESおよび2μg/mlゲンタマイシンを添加したRPMI-1640（Whittak
er Bioproducts, Walkersville, MD）中でTHP-1細胞を培養した。ミクログリア
および星状細胞培養物は、以前に記載されたように（McDonaldら, J. Neurosci.
18:4451[1997]）、生後1〜2日のマウス脳（C57B1/6J）から得た。ミクログリア
を回収した後に星状細胞を回収し、連続継代を行って、星状細胞を増やした。E1
7マウス（C57B1/6J）の皮質からニューロンを培養した。髄膜を含まない皮質を
単離し、0.25％トリプシン、1mM EDTA中で37℃にて15分間消化した。20％熱不活
化FCSを含むDMEMを用いてトリプシンを不活化した。B27を添加した神経基本培地
(Neurobasal media)に皮質を移し、すりつぶして、ポリ-L-リジン（0.05mg/ml）
をコーティングした組織培養ウェル上に載せた。ニューロンを、B2を添加した神
経基本培地（4.0×104/24ウェル組織培養プレート）中で、使用前にin vitroで5
〜7日間培養した。
ノール、5mM HEPESおよび2μg/mlゲンタマイシンを添加したRPMI-1640（Whittak
er Bioproducts, Walkersville, MD）中でTHP-1細胞を培養した。ミクログリア
および星状細胞培養物は、以前に記載されたように（McDonaldら, J. Neurosci.
18:4451[1997]）、生後1〜2日のマウス脳（C57B1/6J）から得た。ミクログリア
を回収した後に星状細胞を回収し、連続継代を行って、星状細胞を増やした。E1
7マウス（C57B1/6J）の皮質からニューロンを培養した。髄膜を含まない皮質を
単離し、0.25％トリプシン、1mM EDTA中で37℃にて15分間消化した。20％熱不活
化FCSを含むDMEMを用いてトリプシンを不活化した。B27を添加した神経基本培地
(Neurobasal media)に皮質を移し、すりつぶして、ポリ-L-リジン（0.05mg/ml）
をコーティングした組織培養ウェル上に載せた。ニューロンを、B2を添加した神
経基本培地（4.0×104/24ウェル組織培養プレート）中で、使用前にin vitroで5
〜7日間培養した。
【０１７７】C. 細胞刺激 THP-1細胞およびミクログリアを、刺激前にまずこれらそれぞれの培地を除去
し、これをハンクス液(HBSS)に取り替えて、37℃にて30分間放置した。細胞を、
懸濁液（5〜10×106細胞/200μl HBSS）中で、または結合ペプチド（48pmole/mm 2 ）上に載せることにより、刺激した。結合ペプチドは、以前に記載されたよう
に（LagenaurおよびLemmon, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:7753[1987]）調製した
。簡単にまとめると、組織培養ウェルをニトロセルロースでコーティングし、こ
のコーティングしたウェルにペプチドを加えて乾燥させた。次にウェルを滅菌3
％ BSAと共にdH2O中で1時間インキュベートし、ニトロセルロースとの細胞の相
互作用を遮断した。BSAを除去し、THP-1細胞をHBSS中に加えて10分間放置した。
培地を調整するために、THP-1細胞（1.8×104）を、48ウェル組織培養皿中の結
合ペプチドを含む神経基本培地（0.25ml）が入ったウェルに、薬物と共にまたは
薬物なしで加え、48時間置いた。
し、これをハンクス液(HBSS)に取り替えて、37℃にて30分間放置した。細胞を、
懸濁液（5〜10×106細胞/200μl HBSS）中で、または結合ペプチド（48pmole/mm 2 ）上に載せることにより、刺激した。結合ペプチドは、以前に記載されたよう
に（LagenaurおよびLemmon, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:7753[1987]）調製した
。簡単にまとめると、組織培養ウェルをニトロセルロースでコーティングし、こ
のコーティングしたウェルにペプチドを加えて乾燥させた。次にウェルを滅菌3
％ BSAと共にdH2O中で1時間インキュベートし、ニトロセルロースとの細胞の相
互作用を遮断した。BSAを除去し、THP-1細胞をHBSS中に加えて10分間放置した。
培地を調整するために、THP-1細胞（1.8×104）を、48ウェル組織培養皿中の結
合ペプチドを含む神経基本培地（0.25ml）が入ったウェルに、薬物と共にまたは
薬物なしで加え、48時間置いた。
【０１７８】D. 神経毒性研究 THP-1単球を用いた神経毒性実験では、上記のように馴化培地0.25mlを加えた
。培地を回収し、遠心分離して非接着細胞をペレット状にし、神経培養物（in v
itroで5〜7日）に直接加えて72時間置いた。全ての条件で２重テストを行い、ウ
ェル上に計数グリッドを載せて、各条件毎に8つの同じ視野（field）からニュー
ロンの数を数えた。各条件毎にニューロンの数の平均値を求め、ニューロンの生
存率を評価した。
。培地を回収し、遠心分離して非接着細胞をペレット状にし、神経培養物（in v
itroで5〜7日）に直接加えて72時間置いた。全ての条件で２重テストを行い、ウ
ェル上に計数グリッドを載せて、各条件毎に8つの同じ視野（field）からニュー
ロンの数を数えた。各条件毎にニューロンの数の平均値を求め、ニューロンの生
存率を評価した。
【０１７９】E. ウェスタンブロッティング 200μlの氷冷したRIPA緩衝液（1％ Triton, 0.1% SDS, 0.5%デオキシコール酸
エステル, 20mM Tris(pH7.4), 150mM NaCl, 10mM NaF, 1mM Na3VO4, 1mM EDTA,
1mM EGTA, 0.2mM PMSF）の中で細胞を溶解し、遠心分離（10,000×g、4℃、10分
間）により不溶物質を除去した。Bradfordの方法（Bradford, Anal. Biochem. 7
2:248[1976]）によってタンパク質濃度を定量した。タンパク質を7.5％ SDS-PAG
Eにより分離し、一次抗体4G10（1：2000）またはCOX-2（1：250）を用いて4℃に
て一晩、ウェスタンブロッティングを行った。増大した化学ルミネッセンス（Pi
erce, Rockford, IL）を介して抗体結合を検出した。
エステル, 20mM Tris(pH7.4), 150mM NaCl, 10mM NaF, 1mM Na3VO4, 1mM EDTA,
1mM EGTA, 0.2mM PMSF）の中で細胞を溶解し、遠心分離（10,000×g、4℃、10分
間）により不溶物質を除去した。Bradfordの方法（Bradford, Anal. Biochem. 7
2:248[1976]）によってタンパク質濃度を定量した。タンパク質を7.5％ SDS-PAG
Eにより分離し、一次抗体4G10（1：2000）またはCOX-2（1：250）を用いて4℃に
て一晩、ウェスタンブロッティングを行った。増大した化学ルミネッセンス（Pi
erce, Rockford, IL）を介して抗体結合を検出した。
【０１８０】F. シクロオキシゲナーゼ-2発現 様々な薬物の存在下または不在下で、THP-1単球またはRAW264.7マウスマクロ
ファージをTPA（100nM）、LPSまたは筋原線維Aβ25-35と共に、5％FCSを含むRPM
I培地の中で18時間インキュベートした。RIPA緩衝液中で細胞を溶解し、細胞溶
解物のアリコートをSDS-PAGEにより分離し、PVDF膜に移し、COX-2に対する抗体
を用いてプローブした。
ファージをTPA（100nM）、LPSまたは筋原線維Aβ25-35と共に、5％FCSを含むRPM
I培地の中で18時間インキュベートした。RIPA緩衝液中で細胞を溶解し、細胞溶
解物のアリコートをSDS-PAGEにより分離し、PVDF膜に移し、COX-2に対する抗体
を用いてプローブした。
