JP2012176984A

JP2012176984A - 脱髄障害を処置するための方法

Info

Publication number: JP2012176984A
Application number: JP2012131867A
Authority: JP
Inventors: Brian Popko; ポプコブライアン; Wensheng Lin; ウェンシェンリン
Original assignee: University of Chicago
Current assignee: University of Chicago
Priority date: 2005-06-14
Filing date: 2012-06-11
Publication date: 2012-09-13
Also published as: EP1909562A4; EP1909562A2; IL188127A0; WO2006138412A2; IL188127A; CA2612374A1; JP2008546704A; WO2006138412A3

Abstract

【課題】脱髄障害を処置するための方法の提供。
【解決手段】本発明は、神経脱髄または再髄鞘形成で役割を果たす分子成分の発見および特徴付けに関する。さらに、本発明は、髄鞘低形成を示す動物モデルの生成に関する。本発明で具体化された組成物および方法は、特に、脱髄障害の薬物スクリーニングおよび／または治療に有用である。本発明は、神経脱髄を軽減する生物活性剤の開発方法を提供する。本方法は、（ａ）候補薬剤を髄鞘形成細胞と接触させる工程と、（ｂ）コントロール細胞と比較して遺伝子もしくは遺伝子産物の発現の変化または前記遺伝子産物の活性の変化を検出する工程と、前記遺伝子または遺伝子産物が小胞体（ＥＲ）ストレスに相関することと、（ｃ）前記遺伝子もしくは遺伝子産物の発現レベルまたは前記遺伝子産物の活性レベルが前記コントロール細胞と比較して調整された場合、前記薬剤を候補として選択する工程とを含む。
【選択図】なし

Description

（相互参照）
本出願は、２００５年６月１４日に出願された米国仮出願第６０／６９０，６９１号、２００６年４月１３日に出願された米国仮出願第６０／７４４，８２６号、および２００６年４月１４日に出願された米国仮出願第６０／７９２，００７号、ならびに２００６年５月９日に出願された米国出願第１１／４３１，７８２号、２００６年５月９日に出願された米国出願第１１／４３１，６０１号、および２００６年５月９日に出願された米国出願第１１／４３１，３７２号の利益を主張する。これらの全ては、その全体について本明細書に参考として援用される。
本発明は、神経学分野に属する。詳細には、本発明は、神経脱髄または再髄鞘形成で役割を果たす分子成分の発見および特徴付けに関する。さらに、本発明は、髄鞘低形成を示す動物モデルの生成に関する。本発明で具体化された組成物および方法は、特に、脱髄障害の薬物スクリーニングおよび／または治療に有用である。

（発明の背景）
神経脱髄は、中枢神経系中のミエリンタンパク質の減少によって特徴づけられる有害な病態である。ミエリンは、中枢神経系（ＣＮＳ）および末梢神経系（ＰＮＳ）の重要要素であり、ニューロンの軸索を包み込み、髄鞘として公知の絶縁層を形成する。髄鞘の存在により、下にある神経軸索への電位の伝播形態の神経シグナルの速度および完全性を増強する。髄鞘の喪失により、神経シグナルがその標的に非常にゆっくりか、非同期的か（例えば、いくつかの軸索が神経伝導において他の軸索よりも速い）、断続的に（例えば、高周波の伝導のみが損なわれる）に到達するか、全く到達しないので、感覚、運動、および他の機能型が有意に損なわれる。

髄鞘は、ＣＮＳ中の膠細胞−乏突起膠細胞およびＰＮＳ中のシュワン細胞の原形質膜（すなわり、細胞膜）によって形成される。髄鞘形成の活動期の間に、ＣＮＳ中の乏突起膠細胞は、約５０００μｍ^２のミエリン表面積／日および約１０^５個ミエリンタンパク質分子／分ほども産生しなければならない（非特許文献１）。髄鞘形成乏突起膠細胞は、脱髄病変で同定されており、このことは、新規に合成されたミエリンを使用して脱髄軸索を修復することができることを示す。

神経脱髄は、ＣＮＳおよびＰＮＳの多数の遺伝性障害および獲得性障害で出現する。これらの障害には、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎、橋中心髄鞘崩壊症（ＣｅｎｔｒａｌＰｏｎｔｉｎｅＭｙｅｌｏｌｙｓｉｓ）（ＣＰＭ）、抗ＭＡＧ疾患、白質萎縮：副腎脳白質ジストロフィ（ＡＬＤ）、アレキサンダー病、カナヴァン病、クラッベ病、異染性白質ジストロフィ（ＭＬＤ）、ペリツェーウス・メルバッハー病、レフサム病、コケイン症候群、ファンデルナップ症候群（ＶａｎｄｅｒＫｎａｐｐＳｙｎｄｒｏｍｅ）、ツェルウェーガー症候群、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害（ＣＩＤＰ）、多病巣性運動神経障害（ｍｕｌｔｉｆｏｃｕａｌｍｏｔｏｒｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）（ＭＭＮ）、アルツハイマー病、および進行性核上麻痺が含まれる。これら障害の多くは、治療薬が存在せず、有効な療法はわずかしかない。

多発性硬化症は、最も一般的な中枢神経系の脱髄疾患であり、世界で約１，０００，０００人が罹患し、約２５０，０００〜３５０，０００人が米国人である。この疾患は、臨床的に再発および緩和によって特徴づけられ、最終的に、慢性身体障害に至る。多発性硬化症の初期は、麻痺、協調性の欠如、感覚障害、および視覚障害をもたらす髄鞘に対する自己免疫炎症性発作（ｓｔｒｉｋｅ）によって特徴づけられる。その後の疾患の慢性進行期は、典型的には、髄鞘の活動性変性および脱髄病変の不適切な再髄鞘形成に起因する（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。

本疾患の正確な病因および病理発生は未知のままである。しかし、病理学的、遺伝的、および免疫学的特長が同定されており、疾患が炎症および自己免疫を根拠とすることが示唆される。例えば、非特許文献５；非特許文献６を参照のこと。活性化Ｔリンパ球およびナチュラルキラー細胞によって分泌される多面発現性サイトカインであるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）は、免疫媒介性脱髄障害（ＭＳおよび実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）が含まれる）で有害な役割を果たすことが現在公知である（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）。このサイトカインは、通常、ＣＮＳ中に存在せず、これらの障害の症候期中に検出可能となる（非特許文献１０）。ｉｎｖｉｔｒｏ研究により、ＩＦＮ−γが精製された発達中の乏突起膠細胞におけるアポトーシを促進することができることが示されている（非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３）。これらの広範な研究にもかかわらず、ＩＦＮ−γの分泌によって乏突起膠細胞が異常になり、髄鞘が変化する正確な機構は十分に理解されていない。

したがって、神経脱髄の分子的機序を解明することができる組成物および方法が非常に必要とされている。脱髄障害治療に有効な生物活性剤の開発も差し迫って必要である。

Ｐｆｅｉｆｆｅｒ，ｅｔａｌ．、ＴｒｅｎｄｓＣｅｌｌＢｉｏｌ．（１９９３）３：１９１−１９７Ｆｒａｎｋｌｉｎ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００２）３：７０５−７１４Ｂｒｕｃｋ，ｅｔａｌ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．（２００３）２０６：１８１−１８５Ｃｏｍｐｓｔｏｎ，ｅｔａｌ．、Ｌａｎｃｅｔ（２００２）３５９：１２２１−１２３１Ｗａｋｓｍａｎ，ｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．（１９８４）１７５：２８２−２９４Ｈａｆｌｅｒｅｔａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．（１９８７）ｌ００：３０７−３３２Ｐｏｐｋｏｅｔａｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．（１９９７）１４：１９−３５ＰｏｐｋｏａｎｄＢａｅｒｗａｌｄ、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．（１９９９）２４：３３１−３３８Ｓｔｅｉｎｍａｎ、Ｍｕｌｔ．Ｓｃｌｅｒ．（２００１ａ）７：２７５−２７６Ｐａｎｉｔｃｈ、Ｄｒｕｇｓ（１９９２）４４：９４６−９６２ＢａｅｒｗａｌｄａｎｄＰｏｐｋｏ、Ｊ．ＮｅｕｒｏＳｃｉ．Ｒｅｓ．（１９９８）５２：２３０−２３９Ａｎｄｒｅｗｓｅｔａｌ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．（１９９８）５４：５７４−５８３Ｆｅｌｄｈａｕｓｅｔａｌ．、Ｊ．Ｓｏｃ．ＧｙｎｅｃｏｌＩｎｖｅｓｔｉｇ．（２００４）１１：８９−９６

（発明の概要）
本発明は、神経脱髄を軽減する生物活性剤の開発方法を提供する。本方法は、（ａ）候補薬剤を髄鞘形成細胞と接触させる工程と、（ｂ）コントロール細胞と比較して遺伝子もしくは遺伝子産物の発現の変化または前記遺伝子産物の活性の変化を検出する工程と、前記遺伝子または遺伝子産物が小胞体（ＥＲ）ストレスに相関することと、（ｃ）前記遺伝子もしくは遺伝子産物の発現レベルまたは前記遺伝子産物の活性レベルが前記コントロール細胞と比較して調整された場合、前記薬剤を候補として選択する工程とを含む。

本発明はまた、神経再髄鞘形成を促進する生物活性剤を開発する方法を提供する。本方法は、（ａ）候補生物活性剤を被験体の脱髄病変由来の髄鞘形成細胞と接触させる工程と、（ｂ）コントロール細胞と比較して遺伝子もしくは遺伝子産物の発現の変化または前記遺伝子産物の活性の変化を検出する工程と、前記遺伝子または遺伝子産物が小胞体（ＥＲ）ストレスに相関することと、（ｃ）前記遺伝子もしくは遺伝子産物の発現レベルまたは前記遺伝子産物の活性レベルが前記コントロール細胞と比較して調整された場合、前記薬剤を候補として選択する工程とを含む。

本発明は、さらに、脱髄障害に関連する現象を調整する生物活性剤を試験する方法に関する。このような方法は、（ａ）候補薬剤を非ヒトトランスジェニック動物に投与する工程と、ＩＦＮ−γ発現の際に前記動物において脱髄が起こることと、（ｂ）脱髄障害に関連する現象に及ぼす前記薬剤の影響を決定する工程とを含む。

脱髄障害に関連する現象を調整する生物活性剤を試験する方法であって、以下の工程：（ａ）候補薬剤を非ヒトトランスジェニック動物由来の細胞と接触させる工程と、（ｂ）コントロール細胞と比較して遺伝子もしくは遺伝子産物の発現の変化または前記遺伝子産物の活性の変化を検出する工程と、前記遺伝子または遺伝子産物が小胞体（ＥＲ）ストレスに相関することと、（ｃ）前記遺伝子もしくは遺伝子産物の発現レベルまたは前記遺伝子産物の活性レベルが前記コントロール細胞と比較して調整された場合、前記薬剤を脱髄障害に関連する現象を調整するのに有効な候補として選択する工程とを行うことによる、方法も本発明で提供する。

本発明は、脱髄障害に関連する現象を調整する生物活性剤を試験する別の方法を提供する。本方法は、（ａ）（ｉ）試験動物の神経脱髄の誘導、および（ｉｉ）前記試験動物を脱髄病変の再髄鞘形成が示されるのに十分な時間脱髄誘導から回復させることを含む方法によって得られた試験動物に候補生物活性剤を投与する工程と、（ｂ）脱髄障害に関連する現象に及ぼす前記薬剤の効果を決定する工程とを含む。

本発明の種々の実施形態では、脱髄障害に関連する現象は、中枢神経系中の乏突起膠細胞または末梢神経系中のシュワン細胞の喪失によって特徴づけられる。他の実施形態では、神経脱髄に関連する現象は、中枢神経系または末梢神経系中の有髄軸索の減少によって特徴づけられる。さらに他の実施形態では、神経脱髄に関連する現象は、乏突起膠細胞マーカーまたはシュワン細胞マーカー、好ましくは、タンパク質性マーカーのレベルの減少によって特徴づけられる。髄鞘形成細胞（乏突起膠細胞およびシュワン細胞が含まれる）の非限定的な例示的マーカータンパク質は、ＣＣ１、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、ミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、乏突起膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、ＮＯＧＯ、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）、末梢性ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、タンパク質２（Ｐ２）、ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）、スルファチド、およびプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）からなる群から選択される。ＭＰＺ、ＰＭＰ２２、およびＰ２は、シュワン細胞の好ましいマーカーである。

一定の実施形態では、本明細書中に言及される脱髄障害は多発性硬化症である。他の実施形態では、脱髄障害は、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎、橋中心髄鞘崩壊症（ＣＰＭ）、抗ＭＡＧ疾患、白質萎縮：副腎脳白質ジストロフィ（ＡＬＤ）、アレキサンダー病、カナヴァン病、クラッベ病、異染性白質ジストロフィ（ＭＬＤ）、ペリツェーウス・メルバッハー病、レフサム病、コケイン症候群、ファンデルナップ症候群、ツェルウェーガー症候群、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害（ＣＩＤＰ）、多病巣性運動神経障害（ＭＭＮ）、アルツハイマー病、および進行性核上麻痺からなる群から選択される。

本発明の１つの態様では、細胞ベースのアッセイで使用される生物活性剤は、単純または複雑な有機分子もしくは無機分子、ペプチド、ペプチド模倣物、タンパク質（例えば、抗体）、リポソーム、低分子干渉ＲＮＡ、またはポリヌクレオチド（例えば、アンチセンス）などの生物学的または化学的化合物からなる群から選択することができる。

本発明はまた、非ヒトトランスジェニック動物であって、（ａ）インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）をコードするトランスジェニックヌクレオチド配列が前記動物のゲノムに安定に組み込まれており、（ｂ）少なくとも１つの他の遺伝子の発現が変化しており、ここで、前記ＩＦＮ−γの発現の際に、前記動物が、工程（ａ）において見られるようなインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）をコードするトランスジェニックヌクレオチド配列が安定に組み込まれたトランスジェニック動物と比較して脱髄の程度がより高いが、前記少なくとも１つの他の遺伝子の発現の変化を欠いている、非ヒトトランスジェニック動物を提供する。

１つの態様では、少なくとも１つの他の遺伝子は、小胞体ストレスと相関する。このような遺伝子には、膵臓ＥＲキナーゼ遺伝子（ｐ−ＰＥＲＫ）、真核細胞翻訳開始因子２α（ｅＩＦ−２α）、真核細胞翻訳開始因子β（ｅＩＦ−２α）、イノシトール要求１（ＩＲＥ１）、活性化転写因子６（ＡＲＴＦ６）、ＣＡＡＴＴエンハンサー結合タンパク質相同タンパク質（ＣＨＯＰ）、結合免疫グロブリンタンパク質（ＢＩＰ）、カスパーゼ−１２、成長およびＤＮＡ損傷タンパク質３４（ＧＡＤＤ３４）、ＣｒｅＰ（ｅＩＦ２αリン酸化の構成性リプレッサー）、サイトカインシグナル伝達１のサプレッサー（ＳＯＣＳ１）、およびＸボックス結合タンパク質−１（ＸＢＰ−１）が含まれるが、これらに限定されない。

別の態様では、非ヒトトランスジェニック動物は、膵臓ＥＲキナーゼ遺伝子（ＰＥＲＫ）のヘテロ接合性ノックアウトを含み、前記動物のゲノムにインターフェロン−γ（ＩＮＦ−γ）を含むトランスジェニックヌクレオチド配列が安定に組み込まれている。

さらに別の態様では、動物は、野生型動物と比較してＩＮＦ−γ媒介性神経脱髄に対する脆弱性が増大している。

このような本発明のトランスジェニック動物由来の細胞も提供する。

被験体の神経脱髄を阻害する方法であって、被験体に末梢神経系または中枢神経系における髄鞘形成細胞中の小胞体（ＥＲ）のストレスレベルを調整するのに有効な量の生物活性剤を投与する工程を含む、方法も本発明に含まれる。髄鞘形成細胞は、乏突起膠細胞またはシュワン細胞であり得る。本発明の１つの態様では、生物活性剤は、髄鞘形成細胞中の小胞体（ＥＲ）の持続したストレスレベルを減少させるのに有効である。いくつかの態様では、生物活性剤は、インターフェロン−γ（ＩＮＦ−γ）アンタゴニストであり、但し、神経脱髄の発症後に適用する場合、インターフェロン−γ（ＩＮＦ−γ）アンタゴニストは抗ＩＮＦ−γ抗体ではない。他の態様では、生物活性剤は、予防効果を得るために神経脱髄の発症前に投与されるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）またはインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）アゴニストである。必要に応じて、生物活性剤は、ＥＲの持続したストレスレベルを減少させる能力によって特徴づけることができ、同様に、小胞体（ＥＲ）ストレスに相関するタンパク質レベルの減少によって特徴づけることができる。例示的なＥＲストレス相関タンパク質には、リン酸化膵臓ＥＲキナーゼ遺伝子（ｐ−ＰＥＲＫ）、真核細胞翻訳開始因子２α（ｅＩＦ−２α）、真核細胞翻訳開始因子β（ｅＩＦ−２β）、イノシトール要求１（ＩＲＥ１）、活性化転写因子６（ＡＲＴＦ６）、ＣＡＡＴＴエンハンサー結合タンパク質相同タンパク質（ＣＨＯＰ）、結合免疫グロブリンタンパク質（ＢＩＰ）、カスパーゼ−１２、成長およびＤＮＡ損傷タンパク質３４（ＧＡＤＤ３４）、ＣｒｅＰ（ｅＩＦ２αリン酸化の構成性リプレッサー）、およびＸボックス結合タンパク質−１（ＸＢＰ−１）が含まれるが、これらに限定されない。

神経脱髄の発生後に被験体の神経再髄鞘形成を促進する方法であって、前記被験体に再髄鞘形成を生じているニューロン組織中の小胞体（ＥＲ）のストレスレベルを調整するのに有効な量の薬剤を投与する工程を含む方法を本発明でさらに提供する。１つの態様では、意図する生物活性剤は、ＩＮＦ−γアンタゴニスト（抗ＩＮＦ−γ抗体またはその抗原結合フラグメントが含まれるが、これらに限定されない）である。別の態様では、生物活性剤は、髄鞘形成細胞中の小胞体（ＥＲ）の持続したストレスレベルを減少させるのに有効である。別の態様では、細胞中に存在するｅＩＦ２αキナーゼ活性の増加またはリン酸化ｅＩＦ−２αレベルの増加によってｅＩＦ−２α経路を活性化するのに有効である。さらに別の態様では、生物活性剤は、細胞中に存在するＰＥＲＫキナーゼ活性の増加またはリン酸化ＰＥＲＫもしくはＰＥＲＫ二量体レベルの増加によってｅＩＦ−２α経路を活性化するのに有効である。なおさらに別の態様では、生物活性剤は、ＧＡＤＤ３４経路の不活化によってｅＩＦ−２α経路を活性化するのに有効である。いくつかの例では、ＧＡＤＤ３４経路の不活化によってＧＡＤＤ３４シグナル伝達が減少する。他の例では、ＧＡＤＤ３４経路の不活化によって細胞中に存在するＰＰＩ（タンパク質ホスファターゼ１）のホスファターゼ活性が減少するかＰＰＩレベルが減少する。

本発明は、さらに、治療を必要とする被験体の脱髄障害の進行を改善する方法を提供する。本方法は、被験体における再髄鞘形成またはＩＮＦ−γシグナル伝達を生じている被験体の神経組織中に存在するインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）レベルを減少させる工程を含む。いくつかの例では、ＩＦＮ−γレベルの減少が、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）アンタゴニスト（例えば、抗ＩＮＦ−γ抗体または抗原結合フラグメント）から構成される一定量の薬学的組成物を脱髄化病変に送達させることによってもたらされる。別の態様では、ＩＦＮ−γシグナル伝達の減少が、ＩＦＮ−γの下流シグナル伝達分子またはその生物活性のレベルの減少によってもたらされる。ＩＦＮ−γの下流シグナル伝達分子がＳＯＣＳ１および／またはＳｔａｔ１を含む。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
被験体の神経脱髄を阻害する方法であって、該被験体に髄鞘形成細胞中の小胞体（ＥＲ）のストレスレベルを調整するのに有効な量の生物活性剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙａｃｔｉｖｅａｇｅｎｔ）を投与する工程を含む、方法。
（項目２）
前記生物活性剤が、髄鞘形成細胞中の小胞体（ＥＲ）の持続したストレスレベルを減少させるのに有効である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記生物活性剤が、インターフェロン−γ（ＩＮＦ−γ）アンタゴニストであり、但し、神経脱髄の発症後に適用する場合、該インターフェロン−γ（ＩＮＦ−γ）アンタゴニストが抗ＩＮＦ−γ抗体ではない、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記生物活性剤が、予防効果を得るために神経脱髄の発症前に投与されるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）またはインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）アゴニストである、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記ＥＲの持続したストレスレベルの減少が、小胞体（ＥＲ）ストレスに相関するタンパク質レベルの減少によって特徴づけられる、項目２に記載の方法。
（項目６）
前記ＥＲストレスに相関するタンパク質が、リン酸化膵臓ＥＲキナーゼ遺伝子（ｐ−ＰＥＲＫ）、真核細胞翻訳開始因子２α（ｅＩＦ−２α）、真核細胞翻訳開始因子β（ｅＩＦ−２β）、イノシトール要求１（ｉｎｏｓｉｔｏｌｒｅｑｕｉｒｉｎｇ１）（ＩＲＥ１）、活性化転写因子６（ＡＲＴＦ６）、ＣＡＡＴＴエンハンサー結合タンパク質相同タンパク質（ＣＨＯＰ）、結合免疫グロブリンタンパク質（ＢＩＰ）、カスパーゼ−１２、成長およびＤＮＡ損傷タンパク質３４（ＧＡＤＤ３４）、ＣｒｅＰ（ｅＩＦ２αリン酸化の構成性リプレッサー）、およびＸボックス結合タンパク質−１（ＸＢＰ−１）からなる群から選択される、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記髄鞘形成細胞が前記被験体の中枢神経系または末梢神経系中に位置する、項目１に記載の方法。
（項目８）
神経脱髄の発生後に被験体の神経再髄鞘形成を促進する方法であって、該被験体に再髄鞘形成を生じているニューロン組織中の小胞体（ＥＲ）のストレスレベルを調整するのに有効な量の生物活性剤を投与する工程を含む、方法。
（項目９）
前記生物活性剤が、髄鞘形成細胞中の小胞体（ＥＲ）の持続したストレスレベルを減少させるのに有効である、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記ＥＲの持続したストレスレベルの減少が、小胞体（ＥＲ）ストレスに相関するタンパク質レベルの減少によって特徴づけられる、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記ＥＲストレスに相関するタンパク質が、リン酸化膵臓ＥＲキナーゼ遺伝子（ｐ−ＰＥＲＫ）、真核細胞翻訳開始因子２α（ｅＩＦ−２α）、真核細胞翻訳開始因子β（ｅＩＦ−２β）、イノシトール要求１（ｉｎｏｓｉｔｏｌｒｅｑｕｉｒｉｎｇ１）（ＩＲＥ１）、活性化転写因子６（ＡＲＴＦ６）、ＣＡＡＴＴエンハンサー結合タンパク質相同タンパク質（ＣＨＯＰ）、結合免疫グロブリンタンパク質（ＢＩＰ）、カスパーゼ−１２、成長およびＤＮＡ損傷タンパク質３４（ＧＡＤＤ３４）、ＣｒｅＰ（ｅＩＦ２αリン酸化の構成性リプレッサー）、およびＸボックス結合タンパク質−１（ＸＢＰ−１）からなる群から選択される、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記被験体が脱髄障害を罹患している、項目８に記載の方法。
（項目１３）
前記被験体が多発性硬化症を罹患している、項目８に記載の方法。
（項目１４）
前記被験体が病原体またはウイルスによって負わされた神経脱髄を罹患している、項目８に記載の方法。
（項目１５）
前記生物活性剤がＩＮＦ−γアンタゴニストである、項目８に記載の方法。
（項目１６）
前記インターフェロン−γ（ＩＮＦ−γ）アンタゴニストが抗体またはその抗原結合フラグメントである、項目８に記載の方法。
（項目１７）
前記生物活性剤が、細胞中に存在するｅＩＦ２αキナーゼ活性の増加またはリン酸化ｅＩＦ−２αレベルの増加によってｅＩＦ−２α経路を活性化するのに有効である、項目８に記載の方法。
（項目１８）
前記生物活性剤が、細胞中に存在するＰＥＲＫキナーゼ活性の増加またはリン酸化ＰＥＲＫもしくはＰＥＲＫ二量体レベルの増加によってｅＩＦ−２α経路を活性化するのに有効である、項目８に記載の方法。
（項目１９）
前記生物活性剤が、ＧＡＤＤ３４経路の不活化によってｅＩＦ−２α経路を活性化するのに有効である、項目８に記載の方法。
（項目２０）
前記ＧＡＤＤ３４経路の不活化によってＧＡＤＤ３４シグナル伝達が減少する、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記ＧＡＤＤ３４経路の不活化によって細胞中に存在するＰＰＩ（タンパク質ホスファターゼＩ）のホスファターゼ活性が減少するかＰＰＩレベルが減少する、項目１９に記載の方法。
（項目２２）
治療を必要とする被験体の脱髄障害の進行を改善する方法であって、該被験体における再髄鞘形成またはＩＮＦ−γシグナル伝達を生じている該被験体の神経組織中に存在するインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）レベルを減少させる工程を含む、方法。
（項目２３）
前記ＩＦＮ−γレベルの減少が、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）アンタゴニストから構成される一定量の薬学的組成物を脱髄化病変に送達させることによってもたらされる、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）アンタゴニストが抗体またはその抗原結合フラグメントである、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記被験体が脱髄障害を罹患している、項目２２に記載の方法。
（項目２６）
前記被験体が多発性硬化症を罹患している、項目２２に記載の方法。
（項目２７）
前記被験体が病原体またはウイルスによって負わされた神経脱髄障害を罹患している、項目２２に記載の方法。
（項目２８）
ＩＦＮ−γシグナル伝達の減少が、ＩＦＮ−γの下流シグナル伝達分子またはその生物活性のレベルの減少によってもたらされる、項目２２に記載の方法。
（項目２９）
前記ＩＦＮ−γの下流シグナル伝達分子がＳＯＣＳ１またはＳｔａｔ１を含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記神経脱髄が炎症性因子によって負わされる、項目１に記載の方法。
（項目３１）
前記神経脱髄が炎症性因子によって負わされる、項目８に記載の方法。
（項目３２）
前記被験体が、炎症性因子によって負わされた神経脱髄障害を罹患している、項目２２に記載の方法。
（項目３３）
神経脱髄を減少させる生物活性剤を開発する方法であって、
（ａ）候補薬剤を髄鞘形成細胞と接触させる工程と、
（ｂ）コントロール細胞と比較して遺伝子もしくは遺伝子産物の発現の変化または該遺伝子産物の活性の変化を検出する工程であって、該遺伝子または遺伝子産物が小胞体（ＥＲ）ストレスに相関する、工程と、
（ｃ）該遺伝子もしくは遺伝子産物の発現レベルまたは該遺伝子産物の活性レベルが該コントロール細胞と比較して調整された場合、該薬剤を候補として選択する工程と
を含む、方法。
（項目３４）
前記神経脱髄が、中枢神経系中の乏突起膠細胞の喪失によって特徴づけられる、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記神経脱髄が、神経系中の有髄軸索の減少によって特徴づけられる、項目３３に記載の方法。
（項目３６）
前記神経脱髄が、乏突起膠細胞マーカーまたはシュワン細胞マーカーレベルの減少によって特徴づけられる、項目３３に記載の方法。
（項目３７）
前記マーカーが、ＣＣ１、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、ミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、乏突起膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、ＮＯＧＯ、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）、末梢性ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、タンパク質２（Ｐ２）、ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）、スルファチド、およびプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）からなる群から選択される、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記髄鞘形成細胞が乏突起膠細胞である、項目３３に記載の方法。
（項目３９）
前記髄鞘形成細胞がシュワン細胞である、項目３３に記載の方法。
（項目４０）
前記生物活性剤が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド、抗体、リポソーム、低分子干渉ＲＮＡ、ならびに小さな有機化合物および無機化合物からなる群から選択される、項目３３に記載の方法。
（項目４１）
神経再髄鞘形成を促進する生物活性剤を開発する方法であって、
（ａ）候補生物活性剤を被験体の脱髄病変由来の髄鞘形成細胞と接触させる工程と、
（ｂ）コントロール細胞と比較して遺伝子もしくは遺伝子産物の発現の変化または該遺伝子産物の活性の変化を検出する工程であって、該遺伝子または遺伝子産物が小胞体（ＥＲ）ストレスに相関する、工程と、
（ｃ）該遺伝子もしくは遺伝子産物の発現レベルまたは該遺伝子産物の活性レベルが該コントロール細胞と比較して調整された場合、該薬剤を候補として選択する工程と
を含む、方法。
（項目４２）
前記ＥＲストレスに相関する遺伝子産物が、リン酸化膵臓ＥＲキナーゼ遺伝子（ｐ−ＰＥＲＫ）、真核細胞翻訳開始因子２α（ｅＩＦ−２α）、真核細胞翻訳開始因子β（ｅＩＦ−２β）、イノシトール要求１（ｉｎｏｓｉｔｏｌｒｅｑｕｉｒｉｎｇ１）（ＩＲＥ１）、活性化転写因子６（ＡＲＴＦ６）、ＣＡＡＴＴエンハンサー結合タンパク質相同タンパク質（ＣＨＯＰ）、結合免疫グロブリンタンパク質（ＢＩＰ）、カスパーゼ−１２、成長およびＤＮＡ損傷タンパク質３４（ＧＡＤＤ３４）、ＣｒｅＰ（ｅＩＦ２αリン酸化の構成性リプレッサー）、およびＸボックス結合タンパク質−１（ＸＢＰ−１）からなる群から選択される、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記検出工程が免疫アッセイを含む、項目４１に記載の方法。
（項目４４）
前記検出工程がハイブリッド形成アッセイを含む、項目４１に記載の方法。
（項目４５）
前記生物活性剤が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド、抗体、リポソーム、低分子干渉ＲＮＡ、ならびに小さな有機化合物および無機化合物からなる群から選択される、項目４１に記載の方法。
（項目４６）
前記髄鞘形成細胞が、前記被験体の中枢神経系中の脱髄病変に由来する、項目４１に記載の方法。
（項目４７）
前記乏突起膠細胞が髄鞘形成乏突起膠細胞である、項目４１に記載の方法。
（項目４８）
前記被験体がトランスジェニック動物である、項目４１に記載の方法。
（項目４９）
前記トランスジェニック動物は、（ａ）該動物のゲノムに安定に組み込まれているインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）をコードするトランスジェニックヌクレオチド配列を有する、項目４１に記載の方法。
（項目５０）
前記被験体が、（ａ）前記動物のゲノムに安定に組み込まれているインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）をコードするトランスジェニックヌクレオチド配列を有し、かつ（ｂ）少なくとも１つの他の遺伝子の発現が変化しており、ここで、該ＩＦＮ−γの発現の際に、該動物が、（ａ）の安定に組み込まれたインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）をコードするトランスジェニックヌクレオチド配列を有するトランスジェニック動物と比較して脱髄の程度がより高いが、該少なくとも１つの他の遺伝子の発現の変化を欠いている、項目４１に記載の方法。
（項目５１）
前記少なくとも１つの他の遺伝子が小胞体ストレスと相関する、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記被験体は、膵臓ＥＲキナーゼ遺伝子（ＰＥＲＫ）のヘテロ接合性ノックアウトを含み、前記動物のゲノムにインターフェロン−γ（ＩＮＦ−γ）を含むトランスジェニックヌクレオチド配列が安定に組み込まれている、項目４１に記載の方法。
（項目５３）
非ヒトトランスジェニック動物であって、
（ａ）該動物のゲノムに安定に組み込まれているインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）をコードするトランスジェニックヌクレオチド配列を有し、
（ｂ）少なくとも１つの他の遺伝子の発現が変化しており、
ここで、該ＩＦＮ−γの発現の際に、該動物が、工程（ａ）において見られるようなインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）をコードするトランスジェニックヌクレオチド配列が安定に組み込まれたトランスジェニック動物と比較して脱髄の程度がより高いが、該少なくとも１つの他の遺伝子の発現の変化を欠いている、非ヒトトランスジェニック動物。
（項目５４）
前記少なくとも１つの他の遺伝子が小胞体ストレスと相関する、項目５３に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
（項目５５）
前記動物は、膵臓ＥＲキナーゼ遺伝子（ＰＥＲＫ）のヘテロ接合性ノックアウトを含み、該動物のゲノムにインターフェロン−γ（ＩＮＦ−γ）を含むトランスジェニックヌクレオチド配列が安定に組み込まれている、項目５３に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
（項目５６）
前記動物が、野生型動物と比較してＩＮＦ−γ媒介性神経脱髄に対する脆弱性が増大している、項目５３に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
（項目５７）
前記動物が、野生型動物と比較して該動物の中枢神経系中の乏突起膠細胞が少ない、項目５３に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
（項目５８）
前記インターフェロン−γ（ＩＮＦ−γ）の発現が誘導性である、項目５３に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
（項目５９）
前記インターフェロン−γ（ＩＮＦ−γ）の発現が中枢神経系に異所的に限定される、項目５３に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
（項目６０）
前記動物がインターフェロン−γ（ＩＮＦ−γ）についてヘテロ接合性であり、そして／または前記小胞体ストレスに相関する１つの他の遺伝子についてヘテロ接合性である、項目５３に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
（項目６１）
前記動物がインターフェロン−γ（ＩＮＦ−γ）についてホモ接合性であり、そして／または前記小胞体ストレスに相関する１つの他の遺伝子についてヘテロ接合性である、項目５３に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
（項目６２）
前記小胞体ストレスに相関する１つの他の遺伝子が、膵臓ＥＲキナーゼ遺伝子（ＰＥＲＫ）、真核細胞翻訳開始因子２α（ｅＩＦ−２α）、真核細胞翻訳開始因子β（ｅＩＦ−２β）、イノシトール要求５３（ＩＲＥ１）、活性化転写因子６（ＡＲＴＦ６）、ＣＡＡＴＴエンハンサー結合タンパク質相同タンパク質（ＣＨＯＰ）、結合免疫グロブリンタンパク質（ＢＩＰ）、カスパーゼ−１２、成長およびＤＮＡ損傷タンパク質３４（ＧＡＤＤ３４）、ＣｒｅＰ（ｅＩＦ２αリン酸化の構成性リプレッサー）、サイトカインシグナル伝達のサプレッサー１（ＳＯＣＳ１）、およびＸボックス結合タンパク質−１（ＸＢＰ−１）からなる群から選択される、項目５３に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
（項目６３）
前記１つの他の遺伝子が内因性遺伝子である、項目５３に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
（項目６４）
前記１つの他の遺伝子が外因性遺伝子である、項目５３に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
（項目６５）
前記動物が、哺乳動物、霊長類、およびげっ歯類からなる群から選択される、項目５３に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
（項目６６）
前記動物が、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、チンパンジー、およびサルからなる群から選択される、項目５３に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
（項目６７）
前記少なくとも１つの他の遺伝子の変化は、該１つの他の遺伝子の破壊に起因する、項目５３に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
（項目６８）
項目５３に記載の非ヒトトランスジェニック動物の細胞であって、該細胞は、インターフェロン−γ（ＩＮＦ−γ）をコードする導入遺伝子が該細胞のゲノムに安定に組み込まれ、ＥＲストレスに相関するタンパク質をコードする少なくとも１つの他の遺伝子が変化している、細胞。
（項目６９）
前記細胞が前記動物の神経系に由来する、項目６８に記載の細胞。
（項目７０）
前記細胞が乏突起膠細胞またはシュワン細胞である、項目６８に記載の細胞。
（項目７１）
脱髄障害に関連する現象を調整する生物活性剤を試験する方法であって、
（ａ）候補薬剤を項目１に記載の非ヒトトランスジェニック動物に投与する工程であって、ＩＦＮ−γ発現の際に該動物において脱髄が起こる、工程と、
（ｂ）脱髄障害に関連する現象に及ぼす該薬剤の影響を決定する工程と
を含む、方法。
（項目７２）
前記脱髄障害に関連する現象が、前記動物の神経系中の乏突起膠細胞またはシュワン細胞の喪失によって特徴づけられる、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
前記脱髄障害に関連する現象が、前記神経系中の有髄軸索の減少によって特徴づけられる、項目７１に記載の方法。
（項目７４）
前記脱髄障害に関連する現象が、乏突起膠細胞マーカーまたはシュワン細胞マーカーレベルの減少によって特徴づけられる、項目７１に記載の方法。
（項目７５）
前記乏突起膠細胞またはシュワン細胞マーカーが、ＣＣ１、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、ミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、乏突起膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、ＮＯＧＯ、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）、末梢性ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、タンパク質２（Ｐ２）、ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）、スルファチド、およびプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）からなる群から選択される、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
前記脱髄障害が多発性硬化症である、項目７１に記載の方法。
（項目７７）
前記脱髄障害が、病原体または物理的損傷によって負わされる、項目７１に記載の方法。
（項目７８）
前記脱髄障害に関連する現象に及ぼす薬剤の影響の決定が免疫アッセイを含む、項目７１に記載の方法。
（項目７９）
前記脱髄障害に関連する現象に及ぼす薬剤の影響の決定がハイブリッド形成アッセイを含む、項目７１に記載の方法。
（項目８０）
前記生物活性剤が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド、抗体、リポソーム、低分子干渉ＲＮＡ、ならびに小さな有機化合物および無機化合物からなる群から選択される、項目７１に記載の方法。
（項目８１）
脱髄障害に関連する現象を調整する生物活性剤を試験する方法であって、
（ａ）候補薬剤を項目１に記載の非ヒトトランスジェニック動物由来の細胞と接触させる工程と、
（ｂ）コントロール細胞と比較して遺伝子もしくは遺伝子産物の発現の変化または該遺伝子産物の活性の変化を検出する工程であって、該遺伝子または遺伝子産物が小胞体（ＥＲ）ストレスに相関する、工程と、
（ｃ）該遺伝子もしくは遺伝子産物の発現レベルまたは該遺伝子産物の活性レベルが該コントロール細胞と比較して調整された場合、脱髄障害に関連する現象を調整するのに有効であるとして該薬剤を選択する工程と
を含む、方法。
（項目８２）
前記神経脱髄に関連する現象が、前記動物の中枢神経系または末梢神経中の乏突起膠細胞またはシュワン細胞の喪失によってそれぞれ特徴づけられる、項目８１に記載の方法。
（項目８３）
前記神経脱髄に関連する現象が、前記動物の神経系中の有髄軸索の減少によって特徴づけられる、項目８１に記載の方法。
（項目８４）
前記神経脱髄に関連する現象が、乏突起膠細胞マーカーまたはシュワン細胞マーカーレベルの減少によって特徴づけられる、項目８１に記載の方法。
（項目８５）
前記乏突起膠細胞またはシュワン細胞マーカーが、ＣＣ１、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）、およびプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）からなる群、ＣＣ１、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、ミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、乏突起膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、ＮＯＧＯ、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）、末梢性ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、タンパク質２（Ｐ２）、ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）、スルファチド、およびプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）からなる群から選択される、項目８４に記載の方法。
（項目８６）
前記脱髄障害が多発性硬化症である、項目８１に記載の方法。
（項目８７）
前記脱髄障害が、病原体またはウイルスによって負わされる、項目８１に記載の方法。
（項目８８）
前記脱髄障害に関連する現象に及ぼす薬剤の影響の決定が免疫アッセイを含む、項目８１に記載の方法。
（項目８９）
前記脱髄障害に関連する現象に及ぼす薬剤の影響の決定がハイブリッド形成アッセイを含む、項目８１に記載の方法。
（項目９０）
前記生物活性剤が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド、抗体、リポソーム、低分子干渉ＲＮＡ、ならびに小さな有機化合物および無機化合物からなる群から選択される、項目８１に記載の方法。
（項目９１）
脱髄障害に関連する現象を調整する生物活性剤を試験する方法であって、
（ａ）（ｉ）試験動物の神経脱髄の誘導、および（ｉｉ）該試験動物を脱髄病変の再髄鞘形成が示されるのに十分な時間脱髄誘導から回復させることを含む方法によって得られた該試験動物に候補生物活性剤を投与する工程と、
（ｂ）脱髄障害に関連する現象に及ぼす該薬剤の影響を決定する工程と
を含む、方法。
（項目９２）
前記試験動物がトランスジェニック動物である、項目９１に記載の方法。
（項目９３）
前記試験動物が、（ａ）インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）をコードするトランスジェニックヌクレオチド配列が該動物のゲノムに安定に組み込まれており、かつ（ｂ）少なくとも１つの他の遺伝子の発現が変化している、トランスジェニック動物であり、ここで、該ＩＦＮ−γの発現の際に、該動物が、（ａ）インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）をコードするトランスジェニックヌクレオチド配列が安定に組み込まれたトランスジェニック動物と比較して脱髄の程度がより高いが、該少なくとも１つの他の遺伝子の発現の変化を欠いている、項目９２に記載の方法。
（項目９４）
前記少なくとも１つの他の遺伝子が小胞体ストレスと相関する、項目９３に記載の方法。
（項目９５）
前記動物は、膵臓ＥＲキナーゼ遺伝子（ＰＥＲＫ）のヘテロ接合性ノックアウトを含み、該動物のゲノムにインターフェロン−γ（ＩＮＦ−γ）を含むトランスジェニックヌクレオチド配列が安定に組み込まれている、項目９１に記載の方法。
（項目９６）
前記ＥＲストレスに相関するタンパク質が、リン酸化膵臓ＥＲキナーゼ遺伝子（ｐ−ＰＥＲＫ）、真核細胞翻訳開始因子２α（ｅＩＦ−２α）、真核細胞翻訳開始因子β（ｅＩＦ−２β）、イノシトール要求１（ＩＲＥ１）、活性化転写因子６（ＡＲＴＦ６）、ＣＡＡＴＴエンハンサー結合タンパク質相同タンパク質（ＣＨＯＰ）、結合免疫グロブリンタンパク質（ＢＩＰ）、カスパーゼ−１２、成長およびＤＮＡ損傷タンパク質３４（ＧＡＤＤ３４）、ＣｒｅＰ（ｅＩＦ２αリン酸化の構成性リプレッサー）、Ｘボックス結合タンパク質−１（ＸＢＰ−１）、成長およびＤＮＡ損傷タンパク質３４（ＧＡＤＤ３４）、ＣｒｅＰ（ｅＩＦ２αリン酸化の構成性リプレッサー）、およびＸボックス結合タンパク質−１（ＸＢＰ−１）からなる群から選択される、項目９４に記載の方法。
（項目９７）
前記脱髄障害に関連する現象が、前記動物の神経系中の乏突起膠細胞またはシュワン細胞の喪失によって特徴づけられる、項目９１に記載の方法。
（項目９８）
前記脱髄障害に関連する現象が、前記動物の神経系中の有髄軸索の減少によって特徴づけられる、項目９１に記載の方法。
（項目９９）
前記脱髄障害に関連する現象が、乏突起膠細胞またはシュワン細胞マーカーレベルの減少によって特徴づけられる、項目９１に記載の方法。
（項目１００）
前記乏突起膠細胞またはシュワン細胞マーカーが、ＣＣ１、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、ミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、乏突起膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、ＮＯＧＯ、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）、末梢性ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、タンパク質２（Ｐ２）、ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）、スルファチド、およびプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）からなる群から選択される、項目９１に記載の方法。
（項目１０１）
前記脱髄障害が多発性硬化症である、項目９１に記載の方法。
（項目１０２）
前記脱髄障害が、病原体またはウイルスによって負わされる、項目９１に記載の方法。
（項目１０３）
前記脱髄障害に関連する現象に及ぼす薬剤の影響の決定が免疫アッセイを含む、項目９１に記載の方法。
（項目１０４）
前記脱髄障害に関連する現象に及ぼす薬剤の影響の決定がハイブリッド形成アッセイを含む、項目９１に記載の方法。
（項目１０５）
前記生物活性剤が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド、抗体、リポソーム、低分子干渉ＲＮＡ、ならびに小さな有機化合物および無機化合物からなる群から選択される、項目９１に記載の方法。
（項目１０６）
前記生物活性剤が、脱髄病変の再髄鞘形成の促進に有効である、項目９１に記載の方法。
（項目１０７）
前記生物活性剤が、髄鞘を再形成する乏突起膠細胞における小胞体ストレスに特徴的なタンパク質レベルの調整で有効である、項目９１に記載の方法。

