CN102177436B - 鉴定疾病风险因子的方法 - Google Patents

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Abstract

本文中提供的是一种用于鉴定与感兴趣疾患(例如阿尔茨海默氏病)形成有关的遗传变体的方法及如此鉴定的遗传变体。还提供了在检测到本文中所描述的遗传变体后，用活性剂(例如用特定活性剂和/或在较早的年龄)治疗的方法。在一些实施方案中，所述遗传变体是TOMM40基因的删除/插入多态性(DIP)。还提供了用于确定受试者是否处于晚期发作阿尔茨海默氏病形成风险升高的试剂盒。进一步提供了用于确定受试者是否会对用活性剂治疗感兴趣疾患有响应的试剂盒。

Description

鉴定疾病风险因子的方法
相关申请
本申请要求2008年8月12日提交的美国临时申请No.61/088,203；2009年6月12日提交的美国临时申请No.61/186,673；和2009年7月10日提交的美国临时申请No.61/224,647的优先权，通过本文中的述及完整收录每一篇的公开内容。
发明领域
本发明涉及基因组学、遗传学、药物遗传学、和生物信息学领域，包括基因组分析和DNA序列变异研究。本发明还涉及DNA序列中的变异与预报个体对特定疾病、病症、或疾患的易感性和/或对特定药物或治疗的响应之间的关联的研究。
发明背景
对与复杂疾病有关的遗传标志物的搜索正在进行中。用SNP阵列进行的基因组尺度扫描研究继续突显ApoE区是对于阿尔茨海默氏病研究中的调查而言最重要的区域(Coon et al.，J.Clin.Psychiatry 68：613-8(2007)；Li et al.，Arch.Neurol.65：45-53(2007))。
先前提出ApoE 4同等型与晚期发作阿尔茨海默氏病形成风险升高有强关联(Pericak-Vance et al.，Am.J.Hum.Genet.48，1034-50(1991)；Martin et al.，2000，美国专利No.6,027,896，Roses，et al.，美国专利No.5,716,828，Roses etal.)。该相关性是剂量依赖性的(Yoshizawa et al.，1994；Schellenberg，1995)。就是说，两种ApoE 4等位基因的携带者比只有一种ApoE 4等位基因的携带者更有可能而且在更早的年龄形成晚期发作阿尔茨海默氏病(LOAD)(Corder etal.，Science 261，921-3(1993))。
不过，E4等位基因只占遗传性阿尔茨海默氏病的大约50％。一种解释是ApoE 4仅仅充当附近连锁不平衡的某物的代替标志物。或者，考虑到最近发现ApoE 4在线粒体毒性中起机械作用(mechanistic role)，ApoE 4的负面效应可能被附近编码的另一种基因产物消除或加剧(Chang et al.，2005)。
由于ApoE状态还与冠状动脉疾病并也有可能与众多其它疾病和病症的风险有关，ApoE区的研究的蕴涵不限于阿尔茨海默氏病，而是潜在深远的(Mahley et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103：5644-51(2006))。更广泛而言，对变异序列检查与已知涉及复杂疾病过程的其它遗传区连锁不平衡的基因周围的过程或途径会提供在解释那些疾病的机制中有价值的信息。
发明概述
本文中提供的是一种用于鉴定与感兴趣疾患形成(例如感兴趣疾病的较早或较晚发作)有关的遗传变体的方法，包括(a)根据含有DNA的生物学样品测定由多名人类受试者个体在感兴趣遗传基因座处携带的核苷酸序列，其中所述受试者包括(i)受感兴趣疾患影响的受试者和(ii)未受感兴趣疾患影响的受试者二者；(b)自在所述多名受试者中观察到的核苷酸序列鉴定所述遗传基因座处的遗传变体(例如使用多重序列比对分析)；(c)通过构建所述受试者的所述核苷酸序列的系统发生树来将所述遗传变体绘图，所述树包含鉴定所述受试者间变体变化(例如同一顺反子上的变体变化)的分支；(d)检查所述树中作为分支呈现的遗传变体并确定受影响的与未受影响的受试者之比以鉴定那些导致受影响与未受影响受试者之比变化的变化(优选地，其中起点是代表最大数目受试者的遗传变体)；并然后(e)鉴定受影响与未受影响受试者之比与所述树上一种或多种邻近变体有实质性差异(例如相差至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、或90％)的遗传变体或变体组(单元型)以由此鉴定与所述感兴趣疾患形成有关的遗传变体。
在一些实施方案中，所有受试者携带与所述感兴趣疾患有关的相同已知多态性。
在一些实施方案中，所述感兴趣疾患是神经变性疾病、代谢疾病(例如血脂障碍)、心血管疾病、精神病症、或癌症。在一些实施方案中，所述感兴趣疾病是疾病发病机制涉及ApoE和/或TOMM40的疾病。
在一些实施方案中，所述感兴趣疾患与升高或降低的线粒体功能障碍有关。在一些实施方案中，所述感兴趣疾患是精神分裂症。在一些实施方案中，所述感兴趣疾患是冠状动脉疾病。在一些实施方案中，所述感兴趣疾患是II型糖尿病。在一些实施方案中，所述感兴趣疾患是帕金森氏病。在一些实施方案中，所述感兴趣疾患是阿尔茨海默氏病。
在一些实施方案中，所述已知多态性风险因子是载脂蛋白E等位基因(例如ApoE 2、ApoE 3或ApoE 4)。
在一些实施方案中，所述感兴趣遗传基因座与所述已知多态性连锁不平衡。在一些实施方案中，所述感兴趣遗传基因座与所述已知多态性在同一染色体上且相距小于10、20、30、40、或50千碱基。在一些实施方案中，所述遗传基因座是TOMM40。
还提供了一种用于确定感兴趣疾患形成风险升高的方法，包括：(a)根据含有DNA的生物学样品确定由受试者个体携带的通过任何前述段落的方法鉴定的遗传变体；并然后(b)当所述遗传变体存在时确定所述受试者形成所述感兴趣疾患的风险升高。
进一步提供了一种用于确定受试者(例如携带至少一种Apo E3等位基因的受试者)中阿尔茨海默氏病形成风险升高的方法，包括：(a)根据取自所述受试者的含有DNA的生物学样品检测与阿尔茨海默氏病风险升高或降低有关的TOMM40基因遗传变体的存在或缺失；并(b)当所述遗传变体存在或缺失时确定所述受试者形成阿尔茨海默氏病风险的升高或降低。
在一些实施方案中，确定所述受试者是否是Apo E2/E2、E2/E3、E2/E4、E3/E3、E3/E4、或E4/E4受试者。在一些实施方案中，确定所述受试者是否是Apo E3/E3或E3/E4受试者。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括下述步骤：(c)当所述受试者被确定为形成阿尔茨海默氏病的风险升高时以治疗有效量给所述受试者施用抗阿尔茨海默氏病活性剂。
在一些实施方案中，当与所述遗传变体不存在或不缺失的受试者相比通过所述遗传变体的存在或缺失所述受试者被确定为风险升高时在较小的年龄在所述受试者中进行所述施用步骤(例如，对于ApoE 4/4受试者，开始于45、46、47、48、49、50、51、52或53岁，且在此后每一年持续进行，而非开始于55岁或更大；对于ApoE 4/3受试者，开始于50、51、52、53、54、55、56、57或58岁，且在此后每一年持续进行，而非开始于60岁或更大；对于ApoE3/3受试者，开始于55、56、57、58、59、60、61、62或63岁，且在此后每一年持续进行，而非开始于65岁或更大；而对于ApoE 2/3受试者，开始于60、61、62、63、64、65、66、67或68岁，且在此后每一年持续进行，而非开始于70岁或更大)。
在一些实施方案中，所述活性剂选自下组：乙酰胆碱酯酶抑制剂，NMDA受体拮抗剂，PPAR激动剂或调控剂(例如噻唑烷二酮或glitazar类中的药物)，抗体，融合蛋白，治疗性RNA分子，及其组合。在一些实施方案中，所述活性剂是罗格列酮或其药学可接受盐。
在一些实施方案中，所述TOMM40遗传变体是下文所示表1中列出的变体。
还提供了一种通过以治疗有效量给受试者施用抗阿尔茨海默氏病活性剂来治疗受试者(例如具有至少一种ApoE 3等位基因的受试者)阿尔茨海默氏病的方法；改良包括：当与不携带与阿尔茨海默氏病风险升高有关的TOMM40基因遗传变体的相应受试者相比所述受试者携带所述遗传变体时，在较小的年龄给所述受试者施用所述活性剂(例如，对于ApoE 4/4受试者，开始于45、46、47、48、49、50、51、52、或53岁，且在此后每一年持续进行，而非开始于55岁或更大；对于ApoE 4/3受试者，开始于50、51、52、53、54、55、56、57、或58岁，且在此后每一年持续进行，而非开始于60岁或更大；对于ApoE 3/3受试者，开始于55、56、57、58、59、60、61、62、或63岁，且在此后每一年持续进行，而非开始于65岁或更大；而对于ApoE 2/3受试者，开始于60、61、62、63、64、65、66、67、或68岁，且在此后每一年持续进行，而非开始于70岁或更大)。
在一些实施方案中，所述受试者是Apo E2/E2、E2/E3、E2/E4、E3/E3、E3/E4、E4/E4受试者。在一些实施方案中，所述受试者是Apo E3/E3或E3/E4受试者。
在一些实施方案中，所述活性剂选自下组：乙酰胆碱酯酶抑制剂，NMDA受体拮抗剂，PPAR激动剂或调控剂(例如噻唑烷二酮或glitazar类中的药物)，抗体，融合蛋白，治疗性RNA分子，及其组合。在一些实施方案中，所述活性剂是罗格列酮或其药学可接受盐。
在一些实施方案中，所述TOMM40基因遗传变体是删除/插入多态性(DIP)。在一些实施方案中，所述DIP是插入多态性。在一些实施方案中，所述DIP是poly-T删除/插入多态性(例如5-100个、或10-80个、或20-50个bp的poly-T)。
在一些实施方案中，所述TOMM40遗传变体是下文所示表1中列出的变体。在一些实施方案中，所述DIP是rs10524523、rs10602329或DIP3。在一些实施方案中，所述DIP是rs10524523。
进一步提供了一种为有所需要的患者治疗感兴趣疾患的方法，其中所述感兴趣疾患与ApoE和/或TOMM40有关，所述方法包括下述步骤：(a)确定由受试者个体携带的通过第1-12段的方法鉴定的遗传变体的存在或缺失以生成所述患者的遗传图谱；并然后，若所述图谱指示所述患者会对活性剂有响应，则(b)以治疗有效量给所述受试者施用所述活性剂以治疗所述感兴趣疾患。
在一些实施方案中，所述活性剂选自下组：乙酰胆碱酯酶抑制剂，NMDA受体拮抗剂，PPAR激动剂或调控剂(例如噻唑烷二酮或glitazar类中的药物)，抗体，融合蛋白，治疗性RNA分子，及其组合。在一些实施方案中，所述活性剂是罗格列酮或其药学可接受盐。
在一些实施方案中，所述TOMM40基因遗传变体是删除/插入多态性(DIP)。在一些实施方案中，所述DIP是插入多态性。在一些实施方案中，所述DIP是poly-T删除/插入多态性(例如5-100个、或10-80个、或20-50个bp的poly-T插入)。
在一些实施方案中，所述TOMM40遗传变体是下文所示表1中列出的变体。在一些实施方案中，所述DIP是rs10524523、rs10602329或DIP3。在一些实施方案中，所述DIP是rs10524523。
还提供了一种在受试者中治疗阿尔茨海默氏病的方法，包括：(a)自取自所述受试者的含有DNA的生物学样品检测与对活性剂的响应性有关的TOMM40基因遗传变体的存在或缺失；并若所述遗传变体存在，则(b)以治疗有效量给所述受试者施用所述活性剂以治疗所述阿尔茨海默氏病。
在一些实施方案中，所述受试者携带至少一种ApoE 3等位基因。在一些实施方案中，所述受试者是Apo E3/E3或E3/E4受试者。
在一些实施方案中，所述活性剂选自下组：乙酰胆碱酯酶抑制剂，NMDA受体拮抗剂，PPAR激动剂或调控剂(例如噻唑烷二酮或glitazar类中的药物)，抗体，融合蛋白，治疗性RNA分子，及其组合。在一些实施方案中，所述活性剂是罗格列酮或其药学可接受盐。
在一些实施方案中，所述TOMM40基因遗传变体是删除/插入多态性(DIP)。在一些实施方案中，所述DIP是插入多态性。在一些实施方案中，所述DIP是poly-T删除/插入多态性(例如5-100个、或10-80个、或20-50个bp的poly-T)。
在一些实施方案中，所述TOMM40基因遗传变体是下文所述表1中列出的变体。在一些实施方案中，所述DIP是rs10524523、rs10602329或DIP3。在一些实施方案中，所述DIP是rs10524523。
进一步提供了抗阿尔茨海默氏病活性剂用于制备药物的用途，所述药物用于进行依照上文所示段落治疗阿尔茨海默氏病的方法。还提供了抗阿尔茨海默氏病活性剂用于进行治疗阿尔茨海默氏病的方法的用途。
提供了一种为处于阿尔茨海默氏病形成风险的患者确定预后的方法，包括获得患者图谱，其中所述获得患者图谱包括：在所述患者的生物学样品中检测至少一种ApoE等位基因的存在或缺失，并检测位于TOMM40基因内含子6或内含子9中的至少一种TOMM40删除/插入多态性(DIP)的存在或缺失，并然后将所述患者图谱转换成所述预后，其中所述ApoE等位基因的存在及所述至少一种TOMM40 DIP多态性的存在将所述患者鉴定为处于阿尔茨海默氏病形成风险的患者。
在一些实施方案中，所述DIP是插入多态性。在一些实施方案中，所述DIP是poly-T删除/插入多态性(例如5-100个、或10-80个、或20-50个bp的poly-T)。
在一些实施方案中，所述DIP是rs10524523、rs10602329或DIP3。在一些实施方案中，所述DIP是rs10524523。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括检测所述受试者是否是ApoE2/E2、E2/E3、E2/E4、E3/E3、E3/E4、E4/E4受试者。在一些实施方案中，所述受试者是Apo E3/E3或E3/E4受试者。
还提供了一种用于将受试者分层入用于治疗阿尔茨海默氏病的疗法的临床试验的亚组的方法，所述方法包括：在所述患者的生物学样品中检测至少一种ApoE等位基因的存在或缺失，并检测位于TOMM40基因内含子6或内含子9中的至少一种TOMM40删除/插入多态性(DIP)的存在或缺失，其中基于所述至少一种ApoE等位基因和/或TOMM40DIP等位基因存在或缺失将所述受试者分层入所述疗法的所述临床试验的所述亚组。
在一些实施方案中，所述DIP是插入多态性。在一些实施方案中，所述DIP是poly-T插入多态性(例如5-100个、或10-80个、或20-50个bp的poly-T插入)。
在一些实施方案中，所述DIP是rs10524523、rs10602329或DIP3。在一些实施方案中，所述DIP是rs10524523。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括检测所述受试者是否是ApoE2/E2、E2/E3、E2/E4、E3/E3、E3/E4、E4/E4受试者。在一些实施方案中，所述受试者是Apo E3/E3或E3/E4受试者。
进一步提供了一种用于在阿尔茨海默氏病的治疗的临床试验中鉴定患者的方法，包括：a)鉴定诊断有阿尔茨海默氏病的患者；并b)为所述诊断有阿尔茨海默氏病的患者确定预后，包括获得患者图谱，其中所述获得患者图谱包括i)在所述患者的生物学样品中检测至少一种ApoE等位基因的存在或缺失，ii)检测位于TOMM40基因内含子6或内含子9中的至少一种TOMM40删除/插入多态性(DIP)的存在或缺失，并iii)将所述患者图谱转换成所述预后，所述预后包括对患者是否是阿尔茨海默氏病的所述治疗的所述临床试验的候选者的预测。
在一些实施方案中，所述DIP是插入多态性。在一些实施方案中，所述DIP是poly-T删除/插入多态性(例如5-100个、或10-80个、或20-50个bp的poly-T)。
在一些实施方案中，所述DIP是rs10524523、rs10602329或DIP3。在一些实施方案中，所述DIP是rs10524523。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括检测所述受试者是否是ApoE2/E2、E2/E3、E2/E4、E3/E3、E3/E4、E4/E4受试者。在一些实施方案中，所述受试者是Apo E3/E3或E3/E4受试者。