【０１８１】G. IL-6およびTNF-αプロモーターアッセイ DEAE-デキストランを用いて、ルシフェラーゼに結合した上流プロモーター配
列（-1160〜+14）を含むヒトIL6-ルシフェラーゼレポーター構築物を、βガラク
トシダーゼレポーター構築物と一緒にTHP-1細胞中にトランスフェクトし、トラ
ンスフェクション効率を制御した。ヒトTNF-αレポーター構築物は、ルシフェラ
ーゼに連結された5’上流プロモーター配列の配列1.2kbを含んでいた。細胞をト
ランスフェクトし、48時間後に薬物の存在下または不在下において40μM Aβま
たは1μg/ml LPSを用いて無血清RPMI中で6時間刺激し、細胞溶解し、ルシフェラ
ーゼ活性を測定した。
列（-1160〜+14）を含むヒトIL6-ルシフェラーゼレポーター構築物を、βガラク
トシダーゼレポーター構築物と一緒にTHP-1細胞中にトランスフェクトし、トラ
ンスフェクション効率を制御した。ヒトTNF-αレポーター構築物は、ルシフェラ
ーゼに連結された5’上流プロモーター配列の配列1.2kbを含んでいた。細胞をト
ランスフェクトし、48時間後に薬物の存在下または不在下において40μM Aβま
たは1μg/ml LPSを用いて無血清RPMI中で6時間刺激し、細胞溶解し、ルシフェラ
ーゼ活性を測定した。
【０１８２】H. シクロオキシゲナーゼ-2プロモーターアッセイ ルシフェラーゼレポーター（ボストン大学のDr. Peter Polgarより贈呈）に結
合されたヒトシクロオキシゲナーゼ-2遺伝子の5’側隣接領域の2.3kbを担持する
プラスミドを用いて、THP-1単球（40μg DNA/107細胞）をエレクトロポレーショ
ンにかけた。SV40駆動型β-ガラクトシダーゼベクターをコトランスフェクトし
て、トランスフェクション効率の評価を行った。次に細胞を、指定薬物の存在下
または不在下において、インキュベーションの最後の18時間の間、インキュベー
トした。トランスフェクションの48時間後に細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性
を測定した。
合されたヒトシクロオキシゲナーゼ-2遺伝子の5’側隣接領域の2.3kbを担持する
プラスミドを用いて、THP-1単球（40μg DNA/107細胞）をエレクトロポレーショ
ンにかけた。SV40駆動型β-ガラクトシダーゼベクターをコトランスフェクトし
て、トランスフェクション効率の評価を行った。次に細胞を、指定薬物の存在下
または不在下において、インキュベーションの最後の18時間の間、インキュベー
トした。トランスフェクションの48時間後に細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性
を測定した。
【０１８３】実施例1 Aβで刺激される細胞内シグナル伝達経路に及ぼすPPARγアゴニストの効果 この実施例では、Aβで刺激される細胞内シグナル伝達経路がPPARγアゴニス
トによって影響されないことを証明する。図1に示すように、原線維形態のAβ1
へのTHP-1単球若しくは一次ミクログリアの曝露は、チロシンキナーゼであるLyn
、Syk、FAKおよびPyk2（Burridge and Chrzanowska,Ann.Rev.Cell Dev.Biol.12:
463 [1996]；Ghazizadehら、J.Biol.Chem.269:8878 [1994]；Kienerら、J.Biol.
Chem.268:24442 [1993]；ならびにLevら、Nature 376:737 [1995]）の活性化の
結果として、タンパク質のチロシンリン酸化の刺激をもたらした。図1において
、THP-1細胞を、ベヒクルのみ（c）、またはβA25-35（40μM、2分間）若しくは
ConA（60μg/ml、5分間、陽性対照）で刺激した。抗リン酸化チロシン抗体、PY2
0を使用して、チロシンリン酸化されたタンパク質を免疫沈降させることによっ
て、βアミロイドで刺激されたTHP-1細胞中のチロシンキナーゼ活性の増加をモ
ニターした。この免疫沈降したタンパク質を[32P]ATP中でインキュベートし、自
己リン酸化させて、活性化チロシンキナーゼおよびその基質を可視化した。図は
、SDS-PAGEによって分離したタンパク質のオートラジオグラムを示す。
トによって影響されないことを証明する。図1に示すように、原線維形態のAβ1
へのTHP-1単球若しくは一次ミクログリアの曝露は、チロシンキナーゼであるLyn
、Syk、FAKおよびPyk2（Burridge and Chrzanowska,Ann.Rev.Cell Dev.Biol.12:
463 [1996]；Ghazizadehら、J.Biol.Chem.269:8878 [1994]；Kienerら、J.Biol.
Chem.268:24442 [1993]；ならびにLevら、Nature 376:737 [1995]）の活性化の
結果として、タンパク質のチロシンリン酸化の刺激をもたらした。図1において
、THP-1細胞を、ベヒクルのみ（c）、またはβA25-35（40μM、2分間）若しくは
ConA（60μg/ml、5分間、陽性対照）で刺激した。抗リン酸化チロシン抗体、PY2
0を使用して、チロシンリン酸化されたタンパク質を免疫沈降させることによっ
て、βアミロイドで刺激されたTHP-1細胞中のチロシンキナーゼ活性の増加をモ
ニターした。この免疫沈降したタンパク質を[32P]ATP中でインキュベートし、自
己リン酸化させて、活性化チロシンキナーゼおよびその基質を可視化した。図は
、SDS-PAGEによって分離したタンパク質のオートラジオグラムを示す。
【０１８４】 Aβに対するこれらの細胞の応答に介在するキナーゼおよびシグナル伝達機構
のエレメントの活性化に影響を与えるPPARγアゴニストの能力を試験した。図2
に示すように、PPARγアゴニストである、PGJ2、DHA、シグリタゾンおよびトロ
グリタゾンは、Aβへの曝露後のタンパク質チロシンリン酸化の誘導を有意には
変更しなかった。この図中、チロシンキナーゼシグナル伝達カスケードの活性化
に及ぼすPPARγアゴニストの効果を、細胞をベヒクル（DMSO）のみ、または10μ
M PGJ2、50μM DHA、50μM シグリタゾン若しくは50μM トログリタゾンととも
に24時間インキュベートした後、抗リン酸化チロシン Ab、4G10を使用した細胞
溶解物のウエスタンブロットによって試験した。これらのデータにより、PPARγ
アゴニストがこれらの細胞中での炎症性応答に連結するシグナル伝達カスケード
の主要な触媒構成要素と相互作用しないことを証明している。
のエレメントの活性化に影響を与えるPPARγアゴニストの能力を試験した。図2
に示すように、PPARγアゴニストである、PGJ2、DHA、シグリタゾンおよびトロ
グリタゾンは、Aβへの曝露後のタンパク質チロシンリン酸化の誘導を有意には
変更しなかった。この図中、チロシンキナーゼシグナル伝達カスケードの活性化
に及ぼすPPARγアゴニストの効果を、細胞をベヒクル（DMSO）のみ、または10μ
M PGJ2、50μM DHA、50μM シグリタゾン若しくは50μM トログリタゾンととも
に24時間インキュベートした後、抗リン酸化チロシン Ab、4G10を使用した細胞
溶解物のウエスタンブロットによって試験した。これらのデータにより、PPARγ
アゴニストがこれらの細胞中での炎症性応答に連結するシグナル伝達カスケード
の主要な触媒構成要素と相互作用しないことを証明している。
【０１８５】実施例2 マクロファージ分化に及ぼすPPARγアゴニストの効果 この実施例では、PPARγアゴニストがTHP-1のマクロファージへの分化を抑制
することを証明する。単球は、ホルボールエステル若しくはその他の活性化刺激
物に曝露された後、形態的および生化学的に分化してマクロファージ表現型にな
る（Tsuchiyaら、Cancer Res. 42:1530 [1982]）。図3A-Jに示すように、THP-1
細胞のマクロファージへの表現型の転換は、細胞をTPA（100 nM）に48時間曝露
することによって刺激された。TPAが誘導する分化を抑制するPPARγアゴニスト