図１は、二重トランスジェニックマウス（ＧＦＡＰ／ｔＴＡ、ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ）のＩＦＮ−γ発現パターンのＥＬＩＳＡ分析の結果を示す。（Ａ）クプリゾンで処置した二重トランスジェニックマウスの前脳中のＩＦＮ−γタンパク質発現のＥＬＩＳＡ分析（ｎ＝２）。（Ｂ）クプリゾンで処置した二重トランスジェニックマウスの脳梁中のＭＨＣ−Ｉ発現のリアルタイムＰＣＲ分析（ｎ＝３）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。図２は、クプリゾンで処置した二重トランスジェニックマウスの脳梁中の孔ＣＣ１抗体での成熟乏突起膠細胞の免疫染色の比較結果を示す。（Ａ）ＣＣ１免疫染色（赤色蛍光）によって検出した成熟乏突起膠細胞は、ＤＯＸ＋およびＤＯＸ−二重トランスジェニックマウスの両方で５週間までに枯渇するようになった。回復中の乏突起膠細胞の再生は、８週目のＤＯＸ−二重トランスジェニックマウスで顕著に減少した。青色蛍光は、ＤＡＰＩ対比染色を示す（ｎ＝３、スケールバー＝２５μＭ）。（Ｂ）クプリゾンで処置した二重トランスジェニックマウスの脳梁中のＣＣ１陽性細胞数（ｎ＝３、＊ｐ＜０．０１）。図３は、ＤＯＸ＋およびＤＯＸ−二重トランスジェニックマウスの両方の脳梁の免疫組織化学的分析および電子顕微鏡分析の結果を示す。（Ａ）ＭＢＰ免疫染色は、ＩＦＮ−γの存在が５週目にクプリゾン誘導性脱髄に影響を及ぼさず、８週目に再髄鞘形成を抑制したことを示した（ｎ＝４、スケールバー＝５０μｍ）。（Ｂ）ＭＢＰ免疫染色についての髄鞘形成スコア（成体雄マウスの完全な脱髄は０であり、正常な髄鞘形成は４である、ｎ＝４、＊ｐ＜０．０１）。図４Ａ。ＥＭ分析によって脱髄および再髄鞘形成を評価した（ｎ＝４）（スケールバー＝０．５μＭ）。（Ｂ）再髄鞘形成した軸索の比率を、８週目の４匹のマウスから計算した（＊ｐ＜０．０１）。図５は、８週間にわたるＤＯＸ＋およびＤＯＸ−二重トランスジェニックマウスにおけるＭＢＰ、ＰＬＰ、およびＣＧＴの相対的ＲＮＡレベルを示すリアルタイムＰＣＲの結果を示す。クプリゾンで処置したマウスの脳梁中のミエリン遺伝子の発現パターン（ｎ＝３）を得た。（Ａ）ＭＢＰの相対的ｍＲＮＡレベルのリアルタイムＰＣＲ分析（＊ｐ＜０．０５）。（Ｂ）ＰＬＰの相対的ｍＲＮＡレベルのリアルタイムＰＣＲ分析（＊ｐ＜０．０５）。（Ｃ）ＣＧＴの相対的ｍＲＮＡレベルのリアルタイムＰＣＲ分析（＊ｐ＜０．０５）。図６は、クプリゾンで処置したＤＯＸ＋およびＤＯＸ−マウスの脳梁中のＮＧ２陽性ＯＰＣの免疫染色を示す。（Ａ）６週目および（Ｂ）８週目のＤＯＸ＋二重トランスジェニックマウスの脳梁中のＮＧ２免疫染色。（Ｃ）６週目および（Ｄ）８週目のＤＯＸ−二重トランスジェニックマウスの脳梁中のＮＧ２免疫染色。赤色蛍光は、ＮＧ２免疫反応性を示す。青色蛍光は、ＤＡＰＩでの対比染色を示す。スケールバー＝２４μｍ。（Ｅ）クプリゾンで処置したマウスの脳梁中のＮＧ２陽性細胞（ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５）。図７は、障害の発症および障害からの回復中のＤＯＸ−およびＤＯＸ＋ＥＡＥを羅患したマウスについての臨床スコアを示す。ＥＡＥの回復段階でのＩＦＮ−γのＣＮＳ送達により、疾患の回復が遅延する。平均臨床スコア、各遺伝子型についてｎ＝２５。図８は、ＰＩＤ５０でのＥＡＥからの回復中のＣＮＳに及ぼすＩＦＮ−γの影響を示す。特に、ＥＡＥの回復段階でのＩＦＮ−γのＣＮＳ送達により、ＰＩＤ５０でのさ再髄鞘形成が阻害される。（Ａ）ＤＯＸ＋マウスの腰髄中のＭＢＰ免疫染色。（Ｂ）ＰＩＤ７でのドキシサイクリンから放出されたＤＯＸ−マウスの腰髄中のＭＢＰ免疫染色。（Ｃ）ＤＯＸ＋マウスの腰髄中のトルイジンブルー染色。（Ｄ）ＰＩＤ７でのドキシサイクリンから放出されたＤＯＸ−マウスの腰髄中のトルイジンブルー染色。（Ｅ）ＤＯＸ＋マウスの腰髄中のＣＣ１染色。（Ｆ）ＰＩＤ７でのドキシサイクリンから放出されたＤＯＸ−マウスの腰髄中のＣＣ１染色。（Ｇ）ＤＯＸ＋マウスの腰髄中の非リン酸化神経フィラメント−Ｈ免疫染色。（Ｈ）ＰＩＤ７でのドキシサイクリンから放出されたＤＯＸ−マウスの腰髄中の非リン酸化神経フィラメント−Ｈ免疫染色。パネルＡおよびＢのスケールバー＝５０μｍ、パネルＣ〜Ｈのスケールバー＝２５μＭ。パネルＥおよびＦ中の赤色蛍光は、ＣＣ１免疫反応性を反映し、青色蛍光は、ＤＡＰＩ対比染色を示す。実験を三連で行った。図９は、ＥＡＥを罹患したマウスのＣＮＳ中の脱髄病変中の炎症性浸潤を示す。ＥＡＥの回復段階でのＩＦＮ−γのＣＮＳ送達により、脱髄病変における炎症性浸潤が増強される。（Ａ）ＤＯＸ＋マウスの腰髄中のＣＤ３免疫染色。（Ｂ）ＰＩＤ７でのドキシサイクリンから放出されたＤＯＸ−マウスの腰髄中のＣＤ３免疫染色。（Ｃ）ＤＯＸ＋マウスの腰髄中のＣＤ１１ｂ免疫染色。（Ｄ）ＰＩＤ７でのドキシサイクリンから放出されたＤＯＸ−マウスの腰髄中のＣＤ１１ｂ免疫染色。（Ｅ）ＰＩＤ５０でのＤＯＸ＋およびＤＯＸ−マウスの腰髄中の炎症性マーカーの発現のリアルタイムＰＣＲ分析。実験を三連で行った（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。図１０は、再髄鞘形成中のＥＲストレスマーカーの発現に及ぼすＩＦＮ−γの影響を示す。クプリゾンを用いて脱髄が誘導されたＤＯＸ＋およびＤＯＸ−マウスの腰髄中の（Ａ）ＢＩＰｍＲＮＡおよび（Ｂ）ＣＨＯＰｍＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ分析（ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５）。（Ｃ）（Ａ）のＤＯＸ＋およびＤＯＸ−マウスの腰髄中のアクチンと比較したＣＨＯＰ、ｐ−ｅＩＦ−１α、ｅＩＦ−２αの発現のウェスタンブロット分析。（Ｄ）８週目のＤＯＸ＋マウス（Ｄ）およびＤＯＸ−マウス（Ｅ）の腰髄中のＣＣ１およびｐ−ｅＩＦ−２αの二重免疫染色。パネルＤおよびＥ：ｎ＝３、スケールバー＝１０μｍ；赤色蛍光はＣＣ１免疫反応性を反映し、緑色蛍光はｐ−ｅＩＦ−２α免疫反応性を反映する。再髄鞘形成に及ぼすＩＦＮ−γの有害な影響は、ＥＲストレスに関連する。図１１は、ＰＥＲＫ酵素の変異について野生型またはヘテロ接合性であるＤＯＸ＋およびＤＯＸ−マウス（ＰＥＲＫ＋／−）の腰髄中の再髄鞘形成状態の比較を示す。（Ａ）９週目の腰髄中の電子顕微鏡写真（ｎ＝５、スケールバー＝０．５μｍ）。（Ｂ）９週目の５匹のマウスにおける再有髄軸索の比率を示すグラフである（＊ｐ＜０．０１）。図１２は、ＰＥＲＫ酵素の変異について野生型またはヘテロ接合性であるＤＯＸ＋およびＤＯＸ−マウス（ＰＥＲＫ＋／−）の腰髄中の乏突起膠細胞数の比較を示す。（Ａ）９週目のマウスにおけるＣＣ１乏突起膠細胞の免疫染色。赤色蛍光はＣＣ１細胞を反映し、青色染色はＤＡＰＩ対比染色である（ｎ＝５、スケールバー＝２５μＭ）。（Ｂ）９週目のマウスにおけるＣＣ１陽性乏突起膠細胞数を示すグラフ（ｎ＋５、＊ｐ＜０．０１）。（Ｃ）９週目のマウスにおけるＣＣ１およびカスパーゼ−３陽性乏突起膠細胞数を示すグラフ（ｎ＝５、＊ｐ＜０．０５）。図１３は、培養ラット乏突起膠細胞におけるＩＦＮ−γ誘導性アポトーシスがＥＲストレスに関連することを示す。（Ａ）７日間分化した未処置乏突起膠細胞。（Ｂ）５日間分化し、７０Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γで４８時間処置した乏突起膠細胞（細胞の縮みおよび細胞体の凝集が明らかとなった（矢印））。（Ｃ）７日間分化した未処置乏突起膠細胞のＴＵＮＥＬおよびＣＮＰ二重標識。（Ｄ）５日間分化し、７０Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γで４８時間処置した乏突起膠細胞のＴＵＮＥＬおよびＣＮＰ二重標識。（Ｅ）ＴＵＮＥＬおよびＣＮＰアーゼ二重陽性細胞の定量（＊ｐ＜０．０５）。（Ｆ）乏突起膠細胞溶解物におけるカスパーゼ−３活性のアッセイ（＊ｐ＜０．０１）。（Ｇ）７０Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γで処置したＢＩＰ、ＣＨＯＰ、およびカスパーゼ−１２の発現のリアルタイムＰＣＲ分析（＊ｐ＜０．０５）。（Ｈ）７０Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γで処置した総ｅＩＦ−２α、ｐ−ｅＩＦ−２α、およびカスパーゼ−１２のウェスタンブロット分析。全実験を、少なくとも３回繰り返した。パネルＡおよびＢ中のスケールバー＝３０μＭ、パネルＣおよびＤ中のスケールバー＝２０μＭ。図１４は、異所的に発現したＩＦＮ−γによって誘導された髄鞘低形成がＥＲストレスに関連することを示す。（Ａ）ＩＦＮ−γを異所的に発現する１４日齢マウスの脳内のｍＲＮＡの検出のためのリアルタイムＰＣＲ分析（ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。Ｅ１４でドキシサイクリンから放出された１４日齢二重トランスジェニックマウスのＣＮＳ中のカスパーゼ−１２についてのウェスタンブロット分析。（Ｃ）ドキシサイクリンを投与した１４日齢の二重トランスジェニックマウスの脊髄中のＢＩＰおよびＣＣ１二重免疫染色。（Ｄ）Ｅ１４でドキシサイクリンから放出された１４日齢二重トランスジェニックマウスの脊髄中のＢＩＰおよびＣＣ１二重免疫染色。（Ｅ）ドキシサイクリンを投与した１４日齢の二重トランスジェニックマウスの脊髄中のｐ−ｅＩＦ−２αおよびＣＣ１二重免疫染色。（Ｆ）Ｅ１４でドキシサイクリンから放出された１４日齢二重トランスジェニックマウスの脊髄中のｐ−ｅＩＦ−２αおよびＣＣ１二重免疫染色。（Ｇ）ドキシサイクリンを投与した１４日齢の二重トランスジェニックマウスの脊髄中のカスパーゼ−１２およびＣＣ１二重免疫染色。（Ｈ）Ｅ１４でドキシサイクリンから放出された１４日齢二重トランスジェニックマウスの脊髄中のカスパーゼ−１２およびＣＣ１二重免疫染色。パネルＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、およびＨ：ｎ＝３、スケールバー＝３０μＭ図１５は、ＩＦＮ−γの条件付き異所性発現に対するＰＥＲＫ＋／−マウスの過敏症を示す。（Ａ）マウス生存曲線（各群についてｎ＝４０）。（ＢおよびＣ）（Ｂ）ドキシサイクリンを投与したか、（Ｃ）Ｅ１４でドキシサイクリンから放出された１４日齢のＧＦＡＰ／ｔＴＡ；ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ；ＰＥＲＫ＋／−マウスの脊髄中のｐ−ｅＩＦ−２αおよびＣＣ１二重標識。（ＢおよびＣ）ｎ＝３；バー、３０μＭ。（Ｄ）１４日齢マウスの脳内のｍＲＮＡレベルのリアルタイムＰＣＲ分析（ｎ＝３）。エラーバーは、標準偏差を示す。図１６は、ＰＥＲＫ＋／−バックグラウンドを有する二重トランスジェニックマウスが重症髄鞘低形成を発症することを示す。（Ａ）ドキシサイクリンを投与した１４日齢の二重トランスジェニックマウスの脊髄中のＭＢＰ免疫染色。（Ｂ）ドキシサイクリンを投与した１４日齢のＧＦＡＰ／ｔＴＡ；ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ；ＰＥＲＫ＋／−マウスの脊髄中のＭＢＰ免疫染色。（Ｃ）Ｅ１４でドキシサイクリンから放出された１４日齢の二重トランスジェニックマウスの脊髄中のＭＢＰ免疫染色。（Ｄ）Ｅ１４でドキシサイクリンを投与した１４日齢のＧＦＡＰ／ｔＴＡ；ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ；ＰＥＲＫ＋／−マウスの脊髄中のＭＢＰ免疫染色。パネルＡ、Ｂ、ＣおよびＤ：ｎ＝３、スケールバー＝１５０μＭ。図１７は、ＰＥＲＫ＋／−バックグラウンドを有する二重トランスジェニックマウスが重症髄鞘低形成を発症することを示す。（Ａ）ドキシサイクリンを投与した１４日齢の二重トランスジェニックマウスの脊髄中の正常な髄鞘形成を示す超微細構造試験。（Ｂ）ドキシサイクリンを投与した１４日齢のＧＦＡＰ／ｔＴＡ；ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ；ＰＥＲＫ＋／−マウスの脊髄中の正常な髄鞘形成を示す超微細構造試験。（Ｃ）Ｅ１４でドキシサイクリンから放出された１４日齢の二重トランスジェニックマウスの脊髄中に軽度の髄鞘低形成を示す超微細構造試験。（Ｄ）Ｅ１４でドキシサイクリンから放出された１４日齢のＧＦＡＰ／ｔＴＡ；ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ；ＰＥＲＫ＋／−マウスの脊髄中に重症髄鞘低形成を示す超微細構造試験。パネルＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤ：ｎ＝３、スケールバー＝１μＭ。（Ｅ）頸髄の白質中の非有髄軸索の比率を、測定点あたり３匹のマウスから計算した（＊ｐ＜０．０１）。図１８は、ＭＢＰ、ＰＬＰ、およびＣＧＴのｍＲＮＡレベルがＰＥＲＫ＋／−バックグラウンドを有する二重トランスジェニックマウスのＣＮＳ中で顕著に減少したことを示す。１４日齢マウスの脳内のミエリン遺伝子発現についてのリアルタイムＰＣＲ分析（ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５）。図１９は、ＰＥＲＫ＋／−バックグラウンドを有する二重トランスジェニックマウスがＣＮＳ中の大部分の乏突起膠細胞が喪失することを示す。（Ａ）１４日齢マウスのＣＮＳ中のＣＣ１陽性細胞の定量（ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５）。（Ｂ）ドキシサイクリンを投与した１４日齢の二重トランスジェニックマウスの脊髄中のＴＵＮＥＬおよびＣＣ１二重標識。（Ｃ）ドキシサイクリンを投与した１４日齢のＧＦＡＰ／ｔＴＡ；ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ；ＰＥＲＫ＋／−マウスの脊髄中のＴＵＮＥＬおよびＣＣ１二重標識。（Ｄ）Ｅ１４でドキシサイクリンから放出された１４日齢の二重トランスジェニックマウスの脊髄中のＴＵＮＥＬおよびＣＣ１二重標識。（Ｅ）Ｅ１４でドキシサイクリンから放出された１４日齢のＧＦＡＰ／ｔＴＡ；ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ；ＰＥＲＫ＋／−マウスの脊髄中のＴＵＮＥＬおよびＣＣ１二重標識。パネルＢ、Ｃ、Ｄ、およびＥ：ｎ＝３；スケールバー＝６０μＭ；赤色蛍光はＣＣ１免疫反応性を示し、緑色蛍光はＴＵＮＥＬ染色を示し、青色蛍光はＤＡＰＩ対比染色を示す。（Ｆ）１４日齢マウスの脊髄中のＣＣ１二重陽性細胞のＴＵＮＥＬの定量（ｎ＝３、＊ｐ＜０．０１）。（Ｇ）高度に凝縮されたクロマチン塊、インタクトな膜、縮んだ細胞質、およびアポトーシス体を含むアポトーシス乏突起膠細胞を示す超微細構造試験。図２０は、成体マウスの乏突起膠細胞が幼若マウスからの乏突起膠細胞の能動的髄鞘形成よりもＩＦＮ−γに対する感受性が低いことを示す。（Ａ）１０週齢マウスの脳内のｍＲＮＡレベルのリアルタイムＰＣＲ分析（ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５）。（Ｂ）ドキシサイクリンを投与した１０週齢の二重トランスジェニックマウスの小脳中のＢＩＰおよびＣＣ１二重免疫染色。（Ｃ）ドキシサイクリンを投与した１０週齢のＧＦＡＰ／ｔＴＡ；ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ；ＰＥＲＫ＋／−マウスの小脳中のＢＩＰおよびＣＣ１二重免疫染色。（Ｄ）４週齢でドキシサイクリンから放出された１０週齢の二重トランスジェニックマウスの小脳中のＢＩＰおよびＣＣ１二重免疫染色。（Ｅ）４週齢でドキシサイクリンから放出された１０週齢のＧＦＡＰ／ｔＴＡ；ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ；ＰＥＲＫ＋／−マウスの小脳中のＢＩＰおよびＣＣ１二重免疫染色。パネルＢ、Ｃ、Ｄ、およびＥ：ｎ＝３、スケールバー＝６０μＭ。赤色蛍光はＣＣ１免疫反応性を示し、緑色蛍光はＢＩＰ染色を示し、青色蛍光はＤＡＰＩ対比染色を示す。（Ｆ）ドキシサイクリンを投与した１０週齢の二重トランスジェニックマウスの小脳中に正常な髄鞘形成を示す超微細構造試験。（Ｇ）ドキシサイクリンを投与した１０週齢のＧＦＡＰ／ｔＴＡ；ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ；ＰＥＲＫ＋／−マウスの小脳中に正常な髄鞘形成を示す超微細構造試験。（Ｈ）４週齢でドキシサイクリンから放出された１０週齢の二重トランスジェニックマウスの小脳中に正常な髄鞘形成を示す超微細構造試験。（Ｉ）４週齢でドキシサイクリンから放出された１０週齢のＧＦＡＰ／ｔＴＡ；ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ；ＰＥＲＫ＋／−マウスの脊髄中に正常な髄鞘形成を示す超微細構造試験。パネルＦ、Ｇ、Ｈ、およびＩ：ｎ＝３、スケールバー＝２μＭ。図２１は、ＰＥＲＫ酵素の変異について野生型（ＤＯＸ三重；ＰＥＲＫ＋／＋）またはヘテロ接合性（ＤＯＸ三重；ＰＥＲＫ＋／−）であるＤＯＸ＋およびＤＯＸ−マウスにおけるＥＡＥの発症および進行の比較を示す。（Ａ）ＥＡＥを罹患しているか罹患していないマウスについての平均臨床スコアの変化。（ＢおよびＣ）免疫化後（ＰＩＤ）１４、１７、および２２日目のマウスにおけるＩＦＮ−γおよびＴ−ＩＮＦの発現についてのリアルタイムＰＣＲ分析。＊ｐ＜０．０１〜０．０５、スチューデントｔ検定；ｎ＝２。エラーバーは、標準偏差を示す。図２２は、ＰＩＤ１４でのＥＡＥを罹患したＤＯＸ＋およびＤＯＸ−マウスの脊髄中のｉＮＯＳ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１０、ＩＬ−２３、およびＩＬ−５の発現についてのリアルタイムＰＣＲ分析野結果を示す。＊ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定、ｎ＝４。図２３は、ＥＡＥ発症時のＩＦＮ−γのＣＮＳ送達によってＰＥＲＫ経路に依存するＥＡＥ誘導性脱髄が防御されることを示す。（Ａ）腰髄組織のＭＢＰ免疫染色は、ＩＦＮ−γのＣＮＳ送達によって免疫化後１７日目（ＰＩＤ１７）でＰＥＲＫ＋／＋バックグラウンドを有するマウスにおいてＥＡＥ誘導性脱髄が防御されることを示した。対照的に、コントロールマウスと比較して、ＰＩＤ１７でＤＯＸ−三重マウスの腰髄中でより重篤な脱髄が検出された。Ｎ＝３、スケールバー＝５０μＭ。（Ｂ）トルイジンブルー染色により、ＤＯＸ−二重マウスの脊髄中のミエリンおよび軸索がＰＩＤ１７でほとんどインタクトなままであることが明らかになった。対照的に、ＰＥＲＫ＋／−バックグラウンドを有するマウスの腰髄中の脱髄および軸索損傷は、ＩＦＮ−γのＣＮＳ送達によってＰＩＤ１７までに防止されなかった。Ｎ＝３、スケールバー＝１０μＭ。（Ｃ）ＣＣ１免疫染色は、ＤＯＸ−二重マウスの腰髄中の乏突起膠細胞がＰＩＤ１７にほとんどインタクトなままであることを示した。対照的に、コントロールマウスと同様に、ＤＯＸ−三重マウスは、ＰＩＤ１７に腰髄中の乏突起膠細胞の大部分を喪失した。Ｎ＝３、スケールバー＝２５μＭ。（Ｄ）ＰＩＤ１７での脊髄中の相対ＭＢＰｍＲＮＡレベルのリアルタイムＰＣＲ分析。１００％は、年齢適合ナイーブマウスの脊髄中のＭＢＰｍＲＮＡレベルを示す（ｎ＝３）。エラーバーは、標準偏差を示す。図２４は、ＩＦＮ−γが乏突起膠細胞に及ぼす細胞防御効果によってＥＡＥ誘導性脱髄を防御したことを示す。Ａ．ＣＤ３免疫染色は、ＩＦＮ−γのＣＮＳ送達によってＰＩＤ１７でＰＥＲＫ＋／＋バックグラウンドのマウスの腰髄中のＴ細胞浸潤が減少するが、ＰＥＲＫ＋／−バックグラウンドのマウスではＴ細胞浸潤に有意な影響を及ぼさないことを示した。Ｎ＝３、スケールバー＝５０μＭ。Ｂ．ＣＤ１１ｂ免疫染色により、ＩＦＮ−γのＣＮＳ送達によってＰＩＤ１７でＰＥＲＫ＋／＋およびＰＥＲＫ＋／−バックグラウンドのマウスの腰髄中のＣＤ１１ｂ陽性単球の浸潤パターンを有意に変化されないことが明らかとなった。Ｎ＝３、スケールバー＝５０μＭ。Ｃ．およびＤ．ＣＤ３免疫染色は、ＩＦＮ−γのＣＮＳ送達によってＰＩＤ１４で腰髄中のＴ細胞浸潤に影響を及ぼさないことを示した。図２５は、疾患のピークにおける脊髄中のサイトカインの発現パターンについてのリアルタイムＰＣＲ分析を示す。（Ａ）ＩＦＮ−γのＣＮＳ送達は、ｉＮＯｓの発現は有意に影響を及ぼさなかった。（Ｂ）ＩＦＮ−γのＣＮＳ送達は、ＩＮＦ−γ発現に有意に影響を及ぼさなかった。（Ｃ）ＩＦＮ−γのＣＮＳ送達は、ＰＥＲＫ＋／＋バックグラウンドのマウスの脊髄中のＩＬ−２発現を減少させたが、ＰＥＲＫ＋／−バックグラウンドのマウスにおいてＩＬ−１２発現を変化させなかった。（Ｄ）ＩＦＮ−γのＣＮＳ送達は、ＰＥＲＫ＋／＋バックグラウンドのマウスの脊髄中のＩＬ−２発現を減少させたが、ＰＥＲＫ＋／−バックグラウンドのマウスにおいてＩＬ−１２発現を変化させなかった。（Ｅ）ＩＦＮ−γのＣＮＳ送達は、ＰＥＲＫ＋／＋バックグラウンドのマウスの脊髄中のＩＬ−２３発現を減少させたが、ＰＥＲＫ＋／−バックグラウンドのマウスにおいてＩＬ−１２発現を変化させなかった。（Ｆ）ＩＦＮ−γのＣＮＳ送達は、ＩＬ−５発現に有意に影響を及ぼさなかった。ＩＦＮ−γのＣＮＳ送達は、ＩＬ−１０発現に有意に影響を与えなかった。全パネル：ｎ＝３。エラーバーは、標準偏差を示す。＊ｐ＜０．０５。ＩＦＮ−γのＣＮＳ送達は、ＩＬ−１０発現に有意に影響を及ぼさなかった。全パネル：ｎ＝３。エラーバーは、標準偏差を示す。＊ｐ＜０．０５。図２６は、同腹仔コントロールマウスでの発症と場合にＧＡＤＤ３４−ヌルマウスにおける臨床的疾患が遅延することを示す。平均臨床的疾患重症度スコア、ｎ＝６。図２７は、ＧＡＤＤ３４機能の喪失の影響についての二重標識免疫組織化学的分析を示す。（ａ）ＧＡＤＤ３４は、８週齢のナイーブマウスの脊髄由来の乏突起膠細胞中で検出できなかった。（ｂ）矢印は、ＰＩＤ１７でＥＡＥを罹患したコントロールマウスの乏突起膠細胞中で上方制御されたＧＡＤＤ３４を指し示す（スケールバー＝１５μｍ、ｎ＝３マウス／研究群）。（ｃ）矢印は、ＣＣ１およびｐ−ｅＩＦ２αの二重標識を指し示す。これらは、ＰＩＤ１７でＥＡＥを罹患したコントロールマウスの腰髄の少数の乏突起膠細胞中でのｅＩＦ２αの穏やかな活性化を示した。（ｄ）ＣＣ１およびｐ−ｅＩＦ２α二重標識は、ＰＩＤ１７でＧＡＤＤ３４ヌルマウス中の乏突起膠細胞（矢印）中のｐ−ｅＩＦ２αレベルが増加したことを示した。Ｎ＝３、スケールバー＝１０μＭ。図２８は、ＧＡＤＤ３４−ヌルマウスおよびコントロールマウス由来の腰髄切片中のＭＢＰの免疫染色を示す。（ａ）および（ｂ）は、ＧＡＤＤ３４野生型およびＧＡＤＤ３４−ヌルマウス由来の腰髄組織のＭＢＰ免疫染色を示す。（ａ）矢印は、ＰＩＤ１７でのＥＡＥを罹患したコントロールマウスで認められる脱髄病変を指し示す一方で、（ｂ）ＰＩＤ１７でのＥＡＥを罹患したＧＡＤＤ３４ヌルマウスにおいて明確な脱髄病変は認められなかった（ｎ＝３、スケールバー＝５０μＭ）。（ｃ）および（ｄ）は、ＧＡＤＤ３４野生型およびＧＡＤＤ３４−ヌルマウスの腰髄切片トルイジンブルー染色を示す。（ｃ）ＰＩＤ１７でコントロールマウスの腰髄中の損傷が重篤に脱髄したのに対して、（ｄ）ＧＡＤＤ３４欠失は、ＰＩＤ１７でＧＡＤＤ３４ヌルマウスの腰髄中のＥＡＥ誘導性脱髄を防御した（ｎ＝３、スケールバー＝１０μＭ）。（ｅ）および（ｆ）。ＧＡＤＤ３４野生型およびＧＡＤＤ３４−ヌルマウス由来の腰髄組織のＣＣ１免疫染色。（ｅ）は、コントロールマウスの腰髄中の脱髄病変中の乏突起膠細胞の大部分はＰＩＤ１７で喪失したのに帯して、ＧＡＤＤ３４ヌルマウスの腰髄中の乏突起膠細胞（矢印）は、ほとんどインタクトなままであったことを示す。（ｆ）（ｎ＝３、スケールバー＝２５μＭ）。（ｇ）および（ｈ）は、コントロールマウスおよびＧＡＤＤ３４−ヌルマウス由来の腰髄組織の非リン酸化神経フィラメント−Ｈ免疫染色の免疫染色を示す。（ｇ）ＰＩＤ１７でのコントロールマウス中の脱髄病変中の矢印は重篤な軸索損傷を示すのに対して、（ｈ）ＧＡＤＤ３４が欠損したマウスは、ＧＡＤＤ３４ヌルマウスの腰髄中の軸索損傷（矢印）が顕著に減少した（ｎ＝３、スケールバー＝２５μＭ）。図２９は、（Ａ）ウェスタンブロット分析および（Ｂ）アクチンに正規化したＭＢＰタンパク質バンドのデンシトメトリー分析によるＩＮＦγによって媒介されたＭＢＰレベルの減少に及ぼすＳａｌの軽減効果を示す。図３０は、Ｆｌａｇ−ＳＯＣＳ１の発現を示す。Ａ．ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１構築物は、２．４ＫｂのＰＬＰ５’隣接ＤＮＡ、エクソン１（ＡＴＧなし）、イントロン１（斜めの縞模様のボックス）、Ｆｌａｇ−ＳＯＣＳ１、およびＳＶ４０ポリＡシグナル配列を含む。ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１導入遺伝子の発現を、いくつかの方法を使用して生後２１日目に特徴づけた。Ｂ．ノーザンブロット分析により、野生型脳（レーン１（ＷＴ、野生型脳））と比較してＰＬＰ／ＳＯＣＳ１脳（レーン２（Ｔ、トランスジェニック脳））中のＦｌａｇ−ＳＯＣＳ１発現が証明された。Ｃ．導入遺伝子特異的プライマーを使用したＱ−ＰＣＲ分析により、脳、脊髄、および坐骨神経中に最も高い濃度の導入遺伝子由来ＳＯＣＳ１ｍＲＮＡが存在し、他の器官でのレベルは有意に低いことが明らかとなった。Ｄ．ウェスタンブロット。Ｅ．免疫沈降。共に、ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１マウス由来の脳サンプル（脳ｆＳＯＣＳ１＋）をロードしたレーンのみで１つの１９ＫＤ（ＳＯＣＳ１の推定分子量）のＦｌａｇ陽性バンドが証明された。Ｆｌａｇタンパク質を、抗体反応のポジティブコントロールとして使用した（１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、抗Ｆｌａｇ（Ｍ２）抗体）。抗ＳＯＣＳ１／ＦＩＴＣ（Ｆ、Ｈ、緑色）および抗Ｆｌａｇ／ＦＩＴＣ抗体（Ｇ、Ｉ、緑色）での免疫染色は、ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１のみで陽性シグナルが証明され（Ｈ、Ｉ、緑色）、野生型マウスサンプルでは証明されなかった（Ｆ、Ｇ）。細胞核を、臭化エチジウムで対比染色した（Ｆ〜Ｉ、赤色）。視床線維（ｔｈａｌａｍｉｃｆｉｂｅｒ）の冠状断面；バー＝２０μｍ。図３１は、ｉｎｖｉｖｏでのＦｌａｇ−ＳＯＣＳ１およびＰＬＰの共存を示す。生後２１日目に採取した野生型（Ａ〜Ｃ、上の横列）およびＰＬＰ／ＳＯＣＳ１（Ｄ〜Ｆ、下の横列）小脳組織の二重免疫染色を、抗ＰＬＰ／Ｃｙ３（Ａ、Ｄ、赤色）および抗Ｆｌａｇ／ＦＩＴＣ（Ｂ、Ｅ、緑色）抗体ならびにＤＡＰＩ核染色（Ｃ、Ｆ、青色）を使用して行った。（Ｂ）野生型サンプルのＰＬＰ陽性構造（Ａ、赤色）は、抗Ｆｌａｇ（Ｂ）について免疫陽性を示さず、（Ｃ）シグナルの共存は確立されなかった。対照的に、ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１サンプルのＰＬＰ陽性構造（Ｄ）は、Ｆｌａｇ−ＳＯＣＳ１を発現し（Ｅ）、抗ＰＬＰと抗Ｆｌａｇ免疫陽性との間の強い共存が検出された（Ｆ、黄色は共存を示す）。小脳の矢状断面；バー＝２０μｍ。図３２は、ｉｎｖｉｔｒｏでのｆｌａｇ−ＳＯＣＳ１およびＰＬＰの共存を示す。野生型（Ａ〜Ｃ、上の横列）およびＰＬＰ／ＳＯＣＳ１（Ｄ〜Ｆ、下の横列）混合初代乏突起膠細胞培養物の二重免疫染色を、抗ＰＬＰ／ＦＩＴＣ（Ａ、Ｄ、緑色）および抗Ｆｌａｇ／Ｃｙ３（Ｂ、Ｅ、赤色）抗体を使用して行った。（Ａ）野生型培養物におけるＰＬＰ陽性乏突起膠細胞は、抗Ｆｌａｇ（Ｂ）について免疫陽性を示さず、（Ｃ）シグナルの共存は確立されなかった。対照的に、ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１培養物中のＰＬＰ陽性構造（Ｅ）は、抗ＰＬＰと抗Ｆｌａｇシグナルとの間の強い共存が検出された（Ｆ）。Ｆｌａｇ−ＳＯＣＳ１は、乏突起膠細胞の細胞体（大きな矢印）および細胞過程（ｃｅｌｌｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）中に局在するようであった。バー＝２０μｍ。図３３は、Ｓｔａｔ１核移行の差分阻害を示す。野生型（Ａ〜Ｄ、上の横列）およびＰＬＰ／ＳＯＣＳ１（Ｅ〜Ｈ；下の横列）マウス由来の混合初代乏突起膠細胞培養物を、１００ＵＩＦＮ−γで３０分間刺激し、抗ＰＬＰ／Ｃｙ３（Ａ、Ｅ、赤色）、抗Ｓｔａｔ１（Ｂ、Ｆ；緑色）、およびＤＡＰＩ核染色（Ｄ，Ｈ；青色）を使用した二重免疫染色を行、蛍光シグナルをデジタル処理で重ね合わせた（ＣおよびＧ、ＰＬＰ／Ｃｙ３とＳｔａｔ１／ＦＩＴＣシグナルとの間の重ね合わせ；ＤおよびＨ、ＰＬＰ／Ｃｙ３と、Ｓｔａｔ１／ＦＩＴＣと、ＤＡＰＩシグナルとの間の重ね合わせ）。野生型培養物では、Ｓｔａｔ１は、全細胞のＤＡＰＩ染色核と共存し、ＰＬＰ陽性乏突起膠細胞が含まれる（小さな矢印）（Ｂ、Ｄ、Ｓｔａｔ１とＤＡＰＩとの間の共存）。ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１培養物では、Ｓｔａｔ１は、ＰＬＰ陰性細胞のＤＡＰＩ陽性核と共存したが（小さな矢印）、ＰＬＰ陽性乏突起膠細胞のＤＡＰＩ陽性核と共存しなかった（大きな矢印）（Ｆ、Ｈ）。ＰＬＰ陽性乏突起膠細胞中のＳｔａｔ１は、ＤＡＰＩ染色核と共存しなかったが、細胞質中に留まった（大きな矢印）（Ｆ、Ｈ）。バー＝１０μｍ。図３４は、ＭＢＰ／ＩＦＮ−γ×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１マウスにおけるＭＨＣクラスＩ分子の差分発現を示す。生後２１日目で採取した野生型（Ａ、Ｂ）、ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１（Ｃ、Ｄ）、ＭＢＰ／ＩＦＮ−γ×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１（Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ）マウス脳を、抗ＭＨＣクラスＩ／ＦＩＴＣ（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｉ；緑色）および抗ｆｌａｇ／Ｃｙ３（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ；赤色）抗体ならびにＤＡＰＩ核染色（Ｊ；青色）で二重免疫染色した。野生型サンプルは、二重陰性であった（Ａ、Ｂ）。ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１サンプルは、（Ｃ）ＭＨＣクラスＩ分子に陰性であり、（Ｄ）Ｆｌａｇに陽性であった。ＭＢＰ／ＩＦＮ−γサンプルは、（Ｅ）ＭＨＣクラスＩ分子に陽性であり、（Ｆ）Ｆｌａｇに陰性であった。二重トランスジェニックＭＢＰ／ＩＦＮ−γ×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１サンプルは、（Ｇ）ＭＨＣクラスＩ分子およびＦｌａｇ（Ｈ）に二重陽性であった。より高い倍率のＭＢＰ／ＩＦＮ−γ×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１サンプル（Ｇ、Ｈ中の四角）は、免疫陽性の差分分布が明らかであった（Ｉ、Ｊ）。ＭＨＣクラスＩ陽性細胞（大きな矢印）は、Ｆｌａｇに陰性であるのに対して、Ｆｌａｇ陽性細胞（小さな矢印）はＭＨＣクラスＩ分子に陰性であった。脳梁の矢状断面；バー＝２０μｍ（Ａ〜Ｈ）；バー＝１０μｍ（Ｉ、Ｊ）。図３５は、乏突起膠細胞およびミエリンのＳＯＣＳ１媒介性防御を示す。（Ａ）ＩＦＮ−γ発現、（Ｂ）乏突起膠細胞密度（ＣＣ１細胞／ｍｍ^２）、（Ｃ）Ｇ比、および（Ｄ）非有髄軸索の比率を、以下の３つのトランスジェニック系の同腹仔間で試験した：生後２１日目の１７２×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１、１８４／１１０×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１、および１８４／６７×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１（完全な説明の結果を参照のこと）。（Ａ）相対的ＩＦＮ−γ発現量は、系の間で異なったが、ＩＦＮ−γのみ（ＩＦＮ−γ）またはＩＦＮ−γとＳＯＣＳ１との両方（ＩＦＮ−γ×ＳＯＣＳ１）のいずれかを発現する同一のトランスジェニック系由来の同腹仔間で発現レベルの統計的差異は認められなかった。ＩＦＮ−γ過剰発現同腹仔（ＩＦＮ−γ）は、野生型、単一トランスジェニックコントロール（ｗｔ／ｃｎｔｒｌ）、およびＰＬＰ／ＳＯＣＳ１同腹仔と比較した場合、（Ｂ）有意な用量依存性乏突起膠細胞の喪失および（Ｃ、Ｄ）髄鞘低形成を示した（＊ｐ＜０．０５、ｎ＝３動物／研究群）。ＩＦＮ−γおよびＳＯＣＳ１の両方を発現する三重トランスジェニック同腹仔（ＩＦＮ−γ×ＳＯＣＳ１）は、ＩＦＮ−γのみを過剰発現する同腹仔（ＩＦＮ−γ）と比較した場合、（Ｂ）有意な乏突起膠細胞および（Ｄ、Ｄ）ミエリン保存を示した（＊＊ｐ＜０．０５、ｎ＝３動物／研究群）。図３６は、ＳＯＣＳ１媒介性乏突起膠細胞防御を示す。生後２１日目のＧＦＡＰ／ｔＴＡ×ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１（１８４／６７×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１）マウス由来の定量領域の代表的領域。Ａ．野生型；Ｂ．ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１；Ｃ．１８４／６７、およびＤ；１８４／６７×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１。ＣＣ１／Ｃｙ３（赤色）およびＤＡＰＩ核染色（青色）での免疫染色。脳梁の矢状断面；バー＝２０μｍ。（Ａ）野生型および（Ｂ）ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１マウス由来のサンプルと比較した（Ｃ）ＩＦＮ−γ過剰発現マウス由来のサンプルにおけるＣＣ１陽性の喪失ならびに（Ｄ）ＩＦＮ−γおよびＳＯＣＳ１の両方を過剰発現するマウス由来のサンプル中の有意な乏突起膠細胞の保存に留意のこと。図３７は、ＳＯＣＳ１媒介性ミエリン防御を示す。生後２１日目のＧＦＡＰ／ｔＴＡ×ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１（１８４／６７×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１）マウス由来の定量領域の代表的領域。Ａ．野生型；Ｂ．ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１；Ｃ．１８４／６７、およびＤ；１８４／６７×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１。脳梁の電子顕微鏡写真；バー＝５００ｎｍ。（Ａ）野生型および（Ｂ）ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１マウス由来のサンプルと比較した（Ｃ）ＩＦＮ−γ過剰発現マウス由来のサンプルにおける髄鞘低形成ならびに（Ｄ）ＩＦＮ−γおよびＳＯＣＳ１の両方を過剰発現するマウス由来のサンプル中の有意なミエリンの保存に留意のこと。