提供了一种用于确定受试者是否形成晚期发作阿尔茨海默氏病的风险升高的试剂盒，包括：(A)至少一种特异性检测ApoE 3、ApoE 4、或ApoE 2的试剂，其中所述试剂选自下组：选择性结合ApoE 3、ApoE 4、或ApoE 2的抗体，和选择性结合编码ApoE 3、ApoE 4、或ApoE 2的DNA的寡核苷酸探针；(B)至少一种特异性检测位于TOMM40基因内含子6或内含子9中的至少一种TOMM40删除/插入多态性(DIP)的存在或缺失的试剂；和(C)通过下述步骤确定受试者是否形成晚期发作阿尔茨海默氏病的风险升高的用法说明，(i)用所述至少一种试剂在所述受试者中检测所述ApoE同等型的存在或缺失；(ii)检测位于TOMM40基因内含子6或内含子9中的至少一种TOMM40删除/插入多态性(DIP)的存在或缺失；并(iii)通过观察用所述至少一种试剂是否检测到ApoE同等型及所述TOMM40DIP的存在来观察所述受试者是否形成晚期发作阿尔茨海默氏病的风险升高，其中所述ApoE同等型及所述TOMM40DIP的存在指示所述受试者形成晚期发作阿尔茨海默氏病的风险升高。
在一些实施方案中，所述至少一种试剂和所述用法说明包装在一个容器中。
在一些实施方案中，所述DIP是插入多态性。在一些实施方案中，所述DIP是poly-T删除/插入多态性(例如5-100个、或10-80个、或20-50个bp的poly-T)。
在一些实施方案中，所述DIP是rs10524523、rs10602329或DIP3。在一些实施方案中，所述DIP是rs10524523。
在一些实施方案中，所述确定步骤进一步包括检测所述受试者是否是Apo E2/E2、E2/E3、E2/E4、E3/E3、E3/E4或E4/E4受试者。在一些实施方案中，所述受试者是Apo E3/E3或E3/E4受试者。
提供了一种用于确定受试者是否会对用活性剂治疗感兴趣疾患有响应的试剂盒，其中所述感兴趣疾患与ApoE和/或TOMM40有关，所述试剂盒包括：(A)至少一种特异性检测ApoE 3、ApoE 4、或ApoE 2的试剂，其中所述试剂选自下组：选择性结合ApoE 3、ApoE 4、或ApoE 2的抗体，和选择性结合编码ApoE 3、ApoE 4、或ApoE 2的DNA的寡核苷酸探针；(B)至少一种特异性检测位于TOMM40基因内含子6或内含子9中的至少一种TOMM40删除/插入多态性(DIP)的存在或缺失的试剂；和(C)通过下述步骤确定受试者是否会对用所述感兴趣活性剂治疗所述感兴趣疾患有响应的用法说明，(i)用所述至少一种试剂在所述受试者中检测所述ApoE同等型的存在或缺失；(ii)检测位于TOMM40基因内含子6或内含子9中的至少一种TOMM40删除/插入多态性(DIP)的存在或缺失；并(iii)通过观察用所述至少一种试剂是否检测到所述ApoE同等型及所述TOMM40DIP的存在来确定受试者是否会对治疗有响应，其中ApoE 3及所述TOMM40DIP的存在指示所述受试者会对用所述活性剂的所述治疗有响应。
在一些实施方案中，所述至少一种试剂和所述用法说明包装在一个容器中。
在一些实施方案中，所述DIP是插入多态性。在一些实施方案中，所述DIP是poly-T删除/插入多态性(例如5-100个、或10-80个、或20-50个bp的poly-T)。
在一些实施方案中，所述DIP是rs10524523、rs10602329或DIP3。在一些实施方案中，所述DIP是rs10524523。
在一些实施方案中，所述确定步骤进一步包括检测所述受试者是否是Apo E2/E2、E2/E3、E2/E4、E3/E3、E3/E4、或E4/E4受试者。在一些实施方案中，所述受试者是Apo E3/E3或E3/E4受试者。
会理解，所有上述实施方案可以以任何方式和/或组合来组合。与本文一起提供的附图中及下文所示说明书中更为详细地解释了本发明的上述和其它目的和方面。
附图简述
图1显示依照一些实施方案鉴定感兴趣遗传基因座中的基因组序列的预定区域中可能与感兴趣疾患有关的遗传变体的一般流程图。
图2显示阿尔茨海默氏病发作的平均年龄图，作为五种常见ApoE基因型的继承的函数，而且呈现ApoE 4作为阿尔茨海默氏病的风险因子(1993)。
图3显示染色体19上的区域A、B、和C，它们是例示性的感兴趣遗传基因座。TOMM40基因密切接近ApoE基因且编码一种指示线粒体外膜的40kD蛋白质。TOMM40与ApoE在线粒体蛋白质输入的调节中直接相互作用，而且现在的一种假说是特定TOMM40变体的存在加剧与ApoE 3等位基因的剂量依赖性存在有关的阿尔茨海默氏病风险升高。
图4以示意图形式显示如图3所指示根据本文中详述的一些实施方案构建的B区域的进化图。每一个水平的椭圆代表一个观察到的序列变体(例如，核苷酸变化)，而椭圆的大小代表其频率。每一个变体称为树上的一个节点，而一个节点到另一个节点通过分支的连接代表观察到由个体受试者携带的成顺式的两个变体。
图5是基于区域B为TOMM40构建的系统发生树的示意图，显示了这个区域中TOMM40变体的两个主要分组或进化枝中ApoE表型的百分比。
图6是TOMM40-ApoE基因座的示意性总览，包括显示在探索性(R1)(23Kb)和验证性(R2)(10Kb)研究中进行一级测序的单元型区段和区域(NCBIBuild 36.3)的LD图。显示了Hapmap数据的LD图(CEU分析小组)、实心脊的单元型区段定义、具有通过不同线特征呈现的D’/LOD颜色方案的r2值。
图7显示系统发生树及变体分开的呈现。7A：SNP变体，进化枝A对B，E6-E10代表TOMM40外显子而垂直线指示SNP的大致位置。两个主要分支的分开具有强自展(bootstrap)支持(973/1000)。7B：rs10524523长度多态性。为长度多态性的每个组提供了描述性统计。在树或很小的进化枝中形成各个外类群(outgroup)的数种长单元型在鉴定为“其余”(Remainder)的组中。
图8呈现通过ApoE基因型3/3(8A)、3/4(8B)、和4/4(8C)分层的rs10524523长度多态性的长度的柱状图。N＝210个单元型(AS群组)。
图9显示60-86岁之间发作的患者的AD发作年龄与rs10524523多态性长度之间的关联。框图指示95％范围(垂直线)、中值(框中的水平线)和四分位间范围(框)。
发明详述
下文更详细地解释了本发明。此描述并非意图作为可实施本发明的所有不同方式或可添加至本发明的所有特征的详细目录。例如，关于一个实施方案例示的特征可并入其它实施方案，而且关于特定实施方案例示的特征可自该实施方案删除。另外，根据本公开，对本文中建议的各种实施方案的不偏离本发明的众多变更和添加对于本领域技术人员会是明显的。因此，下面的说明意图例示本发明的一些特定实施方案，而非穷尽地规定所有排列、组合及其变更。
如本发明的说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”意图也包括复数形式，除非上下文另外清楚指明。同样，如本文中使用的，“和/或”指且涵盖一个或多个所列项的任何和所有可能组合，以及当解释为择一(“或”)时组合的排除。
本发明致力于用于揭示因复杂疾病和病症而特别感兴趣的区域中的遗传变异的方法。它还涉及基于与表型信息的关联，最有信息价值的遗传标志物的发现。在一个实施方案中，本发明可用于定位与对特定疾病、病症、或疾患的易感性有关的遗传标志物。在另一个实施方案中，关于受试者对候选治疗或药物的响应的数据可包括在关于与对该治疗或药物的有利响应有关的遗传标志物定位的系统发生分析中(即药物遗传学)。该方法可应用于来自特定基因座的遗传变异的任何数据集。见图1，它是依照本发明寻找遗传风险因子的办法的流程图。
在一个方面，遗传变异分析基于变异序列数据。在第二个方面，使用二倍体基因型数据揭开结构，由此避免实验或计算推断成分单元型的需要(见例如美国专利No.6,027,896，Roses et al.)。在另一个方面，本方法可应用于源自用实验规程查询靶核酸(这提供存在的序列变异的记录但是实际上没有提供完整序列)的未表征等位基因变异。作为遗传变异的基础的结构对于自二倍体基因型数据推导组分单元型也是有用的。
优选且涵盖本文中描述的方法与本领域知道或记载的用于评估具有疾病或病症(例如那些被认为涉及线粒体功能障碍的(例如阿尔茨海默氏病或其它神经变性疾病))的受试者或用于评估怀疑具有此类疾病形成风险的受试者的其它临床诊断信息联合使用。本发明还可应用于其它复杂疾病、病症、或疾患的遗传风险因子的发现。
通过本文中的述及将本文中引用的所有美国专利参考文献的公开内容完整收入本文。
1.定义
本文中使用了下面的定义：
“感兴趣疾患”指被指派进行系统发生研究和/或后续诊断或预后的特定疾患、疾病、或病症。如本文中使用的，“疾患”包括但不限于与ApoE和/或TOMM40和/或线粒体功能障碍有关的疾患，例如神经变性疾病、代谢疾病、精神病症、和癌症。
涉及ApoE和/或TOMM40的疾患的例子包括但不限于心血管疾病；代谢疾病；神经变性疾病；神经学创伤或疾病；自身免疫疾病(例如多发性硬化(Pinholt M，et al.Apo E in multiple sclerosis and optic neuritis：the apoE-epsilon4 allele is associated with progression of multiple sclerosis.Mult Scler.11：511-5(2005)；Masterman，T.&Hillert，J.The telltale scan：APOE 4inmultiple sclerosis.Lancet Neurol.3：331(2004))、神经精神性系统性红斑狼疮(Pullmann Jr.R，et al.Apolipoprotein E polymorphism in patients withneuropsychiatric SLE.Clin Rheumatol.23：97-101(2004))、等)；病毒感染(例如与丙肝感染有关的肝病(Wozniak MA，et al.Apolipoprotein E-ε4protectsagainst severe liver disease caused by hepatitis C virus.Hepatol.36：456-463(2004))、HIV疾病(Burt TD，et al.Apolipoprotein(apo)E4 enhances HIV-1 cellentry in vitro，and the APOE epsilon4/epsilon4 genotype accelerates HIV diseaseprogression.Proc Natl Acad Sci USA.105：8718-23(2008))、等)；髋骨折/骨质疏松(Pluijm SM，et al.Effects of gender and age on the association ofapolipoprotein E epsilon4 with bone mineral density，bone turnover and the riskof fractures in older people.Osteoporos Int.13：701-9(2002))；线粒体疾病(Chang  S，et  al.Lipid-and receptor-binding regiohs of apolipoprotein E4fragments act in concert to cause mitochondrial dysfunction and neurotoxicity.Proc Natl Acad Sci USA.102：18694-9(2005))；衰老(F，et al.Geneticassociations with human longevity at the APOE and ACE loci.Nat Genet.6：29-32(1994)；Rea IM，et al.，Apolipoprotein E alleles in nonagenarian subjectsin the Belfast Elderly Longitudinal Free-living Ageing Study(BELFAST).Mech.Aging and Develop.122：1367-1372(2001))；炎症(Li L，et al.，Infection inducesa positive acute phase apolipoprotein E response from a negative acute phasegene：role of hepatic LDL receptors.J Lipid Res.49：1782-93(2008))；和记忆功能障碍(Caselli RJ，et al.Longitudinal modeling of age-related memory declineand the APOE epsilon4 effect.N Engl J Med.361：255-63(2009))。
如本文中使用的，“心血管疾病”指涉及心和/或血管的疾病，包括但不限于冠状动脉疾病(Song Y，et al.Meta-analysis：apolipoprotein E genotypes andrisk for coronary heart disease.Ann Intern Med.141：137-47(2004)；Bennet AM，et al.，Association of apolipoprotein E genotypes with lipid levels and coronaryrisk.JAMA 298：1300-11(2007))、动脉粥样硬化(Norata GD，et al.Effects ofPCSK9 variants on common carotid artery intima media thickness and relation toApoE alleles.Atherosclerosis(2009)Jun 27.[Epub ahead of print]，doi：10.1016/j.atherosclerosis 2009.06.023；Paternoster L，et al.AssociationBetween Apolipoprotein E Genotype and Carotid Intima-Media Thickness MaySuggest a Specific Effect on Large Artery Atherothrombotic Stroke.Stroke39：48-54(2008))、缺血性心脏病(Schmitz F，et al.，Robust association of theAPOE 4 allele with premature myocardial infarction especially in patientswithout hypercholesterolaemia：the Aachen study.Eur.J.Clin.Investigation 37：106-108(2007))、血管病诸如缺血性发作(Peck G，et al.The genetics of primaryhaemorrhagic stroke，subarachnoid haemorrhage and ruptured intracranialaneurysms in adults.PLoS One.3：e3691(2008)；Paternoster L，et al.AssociationBetween Apolipoprotein E Genotype and Carotid Intima-Media Thickness MaySuggest a Specific Effect on Large Artery Atherothrombotic Stroke.Stroke39：48-54(2008))、血管性痴呆(Bang OY，et al.Important link between dementiasubtype and apolipoprotein E：a meta-analysis.Yonsei Med J.44：401-13(2003)；Baum L，et al.Apolipoprotein E epsilon4 allele is associated with vasculardementia.Dement Geriatr Cogn Disord.22：301-5(2006))等。