の能力を形態学的にモニターした。細胞を、（図3A）ベヒクルのみ（対照；DMSO
、エタノール）または（図3B）100 nM TPAとともに以下のPPARγアゴニストを含
ませるか含ませないで48時間インキュベートした：（図3C、D）10μM PGJ2、（
図3E、F）50μM DHA、（図3G、H）50μM シグリタゾン、および（図3I、J）50μ
M トログリタゾン。この図に示されるように、細胞のTPAならびにPPARγアゴニ
ストである、PGJ2、DHA、シグリタゾンおよびトログリタゾンを併用した曝露は
、細胞の分化を阻止した。これらのデータは、PPARγアゴニストがこれらの細胞
の分化に関与する広範囲の細胞の活性を抑止するように作用することの直接的な
証拠を提供する。さらに、これらの知見は、これらの細胞内での反応性表現型の
生成を阻止する能力によって、抗炎症剤として作用するこれらの薬剤の役割と一
致する。
することを証明する。単球は、ホルボールエステル若しくはその他の活性化刺激
物に曝露された後、形態的および生化学的に分化してマクロファージ表現型にな
る（Tsuchiyaら、Cancer Res. 42:1530 [1982]）。図3A-Jに示すように、THP-1
細胞のマクロファージへの表現型の転換は、細胞をTPA（100 nM）に48時間曝露
することによって刺激された。TPAが誘導する分化を抑制するPPARγアゴニスト
の能力を形態学的にモニターした。細胞を、（図3A）ベヒクルのみ（対照；DMSO
、エタノール）または（図3B）100 nM TPAとともに以下のPPARγアゴニストを含
ませるか含ませないで48時間インキュベートした：（図3C、D）10μM PGJ2、（
図3E、F）50μM DHA、（図3G、H）50μM シグリタゾン、および（図3I、J）50μ
M トログリタゾン。この図に示されるように、細胞のTPAならびにPPARγアゴニ
ストである、PGJ2、DHA、シグリタゾンおよびトログリタゾンを併用した曝露は
、細胞の分化を阻止した。これらのデータは、PPARγアゴニストがこれらの細胞
の分化に関与する広範囲の細胞の活性を抑止するように作用することの直接的な
証拠を提供する。さらに、これらの知見は、これらの細胞内での反応性表現型の
生成を阻止する能力によって、抗炎症剤として作用するこれらの薬剤の役割と一
致する。
【０１８６】実施例3 ミクログリアが介在するアストロサイトの活性化に及ぼすPPARγアゴニストの効 果 この実施例では、ミクログリアが介在するアストロサイトの活性化をPPARγア
ゴニストが阻止することを証明する。アストロサイトグリオーシスおよび分枝し
た「活性化」形態の獲得が、多数のCNS疾患において、また急性および慢性の両
方の脳傷害に応答して観察される。これらの状況におけるアストロサイトの一次
応答は、中間径フィラメントタンパク質、グリア原線維酸性タンパク質（GFAP）
の発現の増大であり、これはアストロサイトの活性化の標準的なマーカーとして
有用である。馴化培地は、Aβ原繊維による単球の活性化後に単球によって産生
される多数の前炎症性分泌産物を含んでいる。この培養系は、アルツハイマー病
、ならびにアストロサイトの反応性が重要な役割をする多数のCNS疾患において
観察されるアストロサイトグリオーシスの研究のためのモデルを提供する。
ゴニストが阻止することを証明する。アストロサイトグリオーシスおよび分枝し
た「活性化」形態の獲得が、多数のCNS疾患において、また急性および慢性の両
方の脳傷害に応答して観察される。これらの状況におけるアストロサイトの一次
応答は、中間径フィラメントタンパク質、グリア原線維酸性タンパク質（GFAP）
の発現の増大であり、これはアストロサイトの活性化の標準的なマーカーとして
有用である。馴化培地は、Aβ原繊維による単球の活性化後に単球によって産生
される多数の前炎症性分泌産物を含んでいる。この培養系は、アルツハイマー病
、ならびにアストロサイトの反応性が重要な役割をする多数のCNS疾患において
観察されるアストロサイトグリオーシスの研究のためのモデルを提供する。
【０１８７】 図4は、βアミロイドで刺激されたTHP-1細胞からの馴化培地が培養で反応性ア
ストロサイト形態を誘導するのを抑制する、PPARγアゴニストの能力を示す。TH
P-1細胞をこれのみ、またはベヒクル（DMSO）若しくは10μM PGJ2の存在下にて
表面結合βA25-35（48 pmole/mm2）上に平板培養することによって、48時間刺激
した。（図4A）培地のみのウェル、（図4B）βA25-35で刺激したTHP-1細胞培養
物、（図4C）βA25-35で刺激したTHP-1＋10μM PGJ2細胞培養物、（図4D）10μM
PGJ2のみのウェル、（図4E）表面結合βAのみのウェル、ならびに（図4F）THP-
1細胞のみの培養物から、培地を回収した。次に精製したマウスアストロサイト
培養物にこの馴化培地を72時間添加した。培養物を固定し、グリア原線維酸性タ
ンパク質（GFAP）について染色した。
ストロサイト形態を誘導するのを抑制する、PPARγアゴニストの能力を示す。TH
P-1細胞をこれのみ、またはベヒクル（DMSO）若しくは10μM PGJ2の存在下にて
表面結合βA25-35（48 pmole/mm2）上に平板培養することによって、48時間刺激
した。（図4A）培地のみのウェル、（図4B）βA25-35で刺激したTHP-1細胞培養
物、（図4C）βA25-35で刺激したTHP-1＋10μM PGJ2細胞培養物、（図4D）10μM
PGJ2のみのウェル、（図4E）表面結合βAのみのウェル、ならびに（図4F）THP-
1細胞のみの培養物から、培地を回収した。次に精製したマウスアストロサイト
培養物にこの馴化培地を72時間添加した。培養物を固定し、グリア原線維酸性タ
ンパク質（GFAP）について染色した。
【０１８８】 図4に示すように、形態若しくはGFAP発現によって評価したところ、未処理のT
HP-1細胞若しくはアストロサイトからの馴化培地へのアストロサイトの曝露、お
よび原繊維への直接の曝露は、対照培養物との検知し得る差異が導かれなかった
。しかし、活性化されたAβ処理THP-1細胞からの馴化培地は、アストロサイトの
活性化を反映して、GFAP免疫反応性の劇的な増加と分枝した形状の発生を誘起し
た。重要なことは、AβおよびPPARγアゴニスト PGJ2で同時に処理したTHP-1細
胞が見かけ上、対照培養物と同様だったことである。これらの観察は、PPARγア
ゴニストがアストロサイトの活性化に対応するミクログリア分泌産物の産生を抑
制することの証拠を提供する。
HP-1細胞若しくはアストロサイトからの馴化培地へのアストロサイトの曝露、お
よび原繊維への直接の曝露は、対照培養物との検知し得る差異が導かれなかった
。しかし、活性化されたAβ処理THP-1細胞からの馴化培地は、アストロサイトの
活性化を反映して、GFAP免疫反応性の劇的な増加と分枝した形状の発生を誘起し
た。重要なことは、AβおよびPPARγアゴニスト PGJ2で同時に処理したTHP-1細
胞が見かけ上、対照培養物と同様だったことである。これらの観察は、PPARγア
ゴニストがアストロサイトの活性化に対応するミクログリア分泌産物の産生を抑
制することの証拠を提供する。
【０１８９】実施例4 単球が介在する神経毒性に及ぼすPPARγアゴニストの効果 この実施例では、単球が介在する神経毒性をPPARγアゴニストが抑止すること
を証明する。ミクログリアの活性化には、末梢におけるマクロファージの応答を
代表する、それらからの多数の急性期かつ前炎症性の産物の分泌を伴う。多数の
研究が、Aβペプチドでの処理に応答して神経毒性産物を生成する、ミクログリ
ア系の能力について記載している（例えば、Banatiら、Glia 7:111 [1993]；Giu
lian,Glia 7:102 [1993]；Giulianら、Neurochem.Int.27:119 [1995]；およびGi
ulianら、J.Neurosci.16:6021 [1996]、参照）。サイトカイン、ケモカイン、反