（発明の詳細な説明）
本開示を通して、種々の刊行物、特許、および公開された特許明細書は、引例の識別によって援用される。これらの刊行物、特許、および公開された特許明細書の開示は、本発明が関連する分野の状態を完全に説明するために、本開示に参考として援用される。

（一般的技術：）
本発明の実施には、他で示さない限り、従来の免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクス、および組換えＤＮＡ技術を使用し、これらは、当業者の範囲内である。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈａｎｄＭａｎｉａｔｉｓ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ：ＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）；ＣＵＲＲＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔａｌ．ｅｄｓ．，（１９８７））；ｔｈｅｓｅｒｉｅｓＭＥＴＨＯＤＳＩＮＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ２：ＡＰＲＡＣＴＩＣＡＬＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓａｎｄＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒｅｄｓ．（１９９５）），ＨａｒｌｏｗａｎｄＬａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，ＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬ，ａｎｄＡＮＩＭＡＬＣＥＬＬＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））を参照のこと。

（定義：）
明細書および特許請求の範囲で使用する場合、文脈上で他のものを明確に記載しない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には複数形が含まれる。例えば、用語「ａｃｅｌｌ」には、複数の細胞（その混合物が含まれる）が含まれる。

用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、および「オリゴヌクレオチド」を、交換可能に使用する。これらは、任意の長さのヌクレオチドの高分子形態（デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはそのアナログのいずれか）をいう。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することができ、既知または未知の任意の機能を実行することができる。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子フラグメントのコード領域または非コード領域、連鎖分析から定義された遺伝子座（遺伝子座）、エクソン、イントロン、伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、運搬ＲＮＡ、リボゾームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログなどの修飾ヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ポリマーのアセンブリの前または後にヌクレオチド構造の修飾に影響を及ぼし得る。ヌクレオチド配列は、非ヌクレオチド成分によって妨害され得る。ポリヌクレオチドを、重合後に標識成分との抱合によってさらに修飾することができる。

「ヌクレオチドプローブ」または「プローブ」は、ハイブリッド形成反応においてその対応する標的ポリヌクレオチドの検出または同定のために使用されるポリヌクレオチドをいう。

「ハイブリッド形成」は、１つまたは複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化された複合体を形成する反応をいう。ワトソン−クリック塩基対合、ホーグスタイン結合、または任意の他の配列特異的様式によって水素結合が起こり得る。複合体は、二重鎖構造を形成する２つの鎖、多重鎖複合体を形成する３つまたはそれを超える鎖、単一自己ハイブリッド形成鎖、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。ハイブリッド形成反応は、より広範な過程（ＰＣＲの開始またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素切断など）から構成され得る。

用語「ハイブリッド形成された」は、ポリヌクレオチドに適用する場合、ポリヌクレオチドがヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化された複合体を形成する能力をいう。ワトソン−クリック塩基対合、ホーグスタイン結合、または任意の他の配列特異的様式によって水素結合が起こり得る。複合体は、二重鎖構造を形成する２つの鎖、多重鎖複合体を形成する３つまたはそれを超える鎖、単一自己ハイブリッド形成鎖、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。ハイブリッド形成反応は、より広範な過程（ＰＣＲの開始またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素切断など）から構成され得る。

本明細書中で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡおよび／または過程に転写され、次いで、転写されたｍＲＮＡ（「転写物」ともいう）がペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳される過程をいう。転写物およびコードされたポリペプチドを、集合的に、「遺伝子産物」という。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞中でのｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。

「差分発現された」は、被験体中のヌクレオチド配列またはポリペプチド配列に適用する場合、コントロール中で検出された配列と比較した場合に上記配列の過剰発現または過小発現をいう。過小発現はまた、コントロールと比較した場合の試験被験体中での検出可能な発現の非存在によって証明された特定の配列の発現の非存在を含む。

「シグナル伝達」は、刺激シグナルまたは阻害シグナルが細胞内に伝達されて細胞内応答を誘発する過程である。分子は、同一経路または関連経路の下流分子との直接または間接的相互作用を介してそのシグナル伝達効果を媒介することができる。例えば、ＩＦＮγシグナル伝達は、多数の下流分子（１つまたは複数の以下のタンパク質が含まれるが、これらに限定されない：ＰＥＲＫ、ｅＩＦ−２α、ＳＯＣＳ１、およびＳｔａｔ１）を含み得る。

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいうために本明細書中で交換可能に使用される。ポリマーは、線状または分岐していてよく、修飾アミノ酸を含むことができ、非アミノ酸が割り込んでいてよい。この用語はまた、修飾されたアミノ酸ポリマー（例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏａｎ）、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作（標識成分との抱合））を含む。本明細書中で使用される、用語「アミノ酸」は、天然および／または非天然または合成アミノ酸（グリシンおよびＤまたはＬ光学異性体が含まれる）ならびにアミノ酸アナログおよびペプチド模倣物のいずれかをいう。

本明細書中で使用される、「髄鞘形成細胞」は、神経系中の軸索を絶縁するミエリンを産生することができる細胞をいう。例示的な髄鞘形成細胞は、中枢神経系でのミエリン産生を担う乏突起膠細胞および末梢神経系でのミエリン産生を担うシュワン細胞である。

「被験体」、「個体」、または「患者」は、交換可能に使用され、脊椎動物、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ヒトをいう。哺乳動物には、マウス、サル、ヒト、家畜、競技用動物、およびペットが含まれるが、これらに限定されない。ｉｎｖｉｖｏで得られるかｉｎｖｉｔｒｏで培養した生物学的存在（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｅｎｔｉｔｙ）の組織、細胞、およびその子孫も含まれる。

「コントロール」は、比較を目的として実験で使用される選択的被験体またはサンプルである。

本発明の中心的態様は、神経髄鞘形成で役割を果たす細胞中での神経脱髄の小胞体（ＥＲ）との関連の発見である。

（細胞ベースのアッセイ：）
したがって、１つの実施形態では、本発明は、神経脱髄を減少させる生物活性剤を開発する方法を提供する。本方法は、（ａ）候補薬剤を髄鞘形成細胞と接触させる工程と、（ｂ）コントロール細胞と比較して遺伝子もしくは遺伝子産物の発現の変化または前記遺伝子産物の活性の変化を検出する工程と、前記遺伝子または遺伝子産物が小胞体（ＥＲ）ストレスに相関することと、（ｃ）前記遺伝子もしくは遺伝子産物の発現レベルまたは前記遺伝子産物の活性レベルが前記コントロール細胞と比較して調整された場合、前記薬剤を候補として選択する工程とを含む。

別の実施形態では、本発明は、神経再髄鞘形成を促進する生物活性剤を開発する方法を提供する。本方法は、（ａ）候補生物活性剤を被験体の脱髄病変由来の髄鞘形成細胞と接触させる工程と、（ｂ）コントロール細胞と比較して遺伝子もしくは遺伝子産物の発現の変化または前記遺伝子産物の活性の変化を検出する工程と、前記遺伝子または遺伝子産物が小胞体（ＥＲ）ストレスに相関することと、（ｃ）前記遺伝子もしくは遺伝子産物の発現レベルまたは前記遺伝子産物の活性レベルが前記コントロール細胞と比較して調整された場合、前記薬剤を候補として選択する工程とを含む。

本発明の実施は、コントロール細胞との試験髄鞘形成細胞（乏突起膠細胞またはシュワン細胞のいずれか）中の遺伝子もしくは遺伝子産物の発現の比較を含む。本発明のために使用される試験髄鞘形成細胞は、中枢神経系または末梢神経系から単離することができ、試験髄鞘形成細胞由来の細胞培養物およびその子孫、ならびに供給源から調製した区分もしくは塗抹標本、または乏突起膠細胞、シュワン細胞、またはその子孫を含む任意の他の脳サンプルが含まれる。必要に応じて、実質的に他の神経細胞型（ニューロン、小グリア細胞、および星状細胞など）を含まない負荷されたこれらの細胞培養物を使用するために選択することができる。成熟した乏突起膠細胞またはシュワン細胞を単離、生成、または維持するための種々の方法が当該分野で公知であり（Ｂａｅｒｗａｌｄ，ｅｔａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．５２：２３０−２３９；Ｌｅｖｉ，ｅｔａｌ．（１９９６）ＪＮｅｕｒｏｓｃｉＭｅｔｈｏｄｓ．６８（１）：２１−６）、これらを本明細書中に例示する。

一定の実施形態では、神経系が能動的に髄鞘形成している幼若被験体由来の髄鞘形成細胞を使用することが好ましいかもしれない。他の実施形態では、脱髄病変（病原体または物理的損傷によって負わされた病変およびクプリゾンなどの毒物に起因する病変が含まれるが、これらに限定されない）中の成体乏突起膠細胞前駆体由来の再髄鞘形成細胞を使用することが好ましいかも知れない。さらに他の実施形態では、ＩＦＮ−γに直接曝露されるか、神経系がＩＦＮ−γに曝露された被験体に由来する髄鞘形成細胞を使用することが好ましいかもしれない。例えば、中枢神経系中でＩＦＮ−γを異所的に発現するトランスジェニック動物由来の乏突起膠細胞を使用するために選択することができる。さらに他の実施形態では、任意のＥＲストレス関連遺伝子を差分発現する試験髄鞘形成細胞を選択することができる。このような髄鞘形成細胞は、ＥＲストレス原因遺伝子またはＥＲストレス抑制遺伝子（例えば、ＢＩＰおよび膵臓ＥＲキナーゼ遺伝子（ＰＥＲＫ））を過剰発現するか過小発現することができる。これらの髄鞘形成細胞は、１つまたは複数のＥＲストレス関連遺伝子ノックイン（過剰発現）またはノックアウト（過小発現）を有するトランスジェニック動物に由来し得る。

あるいは、このような髄鞘形成細胞を、このような過剰発現または過小発現をもたらすための遺伝子媒介物（ｇｅｎｅｔｉｃｖｅｈｉｃｌｅ）の細胞への導入によって生成することができる。本発明に適切な膨大な遺伝子媒介物は、当該分野で利用可能である。これらには、ウイルスおよび非ウイルス発現ベクターが含まれる。非限定的な例示的ウイルス発現ベクターは、レトロウイルスなどのＲＮＡウイルスならびにアデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどのＤＮＡウイルス由来のベクターである。非ウイルス発現ベクターには、プラスミド、コスミド、およびＤＮＡ／リポソーム複合体が含まれるが、これらに限定されない。必要に応じて、遺伝子媒介物を、遺伝子媒介物中に保有される外因性遺伝子の組織特異的、細胞特異的、またはさらにオルガネラ特異的発現を指示する調節配列を保有するように操作することができる。