如本文中使用的，“神经变性疾病”指阿尔茨海默氏病(Corder EH，et al.Gene dose of apolipoprotein E type 4 allele and the risk of Alzheimer′s disease inlate onset families.Science 261：921-3(1993)；Corder EH，et al.There is apathologic relationship between ApoE-epsilon 4and Alzheimer′s disease.ArchNeurol.52：650-1(1995))、帕金森氏病(Huang X，et al.Apolipoprotein E anddementia in Parkinson disease：a meta-analysis.Arch Neurol.63：189-93(2006)；Huang X et al.APOE-[epsilon]2allele associated with higher prevalence ofsporadic Parkinson disease.Neurology 62：2198-202(2004)；Martinez，M.et al.Apolipoprotein E4is probably responsible for the chromosome 19linkage peakfor Parkinson′s disease.Am.J.Med.Genet.B Neuropsychiatr.Genet.136B，172-174(2005))、亨廷顿氏病和多种不太常见的引起神经元减退的疾病和病症例如老年性黄斑变性(age-related mascular degeneration)(Thakkinstian A，etal.Association between apolipoprotein E polymorphisms and age-related maculardegeneration：A HuGE review and meta-analysis.Am J Epidemiol.164：813-22(2006)；Bojanowski CM，et al.An apolipoprotein E variant may protect againstage-related macular degeneration through cytokine regulation.Environ MolMutagen.47：594-602(2006))。
“神经学创伤或疾病”包括但不限于头部损伤后的后果(Zhou W，et al.Meta-analysis of APOE4 allele and outcome after traumatic brain injury.JNeurotrauma.25：279-90(2008)；Lo TY，et al.Modulating effect ofapolipoprotein E polymorphisms on secondary brain insult and outcome afterchildhood brain trauma.Childs Nerv Syst.25：47-54(2009))、偏头痛(Gupta R，etal.Polymorphism in apolipoprotein E among migraineurs and tension-typeheadache subjects.J Headache Pain.10：115-20(2009))、血管性水肿(James ML，et al.Apolipoprotein E modifies neurological outcome by affecting cerebraledema but not hematoma size after intracerebral hemorrhage in humans.J StrokeCerebrovasc Dis.18：144-9(2009)；James ML，et al.Pharmacogenomic effects ofapolipoprotein e on intracerebral hemorrhage.Stroke 40：632-9(2009))等。
如本文中使用的，“代谢疾病”包括但不限于血脂障碍(Willer CJ，et al.Newly identified loci that influence lipid concentrations and risk of coronaryartery disease.Nat Genet.40：161-9(2008)；Bennet AM，et al.，Association ofapolipoprotein E genotypes with lipid levels and coronary risk.JAMA298：1300-11(2007))、末期肾病(Oda H，et al.Apolipoprotein E polymorphismand renal disease.Kidney Int Suppl.71：S25-7(1999)；Hubacek JA，et al.Apolipoprotein E Polymorphism in Hemodialyzed Patients and Healthy对照s.Biochem Genet.(2009)Jun 30.[Epub ahead of print]DOI10.1007/s10528-009-9266-y.)、慢性肾病(Yoshida T，et al.Association of apolymorphism of the apolipoprotein E gene with chronic kidney disease inJapanese individuals with metabolic syndrome.Genomics 93：221-6(2009)；LeivaE，et al.Relationship between Apolipoprotein E polymorphism and nephropathyin type-2diabetic patients.Diabetes Res Clin Pract.78：196-201(2007))、胆囊病(Boland LL，et al.Apolipoprotein E genotype and gallbladder disease risk in alarge population-based cohort.Ann Epidemiol.16：763-9(2006)；Andreotti G，etal.Polymorphisms of genes in the lipid metabolism pathway and risk of biliarytract cancers and stones：a population-based case-对照study in Shanghai，China.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev.17：525-34(2008))、糖尿病(II型)(Elosua R，et al.Obesity Modulates the Association among APOE Genotype，Insulin，andGlucose in Men.Obes Res.11：1502-1508(2003)；Moreno JA，et al.TheApolipoprotein E Gene Promoter(-219G/T)Polymorphism Determines InsulinSensitivity in Response to Dietary Fat in Healthy Young Adults.J.Nutr.135：2535-2540(2005))、代谢综合征、胆石症(Abu Abeid S，et al.Apolipoprotein-E genotype and the risk of developing cholelithiasis followingbariatric surgery：a clue to prevention of routine prophylactic cholecystectomy.Obes Surg.12：354-7(2002))等。
如本文中使用的，“精神病症”指精神分裂症(Kampman O，et al.Apolipoprotein E polymorphism is associated with age of onset in schizophrenia.J Hum Genet.49：355-9(2004)；Dean B.et al.，Plasma apolipoprotein E isdecreased in schizophrenia spectrum and bipolar disorder.Psychiatry Res.158：75-78(2008))、强制性障碍(OCD)、成瘾性行为(吸烟成瘾、酒精成瘾等)、双相型障碍(Dean B.et al.，Plasma apolipoprotein E is decreased inschizophrenia spectrum and bipolar disorder.Psychiatry Res.158：75-78(2008))、和精神性质的其它疾病、病症、或疾患。
如本文中使用的，“疾患形成”指疾病、病症、或其它医学疾患的初始诊断，或受试者已诊断的现有疾病、病症、或医学疾患的加剧。
如本文中使用的，“诊断”或“预后”指基于与共享共同核苷酸序列、症状、征候、家族史或考虑患者健康状况有关的其它数据的多数个体的比较，使用信息(例如遗传信息或来自对生物学样品的其它分子测试的数据、征候和症状、身体检查发现、认知性能结果等)来预料最有可能的后果、时帧和/或对用于给定疾病、病症或疾患的特定处理的响应。
如本文中使用的，“生物学样品”指怀疑含有感兴趣核酸的材料。含有DNA的生物学样品包括毛发、皮肤、颊拭样和生物学流体诸如血液、血清、血浆、痰、淋巴液、精液、阴道粘液、粪便、尿液、脊髓液等等。自此类样品分离DNA是本领域技术人员熟知的。
依照一些实施方案的“受试者”指其基因型或单元型要与个体的状况(即疾病或病症状态)和/或对候选药物或治疗的响应联合来确定并记录的个体。使用来自多数受试者的核苷酸序列来构建系统发生树，并然后可以出于诊断或预后目的将来自受试者个体的同源核苷酸序列与系统发生树上的那些比较。
如本文中使用的，“基因”指含有用于RNA产物的受调节生物合成的所有信息的DNA区段，包括启动子、外显子、内含子和控制表达的其它非翻译区。
如本文中使用的，“遗传基因座”或“基因座”指染色体或DNA分子上的位置，常常对应于基因或身体或表型特征或特定核苷酸或核苷酸串。基因座的英文单数形式是locus，复数形式是loci。
如本文中应用于核酸的，“扩增”指任何导致核酸的一个或多个拷贝形成的方法，其中优选扩增是指数式的。一种用于酶促扩增特定DNA序列的此类方法称作聚合酶链式反应(PCR)，如记载于Saiki et al.，1986，Science230：1350-1354。PCR中使用的引物正常情况长度变化自约10个至50个或更多个核苷酸，而且通常选择为至少约15个核苷酸以确保足够的特异性。生成的双链片段叫作“扩增子”，而且长度变化可自少至约30个核苷酸至20,000个或更多个核苷酸。
如本文中使用的，“标志物”或“遗传标志物”指特定基因座处的已知DNA序列变异。变异可以由于突变或遗传而存在于个体中。遗传标志物可以是短DNA序列，诸如单个碱基对变化(单核苷酸多态性，SNP)周围的序列，或长DNA序列，像微卫星。标志物可用于研究遗传病与其遗传原因(例如导致缺陷或其它不想要形式蛋白质的特定基因突变)之间的相关性。
如本文中使用的，“遗传风险因子”指与对疾患、疾病、或病症的易感性升高有关的遗传标志物。它还指与对感兴趣的选定药物或治疗的特定响应有关的遗传标志物。
如本文中使用的，“与...有关的”指两项或更多项特征的一起发生比预期会偶然单独发生更常见。关联的一个例子涉及白血球表面上称作HLA(HLA代表人白细胞抗原)的一项特征。一种特定HLA类型，即HLA B-27型，与多种疾病包括强直性脊柱炎的风险升高有关。强直性脊柱炎在具有HLAB-27的人中比在一般群体中发生的可能性高至87倍。
由于遗传风险因子而“疾患发生风险的升高的”受试者指易患疾患、对疾患具有遗传易感性和/或比缺乏所述遗传风险因子的受试者更有可能形成疾患的受试者。例如，由于存在一个或两个ApoE 4等位基因而“阿尔茨海默氏病形成的风险升高的“受试者”比不携带ApoE 4等位基因的受试者更有可能形成阿尔茨海默氏病。
如本文中使用的，“多态性”指基因组DNA中的特定基因座处存在两种或更多种不同核苷酸序列。多态性可充当遗传标志物，而且还可称作遗传变体。多态性包括核苷酸替代、插入、删除和微卫星，而且可以但非必然导致基因表达或蛋白质功能的可检测差异。多态性位点指基因座内至少一名群体中的个体的核苷酸序列与参照序列不同的核苷酸位置。
如本文中使用的，“删除/插入多态性”或“DIP”指一种型式(version)的序列中相对于另一种插入一个或多个核苷酸。如果已知哪种等位基因代表次要等位基因，那么在次要等位基因是核苷酸删除时使用术语删除，而且在次要等位基因是核苷酸添加时使用术语“插入”。还在有多种形式或长度且次要等位基因不明显时使用术语“删除/插入多态性”。例如，对于本文中描述的poly-T多态性，观察到多种长度的多态性。
如本文中使用的，“多态性数据”指关于特定基因的下面一项或多项的信息：多态性位点的位置；那些位点处的序列变异；一个或多个群体中多态性的频率；对于基因确定的不同基因型和/或单元型；一个或多个群体中一种或多种这些基因型和/或单元型的频率；和性状与基因的基因型或单元型之间的任何已知关联。
如本文中使用的，“单元型”指个体中至少一条染色体上携带的遗传变体或变体组合。单元型常常包括多个毗邻多态性基因座。如本文中使用的，单元型的所有部分存在于染色体或单倍体DNA分子的同一拷贝上。如无没有相反证据，则假设单元型代表有可能在减数分裂期间一起遗传的多个基因座的组合。每个人携带任何给定遗传基因座的一对单元型，由在来自双亲的同源染色体上继承的序列组成。这些单元型可以是相同的，或者可以代表给定基因座的两种不同遗传变体。单元型定型指用于确定个体中的一种或多种单元型的过程。单元型定型可以包括使用家族系谱、分子技术和/或统计推断。
如本文中使用的，“变体”、“变异”、或“遗传变体”指群体中单元型的特定同等型，即基因的序列内在至少一个并通常超过一个的变异位点或核苷酸的序列与同一单元型的其他形式不同的特定形式。这些在基因的不同等位基因间不同的变异位点处的序列称作“基因序列变体”、“等位基因”、“变异”或“变体”。术语“可变形式”指通过在基因序列内具有至少一个并通常超过一个的变异位点，能与其它等位基因区分的等位基因。本领域已知的等同于“变异”或“变体”的其它术语包括突变和单核苷酸多态性(SNP)。提到存在变异意味着特定变异，即特定多态性位点处的特定核苷酸，而非仅仅是存在基因的任何变异。
如本文中使用的，“同等型”指基因、mRNA、cDNA或由其编码的蛋白质的特定形式，通过其特定序列和/或结构而与其它形式区分。例如，载脂蛋白E的ApoE 4同等型对ApoE 2或ApoE 3同等型。
如本文中使用的，“顺反子”指在单一染色体上发现的含有单一多肽的遗传密码且发挥遗传单元的功能的DNA区段。顺反子包括涉及单一功能单元(即基因)的外显子、内含子和调节元件。该术语衍生自经典的顺反测试，其用于确定遗传元件，是在无论它们是否位于同一DNA分子上时均能够在功能上相互作用(“反式”互补)或者是只在它们位于同一DNA分子上时能够在功能上相互作用(“顺式”作用元件)。
在本发明的语境中，术语“基因型”指基因的特定等位基因形式，其可以通过特定位点处的核酸序列中存在的特定核苷酸来定义。基因型也可以指一个或多个多态性基因座处存在的等位基因对。对于二倍体生物体，诸如人类，两个单元型构成基因型。基因型定型指用于确定个体的基因型的任何过程，例如通过核酸扩增、抗体结合或其它化学分析。所得基因型可以是未定相的(unphased)，意味着不知道找到的序列衍生自哪条亲本染色体。