応性酸素および窒素類、ならびに未確定神経毒性成分を含む多様なミクログリア
分泌産物がニューロンに対して毒性であることが報告されている（Brownら、Nat
ure 380:345 [1996]；Iiら、Brain Res.720:93 [1996]；およびKretzschmarら、
J.Neur.Transm.50 [1997]）。これらの神経毒性産物の放出は、前炎症性応答を
仲介する生物学的応答の統制されたプログラムの結果を表す。
を証明する。ミクログリアの活性化には、末梢におけるマクロファージの応答を
代表する、それらからの多数の急性期かつ前炎症性の産物の分泌を伴う。多数の
研究が、Aβペプチドでの処理に応答して神経毒性産物を生成する、ミクログリ
ア系の能力について記載している（例えば、Banatiら、Glia 7:111 [1993]；Giu
lian,Glia 7:102 [1993]；Giulianら、Neurochem.Int.27:119 [1995]；およびGi
ulianら、J.Neurosci.16:6021 [1996]、参照）。サイトカイン、ケモカイン、反
応性酸素および窒素類、ならびに未確定神経毒性成分を含む多様なミクログリア
分泌産物がニューロンに対して毒性であることが報告されている（Brownら、Nat
ure 380:345 [1996]；Iiら、Brain Res.720:93 [1996]；およびKretzschmarら、
J.Neur.Transm.50 [1997]）。これらの神経毒性産物の放出は、前炎症性応答を
仲介する生物学的応答の統制されたプログラムの結果を表す。
【０１９０】 この実施例の実験では、一次皮質ニューロンの高度に精製した集団を、THP-1
細胞若しくは一次ミクログリアからの馴化培地中で培養する、組織培養モデル系
を使用して、神経毒性および前炎症性産物の生成を評価および定量する。具体的
に言うと、マウス皮質ニューロンの精製培養物（E16、4.0ｘ104ニューロン／ウ
ェル、in vitro 5-7日目のものを使用）を単独で、またはTHP-1細胞からの馴化
培地（1.8ｘ104 THP-1細胞／1馴化）の存在下で培養した。THP-1細胞をこれのみ
の組織培養ウェル、またはDMSOベヒクル（対照）若しくはPPARγアゴニストの存
在下のβA25-35でコーティング（48 pmole/mm2）したウェル上に平板培養するこ
とによって、48時間刺激した。培地のみのウェル、THP-1細胞のみの培養物、表
面結合βA25-35のみのウェル、薬剤のみのウェル、βA＋THP-1細胞培養物、なら
びにβA＋THP-1＋薬剤培養物からの馴化培地をマウス皮質ニューロン培養物に72
時間添加した。次にニューロンを固定し、ニューロン特異的MAP2タンパク質につ
いて染色し、計数してニューロンの生存を定量した。
細胞若しくは一次ミクログリアからの馴化培地中で培養する、組織培養モデル系
を使用して、神経毒性および前炎症性産物の生成を評価および定量する。具体的
に言うと、マウス皮質ニューロンの精製培養物（E16、4.0ｘ104ニューロン／ウ
ェル、in vitro 5-7日目のものを使用）を単独で、またはTHP-1細胞からの馴化
培地（1.8ｘ104 THP-1細胞／1馴化）の存在下で培養した。THP-1細胞をこれのみ
の組織培養ウェル、またはDMSOベヒクル（対照）若しくはPPARγアゴニストの存
在下のβA25-35でコーティング（48 pmole/mm2）したウェル上に平板培養するこ
とによって、48時間刺激した。培地のみのウェル、THP-1細胞のみの培養物、表
面結合βA25-35のみのウェル、薬剤のみのウェル、βA＋THP-1細胞培養物、なら
びにβA＋THP-1＋薬剤培養物からの馴化培地をマウス皮質ニューロン培養物に72
時間添加した。次にニューロンを固定し、ニューロン特異的MAP2タンパク質につ
いて染色し、計数してニューロンの生存を定量した。
【０１９１】 非処理THP-1からの馴化培地は、ほとんどまたは全く神経毒性を示さなかった
。しかし、原繊維Aβに曝露したTHP-1細胞からの馴化培地は高度に神経毒性で、
大部分のニューロンを72時間以内に殺傷した。図5に示すように、THP-1単球をNS
AIDおよびPPARγアゴニスト、イブプロフェン（100μM、1 mM）若しくはインド
メタシン（100μM）の存在下でAβに曝露した場合は、神経毒素の産生は抑制さ
れた。
。しかし、原繊維Aβに曝露したTHP-1細胞からの馴化培地は高度に神経毒性で、
大部分のニューロンを72時間以内に殺傷した。図5に示すように、THP-1単球をNS
AIDおよびPPARγアゴニスト、イブプロフェン（100μM、1 mM）若しくはインド
メタシン（100μM）の存在下でAβに曝露した場合は、神経毒素の産生は抑制さ
れた。
【０１９２】 同様に、PPARγアゴニストである、PGJ2（5μM、10μM）およびDHA（10μM、5
0μM）（図6）ならびにチアゾリジンジオンのシグリタゾン（10μM、50μM）（
図7）およびトログリタゾン（10μM、50μM）（図8）もまた、神経毒素の産生を
阻止した。これらのデータは、多様なPPARγアゴニストが活性化された単球／マ
クロファージからの前炎症性神経毒性産物の生成を抑制するように作用すること
を証明している。
0μM）（図6）ならびにチアゾリジンジオンのシグリタゾン（10μM、50μM）（
図7）およびトログリタゾン（10μM、50μM）（図8）もまた、神経毒素の産生を
阻止した。これらのデータは、多様なPPARγアゴニストが活性化された単球／マ
クロファージからの前炎症性神経毒性産物の生成を抑制するように作用すること
を証明している。
【０１９３】実施例5 インターロイキン-6およびTNF-αの発現に及ぼすPPARγアゴニストの効果 この実施例では、PPARγアゴニストがインターロイキン-6およびTNF-αの発現
を抑制することを証明する。Aβ若しくはその他の免疫刺激物によるミクログリ
アの活性化の結果の1つは、サイトカイン産生の刺激である。この実施例におけ
る実験では、PPARγアゴニストがヒトIL-6およびTNF-α遺伝子のプロモーターの
活性に影響を与えるかどうかを試験した。これらの実験では、ルシフェラーゼに
連結させた、ヒト遺伝子のプロモーターエレメントへのリポーターを使用した。
THP-1細胞に、IL-6ルシフェラーゼリポーター若しくはTNF-αリポーター構築物
を一時的にトランスフェクトし、48時間後にプロモーター活性についてアッセイ
した。トランスフェクション効率を制御するために、細胞にβガラクトシダーゼ
リポーター構築物を同時トランスフェクトした。最後の6時間は、トログリタゾ
ン（50μM）、シグリタゾン（50μM）、DHA（50μM）、PGJ2（10μM）、若しく
はイブプロフェン（1 mM）の存在下または不在下で、LPS（1μg/ml）若しくはA
β25-35（40μM）とともに、細胞をインキュベートした。実験を二重に実施した
が、報告したデータは、その測定の平均を表している。図9Aおよび9Bに示すよう
に、THP-1細胞のLPSおよびAβ処理の結果、両サイトカイン遺伝子のプロモータ
ー活性の刺激がもたらされ、このことはこれらの薬剤のサイトカイン産生へのin
vivo効果に一致している。THP-1細胞と天然のPPARγアゴニストである、PGJ2お
よびDHAとのインキュベートの結果、プロモーター活性の抑制がもたらされた。
同様に、チアゾリジンジオンの、トログリタゾンおよびシグリタゾン、さらには
イブプロフェンもまたリポーターの発現を抑止した。これらのデータは、多様な
PPARγアゴニストがIL-6およびTNF-α遺伝子の発現を効果的に抑制することを証
明している。
を抑制することを証明する。Aβ若しくはその他の免疫刺激物によるミクログリ
アの活性化の結果の1つは、サイトカイン産生の刺激である。この実施例におけ
る実験では、PPARγアゴニストがヒトIL-6およびTNF-α遺伝子のプロモーターの
活性に影響を与えるかどうかを試験した。これらの実験では、ルシフェラーゼに
連結させた、ヒト遺伝子のプロモーターエレメントへのリポーターを使用した。