中枢神経系および末梢神経系中で導入遺伝子を発現するために適用可能な多数の組織または細胞特異的調節配列が証明されている。例示的配列は、グリア線維酸性遺伝子（ＧＦＡＰ）の転写調節配列である。調節配列により、中枢神経系および末梢神経系（例えば、シュワン細胞）中で導入遺伝子を異所性発現することが可能である。

広範な種々の細胞内局在配列が特徴づけられており、導入遺伝子のオルガネラ特異的発現を指示するために適用可能である。例えば、細胞内局在化配列は、以下のいずれか１つであり得る：（ａ）細胞の外側への遺伝子産物の分泌を指示するシグナル配列、（ｂ）原形質膜または細胞の他の膜成分へのタンパク質の付着を可能にする膜繋留ドメイン、（ｃ）核へのコードタンパク質の転位置を媒介する核局在化配列、（ｄ）コードタンパク質を主にＥＲに限定する小胞体保留配列（例えば、ＫＤＥＬ配列）、または（ｅ）コードタンパク質産物の差分細胞内分布で役割を果たす任意の他の配列。

遺伝子媒介物を、当該分野で公知の任意の方法によって宿主細胞（例えば、乏突起膠細胞またはシュワン細胞などの髄鞘形成細胞）に挿入することができる。適切な方法には、リン酸カルシウム沈降、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、または微量注入を使用したトランスフェクションが含まれ得る。

適切なコントロール細胞または組織の選択は、最初に選択される試験細胞または組織およびその表現型または遺伝子型の特徴に依存し、これらは研究中である。試験髄鞘形成細胞が脱髄病変に由来するのに対して、非脱髄組織由来の１つまたは複数の対応物をコントロール細胞として使用することができる。試験髄鞘形成細胞をＩＦＮ−γで処置するのに対して、コントロール細胞は未処置対応物であり得る。試験細胞およびコントロールを並行して分析することが一般的に好ましい。

本発明の目的のために、神経脱髄を調整するのに有効な生物活性剤は、生物学的または化学的な化合物（単純または複雑な有機または無機分子、ペプチド、ペプチド模倣物、タンパク質（例えば、抗体）、リポソーム、低分子干渉ＲＮＡ、またはポリヌクレオチド（例えば、アンチセンス）など）（これらに限定されない）を含むことが意図される。好ましい薬剤クラスには、標的分子の下流シグナル伝達効果を遮断するクラスが含まれる。この薬剤クラスには、典型的には細胞に繋留した未変性受容体とリガンドの結合を競合し、それにより、リガンドのその下流効果の媒介を防止する可溶性リガンド受容体またはその誘導体が含まれ得る。方法論は、当該分野で公知である。例えば、Ｅｃｏｎｏｍｉｄｅｓ
ｅｔａｌ．（２００３）ＮａｔＭｅｄ９（ｌ）：４７−５２を参照のこと。

ありとあらゆる化合物（例えば、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドなどのポリマーならびに合成有機化合物）を、種々のコア構造に基づいて合成することができ、これらも本明細書中で意図される。さらに、種々の天然供給源から、スクリーニング用の化合物（植物または動物の抽出物など）を得ることができる。常に明確に記載しているわけではないが、本スクリーニング法によって同定された薬剤として、活性成分（ａｃｔｉｖｅａｇｅｎｔ）を単独で使用するか、同一または児となる生物活性を有する別のモジュレーターと組み合わせて使用することができると理解すべきである。好ましい薬剤クラスは、ＩＦＮ−γアンタゴニストである。当業者に理解されるように、アンタゴニストは、アンタゴニストが相互作用する標的によって媒介される生物活性を阻害する。アンタゴニストは、標的への直接的結合または標的との直接的相互作用によって阻害効果を有効にすることができる。アンタゴニストはまた、同一のシグナル伝達経路中の分子との最初の相互作用によってその阻害効果を間接的に有効にすることができる。本発明のＩＦＮ−γアンタゴニストは、神経脱髄に及ぼすＩＦＮ−γの有害な影響を減少することができる単純または複雑な有機分子もしくは無機分子、ペプチド、ペプチド模倣物、タンパク質（例えば、抗体）、リポソーム、低分子干渉ＲＮＡ、またはポリヌクレオチド（例えば、アンチセンス）を含む。

予防効果が望まれるいくつかの例では、ＩＦＮ−γまたはＩＦＮ−γアゴニスト（例えば、サルブリノール（ｓａｌｕｂｒｉｎｏｌ）（Ｓａｌ））を、神経脱髄の発症前に適用することができる。当業者に理解されるように、アゴニストは、アゴニストが相互作用する標的によって媒介される生物活性を活性化する。アゴニストは、標的への直接的結合または標的との直接的相互作用によって阻害効果を有効にすることができる。アゴニストはまた、同一のシグナル伝達経路中の分子との最初の相互作用によってその刺激効果を間接的に有効にすることができる。本発明のＩＦＮ−γアゴニストは、神経脱髄に及ぼすＩＦＮ−γの有害な影響を減少することができる単純または複雑な有機分子もしくは無機分子、ペプチド、ペプチド模倣物、タンパク質（例えば、抗体）、リポソーム、低分子干渉ＲＮＡ、またはポリヌクレオチド（例えば、アンチセンス）を含む。

薬剤が裸のＲＮＡ以外の組成物である場合、薬剤を、細胞培養物に直接添加するか、添加のための培養培地に添加することができる。当業者に明らかなように、「有効な」量を添加しなければならず、この量は、経験的に決定することができる。薬剤がポリペプチドである場合、トランスフェクションまたはエレクトロポレーションによって細胞に直接導入することができる。あるいは、上記の遺伝子送達媒介物または他の方法を使用して細胞に挿入することができる。

本明細書中で使用される場合、ＥＲストレス関連遺伝子は、ＥＲにおけるストレスに相関するタンパク質をコードする全ての核酸を含む。一般に、これらのタンパク質は、ＥＲホメオスタシスで役割を果たす。ストレス（内因性または外因性）が細胞中に出現し得る方法が多数存在し、これらには、病的感染、化学的傷害、遺伝子変異、栄養枯渇、さらに正常な細胞分化が含まれるが、これらに限定されない。

一般に、ホメオスタシスの破壊およびそれによるＥＲストレスは、ＥＲ小胞体ルーメン中の非折り畳みタンパク質または誤折り畳みタンパク質の蓄積によって証明される（Ｒｕｔｋｏｗｓｋｉ，ｅｔａｌ．（２００４）ＴｒｅｎｄｓＣｅｌｌＢｉｏｌ．１４：２０−２８；Ｍａ，ｅｔａｌ．（２００１）Ｃｅｌｌ１０７：８２７−８３０）。このストレスは、非折り畳みタンパク質応答（細胞がそれ自体をＥＲストレスから防御することを意図する機能的機構）を誘発する。非折り畳みタンパク質応答は、１）その機能がＥＲの折り畳み能力を増加させてタンパク質凝集を防止することであるＥＲシャペロンタンパク質の転写誘導、２）タンパク質の過負荷およびその後の非折り畳みタンパク質の蓄積を減少させるための翻訳弱化、および３）２６Ｓプロテアソームによるその分解に関連する逆行性輸送によるＥＲからの誤折り畳みタンパク質の除去を含み得る。これらの防御応答は、ＥＲ内のホメオスタシスを維持するために一過性に作用するが、保持されたＥＲストレスが最終的に細胞死を導き得る（Ｒｕｔｋｏｗｓｋｉ，ｅｔａｌ（２００４）ＴｒｅｎｄｓＣｅｌｌＢｉｏｌ．１４：２０−２８；Ｍａ，ｅｔａｌ．（２００１）Ｃｅｌｌ１０７：８２７−８３０；Ｒａｏ，ｅｔａｌ．（２００４）ＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｉｆｆｅｒ．１１：３７２−３８０）。そのようなものとして、上記の非折り畳みタンパク質応答の１つまたは複数の態様に関与する遺伝子は、本発明の実施に適切である。ＥＲストレス関連遺伝子の非限定的な例には、膵臓ＥＲキナーゼ遺伝子（ＰＥＲＫ）、真核細胞翻訳開始因子２α（ｅＩＦ−２α）、真核細胞翻訳開始因子β（ｅＩＦ−２α）、イノシトール要求１（ＩＲＥ１）、活性化転写因子６（ＡＲＴＦ６）、ＣＡＡＴＴエンハンサー結合タンパク質相同タンパク質（ＣＨＯＰ）、結合免疫グロブリンタンパク質（ＢＩＰ）、カスパーゼ−１２、成長およびＤＮＡ損傷タンパク質３４（ＧＡＤＤ３４）、ＣｒｅＰ（ｅＩＦ２αリン酸化の構成性リプレッサー）、およびＸボックス結合タンパク質−１（ＸＢＰ−１）が含まれる。

ＥＲストレス関連遺伝子または遺伝子産物の発現の変化を、候補薬剤とい接触した場合の試験髄鞘形成細胞とコントロール細胞との間の対応する遺伝子のｍＲＮＡレベルの相違についてのアッセイによって決定することができる。あるいは、ＥＲストレス関連遺伝子の差分発現を、コードポリペプチドレベルまたは遺伝子産物レベルの相違の検出によって決定する。

ｍＲＮＡ転写物または対応するポリヌクレオチドのレベルの薬剤誘導性の変化をアッセイするために、髄鞘形成細胞を含む生体サンプル中に含まれる核酸を、当該分野の標準的方法にしたがって最初に抽出する。例えば、ｍＲＮＡを、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．（１９８９），ｓｕｐｒａに従って種々の溶解酵素または化学的溶液を使用して単離するか、製造者によって提供された添付の説明書に従った核酸結合樹脂によって抽出することができる。次いで、抽出された核酸サンプル中に含まれるｍＲＮＡを、当該分野で広く知られている方法に従うか本明細書中に例示の方法に基づいた増幅手順または従来のハイブリッド形成アッセイ（例えば、ノーザンブロット分析）によって検出する。

本発明の目的のために、増幅は、標的配列を複製することができる妥当な信頼性のあるプライマーおよびポリメラーゼを使用した任意の方法を意味する。天然または組換えＤＮＡポリメラーゼ（ＴａｑＧｏｌｄ（商標）、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメント、および逆転写酵素など）によって増幅を行うことができる。好ましい増幅方法は、ＰＣＲである。特に、単離ＲＮＡを、定量的ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写アッセイ（ＲＴ−ＰＣＲ）に供して、ＥＲストレス関連遺伝子の発現レベルを定量することができる。

増幅アッセイ中に実時間で遺伝子発現レベルの検出を行うことができる。１つの態様では、増幅した産物を、蛍光ＤＮＡ結合剤（ＤＮＡ介入物およびＤＮＡ溝結合剤が含まれるが、これらに限定されない）で直接視覚化することができる。二本鎖ＤＮＡ分子に組み込まれた介入物の量は、典型的には、ＤＮＡ産物の増幅量に比例するので、当該分野の従来の光学系を使用した介入色素の蛍光の定量によって産物の増幅量を都合良く決定することができる。本出願に適切なＤＮＡ結合色素には、ＳＹＢＲグリーン、ＳＹＢＲブルー、ＤＡＰＩ、ヨウ化プロピジウム、Ｈｏｅｓｔｅ、ＳＹＢＲゴールド、臭化エチジウム、アクリジン、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリフラビン、フルオロクマリン（ｆｌｕｏｒｃｏｕｍａｎｉｎ）、エリプチシン、ダウノマイシン、クロロキン、ジスタマイシンＤ、クロモマイシン、ホミジウム、ミトラマイシン、ルテニウムポリピリジル、およびアントラマイシンなどが含まれる。

別の態様では、配列特異的プローブなどの他の蛍光標識を増幅反応で使用して、増幅産物の検出および定量を促進することができる。プローブベースの定量的増幅は、所望の
増幅産物の配列特異的検出に依存する。これは、特異性および感度を増加させる蛍光標的特異的プローブ（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標））を使用する。プローブベースの定量的増幅の実施方法は当該分野で十分に確立されており、米国特許第５，２１０，０１５号に教示されている。

さらに別の実施形態では、ＥＲストレス関連遺伝子と配列相同性を有するハイブリッド形成プローブを使用した従来のハイブリッド形成アッセイを行うことができる。典型的には、プローブは、ハイブリッド形成反応において試験被験体由来の生体サンプル内に含まれる標的ポリヌクレオチド（例えば、ＥＲストレス関連遺伝子）と安定な複合体を形成することが可能である。アンチセンスをプローブ核酸として使用する場合、サンプル中に提供された標的ポリヌクレオチドをアンチセンス核酸配列に相補的であるように選択することが当業者に認識されている。逆に、核酸プローブがセンス核酸である場合、標的ポリヌクレオチドを、センス核酸配列に相補的であるように選択する。

当業者に公知のように、種々のストリンジェンシー条件下でハイブリッド形成を行うことができる。本発明の実施に適切なハイブリッド形成条件は、プローブと標的ＥＲストレス関連遺伝子との間の認識相互作用が十分に特異的であり、且つ十分に安定である条件である。ハイブリッド形成反応のストリンジェンシーを増加させる条件は、当該分野で広く知られており、且つ公開されている。例えば、（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔａｌ，（１９８９），ｓｕｐｒａ；ＮｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅＩｎＳｉｔｕＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＭａｎｕａｌ，ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ，ｓｅｃｏｎｄｅｄｉｔｉｏｎ）を参照のこと。ハイブリッド形成アッセイを、任意の固体支持体（ニトロセルロース、ガラス、シリコン、および種々の遺伝子アレイが含まれるが、これらに限定されない）上に固定したプローブを使用して形成することができる。米国特許第５，４４５，９３４号に記載のように、好ましいハイブリッド形成アッセイを高密度遺伝子チップにて行う。

ハイブリッド形成アッセイ中に形成されたプローブ−標的複合体の都合の良い検出のために、ヌクレオチドプローブを転出可能な標識に抱合する。本発明での使用に適切な検出可能な標識には、光化学的手段、生化学的手段、分光学的手段、免疫か学的手段、電気的手段、光学的手段、または化学的手段によって検出可能な任意の組成物が含まれる。広範な種々の適切な検出可能な標識は当該分野で公知であり、蛍光標識もしくは化学発光標識、放射性同位体標識、酵素、または他のリガンドが含まれる。好ましい実施形態では、蛍光標識または酵素タグ（ジゴキシゲニン、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼ、アビジン／ビオチン複合体など）を使用することが望ましい可能性が高い。

ハイブリッド形成強度を検出または定量するために使用される検出方法は、典型的には、上記で選択された標識に依存する。例えば、放射光を検出するための光検出器を使用して、放射性標識を検出することができる。酵素標識を、典型的には、酵素への基質の提供および基質に対する酵素作用によって産生された反応生成物の測定によって検出し、最後に、比色分析標識を、有色標識の簡単な視覚化によって検出する。

ＥＲストレス関連遺伝子の発現における薬剤誘導性の変化を、対応する遺伝子産物の試験によって決定することもできる。タンパク質レベルの検出は、典型的には、ａ）髄鞘形成細胞を含む生体サンプル中に含まれるタンパク質をＥＲストレス関連タンパク質に特異的に結合する薬剤を接触させる工程と、（ｂ）このようにして形成された任意の薬剤：タンパク質複合体を同定する工程とを含む。本発明の１つの態様では、ＥＲストレス関連タンパク質に特異的に結合する薬剤は、抗体、好ましくは、モノクローナル抗体である。

薬剤とＥＲストレス関連タンパク質との間で複合体が形成される条件下で薬剤を試験サンプル由来のＥＲストレス関連タンパク質のサンプルと接触させることによって反応を行う。複合体の形成を、当該分野の標準的手順にしたがって直接または間接的に検出することができる。直接的検出法では、薬剤を、検出可能な標識と共に提供し、未反応の薬剤を、複合体から除去することができる。それにより、残存標識の量は形成された複合体の量を示す。このような方法のために、ストリンジェントな洗浄条件中でさえも薬剤に付着したままである標識を選択することが好ましい。標識が結合反応を妨害しないことが好ましい。代替法では、間接的検出手順は、薬剤が化学的または酵素的に導入された標識を含むことが必要である。望ましい標識は、一般に、得られた薬剤：ポリペプチド複合体の結合または安定性を妨害しない。しかし、標識を、典型的には、有効な結合およびそれによる検出可能なシグナルの生成のための抗体に接近可能なようにデザインする。

タンパク質レベルの検出のための広範な種々の標識は、当該分野で公知である。非限定的な例には、放射性同位体、酵素、コロイド物質、蛍光化合物、生物発光化合物、および化学発光化合物が含まれる。

結合反応中の薬剤：ポリペプチド複合体の形成量を、標準的な定量アッセイによって定量することができる。上記で説明するように、薬剤：ポリペプチド複合体の形成を、結合部位での標識の残存量によって直接測定することができる。代替法では、ＥＲストレス関連タンパク質を、標識されたアナログと特異的因子上の部位への結合を競合する能力について試験する。この競合アッセイでは、標識の捕捉量は、試験サンプル中のＥＲストレス関連タンパク質の存在量に反比例する。

上記で概説した原則に基づいたタンパク質分析のための多数の技術が当該分野で利用可能である。これらには、放射免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫放射測定アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫放射測定アッセイ、ｉｎｓｉｔｕ免疫アッセイ（例えば、コロイド金、酵素、または放射性同位体標識を使用する）、ウェスタンブロット分析、免疫値沈降アッセイ、免疫蛍光アッセイ、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥが含まれるが、これらに限定されない。

ＥＲストレス関連タンパク質を特異的に認識するかこれに結合する抗体は、上記タンパク質分析の実施に好ましい。必要に応じて、特定の翻訳後修飾型（例えば、ＥＲストレス関連誘導性修飾）を認識する抗体を使用することができる。翻訳後修飾には、グリコシル化、脂質化、アセチル化、およびリン酸化が含まれるが、これらに限定されない。これらの抗体を、業者から購入することができる。例えば、チロシンリン酸化タンパク質を特異的に認識する抗ホスホチロシン抗体は、多数の業者（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎおよびＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒが含まれる）から利用可能である。抗ホスホチロシン抗体は、ＥＲストレスに応答してそのチロシン残基を差分的にリン酸化するタンパク質の検出に特に有用である。このようなタンパク質には、真核細胞翻訳開始因子２（ｅＩＦ−２α）が含まれるが、これらに限定されない。あるいは、これらの抗体を、従来のポリクローナル抗体技術またはモノクローナル抗体技術を使用して、宿主動物または抗体産生細胞を所望の翻訳後修飾を示す標的タンパク質で免疫化することによって生成することができる。

本発明の方法の実施では、異なる身体組織、異なる細胞型、および／または異なる細胞内構造中でＥＲストレス関連タンパク質の発現パターンを識別することが望ましいかもしれない。これらの研究を、一定の組織、細胞型、または細胞内構造中で選択的に発現するタンパク質マーカーに結合することができる組織特異的抗体、細胞特異的抗体、または細胞内構造特異的抗体を使用して実施することができる。

例えば、標的ＥＲストレス関連タンパク質を乏突起膠細胞などの特異的細胞型に局在化するために、乏突起膠細胞マーカーに特異的な１つまたは複数の抗体を使用した同時染色を使用することができる。乏突起膠細胞の例示的マーカーには、ＣＣ１、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、ミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、乏突起膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、ＮＯＧＯ、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）、末梢性ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、タンパク質２（Ｐ２）、ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）、スルファチド、およびプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）が含まれるが、これらに限定されない。特異的細胞内構造中に局在するＥＲストレス関連タンパク質を検出または定量するために、このような構造中に差分的に存在する抗原に指向する１つまたは複数の抗体を使用した同時染色を行うことが好ましい。広範な種々のオルガネラ特異的抗体を当該分野で利用可能である。非例示的例には、ＥＲ常在（ｒｅｓｉｄｅｎｔ）タンパク質ＢＩＰに指向する小胞体（ＥＲ）特異的抗体、細胞表面受容体（上皮成長因子受容体（ＥＧＦ受容体）など）と反応性を示す原形質膜特異的抗体、ゴルジ特異的抗体γ−アダプチン、および（例えば、上皮細胞と間質細胞との間で）異なる細胞型由来のサイトケラチンに分化するサイトケラチン特異的抗体が含まれる。免疫特異的結合を検出および定量するために、デジタル画像システム（共焦点顕微鏡が含まれるが、これらに限定されない）を使用することができる。

ＥＲストレス関連遺伝子の発現の変化を、コントロール細胞と比較した遺伝子産物の活性の変化を試験することによって決定することもできる。ＥＲストレス関連タンパク質の活性の薬剤誘導性変化についてのアッセイは、生物化生および／またはシグナル伝達経路（調査中）に依存するであろう。例えば、ＥＲストレス関連タンパク質がキナーゼである場合、下流基質をリン酸化する能力の変化を、当該分野で公知の種々のアッセイによって決定することができる。代表的なアッセイには、リン酸化タンパク質を認識する抗ホスホチロシン抗体などの抗体を使用した免疫ブロッティングおよび免疫沈降が含まれるが、これらに限定されない。さらに、キナーゼ活性を、高処理化学発光アッセイ（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒから利用可能）およびｅＴａｇ（商標）アッセイなど）によって検出することができる（Ｃｈａｎ−Ｈｕｉ，ｅｔａｌ．（２００３）ＣｌｉｎｉｃａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１１１：１６２−１７４）。

ＥＲストレス関連タンパク質が細胞内ｐＨ条件を変動させるシグナル伝達カスケードの一部である場合、蛍光ｐＨ色素などのｐＨ感受性分子を、レポーター分子として使用することができる。ＥＲストレス関連タンパク質がイオンチャネルである別の例では、膜電位および／または細胞内イオン濃度の変動をモニタリングすることができる。多数の市販のキットおよび高処理デバイスは、イオンチャネルのモジュレーターについての迅速且つ頑強なスクリーニングに特に適切である。代表的な装置には、ＦＬＩＰＲ（商標）（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．）およびＶＩＰＲ（ＡｕｒｏｒａＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）が含まれる。これらの装置は、１０００個を超えるマイクロプレートウェルの反応を同時に検出し、１秒間または１ミリ秒（ｍｉｎｉｓｅｃｏｎｄ）以内に実時間測定値および機能データを得ることができる。

ＥＲストレス関連タンパク質がプロテアーゼであるさらに別の例では、基質タンパク質の切断におけるその活性を、切断されたポリペプチドの分析によって検出することができる。いくつかのポリペプチド分析方法が当該分野で利用可能である。非限定的な例示的方法は、二次元電気泳動、質量分析、およびペプチド配列決定である。

本発明の方法によって同定される候補薬剤の全部または一部を、広範な種々の条件が生じる神経脱髄を調整する能力によってさらに特徴づけることができる。例えば、病原体または物理的損傷によって負わされる障害、遺伝的素因、炎症、および／または自己免疫応答に寄与する障害で神経脱髄が起こり得る。具体的には、細菌またはウイルスの感染（例えば、ＨＩＶ−空胞性髄鞘障害およびＨＴＬＶなど）の際に神経脱髄が起こり得る。これはまた、有害物質との直接的接触または体内への有毒代謝産物の蓄積（例えば、橋中心髄鞘崩壊症およびビタミン欠乏症など）に起因し得る。神経脱髄はまた、脊髄損傷、遺伝病（白質萎縮、副腎脳白質ジストロフィ、変性多系統萎縮、ビンスワンガー脳症、中枢神経系の腫瘍、および多発性硬化症が含まれるが、これらに限定されない）で生じ得る。

形態学的に、神経脱髄を、中枢神経系中の乏突起膠細胞または末梢神経系中のシュワン細胞の喪失によって特徴づけることができる。神経系中の有髄軸索の減少または乏突起膠細胞またはシュワン細胞マーカーレベルの減少によって決定することもできる。乏突起膠細胞またはシュワン細胞の例示的マーカータンパク質には、ＣＣ１、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、ミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、乏突起膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、ＮＯＧＯ、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）、末梢性ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、タンパク質２（Ｐ２）、ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）、スルファチド、およびプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）が含まれるが、これらに限定されない。そのようなものとして、本発明の方法によって同定された候補薬剤は、神経脱髄の有害な形態学的特徴を阻害することができる物質を含む。

本発明の方法によって同定された候補薬剤を、以下の２つのクラスに大きく分類することができる。第１のクラスは、細胞または被験体に投与した場合にＥＲストレスを引き起こす遺伝子またはタンパク質の発現または活性のレベルを減少させる薬剤を含む。第２のクラスは、ＥＲストレス抑制遺伝子またはタンパク質（例えば、ＢＩＰおよびＰＥＲＫ）の発現または活性のレベルを増加させる薬剤を含む。１つの態様では、薬剤は、中枢神経系中の乏突起膠細胞または末梢神経系中のシュワン細胞の再髄鞘形成における小胞体ストレスの特徴を示すタンパク質（例えば、主要組織適合遺伝子複合体Ｉ）のレベルを減少させる。

（動物研究：）
神経脱髄容態に有利な生物活性剤の開発は、動物モデルの使用も含み得る。したがって、本発明は、脱髄障害に関連する現象を調整する生物活性剤を試験するための動物モデルの使用方法を提供する。本方法は、（ａ）（ｉ）試験動物の神経脱髄の誘導、および（ｉｉ）前記試験動物を脱髄病変の再髄鞘形成が示されるのに十分な時間脱髄誘導から回復させることを含む方法によって得られた試験動物に候補生物活性剤を投与する工程と、（ｂ）脱髄障害に関連する現象に及ぼす前記薬剤の効果を決定する工程とを含む。

本発明の動物モデルは、動物の神経系（中枢神経系および末梢神経系が含まれる）中に神経脱髄容態を生じる手順を受け入れられる任意の非ヒト脊椎動物を含む。好ましいモデル生物には、哺乳動物、霊長類、およびげっ歯類が含まれるが、これらに限定されない。好ましいモデルの非限定的な例は、ラット、マウス、モルモット、ネコ、イヌ、ウサギ、ブタ、チンパンジー、およびサルである。試験動物は、野生型またはトランスジェニックであり得る。

１つの態様では、本発明の方法は、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）をコードするトランスジェニックヌクレオチド配列がゲノムに安定に組み込まれたトランスジェニック動物を使用する。別の態様では、本発明の方法は、少なくとも１つの他の遺伝子の発現が変化しているトランスジェニック動物であって、ここで、ＩＦＮ−γの発現の際に、動物が、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）のみをコードするトランスジェニックヌクレオチド配列が安定に組み込まれたトランスジェニック動物と比較してより高い脱髄の程度を示す、トランスジェニック動物を含む。好ましい態様では、少なくとも１つの他の遺伝子がＥＲストレス関連タンパク質をコードする。別の好ましい態様では、試験動物は、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）をコードするトランスジェニックヌクレオチド配列がゲノムに安定に組み込まれた膵臓ＥＲキナーゼ遺伝子（ＰＥＲＫ）のヘテロ接合性ノックアウトである。好ましくは、トランスジェニック動物中に保有される導入遺伝子の発現は、異所性、組織特異的、細胞型特異的、またはオルガネラ特異的である発現をもたらすように誘導可能である。

上記のように、組織特異的および細胞特異的調節配列は、中枢神経系中での導入遺伝子の発現に利用可能である。例示的配列は、グリア線維酸性遺伝子（ＧＦＡＰ）の転写調節配列である。調節配列により、中枢神経系中、具体的には、星状細胞中で導入遺伝子を異所性発現することが可能である。特定の細胞内位置中の導入遺伝子の発現が望ましい場合、導入遺伝子を、当該分野で広く実施されている組換えＤＮＡ技術によって対応する細胞内局在化配列に作動可能に連結することができる。例示的な細胞内局在化配列には、（ａ）細胞の外側への遺伝子産物の分泌を指示するシグナル配列、（ｂ）原形質膜または細胞の他の膜成分へのタンパク質の付着を可能にする膜繋留ドメイン、（ｃ）核へのコードタンパク質の転位置を媒介する核局在化配列、（ｄ）コードタンパク質を主にＥＲに限定する小胞体保留配列（例えば、ＫＤＥＬ配列）、または（ｅ）コードタンパク質産物の差分細胞内分布で役割を果たす任意の他の配列が含まれるが、これらに限定されない。

試験動物の脱髄容態は、一般に、神経系（例えば、中枢神経系または末梢神経系）中の有髄軸索の減少または乏突起膠細胞およびシュワン細胞などの髄鞘形成細胞のマーカーレベルの減少をいう。髄鞘形成細胞を同定するための例示的マーカーには、ＣＣ１、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、ミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、乏突起膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、ＮＯＧＯ、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）、末梢性ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、タンパク質２（Ｐ２）、ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）、スルファチド、およびプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）が含まれるが、これらに限定されない。

これらの現象を、本明細書中に記載の免疫組織化学的手段またはタンパク質分析によって観察することができる。１つの態様では、試験動物の脳の切片を、乏突起膠細胞マーカーを特異的に認識する抗体で染色することができる。別の態様では、乏突起膠細胞の発現レベルを、免疫ブロッティング、ハイブリッド形成手段、および増幅手順、ならびに当該分野で十分に確立され、そして／または本明細書中に提供されている任意の他の方法によって定量することができる。

試験動物中に脱髄を誘導する方法が多数確立されている。例えば、神経脱髄を、病原体または物理的損傷、試験度物中に炎症反応および／または自己免疫応答を誘導する薬剤によって負わされ得る。好ましい方法は、脱髄誘導薬（ＩＦＮ−γおよびクプリゾン（ビス−シクロヘキサノンオキサルジヒドラゾン）が含まれるが、これらに限定されない）を使用する。クプリゾン誘導性脱髄モデルは、Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ，ｅｔａｌ．（２００１）ＢｒａｉｎＰａｔｈｏｌ．１１：１０７−１１６に記載されている。この方法では、試験動物に、典型的には、クプリゾンを含む飼料を数週間（約１〜約１０週間の範囲）与える。

適切な方法による脱髄容態の誘導後、動物を、前に脱髄した病変またはその付近に再髄鞘形成させるのに十分な時間で回復させる。再有髄軸索の発生に必要な時間が動物によって異なるが、一般に、少なくとも約１週間必要であり、より頻繁には少なくとも２〜１０週間、さらにより頻繁には約４〜約１０週間必要である。再髄鞘形成を、神経系（例えば、中枢神経系または末梢神経系）中の有髄軸索の増加の観察または髄鞘形成細胞のマーカータンパク質レベルの増加の検出によって確認することができる。同一の脱髄検出方法を使用して、再髄鞘形成が起こったかどうかを決定することができる。

脱髄に関連する現象に及ぼす試験薬剤の影響の決定は、当該分野で公知の任意の適切な方法（上記細胞ベースのアッセイの項に記載の方法が含まれるが、これらに限定されない）を含む。一般に、免疫組織化学的分析および電子顕微鏡分析を実施して、試験薬剤の影響を視覚化することができる。さらに、ＥＲストレス関連遺伝子または遺伝子産物の差分配列の検出に適用可能な手順を使用することができる。ＥＲストレス関連タンパク質の活性の測定技術も適用することができる。上記のように、ＥＲストレス関連遺伝子の非限定的な例には、膵臓ＥＲキナーゼ遺伝子（ＰＥＲＫ）、真核細胞翻訳開始因子２α（ｅＩＦ−２α）、真核細胞翻訳開始因子β（ｅＩＦ−２β）、イノシトール要求１（ＩＲＥ１）、活性化転写因子６（ＡＲＴＦ６）、ＣＡＡＴＴエンハンサー結合タンパク質相同タンパク質（ＣＨＯＰ）、結合免疫グロブリンタンパク質（ＢＩＰ）、カスパーゼ−１２、成長およびＤＮＡ損傷タンパク質３４（ＧＡＤＤ３４）、ＣｒｅＰ（ｅＩＦ２αリン酸化の構成性リプレッサー）、およびＸボックス結合タンパク質−１（ＸＢＰ−１）が含まれる。