如本文中使用的，“连锁不平衡”指两个或更多个基因座处的等位基因的非随机关联。连锁不平衡描述如下的情况，其中等位基因或遗传标志物的一些组合在群体中发生的频率比基于等位基因的频率预期会自等位基因随机形成单元型的频率更高或更低。不同基因座处的多态性间的非随机关联通过连锁不平衡的程度来测量。
如本文中使用的，“多重序列比对”或“MSA”指来自自多名个体衍生的基因组DNA的三条或更多条核苷酸序列的比对，以确定序列间的同源性和异源性。一般地，假设查询序列的输入集具有进化相关性，由此它们共享一个谱系且遗传自共同祖先。计算机算法最常用于实施对比对序列的分析。
参照例示方法的框图(例如图1)描述了本发明的一些实施方案，它们可以包括由计算机和/或计算机程序产品执行的步骤。会理解，框图和/或操作例示的每一个框，及框图和/或操作例示的框组合可以由模拟和/或数字硬件和/或计算机程序指令来执行。可以给通用计算机、专用计算机、ASIC和/或其它可编程数据处理装置的处理器提供这些计算机程序指令，使得经由计算机和/或其它可编程数据处理装置的处理器执行的指令创建用于执行框图和/或操作例示中规定的功能/作用的手段。因而，会领会，框图和操作例示支持装置、方法和计算机程序产品。
还可以包括其它软件，诸如操作系统。会进一步领会，多重序列比对模块、作图模块和/或本文中描述的其它模块的功能性可以(至少部分地)使用分立硬件组件、一个或多个特定用途集成电路(ASIC)和/或一个或多个特殊用途数字处理器和/或计算机来实现。
如本文中使用的，“作图”指创建系统发生树，即给观察到的每种新核苷酸序列变体指派节点，将该节点连接至代表由同一个体携带于同一染色体或顺反子上的已知序列的另一节点，并对每个节点处代表的每种类型的受试者数目计数。见图4，它是以这种方式建立的系统发生树的一个例子。
“系统发生”指涉及物种内各组生物体或个体间的进化联系的研究。在易于获得遗传信息之前，系统发生主要基于表型观察。如本文中使用的，“系统发生作图”指使用DNA序列数据来连接由多个个体携带的相关序列变体以确定进化联系和分歧的时间顺序(chronology)。“系统发生树”是对变体间联系作图的成果。
如本文中使用的，“节点”指系统发生树上代表由至少一名受试者携带的实际变异序列的多态性数据点。节点通过分支连接至另一节点，后者代表由同一个体携带于同一染色体上及同一顺反子中的但位于顺反子内不同遗传基因座处的变异序列。存在节点指示至少一名受试者携带由该节点指代的序列以及由通过分支与其连接的邻近节点代表的序列二者。
如本文中使用的，“分支”指代表两种不同变异序列或单元型的两个节点之间的连接，其中所述两种变体位于来自受试者个体的同一染色体上和同一顺反子中。“分支点”指延伸出超过两个分支的任何节点，但是它在本文中尤其用于指延伸出三个或更多个节点的根节点。“根节点”代表共同进化祖先的遗传序列，遗传分歧自其产生各种各样由连接的节点代表的附近序列变体。
如本文中使用的，“迭代”指反复计算一个系列中每个特征的值。例如，分析系统发生树上的每个节点以计算受感兴趣疾患(诸如阿尔茨海默氏病)影响的受试者数目与对照未受影响受试者之比；将该比与连接的节点比较以定位与感兴趣疾病、病症、或疾患形成风险升高或降低的关系。一个节点与下一个之间该比的实质性变化指示存在升高或降低较早疾病发作风险的变体。“迭代检查遗传变体”指分析开始于代表由最多数目受试者个体共享的序列的节点并连续分析自该节点延伸出的分支连接的节点，接着是第二水平的节点，依此类推。然后，分析总体上自树的根部向树的外部分支和节点移动。
如本文中使用的，“治疗”包括任何试图实现受试者健康的特定方面的变化(即致力于特定疾病、病症或疾患)的药物、方法、生活方式改变或引入的其它调整。
如本文中使用的，“药物”指给人施用来治疗或预防或控制疾病或疾患的化学实体或生物学产品，或化学实体或生物学产品的组合。如本文中使用的，术语“药物”与术语“药”、“药剂”、“治疗性干预”、或“药学产品”同义。最优选地，药物得到政府机构批准用于治疗至少一种特定疾病或疾患。
“疾病”、“病症”、和“疾患”是本领域普遍公认的，而且指个体或患者中存在一般公认为异常和/或不想要的征候和/或症状。疾病或疾患可以基于病理变化来诊断和归类。疾病或疾患可以为选自标准教科书诸如Harrison’sPrinciples of Internal Medicine，1997或Robbins Pathologic Basis of Disease，1998中列出的疾病类型。
如本文中使用的，“线粒体功能障碍”指细胞内线粒体的任何有害异常。本领域现在已知与线粒体功能障碍有关的一些疾病、病症、或疾患包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏病和其它神经变性疾病、中风和心脏病发作中的缺血-再灌注损伤、癫痫、糖尿病和衰老。本领域已经将许多其它疾病、病症和疾患与线粒体功能障碍关联起来。确实，线粒体对于大多数细胞类型的正常机能是至关重要的，而且线粒体减退常常导致细胞死亡。通过损害ATP生成、破坏钙稳态和提高氧化应激，这种线粒体功能障碍引起细胞损伤和死亡。此外，通过引起细胞色素c和其它促凋亡因子释放入细胞质，线粒体损伤可导致凋亡性细胞死亡(综述见Wallace，1999；Schapira，2006)。关于本文中发现的一个特定例子，假设ApoE 3和ApoE 4同等型经由与TOMM40的相互作用来引起线粒体功能障碍。一些TOMM40变体可以与ApoE 3同等型协同作用来加速线粒体减退。认为这种线粒体机制促成多种复杂遗传性疾病、病症和疾患。
如本文中使用的，“受试者”优选但不限于人类受试者。受试者可以是男性或女性，而且可以是任何人种或种族，包括但不限于白人(Caucasian)、非洲裔美国人(African-American)、非洲人、亚洲人、西班牙语裔(Hispanic)、印第安人等。受试者可以是任何年龄，包括新生儿、婴儿、幼儿、儿童、青少年、成人和老人。受试者还可以包括动物受试者，特别是哺乳动物受试者，诸如犬、猫、牛、山羊、马、绵羊、猪、啮齿类(例如大鼠和小鼠)、兔类、灵长类(包括非人灵长类)等，其经筛选用于兽医用药或药学药物开发目的。
如本文中使用的，“治疗”或“处理”指对罹患疾病的患者给予好处(包括患者的疾患(例如一种或多种症状)的改善、疾病的发作或进展的延迟等)的任何类型的措施。
如本文中使用的，“晚期发作阿尔茨海默氏病”或“LOAD”是本领域已知的，而且是阿尔茨海默氏病在65岁后发作或诊断的情况中使用的分类。它是阿尔茨海默氏病的最常见形式。
2.用于鉴定遗传变体的方法
虽然自基因组尺度扫描推导的关联表是有用的，但是它们一般不足以解释疾病复杂性。家族、途径和基因相互作用可提供特异性。高分辨率变异作图可揭示复杂遗传相互作用的答案。在自身不能完全解释与感兴趣疾病、病症、或疾患的关联的一种已知遗传风险因子可能呈现卓越候选遗传基因座用于更详细的调查的情况中，这是特别适用的。此外，药物遗传学在可用于药物开发的同时，还能延伸生物学关联性。分析来自大量个体的序列数据以发现群体中个体间基因序列变异会导致群体中所有变体的更大部分的检测。
要通过本发明的方法来分析的初始序列信息衍生自多个受试者的基因组DNA。生物体可以是其多种序列可得的任何生物体，但是优选来自人类。在鉴定新变异时，筛选基于人种、种族、性别和/或地理起源的不同群体组常常是有用的，因为特定变异的频率在此类组间可能不同。最优选地，对于认为是多基因的疾病或病症(遗传复杂疾病/病症)，由受试者群体呈现的表型来自型谱的极端。含有DNA的生物学样品可以是血液、精液、颊拭样等。自此类样品分离DNA是本领域公知的。
在一些实施方案中，本发明涉及分析来自具有给定疾病、病症或疾患(遗传的或其它的)的至少一种已知风险因子的多个受试者的核苷酸序列数据。分析核苷酸序列以生成单元型数据，并然后将单元型或遗传变体绘图到系统发生树上以展现所代表的序列的进化。通过将此树与关于多个受试者的表型数据比较，有可能为携带在系统发生树上观察到的单元型的受试者个体做出预后或诊断。
在其它实施方案中，本发明涉及药物遗传学和药物基因组学领域及遗传单元型信息用于预测个体对疾病的易感性和/或他们对一种或多种特定药物的响应的用途，从而可以开发适应群体组的遗传差异的药物和/或将其施用于具有适宜遗传谱的个体。
核苷酸序列信息衍生自基因组DNA。使用的基因组序列数据可以得自临床或非人动物或得自培养的细胞或分离的组织研究。生物体可以是其多种序列可得的任何生物体，但是优选来自人类。在鉴定新变异时，筛选基于人种、种族、性别和/或地理起源的不同群体组常常是有用的，因为特定变异的频率在此类组间可能不同。最优选地，对于认为是多基因的疾病或病症(遗传复杂疾病/病症)，由受试者群体呈现的表型是极端对立项。
含有DNA的生物学样品可以是血液、精液、颊拭样等。自此类样品分离DNA是本领域公知的。用于确定特定感兴趣遗传基因座处的DNA序列的方法也是本领域已知的。自动化测序现在是广泛可得的，而且只需要分离的DNA样品和至少一种特异性设计成识别感兴趣遗传基因座内或附近高度保守序列的引物。
依照一些实施方案，自包括对特定病症完善表征的患者的人群组，仔细测序出感兴趣的限定遗传区或基因座(例如由一套正向和反向PCR引物限定的)。
确定共有序列，并且将给定基因座的所有观察到的序列变体汇编成表。具有最大数目观察到的变体的基因座代表来自共同祖先的进化分歧。因此，这些基因座是顺式连接于只具有一个或很少观察到的变体的基因座的。至少在调查的初始阶段期间，优选配对成受试者组的群体共享代表相似祖先的共同一般表型。否则，经由构建系统发生树来分析这些数据会需要极大数目的受试者。
3.多重序列比对
确定群体中基因或基因区中特定变异或多处变异的存在可以以多种方式来实施，它们都涉及通过靶向感兴趣区域内已知高度保守的序列来定位特定遗传基因座。根据高度保守的基因座，经由本领域公知的多种技术之一易于获得毗邻序列。
分析来自多个受试者的平行DNA序列中的第一步是多重序列比对(“MSA”)。MSA通常用于展示来自在基因或基于区内具有多态性差异的同源样品的序列比对以显示保守区域和变异序列。可以使用各种已知技术之一或更多和公众可得软件来构建在感兴趣基因座处获得的序列信息的MSA，而且它们是公众自许多来源(包括因特网)可得的。本领域已知的用于分析多重序列比对的方法包括例如美国专利6,128,587，Sjolander；美国专利6,291,182，Schork et al.；及美国专利6,401,043，Stanton et al.中记载的那些。
4.系统发生树和分析
各种用于构建“系统发生树”的方法是本领域已知的(见例如Sanderson，2008)。Sun等人使用“单元型区段”分析来研究toll样受体(TLR)变体与前列腺癌之间的关联(2005)，而Bardel等人(2005)使用进化枝分析办法来调查CARD15基因变体与克罗恩氏病之间的关联。然而，均未利用先前与疾病关联起来的遗传基因座来调查连锁。
依照一些实施方案的系统发生树可以用拓扑来构建，其中在所研究人类受试者个体中观察到的单元型序列变体形成树上的节点(代表在数据中观察到的每一种序列)。节点可连接其它节点，而且在树的分支位点、共同根或根节点处找到共同祖先。系统发生树反映所分析数据的遗传基因座间的进化相关性(见Sanderson，2008；Tzeng，2005；Seltman，2003)。图4显示为图3所示遗传基因座的B区构建的详细系统发生树。
系统发生树评估的起点一般是MSA(见上文)。可使用多种软件基于序列数据来构建系统发生树。见例如美国专利7,127,466和美国专利6,532,467，Brocklebank，et al.。基本前提在于展现许多变体的遗传基因座由顺式连接的这些变体呈现。多态性在树中创建分支点(节点)，其限定相关序列或单元型的组。
利用系统发生树来获得信息，即迭代检查受疾患影响的受试者与未受影响对照受试者之比；计算开始于在最大数目受试者中观察到的节点并向树的外围移动至在较少受试者中观察到的节点。目的是定位受感兴趣疾患影响的受试者与未受影响对照受试者之比有实质性变化的分支点、分支、或节点。此类分支点代表较高风险受试者相对于较低风险受试者的进化分歧，反之亦然。
对生成的系统发生树的统计分析可以依照本领域已知方法来实施。一种本领域公认的方法是计算自展置信水平(见Efron et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，13429-13434(1996))。
5.患者评估
一旦为特定遗传基因座生成系统发生树，就可以评估受试者个体，即将他们的DNA序列与构成系统发生树的序列比较。存在与代表具有更高感兴趣疾患发病率的受试者(即受疾病或病症影响的受试者与未受影响的对照受试者之比更高)的树区域对应的单元型或序列变体会意味着该受试者个体也具有升高的风险。相反，实质更低的比对应于感兴趣疾患形成的风险较低。
也可以依照一些实施方案基于感兴趣疾患对感兴趣的活性剂治疗或治疗方法的响应性来分析系统发生树。
6.APOE和TOMM40
ApoE表型和基因型是本领域公知的。为ApoE建立的命名系统以及其表型和基因型记载于例如Zannis et al.，1982，通过本文中的述及而收录。
TOMM40(线粒体外膜通道亚基，40kDa)表型和基因型也是已知的。TOMM40作为见于线粒体膜中的转位酶的通道形成亚基的发挥其功能，其对于将蛋白质输入线粒体是必需的。
来自阿尔茨海默氏病患者研究的基因组尺度关联扫描数据毫无疑义地鉴定出含有载脂蛋白E(ApoE)基因的连锁不平衡区域。自1993年的最初出版物(见例如Corder et al.)起，ApoE 4变体作为经过证实的易感性基因已经得到广泛复制。然而，基因组尺度关联扫描数据导致在细胞生物学研究中观察到引人注目的“巧合”，涉及ApoE和TOMM40共定位至线粒体外膜。在1998年对ApoE周围的连锁不平衡建模的研究期间首次遭遇这种其它基因，TOMM40。多态性定位于ApoE邻近的连锁不平衡小区域内。
ApoE共定位至线粒体外膜，提示同等型特异性相互作用导致ApoE诱导的线粒体凋亡作为阿尔茨海默氏病表达中早期步骤的潜在作用。生物学数据已经证明神经元细胞培养物中活动线粒体的比例以及它们移动的速度及它们穿过的距离是影响线粒体凋亡升高的因素。系统发生数据提示TOMM40对阿尔茨海默氏病形成的独立遗传效应。
ApoE特异性结合人类神经元培养物中的线粒体(Chang，2005)，而且对数以百计的阿尔茨海默氏病患者和匹配对照中这个连锁不平衡区域的测序，与TOMM40遗传变体进化的作图组合，为ApoE-TOMM40相互作用限定了一个特别感兴趣的区域，如图3所示。这些进化数据进一步支持ApoE与TOMM40之间的遗传关联，而且提示线粒体功能障碍可能导致多年里缓慢发生的神经元死亡。阿尔茨海默氏病的发作年龄分布(见例如美国专利6,027,896，Roses etal.)可能反映两种生物化学相互作用蛋白质导致疾病临床表达的紧密连锁变体的继承。
如本文中详述的，TOMM40变体的多种单元型与ApoE等位基因之间的相互作用促成阿尔茨海默氏病发病机制；特别地，与ApoE的E 3等位基因连锁的TOMM40单元型促成疾病发病机制。数种TOMM40基因变体仅与ApoE 3顺式连锁地进化。(类似地，特定TOMM40变体可能与ApoE 4或ApoE 2顺式连锁地进化。)如此，TOMM40变体添加的任何遗传效应与ApoE 4独立地分离，但是两种变异蛋白质产物可以在功能上反式相互作用，以生成给定的可见的表型或性状。如此，TOMM40变体添加的任何遗传效应与ApoE 4独立地分离。邻近相互作用基因的这种“巧合”可解释在所有阿尔茨海默氏病基因组尺度关联扫描研究中找到的特别显著的统计关联数据。有趣的是注意到最初的商品化基因组尺度关联扫描平台不含有任何ApoE多态性，但是用TOMM40和ApoC1 SNP标示-但是该区域事实上始终称作“ApoE区”。
还可以在药物遗传学背景内审视组合了疾病遗传与发病机制的推定分子机制的这些数据。由于继承ApoE 4等位基因的强遗传效应，ApoE 4被称作复杂易感性基因已经超过十年。发作年龄分布作为ApoE基因型的函数的一致再现证实了ApoE 3继承的作用不完全是良性的，而是在较低疾病发作率观察到的较低风险因子。有TOMM40遗传变体只定位在连锁不平衡区域中含有ApoE 3的DNA链上(Roses et al.，未发表的数据)，且因此没有处于基因组尺度关联组中的SNP所要求的Hardy-Weinberg平衡。TOMM40序列中只与ApoE 3顺式连锁的进化变化起提高与ApoE 3有关的阿尔茨海默氏病风险的作用，而与ApoE 3顺式连锁的其它TOMM40变体降低与ApoE 3有关的风险。一种独立遗传测试会是确定那些与较少阿尔茨海默氏病有关的TOMM40多态性是否在含有ApoE 3的基因型[ApoE 3/3或ApoE 4/3]的发作年龄分布图中在较大的年龄隔离。