THP-1細胞に、IL-6ルシフェラーゼリポーター若しくはTNF-αリポーター構築物
を一時的にトランスフェクトし、48時間後にプロモーター活性についてアッセイ
した。トランスフェクション効率を制御するために、細胞にβガラクトシダーゼ
リポーター構築物を同時トランスフェクトした。最後の6時間は、トログリタゾ
ン（50μM）、シグリタゾン（50μM）、DHA（50μM）、PGJ2（10μM）、若しく
はイブプロフェン（1 mM）の存在下または不在下で、LPS（1μg/ml）若しくはA
β25-35（40μM）とともに、細胞をインキュベートした。実験を二重に実施した
が、報告したデータは、その測定の平均を表している。図9Aおよび9Bに示すよう
に、THP-1細胞のLPSおよびAβ処理の結果、両サイトカイン遺伝子のプロモータ
ー活性の刺激がもたらされ、このことはこれらの薬剤のサイトカイン産生へのin
vivo効果に一致している。THP-1細胞と天然のPPARγアゴニストである、PGJ2お
よびDHAとのインキュベートの結果、プロモーター活性の抑制がもたらされた。
同様に、チアゾリジンジオンの、トログリタゾンおよびシグリタゾン、さらには
イブプロフェンもまたリポーターの発現を抑止した。これらのデータは、多様な
PPARγアゴニストがIL-6およびTNF-α遺伝子の発現を効果的に抑制することを証
明している。
【０１９４】実施例6 シクロオキシゲナーゼ-2の発現に及ぼすPPARγアゴニストの効果 この実施例では、PPARγアゴニストがシクロオキシゲナーゼ-2の発現を阻止す
ることを証明する。具体的に言うと、この実施例では多様な免疫刺激に応答して
、シクロオキシゲナーゼ-2（COX-2）が誘導的に発現されることを証明する。図1
0Aおよび10Bに示すように、THP-1細胞のホルボールエステル（TPA）若しくはLPS
での18時間の処理の結果、用量依存様式でのCOX-2の発現の誘導がもたらされた
。図10Aにおいて、THP-1単球を、ベヒクル（v）若しくは示した濃度（nM）のホ
ルボールエステル（TPA）の存在下でインキュベートした。未処理の細胞を「z」
で表示する。図10Bにおいて、THP-1単球を処理しない（z）か、あるいは単独で
（c）またはベヒクル（v）若しくは示した濃度（nM）のLPSの存在下でインキュ
ベートした。
ることを証明する。具体的に言うと、この実施例では多様な免疫刺激に応答して
、シクロオキシゲナーゼ-2（COX-2）が誘導的に発現されることを証明する。図1
0Aおよび10Bに示すように、THP-1細胞のホルボールエステル（TPA）若しくはLPS
での18時間の処理の結果、用量依存様式でのCOX-2の発現の誘導がもたらされた
。図10Aにおいて、THP-1単球を、ベヒクル（v）若しくは示した濃度（nM）のホ
ルボールエステル（TPA）の存在下でインキュベートした。未処理の細胞を「z」
で表示する。図10Bにおいて、THP-1単球を処理しない（z）か、あるいは単独で
（c）またはベヒクル（v）若しくは示した濃度（nM）のLPSの存在下でインキュ
ベートした。
【０１９５】 図11Aおよび11Bに示すように、TPAおよびLPSに誘導されるCOX-2の発現が、PPA
RγアゴニストのPGJ2により、10μM PGJ2の用量において、ほぼ完全な発現抑止
として抑制された。図11Aにおいて、THP-1単球を100 nM TPAおよび示した濃度（
μM）のPGJ2の存在若しくは不在下でインキュベートした。図11Bにおいて、THP-
1単球をLPS 25μg および示した濃度（μM）のPGJ2の存在若しくは不在下でイン
キュベートした。シクロオキシゲナーゼ-2の発現を、COX-2特異的抗体を使用す
る細胞溶解物のウエスタン分析によって評価した。
RγアゴニストのPGJ2により、10μM PGJ2の用量において、ほぼ完全な発現抑止
として抑制された。図11Aにおいて、THP-1単球を100 nM TPAおよび示した濃度（
μM）のPGJ2の存在若しくは不在下でインキュベートした。図11Bにおいて、THP-
1単球をLPS 25μg および示した濃度（μM）のPGJ2の存在若しくは不在下でイン
キュベートした。シクロオキシゲナーゼ-2の発現を、COX-2特異的抗体を使用す
る細胞溶解物のウエスタン分析によって評価した。
【０１９６】 図12Aおよび12Bに示すように、PPARγアゴニストのシグリタゾン、トログリタ
ゾン、DHAおよびインドメタシンもまた、TPAで刺激されるCOX-2の発現を抑制し
た。これらの実験において、THP-1単球を100 nm TPAの存在または不在下で18時
間インキュベートした。PPARγアゴニストのインドメタシン（1 mM）、シグリタ
ゾン（50μM）、ドコサヘキサン酸（100μM）、およびPGJ2（10μM）（図12A）
またはインドメタシン（500μM）若しくはトログリタゾン（50μM）（図12B）を
単独で、またはTPAと組合せて培養物に添加した。細胞溶解物のウエスタン分析
によって、COX-2の発現をモニターし、そのブロットを抗COX-2特異的抗体でプロ
ーブした。
ゾン、DHAおよびインドメタシンもまた、TPAで刺激されるCOX-2の発現を抑制し
た。これらの実験において、THP-1単球を100 nm TPAの存在または不在下で18時
間インキュベートした。PPARγアゴニストのインドメタシン（1 mM）、シグリタ
ゾン（50μM）、ドコサヘキサン酸（100μM）、およびPGJ2（10μM）（図12A）
またはインドメタシン（500μM）若しくはトログリタゾン（50μM）（図12B）を
単独で、またはTPAと組合せて培養物に添加した。細胞溶解物のウエスタン分析
によって、COX-2の発現をモニターし、そのブロットを抗COX-2特異的抗体でプロ
ーブした。
【０１９７】 図13Aに示すように、TPAと同様にAβによるTHP-1の処理の結果、COX-2の発現
の迅速な誘導がもたらされ、それは24時間目まで持続した。この図中、THP-1単
球を、ベヒクル（DMSO）、TPA（100 nM）若しくはAβ25-35原繊維とともに0-24
時間インキュベートした。図13Bに示すように、PPARγの特定のアゴニスト、PGJ 2 とこの細胞の共インキュベートはCOX-2の発現を劇的に抑制した。この図中、マ
ウスマクロファージ系統、RAW 264.7を、PGJ2（10μM）の不在若しくは存在下で
、ホルボールエステル（100 nM）若しくは原繊維Aβ（25-35）（40μM）ととも
に18時間、インキュベートした。細胞溶解物のウエスタン分析によって、COX-2
の発現をモニターし、そのブロットを抗COX-2特異的抗体でプローブした。これ
らの観察は、本発明がADおよびその他の炎症性疾患におけるCOX-2の作用の抑制
のための新規な治療方法を提供することを証明しているので、特に意義がある。
の迅速な誘導がもたらされ、それは24時間目まで持続した。この図中、THP-1単
球を、ベヒクル（DMSO）、TPA（100 nM）若しくはAβ25-35原繊維とともに0-24
時間インキュベートした。図13Bに示すように、PPARγの特定のアゴニスト、PGJ 2 とこの細胞の共インキュベートはCOX-2の発現を劇的に抑制した。この図中、マ
ウスマクロファージ系統、RAW 264.7を、PGJ2（10μM）の不在若しくは存在下で
、ホルボールエステル（100 nM）若しくは原繊維Aβ（25-35）（40μM）ととも
に18時間、インキュベートした。細胞溶解物のウエスタン分析によって、COX-2
の発現をモニターし、そのブロットを抗COX-2特異的抗体でプローブした。これ
らの観察は、本発明がADおよびその他の炎症性疾患におけるCOX-2の作用の抑制
のための新規な治療方法を提供することを証明しているので、特に意義がある。
【０１９８】実施例7 COX-2プロモーター活性に及ぼすPPARγアゴニストの効果 この実施例では、PPARγアゴニストがCOX-2プロモーター活性を抑制すること
を証明する。ルシフェラーゼリポーターの1つに連結させた2.4 kbのヒトCOX-2プ