別の実施形態では、本発明は、神経脱髄病態の病理発生の誘発に適切な非ヒトトランスジェニック動物を提供する。トランスジェニック動物はまた、神経脱髄を阻害するか脱髄病変の再髄鞘形成を促進するのに有効な生物活性剤の開発に有用である。１つの態様では、本発明のトランスジェニック動物は、（ａ）インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）をコードするトランスジェニックヌクレオチド配列が動物のゲノムに安定に組み込まれており、（ｂ）少なくとも１つの他の遺伝子の発現が変化しており、ここで、ＩＦＮ−γの発現の際に、動物が、工程（ａ）において見られるようなインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）をコードするトランスジェニックヌクレオチド配列が安定に組み込まれたトランスジェニック動物と比較して脱髄の程度がより高いが、少なくとも１つの他の遺伝子の発現の変化を欠いている。

本発明は、その全細胞中に１つまたは複数の所望の導入遺伝子を保有するトランスジェニック動物ならびにいくつかであるがその全てではない細胞中に導入遺伝子を保有する動物（すなわち、モザイク動物）を意図する。任意の種の動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、マイクロピッグ（ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇ）、ヤギ、および非ヒト霊長類（例えば、バブーン、サル、およびチンパンジー）が含まれるが、これらに限定されない）を使用して、本発明のトランスジェニック動物を作製することができる。

所望の導入遺伝子を、単一コピーまたはコンカテマー（例えば、ヘッド−ヘッドタンデムまたはテール−テールタンデム）として組み込むことができる。所望の導入遺伝子を、特定の組織または細胞型、好ましくは、中枢神経系内の細胞に選択的に導入し、活性化することもできる。このような細胞型特異的活性化に必要な調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、調節配列は当業者に自明である。好ましくは、ターゲティングされた細胞型を、神経系（中枢神経系および末梢神経系が含まれる）に配置する。

導入遺伝子を内因性対応物の染色体部位に組み込むことが望ましい場合、遺伝子ターゲティングが好ましい。簡潔に述べれば、このような技術を使用すべきである場合、内因性対応物に相同ないくつかのヌクレオチド配列を、染色体配列を使用した相同組換えを介して、内因性遺伝子のヌクレオチド配列の機能に組み込み、破壊する目的でデザインする。

胚顕微操作のためのテクノロジーにおける利点により、哺乳動物の受精卵に異種ＤＮＡを導入することも可能である。例えば、全能性または多能性の幹細胞を、微量注入、リン酸カルシウム媒介沈降、リポソーム融合、レトロウイルス感染、または他の手段によって形質転換することができる。次いで、形質転換した細胞を胚に導入し、次いで、胚をｌトランスジェニック動物に成長させる。好ましい実施形態では、成長中の胚に、所望の導入遺伝子を含むウイルスベクターを感染させ、その結果、導入遺伝子を発現するトランスジェニック動物を感染胚から作製することができる。別の好ましい実施形態では、所望の導入遺伝子を、好ましくは単一細胞段階の胚の前核または細胞質に同時注入し、胚を成熟トランスジェニック動物に成長させた。これらの方法および他の異なるトランスジェニック動物の作製方法が当該分野で十分に確立されており、したがって、本明細書中に詳述しない。例えば、米国特許第５，１７５，３８５号および同第５，１７５，３８４号を参照のこと。

本発明のトランスジェニック動物を、以下の２つの型に大きく分類することができる：「ノックアウト」および「ノックイン」。「ノックアウト」は、標的遺伝子の機能を減少させ、好ましくは、標的遺伝子発現が小さいか検出不可能であるようにトランスジェニック配列の導入を介して標的遺伝子が変化している。「ノックイン」は、例えば、標的遺伝子のさらなるコピーの導入または調節配列の作動可能な挿入によって標的遺伝子発現が増加し、それにより標的遺伝子の内因性コピーの発現が増強された宿主細胞ゲノムが変化したトランスジェニック動物である。ノックインまたはノックアウトトランスジェニック動物は、標的遺伝子に関してヘテロ接合性またはホモ接合性であり得る。ノックアウトおよびノックインの両方は、「バイジェニック（ｂｉｇｅｎｉｃ）」であり得る。バイジェニック動物は、少なくとも２つの変化した宿主細胞遺伝子を有する。好ましいバイジェニック動物は、ＩＦＮ−γをコードする導入遺伝子および少なくとも１つの他の遺伝子の機能を破壊する別のトランスジェニック配列を保有する。

本実施形態の一定の態様では、少なくとも１つの他の遺伝子は、ＥＲストレス関連遺伝子である。別の態様では、他の遺伝子は、外因性遺伝子（すなわち、宿主細胞中に存在しない遺伝子）または内因性遺伝子（すなわち、導入された遺伝子がレシピエント動物由来の内因性対応物を見出す）であり得る。このようなＥＲストレス関連遺伝子を、膵臓ＥＲキナーゼ遺伝子（ＰＥＲＫ）、真核細胞翻訳開始因子２α（ｅＩＦ−２α）、真核細胞翻訳開始因子β（ｅＩＦ−２β）、イノシトール要求１（ＩＲＥ１）、活性化転写因子６（ＡＲＴＦ６）、ＣＡＡＴＴエンハンサー結合タンパク質相同タンパク質（ＣＨＯＰ）、結合免疫グロブリンタンパク質（ＢＩＰ）、カスパーゼ−１２、成長およびＤＮＡ損傷タンパク質３４（ＧＡＤＤ３４）、ＣｒｅＰ（ｅＩＦ２αリン酸化の構成性リプレッサー）、およびＸボックス結合タンパク質−１（ＸＢＰ−１）からなる群から選択することができる。

好ましい非トランスジェニック動物は、膵臓ＥＲキナーゼ遺伝子（ＰＥＲＫ）のヘテロ接合性ノックアウトを含み、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）をコードするトランスジェニックヌクレオチド配列がゲノムに安定に組み込まれている。１つの態様では、好ましいトランスジェニック動物は、野生型動物と比較してＩＦＮ−γ媒介性神経脱髄に対する脆弱性が増加する。

本発明の非ヒトトランスジェニック動物の細胞も本発明で提供する。１つの態様では、細胞は、ＩＦＮ−γをコードする導入遺伝子がゲノムに安定に組み込まれており、ＥＲストレスに相関するタンパク質をコードする少なくとも１つの他の遺伝子が変化している。別の態様では、本発明の細胞は、中枢神経系に由来する。さらに別の態様では、本発明の細胞は乏突起膠細胞である。さらに別の態様では、本発明の細胞は、末梢神経系に由来し、シュワン細胞が含まれるが、これに限定されない。

上記項目で考察されるように、これらの細胞は、神経脱髄容態の分子基盤の解明および神経脱髄の阻害または再髄鞘形成の促進に有効な薬剤の開発のための細胞ベースのアッセイの実施に特に有用である。

（本発明の薬学的組成物：）
ＥＲストレス関連遺伝子またはタンパク質を調整するのに有効な選択された生物活性剤を、神経脱髄障害の治療薬の調製のために使用することができる。好ましい薬剤クラスは、乏突起膠細胞中のＩＦＮ−γ誘発性ＥＲストレスを緩和するのに有効である。

１つの態様では、本発明の選択された薬剤を投与して、細菌およびウイルスなどの病原体によって負わされた神経脱髄を治療することができる。別の態様では、選択された薬剤を使用して、有害物質または体内への有毒代謝産物の蓄積（例えば、橋中心髄鞘崩壊症およびビタミン欠乏症など）に起因する神経脱髄を治療することができる。さらに別の態様では、薬剤を使用して、脊髄損損傷などの物理的損傷に起因する脱髄を治療することができる。なおさらに別の態様では、薬剤を投与して、遺伝的特性を有する障害、遺伝病（白質萎縮、副腎脳白質ジストロフィ、変性多系統萎縮、ビンスワンガー脳症、中枢神経系の腫瘍、および多発性硬化症が含まれるが、これらに限定されない）中に生じた脱髄を治療することができる。

種々の送達系が公知であり、これを使用して、本発明の生物活性剤を投与することができる（例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル中のカプセル化、組換え細胞による発現、受容体媒介性エンドサイトーシス（ＷｕａｎｄＷｕ，（１９８７），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての治療核酸の構築など）。送達方法には、動脈内、筋肉内、静脈内、鼻腔内、および経口経路が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、本発明の薬学的組成物を治療を必要とする領域に局所的に投与することが望ましいかもしれない。これを、例えば、手術中の局所融合、注入、またはカテーテルによって行うことができる。一定の実施形態では、薬剤を、被験体の神経系、好ましくは中枢神経系に送達させる。別の実施形態では、再髄鞘形成を受けている神経組織に薬剤を投与する。

選択された薬剤の投与を、一連の治療を通して１回、連続的、または断続的に行うことができる。最も有効な手段および投薬量の決定方法は、当業者に周知であり、治療に使用される組成物、治療の目的、治療される標的細胞、および治療される被験体によって変化する。単回または複数回の投与を、担当医によって選択された用量レベルおよびパターンを使用して行うことができる。

本発明の薬学的組成物の調製を、一般的に承認されている医薬品の調製手順にしたがって行う。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ１８ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ（１９９０），Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎｅｄ．，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，ＰＡを参照のこと。意図する使用および投与様式に依存して、薬学的組成物の調製において有効成分をさらに処理することが望ましいかもしれない。適切な処理は、適切な非毒性および非干渉性組成物との混合、滅菌、投与単位への分割、および送達デバイス中のカプセル化を含み得る。

経口、鼻腔内、または局所投与のための薬学的組成物を、固体、半固体、または液体形態（錠剤、カプセル、粉末、液体、および懸濁液が含まれる）で供給することができる。注射用組成物を、溶液または懸濁液としてか、乳濁液としてか、注射前に液体に溶解または懸濁するのに適切な固体形態として供給することができる。気道を介した投与のために、好ましい組成物は、適切な噴霧デバイスと共に使用する場合、固体、粉末、またはエアゾールで提供される組成物である。

液体の薬学的に許容可能な組成物を、例えば、本明細書中に具体化したポリペプチドを液体賦形剤（水、生理食塩水、デキストロース水溶液、グリセロール、またはエタノールなど）に溶解または分散させることによって調製することができる。組成物はまた、他の薬用因子（ｍｅｄｉｃｉｎａｌａｇｅｎｔ）、薬学的作用因子（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌａｇｅｎｔ）、アジュバント、キャリア、および助剤（湿潤剤または乳化剤、およびｐＨ緩衝剤など）を含み得る。

必要に応じて、薬学的組成物を、遅延放出形態または徐放形態で処方し、それにより、比較的一定レベルの活性化合物を長期にわたって提供することができる。

（同定されたＥＲストレス関連遺伝子の他の適用：）
本発明の別の実施形態は、被験体中で幹細胞を使用して再髄鞘形成を促進する方法である。このアプローチでは、培養幹細胞を、典型的には、髄鞘形成乏突起膠細胞中のＥＲストレスを改善することができる遺伝子でトランスフェクトする。次いで、遺伝子修飾した幹細胞を、神経脱髄容態を罹患した被験体のＣＮＳに導入する。遺伝子修飾された幹細胞を送達するのに有効な任意の手段を利用可能である。典型的には、幹細胞を、被験体の神経系に直接注射する。この方法論は、例えば、Ｍｏｒｒｉｓ，ｅｔａｌ．（１９９７）ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．２７２（７）：４３２７−３４（本明細書中で参考として援用される）に詳述されている。幹細胞に導入されるべき候補遺伝子には、ＢＩＰ、ＰＥＲＫ、およびサイトカインシグナル伝達１のサプレッサー（ＳＯＣＳ１）が含まれるが、これらに限定されない。

ＥＲストレスから細胞を防御するためにＢＩＰが必要であると報告されている。ＢＩＰの過剰発現により、細胞ｍＲＮＡの翻訳が継続され、それにより、ＥＲストレスを軽減する。ＳＯＣＳ１は、ＩＦＮ−γシグナル伝達を遮断することが知られている。そのようなものとして、ＳＯＣＳ１を過剰発現する幹細胞およびそれによるこのような幹細胞由来の髄鞘形成細胞は、ＩＦＮ−γによって媒介される脱髄効果に対する感受性が低いと予想される。

神経細胞集団を、胚幹細胞の分化培養物から産生することができ（Ｌｉｅｔａｌ．，（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：９７１−９７４）、動物モデル系において種々の欠損を修復するための実験モデルで使用されている（ｒｅｖｉｅｗ，Ｓｖｅｎｄｓｅｎ
ａｎｄＳｍｉｔｈ，ＴｒｅｎｄｓｉｎＮｅｕｒｏｓｃｉ．２２：３５７−３６４）。

ヒトでは、神経細胞は、ヒト胎児性癌細胞に由来し得、レチノイン酸を使用して分化するように誘導することができる。これらの胚幹細胞は、ＣＮＳ疾患の実験モデルにおける欠損を修復することが示されている。いくつかの実施形態では、ＥＲストレスのモジュレーターを、多能性幹細胞で発現することができる。好ましくは、操作された幹細胞を必要とする患者に導入して、再髄鞘形成を誘導し、そして／または本明細書中に引用した障害の患者に関連する脱髄から神経細胞を防御することができる。多能性幹細胞は、胚幹細胞（ＥＳ）または胚生殖細胞（ＥＧ）であり得る。ｉｎｖｉｔｒｏでの幹細胞からの神経前駆細胞の生成は、中枢神経系における組織再構築ならびに遺伝子の送達および発現のための無制限の細胞供給源として役立ち得る。

ＥＳ細胞およびＥＧ細胞の培養方法は、当該分野で公知である。例えば、ＥＳ株およびＥＧ株を、支持細胞層上で培養し、線維芽細胞成長因子および白血病抑制因子などの組換えホルモンの存在下にて未分化状態で成長および維持することができる。ホルモン環境の変化、胚様体の形成、またはこれらの組み合わせによって分化を開始することができる。胚様体形成は、最も広く使用されている過程である。あるいは、組織特異的可逆的形質転換を、米国特許出願番号２００６００６８４９６号（本明細書中で参考として援用される）に記載の方法に従って、出発物質として幹細胞を使用した分化神経細胞株の確立のために使用することができる。米国特許出願番号２００６００６８４９６号は、形質転換遺伝子の組織特異的発現を使用する方法を開示しており、この方法を使用して、特定の細胞型を同定および培養することができる。この形質転換事象を、いくつかの形態の方法で、多数の可能な過程の１つを使用して逆戻させ、非形質転換分化細胞のクローン集団または半精製集団（異なる細胞もしくは半精製細胞またはクローン細胞集団が含まれる）を遊離することができる。グリア線維酸性遺伝子（ＧＦＡＰ）プロモーターを使用して、グリア期限の細胞中で遺伝子が選択的に発現されている。神経前駆細胞を分化させて、神経細胞またはグリア細胞を得ることができる。神経細胞を同定するために使用することができるマーカーには、ＧＦＡＰおよびＭＰＢが含まれるが、これらに限定されない。

細胞療法での使用に好ましい細胞は、ヒト胚幹細胞である。１つの態様では、本発明は、１つまたは複数のＥＲストレスタンパク質のモジュレーターを発現することができる未分化のヒト胚幹細胞の負荷調製物を提供し、この調製物は、ｉｎｖｉｔｒｏで増幅することができ、神経前駆細胞、神経細胞、および／またはグリア細胞に分化することができる。本発明の別の実施形態では、神経前駆細胞は、最初にヒトＥＳ細胞に由来し、ＥＲストレス経路の１つまたは複数のモジュレーターを発現するように操作され、その後に成熟神経細胞およびグリア細胞（乏突起膠細胞および星状細胞が含まれる）に分化する。あるいは、神経前駆細胞は、最初に成熟神経細胞（乏突起膠細胞および星状細胞が含まれる）に分化され、その後にＥＲストレス応答の１つまたは複数のモジュレーターを発現するように操作される。

神経前駆細胞中で発現されるように誘導することができるモジュレーターには、タンパク質の折り畳みおよび成熟、タンパク質輸送、タンパク質の合成および修飾、Ｃａ^２＋ホメオスタシス、転写因子、ＵＰＲ標的遺伝子、およびアポトーシスを媒介するタンパク質のモジュレーターが含まれる。タンパク質の折り畳みおよび成熟のモジュレーターには、ＢＩＰ／ＧＲＰ７８、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ関連タンパク質Ｐ５、コラーゲン結合タンパク質２、第４哺乳動物ＥＲＤＮＡＪタンパク質（ＥＲｄｊ４）、酸素調節タンパク質１５０ｋＤ（ＯＲＰ１５０）、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１３）、ＧＲＰ９４、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼＥＲｐ７０様、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼＥＲｐ６０様、プロリン４ヒドロキシラーゼβ−サブユニット（Ｐ４ＨＢ）、ｈｓｃ７０（７１−ｋＤ熱ショック同族タンパク質）のモジュレーターが含まれるが、これらに限定されない。タンパク質輸送のモジュレーターには、推定ミトコンドリア膜タンパク質輸送受容体（ｈＴＩＭ４４）、トランスロコン関連タンパク質δサブユニット（ＴＲＡＰδ）、および膜貫通タンパク質ｒｎｐ２４が含まれるが、これらに限定されない。タンパク質の合成および修飾のモジュレーターには、グリシル−ｔＲＮＡシンターゼ、アラニル−ｔＲＮＡシンターゼ、アスパラギンシンターゼ、グルタミン−フルクトース−６リン酸アミドトランスフェラーゼ（ＧＦＡＴ）、および内在性膜タンパク質１（ＩＴＭ１）が含まれるが、これらに限定されない。Ｃａ^２＋ホメオスタシスのモジュレーターには、カルアレチキュリン、スタニオカルシン２、原形質膜Ｃａ^２＋ポンプ、ＡＴＰａｓｅ、カルネキシン、新規のＤＮＡ結合／ＥＦ−ハンド／ロイシンジッパータンパク質（ＮＥＦＡ）、およびヌクレオニジン１が含まれるが、これらに限定されない。転写因子のモジュレーターには、ＣＨＯＰ、Ｃ／ＥＢＰ−β、ＴＧＦ−β刺激クローン２２（ＴＳＣ２２）様、Ｘボックス結合タンパク質１（ＸＢＰ−１）、およびＥｇｒ−１が含まれるが、これらに限定されない。ＵＰＲ標的遺伝子のモジュレーターには、ＨＥＲＰおよびＳＥＲＰ／ＲＡＭＰ４のモジュレーターが含まれるが、これらに限定されない。アポトーシスのモジュレーターには、Ｂｂｃ３／ＰＵＭＡ、カスパーゼ３、およびカスパーゼ１２が含まれるが、これらに限定されない。

好ましくは、未分化または分化した神経細胞中で発現するモジュレーターは、ＰＥＲＫ経路のモジュレーターである。１つの実施形態では、ＰＥＲＫ経路の１つまたは複数のモジュレーターを、未分化または分化した神経細胞で発現することができる。例えば、神経前駆細胞を、リン酸化ｅＩＦ−２α（ｐ−ｅＩＦ−２α）レベルが上昇する一方で、ＩＦＮ−γサイトカインシグナル伝達経路のインヒビター（例えば、ＳＯＣＳ１）を同時に発現する合成ＰＥＲＫ融合酵素を発現するように誘導することができる。

さらに別の態様では、本発明は、ＰＥＲＫ経路のモジュレーターを発現する神経前駆細胞、神経細胞、およびグリア細胞を提供し、これらを、細胞療法および遺伝子療法のために使用することができる。幹細胞のために選択される送達経路は、送達経路が損傷した器官の修復が起こるかどうかを決定するための一助となると言う点で極めて重大である。損傷領域付近の高濃度の幹細胞は、器官を修復するための十分な幹細胞の局在化および分化が起こる機会を増加させる。多くの場合、これは、幹細胞の標的化投与および領域投与を含む。

遺伝子療法は、髄鞘形成細胞のＥＲストレスの調整によって再髄鞘形成を促進するための代替アプローチである。ｉｎｖｉｖｏまたはｅｘｖｉｖｏのために発現ベクターを使用する場合、薬学的に許容可能なベクター（複製能力のないレトロウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターなど）が好ましい。本発明のＥＲストレス抑制遺伝子を含む薬学的に許容可能なベクターを、挿入したポリヌクレオチドの一過性または安定な発現のためにさらに修飾することができる。本明細書中で使用される、用語「薬学的に許容可能なベクター」には、ＥＲストレス抑制遺伝子を選択的にターゲティングして神経系に存在する細胞（好ましくは、神経系中の乏突起膠細胞）に導入する能力を有するベクターまたは送達ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）が含まれるが、これらに限定されない。複製能力のないレトロウイルスベクターの例は、ＬＮＬ６である（Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．ｅｔａｌ．（１９８９）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ７：９８０−９９０）。遺伝子マーカーのレトロウイルス媒介性遺伝子導入のための複製能力のないレトロウイルスの使用方法は、十分に確立されている（Ｃｏｒｒｅｌｌｅｔａｌ．（１９８９）ＰＮＡＳＵＳＡ８６：８９１２；Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ（１９８９）ＰＮＡＳＵＳＡ８６：８９１２−５２；Ｃｕｌｖｅｒ，Ｋ．（１９９１）ＰＮＡＳＵＳＡ８８：３１５５；ａｎｄＲｉｌｌ，Ｄ．Ｒ．（１９９１）Ｂｌｏｏｄ７９（１０）：２６９４−７００）。臨床的調査により、ウイルスベクターに関連する副作用はほとんど無いか全く無いことが示されている（Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６：８０８−１３を参照のこと）。あるいは、ＥＲストレス抑制遺伝子の導入を、Ｃｈｅｒｎａｊｏｖｓｋｙ，ｅｔ
ａｌ．（２００４）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４（１０）：８００−１１に記載の方法を使用して行うことができる。

髄鞘形成細胞（乏突起膠細胞およびシュワン細胞が含まれる）中のＥＲストレス原因遺伝子の発現を、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）テクノロジー（転写後遺伝子サイレンシング型）の使用によって阻害または防止することができる。ＲＮＡｉを使用して、偽「ノックアウト」（すなわち、遺伝子によってコードされた産物または目的のコード領域の発現が減少し、系中のコードされた産物の活性が全体的に減少する系）を作製することができる。そのようなものとして、ＲＮＡｉを行って、核酸またはそのフラグメントもしくは変異型（ｖａｒｉａｎｔ）をターゲティングし、次に、コードする産物の発現および活性レベルを減少させることができる。このような系を、産物の機能的研究のために使用することができ、このような産物の活性に関連する障害を治療することもできる。ＲＮＡｉは、例えば、Ｈａｍｍｏｎｄｅｔａｌ．（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ１０；２９３（５５３２）：１１４６−５０．，Ｃａｐｌｅｎｅｔａｌ．（２００１）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．２００１Ａｕｇ１４；９８（１７）：９７４２−７（その全てが本明細書中で参考として援用される）に記載されている。ＲＮＡｉを行うための試薬およびキットは、例えば、ＡｍｂｉｏｎＩｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘ．，ＵＳＡ）およびＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓＩｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．，ＵＳＡ）から市販されている。

いくつかの系におけるＲＮＡｉの初期因子（ｉｎｉｔｉａｌａｇｅｎｔ）は、標的核酸に対応するｄｓＲＮＡ分子であると考えられる。次いで、ｄｓＲＮＡは、２１〜２３ヌクレオチド長（１９〜２１ｄｂｐの二重鎖（それぞれ２つのヌクレオチド３’オーバーハングを有する））である低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に切断すると考えられる。この第１の切断工程を行うと考えられる酵素は、「ダイサー」と呼ばれ、ｄｓＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼの多数のＲＮアーゼＩＩＩファミリーに分類される。あるいは、ＲＮＡｉを、細胞への直接導入またはこのようなｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ様分子の適切な前駆体（例えば、前駆体をコードするベクターなど）の細胞への導入による細胞内での生成を介して行うことができる。次いで、ｓｉＲＮＡを他の細胞内成分と結合させて、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成することができる。このようにして形成されたＲＩＳＣは、その後、相同性によってそのｓｉＲＮＡ成分と標的転写物との間の塩基対合相互作用を介して目的の転写物をターゲティングし、標的転写物がｓｉＲＮＡの３’末端から約１２ヌクレオチド切断することができる。したがって、標的ｍＲＮＡが切断され、コードされるタンパク質産物のレベルが減少する。

ＲＮＡｉを、細胞への適切なｉｎｖｉｔｒｏ合成ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ様分子の導入によって行うことができる。ＲＮＡｉを、例えば、化学合成ＲＮＡを使用して行うことができる。あるいは、適切な発現ベクターを使用して、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎ
ｖｉｖｏでこのようなＲＮＡを転写することができる。センス鎖およびアンチセンス鎖（同一のベクターまたは個別のベクター上に存在する配列によってコードされた）のｉｎ
ｖｉｔｒｏ転写を、例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを使用して行うことができ、この場合、ベクターは、Ｔ７プロモーターに作動可能に連結された適切なコード配列を含み得る。ｉｎｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡを、実施形態で、（例えば、大腸菌ＲＮアーゼＩＩＩを使用して）ｉｎｖｉｔｒｏにてＲＮＡｉをもたらすサイズにプロセシングすることができる。センスおよびアンチセンス転写物を組み合わせて、ＲＮＡ二重鎖を形成し、これを目的の標的細胞に導入する。小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を発現し、これをｓｉＲＮＡ様分子にプロセシングすることができる他のベクターを使用することができる。種々のベクターベースの方法は、例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐｅｔａｌ．（２００２）ＳｃｉｅｎｃｅＡｐｒ１９；２９６（５５６７）：５５０−３．Ｅｐｕｂ２００２Ｍａｒ２１；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌ（２００２）Ｓｅｐｔ２（３）：２４３−７．Ｐａｄｄｉｓｏｎｅｔａｌ．（２００２）ＧｅｎｅｓＤｅｖ．２００２Ａｐｒ１５；１６（８）：９４８−５８に記載されている。ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏ（例えば、遺伝子療法）のいずれかで細胞にこのようなベクターを導入するための種々の方法は、当該分野で公知である。

したがって、１つの実施形態では、１つまたは複数のＥＲストレス原因遺伝子の発現を、ＥＲストレス抑制遺伝子またはそのフラグメントをコードする核酸またはその核酸に相同な核酸に対応するｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ様分子を細胞に導入するか細胞内で精製するによって阻害することができる。「ｓｉＲＮＡ様分子」は、ｓｉＲＮＡと（例えば、サイズおよび構造が）類似し、ｓｉＲＮＡ活性を誘発する（すなわち、ＲＮＡｉ媒介性発現阻害をもたらす）ことができる核酸分子をいう。種々の実施形態では、このような方法は、細胞へのｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ様分子の直接投与または上記のベクターベースの方法の使用を必要とし得る。１つの実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ様分子は、約３０ヌクレオチド長未満である。さらなる実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ様分子は、約２１〜２３ヌクレオチド長である。１つの実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ様分子は、約１９〜２１ｂｐの二重鎖部分を含み、それぞれの鎖が２つの３’オーバーハングを有する。実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ様分子は、ＥＲストレス原因遺伝子またはそのフラグメントもしくは変異型（または変異型のフラグメント）をコードする核酸に実質的に相同である。このような変異型は、ＥＲストレス原因活性を有するタンパク質をコードすることができる。

このようなＲＮＡｉ法を使用して、例えば、中枢神経系中のＩＦＮ−γの発現を阻害することができる。ＲＮＡｉ法によって阻害することができるＥＲストレス原因遺伝子には、ＩＦＮ−γ、ＧＡＤＤ３４、タンパク質ホスファターゼ１（ＰＰ１）、およびアポトーシスを媒介する１つまたは複数の遺伝子（例えば、カスパーゼをコードする遺伝子）が含まれるが、これらに限定されない。

本発明を、以下の実施例を参照してより深く理解することができ、実施例は単なる例示を意図するが、本発明の実施で現在知られている様式を制限しない。

（実施例１：ＩＦＮ−γは、初期脱髄、乏突起膠細胞の喪失、ミエリン遺伝子発現の減少に影響を及ぼさない）
脱髄に及ぼすＩＦＮ−γの影響を、テトラサイクリン調節系を使用してＩＦＮ−γの送達を一過性に調節することが可能なトランスジェニックマウスを使用したクプリゾン動物モデルにおいて評価した（Ｌｉｎ，ｅｔａｌ．（２００４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：１００７４−１００８３）。トランスジェニックマウスを、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドの１１０ＧＦＡＰ／ｔＴＡマウス株とＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドの１８４ＴＲＥ／ＩＦＮ−γとを交配して、ＧＦＡＰ／ｔＴＡ；ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ二重トランスジェニックマウスを得ることによって作製した（Ｌｉｎ，ｅｔａｌ．（２００４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：１００７４−１００８３）。コントロール（ＤＯＸ＋）マウスにおけるｔＴＡによるＴＲＥ／ＩＦＮ−γ導入遺伝子の転写活性化を、飲料水に０．０５ｍｇ／ｍｌドキシサイクリンを添加し、これを計画日から自由に与えることによって抑制した。ＤＯＸ＋二重トランスジェニックマウスは、クプリゾン固形飼料を与えられ、且つドキシサイクリン溶液から決して開放されないＧＦＡＰ／ｔＴＡ；ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ二重トランスジェニック動物であった。ＤＯＸ−二重トランスジェニックマウスは、クプリゾン固形飼料を与えられ、且つＩＦＮ−γ発現を誘導するためにドキシサイクリンから開放したＧＦＡＰ／ｔＴＡ；ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ二重トランスジェニック動物であった。

０．２％クプリゾン（Ｓｉｇｍａ− Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＩ）を含む破砕マウス固形飼料をマウスに６週間まで与えることによって、６週齢のＤＯＸ＋およびＤＯＸ−雄マウスに脱髄を誘導した。その後、両マウス群を、正常な飼料に３週間戻して、再髄鞘形成をさせた。全動物手順を、ＮＩＨＧｕｉｄｅｆｏｒｔｈｅＣａｒｅａｎｄＵｓｅｏｆＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌｓを完全に遵守して行い、これらの手順は、ＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅｏｆＴｈｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｈｉｃａｇｏによって承認された。

脱髄に及ぼすＩＦＮ−γおよびＭＢＰの影響を、ＩＦＮ−γおよびＭＨＣ−Ｉレベル、乏突起膠細胞の喪失、およびミエリン遺伝子の発現として評価した。

これらの動物中のＩＦＮ−γ発現を、以下のように酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）分析によって試験した。脊髄および前脳を取り出し、氷冷ＰＢＳでリンスし、その直後に電動ホモジナイザーを使用して完全プロテアーゼカクテル（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を含む５倍体積のＰＢＳ中で均質化した。氷上で５分間のインキュベーション後、抽出物を、１４０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって明澄化した。各抽出物のタンパク質含有量を、ＤＣタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）によって決定した。ＥＬＩＳＡアッセイを、マウスＩＦＮ−γＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍ，５Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）およびＭＢＰ抗体（１：１０００；ＳｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒＭｏｎｏｃｌｏｎａｌｓ）を使用し、製造者の説明書にしたがって行った。

リアルタイムＰＣＲを使用して、ＭＨＣ−Ｉ発現に及ぼすＩＦＮ−γの影響を決定した。ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、脳梁（Ｊｕｒｅｖｉｃｓ，ｅｔａｌ．，２００２）から単離し、ＤＮＡｓｅＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で処置してゲノムＤＮＡを消失させた。逆転写を、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍｆｏｒＲＴ−ＰＣＲｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して行った。リアルタイムＰＣＲを、ｉＱｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＨｅｒｃｕｌｅｓＣＡ）を使用して、Ｂｉｏ−ＲａｄｉＱリアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＨｅｒｃｕｌｅｓＣＡ）にて行った。リアルタイムＰＣＲ用のプライマーおよびプローブ（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ．，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）を以下に示した。