检测受试者中ApoE 2、3或4和/或TOMM40单元型或编码它们的DNA(在一些实施方案中，包括每一项的等位基因数目)的存在或缺失可以通过任何合适手段直接或间接进行。本领域技术人员知道多种技术。一般都涉及自受试者收集含有DNA或蛋白质的生物学材料的样品，并然后检测受试者是否具有感兴趣单元型的步骤。例如，关于ApoE的检测步骤可如下进行，即自受试者(例如自脑脊液或含有ApoE的任何其它流体或组织)收集ApoE样品，并然后确定ApoE样品中ApoE 2、3、或4同等型的存在或缺失(例如通过等电聚焦或免疫测定法)。
确定编码ApoE和/或TOMM40同等型的DNA的存在或缺失可以通过用经合适可检测基团标记的寡核苷酸探针对感兴趣基因组DNA区域直接测序来进行，和/或通过扩增反应的手段来进行，诸如聚合酶链式反应或连接酶链式反应(然后可以用经标记的寡核苷酸探针或多种其它技术来检测该扩增反应的产物)。另外，检测步骤可以包括检测受试者对于编码ApoE和/或TOMM40单元型的基因是杂合还是纯合的步骤。知道可用来进行本发明的多种不同寡核苷酸探针测定形式。见例如美国专利No.4,302,204，Wahl et al.；美国专利No.4,358,535，Falkow et al.；美国专利No.4,563,419，Ranki et al.；及美国专利No.4,994,373，Stavrianopoulos et al.(申请人明确意图通过述及将本文中引用的所有美国专利参考文献的公开内容收入本文)。
在一些实施方案中，检测可以包括多重DNA扩增(例如等位基因特异性荧光PCR)。在一些实施方案中，检测可以包括与微阵列(芯片、珠等)杂交。在一些实施方案中，检测可以包括对含有试图检测的单元型的基因的适宜部分测序。在一些实施方案中，改变对一种或多种内切核酸酶限制酶消化的易感性的单元型可用于检测。例如，可使用限制性片段长度多态性(RFLP)，其指在将各种限制酶施于DNA时的消化样式。在一些实施方案中，一种或多种单元型的存在可通过等位基因特异性扩增来确定。在一些实施方案中，单元型的存在可通过引物延伸来确定。在一些实施方案中，单元型的存在可通过寡核苷酸连接来确定。在一些实施方案中，单元型的存在可通过与可检测标记的探针的杂交来确定。见例如美国专利申请公开号2008/0153088，Sun etal.；Kobler et al.，Identification of an 11T allele in the polypyrimidine tract ofintron 8of the CFTR gene，Genetics in Medicine 8(2)：125-8(2006)；Costa et al.，Multiplex Allele-Specific Fluorescent PCR for Haplotyping the IVS8(TG)m(T)nLocus in the CFTR Gene，Clin.Chem.，54：1564-1567(2008)；Johnson et al.，AComparative Study of Five Technologically Diverse CFTR Testing Platforms，J.Mol.Diagnostics，9(3)(2007)；Pratt et al.，Development of Genomic ReferenceMaterials for Cystic Fibrosis Genetic Testing，J.Mol.Diagnostics，11：186-193(2009)。
可以通过任何合适手段对自生物学样品分离的DNA进行选定核酸序列或靶核酸序列的扩增。一般见D.Kwoh and T.Kwoh，1990。合适扩增技术的例子包括但不限于聚合酶链式反应、连接酶链式反应、链置换扩增(一般见Walker et al.，1992a；Walker et al.，1992b)、基于转录的扩增(见Kwoh et al.，1989)、自主序列复制(“3SR”)(见Guatelli et al.，1990)、Qβ复制酶系统(见Lizardi et al.，1988)、基于核酸序列的扩增(“NASBA”)(见Lewis，1992)、修复链反应(repair chain reaction，“RCR”)(见Lewis，见上)、及飞反DNA扩增(boomerang DNA amplification，“BDA”)(see Lewis，supra)。聚合酶链式反应是当前优选的。
诸如前述的DNA扩增技术可涉及使用一种探针、一对探针、或两对探针，这些探针特异性结合编码ApoE 4的DNA，但是在相同杂交条件下不结合编码ApoE 2或ApoE 3的DNA，而且充当用于在扩增反应中扩增ApoE 4DNA或其部分的引物。同样地，可以使用一种探针、一对探针、或两对探针，这些探针特异性结合编码ApoE 2的DNA，但是在相同杂交条件下不结合编码ApoE3或ApoE 4的DNA，而且充当用于在扩增反应中扩增ApoE 2DNA或其部分的引物；而且可以使用一种探针、一对探针、或两对探针，这些探针特异性结合编码ApoE 3的DNA，但是在相同杂交条件下不结合编码ApoE 2或ApoE 4的DNA，而且充当用于在扩增反应中扩增ApoE 3DNA或其部分的引物。
类似地，可以使用一种探针、一对探针、或两对探针，这些探针特异性结合编码感兴趣的TOMM40单元型的DNA，但是在相同杂交条件下不结合其它TOMM40单元型，而且充当用于在扩增反应中扩增TOMM40DNA或其部分的引物。
一般地，用于检测编码ApoE和/或TOMM40单元型的DNA的寡核苷酸探针是结合编码感兴趣的单元型的DNA，但是在相同杂交条件下不结合编码其它单元型的DNA的寡核苷酸探针。用合适的可检测基团标记寡核苷酸探针，诸如下文关于抗体列出的那些。
可以依照已知技术进行聚合酶链式反应(PCR)。见例如美国专利No.4,683,195；4,683,202；4,800,159；和4,965,188。一般地，PCR涉及首先在杂交条件下用针对要检测的特定序列的每一条链的一种寡核苷酸引物处理核酸样品(例如在热稳定的DNA聚合酶存在下)，从而合成每种引物的延伸产物，其与每一条核酸链互补，其中引物与其要杂交的特定序列的每一条链足够互补，使得当与其互补物分开时，自每种引物合成的延伸产物能充当模板来合成其它引物的延伸产物，并然后在变性条件下处理样品以将引物延伸产物与其模板分开，如果要检测的序列存在的话。循环重复这些步骤，直至获得期望程度的扩增。扩增序列的检测可以如下进行，向反应产物添加能够与反应产物杂交的寡核苷酸探针(例如本发明的寡核苷酸探针)，该探针携带可检测标记物，并然后依照已知技术或通过直接在凝胶上显现来检测标记物。
当PCR条件容许扩增所有ApoE等位基因类型时，可以通过与等位基因特异性探针的杂交、通过限制性内切核酸酶消化、通过变性梯度凝胶上的电泳、或其它技术来区分各类型。用于确定ApoE基因型的一种PCR方案记载于Wenham et al.(1991)，通过本文中的述及而收录。其中记载了有效扩增及鉴定ApoE同等型的引物的例子。可以采用对ApoE多态性区域具(无论ApoE4、E3或E2)特异性的引物。在Wenham中，例如，采用扩增跨越ApoE多态性位点(密码子112和158，其含有核苷酸3745和3883)的227bp DNA区域的PCR引物。然后使扩增的片段接受限制性内切核酸酶CfoI作用，其自六种可能的ApoE基因型提供不同限制性片段，可以在电泳凝胶上识别。别的方法还可见Hixon et al.(1990)；Houlston et al.(1989)；Wenham et al.(1991)；及Konrulaet al.(1990)，这些均通过本文中的述及而收录。
在阿尔茨海默氏病之外，有数种其它遗传上复杂的疾病和病症，对于它们，本发明的方法提供胜过现有分析的优点。例如，来自多项2型糖尿病遗传研究的数据支持为通过基因组尺度关联研究来限定基因座提供统计显著性会需要很多临床病例/对照系列的观点。
7.活性剂、组合物和治疗
如上所述，也可基于感兴趣疾患对依照一些实施方案的感兴趣活性剂治疗或治疗方法的响应性来分析使用本文中详述的方法创建的系统发生树，而且为受试者或患者做出的治疗决策可以基于所鉴定的特定遗传变体。
活性剂。活性剂包括已知用于治疗感兴趣疾患的那些，而且包括抗阿尔茨海默氏病活性剂，包括但不限于乙酰胆碱酯酶抑制剂、NMDA受体拮抗剂、和过氧化物酶体增殖子活化的受体(PPAR)激动剂或调控剂，包括但不限于噻唑烷二酮或glitazar类中的那些药物。活性剂还可以是生物药学产品，例如抗体(例如单克隆抗体、多克隆抗体、抗体衍生物或经修饰抗体诸如DomainAntibodiesTM、Bapineuzumab、等)、融合蛋白或治疗性RNA分子。活性剂还可以是任何这些产品的组合。
乙酰胆碱酯酶抑制剂的例子包括但不限于多奈哌齐(donepezil)(可作为ARICEPT购买)、加兰他敏(galantamine)(可作为RAZADYNE购买)、和利凡斯的明(rivastigmine)(可作为EXELON购买)及其药学可接受盐。别的例子包括但不限于美国专利No.6,303,633；5,965,569；5,595,883；5,574,046；和5,171,750中记载的那些(通过本文中的述及完整收录本文中引用的所有美国专利参考文献的公开内容)。
NMDA受体拮抗剂的例子包括但不限于美金刚(memantine)(可作为AKATINOL、AXURA、EBIXIA/ABIXIA、MEMOX和NAMENDA购买)及其药学可接受盐。别的例子包括但不限于美国专利No.6,956,055；6,828,462；6,642,267；6,432,985；和5,990126中记载的那些。
噻唑烷二酮的例子包括但不限于罗格列酮(rosiglitazone)(可作为AVANDIA购买)及其药学可接受盐。别的例子包括但不限于：5-(4-[2-(N-甲基-N-(2-苯并噻唑基)氨基)乙氧基]苄基)-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-(2-苯并噻唑基)氨基)乙氧基]苯亚甲基)-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-(2-苯并唑基)氨基)乙氧基]苄基)-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-(2-苯并唑基)氨基)乙氧基]苯亚甲基)-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-(2-嘧啶基)氨基)乙氧基]苄基)-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-(2-嘧啶基)氨基)乙氧基]苯亚甲基)-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-(2-(N-甲基-N-[2-(4，5-二甲基噻唑基)]氨基)乙氧基]苄基)-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-[2-(4，5-二甲基噻唑基)]氨基)乙氧基]苯亚甲基)-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-(2-噻唑基)氨基)乙氧基]苄基)-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-(2-噻唑基)氨基)乙氧基]苯亚甲基)-2，4-噻唑烷二酮；5-[4-(2-(N-甲基-N-(2-(4-苯基噻唑基))氨基)乙氧基)苄基]-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-(2-(4-苯基噻唑基))氨基)乙氧基]苯亚甲基)-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-[2-(4-苯基-5-甲基噻唑基)]氨基)乙氧基]苄基)-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-[2-(4-苯基-5-甲基噻唑基)]氨基)乙氧基]苯亚甲基)-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-[2-(4-甲基-5-苯基噻唑基)]氨基)乙氧基]苄基)-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-[2-(4-甲基-5-苯基噻唑基)]氨基)乙氧基]苯亚甲基)-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-[2-(4-甲基噻唑基)]氨基)乙氧基]苄基)-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-[2-(4-甲基噻唑基)]氨基)乙氧基]苯亚甲基)-2，4-噻唑烷二酮；5-[4-(2-(N-甲基-N-[2-(5-苯基唑基)]氨基)乙氧基)苄基]-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-[2-(5-苯基唑基)]氨基)乙氧基]苯亚甲基)-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-[2-(4，5-二甲基唑基)]氨基)乙氧基]苄基)-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-[2-(4，5-二甲基唑基)]氨基)乙氧基]苯亚甲基)-2，4-噻唑烷二酮；5-[4-(2-(2-嘧啶基氨基)乙氧基)苄基]-2，4-噻唑烷二酮；5-[4-(2-(2-嘧啶基氨基)乙氧基)苯亚甲基]-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-乙酰基-N-(2-嘧啶基)氨基)乙氧基]苄基)-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-(2-(N-(2-苯并噻唑基)-N-苄基氨基)乙氧基)苯亚甲基)-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-(2-(N-(2-苯并噻唑基)-N-苄基氨基)乙氧基)苄基)-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[3-(N-甲基-N-(2-苯并唑基)氨基)丙氧基]苄基)-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[3-(N-甲基-N-(2-苯并唑基)氨基)丙氧基]苯亚甲基)-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-(2-吡啶基)氨基)乙氧基]苄基)-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-(2-吡啶基)氨基)乙氧基]苯亚甲基)-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[4-(N-甲基-N-(2-苯并唑基)氨基)丁氧基]苯亚甲基)-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[4-(N-甲基-N-(2-苯并唑基)氨基)丁氧基]苄基)-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-(2-苯并唑基)氨基)乙氧基]苯亚甲基)2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-(2-苯并唑基)氨基)乙氧基]苄基)-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-异丙基-N-(2-苯并唑基)氨基)乙氧基]苄基)-2，4-噻唑烷二酮，及其药学可接受盐。见例如美国专利No.5,002953。