ロモーターを含有する構築物を使用して、THP-1細胞中のCOX-2プロモーター活性
を評価した。細胞をPPARγアゴニスト、PGJ2で処理した場合、プロモーターの活
性が劇的に抑制された（約90％の抑制）。図14に示すように、同様に、チアゾリ
ジンジオンのシグリタゾンおよびトログリタゾンがDHAの場合と同じく、このプ
ロモーターからの転写を阻止した。具体的に言うと、エレクトロポレーションに
よって、COX-2ルシフェラーゼリポーター構築物をTHP-1細胞にトランスフェクト
した。細胞にSV-40βガラクトシダーゼプラスミドを同時トランスフェクトして
、トランスフェクションの効率の評価ができるようにした。細胞を48時間インキ
ュベートし、溶解し、ルシフェラーゼおよびβガラクトシダーゼ活性を測定した
。最後の18時間は、細胞を示した薬剤の不在または存在下でインキュベートした
（対照＝非トランスフェクト細胞；PGL-C＝ベクター対照；COX＝COX-2ルシフェ
ラーゼリポーターをトランスフェクトした細胞；細胞にCOX-2ルシフェラーゼリ
ポーターをトランスフェクトして、PGJ2[10μM]、トログリタゾン[50μM]、シグ
リタゾン[50μM]、若しくはDHA[50μM]とともに18時間インキュベート）。デー
タは、2つの独立した実験における二重判定の平均（+/-SEM）を表している。こ
れらのデータは、COX-2の発現のPPARγによって調節された発現が、COX-2遺伝子
内のcis作用性プロモーターエレメントに及ぼしたこれらの薬剤の作用の直接の
結果であることを立証している。
を証明する。ルシフェラーゼリポーターの1つに連結させた2.4 kbのヒトCOX-2プ
ロモーターを含有する構築物を使用して、THP-1細胞中のCOX-2プロモーター活性
を評価した。細胞をPPARγアゴニスト、PGJ2で処理した場合、プロモーターの活
性が劇的に抑制された（約90％の抑制）。図14に示すように、同様に、チアゾリ
ジンジオンのシグリタゾンおよびトログリタゾンがDHAの場合と同じく、このプ
ロモーターからの転写を阻止した。具体的に言うと、エレクトロポレーションに
よって、COX-2ルシフェラーゼリポーター構築物をTHP-1細胞にトランスフェクト
した。細胞にSV-40βガラクトシダーゼプラスミドを同時トランスフェクトして
、トランスフェクションの効率の評価ができるようにした。細胞を48時間インキ
ュベートし、溶解し、ルシフェラーゼおよびβガラクトシダーゼ活性を測定した
。最後の18時間は、細胞を示した薬剤の不在または存在下でインキュベートした
（対照＝非トランスフェクト細胞；PGL-C＝ベクター対照；COX＝COX-2ルシフェ
ラーゼリポーターをトランスフェクトした細胞；細胞にCOX-2ルシフェラーゼリ
ポーターをトランスフェクトして、PGJ2[10μM]、トログリタゾン[50μM]、シグ
リタゾン[50μM]、若しくはDHA[50μM]とともに18時間インキュベート）。デー
タは、2つの独立した実験における二重判定の平均（+/-SEM）を表している。こ
れらのデータは、COX-2の発現のPPARγによって調節された発現が、COX-2遺伝子
内のcis作用性プロモーターエレメントに及ぼしたこれらの薬剤の作用の直接の
結果であることを立証している。
【０１９９】実施例8 中枢神経系の損傷に及ぼすPPARγアゴニストの効果 標準的技術を使用して、PO スプラグ-ダウレイ（Sprague-Dawley）仔ラットか
らアストロサイトを単離し 、24ウェル組織培養プレートのポリLリジン（0.1 mg
/ml）およびラミニン（5μg/ml）でコーティングしたガラスカバースリップ上に
、50,000細胞／ウェルの密度で播種し、10％ウシ胎仔血清を補充したDMEM-F12培
地中で密集に達するまで（1-3日）おいた。3日後、成体スプラグ-ダウレイ（Spr
ague-Dawley）ラットからチオグリコレートで誘発した腹腔マクロファージを単
離し、100,000細胞／ウェルの密度でアストロサイト培養物中に導入した。非活
性化マクロファージを培地のみに播種し、一方活性化マクロファージに強力なマ
クロファージ活性化剤であるザイモサン0.5 mg/mlを導入する。ザイモサンはサ
ッカロミセス セレビシエ（S.cerevisiae）に由来する細胞壁粒子で、α-マンナ
ンおよびβ-グルカン残基で構成されている（Lombardら、J.Immunol.Methods 17
4:155 [1994]）。ザイモサンの食作用には、MFRマンノース受容体およびβ-グル
カン受容体が関与し（Czop, Adv.Immunol.38:361 [1986]；Stewart and Weir,J.
Clin.Lab.Immunol.28:103 [1989]；ならびにLombardら、上記）、これは強力な
マクロファージ活性化剤であって、ロイコトリエンの産生（Czop,上記）、リソ
ソーム酵素の放出（Tapper and Sundler,Biochem.J.306:829 [1995]）、アラキ
ドン酸の分解（Daum and Rohrbach,FEBS 309:110 [1992]）、サイトカインの放
出（例えばIL-1、IL-6、TNF-α、IFN-γ）（Ofekら、Annu.Rev.Microbiol.49:23
9 [1995] ；およびHashimotoら、Biol.Pharm.Bull.20:1006 [1997]）、呼吸バー
スト（Berton and Gordon,Immunology 49:705 [1983]）ならびにマクロファージ
が介在する細胞毒性に至り得るその他の経路の活性化を導く。マクロファージ、
アストロサイトおよび薬剤処理用剤を含む共培養物を3日間維持した。各グルー
プ内で標準化するために、各グループを2構成（処理剤を含む非活性化マクロフ
ァージおよび処理剤を含む活性化マクロファージ）として、活性化しない培養調
製物に対する薬剤の効果における変動の可能性を調整する。3日間の培養後、4％
パラホルムアルデヒドで培養物を固定する前に、ヨウ化プロピジウムを使用して
、細胞の生存性を評価した。固定した培養物をGFAPに対する抗体で染色して、ア
ストロサイトを同定し、ED1でマクロファージを染色し、DAPIですべての細胞核
を標識した。各カバースリップについて、低出力の16ｘ対物レンズを使用して、
標準グリッドから6種の顕微鏡視野を撮影した。これらの写真をコンピュータ内
でスキャンし、ランダム化し、そしてNIH Imageでもって盲目的に分析して、生
存アストロサイトの数、 生存マクロファージの数、細胞密度、および培養空洞
の大きさを測定した。各測定グループからの定量データは、1視野について、適
切な対照グループの平均を数値1に標準化したものに相対させて表現した。次に
データを、多重比較のための分散の分析（ANOVA）およびフィッシャー（Fisher
）のPLSDを使用する統計ソフトウェアで分析した。
らアストロサイトを単離し 、24ウェル組織培養プレートのポリLリジン（0.1 mg
/ml）およびラミニン（5μg/ml）でコーティングしたガラスカバースリップ上に
、50,000細胞／ウェルの密度で播種し、10％ウシ胎仔血清を補充したDMEM-F12培
地中で密集に達するまで（1-3日）おいた。3日後、成体スプラグ-ダウレイ（Spr
ague-Dawley）ラットからチオグリコレートで誘発した腹腔マクロファージを単
離し、100,000細胞／ウェルの密度でアストロサイト培養物中に導入した。非活
性化マクロファージを培地のみに播種し、一方活性化マクロファージに強力なマ
クロファージ活性化剤であるザイモサン0.5 mg/mlを導入する。ザイモサンはサ
ッカロミセス セレビシエ（S.cerevisiae）に由来する細胞壁粒子で、α-マンナ
ンおよびβ-グルカン残基で構成されている（Lombardら、J.Immunol.Methods 17
4:155 [1994]）。ザイモサンの食作用には、MFRマンノース受容体およびβ-グル
カン受容体が関与し（Czop, Adv.Immunol.38:361 [1986]；Stewart and Weir,J.