ＭＨＣ−ＩのＰＣＲ反応で使用したセンスおよびアンチセンスプライマーは、それぞれ、以下であった：

。
プローブは、ＭＨＣ−Ｉプローブ：

であった。

乏突起膠細胞集団に及ぼすＩＦＮ−γの影響を、抗ＣＣ１抗体（ＡＰＣ７，１：５０；ＥＭＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）を使用した乏突起膠細胞の免疫組織化学的分析によって評価した。最初にマウスを麻酔し、左心室を介して４％パラホルムアルデヒドを含む０．１ＭＰＢＳを潅流したマウスから得た脳切片に対して免疫組織化学を行った。脳を取り出し、パラホルムアルデヒドで後固定し、３０％スクロース中で低温保存し、ＯＣＴ中に包埋し、凍結乾燥させた。凍結切片を、クリオスタット中で厚さ１０μｍに切断した。シドマン切片（Ｓｉｄｍａｎｓｅｃｔｉｏｎ）２４１〜２５１に対応する脳梁の脳弓領域の冠状断面を、使用するために選択し、全ての比較分析を、正中脳梁に制限した（Ｓｉｄｍａｎ，ｅｔａｌ．（１９７１）ＡｔｌａｓｏｆｔｈｅＭｏｕｓｅＢｒａｉｎａｎｄＳｐｉｎａｌＣｏｒｄ（ＨａｒｖａｒｄＵｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）。免疫組織化学のために、凍結切片を、−２０℃アセトンで処理し、１０％ＮＧＳおよび０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳでブロッキングし、ブロッキング液で希釈した一次抗体と共に一晩インキュベートした。適切な蛍光色素または酵素で標識した二次抗体（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を、検出のために使用した。ＣＣ１に対する抗体（ＡＰＣ７，１：５０；ＥＭＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）を、成熟乏突起膠細胞のマーカーとして使用した。ＭＢＰに対する抗体（１：１０００；ＳｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒＭｏｎｏｃｌｏｎａｌｓ，Ｌｕｔｈｅｒｖｉｌｌｅ，ＭＡ）を使用して、髄鞘形成度を検証した。活性カスパーゼ−３に対する抗体（１：５０，ＣｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を、アポトーシス細胞のマーカーとして使用した。蛍光染色切片を、ＤＡＰＩ（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄマウント培地（ｍｏｕｎｔｉｎｇｍｅｄｉｕｍ）を使用してマウントし、ＺｅｉｓｓＡｘｉｏｐｌａｎ蛍光顕微鏡を使用して視覚化した。ＯｐｅｎＬａｂソフトウェアスイートを使用して、ＡｐｐｌｅＭａｃｉｎｔｏｓｈコンピュータに接続したＰｈｏｔｏｍｅｔｒｉｅｓＰＸＬＣＣＤカメラを使用して画像を収集した。免疫陽性細胞を、０．０４ｍｍ^２の領域に限定された正中脳梁内の陽性細胞の計数によって定量した。ＤＡＰＩ染色によって認められる核を有する細胞のみを計数した。各ＭＢＰ免疫染色スライドを、０から４のスケールで記録した。スコア０は、成体マウスの脳梁中の完全な脱髄を示し、スコア４は正常な髄鞘形成を示す。

以下のプライマーａｄｎプローブを使用したリアルタイムＰＣＲを上記のように使用して、ＭＢＰ、ＰＬＰ、およびＣＧＴの発現を決定した：

ＭＢＰレベルも上記の免疫組織化学的分析およびＭＢＰに対する抗体（１：１０００；ＳｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒＭｏｎｏｃｌｏｎａｌｓ，Ｌｕｔｈｅｒｖｉｌｌｅ，ＭＡ）の使用によって決定されるので、脱髄の程度を決定した。脱髄を、下記の電子顕微鏡法によっても評価した。マウスを麻酔し、４％パラホルムアルデヒドおよび２．５％グルタルアルデヒド（ｐＨ７．３）を含む０．１ＭＰＢＳを使用して潅流した。脳を１ｍｍの切片にスライスし、脳弓領域に対応する切片をトリミングし、分析のために処理し、脳梁断面が得られるように仕向けた。薄片を切断し、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色し、以前に記載のように分析した（Ｃｏｅｔｚｅｅ，ｅｔａｌ．（１９９６）Ｃｅｌｌ８６：２０９−２１９）。再有髄軸索の全比率は、マウスあたり最小で３００本の線維の分析に基づいた。

結果は、ＤＯＸ＋マウスが研究中に前脳にＩＦＮ−γを発現しなかった一方で、ＤＯＸ−マウスは２週間のクプリゾン処置およびドキシサイクリンの除去後に前脳中に約２０ｐｇ／ｍｇのＩＦＮ−γを発現し始めたことを示す（図１Ａ）。リアルタイムＰＣＲ分析は、ＩＦＮ−γレベルの増加によって再髄鞘形成中の脳梁中に主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ（ＭＨＣ−Ｉ）（ＩＦＮ−γシグナル伝達の下流標的）の発現が有意に増加したことを示した（図１Ｂ）。クプリゾン処理から５週間後、ＤＯＸ＋およびＤＯＸ−二重トランスジェニックマウスの脳梁中の脱髄は最大レベルに到達し（図２）、軸索はほとんど完全に脱髄された（図３）。また、この時、ＣＣ１陽性成熟乏突起膠細胞は、ＤＯＸ＋およびＤＯＸ−二重トランスジェニックマウスの両方において病変部位内で喪失した（図４）。さらに、クプリゾンでの処置から２週間および４週間の脱髄期間中に、ミエリン遺伝子ＭＢＰ、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、およびセラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）の発現が減少し、この減少は、ＤＯＸ＋およびＤＯＸ−二重トランスジェニックマウスの間で類似していた（図５）。

これらのデータにより、ＩＦＮ−γの存在はクプリゾン曝露によって誘導された初期病的過程に有意な影響を及ぼさないことが示唆される。

統計学。データを、平均±標準偏差として示す。Ｓｉｇｍａｓｔａｔ３．１ソフトウェアを使用した一元配置ＡＮＯＶＡ検定によって多重比較を統計的に評価した。ｐ＜０．０５の場合、差異を統計的に有意と見なした。

（実施例２：ＩＦＮ−γは、脱髄病変中の再髄鞘形成を抑制する）
実施例１に記載のクプリゾン処置マウスにおける再髄鞘形成に及ぼすＩＦＮ−γの影響を、以下の５週間目のクプリゾンの使用中止後に決定した。使用した実験方法は、実施例１に記載の方法と同一である。

図１ＡおよびＢは、ＤＯＸ−マウス中に存続するＩＦＮ−γレベルがクプリゾンの使用中止後でさえも増加し、ＩＦＮ−γの増加に伴ってＭＣＨ−１が持続的に増加したことを示す。８週目までに、ＤＯＸ＋マウスの脳梁中にかなりの数の乏突起膠細胞が認められた一方で、ＤＯＸ−中の乏突起膠細胞の再生は抑制された（図２ＡおよびＢ）。ＤＯＸ＋二重トランスジェニックマウスの脳梁中の再髄鞘形成は６週目に開始され、クプリゾンが飼料から除去された２週間後に明らかであった（８週目；図３）。コントロールマウスＤＯＸ＋では、８週目に多数の軸索が実質的に回復したのに対して（４８．４％±４％、図４）、ＤＯＸ−マウスの脳梁中の再髄鞘形成は顕著に抑制されたままであり（８週目；図３）、それに伴って、再有髄軸索がより少なかった（２６．９％±７％、図４）。ミエリン遺伝子が再髄鞘形成過程中に上方制御することを示したという前の所見と一致して、コントロールＤＯＸ＋マウスの脳梁において、ミエリン遺伝子ＭＢＰ、ＰＬＰ、およびＣＧＴは、６週目で上方制御され、８週目でピークレベルに到達した（図５）。しかし、ＤＯＸ−マウスでは、同一のミエリン遺伝子の発現は、６週目および８週目の両方で有意に低下した。

これらのデータは、脱髄病変中のＩＦＮ−γの存在が再髄鞘形成を抑制することを示す。

（実施例３：ＩＦＮ−γは、脱髄病変中のＣＣ１陽性乏突起膠細胞の再増殖を減少させる）
再髄鞘形成は、病変部位での乏突起膠細胞前駆体（ＯＰＣ）による脱髄病変の再増殖によって起こり、乏突起膠細胞前駆体は病変部位で乏突起膠細胞に分化する（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ，ｅｔａｌ．（２００１）ＢｒａｉｎＰａｔｈｏｌ．１１：１０７−１１６；Ｍａｓｏｎ，ｅｔａｌ．（２０００）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．６１：２５１−２６２）。ＣＣ１陽性乏突起膠細胞は、ＮＧ２陽性ＯＰＣに由来する（Ｗａｔａｎａｂｅｅｔａｌ１９９８；Ｍａｓｏｎｅｔａｌ２０００））。したがって、病変の再増殖を、ＣＣ１および／またはＮＧ２陽性細胞の存在によって評価することができる。

乏突起膠細胞前駆体（ＯＰＣ）による脱髄病変の再増殖に及ぼすＩＦＮ−γの影響を、実施例２のマウスにおいて、ＤＯＸ＋およびＤＯＸ−マウスの脳梁由来の切片中で計数したＣＣ１陽性成熟乏突起膠細胞およびＮＧ２陽性ＯＰＣの数として評価した。再髄鞘形成中の乏突起膠細胞の分析のために使用した方法は、実施例２に記載の方法と同一である。ＯＰＣ中のＮＧ２の免疫染色を、ＮＧ２抗体（１：５０；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を使用して行った。

クプリゾン曝露から６週間後、ＣＣ１陽性乏突起膠細胞は、コントロールＤＯＸ＋マウスの脱髄脳梁内に再出現し始め（４２．５±２．１／０．０４ｍｍ^２）、８週目にｋ２２８．７±２０．２／０．０４ｍｍ^２に到達した。しかし、ＤＯＸ−二重トランスジェニック動物では、同一測定点（８週目）で脳梁内のＣＣ１陽性乏突起膠細胞数が劇的に減少した（７８±１２．７／０．０４ｍｍ^２）。クプリゾン処置の４週目に、ＩＦＮ−γが、ＤＯＸ＋動物中の数と比較した場合、ＤＯＸ−マウスの脳梁中のＮＧ２陽性ＯＰＣ数が有意に増加した（ＤＯＸ−：４６±４．２４対ＤＯＸ＋：１９±２．１２／０．０４ｍｍ^２；ｐ＜０．０５）。しかし、６週目に、ＤＯＸ−マウスは、ＤＯＸ＋マウスよりもＮＧ２陽性ＯＰＣが少なかった（ＤＯＸ− ３１．５±０．７１対ＤＯＸ＋８０±２．８／０．０４ｍｍ^２；ｐ＜０．０５）。７週目および８週目までに、ＤＯＸ−マウス中のＮＧ２陽性ＯＰＣ数は、ＤＯＸ＋マウスに匹敵するようになった（図６）。

データは、ＣＣ１陽性乏突起膠細胞数の減少はＩＦＮ−γの存在下での脱髄病変の不十分な再髄鞘形成に寄与すること、および動員されたＯＰＣ数に有意に影響を及ぼすことなくＩＦＮ−γが病変部位へのＯＰＣの動員を遅延させることを示す。

（実施例４：ＩＦＮ−γはＭＳ動物モデルにおける再髄鞘形成を阻害する）
ＣＮＳへのＩＦＮ−γの送達を一過性に調節することが可能な二重トランスジェニックマウス（Ｌｉｎｅｔａｌ．，ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ２４：１００７４−１００８３（２００４））を使用して、ＥＡＥの病理発生におけるＩＦＮ−γの役割を評価した。ＧＦＡＰ／ｔＴＡ；ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ二重トランスジェニックマウスを実施例１に記載のように使用して、ＥＡＥに起因する脱髄に及ぼすＩＦＮ−γの影響を決定した。全マウスに、計画日からドキシサイクリンを与えてＩＦＮ−γ発現を抑制し、ミエリン乏突起膠細胞タンパク質（ＭＯＧ３５−５５）で免疫化してＥＡＥを誘導した。免疫化後７日目（ＰＩＤ７）に、実験群のドキシサイクリンの使用を中止した（ＰＩＤ７ＤＯＸ−）。

実施例１に記載のＥＬＩＳＡ免疫アッセイを使用してコントロール（ＤＯＸ＋）およびＰＩＤ７ＤＯＸ−マウスにおけるＩＦＮ−γレベルを決定し、疾患の重症度を、臨床スコアの関数として評価した。臨床重症度スコアを、０〜５ポイントのスケール（０＝健康、１＝弛緩した尾、２＝運動失調および／または後肢の不全麻痺、３＝後肢の麻痺および／または前肢の不全麻痺、４＝四肢の麻痺（ｔｅｔｒａｐａｒａｌｙｓｉｓ）、および５＝瀕死または死亡）」にしたがって記録した。

ＥＡＥを罹患したＤＯＸ＋およびＤＯＸ−動物由来の脊髄を、ＭＢＰで免疫染色し、軸索の再髄鞘形成を評価した。ＤＯＸ＋およびＤＯＸ−マウス由来の脊椎中の乏突起膠細胞数を、ＣＣ１陽性細胞数として決定した。軸索損傷を、非リン酸化神経フィラメント−Ｈの免疫染色によって評価した。非リン酸化神経フィラメント−Ｈに対する抗体は、１０００倍希釈したＳＭＩ３２であり、ＳｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒＭｏｎｏｃｌｏｎａｌｓから入手した。

ＥＬＩＳＡアッセイ由来の結果は、ＤＯＸ＋およびＤＯＸ−マウス中のＩＦＮ−γレベルがＰＩＤ１７での疾患ピークで類似する（６０ｐｇ／ｍｇ）ことを示した。ＰＩＤ５０では、ＩＦＮ−γレベルは、コントロールＤＯＸ＋マウス（６．２２ｐｇ／ｍｇ）よりもＤＯＸ−マウス（４０．２４ｐｇ／ｍｇ）で有意に高かった。

ＰＩＤ１７での平均最大臨床スコアは、ＤＯＸ＋およびＤＯＸ−ＰＩＤ１７マウスで類似していた（それぞれ、ＤＯＸ＋：２．６６±０．８０およびＤＯＸ−：２．６９±０．６９）。この時、２５匹のコントロールマウスのうちの２０匹および３０匹のＤＯＸ−マウスのうちの２４匹が、後肢麻痺を発症した。コントロールマウスは、２１日目までにＥＡＥから回復し始め、５０日目までに（ＰＩＤ５０）、コントロールＤＯＸ＋マウスは、ナイーブマウスと識別不可能であった。しかし、ＰＩＤ５０で、ＥＡＥに特徴的な後肢麻痺を発症したＤＯＸ−マウスの半分（１２／２４）は、コントロール群で回復が認められた時点で、麻痺を罹患したままであった（ＰＩＤ５０）。コントロールＤＯＸ＋マウスの臨床スコアがＰＩＤ５０で１未満に減少した一方で、ＤＯＸ−マウスのスコアはほぼ２のままであった（図７）。

ＰＩＤ７では、ＤＯＸ−マウスの腰髄中のＭＢＰレベルは、ＤＯＸ＋マウスと比較した場合、顕著に減少した（図８Ａおよび８Ｂ）。トルイジンブルー染色は、ＤＯＸ−マウス由来の多数の軸索が髄鞘形成しなかった一方で、ＤＯＸ＋マウス由来の軸索はほとんど髄鞘形成しなかったことを示した（図８Ｃおよび８Ｄ）。ＣＣ１陽性乏突起膠細胞数は、ＤＯＸ−動物において、ＰＩＤ５０で有意に減少した（図８Ｅおよび８Ｆ）。非リン酸化神経フィラメント−Ｈの免疫染色は、ＤＯＸ＋およびＤＯＸ−マウスで類似し、したがって、軸索損傷はＩＦＮ−γに影響を受けないことを示した（図８Ｇおよび８Ｈ）。

これらのデータは、ＩＦＮ−γがＥＡＥからの回復を遅延させ、ＩＦＮ−γに起因する再髄鞘形成の失敗はＤＯＸ−マウスの不十分な回復に寄与したことを示す。

（実施例５：ＩＦＮ−γは、ＥＡＥ脱髄病変における炎症反応を増強する）
ＩＦＮ−γは、ＭＨＣ抗原を誘導してマクロファージおよびＴリンパ球を活性化することが知られている。Ｔ細胞およびマクロファージの決定ならびにＭＨＣ−１、ＴＮＦ−ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、およびＩＬ−１７の発現の測定によって再髄鞘形成中のＣＮＳにおけるＩＦＮ−γの炎症効果を研究した。実施例４に記載のように、ＥＡＥを罹患したＤＯＸ＋およびＤＯＸ−マウス由来の組織において免疫組織化学を行った。実験手順は、上記実施例に記載の手順に従った。

ＣＤ３（ＣＤ３抗体１：５０；ＳａｎｔａＣｒｕｚ，ＳａｎｔａＣｒｕｚ，ＣＡ）およびＣＤ１１ｂ（ＣＤ１１ｂ抗体１：５０，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｎｅｃｕｌａ，ＣＡ）の免疫染色は、ＩＦＮ−γがＤＯＸ＋およびＤＯＸ−マウスの腰髄中の浸潤Ｔ細胞およびマクロファージ数を有意に増加させないことを示した（図９ＡおよびＢ）。リアルタイムＰＣＲ分析により、ＤＯＸ＋動物と比較した場合、ＤＯＸ−マウスにおいてＩＦＮ−γがＭＨＣ−１、ＴＮＦ−ａ、ＩＬ−２、およびＩＬ−１２の発現を増加させ、ＩＬ−１７の発現を減少させることが明らかとなった。ＩＦＮ−γは、ｉＮＯｓおよびＩＬ−２３の発現を変化させなかった（図９Ｅ）。使用したプローブおよびプライマーは以下である：ＭＨＣ−Ｉセンスプライマー：

ＭＨＣ−Ｉアンチセンスプライマー：

ＭＨＣ−Ｉプローブ：

これらのデータは、ＩＦＮ−γがＥＡＥの回復段階で脱髄病変中の免疫応答を適度に増強し、それにより、このサイトカインによって誘発された再髄鞘形成不全に寄与することを示す。

（実施例６：ＩＦＮ−γによる再髄鞘形成の抑制はＥＲストレスに関連する）
乏突起膠細胞は、タンパク質合成の破壊および分泌経路の混乱に高い感受性を示すことが示されている（Ｐｆｅｉｆｆｅｒ，ｅｔａｌ．（１９９３）ＴｒｅｎｄｓＣｅｌｌ
Ｂｉｏｌ．３：１９１−１９７；Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄ，ｅｔａｌ．（２００２）Ｎｅｕｒｏｎ３６：５８５−５９６；Ｌｅｅｇｗａｔｅｒ，ｅｔａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２９：３８３−３８８）。ＩＦＮ−γが再髄鞘形成乏突起膠細胞における小胞体（ＥＲ）機能を妨害するかどうかを決定するために、ＩＦＮ−γを発現するマウスの脳梁中のＥＲストレスマーカーの発現をモニタリングした。実施例１に記載のトランスジェニックマウスを使用して研究を行った。

実施例１のクプリゾン処置マウスの脳梁中のＥＲストレス関連遺伝子結合免疫グロブリンタンパク質／７８ｋＤａグルコース調節タンパク質（ＢＩＰ／ＧＲＰ７８）およびＣＡＡＴＴエンハンサー結合タンパク質相同タンパク質／成長およびＤＮＡ損傷タンパク質１５３（ＣＨＯＰ／ＧＡＤＤ１５３）をコードするｍＲＮＡのレベルを、実施例１に記載のように、リアルタイムＰＣＲを使用して決定した。使用したプローブ、センスプライマー、およびアンチセンスプライマーは、以下であった。

。

ｅＩＦ−２複合体上のヌクレオチド交換を阻害してほとんどのタンパク質合成を弱めるリン酸化ｅＩＦ−２αのレベルをウェスタンブロットによって分析し、上記のように、発現はＣＣ１抗体の免疫染色によって共存した。ウェスタンブロット分析を、以下のように行った。３匹のマウス由来の脳梁を、氷冷リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）でリンスしてプールし、その直後に、電動ホモジナイザーを使用して、５倍体積のＴｒｉｔｏｎＸ−１００緩衝液（２０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０％グリセロール、１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭピロリン酸四ナトリウム、１００ｍＭＮａＦ、１７．５ｍＭ β−グリセロホスフェート、１０ｍＭフェニルメチルスルホニルフッ化物、１５μｇ／ｍｌアプロトニン、および６μｇ／ｍｌペプスタチンＡ）中で均質化した。氷上で１５分間のインキュベーション後、抽出物を、１４，０００ｒｐｍでそれぞれ３０分間の２回の遠心分離によって明澄化した。各抽出物のタンパク質含有量を、タンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって決定した。抽出物（４０μｇ）を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ニトロセルロースに移した。ブロットを、一次抗体（下記）とインキュベートし、シグナルを、西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合二次抗体との反応後の化学発光によって明らかにした。以下の一次抗体を使用した：抗ｅＩＦ−２α；（１：５００；ＳａｎｔａＣｒｕｚ，ＳａｎｔａＣｒｕｚ，ＣＡ）、抗ｐ−ｅＩＦ−２α（１：１０００，ＣｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＣＨＯＰ（１：５００；ＳａｎｔａＣｒｕｚ）、および抗アクチン（１：１０００；Ｓｉｇｍａ，ＳｔＬｏｕｉｓ，ＭＯ）。

ＥＲストレス応答に関連するＢＩＰおよびＣＨＯＰのｍＲＮＡレベルは、コントロールＤＯＸ＋動物と比較して、ＤＯＸ−二重トランスジェニックマウスの脳梁中で約２倍に増加した（図１０Ａおよび１０Ｂ）。ウェスタンブロット分析によって、ＤＯＸ−二重トランスジェニックマウスの脳梁中でＣＨＯＰタンパク質レベルの増加（約１．７倍）も認められた（図１０Ｃ）。ウェスタンブロット分析により、ＩＦＮ−γが同一のＤＯＸ−動物の脳梁中のリン酸化ｅＩＦ−２α（ｐ−ｅＩＦ−２α）レベルを約１．８倍に上昇させることも明らかとなった（図１０Ｃ）。さらに、ＣＣ１抗体を使用した共存分析により、再髄鞘形成乏突起膠細胞のｐ−ｅＩＦ−２αレベルが増加することが明らかとなった（図１０Ｄおよび図１０Ｅ）。

これらの結果は、再髄鞘形成に及ぼすＩＦＮ−γの有害な影響がＥＲストレス経路の活性化に関連することを示す。

（実施例７：ＰＥＡＫがＩＦＮ−γによって誘導された再髄鞘形成の減少の重症度を調整する）
病変を再髄鞘形成するためのＩＦＮ−γに起因する減少におけるＥＲストレス応答の関与を、膵臓ＥＲキナーゼ（ＰＥＲＫ）の機能変異の喪失にヘテロ接合性を示し（Ｈａｒｄｉｎｇ，ｅｔａｌ．，（２００１）ＭｏｌＣｅｌｌ７：１１５３−１１６３）、ＣＮＳ中のＩＦＮ−γの発現を一過性に調節するように作製されたトランスジェニックマウスで試験した。ＴＲＥ／ＩＦＮ−γマウスを、最初に、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドのＰＥＲＫ＋／−マウスと交配して（Ｈａｒｄｉｎｇ，ｅｔａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ７：１１５３−１１６３）、ＰＥＲＫ変異を有するマウスを作製し、得られた子孫をＧＦＡＰ／ｔＴＡマウスと交配させて、ＰＥＲＫ変異にヘテロ接合性を示すトランスジェニックマウスを得た。ＩＦＮ−γの存在下または非存在下での再髄鞘形成に及ぼすＰＥＲＫの影響を、再髄鞘形成病変中の乏突起膠細胞の髄鞘形成レベルおよび再髄鞘形成病変中に存在する乏突起膠細胞数の関数として評価した。

前の実施例に記載のように、ＩＮＦ−γ（ＤＯＸ−ＰＥＲＫ＋／＋およびＤＯＸ−ＰＥＲＫ＋／−）を発現するように作製されたＰＥＲＫ＋／＋およびＰＥＲＫ＋／−マウスおよびＩＦＮ−γの発現が抑制されたマウス（ＤＯＸ＋ＰＥＲＫ＋／＋およびＤＯＸ＋ＰＥＲＫ＋／−）中の再髄鞘形成範囲を評価した。電子顕微鏡法によって再髄鞘形成を試験し、全動物の脳梁中のＣＣ１陽性乏突起膠細胞数およびカスパーゼ−３発現レベルと比較した。カスパーゼ−３レベルを、カスパーゼ抗体（活性カスパーゼ−３抗体１：５０；ＣｅｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用した免疫組織化学的方法によって、実施例１に記載の方法にしたがって決定した。脱髄は、０．２％クプリゾンでのマウスの同時処理およびドキシサイクリンからの開放によって、ドキシサイクリンに対して維持されたＰＥＲＫ＋／−バックグラウンドの６週齢のＧＦＡＰ／ｔＴＡ；ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ二重トランスジェニックマウス（ＤＯＸ−ＰＥＲＫ＋／−）で誘導された。６週目にクプリゾンを使用中止することによって再髄鞘形成が起こった。

ＣＣ１陽性乏突起膠細胞の免疫組織化学的分析およびＥＭ分析により、ＰＥＲＫ機能の喪失がクプリゾン処置中の脱髄過程に影響を及ぼさないことが明らかとなった（データ示さず）。対照的に、クプリゾン曝露時にドキシサイクリンから開放されたＧＦＡＰ／ｔＴＡ；ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ，ＰＥＲＫ＋／−マウス（ＤＯＸ− ＰＥＲＫ＋／−）は、ＰＥＲＫ＋／＋バックグラウンドの二重トランスジェニックマウス（ＤＯＸ−ＰＥＲＫ＋／＋）（５４．０％±４．３％対３１．１％±７．６％；ｐ＜０．０１）よりも９週目（クプリゾンが飼料から除去された３週間後）で再髄鞘形成が有意により少なくなった（１５．６％±７．６％、図１１）。ドキシサイクリンが継続的に維持されたマウス（ＤＯＸ＋ＰＥＲＫ＋／−およびＤＯＸ＋ＰＥＲＫ＋／＋）は、ＤＯＸ−マウスよりも再有髄軸索が有意に多かった（５４％）（図１１）。

ＤＯＸ＋ＰＥＲＫ＋／＋動物（２８３．２±２７．７／０．０４ｍｍ^２；ｐ＜０．０１；図１２ＡおよびＢ）よりもＤＯＸ−ＰＥＲＫ＋／＋マウスで有意に少なかった（１２３．２±２７．５／０．０４ｍｍ^２）ＣＣ１陽性乏突起膠細胞数およびほんのわずかな乏突起膠細胞が、ＤＯＸ−ＰＥＲＫ＋／−マウスの脳梁で検出された（図１２ＡおよびＢ）。さらに、ＤＯＸ−ＰＥＲＫ＋／−マウスにおけるカスパーゼ−３について陽性染色された乏突起膠細胞数は、ＤＯＸ−ＰＥＲＫ＋／＋マウスの２．３倍であった（図１２Ｃ）。

これらのデータは、ＥＲストレス応答がＩＦＮ−γによって誘発された再髄鞘形成の失敗および乏突起膠細胞数の減少に関連し、ＰＥＲＫがＥＲストレス中の再髄鞘形成に不可欠であることを示す。

（実施例８：ＩＦＮ−γによって誘導された乏突起膠細胞のアポトーシスはｉｎｖｉｔｒｏでのＥＲストレスに関連する）
ＩＦＮ−γによって誘導された乏突起膠細胞のアポトーシスがＥＲストレスに影響を及ぼすかどうかを試験するために（形態学に及ぼす影響）、アポトーシス度およびＥＲマーカーの発現を、乏突起膠細胞前駆細胞（ＯＰＣ）培養物において研究した。乏突起膠細胞前駆体を、新生ラット脳から培養した（Ｂａｅｒｗａｌｄ，ｅｔａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．５２：２３０−２３９）。混合グリア培養物を、フラスコ中の１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む培地中で成長させ、星状細胞層がコンフルエントになった場合（１０〜１４日目）、オービタルシェーカーを使用して、乏突起膠細胞前駆体を星状細胞および小グリアから分離した。その９５％を超える細胞がＡ２Ｂ５陽性、ＧＦＡＰ陰性、およびＣＤ１１ｂ陰性である細胞を、ＰＤＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＦＧＦ（５ｎｇ／ｍｌ）（共にＲ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）も含む０．５％ＦＢＳ含有培地中で培養した。次いで、細胞を、分化のためにＰＤＧＦおよびＦＧＦを含まない０．５％ＦＢＳ培地に変更した。分化培地中で５日後に、約４０％の細胞がミエリンタンパク質２’３’−環状ヌクレオチド３’−ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）に陽性であった。７０Ｕ／ｍｌ組換えラットＩＦＮ−γ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）を、５日間分化させた細胞に添加した。分化培地中で５日後に、約４０％の細胞がＣＮＰ陽性であった。７０Ｕ／ｍｌの組換えＩＦＮ−γ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を、５日間分化させた細胞に添加した。一般的なＥＲストレス誘導剤に対する乏突起膠細胞応答を試験するために、５日間または７日間分化培地で培養した前駆細胞を、２μｇ／ｍｌのツニカマイシン（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）で６時間処置した。

ＯＰＣ細胞のアポトーシスレベルを、製造者の説明書に従ってＡｐｏｐＴａｇキット（ＳｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓＣｏｒｐ．，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＣＡ）を使用したＣＮＰ（１：２００；ＳｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒＭｏｎｏｃｌｏｎａｌｓ，Ｌｕｔｈｅｒｖｉｌｌｅ，ＭＤ）およびＴＵＮＥＬの二重染色によって決定した。アポトーシスを、製造者の説明書にしたがって蛍光測定カスパーゼ３アッセイキット（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用した乏突起膠細胞溶解物中のカスパーゼ−３活性の測定によっても評価した。

ＩＦＮ−γがＥＲ機能に影響を及ぼすかどうかを決定するために、ＥＲマーカー結合免疫グロブリンタンパク質（ＢＩＰ）、ＣＡＡＴエンハンサー結合タンパク質相同タンパク質（ＣＨＯＰ）、およびカスパーゼ１２のＲＮＡ発現を、リアルタイムＰＣＲを使用して決定した。ＲＮＡを、トリアゾール試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して培養培地およびマウス脳から単離し、ＤＮＡアーゼＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処置して、ゲノムＤＮＡを消失させた。ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍｆｏｒＲＴ−ＰＣＲキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して逆転写を行った。リアルタイムＰＣＲを、ｉＱＳｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＨｅｒｃｕｌｅｓＣＡ）を使用して、Ｂｉｏ−ＲａｄｉＱリアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）にて行った。リアルタイムＰＣＲ用のプライマーおよびプローブ（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ．，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）を以下に示した：

。

リン酸化ｅＩＦ−２αおよびカスパーゼ１２タンパク質レベルに及ぼすＩＦＮ−γの影響を決定するために、以下のプロトコールに従って以下の抗体を使用してウェスタンブロット分析を行った：抗−ｅＩＦ−２α（１：５００；ＳａｎｔａＣｒｕｚ）、抗−ｐ−ｅＩＦ−２α（１：１０００，ＣｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗カスパーゼ−１２（１：５００；ＳａｎｔａＣｒｕｚ）、および抗アクチン（１：１０００；Ｓｉｇｍａ，ＳｔＬｏｕｉｓ，ＭＯ）。組織または培養細胞を、氷冷リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）でリンスし、その直後に、電動ホモジナイザーを使用して、５倍体積のＴｒｉｔｏｎＸ−１００緩衝液（２０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０％グリセロール、１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭピロリン酸四ナトリウム、１００ｍＭＮａＦ、１７．５ｍＭ β−グリセロホスフェート、１０ｍＭフェニルメチルスルホニルフッ化物、１５μｇ／ｍｌアプロトニン、および６μｇ／ｍｌペプスタチンＡ）中で均質化した。氷上で１５分間のインキュベーション後、抽出物を、１４，０００ｒｐｍでそれぞれ３０分間の２回の遠心分離によって明澄化した。各抽出物のタンパク質含有量を、タンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって決定した。抽出物（４０μｇ）を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ニトロセルロースに移した。ブロットを、一次抗体（下記）とインキュベートし、シグナルを、西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合二次抗体との反応後の化学発光によって明らかにした。