如上所述，可以以其药学可接受盐的形式来制备本文中公开的活性剂。药学可接受盐指保持亲本化合物的期望生物学活性且不产生不想要的毒理学效果的盐。此类盐的例子有(a)与无机酸形成的酸加成盐，无机酸例如氢氯酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等等；和与有机酸形成的盐，有机酸诸如例如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、葡糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、鞣酸、棕榈酸、海藻酸、多聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、萘二磺酸、多聚半乳糖醛酸、等等；(b)自元素阴离子形成的盐，元素诸如氯、溴、和碘；及(c)自碱衍生的盐，诸如铵盐、碱金属盐诸如钠和钾盐、碱土金属盐诸如钙和镁盐、及与有机碱的盐，有机碱诸如二环己胺和N-甲基-D-葡萄糖胺。
可以作为前药来施用活性剂。如本文中使用的，“前药”指本发明化合物的如下前药，其在合理医学判断的范围内，适合于接触人类和较人低等的动物的组织使用而没有不当的毒性、刺激、过敏反应等等，与合理的风险/利益比相称，且有效实现它们的预定用途，以及在可能的情况中本发明化合物的两性形式。术语“前药”指如下的化合物，其在体内，例如通过血液中的水解迅速转化以生成上式的亲本化合物。详尽的讨论见T.Higuchi and V.Stella，Prodrugs as Novel delivery Systems，Vol.14，the A.C.S.SymposiumSeries及Edward B.Roche，ed.，Bioreversible Carriers in Drug Design，AmericanPharmaceutical Association and Pergamon Press，1987，通过本文中的述及收录二者。还可见美国专利No.6,680,299。例子包括如下的前药，其在体内被受试者代谢成具有本文中描述的活性化合物的活性的活性药物，其中所述前药是醇或羧酸基团的酯，如果化合物中存在此类基团的话；醇基团的缩醛或缩酮，如果化合物中存在此类基团的话；胺基团的N-Mannich碱或亚胺，如果化合物中存在此类基团的话；或羧基的Schiff碱、肟、乙缩醛、烯醇酯、唑烷或噻唑烷，如果化合物中存在此类基团的话，诸如美国专利No.6,680,324和美国专利No.6,680,322中记载的。
组合物。为了施用，可以依照已知技术在药学载体中配制上文所述活性剂。见例如Remington，The Science And Practice of Pharmacy(9th Ed.1995)。在依照本发明的药物配制剂的制造中，通常将活性化合物(包括其药学可接受盐)与可接受载体等混合。当然，载体必须是就与配制剂中的任何其它组分相容而言可接受的，而且不能是对患者有害的。载体可以是固体或液体或二者兼有，而且优选与化合物一起配制成单位剂量配制剂，例如片剂，其可以含有0.01或0.5％至95％或99％(以重量计)的活性化合物。可以在本发明的配制剂中掺入一种或多种活性化合物，配制剂可以通过药学的任何公知技术来制备，包括将各成分(任选包括一种或多种助剂)混合。
本发明的配制剂包括那些适合于口服、直肠、表面、口腔(例如舌下)、阴道、胃肠外(例如皮下、肌肉内、皮内、或静脉内)、表面(即皮肤和粘膜表面，包括气道表面)和经皮施用，尽管任何给定情况中最合适的路径会取决于所治疗疾患的性质和严重性及所使用特定活性化合物的性质。
适合于口服施用的配制剂可以呈现为分立的单元，诸如胶囊剂、扁囊剂、锭剂、或片剂，每个含有预定量的活性化合物；为粉剂或颗粒剂；为水或非水液体中的溶液或悬浮液；或为水包油或油包水乳剂。此类配制剂可以通过药剂学的任何合适方法来制备，其包括使得活性化合物与合适载体(其可以含有一种或多种上文所述助剂)相关联的步骤。一般地，如下制备本发明的配制剂，即将活性化合物与液体或粉碎的(finely divided)固体载体或二者兼有均匀且密切混合，并然后在必要时对所得混合物定型。例如，可以通过对含有活性化合物及任选的一种或多种助剂的粉末或颗粒压制或铸模来制备片剂。可以通过在合适的机器中对自由流动形式的化合物(诸如粉末或颗粒，任选与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂和/或表面活性/分散剂混合)压制来制备压制片剂。可以通过在合适的机器中对用惰性液体粘合剂润湿的粉化化合物铸模来制备模制片剂
适合于口腔(舌下)施用的配制剂包括在有香味的基材(通常是蔗糖和阿拉伯树胶或黄芪树胶)中包含活性化合物的锭剂；和在惰性基材诸如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯树胶中包含化合物的软锭剂。
适合于胃肠外施用的本发明配制剂包括活性化合物的无菌的水和非水注射溶液，该制剂优选与预定接受者的血液等张。这些制剂可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使得配制剂与预定接受者的血液等张的溶质。水和非水无菌悬浮液可以包括悬浮剂和增稠剂。配制剂可以在单剂或多剂容器中呈现，例如密封的安瓿和管形瓶，而且可以在冷冻-干燥(冻干)条件中保存，只需要在临使用前添加无菌液体载体，例如盐水或注射用水。可以自先前描述种类的无菌粉剂、颗粒剂和片剂制备临场配制的注射溶液和悬浮液。例如，在本发明的一个方面，在密封容器中以单位剂量形式提供了包含活性剂或其盐的可注射的、稳定的、无菌的组合物。以冻干物的形式提供化合物或盐，其能够用合适的药学可接受载体重建以形成适合于注射入受试者的液体组合物。单位剂量形式通常包含约10mg至约10g化合物或盐。当化合物或盐基本上不溶于水时，可以以足够数量采用足够量的生理学可接受的乳化剂以在水载体中乳化化合物或盐。一种此类有用乳化剂是磷脂酰胆碱。
适合于表面应用于皮肤的配制剂优选采取软膏剂、乳膏剂、洗剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油的形式。可使用的载体包括石油凝胶、羊毛脂、聚乙二醇、醇、经皮强化剂及其两种或更多种的组合。
适合于经皮施用的配制剂可以呈现为分立的贴剂，适应保持与接受者的表皮密切接触较长一段时间。适合于经皮施用的配制剂也可以通过离子电渗来投递(见例如Pharmaceutical Research 3(6)：318(1986))，而且通常采取活性化合物的任选缓冲的水溶液的形式。合适配制剂包含柠檬酸盐或bis\tris缓冲液(pH 6)或乙醇/水且含有0.1至0.2M活性组分。
在活性剂之外，药物组合物可以含有其它添加剂，诸如调节pH的添加剂。具体而言，有用的pH调节剂包括酸(诸如氢氯酸)、碱或缓冲剂(诸如乳酸钠、乙酸钠、磷酸钠、柠檬酸钠、硼酸钠或葡糖酸钠)。另外，组合物可以含有微生物防腐剂。有用的微生物防腐剂包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯和苯甲醇。在将配制剂放置在为多剂使用设计的管形瓶中时，通常采用微生物防腐剂。当然，如指出的，可以使用本领域公知的技术将本发明的药物组合物冻干。
剂量。其使用在本发明的范围中的任何特定活性剂的治疗有效剂量会随化合物的不同及患者的不同而有所变化，而且会取决于患者的状况及投递的路径。对于口服施用，可使用1、2或3mg至30、40或50mg的总日剂量，作为每日单剂给予或分成分成每日两或三剂。
治疗。本文中描述的或使用本文中教导的方法发现的遗传变体可用于确定受疾患(例如与ApoE和/或TOMM40有关的疾患)影响的患者的治疗过程，通过例如基于一种或多种遗传变体的存在或缺失来确定施用哪种活性剂和/或治疗过程。遗传变体的存在或缺失可指示活性剂和/或治疗过程对患者的功效，预测疾患发作年龄，指示优选的剂量方案，等。可以为患者生成遗传谱，而且参考该谱来确定该患者是否在有可能对特定活性剂有响应的患者组中。
关于使用的用法说明可以与活性剂一起包装或以其它方式与活性剂关联，指明基于遗传变体的存在或缺失关于治疗、治疗时机、剂量方案等的推荐。
8.确定疾病风险预测或预后的方法
为了依照本发明的一些实施方案确定无症状个体的疾病风险预测或预后(根据疾病的通常过程或病例的特性预料痛苦或疾病过程的前景)，可以加工诊断数据包括患者的诊断或医学史和遗传数据诸如患者的基因型(例如ApoE和/或TOMM40基因型)以提供治疗选项和后果预测。加工可以包括获得“患者谱”，诸如患者的医学史的集合，包括年龄和性别、感兴趣基因座的基因型定型(例如使用适当设计的引物及使用RT-PCR或PCR扩增步骤)和/或表型定型(例如使用抗体介导的方法或酶测试)、及将此原始数据转换成预后的统计分析或其它分析。预后可以包括预测患者疾病发作年龄、对药物疗法的响应、治疗的时机、治疗功效等。在一些实施方案中，预后可以包括使用计算机软件程序来分析患者数据并针对关系数据库运行统计交叉核对以将患者数据或谱转换成预后。
“患者谱”包括关于正在实施预测和/或预后分析的患者的数据和/或材料。数据可以包括关于患者的诊断、年龄、性别和/或基因型的信息。患者谱还可以包括来自患者的材料，诸如血液、血清蛋白质样品、脑脊液或纯化的RNA或DNA。
9.临床试验中的基因型分层
在进行临床试验时可以使用本文中教导的或用本文中的方法确定的基因型的检测，其方式就像使用其它基因型信息来进行临床试验，诸如例如美国专利No.6,573,049、6,368,797和6,291,175中记载的。
在一些实施方案中，此类方法有利地将患者群体分层或容许患者群体细化(例如通过将群体分成一个或多个亚组)，使得能更加准确地检测特定治疗方案的优点，特别是对于具有特定基因型的特定患者亚群。在一些实施方案中，此类方法包括给多个受试者施用测试活性剂或疗法(通常给分开的但相似表征的多个受试者施用对照或安慰剂疗法)并在多个受试者中如上所述检测基因型(例如ApoE和/或TOMM40)的存在或缺失。可以在施用测试疗法的步骤之前、之后或同时检测基因型。然后可以根据任何合适参数或潜在治疗结果或后果(包括但不限于所述疗法的功效、疗法的副作用的缺失等)来确定一种或多种检测到的等位基因对测试疗法的影响。
对于诊断有疾病或有疾病形成风险的受试者，可以建立临床试验来测试测试化合物治疗任何数目已经确定与特定基因型有关的疾病的功效。如果在临床试验完成后对受试者进行基因型定型，那么该分析仍可致力于确定对疾病的治疗与要评估功效的等位基因之间的相关性。或者，如果有症状的或无症状的受试者尚未诊断出疾病但已经确定有疾病形成风险，那么可以进行与上文所述临床试验相似的临床试验。
在设计治疗组时也可以考虑根本的生物学机制。例如，ApoE 4(1-272)片段比ApoE 3(1-272)更多地结合线粒体，降低线粒体细胞动力学及降低突触发生。罗格列酮，一种用于治疗阿尔茨海默氏病的药物候选，提高有丝分裂及提高突触发生-对抗ApoE片段结合的效果-影响ApoE 3的程度比ApoE 4高。因此，可以基于根本的作用机制来选择药物或治疗候选(例如罗格列酮)，因为它涉及用于分层的遗传标志物(例如ApoE 2、E 3、E 4和/或TOMM40变体)。
为试验选择的药物的功效评估可以包括监测受试者一段时间并分析疾病发作的延迟和发作时疾病的强度，以及测量与疾病有关的症状的发作。在临床试验中消除或延迟疾病发作或减轻疾病症状的的药物可能是在诊断有疾病或有疾病形成风险的患者中使用的有益药物。在此类试验中可以使用的测试化合物包括上文所述药剂，包括先前批准用于临床使用的药剂和尚未批准使用或未批准用于治疗特定疾病的的新化合物。如此，在一些实施方案中，临床试验可以包括优化药物施用，包括剂量、施用的时机、毒性或副作用、施用的路径和治疗的功效。
10.可用于检测感兴趣基因座处的基因型变体的试剂盒
本文中提供了用于确定受试者是否处于疾病形成风险升高、在较早的发作年龄形成疾病和/或为特定治疗的候选者的试剂盒，其中所述疾病与ApoE和/或TOMM40有关(例如晚期发作阿尔茨海默氏病)。试剂盒包括至少一种对于检测本文所述ApoE和/或TOMM40变体的存在或缺失具特异性的试剂，而且可以包括有助于确定受试者是否疾病形成风险升高的用法说明。试剂盒可以任选包括用于检测ApoE基因(例如ApoE 2、ApoE 3和/或ApoE 4)的核酸或关于用于检测ApoE基因型的等电聚焦方法的用法说明；和/或用于检测本文所述TOMM40变体的核酸。在一些实施方案中，试剂盒可以任选包括一种或多种结合ApoE 2、ApoE 3、ApoE 4或TOMM40同等型的抗体。可以以任何合适方式来包装测试试剂盒，通常所有要素与一张关于进行测试的印刷用法说明一起置于一个容器中。
在一些实施方案中，试剂盒可以任选含有缓冲液、酶和试剂，用于通过引物指导的扩增来扩增基因组核酸。试剂盒还可以包括一种或多种用于检测扩增核酸中特定单元型的存在或缺失的装置。此类装置可以包括一种或多种与单元型核酸杂交的探针，其可以附着至生物芯片或微阵列装置，诸如美国专利No.6,355,429中记载的生物芯片或微阵列装置之任一。生物芯片或微阵列装置任选具有至少一种能与单元型序列杂交的捕捉探针，附着于表面。在优选的实施方案中，生物芯片或微阵列含有多种探针，且最优选含有针对单元型序列的至少一种探针，若单元型序列存在的话，它会通过一套侧翼引物来扩增。例如，如果五对侧翼引物用于扩增，那么该装置会含有针对每一种扩增产物的至少一种单元型探针，即至少五种探针。试剂盒还优选包括关于使用试剂盒成分的用法说明。
在下面的非限制性实施例中更为详细地解释本发明。
实施例1：系统发生树的构建
所有已知基因组尺度扫描研究在载脂蛋白C1[ApoC1]基因座周围展现极其显著的p值(Mahley et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103：5644-51(2006)；Coon et al.，J.Clin.Psychiatry 68：613-8(2007)；Li et al.，Arch.Neurol.65：45-53(2007))。同样重要的是每个系列鉴定出ApoE连锁不平衡区域以外的一个“偏爱”临界显著的候选基因，但是每一项研究中的这些偏爱候选基因是不同的。TOMM40靠近ApoC1，而且与ApoE连锁不平衡。认为ApoE 3或ApoE4与不同TOMM40同等型之间的相互作用与较早年龄范围内阿尔茨海默氏病形成风险升高或降低有关。Apo 4/4、3/4、3/3、2/4、和2/3基因型的发作年龄曲线显示于图2，指示疾病较早形成的一系列风险，这取决于ApoE谱。然而，ApoE本身似无法解释这些发作年龄曲线中的所有数据。
已经提出了用于与不同ApoE等位基因有关的阿尔茨海默氏病风险的多态性制谱的各种方法(见例如Cox等人的美国申请No.20060228728；Li和Grupe的美国申请No.20080051318)。本文中展现了用于解决ApoE 4之谜的一种系统发生办法。
生物学样品、DNA分离、感兴趣基因座扩增。总共340名受试者包括A组中的135个阿尔茨海默氏病病例和99个年龄匹配对照以及B组中的57个病例和49个对照。所有受试者携带先前与较高风险的较早疾病发作关联起来的ApoE基因型(即3/3、3/4、或4/4)。自所有受试者收集含有DNA的生物学样品。然后依照常规方法分离基因组DNA，用于对染色体19上的遗传基因座测序。
图3显示染色体19上使用来自多份报告的基因组尺度扫描数据的研究所靶向的遗传区域。该区域涵盖在GenBank参照序列AF050154内。使用软件来为变异基因座生成多重序列比对(例如ClustalW2，European BioinformaticsInstitute)。随后，使用用于形成系统发生树的软件来分析多重序列比对(例如MEGA version 2.1，Center for Evolutionary Functional Genomics，TREEVOLVE，Department of Zoology，University of Oxford，或基于简约性的构建软件，诸如PAUP，Sinauer Associates)。可以用例如遗传数据分析(GDA：用于分析分立遗传数据的软件，北卡罗来纳州州立大学的生物信息研究中心)来实施统计分析。B区分析的结果展现于图4的系统发生树中。
图4中的每个数据代表一个观察到的序列变体。这些变体可以是核苷酸替代、插入、删除或微卫星，而且可以导致或不导致基因表达或蛋白质功能的可检测差异。每个节点代表在超过一条染色体上发生的一种变体(或一些变体)。邻近节点限定顺式的，且因此更有可能作为受试者的染色体上感兴趣区域中的一个单元继承的序列的边界。在最大数目的后续节点之前的节点代表随时间发生遗传分歧的进化祖先变体。