Clin.Lab.Immunol.28:103 [1989]；ならびにLombardら、上記）、これは強力な
マクロファージ活性化剤であって、ロイコトリエンの産生（Czop,上記）、リソ
ソーム酵素の放出（Tapper and Sundler,Biochem.J.306:829 [1995]）、アラキ
ドン酸の分解（Daum and Rohrbach,FEBS 309:110 [1992]）、サイトカインの放
出（例えばIL-1、IL-6、TNF-α、IFN-γ）（Ofekら、Annu.Rev.Microbiol.49:23
9 [1995] ；およびHashimotoら、Biol.Pharm.Bull.20:1006 [1997]）、呼吸バー
スト（Berton and Gordon,Immunology 49:705 [1983]）ならびにマクロファージ
が介在する細胞毒性に至り得るその他の経路の活性化を導く。マクロファージ、
アストロサイトおよび薬剤処理用剤を含む共培養物を3日間維持した。各グルー
プ内で標準化するために、各グループを2構成（処理剤を含む非活性化マクロフ
ァージおよび処理剤を含む活性化マクロファージ）として、活性化しない培養調
製物に対する薬剤の効果における変動の可能性を調整する。3日間の培養後、4％
パラホルムアルデヒドで培養物を固定する前に、ヨウ化プロピジウムを使用して
、細胞の生存性を評価した。固定した培養物をGFAPに対する抗体で染色して、ア
ストロサイトを同定し、ED1でマクロファージを染色し、DAPIですべての細胞核
を標識した。各カバースリップについて、低出力の16ｘ対物レンズを使用して、
標準グリッドから6種の顕微鏡視野を撮影した。これらの写真をコンピュータ内
でスキャンし、ランダム化し、そしてNIH Imageでもって盲目的に分析して、生
存アストロサイトの数、 生存マクロファージの数、細胞密度、および培養空洞
の大きさを測定した。各測定グループからの定量データは、1視野について、適
切な対照グループの平均を数値1に標準化したものに相対させて表現した。次に
データを、多重比較のための分散の分析（ANOVA）およびフィッシャー（Fisher
）のPLSDを使用する統計ソフトウェアで分析した。
【０２００】 上記の説明中のすべての出版物および特許を参照により本明細書に組み入れる
。記載した本発明の方法および体系の各種の改変および変更は、本発明の範囲お
よび精神からはずれることなく、当業者に明らかであろう。本発明を特定の好ま
しい実施形態に関連させて記載したが、特許請求の範囲に記載した本発明がこう
した特定の実施形態によって不当に限定されるべきものでないことを理解された
い。実際、本発明を実施するために記載した様式についての、細胞生物学、神経
科学、医学、化学および分子生物学または関連分野の当業者にとって明らかな各
種の改変は、添付する請求の範囲内のものであることを意図している。
。記載した本発明の方法および体系の各種の改変および変更は、本発明の範囲お
よび精神からはずれることなく、当業者に明らかであろう。本発明を特定の好ま
しい実施形態に関連させて記載したが、特許請求の範囲に記載した本発明がこう
した特定の実施形態によって不当に限定されるべきものでないことを理解された
い。実際、本発明を実施するために記載した様式についての、細胞生物学、神経
科学、医学、化学および分子生物学または関連分野の当業者にとって明らかな各
種の改変は、添付する請求の範囲内のものであることを意図している。
【図１】 図１は、βアミロイドで刺激したTHP-1細胞におけるチロシンリン酸化タンパ
ク質をSDS-PAGEで分解し、抗ホスホチロシン抗体を用いてチロシンリン酸化タン
パク質をモニターしたオートラジオグラムを示す。
ク質をSDS-PAGEで分解し、抗ホスホチロシン抗体を用いてチロシンリン酸化タン
パク質をモニターしたオートラジオグラムを示す。
【図２】 図２は、細胞溶解物を抗ホスホチロシン抗体によるウェスタンブロットで調べ
たときの、PPARγアゴニストがチロシンキナーゼシグナル伝達カスケードの活性
化に及ぼす影響を示す。
たときの、PPARγアゴニストがチロシンキナーゼシグナル伝達カスケードの活性
化に及ぼす影響を示す。
【図３】 図3A〜Jは、表示した化合物で刺激したときのTHP-1細胞のマクロファージへの
表現型変換を示す。
表現型変換を示す。
【図４】 図４は、PPARγアゴニストがβアミロイドで刺激したTHP-1細胞からの馴らし
培地を妨げて反応性アストロサイトの形態を誘導する能力を測定するために、表
示した化合物で処理した細胞を示す。培養物を固定し、グリア繊維酸性タンパク
質(GFAP)を染色した。
培地を妨げて反応性アストロサイトの形態を誘導する能力を測定するために、表
示した化合物で処理した細胞を示す。培養物を固定し、グリア繊維酸性タンパク
質(GFAP)を染色した。
【図５】 図５は、表示した化合物でTHP-1細胞を処理したときの細胞の生存を示すグラ
フである。
フである。
【図６】 図６は、表示した化合物でTHP-1細胞を処理したときの細胞の生存を示すグラ
フである。
フである。
【図７】 図７は、表示した化合物でTHP-1細胞を処理したときの細胞の生存を示すグラ
フである。
フである。
【図８】 図８は、表示した化合物でTHP-1細胞を処理したときの細胞の生存を示すグラ
フである。
フである。
【図９】 図9Aは、表示した化合物に応答するIL-6プロモーター活性を示すグラフである
。 図9Bは、表示した化合物に応答するTNF-αプロモーター活性を示すグラフであ
る。
。 図9Bは、表示した化合物に応答するTNF-αプロモーター活性を示すグラフであ
る。
【図１０】 図10Aは、ホルボールエステルで処理したときの細胞溶解物のCOX-2特異的抗体
によるウェスタン分析で評価したシクロオキシゲナーゼ-2発現を示す。 図10Bは、LPSで処理したときの細胞溶解物のCOX-2特異的抗体によるウェスタ
ン分析で評価したシクロオキシゲナーゼ-2発現を示す。
によるウェスタン分析で評価したシクロオキシゲナーゼ-2発現を示す。 図10Bは、LPSで処理したときの細胞溶解物のCOX-2特異的抗体によるウェスタ
ン分析で評価したシクロオキシゲナーゼ-2発現を示す。
【図１１】 図11Aは、ホルボールエステルとPPARγアゴニストで処理したときの細胞溶解
物のCOX-2特異的抗体によるウェスタン分析で評価したシクロオキシゲナーゼ-2
発現を示す。 図11Bは、LPSとPPARγアゴニストで処理したときの細胞溶解物のCOX-2特異的
抗体によるウェスタン分析で評価したシクロオキシゲナーゼ-2発現を示す。
物のCOX-2特異的抗体によるウェスタン分析で評価したシクロオキシゲナーゼ-2
発現を示す。 図11Bは、LPSとPPARγアゴニストで処理したときの細胞溶解物のCOX-2特異的
抗体によるウェスタン分析で評価したシクロオキシゲナーゼ-2発現を示す。
【図１２】 図12A〜Bは、ホルボールエステルおよび表示したPPARγアゴニストで処理した
ときの、細胞溶解物のCOX-2特異的抗体によるウェスタン分析で評価したシクロ
オキシゲナーゼ-2発現を示す。
ときの、細胞溶解物のCOX-2特異的抗体によるウェスタン分析で評価したシクロ
オキシゲナーゼ-2発現を示す。
【図１３】 図13A〜Bは、PPARγアゴニストの存在下または不在下にホルボールエステルま
たはβアミロイドで処理したときの、細胞溶解物のCOX-2特異的抗体によるウェ
スタン分析で評価したシクロオキシゲナーゼ-2発現を示す。
たはβアミロイドで処理したときの、細胞溶解物のCOX-2特異的抗体によるウェ
スタン分析で評価したシクロオキシゲナーゼ-2発現を示す。
【図１４】 図14は、表示した化合物に応答するヒトCox-2プロモーター活性を示す。
【図１５】 図15は、本発明の治療用化合物の化学構造を示す。
【図１６】 図16は、本発明の治療用化合物の化学構造を示す。
【図１７】 図17は、種々のPPARγアゴニストが中枢神経系二次損傷の細胞培養物モデルに
及ぼす影響を示すグラフである。
及ぼす影響を示すグラフである。
【図１８】 図18は、ヒト2.4kb cox-2遺伝子プロモーター領域の配列（配列番号１）を示
す。翻訳開始部位はヌクレオチド2328にある。