精製乏突起膠細胞前駆細胞（ＯＰＣ）を、合成培地で５日間分化させ、その時点で約４０％の細胞がミエリンタンパク質２’３ ’−環状ヌクレオチド３’−ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）を発現し、分岐突起（ｂｒａｎｃｈｅｄｐｒｏｃｅｓｓ）を伸張した（図１３Ａおよび１３Ｃ）。これらの細胞は、より成熟した乏突起膠細胞培養物の特徴である平膜シート（ｆｌａｔｍｅｍｂｒａｎｅｓｈｅｅｔ）に伸張しなかった。７０Ｕ／ｍｌＩＦＮ−γで４８時間処置した場合、これらの細胞は、異常な形態学的変化（細胞の縮みおよび細胞体の凝集ならびにその後の培養プレートからの剥離が含まれる）を示した（図１３Ａおよび１３Ｂ）。末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）およびＣＮＰ二重標識により、ＩＦＮ−γが相当な数の乏突起膠細胞でアポトーシスを誘導したことが明らかとなった（図１３Ｃ、１３Ｄ、および１３Ｅ）。さらに、ＩＦＮ−γ処置乏突起膠細胞の細胞溶解物中のカスパーゼ−３活性は顕著に増加した（図１３Ｆ）。したがって、７０Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γは、ミエリン成分を能動的に合成する乏突起膠細胞のアポトーシスを誘導することができる。

ＩＦＮ−γがＥＲ機能を妨害するかどうかを決定するために、ＥＲストレスマーカーの発現を、サイトカイン処置乏突起膠細胞培養物中でモニタリングした。結合免疫グロブリンタンパク質／／７８ＫＤａグルコース調節タンパク質（ＢＩＰ／ＧＲＰ７８）およびＣＡＡＴＴエンハンサー結合タンパク質相同タンパク質／成長およびＤＮＡ損傷タンパク質１５３（ＣＨＯＰ／ＧＡＤＤ１５３）（共にＥＲストレス応答に関連する）をコードするｍＲＮＡのレベルは、ＩＦＮ−γ曝露後の乏突起膠細胞で約２〜３倍に増加した。ｅＩＦ−２複合体上のヌクレオチド交換が阻害されてほとんどのタンパク質合成が弱めるｅＩＦ−２αのリン酸化は、ＥＲストレスの発生から数分以内に起こる（Ｒｏｎ，２００２）。ウェスタンブロット分析により、ＩＦＮ−γが乏突起膠細胞培養物中のリン酸化ｅＩＦ−２α（ｐ−ｅＩＦ−２α）レベルを上昇させることが明らかとなった（図１３Ｈ）。カスパーゼ−１２（ＥＲ局在化カスパーゼ）はＥＲストレスによって活性化され、カスパーゼ−３を切断することができる（Ｎａｋａｇａｗａ，ｅｔａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ４０３：９８−１０３；Ｌａｍｋａｎｆｉ，ｅｔａｌ．（２００４）ＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｉｆｆｅｒ．１１：３６５−３６８）。ＩＦＮ−γでの乏突起膠細胞の処置後にカスパーゼ−１２の誘導が認められた（図１３Ｇ）。さらに、カスパーゼ−１２の活性フラグメントレベルは、ＩＦＮ−γ処置の４８時間後に強く上昇した（図１３Ｈ）。これらの結果は、培養乏突起膠細胞におけるＩＦＮ−γ誘導性アポトーシスがＥＲストレス経路の活性化に関連することを示す。

合成培地中で５日間分化させた精製乏突起膠細胞前駆細胞（ＯＰＣ）の４０％が、ミエリンタンパク質２’３ ’−環状ヌクレオチド３’−ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）を発現し、分岐突起を伸張した（図１３Ａおよび１３Ｃ）。これらの細胞は、より成熟した乏突起膠細胞培養物の特徴である平膜シートに伸張しなかった。７０Ｕ／ｍｌＩＦＮ−γで４８時間処置した場合、これらの細胞は、異常な形態学的変化（細胞の縮みおよび細胞体の凝集ならびにその後の培養プレートからの剥離が含まれる）を示した（図１３Ａおよび１３Ｂ）。末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）およびＣＮＰ二重標識により、ＩＦＮ−γが相当な数の乏突起膠細胞でアポトーシスを誘導したことが明らかとなった（図１３Ｃ、１３Ｄ、および１３Ｅ）。さらに、ＩＦＮ−γ処置乏突起膠細胞の細胞溶解物中のカスパーゼ−３活性は顕著に増加した（図１３Ｆ）。

これらのデータは、ＩＦＮ−γがミエリン成分を能動的に合成する乏突起膠細胞のアポトーシスを誘導することができることを示す。

ＩＦＮ−γがＥＲ機能を妨害するかどうかを決定するために、ＥＲストレスマーカーの発現を、サイトカイン処置乏突起膠細胞培養物中でモニタリングした。結合免疫グロブリンタンパク質／７８ＫＤａグルコース調節タンパク質（ＢＩＰ／ＧＲＰ７８）およびＣＡＡＴＴエンハンサー結合タンパク質相同タンパク質／成長およびＤＮＡ損傷タンパク質１５３（ＣＨＯＰ／ＧＡＤＤ１５３）（共にＥＲストレス応答に関連する）をコードするｍＲＮＡのレベルは、ＩＦＮ−γ曝露後の乏突起膠細胞で約２〜３倍に増加した（図１３Ｇ）。ｅＩＦ−２複合体上のヌクレオチド交換が阻害されてほとんどのタンパク質合成を弱めるｅＩＦ−２αのリン酸化は、ＥＲストレスの発生から数分以内に起こる（Ｒｏｎ，２００２）。ウェスタンブロット分析により、ＩＦＮ−γが乏突起膠細胞培養物中のリン酸化ｅＩＦ−２α（ｐ−ｅＩＦ−２α）レベルを上昇させることが明らかとなった（図１３Ｈ）。カスパーゼ−１２（ＥＲ局在化カスパーゼ）はＥＲストレスによって活性化され、カスパーゼ−３を切断することができる（Ｎａｋａｇａｗａ，ｅｔａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ４０３：９８−１０３；Ｌａｍｋａｎｆｉ，ｅｔａｌ．（２００４）ＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｉｆｆｅｒ．１１：３６５−３６８）。ＩＦＮ−γでの乏突起膠細胞の処置後にカスパーゼ−１２の誘導が認められた（図１３Ｇ）。さらに、カスパーゼ−１２の活性フラグメントレベルは、ＩＦＮ−γ処置の４８時間後に強く上昇した（図１３Ｈ）。

これらの結果は、培養乏突起膠細胞におけるＩＦＮ−γ誘導性アポトーシスがＥＲストレス経路の活性化に関連することを示す。

（実施例９：ＩＦＮ−γの異所性発現によって誘導された髄鞘低形成はＥＲストレスに関連する）
マウス発達中の乏突起膠細胞の髄鞘形成に及ぼすＩＦＮ−γの影響を研究するために、テトラサイクリン（ｔｅｔ）調節系（Ｌｉｎ，ｅｔａｌ．（２００４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：１００７４−１００８３）を使用したＣＮＳへのＩＦＮ−γ送達を一過性に調節したトランスジェニックマウスを作製した。星状細胞中でｔＴＡ発現を駆動するために、グリア線維酸性遺伝子（ＧＦＡＰ）遺伝子の転写調節領域を選択した（Ｂｒｅｎｎｅｒ，ｅｔａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４：１０３０−１０３７）。ＧＦＡＰ／ｔＴＡマウスをＴＲＥ／ＩＦＮ−γマウスと交配させて、両方の導入遺伝子にヘミ接合性を示す動物を産生した。これらのマウスをドキシサイクリンに対して維持する場合（ＤＯＸ＋）、ＩＦＮ−γ導入遺伝子の発現は抑制される（図１０Ａ）。二重トランスジェニックマウスをドキシサイクリンから開放した場合（ＤＯＸ−）、ＩＦＮ−γが発現する。これらの実験の目的のために、発生後１４日目（Ｅ１４）までにドキシサイクリンをマウスに投与し、この時点で、実験動物（ＤＯＸ−）にドキシサイクリンを投与するのを停止する一方で、コントロール動物（ＤＯＸ＋）に薬物を継続的に与えた。ＩＦＮ−γのｍＲＮＡは、生後１０日目の早さでＤＯＸ−マウスにおいて検出することができる（データ示さず）。

リアルタイムＰＣＲを行い、ＩＦＮ−γ、ＭＨＣ−１、ＢＩＰ、ＣＨＯＰ、およびカスパーゼ１２の発現レベルを決定した。ＢＩＰ、ＣＨＰ、およびカスパーゼ１２のＰＣＲ反応のためのプライマーを、実施例１に示す。ＩＦＮ−γのセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーは、それぞれ、

であり、ＭＨＣ−１のセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーは、

であった。

実施例６に記載のように、ウェスタンブロット分析を１４日齢のマウスのＣＮＳに対して行い、カスパーゼ−１２の発現を決定した。

以下の通りに免疫組織化学的方法を使用して、脳および脊髄組織を分析した。麻酔したマウスを、左心室を介して４％パラホルムアルデヒドを含む０．１ＭＰＢＳを潅流した。半矢状（ｈａｌｆ−ｓａｇｇｉｔａｌ）脳および経頸的脊髄を取り出し、パラホルムアルデヒドで後固定し、３０％スクロース中で低温保存し、ＯＣＴ中に包埋し、凍結乾燥させた。凍結切片を、クリオスタット中で厚さ１０μｍに切断した。シドマン切片２４１〜２５１に対応する脳梁の脳弓領域の冠状断面を、使用するために選択し、全ての比較分析を、正中脳梁に制限した（Ｓｉｄｍａｎ，ｅｔａｌ．（１９７１）ＡｔｌａｓｏｆｔｈｅＭｏｕｓｅＢｒａｉｎａｎｄＳｐｉｎａｌＣｏｒｄ（ＨａｒｖａｒｄＵｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）。免疫組織化学のために、凍結切片を、−２０℃アセトンで処理し、１０％ＮＧＳおよび０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳでブロッキングし、ブロッキング液で希釈した一次抗体と共に一晩インキュベートした。適切な蛍光色素または酵素で標識した二次抗体（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を、検出のために使用した。ＣＣ１に対する抗体（ＡＰＣ７，１：５０；ＥＭＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）を、成熟乏突起膠細胞のマーカーとして使用した。ＭＢＰに対する抗体（１：１０００；ＳｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒＭｏｎｏｃｌｏｎａｌｓ，Ｌｕｔｈｅｒｖｉｌｌｅ，ＭＡ）を使用して、髄鞘形成度を検証した。活性カスパーゼ−３に対する抗体（１：５０，ＣｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を、アポトーシス細胞のマーカーとして使用した。蛍光染色切片を、ＤＡＰＩ（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄマウント培地を使用してマウントし、ＺｅｉｓｓＡｘｉｏｐｌａｎ蛍光顕微鏡を使用して視覚化した。ＯｐｅｎＬａｂソフトウェアスイートを使用して、ＡｐｐｌｅＭａｃｉｎｔｏｓｈコンピュータに接続したＰｈｏｔｏｍｅｔｒｉｅｓＰＸＬＣＣＤカメラを使用して画像を収集した。免疫陽性細胞を、０．０４ｍｍ^２の領域に限定された正中脳梁内の陽性細胞の計数によって定量した。ＤＡＰＩ染色によって認められる核を有する細胞のみを計数した。各ＭＢＰ免疫染色スライドを、０から４のスケールで記録した。スコア０は、成体マウスの脳梁中の完全な脱髄を示し、スコア４は正常な髄鞘形成を示す。

リアルタイムＰＣＲ分析は、生後（ＰＮＤ）１４日目のＣＮＳ中のＩＦＮ−γおよび主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ（ＩＦＮ−γ活性の下流標的）が健全なレベルで発現したことを示した（図１４Ａ）。発達中にＣＮＳ中にＩＦＮ−γを異所的に発現する二重トランスジェニックマウス（ＤＯＸ−）は軽度に髄鞘低形成し（図１６および１７を参照のこと）、これは、乏突起膠細胞中でＩＦＮ−γを構成性に発現するために以前に作製されたトランスジェニックマウスで認められた所見と一致する（Ｃｏｒｂｉｎ，ｅｔａｌ．（１９９６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：３５４−３７０）。これらのマウスで認められた髄鞘形成の減少は、ＩＦＮ−γ誘導性乏突起膠細胞アポトーシスと相関する（図１９Ａおよび１９Ｆを参照のこと）。ＩＦＮ−γは、コントロールレベルの約１．６倍および２倍にＢＩＰおよびＣＨＯＰ発現を上方制御し、これらの動物のＣＮＳ中のカスパーゼ−１２発現を強く増強した（図１４Ａ）。より顕著には、カスパーゼ−１２の活性フラグメントレベルも、これらの動物のＣＮＳ中で増加した（図１４Ｂ）。さらに、ＣＣ１抗体を使用した共存分析により、乏突起膠細胞がＢＩＰ（図１４Ｃおよび１４Ｄ）、ｐ−ｅＩＦ−２α（図１４Ｅおよび１４Ｆ）、およびカスパーゼ−１２（図１４Ｇおよび１４Ｈ）の発現を増加させることが明らかとなった。

これらのデータは、ＥＲストレスと、ＩＦＮ−γ誘導性乏突起膠細胞アポトーシスと、発達中の髄鞘低形成との間の関連性を支持する。

（実施例１０：ＩＦＮ−γの条件付き誤発現に対するＰＥＲＫ＋／−マウスの過敏性）
ＩＦＮ−γによって誘導されたＥＲストレス応答の関与を試験するために、膵臓ＥＲキナーゼ（ＰＥＲＫ）の変異機能の喪失にヘテロ接合性を示すトランスジェニックマウスを使用してＰＥＲＫ酵素の関与を評価した（Ｈａｒｄｉｎｇ，ｅｔａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ７：１１５３−１１６３）。ＰＥＲＫ＋／−マウス中のｐ−ｅＩＦ−２αレベルの関数を評価したので、導入遺伝子動物の表現型を分析した。

実施例１に記載のＧＦＡＰ／ｔＴＡおよびＴＲＥ／ＩＦＮ−γ二重トランスジェニックマウスを、ＰＥＲＫ＋／−マウスと交配し、得られた子孫を交雑受精させて、ＰＥＲＫ変異にホモ接合性またはヘテロ接合性を示す二重トランスジェニックマウスを得た。ＰＥＲＫ−／−バックグラウンドを有する二重トランスジェニックマウスの大部分は、全期間にわたってドキシサイクリンを投与されているかどうか、または胚齢１４日目（Ｅ１４）にドキシサイクリンを水と交換したかどうかと無関係に生後１２日以内に死亡した。ＰＥＲＫ＋／＋バックグラウンドの二重トランスジェニックＧＦＡＰ／ｔＴＡ；ＴＲＥ／ＩＦＮ−γマウスは、Ｅ１４でドキシサイクリンから開放される（Ｅ１４ＤＯＸ− ＰＥＲＫ＋／＋）、予想されるミノル振戦および運動失調を示したが、良好に生存した。対照的に、ＰＥＲＫ＋／−バックグラウンドの二重トランスジェニックマウス（Ｅ１４ＤＯＸ−
ＰＥＲＫ＋／−）は、さらにより重篤な表現型を有していた。これらの動物は、ＧＦＡＰ／ｔＴＡおよびＴＲＥ／ＩＦＮ−γ対立遺伝子の組み合わせを受け継がなかったＩＦＮ−γ発現ＰＥＲＫ＋／＋同腹仔またはＰＥＲＫ＋／−動物よりもかなり小さく、重篤な振戦および運動失調を示さず、強直発作を経験したこれらのマウスの約２／３であった。顕著には、Ｅ１４でドキシサイクリンから開放されたＰＥＲＫ＋／−バックグラウンドの二重トランスジェニックマウスの９０％超が生後（ＰＤＮ）２７日までに死亡したのに対して、野生型バックグラウンドの二重トランスジェニックマウスは、正常に生存した（図１５）。

マウスの表現型の重症度（ｓｅｖｅｒｉｔｙ）を決定づけるリン酸化ｅＩＦ−２α（ｐ−ｅＩＦ−２α）を評価した。ＰＥＲＫ＋／＋マウス由来の乏突起膠細胞中のｐ−ｅＩＦ−２αレベルは、ＰＥＲＫ＋／−マウスで測定されるレベルと比較した場合に有により高かったのに対して（図１４ＥおよびＦ）、ＰＥＲＫ＋／−マウスのＣＮＳでは小さなｐ−ｅＩＦ−２αの増加が認められた（図１５ＢおよびＣ）。ｐＥＰＫ中の機能変異の喪失は、ＢＩＰ、ＣＨＯＰ、およびカスパーゼ−１２のＲＮＡレベルに有意な影響を及ぼさなかった（図１５Ｄ）。

これらの結果により、ＩＦＮ−γに応答してｐ−ｅＩＦ−２αレベルを上昇させる能力の低下はＰＥＲＫ＋／−バックグラウンドのＩＦＮ−γを発現するマウスにおける重篤な表現型に寄与する。

（実施例１１：ＩＦＮ−γ誤発現はＰＥＲＫ＋／−バックグラウンドで重篤な髄鞘低形成を引き起こす）
ＣＮＳ中にＩＦＮ−γを発現するＰＥＲＫ＋／−マウスによって示される強直発作を伴う振戦表現型（実施例３に記載）は、ミエリン変態が示唆される。ＰＥＲＫ＋／−マウスにおける髄鞘形成レベルを評価するために、髄鞘形成状態を、ＭＢＰの免疫染色によって評価し、この評価を、Ｅ１４でドキシサイクリンから開放された１４日齢のＧＦＡＰ／ｔＴＡ；ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ；ＰＥＲＫ＋／−マウスにおいて行い、野生型バックグラウンドの二重トランスジェニックマウスと比較した（図１６）。ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）についての免疫染色は、野生型バックグラウンドの二重トランスジェニックマウスと比較して、Ｅ１４でドキシサイクリンから開放された１４日齢のＧＦＡＰ／ｔＴＡ；ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ，ＰＥＲＫ＋／−マウスのＣＮＳ中で顕著に減少した（図１６）。さらに、超微細構造試験により、ＣＮＳ中にＩＦＮ−γを発現するＰＥＲＫ＋／−マウスの脊髄中の軸索の大部分（８１％±１４．９％）が髄鞘を形成しなかったことが明らかとなった（図１７）。対照的に、Ｅ１４でドキシサイクリンから開放された野生型バックグラウンドの二重トランスジェニック動物は、非有髄軸索が顕著により少なかったのに対して（３０％±１２．９％）、ＩＦＮ−γ発現を抑制するためにドキシサイクリンに対して継続的に維持した動物は、非有髄軸索がさらにより少なかった（９．８％±６．１％）。

これらのデータは、ＰＥＲＫ＋／−バックグラウンドのＩＦＮ−γによって誘導された重症振戦表現型と髄鞘低形成との間の相関を確立する。

（実施例１２：ＰＥＲＫ＋／−マウスにおけるＩＦＮ−γ誤発現後の乏突起膠細胞の喪失）
ＣＮＳ中にＩＦＮ−γを発現するＰＥＲＫ＋／−マウスによって示される髄鞘低形成を説明する細胞機構を洞察するために、これらの動物における乏突起膠細胞機能の状帯を試験した。本発明者らは、ミエリンマーカーであるＭＢＰ、ＰＬＰ、およびセラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）をコードするｍＲＮＡの定常状態のレベルを決定した。リアルタイムＰＣＲ分析は、Ｅ１４でドキシサイクリンから開放された野生型バックグラウンドの１４日齢の二重トランスジェニックマウスの脳内のＭＢＰ、ＰＬＰ、およびＣＧＴのｍＲＮＡレベルが正常よりわずかに低いことを示した。Ｅ１４でドキシサイクリンから開放されたＧＦＡＰ／ｔＴＡ；ＴＲＥ／ＩＦＮ− ７；ＰＥＲＫ＋／−マウスのＣＮＳ中のこれらのｍＲＮＡレベルはさらに低かった（図１８）。ミエリンタンパク質コードｍＲＮＡの定常状態レベルの減少が髄鞘形成細胞数の減少に起因するかどうかを決定するために、本発明者らはこれらのマウス中の乏突起膠細胞数を決定した。コントロールマウスと比較して、Ｅ１４でドキシサイクリンから開放された野生型バックグラウンドの１４日齢のＧＦＡＰ／ｔＴＡ；ＴＲＥ／ＩＦＮ−γトランスジェニックマウスにおけるＣＣ１免疫染色によって同定された乏突起膠細胞がわずかにより少なかった（図１９Ａ）。対照的に、ＰＥＲＫ＋／−バックグラウンドのＩＦＮ−γ発現トランスジェニックマウスの脳梁および小脳中で非常に少数の乏突起膠細胞しか検出することができず、これらのマウスの脊髄中の乏突起膠細胞数は、５０％を超えて減少した（図１９Ａ）。

さらに、これらのマウスの頸髄中でＴＵＮＥＬ陽性を示した乏突起膠細胞数は、Ｅ１４でドキシサイクリンから開放された後の野生型バックグラウンドの二重トランスジェニックマウス中のこのような細胞の数よりも２．５倍多かった（図１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｄ、１９Ｅ、および１９Ｆ）。さらに、超微細構造試験は、アポトーシス乏突起膠細胞が高度に凝縮されたクロマチン塊、インタクトな膜、縮んだ細胞質、およびアポトーシス体を含んでいたことを示した（図１９Ｇ）。これらのデータは、ＩＦＮ−γがＥＲストレス経路によって乏突起膠細胞を損傷するという仮説を補足し、ＰＥＲＫがＩＦＮ−γ誘導性ＥＲストレスの有害な結果からの乏突起膠細胞の防御で極めて重要な役割を果たすことを示す。

（実施例１３：成体動物中の乏突起膠細胞は、幼若動物由来の能動的に髄鞘形成する乏突起膠細胞よりもＩＦＮ−γに対する感受性が低い）
幼若な成長中の動物の能動的に髄鞘形成する乏突起膠細胞と比較して、成体マウス中の乏突起膠細胞は、ミエリン構造におけるホメオスタシスの維持に過不足のないより低いレベルの膜タンパク質および脂質を産生する（Ｍｏｒｅｌｌ，ｅｔａｌ．（１９９９）ＢａｓｉｃＮｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ，ａｎｄＭｅｄｉｃａｌＡｓｐｅｃｔｓ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−ＲａｖｅｎＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）：６９−９３）。したがって、成体動物中の乏突起膠細胞のＥＲは、増加したタンパク質負荷を処理するためのより簡素な能力を有し得、そのようなものとして、タンパク質分泌経路の破壊により小さな感受性を示し得る。この可能性を試験するために、二重トランスジェニックマウスを成熟するまで成長させ、その時点で、ＣＮＳ中のＩＦＮ−γ発現が開始された。リアルタイムＰＣＲ分析は、４週目でドキシサイクリンから開放された二重トランスジェニック動物が約６週齢でＩＦＮ−γを発現し始め、ＣＮＳ中のＩＦＮ−γｍＲＮＡおよびタンパク質レベルがＥ１４でドキシサイクリンから開放された成長中のマウスのレベルに匹敵することを示した（データ示さず）。ＩＦＮ−γは、成体マウス、ＰＥＲＫ＋／−バックグラウンドのマウスにおいてさえも乏突起膠細胞の生存に影響を及ぼさなかった（図２０Ｂ、２０Ｃ、２０Ｄ、および２０Ｅ）。さらに、超微細構造試験により、４週齢でドキシサイクリンから開放された野生型またはＰＥＲＫ＋／−バックグラウンドの１０週齢の二重トランスジェニックマウスのＣＮＳ中の正常なミエリンが明らかとなった（図２０Ｆ、２０Ｇ、２０Ｈ、および２０Ｉ）。ＩＦＮ−γによるＢＩＰおよびＣＨＯＰの小さな誘導は、４週齢でドキシサイクリンから開放された１０週齢の二重トランスジェニックマウスの小脳中で認められた（図２０Ａ）。それにもかかわらず、共存分析は、成熟乏突起膠細胞がＢＩＰ発現を有意に増加させないことを示した（図２０Ｂ、２０Ｃ、２０Ｄ、および２０Ｅ）。

したがって、データは、成体動物由来の乏突起膠細胞が成長中の幼若マウスの能動的に髄鞘形成する乏突起膠細胞よりもＩＦＮ−γの存在に対する感受性が低いことを示す。

（実施例１４：ＥＡＥ発症時のＩＦＮ−γの投与によって疾患の重症度が弱められる）
ＣＮＳへのＩＦＮ−γの送達を一過性に調節することが可能な二重トランスジェニックマウス（Ｌｉｎｅｔａｌ．，ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ２４：１００７４−１００８３（２００４））を使用して、ＥＡＥの病理発生におけるＩＦＮ−γの役割を評価した。ＧＦＡＰ／ｔＴＡ；ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ二重トランスジェニックマウスを上記実施例に記載のように使用して、ＥＡＥに起因する脱髄に及ぼすＩＦＮ−γの影響を決定した。全マウスに、計画日からドキシサイクリンを与えてＩＦＮ−γ発現を抑制し、実験群をその後にＭＯＧ３５−５５ペプチドで免疫化してＥＡＥの発症を誘導した。ＥＡＥの誘導のために、マウスの脇腹および尾の根元（ｔａｉｌｂａｓｅ）に、６００μｇの結核菌（Ｈ３７Ｒａ株；Ｄｉｆｃｏ）を補足した完全フロイントアジュバント（Ｄｉｆｃｏ）中に乳化した２００μｇのＭＯＧ３５−５５ペプチドを皮下注射した。４００ｎｇの百日咳毒素（ＬｉｓｔＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の２回の腹腔内注射を、２４時間後および７２時間後に行った。臨床スコア（０＝健康、１＝弛緩した尾、２＝運動失調および／または後肢の不全麻痺、３＝後肢の麻痺および／または前肢の不全麻痺、４＝四肢の麻痺、および５＝瀕死または死亡）を毎日記録した。コントロール動物に継続的にドキシサイクリンを与えた一方で（ＤＯＸ＋二重マウス）、実験動物（ＤＯＸ−二重マウス）の抗生物質異を枯渇させてＩＦＮ−γを発現させた。ＩＦＮ−γの影響を以下のようにモニタリングした。

疾患の発症は、ＤＯＸ−およびＤＯＸ＋二重動物の両方において１４日目で明らかであり、その時点で（ＰＩＤ１４；免疫化後１４日目）臨床スコアに有意差は認められなかった。しかし、ＤＯＸ−二重マウスは、ＤＯＸ＋二重マウスよりも有意に軽度の疾患を発症し、ＤＯＸ−群の２５匹の動物のうちの２匹のみが後肢麻痺を示す一方で、ＤＯＸ＋二重マウスの有意により大きな部分（２０／２５）は、肢麻痺を発症した（図２１（ａ）および表１）。

リアルタイムＰＣＲ分析を行って、ＤＯＸ−およびＤＯＸ＋動物の脊髄中のＩＦＮ−γの発現レベルを評価した。麻酔したマウスを、ＰＢＳで潅流した。Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して脊髄からＲＮＡを単離し、ＤＮＡｓｅＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処置してゲノムＤＮＡを消失させた。ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＦｉｒｓｔ
ＳｔｒａｎｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍｆｏｒＲＴ−ＰＣＲキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して逆転写を行った。ＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲを、以前に記載のように、ｉＱｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、Ｂｉｏ−ＲａｄｉＱリアルタイムＰＣＲ検出システムにて行った^１２。図２１（ｂ）は、ＤＯＸ−動物の脊髄中のＩＦＮ−γレベルがＥＡＥ発症時（ＰＩＤ１４）に検出できるようになり、疾患のピーク時（ＰＩＤ１７）にピークに到達し、その後の疾患の回復期（ＰＩＤ２２）に減少した。

ＤＯＸ−動物の脊髄中のＩＦＮ−γｍＲＮＡレベルは、ＰＩＤ１４、ＰＩＤ１７、およびＰＩＤ２２のすべての時点でＤＯＸ＋マウスより有意に高かった（図２１ｂ）。さらに、トランスジェニックＩＦＮ−γを、ＰＩＤ１４の早さでＤＯＸ−二重マウスの脊髄で検出することができる（図２１Ｃ）。したがって、これらのデータは、ＥＡＥ発症時のＣＮＳへのＩＦＮ−γの送達によって疾患の重症度の進行を有意に弱めることを示す。

ＰＩＤ１４でのＤＯＸ−およびＤＯＸ＋動物の脊髄中の種々のサイトカインの発現のリアルタイムＰＣＲ分析は、ＩＦＮ−γはｉＮＯｓ、ＴＮＦ−ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、およびＩＬ−１０の発現を増加させるが、ＩＬ−２およびＩＬ−５の発現に影響を及ぼさなかったことを示した（図２２）。

ＥＡＥに起因する脱髄に及ぼすＩＦＮ−γの影響の組織病理学的評価を、疾患のピーク時（ＰＩＤ１７）のＤＯＸ＋およびＤＯＸ−動物の脊髄に対して行った。ＤＯＸ−動物の脊髄は、髄鞘の破壊、軸索損傷、乏突起膠細胞喪失（図２３Ａ、２３Ｂ、および２３Ｃ）、血管周囲炎（図２４Ａおよび２４Ｂ）を示し、これらは、ＥＡＥに典型的な組織病理学的特徴である。対照的に、ＤＯＸ−動物の腰髄由来のミエリン、軸索、および乏突起膠細胞はほとんどインタクトなままであり（図２３Ａ、２３Ｂ、および２３Ｃ）、ＣＤ３陽性Ｔ細胞浸潤はＤＯＸ＋動物で認められるものよりも低かった（図２４Ａ）。さらに、ＤＯＸ−二重マウスの脊髄中のミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）のｍＲＮＡレベルは、リアルタイムＰＣＲによって評価したところ、年齢適合ナイーブマウス中のＭＢＰｍＲＮＡレベルと比較した場合、ＭＢＰｍＲＮＡはＥＡＥによって有意に減少しないことが明らかとなった。しかし、ＭＢＰｍＲＮＡレベルは、ＤＯＸ＋二重マウスにおいて３０％減少した（図２３Ｄ）。

したがって、これらのデータは、ＣＮＳへのＩＦＮ−γの送達により、ＥＡＥ誘導性脱髄から防御されることを示す。

（実施例１５：ＥＡＥ発症時のＩＦＮ−γの投与は、細胞防御機構によってその抗炎症性とは無関係に脱髄から乏突起膠細胞を防御する）
ＥＡＥ病理発生中、Ｔ細胞が末梢神経系で刺激され、臨床的疾患発症の十分に以前にＣＮＳに入る（Ｈｉｃｋｅｙｅｔａｌ．，（１９９１）ＪＮｅｕｒｏｓｃｉＲｅｓ
２８：２５４−２６０）。ＥＡＥの脱髄の影響からのＣＮＳの防御におけるＩＦＮ−γの影響がＩＦＮ−γの抗炎症活性に起因するかどうかを決定するために、Ｔ細胞および単球の浸潤レベルを評価し、既知の炎症性サイトカインの発現を評価した。