存在对应于代表具有实质性更高阿尔茨海默氏病发病率的受试者(即受疾病影响的受试者与未受影响的对照受试者的比更高)的树区域单元型或序列变体会意味着该受试者个体也处于升高的风险。相反，实质性更低的比对应于阿尔茨海默氏病形成风险降低。
在线粒体蛋白质输入的调节中，TOMM40与ApoE直接相互作用，而且当前的一种假说是特定TOMM40变体的表达加剧与ApoE 3等位基因的剂量依赖性存在有关的相对中等的阿尔茨海默氏病风险。使用本发明的方法在B区内发现此类TOMM40变体。
对人类受试者测试新药物具有极大的风险(见Kenter and Cohen，Lancet，368：1387-91(2006))。使用系统发生树来预料个体对感兴趣药物或治疗的响应有可能显著降低该风险。预备研究指示罗格列酮(Avandia)在阿尔茨海默氏病的治疗中可能具有遗传谱特异性功效(见Risner et al.，ThePharmacogenomics Journal 6，246-254(2006)；Brodbeck et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.105，1343-6(2008))。II期临床试验数据指示没有ApoE 4等位基因的阿尔茨海默氏病患者比携带1个或2个ApoE 4等位基因的患者更好地响应罗格列酮(未显示的数据)。这支持用本文中教导的方法鉴定出的变体可用于基于基因型来预料个体对治疗的响应的假说。
实施例2：感兴趣TOMM40变体的鉴定
使用CLUSTAL X程序(version 2.0.10，Larkin et al.，Clustal W and ClustalX version 2.0.Bioinformatics，23：2947-2948(2007))比对174条序列(87名受试者每人2条)。使用欧洲生物信息研究所(EBI)网站上执行的近邻连接算法((Saitou and Nei，The neighbor-joining method：a new method for reconstructingphylogenetic trees.Mol.Evol.Biol.，4：406-425(1987))，使用多重序列比对来构建系统发生树。
所得系统发生树具有在第一分歧处有两个大组(A、B)的结构。将这些组的ApoE基因型频率制表并显示于图5。显然B组含有主要为ε3/ε3和ε3/ε4ApoE基因型的受试者单元型，而且几乎没有ε4/ε4的受试者单元型。A组含有几乎所有是ε4/ε4基因型的受试者单元型。
使用通过SNP发现平台(Polymorphic)生成的多态性表来鉴定将数据隔离成两个组的特定TOMM40基因变体。使用似然比检验来鉴定p值小于0.005的重要变体。
变体表汇总于表1。在该表中，在次要等位基因是核苷酸删除时使用术语“删除”，而在次要等位基因是核苷酸添加时使用术语“插入”。在有超过两种可能形式且次要等位基因不明显时使用术语“删除/插入多态性”。例如，对于poly-T多态性，观察到多种长度多态性。该表的第二栏提供关于与将序列分成两个组的变体有关的特定等位基因的身份的信息。例如，T＞A指示T等位基因将序列分离入系统发生树上的“A”组。在列出两种等位基因时，例如G＞B；A＞A，每一种等位基因独特地将序列数据分离入两个组，而在列出一种等位基因时，它与数据的优势分离有关，而剩余等位基因没有独特地将数据分离成同质组，而是两个组的混合。
表1：与系统发生树上通过ApoE基因型来分区的组有关的TOMM40变体
实施例3：ApoE 3的两种不同形式：那些与提高风险和降低发作年龄的TOMM40单元型及降低风险的TOMM40单元型连锁的
载脂蛋白E(ApoE)基因型，特别是ApoEε4(ApoE 4)与阿尔茨海默氏病(AD)风险和发作年龄的关联仍然是任何复杂疾病中最为确证的遗传关联。晚期发作AD的ApoE 4遗传度估值的范围为58％至79％，而且ApoE 4等位基因所致群体归因风险介于20％和70％之间。这些估值提示其它遗传变体和/或变体间相互作用招致另外的疾病风险并改变发作年龄分布。
AD的基因组尺度扫描关联结果一致地再现了含有ApoE的LD区域的极度相关性。TOMM40，即线粒体外膜的蛋白质转位酶，与ApoE处于高度LD，且编码膜通道，细胞质肽和蛋白质经由该通道横穿以合成新的线粒体。我们的目的是鉴定LD区域内别的提高遗传度估值的单元型。
方法：我们在AD患者和对照中使用深度(10X)一级测序检查了含有ApoE和TOMM40二者的LD区域。我们在66名患者和66名年龄匹配对照中关于风险和发作年龄分布对覆盖TOMM40和ApoE的LD区域实施了系统发生分析。
结论：我们发现不同TOMM40变体的独特且不同继承家族位于与ApoE 3相同的基因组间隔上，但是不在含有ApoE 4的基因组间隔上，而且能提高或降低AD的风险年龄分布。因此，这些TOMM40变体的遗传继承独立于ApoE4的继承，有效提供ApoE 3的两种不同形式的区别：与提高风险和降低发作年龄的TOMM40单元型连锁的，及与降低风险的TOMM40单元型连锁的。这些数据提高发作年龄的遗传风险的精确性，这取决于年龄、ApoE和TOMM40基因型，而且提供机会来限定之后5-7年里的高AD风险，较之较低AD风险。
实施例4：对三种鉴定出的TOMM40DIP变体的分析
本申请中鉴定的TOMM40变体中的三种是位于内含子6或内含子9中的删除/插入多态性(DIP)。这些DIP在国家生物技术信息中心dbSNP数据库中鉴定为rs10524523和rs10602329，及一种先前未记载的多态性，称作DIP3。根据NCBI build 36，这些多态性分别位于chr19：50,094,889、chr19：50,094,731、和chr19：50,096,647。本发明描述了使用对TOMM40基因(具体是该基因的一种10Kb片段)的系统发生分析鉴定这些DIP，而且DIP与通过系统发生分析确定的不同进化组有关。本发明进一步公开了这些DIP用于下述各项的效用：(1)确定健康人未来形成阿尔茨海默氏病的风险；和(2)在大约8年时间帧内预测AD发作年龄。
本文中表征的三种DIP多态性对应于TOMM40基因中的DIP poly-T重复的不同长度。DIP poly-T变体与疾病风险的关联有例可循。例如，囊性纤维化病跨膜传导调节蛋白(CFTR)基因内含子8中的poly-T变体与外显子9的跳读和囊性纤维化病形成有关(Groman et al.，Am J Hum Genet 74(1)：176-9(2004))。本文中公开了：(1)使用新方法-系统发生关联分析(上文描述的)-来鉴定预示的疾病风险和/或疾病发作年龄差异的DIP，(2)与AD发作年龄和AD风险的差异有关的三种特定DIP的身份，(3)个别地、一同地或与TOMM40或ApoE中的其它序列变体一起使用这些SNP来诊断疾病或预测或确定疾病特征，诸如疾病发作年龄、疾病预后、疾病亚型、疾病严重性、和还有分析或确定对药物的响应。
系统发生分析揭示rs10524523和rs10602329DIP分布在两个不同进化枝中。这项分析揭示在这些基因组处较短的poly-T长度位于B组中通过系统发生鉴定的进化枝，该组还包含更高百分比的ApoE e3/e3基因型受试者，显著少的(0％)ApoE e4/e4受试者和更低的病例/对照比(即AD疾病风险)(图5)。根据似然比检验或Pearson卡方检验，DIP长度与系统发生组之间的关联是统计学显著的(p＜0.0001)。
由于基因组架构，两种基因之间如系统发生分析中所示的高连锁不平衡和进化相关性，及两种基因产物之间推定的物理相互作用，TOMM40基因型的影响有可能延伸至受ApoE基因型影响的其它疾病。这些疾病包括但不限于帕金森氏病、多发性硬化、心血管疾病、血脂障碍、外伤性脑损伤恢复、自脑缺血事件恢复、对麻醉剂的响应、及对用于治疗AD和此处所列疾病的药物的响应。
这些多态性还可用于药物开发工作，即用于筛选可用于治疗受TOMM40或ApoE蛋白质中的变异或基因变体影响的疾病的化合物。
另外，变体可影响或决定基于特异性靶向的生物药物的疗法，生物药物例如单克隆抗体和siRNA分子。
使用多种不同分子核苷酸分析方法能自个体的DNA样品鉴定出本文中公开的TOMM40中的DIP多态性，方法包括但不限于用下文列出的表4中指示的引物进行的DNA测序。
实施例5：rs10524523处较长的poly-T束与较早的LOAD发作年龄显著有关
系统发生分析已经用于鉴定低频率遗传变体间的基因组相关性及进化相关单元型聚簇(Hahn et al.Population genetic and phylogenetic evidence forpositive selection on regulatory mutations at the factor VII locus in humans.Genetics 167，867-77(2004))。这种方法被用来对ApoE-TOMM40LD区段探索LOAD的新风险决定子的存在。在一项探索性研究中，对72个LOAD病例和60个年龄匹配对照扩增含有TOMM40和ApoE基因的23Kb DNA并测序，并确定了分相(phase-resolved)单元型(Li et al.Candidate single-nucleotidepolymorphisms from a genomewide association study of Alzheimer disease.ArchNeurol 65，45-53(2008))。有可能为这个区域编码外显子2-10的10Kb构建不同的系统发生树。以强自展支持(98％，1000份重复)区分了两个进化枝(A和B)。这种系统发生树上在TOMM40单元型的两个进化枝间ApoE基因型分布有显著差异，提示这个区域可能在功能上是重要的。两个进化枝都含有具有ε3/ε3基因型的受试者，但是所有进化枝B单元型中98％与ApoEε3等位基因处于顺式(P＝1.2x10-18，Fisher氏精确检验，双尾(two-tailed))。
TOMM40的这个10Kb区域的系统发生结构、特定单元型的ApoEε3特异性继承和进化枝特异性多态性的身份随后在两个独立的LOAD病例/对照群组中得到了证实，包括一个具有尸检证实的AD状态和疾病发作年龄数据的群组。还对这两个群组探索了两个进化枝与疾病风险和疾病发作年龄之间的关联(在数据可得的情况中)。第一个群组(AS)包含在亚利桑那州阿尔茨海默氏病研究中心(ADRC)确认的AD病例(n＝74)和对照(n＝31)。第二个群组(DS)是在Duke Bryan ADRC装配的，而且只包含ApoEε3/ε4受试者(40个疾病发作年龄已知的尸检证实的病例和33个对照)(表2)。虽然对DS群组50至68岁疾病发作的子集成功进行了DNA测序，但是关联分析限于60岁后形成AD的患者子集。
表2。群组组成。显示了每个系列的病例和对照的数目、年龄均值和女性的百分比。给出的年龄均值是病例的AD诊断年龄和对照的检查年龄。括弧中给出了均值的标准偏差。
对AS群组以强自展支持(97％，1000份重复)形成了结构与探索性研究中生成的系统发生树相似的系统发生树。ApoEε4/ε4受试者只在进化枝A中出现(组间98％分离，P＝2.0x10-4，Fisher氏精确检验，双尾)，而剩余ApoE基因型分布在进化枝A和B之间(图6)。就是说，ApoEε4总是与进化枝A变体处于LD，而ApoEε3存在于进化枝A和进化枝B两种单元型中。对少数ApoEε2/ε4受试者在系统发生树上的分布的检查提示ApoEε2-TOMM40单元型与ApoEε3-TOMM40单元型共享相似的进化史(未显示的数据)。为了使用不同的方法检验系统发生结构，及为了确保遗传间隔内的重组没有混淆为了AS群组形成的系统发生树结构，还使用统计简约性(statistical parsimony)(TCSversion 1.21(Clement et al.TCS：a computer program to estimate genegenealogies.Mol Ecol 9，1657-9(2000)))构建了单元型网络。自两种方法(最大简约性和TCS)衍生的主要受试者单元型簇是叠合的。
进化枝A比进化枝B更加频繁地与AD病例有关(OR＝1.44，95％CI＝0.76-2.70)。分析ApoEε3/ε4杂合子(n＝36)以评估与进化枝A单元型有关的疾病风险，同时以ApoEε4的效应为对照。相对于进化枝A和进化枝B杂合的子集，TOMM40进化枝A纯合的子集有LOAD发病率更高的趋势(OR＝1.36，95％CI＝0.40-4.61)，并因此假设至少一些限定进化枝A的TOMM40变体赋予不依赖ApoEε4的LOAD风险。
对AS群组序列数据的分析鉴定出TOMM40 10Kb区域中的39个多态性位点，其中有30个有简约性信息价值的(parsimony-informative)位点(至少两种不同核苷酸，每种在至少两条不同序列中呈现)。在30个有简约性信息价值的位点中，18个的次要等位基因频率(MAF)＞0.10，而六个SNP在TOMM40基因的边界之外。10个SNP唯独存在于ApoEε3的背景中(P＝6.07x10-50，Fisher氏精确检验，双尾，n＝210)，而且从未在ApoEε4/ε4纯合受试者中观察到(n＝16)。大多数ε3特异性TOMM40变体位于内含子区中。
图7图示对来自AS群组的ApoEε3/ε3受试者区分(P＜0.001)TOMM40进化枝A和B的10个SNP和6个插入/删除多态性。对这些多态性个别地及作为单元型检验与LOAD风险的关联(表3)。每一种进化枝B等位基因的疾病风险优势比(在所有病例中是次要等位基因)提示进化枝B等位基因在AS群组中给予AD风险以保护，然而在每一种情况中关联勉强地错失显著性。为了解释ApoEε4对表3中报告的优势比的影响，通过自合并AS和DS群组的ApoEε3/ε4受试者随机选择序列，构建了48个AD病例和48个AD对照的平衡集。在这个平衡数据集中，单SNP再次没有与LOAD显著有关联。然而，区分TOMM40进化枝B的四种SNP(rs8106922、rs1160985、rs760136、rs741780)的次要等位基因先前在三项LOAD病例/对照基因组尺度关联研究中进行过测定，而且发现给予疾病风险以保护(在每种情况中OR＜1)，这与在我们的研究中观察到的趋势一致(Abraham et al.A genome-wide association studyfor late-onset Alzheimer’s disease using DNA pooling.BMC Med Genomics 1，44(2008)；Carrasquillo et al.Genetic variation in PCDH11X is associated withsusceptibility to late-onset Alzheimer’s disease.Nat Genet 41，192-198(2009)；Takei et al.Genetic association study on in and around the ApoE in late-onsetAlzheimer disease in Japanese.Genomics 93，441-448(2009))。
区分两个进化枝并因此区分ApoEε3单元型的两个组的另一种多态性是位于TOMM40内含子6中的poly-T变体(rs10524523)。在ApoEε4染色体上，变体相对较长，长度具有窄、单峰分布(21-30个T残基，均值＝26.78，s.d.＝2.60，n＝32)，而在ApoEε3染色体上，长度的双峰分布是明显的，峰位于15.17个(s.d.＝0.85，n＝36)和33.15个(s.d.＝2.09，n＝55)T残基(图8)。在AS群组中，更长的poly-T长度(T＞＝27)几乎唯独分离入进化枝A中，即较高风险进化枝(P＝7.6x10-46，n＝210，Fisher精确检验，双尾)。含有两种最常见的较短长度的范畴(15或16个T残基)的病例/对照比为1.46(95％CI＝1.25-1.75)，而长度较长的范畴(28、29、33和34个T残基)的病例/对照比为2.02(95％CI＝1.13-2.87)。此数据显示朝向较长rs10524523poly-T长度与AD之间关联的趋势(OR＝1.38，95％CI＝0.80-2.39)。