す。翻訳開始部位はヌクレオチド2328にある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/5575 Ａ６１Ｋ 31/5575 ４Ｃ０８４ Ａ６１Ｐ 25/28 Ａ６１Ｐ 25/28 ４Ｃ０８６ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｑ 1/02 ４Ｃ２０６ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ０７Ｄ 277/14 // Ｃ０７Ｄ 277/14 413/10 413/10 413/12 413/12 413/14 413/14 417/12 417/12 417/14 417/14 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｎ 5/10 5/00 Ｂ (72)発明者 コンブス，コリン アメリカ合衆国 44121 オハイオ州，ユ ニバーシティー ヘイツ，アパートメント 101，セダーロード 14360 (72)発明者 シルバー，ジェリー アメリカ合衆国 44140 オハイオ州，ベ イ ヴィレッジ，ハンティングトン ウッ ズ パークウェイ 31129 (72)発明者 フィッチ，マイケル，ティー． アメリカ合衆国 44121 オハイオ州，エ ス．エウクリッド，グリーン ロード 1062 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA08 CA04 DA02 EA04 FA01 GA11 HA11 HA12 4B063 QA01 QA18 QQ20 QQ22 QR60 QR77 QR80 QS24 QS28 4B065 AA93Y AA94X AB01 AC14 CA27 CA46 4C033 AB01 AB20 4C063 AA01 BB08 CC62 CC78 DD12 DD62 EE01 4C084 AA02 AA17 MA52 NA14 ZA011 ZA012 ZA161 ZA162 ZA361 ZA362 ZB011 ZB012 4C086 AA02 BC82 DA01 MA01 MA04 MA52 NA14 ZA01 ZA16 ZA36 ZB01 4C206 AA02 DA05 MA01 MA04 MA72 NA14 ZA01 ZA16 ZA36 ZB01
Claims (42)
- 【請求項１】 アルツハイマー病にかかっている被験者およびアルツハイマ
ー病にかかりやすい被験者からなる群より選択される被験者に、治療に有効な量
のPPARγアゴニストを投与することを含む、前記被験者の治療方法。 - 【請求項２】 PPARγアゴニストがチアゾリジンジオンからなる、請求項１
に記載の方法。 - 【請求項３】 チアゾリジンジオンがトログリタゾンからなる、請求項２に
記載の方法。 - 【請求項４】 チアゾリジンジオンがシグリタゾンからなる、請求項２に記
載の方法。 - 【請求項５】 チアゾリジンジオンがピオグリタゾンからなる、請求項２に
記載の方法。 - 【請求項６】 チアゾリジンジオンがBRL 49653からなる、請求項２に記載
の方法。 - 【請求項７】 チアゾリジンジオンがエングリタゾンからなる、請求項２に
記載の方法。 - 【請求項８】 PPARγアゴニストがドコサヘキサエン酸からなる、請求項１
に記載の方法。 - 【請求項９】 PPARγアゴニストがプロスタグランジンJ2およびプロスタグ
ランジンJ2類似体からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１０】 プロスタグランジンJ2類似体がΔ12-プロスタグランジンJ 2 および15-デオキシ-Δ12,14-プロスタグランジンJ2からなる群より選択される
、請求項９に記載の方法。 - 【請求項１１】 前記投与が経口投与することを含む、請求項１に記載の方
法。 - 【請求項１２】 PPARγアゴニストの治療に有効な量が約10mg/kg/日からな
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１３】 中枢神経系の損傷をかかえている被験者に、治療に有効な
量のPPARγアゴニストを投与することを含む、前記被験者の治療方法。 - 【請求項１４】 PPARγアゴニストがチアゾリジンジオンからなる、請求項
１３に記載の方法。 - 【請求項１５】 チアゾリジンジオンがトログリタゾンからなる、請求項１
４に記載の方法。 - 【請求項１６】 チアゾリジンジオンがシグリタゾンからなる、請求項１４
に記載の方法。 - 【請求項１７】 チアゾリジンジオンがピオグリタゾンからなる、請求項１
４に記載の方法。 - 【請求項１８】 チアゾリジンジオンがBRL 49653からなる、請求項１４に
記載の方法。 - 【請求項１９】 チアゾリジンジオンがエングリタゾンからなる、請求項１
４に記載の方法。 - 【請求項２０】 PPARγアゴニストがドコサヘキサエン酸からなる、請求項
１３に記載の方法。 - 【請求項２１】 PPARγアゴニストがプロスタグランジンJ2およびプロスタ
グランジンJ2類似体からなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。 - 【請求項２２】 プロスタグランジンJ2類似体がΔ12-プロスタグランジンJ 2 および15-デオキシ-Δ12,14-プロスタグランジンJ2からなる群より選択される
、請求項２１に記載の方法。 - 【請求項２３】 前記投与が経口投与することを含む、請求項１３に記載の
方法。 - 【請求項２４】 PPARγアゴニストの治療に有効な量が約10mg/kg/日からな
る、請求項１３に記載の方法。 - 【請求項２５】 炎症性成分が原因の疾患にかかっている被験者および炎症
性成分が原因の疾患にかかりやすい被験者からなる群より選択される被験者に、
治療に有効な量のPPARγアゴニストを投与することを含む、前記被験者の治療方
法。 - 【請求項２６】 PPARγアゴニストがチアゾリジンジオンからなる、請求項
２５に記載の方法。 - 【請求項２７】 チアゾリジンジオンがトログリタゾンからなる、請求項２
６に記載の方法。 - 【請求項２８】 チアゾリジンジオンがシグリタゾンからなる、請求項２６
に記載の方法。 - 【請求項２９】 チアゾリジンジオンがピオグリタゾンからなる、請求項２
６に記載の方法。 - 【請求項３０】 チアゾリジンジオンがBRL 49653からなる、請求項２６に
記載の方法。 - 【請求項３１】 チアゾリジンジオンがエングリタゾンからなる、請求項２
６に記載の方法。 - 【請求項３２】 PPARγアゴニストがドコサヘキサエン酸からなる、請求項
２５に記載の方法。 - 【請求項３３】 PPARγアゴニストがプロスタグランジンJ2およびプロスタ
グランジンJ2類似体からなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。 - 【請求項３４】 プロスタグランジンJ2類似体がΔ12-プロスタグランジンJ 2 および15-デオキシ-Δ12,14-プロスタグランジンJ2からなる群より選択される
、請求項３３に記載の方法。 - 【請求項３５】 前記投与が経口投与することを含む、請求項２５に記載の
方法。 - 【請求項３６】 PPARγアゴニストの治療に有効な量が約10mg/kg/日からな
る、請求項２５に記載の方法。 - 【請求項３７】 前記炎症性成分が原因の疾患がアルツハイマー病、発作、
外傷性損傷および脊髄損傷からなる群より選択される、請求項２５に記載の方法
。 - 【請求項３８】 cox-2遺伝子のPPARγ介在遺伝子転写を改変する化合物の
能力を測定する方法であって、次のステップ： a) i) １種以上の被験化合物、 ii) 機能しうる順序で、1) PPARγ感受性cox-2調節エレメント、2) プロ
モーターおよび3) 異種遺伝子を含むオリゴヌクレオチド配列を含有するDNA構築
物により形質転換された宿主細胞、 を用意すること、 b) １種以上の被験化合物と該宿主細胞とを、該異種遺伝子の発現が１種以上
の該化合物に応答する条件下で接触させること、 を含んでなる方法。 - 【請求項３９】 ステップb)における異種遺伝子の発現レベルと、該化合物
の不在下での該宿主細胞からの該遺伝子の発現レベルとを比較するステップをさ
らに含む、請求項３８に記載の方法。 - 【請求項４０】 PPARγ感受性cox-2調節エレメントを含むオリゴヌクレオ
チド配列を含有する前記DNA構築物が配列番号１を含む、請求項３８に記載の方
法。 - 【請求項４１】 COX-2発現を調節する方法であって、次のステップ： a) i) １種以上の、COX-2を発現する細胞、 ii) １種以上の該細胞においてPPARγを発現させる手段、 iii)１種以上のPPARγアゴニスト、 を用意すること、 b) １種以上の該細胞中に、任意の順序で、PPARγを発現させる手段および１
種以上のPPARγアゴニストを導入すること、 を含んでなる方法。 - 【請求項４２】 １種以上のCOX-2を発現する細胞が異常なレベルのCOX-2を
発現する細胞を含む、請求項４１に記載の方法。
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