虽然AS群组只有朝向TOMM40单元型或各多态性与LOAD的关联的趋势，但是有rs10524523的poly-T长度范畴与LOAD发作年龄之间的显著关联。这使用有疾病发作数据的尸检证实的ApoEε3/ε4受试者的DS群组进行了检验。较长poly-T等位基因(＞＝27个T残基)与疾病在年轻得多的年龄发作有显著关联(70.5岁+/-1.2比77.6岁+/-2.1，P＝0.02，n＝34)(图5)。
因此，这种多态性显著影响携带ApoEε3等位基因的个体的疾病发作年龄。位于内含子6中的三种其它poly-T长度多态性(rs34896370、rs56290633和rs10602329)也区分进化枝A和B，但是这些多态性与疾病发作年龄没有关联。类似地，在区分进化枝的SNP的单元型与LOAD的年龄之间没有相关性，或者对于单SNP，rs8106922亦如此，其在三项基因组尺度关联研究与AD风险有显著关联的(Abraham et al.A genome-wide association study for late-onsetAlzheimer’s disease using DNA pooling.BMC Med Genomics 1，44(2008)；Carrasquillo et al.Genetic variation in PCDH11X is associated withsusceptibility to late-onset Alzheimer’s disease.Nat Genet 41，192-198(2009)；Takei et al.Genetic association study on in and around the ApoE in late-onsetAlzheimer disease in Japanese.Genomics 93，441-448(2009))(未显示的数据)。
我们得出结论，rs10524523处较长的poly-T束与较早的LOAD发作年龄显著有关。这种变体在ApoEε4染色体上的长度相对均一，而且相对较长，但有两个与ApoEε3连锁的poly-T长度范畴。ApoEε2染色体也表现出携带与ε3染色体相似的长度可变的poly-T重复，但是需要进一步的调查来检验这种初步发现及确定poly-T重复是否影响ApoEε2携带者的非常晚的疾病发作年龄。
虽然有可能的是有其它变体影响不是ApoEε4纯合的个体的LOAD发作年龄，但是TOMM40内含子6中poly-T多态性的长度表现为这个连锁区域中最有力的遗传预报物且应当进行前瞻性验证。这些数据提示ApoE基因型分层的发作年龄曲线(Corder et al.Gene dose of apolipoprotein E type 4allele andthe risk of Alzheimer’s disease in late onset families.Science 261，921-3(1993)；Li et al.Candidate single-nucleotide polymorphisms from a genomewideassociation study of Alzheimer disease.Arch Neurol 65，45-53(2008))实际上是多组曲线，其中每条曲线反映ApoE和TOMM40中连锁多态性的一种特异性相互作用。因此，这些数据为超过60岁的个体在5-7年窗口内预测LOAD发作年龄增加了分辨率(resolution)。当前正在计划验证ApoE基因型和TOMM40单元型或rs10524523与疾病发作年龄的关联的研究。这项研究会是在数个种族组中进行的一项前瞻性，5年，基于群体的研究，而且会与预防或延迟疾病发作药物试验组合。
方法
在这项研究中分析的两个群组来自亚利桑那州阿尔茨海默氏病研究中心(ADRC，菲尼克斯，亚利桑那州)和Duke Bryan ADRC(达勒姆，北卡罗来纳州)。受试者都是欧洲后裔。亚利桑那州和Duke研究得到了这些机构审查组的批准，而且获得了所有参与者的知情同意书。每个群组中病例和对照的年龄和性别数据显示于表2。对于Duke群组，疾病发作年龄是回顾确定的，而且疾病诊断通过尸检得到证实。
在Polymorphic DNA Technologies(Alameda，CA)将样品分配到96孔板上进行远程(long range)PCR和DNA测序。
使用Takara LA Taq聚合酶(Takara Mirus Bio)实施远程PCR。反应混合物和PCR条件与制造商推荐的那些相同。PCR在50μL体积中，用2.5U LA Taq和200-400ng人基因组DNA进行。热循环用下面的条件进行：1个循环的94℃，1min；14个循环的94℃，30sec；57℃，30sec；68℃，9min；16个循环的94℃，30sec；57℃，30sec；68℃，9min+15sec/循环；1个循环的72℃，10min。用于远程PCR的引物显示于表4。
在0.8％琼脂糖凝胶上运行PCR产物，通过结晶紫染料来显现，与大小标准比较，切出凝胶，并用TOPO XL PCR克隆试剂盒(Invitrogen)包含的纯化材料提取。将远程PCR产物克隆入TOPO XL PCR克隆载体。这种系统使用TA克隆载体，而且推荐用于最长10kb的插入物。依照制造商的用法说明，用载体转化电感受态细胞(来自同一试剂盒)，在抗生素存在下涂板，并温育。自每块板挑取十个克隆，并以96孔格式培养。
将稀释的培养物转移至变性缓冲液，其是TempliPhi DNA测序模板扩增试剂盒(GE HealthCare/Amersham Biosciences)的一部分。这种缓冲液引起质粒DNA释放，但是不释放细菌DNA。将培养物加热，冷却，旋转，并转移至含有TempliPhi酶和其它成分的新鲜板。将此混合物于30℃温育18小时以促进质粒模板的扩增。然后将这些产物旋转，并加热至65℃以破坏酶。
在使用Big Dye，3.1版测序试剂盒(Applied Biosystems)的DNA测序反应中使用质粒模板。对于每个反应，使用适宜的测序引物(表4)，其设计成与模板的独特位置退火。进行循环测序，其使用退火温度50℃、延伸温度60℃、和变性温度96℃，总共30个循环。使用标准运行模式在带50cm毛细管阵列的ABI 3730XL DNA测序仪上运行测序反应产物。
使用称作“Agent”(由Celera开发)的一种私有测序分析程序来比对测序读出与适宜参照序列，并生成与每一种克隆有关的“毗连序列群”。该系统给任何样品有任何变异的所有碱基提供估计质量得分。对每份样品的测序报告分析对于一个克隆子集以一种单元型样式而对于剩余克隆以一种不同单元型样式有关的SNP的存在。感兴趣区域的参照文件通过列出公知自NCBIdbSNP可得的该区域的已知变异来制备。感兴趣区域的基因型文件通过对每个受试者的单元型报告搜索已知参照序列与共有单元型序列之间的所有变异来创建。
poly-T变体(例如rs10524523)的长度阅读错误的量级通过检查自10个克隆(它们是对于为具有单一单元型的样品制备的)观察到的长度来评估。对于具有短poly-T长度16的典型样品，10个克隆的标准偏差为0.97。对于具有更长poly-T长度例如27的典型样品，标准偏差为1.58。
进行了系统发生分析。使用ClustalW2(version 2.0.10)程序使用缺省参数对序列实施了多重序列比对。使用Genedoc(2.7.000版)对比对进行了手工调整。系统发生树是使用Bayesian、最大似然和基于距离的重建而构建的。使用的系统发生树构建软件是Paup*(4.0b10版)、ClustalX2(近邻连接法，2.0.10版)和Mr.Bayes(3.1.2版)。
在所有方法中都使用了树二分和重接分支交换。使用Modeltest程序(3.7版)评估了序列进化的最佳拟合模型，其提供下述关键决定子的估值：比率矩阵、伽马分布的形状和不变异位点的比例。使用1000份重复实施了自展分析以确定特定树形态的统计支持。
还使用程序TCS(1.21版)(Clement et al.TCS：a computer program toestimate gene genealogies.Mol Ecol 9，1657-9(2000))自序列数据构建了单元型网络以比较系统发生树与使用统计简约性估算的进化树。系统发生树和单元型网络构建两次，其中缺口作为第一种情况的缺失数据及作为第二种情况的第五特征来处理。感兴趣区域中的核苷酸多样性使用DnaSP(5.00.02版)(Librado et al.DnaSP v5：a software for comprehensive analysis of DNApolymorphism data.Bioinformatics 25，1451-2(2009))来计算。
对感兴趣区域构建系统发生树、单元型网络及完成核苷酸多样性分析后，比较来自不同方法的结果并综合为共有树(consensus tree)。假设共享新近疾病突变的序列组在系统发生树上的分离更加接近，然而，表型模拟、显性和上位性所致散发病例会将噪声引入表型-单元型相关性(Tachmazidou etal.Genetic association mapping via evolution-based clustering of haplotypes.PLoS Genet 3，e111(2007))。
然而，表型模拟、显性和上位性所致散发病例会将噪声引入表型-单元型相关性。这项系统发生分析着眼于高水平进化枝聚集以使这些影响降至最低。使用在系统发生树中第一次分拆时确定的进化枝来检验来自进化枝‘B’的TOMM40受试者-单元型与AD在比来自进化枝‘A’的受试者-单元型更晚的年龄发作有关的假说(每个受试者给AD发作年龄关联信号贡献两个单元型)。使用这种办法实施的关联检验的数目比典型基因组尺度关联研究低几个量级，因为系统发生分析鉴定进化相关受试者-单元型的范畴。如果关联检验证实不同进化枝通过发作年龄将受试者-单元型数据归类，那么进行进一步的统计分析来鉴定将序列分离入每一个进化枝的变体。有效地，这项分析使用一系列由树结构引导的一自由度检验来评估每种变体作为影响发作年龄的因素的显著性。使用单核苷酸和插入/删除多态性进行了系统发生分析。用分析中包括的多态性位点数目的Bonferroni修正调整对关联的统计学检验。
将来自多态性分析软件的单元型报告和来自DnaSP软件(5.00.02版)(Librado et al.DnaSP v5：a software for comprehensive analysis of DNApolymorphism data.Bioinformatics 25，1451-2(2009))的报告用于后续的统计分析。我们对各TOMM40SNP变体、TOMM40单元型和poly-T重复长度分析了与AS群组LOAD风险和DS群组LOAD发作年龄的关联。使用Fisher氏精确检验(双尾)比较了与每一种ApoE等位基因或ApoE基因型有关的特定TOMM40等位基因的比例的差异。以30个有简约性信息价值的位点和α＝0.05开始，特定等位基因关联的显著性的Bonferroni修正会要求0.001的P值。作为(病例中的次要等位基因数目/对照中的次要等位基因数目)/(病例中的主要等位基因数目/对照中的主要等位基因数目)计算了优势比(OR)，并以95％置信区间报告。通过双尾t检验比较了限定LOAD发作年龄组的均值。对组变异实施了标准F检验以确定t检验是假设相等还是不等方差而计算的。统计分析是使用JMP软件(version 8，SAS Institute，Cary，NC)进行的。
编号代码：GenBank：TOMM40，线粒体外膜转位酶40同系物，10452；ApoE，载脂蛋白E，348。
前述是本发明的例示，而且不应解释为其限制。本发明由所附权利要求来限定，其包括权利要求的等同方案。
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申请号：PCT/US09/53373    文件日期：08/11/2009
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表格修正日期：2006年2月8日

Claims (21)

1.一种用于确定受试者是否形成晚期发作阿尔茨海默氏病的风险升高的试剂盒，包括：
(A)至少一种特异性检测ApoE 3、ApoE 4和/或ApoE 2的试剂，其中所述试剂选自下组：选择性结合ApoE同等型的抗体，和选择性结合编码ApoE等位基因的DNA的寡核苷酸探针；
(B)至少一种特异性检测与升高的或降低的阿尔茨海默氏病风险有关的位于TOMM40基因内含子6或内含子9中的至少一种TOMM40删除/插入多态性(DIP)变体的存在或缺失的试剂；和
(C)通过下述步骤确定受试者是否形成晚期发作阿尔茨海默氏病的风险升高的用法说明，
(i)用所述至少一种试剂在所述受试者中检测ApoE 3、ApoE4和/或ApoE 2同等型的存在或缺失；
(ii)检测与升高的或降低的阿尔茨海默氏病风险有关的位于TOMM40基因内含子6或内含子9中的至少一种TOMM40删除/插入多态性(DIP)变体的存在或缺失；并
(iii)通过观察用所述至少一种试剂是否检测到ApoE 3、ApoE 4、和/或ApoE 2及所述TOMM40DIP的存在来观察所述受试者是否形成晚期发作阿尔茨海默氏病的风险升高，其中ApoE 3、ApoE4和/或ApoE 2同等型及所述TOMM40 DIP变体的存在指示所述受试者形成晚期发作阿尔茨海默氏病的风险升高，
其中所述DIP是rs10524523、rs10602329或DIP3。
2.权利要求1的试剂盒，其中所述至少一种试剂和所述用法说明包装在一个容器中。
3.权利要求1或权利要求2的试剂盒，其中所述DIP是插入多态性。
4.权利要求1或权利要求2的试剂盒，其中所述DIP是poly-T删除/插入多态性。
5.权利要求1或权利要求2的试剂盒，其中所述DIP是rs10524523。
6.权利要求1或权利要求2的试剂盒，其中所述确定步骤进一步包括检测所述受试者是否是Apo E2/E2、E2/E3、E2/E4、E3/E3、E3/E4或E4/E4受试者。
7.权利要求3的试剂盒，其中所述确定步骤进一步包括检测所述受试者是否是Apo E2/E2、E2/E3、E2/E4、E3/E3、E3/E4或E4/E4受试者。
8.权利要求4的试剂盒，其中所述确定步骤进一步包括检测所述受试者是否是Apo E2/E2、E2/E3、E2/E4、E3/E3、E3/E4或E4/E4受试者。
9.权利要求5的试剂盒，其中所述确定步骤进一步包括检测所述受试者是否是Apo E2/E2、E2/E3、E2/E4、E3/E3、E3/E4或E4/E4受试者。
10.(A)至少一种特异性检测ApoE 3、ApoE 4和/或ApoE 2的试剂，其中所述试剂选自下组：选择性结合ApoE同等型的抗体，和选择性结合编码ApoE等位基因的DNA的寡核苷酸探针，和/或
(B)至少一种特异性检测与升高的或降低的阿尔茨海默氏病风险有关的位于TOMM40基因内含子6或内含子9中的至少一种TOMM40删除/插入多态性(DIP)变体的存在或缺失的试剂
在制备权利要求1-9中任一项的试剂盒中的用途。
11.权利要求10的用途，其中所述DIP是poly-T删除/插入多态性，具有为至少27个连续碱基对的poly-T。
12.权利要求11的用途，其中所述DIP是poly-T删除/插入多态性，具有为rs10524523处的至少27个连续碱基对的poly-T。
13.权利要求10的用途，其中所述确定之后有下述步骤：
(iv)当所述受试者被确定为形成晚期发作阿尔茨海默氏病的风险升高时以治疗有效量给所述受试者施用抗阿尔茨海默氏病活性剂。
14.权利要求13的用途，其中当所述受试者被确定为形成晚期发作阿尔茨海默氏病的风险升高时在较小的年龄在所述受试者中进行所述施用步骤。
15.权利要求13或权利要求14的用途，其中所述活性剂选自下组：乙酰胆碱酯酶抑制剂，NMDA受体拮抗剂，过氧化物酶体增殖子活化的受体激动剂或调控剂，抗体，融合蛋白，治疗性RNA分子，及其组合。
16.权利要求13或权利要求14的用途，其中所述活性剂是噻唑烷二酮。
17.权利要求13或权利要求14的用途，其中所述活性剂是噻唑烷二酮药物。
18.权利要求13或权利要求14的用途，其中所述治疗包括延迟阿尔茨海默氏病的发作。
19.权利要求15的用途，其中所述治疗包括延迟阿尔茨海默氏病的发作。
20.权利要求16的用途，其中所述治疗包括延迟阿尔茨海默氏病的发作。
21.权利要求17的用途，其中所述治疗包括延迟阿尔茨海默氏病的发作。
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