図２４Ｃおよび２４Ｄに示す結果は、ＩＦＮ−γがＣＤ３陽性Ｔ細胞浸潤に有意に影響を及ぼさないが、ＥＡＥ発症時の脊髄中のＣＤ１１ｂ陽性単球浸潤は増加させたことを示す（図２４Ｅおよび２４Ｆ）。重要には、リアルタイムＰＣＲ分析は、ＣＮＳへのＩＦＮ−γの送達によって、ＥＡＥ発症時の脊髄中の誘導性一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯｓ）、腫瘍壊死因子−γ（ＴＮＦ−γ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−１２、およびＩＬ−１０の発現が増強されるが（図２２）、疾患ピーク時にｉＮＯｓやＴＮＦ−γの発現に有意に影響を及ぼさなかった（図２５）。さらに、ＩＦＮ−γのＣＮＳ送達は、疾患ピーク時のＣＤ１１ｂ陽性単球浸潤を変化させなかった（図２４Ｂ）。

これらのデータにより、ＩＦＮ−γがその抗炎症性によってＥＡＥ誘導性脱髄を防御する（一部の研究者によって提案されている仮説）ことはありそうにないと示唆される（Ｍｕｈｌｅｔａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ３：１２４７−１２５５（２００５））。

乏突起膠細胞の死滅は、ＥＡＥ病変中の炎症性浸潤を調整することが示されている（Ｈｉｓａｈａｒａｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ１９：３４１−３４８（２０００）；Ｈｉｓａｈａｒａｅｔａｌ．，（２００１）ＪＥｘｐＭｅｄ１９３：１１１−１２２）。ＩＦＮ−γはＥＡＥの発症時に炎症反応を促進し、その後の病期での乏突起膠細胞の死滅に及ぼすＩＦＮ−γの阻害効果がＴ細胞浸潤の減少を説明することができる可能性がある。本発明者らの以前の所見は、ＭＢＰ遺伝子の調節下でＩＦＮ−γを発現するトランスジェニックマウスはクプリゾンによって誘導された乏突起膠細胞アポトーシスおよび脱髄に耐性を示すことを示している（Ｇａｏｅｔａｌ．，（２０００）ＭｏｌＣｅｌｌＮｅｕｒｏｓｃｉ１６：３３８−３４９）。クプリゾンによって損傷を受けた乏突起膠細胞がアポトーシスを経験し（ＭａｔｓｕｓｈｉｍａａｎｄＭｏｒｅｌｌ（２００１）ＢｒａｉｎＰａｔｈｏｌ１１：１０７−１１６）、その直後に小グリアの動員およびミエリンの食作用が起こる。クプリゾン動物モデルでは、脱髄乏突起膠細胞アポトーシスがＴ細胞や血液脳関門の破壊と関与しないことが知られている。

したがって、これらのデータにより、ＩＦＮ−γが細胞防御効果によって脱髄から乏突起膠細胞を防御することが示唆される。

（実施例１６：ＥＡＥ発症時のＩＦＮ−γの投与は、ＰＥＲＫ経路の活性化によって脱髄から乏突起膠細胞を防御する）
脱髄および乏突起膠細胞の喪失は、多発性硬化症（ＭＳ）およびその動物モデル（実験的自己免疫性脳髄膜炎（ＥＡＥ））の特質である。重篤な細胞損傷に起因せずに下流シグナル伝達経路を活性化する低レベルのストレスがより重篤なストレスの多い事象へのその後の曝露を防御することができることが長期にわたり知られている。膵臓小胞体キナーゼ（ＰＥＲＫ）は、ＥＲストレス誘導性キナーゼをコードし、これは真核細胞翻訳開始因子２α（ｅＩＦ２α）をリン酸化して多数の細胞防御遺伝子のストレス誘導性発現を増強する（Ｈａｒｄｉｎｇｅｔａｌ．，（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ３９７：２７ｌ−２７４；Ｌｕｅｔａｌ．，（２００４）ＥＭＢＯＪ２３：１６９−１７９；Ｈａｒｄｉｎｇｅｔａｌ，（２００３）ＭｏｌＣｅｌｌ１１：６１９−６３３）。

ＰＥＲＫ経路がＥＡＥによって誘導された脱髄からのＩＦＮ−γの防御効果を媒介するかどうかを決定するために、一連のＥＡＥ中の乏突起膠細胞中のリン酸化ＰＥＲＫ（ｐ−ＰＥＲＫ）およびリン酸化−ｅＩＦ２α（ｐ−ｅＩＦ２α）をモニタリングした。

ＣＣ１抗体を使用した共存分析により、少数の乏突起膠細胞がＥＡＥ発症時のコントロールマウスの脊髄中でｐ−ＰＥＲＫ陽性およびｐ−ｅＩＦ２α陽性であり、これは以前の報告と一致することが明らかとなった（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｙｅｔａｌ．，２００４）。対照的に、ＩＦＮ−γのＣＮＳ送達は、乏突起膠細胞中でＰＥＲＫ−ｅＩＦ２α経路を顕著に活性化した（図２４）。

これらのデータは、乏突起膠細胞中のＰＥＲＫ経路の活性化とＥＡＥ誘導性脱髄におけるＩＦＮ−γの防御的役割との間の関連を支持する。

遺伝学ベースのアプローチを使用して、ＥＡＥに及ぼすＩＦＮ−γの防御的影響におけるＰＥＲＫ経路の関与を試験した。ＰＥＲＫの機能変異の喪失にヘテロ接合性を示すマウスは表現型的に健康であるが、半数体不全の証拠を示す（Ｈａｒｄｉｎｇｅｔａｌ．，２０００；Ｌｉｎｅｔａｌ．，２００５）。ＴＲＥ／ＩＦＮ−γマウスを、ＰＥＲＫ＋／−マウスと交配し、その子孫をＧＦＡＰ／ｔＴＡマウスと交配してＰＥＲＫ変異にヘテロ接合性を示す三重トランスジェニックマウスを得た。計画以来ドキシサイクリンを投与している６週齢のＰＥＲＫ＋／−バックグラウンドの有するＧＦＡＰ／ｔＴＡ；ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ三重トランスジェニックマウスを、ＭＯＧ３５−５５ペプチドで免疫化し、同時にドキシサイクリンの使用を停止するか（ＤＯＸ−三重マウス）、ドキシサイクリンを投与し続けた（ＤＯＸ＋三重マウス）。コントロールＤＯＸ＋三重マウスは、コントロールＤＯＸ＋二重マウスに類似のＥＡＥ疾患経過を示した。顕著には、ＩＦＮ−γのＣＮＳ送達は、ＰＥＲＫ変異についてヘテロ接合性のマウスにおいてＥＡＥを改善しなかった。ＤＯＸ−三重マウスの罹患率、ＥＡＥ重症度、および死亡率は、コントロールＤＯＸ＋三重マウスに匹敵した（表１）。神経病理学的分析により、ＥＡＥ発症時のＩＦＮ−γのＣＮＳ送達が、疾患ピーク時のＰＥＲＫ＋／−バックグラウンドを有するマウスの腰髄における脱髄、軸索損傷、または乏突起膠細胞の喪失を防御しなかったことが明らかとなった。実際、ＭＢＰ免疫染色、トルイジンブルー染色、およびＭＢＰについてのリアルタイムＰＣＲ分析は、一貫して、疾患重症度のピーク時にＤＯＸ−三重マウスおよびコントロールＤＯＸ＋三重マウスの脊髄中に類似の脱髄を示した（図２３）。さらに、本発明者らは、ＰＥＲＫにおける機能変異の喪失は一連のＥＡＥ中の炎症性浸潤およびサイトカインの発現プロフィールに有意に影響を及ぼさないことを見出した。したがって、これらのデータは、乏突起膠細胞中のＩＦＮ−γによるＰＥＲＫ経路の活性化がＥＡＥに起因する脱髄からのニューロンの防御に不可欠であることを示す。これにより、ＩＦＮ−γは、ＰＥＲＫ経路に依存する「総合的（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）ストレス応答」を活性化し、その後の有害物への曝露から神経系を防御することが示唆される。

（実施例１７：脱髄におけるＧＡＤＤ３４の役割：ｉｎｖｉｖｏでのＧＡＤＤ３４の機能喪失の影響）
脱髄におけるＧＡＤＤ−３４の役割を、ＧＡＤＤ−３４を欠損し、ＥＡＥが誘導されたマウスにおいて研究した。

ＥＡＥ中における乏突起膠細胞中のｅＩＦ２αの活性化が認められている（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｙｅｔａｌ．，２００４；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｙｅｔａｌ，２００５）。上記実施例に記載されるように、ＥＡＥ発症時のＩＦＮ−γのＣＮＳ送達は、ＰＥＲＫ依存性総合的ストレス応答経路の活性化によってＥＡＥ誘導性脱髄を防御し、疾患の重症度を弱めることが示されている。ＧＡＤＤ３４は、タンパク質ホスファターゼ−１（ＰＰ１）に関与し、真核細胞翻訳伸長因子ｅＩＦ２αの脱髄をターゲティングする調節サブユニットをコードするストレス誘導性遺伝子である（Ｃｏｎｎｏｒｅｔａｌ，２００１；Ｎｏｖｏａ，２００１；Ｎｏｖｏａｅｔａｌ．，２００３）。ＧＡＤＤ３４−ヌルマウスは健康であるが、ＧＡＤＤ３４の喪失によってストレスを受けた細胞中のリン酸化ｅＩＦ２α（ｐ−ｅＩＦ２α）レベルが増加する。さらに、ＧＡＤＤ３４−ヌル動物がＥＲストレスに起因する細胞死を顕著に防御することが示されている（Ｊｏｕｓｓｅｅｔａｌ．，２００３；Ｍａｒｃｉｎｉａｋｅｔａｌ．，２００５）。したがって、ＥＡＥの病理発生におけるｅＩＦ２αの役割を、ＧＡＤＤ３４−ヌルマウスを使用して試験した。

ＧＡＤＤ３４−ヌルマウスを作製した。マウスを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスと６回戻し交配下。ＥＡＥを以下のように誘導する。マウスの脇腹および尾の根元に、６００μｇの結核菌を補足した完全フロイントアジュバント中に乳化した２００μｇのＭＯＧ３５−５５ペプチドを皮下注射した。４００ｎｇの百日咳毒素の２回の腹腔内注射を、ＭＯＧ３５−５５ペプチドでの免疫化から２４時間後および７２時間後に行った。臨床重症度スコアを０〜５ポイントのスケール（０＝健康、１＝弛緩した尾、２＝運動失調および／または後肢の不全麻痺、３＝後肢の麻痺および／または前肢の不全麻痺、４＝四肢の麻痺、および５＝瀕死または死亡）にしたがって毎日記録した。

図２６の結果は、コントロール動物と比較した場合、ＧＡＤＤ３４−ヌルマウスにおいて疾患の発症が有意に遅延することを示す。したがって、ＧＡＤＤ３４の阻害は、ＥＡＥの発症を遅延させる。

ＣＮＳ中の組織損傷を、Ｌｉｎｅｔａｌ．（投稿中）に記載のように免疫組織化学的分析およびトルイジンブルー染色によって決定する。脊髄組織を、疾患重症度のピークでの組織損傷について分析する。ＣＣ１に対する抗体（ＡＰＣ７）をマーカーとして使用して成熟乏突起膠細胞を同定し、ＭＢＰに対する抗体を使用して脱髄の程度を決定し、非リン酸化神経フィラメント−Ｈ（ＳＭＩ３２）を使用して軸索損傷を検出する。さらに、脱髄および軸索損傷の重症度を、トルイジンブルーでの組織の染色によって試験する。ミエリン遺伝子発現が乏突起膠細胞機能と高度に相関するので、リアルタイムＰＣＲを行って、脊髄中のＭＢＰ、ＰＬＰ、およびセラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）をコードするｍＲＮＡの定常状態のレベルを決定する。ＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲにより、病変中の脱髄の程度を定量することが可能である。

結果は、ＥＡＥの進行が、ＧＡＤＤ３４−ヌルマウスおよび野生型コントロールの両方においてＭＢＰ、ＰＬＰ、およびＣＧＴをコードするｍＲＮＡの減少を伴うことを示す。しかし、ＧＡＤＤ３４−ヌルマウスにおける減少は、野生型動物で見出された減少に先立つ。

組織学的結果が臨床スコアを使用して定量した表現型の変化によって評価した疾患の経時変化と一致すると予想され、ＧＡＤＤ３４機能の喪失がＥＡＥの特徴である脱髄および乏突起膠細胞の喪失を防御する可能性が高い。

（実施例１８：ＧＡＤＤ３４の喪失は、ＥＡＥ中の脱髄から乏突起膠細胞を防御する）
種々のストレスの多い容態は、ｅＩＦ２αと関連する。以下の４つの哺乳動物ｅＩＦ２αキナーゼが同定されている：ＰＥＲＫ、ＧＣＮ２、ＲＮＡ活性化タンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）、およびＨＲＩ（Ｐｒｏｕｄ，２００５）。上記実施例に記載されるように、ＰＥＲＫ−ｅＩＦ２α経路を、免疫サイトカインＩＦＮ−γによってＥＡＥ中の乏突起膠細胞中で活性化させる。Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｙｅｔａｌ．（２００４）は、ＰＫＲ−ｅＩＦ２α経路の活性化が活性なＥＡＥを罹患した動物のＣＮＳ中の炎症細胞で生じることを示した。

ＥＡＥを有するがＧＡＤＤ３４を欠くマウスで認められる影響が乏突起膠細胞の防御を反映することを確認するために、ＣＣ１およびｐ−ｅＩＦ２αの二重免疫染色をＧＡＤＤ３４−ヌルマウス中で行い、野生型コントロール動物で行った二重免疫染色と比較する。

さらに、ＣＤ３およびｐ−ｅＩＦ２αの二重免疫染色を行って、野生型動物と比較した場合にＧＡＤＤ３４−ヌルマウスのＣＮＳ中のＴ細胞中でｐ−ｅＩＦ２αレベルが増加するかどうかを決定する。ＧＡＤＤ３４−ヌルマウスおよび同腹仔コントロールマウスにおけるＣＮＳおよび末梢免疫系中の免疫応答を、Ｌｉｎｅｔａｌ．（投稿中）に記載のように分析する。

結果がｐ−ｅＩＦ２αレベルが野生型マウスよりもＧＡＤＤ３４−ヌルマウスの乏突起膠細胞中で高いことを示すと予想される。いかなる特定の理論に拘束されないが、ｅＩＦ２αのリン酸化の増強が総合的ストレス応答を延長すると予想され、したがって、ＥＡＥに起因する損傷から乏突起膠細胞を防御する。

（実施例１９：脱髄におけるＧＡＤＤ３４の役割：ｉｎｖｉｔｒｏでのＧＡＤＤ３４の機能喪失の影響）
乏突起膠細胞で認められ、且つＧＡＤＤ３４欠失によって増加する防御効果を評価するために、ＧＡＤＤ３４の発現を遮断するためにｓｉＲＮＡを使用する実験を、精製ラット培養乏突起膠細胞に対して行う。実験プロトコールは、Ｌｉｎｅｔａｌ．（投稿中）に記載されている。新生ラット脳由来の乏突起膠細胞前駆体（ＯＰＣ）を、以下のように培養する。混合グリア培養物を、フラスコ中の１０％ＦＢＳを含む培地中で成長させ、星状細胞層がコンフルエントになった場合（１０〜１４日目）、オービタルシェーカーを使用して、乏突起膠細胞前駆体を星状細胞および小グリアから分離した。その９５％を超える細胞がＡ２Ｂ５陽性、ＧＦＡＰ陰性、およびＣＤ１１ｂ陰性である細胞を、０．５％ＦＢＳ、ＰＤＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、およびＦＧＦ（５ｎｇ／ｍｌ）を含む培地中で最初に培養した。次いで、細胞をＰＤＧＦおよびＦＧＦを含まない０．５％ＦＢＳ培地に移して分化を誘導した。

低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を、ｓｉＲＮＡＴａｒｇｅｔＦｉｎｄｅｒソフトウェア（Ａｍｂｉｏｎ）を使用してデザインし、これを使用して、ラットＧＡＤＤ３４の発現を阻害する。ｓｉＲＮＡの標的配列を、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ＶｅｃｔｏｒｓＩｎｓｅｒｔＤｅｓｉｇｎＴｏｏｌ（Ａｍｂｉｏｎ）と組み合わせて使用して、ｓｉＲＮＡ標的配列由来のＤＮＡオリゴヌクレオチドインサートをコードするヘアピンｓｉＲＮＡを作製する。プログラムは、クローニングのために使用されるループ配列およびオーバーハングを付加する。ヘアピンｓｉＲＮＡコードＤＮＡオリゴヌクレオチドインサートを、製造者の説明書にしたがってｐＳｉｌｅｎｃｅｒ４．１−ＣＭＶベクター（Ａｍｂｉｏｎ）にクローン化し、ＧＡＤＤ３４に特異的なヘアピンｓｉＲＮＡをコードするｐＳｉｌｅｎｃｅｒ４．１−ＣＭＶベクターを、製造者のプロトコールに従ってＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット（Ａｍａｘａ）を使用してＯＰＣにトランスフェクトする。コントロール乏突起膠細胞を、ＧＡＤＤ３４ｓｉＲＮＡを欠く４．１−ＣＭＶベクターであるコントロールベクターでトランスフェクトする。トランスフェクション後、細胞を、２．５μｇ／ｍＬピューロマイシンを使用して１０〜１４日間にわたって選択する。トランスフェクトしたＯＰＣを、ＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲを使用してＧＡＤＤ３４ｍＲＮＡの存在について分析し、ウェスタンブロット分析を使用してＧＡＤＤ３４タンパク質の存在について分析する。

結果により、ＧＡＤＤ３４遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡがＧＡＤＤ３４の転写およびＧＡＤＤ３４タンパク質の発現を首尾よく阻害すると示唆されると予想される。

さらに、サルブリノール（Ｓａｌ）の防御効果を試験して、Ｓａｌがサイトカイン、酸化物、ペルオキシ亜硝酸塩、およびグルタミン酸塩から乏突起膠細胞を防御するかどうかを決定する。サルブリノールは、ＰＰ１−ＧＡＤＤ３４ホスファターゼ活性を特異的に阻害し、それにより、ストレスを受けた細胞中のｅＩＦ２αリン酸化を維持することが知られている（Ｂｏｙｃｅｅｔａｌ．，２００５）。Ｓａｌを、ＴＮＦ−γ、Ｈ_２Ｏ_２、ペルオキシ亜硝酸塩ドナーＳＩＮ−１、およびグルタミン酸塩と組み合わせ、これを７日間分化させた細胞に添加する。ウェスタンブロット分析を使用して、Ｓａｌが培養乏突起膠細胞中でｐ−ｅＩＦ２αレベルを上昇させるかどうかを試験する。また、乏突起膠細胞の生存度を、Ｌｉｎｅｔａｌ．，２００１および２００５に記載のように、ＭＴＴアッセイ（Ｒｏｃｈｅ）、ＴＵＮＥＬアッセイ（ＡｐｏｐＴａｇｋｉｔ；Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、およびカスパーゼ−３活性アッセイ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｕｉｓ，ＭＯ）によって決定する。

結果は、ｓｉＲＮＡテクノロジーを使用したその発現の遮断またはその酵素活性の直接阻害によるＧＡＤＤ３４機能の阻害によって反応性酸化的／ニトロ化的ストレスおよびグルタミン酸塩細胞傷害性から乏突起膠細胞を防御することを示す。疾患ピークでの組織学的分析により、ＧＡＤＤ３４欠失が乏突起膠細胞中のｐ−ｅＩＦ２αレベルを上昇させ、ＥＡＥ誘導性脱髄および乏突起膠細胞の喪失から防御されることが明らかとなるであろう。ＧＡＤＤ３４ｓｉＲＮＡトランスフェクションおよびＳａｌがサイトカイン曝露、反応性酸化的／ニトロ化的ストレス、およびグルタミン酸塩興奮毒性（ｅｘｃｉｔｏｘｉｃｉｔｙ）から乏突起膠細胞を防御すると予想される。Ｓａｌの細胞防御効果の種々の態様とＧＡＤＤ３４ｓｉＲＮＡトランスフェクションの態様とを比較する。ＥＡＥを罹患したマウスおよびＭＳを罹患した患者のマウスにおけるＳａｌの防御効果を試験する。

（実施例２０：乏突起膠細胞におけるＰＥＲＫ依存性総合的ストレス応答経路の活性化は脱髄を防御する）
ＰＥＲＫの活性化は、ＰＥＲＫの二量体形成によって開始され、それにより、トランス自己リン酸化され、その基質ｅＩＦ２αのリン酸化能力が増加する。通常、この二量体形成事象は、ＰＥＲＫのストレス感受性ＥＲルーメンドメインによって駆動される（Ｈａｒｄｉｎｇ１９９９）。他の研究者は、ＰＥＲＫのｅＩＦ２αキナーゼエフェクタードメインを２修飾ＦＫ５０６結合ドメイン（Ｆｖ２Ｅ）を含むポリペプチドと融合して、融合タンパク質（Ｆｖ２Ｅ−ＰＥＲＫ）を生成し、この人工的ｅＩＦ２αキナーゼ（Ｆｖ２Ｅ−ＰＥＲＫ）の活性が二量体ＡＰ２０１８７に従属し、ＥＲストレスの上流シグナル伝達から脱共役される（Ｌｕｅｔａｌ．，２００４）。

ｉｎｖｉｔｒｏでの乏突起膠細胞に及ぼすＰＥＲＫ活性化の防御効果を試験するために、乏突起膠細胞前駆細胞（ＯＰＣ）を、Ｆｖ２Ｅ−ＰＥＲＫをコードする構築物でトランスフェクトした。Ｆｖ２Ｅ−ＰＥＲＫ構築物を、哺乳動物ベクターｐｃＤＮＡ３．１にサブクローン化して、融合タンパク質Ｆｖ２Ｅ−ＰＥＲＫタンパク質を発現する哺乳動物発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１−Ｆｖ２Ｅ−ＰＥＲＫ）を生成する。上記の精製ラットＯＰＣを、Ｎｕｃｌｅｏｆａｃｔｏｒキット（Ａｍａｘａ）を使用してｐｃＤＮＡ３．１−Ｆｖ２Ｅ−ＰＥＲＫでトランスフェクトし、Ｇ４１８（４００μｇ／ｍｌ）を使用して１０〜１４日間選択する。

ＯＰＣを、分化するように７日間誘導し、ＰＥＲＫ−ｅＩＦ２α経路の活性化を、二量体形成剤（ｄｉｍｅｒｉｚｅｒ）ＡＰ２０１８７のみの存在下またはＴＮＦ−γ、Ｈ_２Ｏ_２、ペルオキシ亜硝酸塩ドナーＳＩＮ−Ｉ、またはグルタミン酸塩と組み合わせて評価する。

Ｆｖ２−ＰＥＲＫをコードするｍＲＮＡの発現を、リアルタイムＰＣＲを使用して検証し、Ｆｖ２−ＰＥＲＫタンパク質の発現をウェスタンブロット分析によって検証する。ＰＥＲＫ−ｅＩＦ２αの活性化の影響を、トランスフェクトしたＯＰＣへのＡＰ２０１８７の添加後のｐ−ｅＩＦ２αについてウェスタンブロット分析によって評価する。さらに、トランスフェクトした乏突起膠細胞の生存度を、ＭＴＴアッセイ、ＴＵＮＥＬアッセイ、およびカスパーゼ−３活性アッセイを使用して、ＯＰＣの７日間の分化後に上記のように決定する。ＴＮＦ−ａ、Ｈ_２Ｏ_２、ペルオキシ亜硝酸塩ドナーＳＩＮ−１、またはグルタミン酸塩の存在下でＯＰＣにＡＰ２０１８７を添加した後、同一の分析を行った。乏突起膠細胞の生存度を、ＭＴＴアッセイ、ＴＵＮＥＬアッセイ、およびカスパーゼ−活性によって決定する。

ＡＰ２０１８７がＥＲストレス経路のエフェクターからＦｖ２−ＰＥＲＫ発現乏突起膠細胞を防御すると予想される。

（実施例２１：ＰＥＲＫ経路の活性によって上方制御される遺伝子の同定）
乏突起膠細胞に及ぼすＰＥＲＫ経路の活性化の防御効果を説明する機構を決定するために、ｍＲＮＡマイクロアレイ分析を使用して、上方制御された細胞防御遺伝子を同定する。

ｐｃＤＮＡ３．１−Ｆｖ２Ｅ−ＰＥＲＫでトランスフェクトされたＯＰＣを７日間分化させ、ＡＰ２０１８７で処置した。ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＡＰ２０１８７処置トランスフェクション細胞およびコントロールトランスフェクション細胞から単離し、ＤＮＡｓｅＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加してゲノムＤＮＡを消失させる。蛍光標識ＲＮＡプローブを準備し、Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘラット高密度オリゴヌクレオチドアレイとハイブリッド形成する。アレイの一次画像分析を、Ｇｅｎｅｃｈｉｐソフトウェアパッケージ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用して行う。生データも、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇソフトウェアによって分析する。その未加工のハイブリッド形成シグナルがチップバックグラウンドより有意に強い遺伝子のみを評価する。各遺伝子についての未加工のシグナル強度を同一チップ由来の全遺伝子の平均シグナル強度に対して正規化して、正規化シグナル強度を得る。その後の分析のために同一スケールで全データを視覚化するために、各遺伝子の正規化シグナル強度を、全サンプル間の遺伝子の平均シグナル強度で割って発現レベルを得る。

結果は、ＥＡＥにおけるＰＥＲＫ経路の防御効果に関与する細胞防御遺伝子が同定されることを示す。ＥＡＥの病理発生における新規に同定された遺伝子の役割を評価する。

（実施例２２：ＰＥＲＫ−ｅＩＦ２αの活性化により、ＥＡＥ中の乏突起膠細胞が細胞防御される）
ＰＥＲＫ−ｅＩＦ２α経路の活性化が乏突起膠細胞に及ぼす細胞防御効果によってＥＡＥ誘導性組織損傷を防御することを直接証明するために、マウス中のＰＥＲＫ活性を、乏突起膠細胞中のＰＥＲＫ経路の活性化を調節可能にするように調整する。

ミエリンプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）遺伝子の調節配列の転写調節下で乏突起膠細胞中にタンパク質を特異的に発現するトランスジェニックマウスを作製するために以前に使用された方法に基づいて（Ｆｕｓｓｅｔａｌ．，２０００，２００１；Ｄｏｅｒｆｌｉｎｇｅｒｅｔａｌ．，２００３）、融合Ｆｖ２Ｅ−ＰＥＲＫ（ＰＬＰ／Ｆｖ２Ｅ−ＰＥＲＫ）を発現する発現構築物を操作し、導入遺伝子フラグメントを、受精Ｃ５７ＢＬ／６マウスの卵母細胞に注射する。

導入遺伝子を発現する種々のＰＬＰ／Ｆｖ２Ｅ−ＰＥＲＫトランスジェニックマウス株が得られ、導入遺伝子の発現が動物に有害であることは見出されない。定量的リアルタイムＰＣＲを使用して、ヘテロ接合性動物のゲノム内に組み込まれた導入遺伝子のコピー数を決定し、ＣＮＳ中のＦｖ２Ｅ−ＰＥＲＫｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルを、リアルタイムＰＣＲおよびウェスタンブロット分析を使用して決定する。トランスジェニックマウスに、ＡＰ２０１８７を腹腔内注射し、ＣＮＳ中のＦｖ２Ｅ−ＰＥＲＫ活性を、ｐ−Ｆｖ２Ｅ−ＰＥＲＫおよびｐ−ｅＩＦ２αについてのウェスタンブロット分析によって決定する。最後に、ＣＣ１およびｐ−ｅＩＦ２α二重免疫染色を行って、ｅＩＦ２α経路がＡＰ２０１８７を投与されたトランスジェニックマウス中の乏突起膠細胞で特異的に活性化されるかどうか確認する。

ＡＰ２０１８７の投与後に乏突起膠細胞中のＰＥＲＫ経路を小さく活性化することが可能なトランスジェニックマウスを、ＥＡＥ実験のために選択する。実施例１に記載のように、マウスをＭＯＧ３３−３５ペプチドで免疫化し、乏突起膠細胞中のＦｖ２Ｅ−ＰＥＲＫを、ＥＡＥの発症前にＡＰ２０１８７を投与することによって活性化する。乏突起膠細胞中でのｅＩＦ２αの活性化を、ＣＣ１およびｐ−ｅＩＦ２α二重免疫染色によって検証し、臨床表現型、ＣＮＳにおける組織病理学的所見、およびＣＮＳにおける免疫応答を、上記実施例に記載のように特徴づける。

（実施例２３：再髄鞘形成乏突起膠細胞におけるＰＥＲＫ経路の活性化は、ＥＡＥ誘導性脱髄病変の再髄鞘形成を促進させる）
ＰＥＲＫ経路の活性化によってＥＡＥ誘導性脱髄病変中の乏突起膠細胞の再髄鞘形成が促進されるかどうかを決定するために、ＰＬＰ／Ｆｖ２Ｅ−ＰＥＲマウスにＥＡＥを誘導し、ＡＰ２０１１８７の存在下および非存在下でのＰＥＲＫの役割を評価する。

実施例に記載のようにＰＬＰ／Ｆｖ２Ｅ−ＰＥＲＫマウスをＭＯＧ３３−３５ペプチドで免疫化し、ＥＡＥの回復期のマウスへのＡＰ２０１１８７の投与によって乏突起膠細胞中のＦｖ２Ｅ−ＰＥＲＫを活性化する。臨床重症度スコアを、０〜５ポイントのスケール（０＝健康、１＝弛緩した尾、２＝運動失調および／または後肢の不全麻痺、３＝後肢の麻痺および／または前肢の不全麻痺、４＝四肢の麻痺、および５＝瀕死または死亡）にしたがって毎日記録した。

乏突起膠細胞中でのｅＩＦ２αの活性化を、ＣＣ１およびｐ−ｅＩＦ２α二重免疫染色によって検証する。一旦ＡＰ２０１８７処置マウスとコントロールマウスとの間の疾患の重症度が有意に異なるようであると、脊髄組織を調製し、再髄鞘形成について分析する。いずれかに記載のように（Ｌｉｎｅｔａｌ．、投稿中）、ＣＣ１免疫染色を使用して脱髄病変中の成熟乏突起膠細胞数を決定し、ＭＢＰについての免疫染色およびトルイジンブルー染色を使用して脱髄の程度を検証する。ＣＮＳにおける免疫応答を、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ３免疫染色、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−γ、ｉＮＯｓ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、およびＩＬ−２３についてのリアルタイムＰＣＲ分析によって評価する。

（実施例２４：ＰＥＲＫ−ｅＩＦ−２α経路を、ＭＳ患者の病変由来の乏突起膠細胞中で活性化する）
ＭＳ患者のＣＮＳ組織を、ＨｕｍａｎＢｒａｉｎａｎｄＳｐｉｎａｌＦｌｕｉｄＲｅｓｏｕｒｃｅＣｅｎｔｅｒ（ＬｏｓＡｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）およびＴｈｅＲｏｃｋｙＭｏｕｎｔａｉｎＭＳＣｅｎｔｅｒ（Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ，ＣＯ）から入手する。組織は、その生存期間にＭＳを罹患していたヒト由来の脳および脊髄組織、髄液、および他の組織標本を含み得る。サンプルを凍結するか、そうでなければ、ドナーの死亡直後に保存し、ドナーの病歴についての情報と共に慎重に貯蔵組織の目録を作成する。

Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して総ＲＮＡを凍結サンプルから単離し、ＤＮＡｓｅＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処置してゲノムＤＮＡを消失させた。ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍ
ｆｏｒＲＴ−ＰＣＲキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して逆転写を行った。ＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲを使用して、ＩＦＮ−γおよびＥＲストレスマーカーＢＩＰおよびＣＨＯＰの発現を定量した。ＰＥＲＫ、ｅＩＦ２α、ｐ−ＰＥＲＫ、およびｐ−ｅＩＦ２αのタンパク質レベルを、ウェスタンブロット分析を使用して決定した。

残存する凍結組織を、最適切断温度の化合物中に包埋する。組織サンプルの凍結切片（厚さ１０μｍ）を調製し、ＣＣ１免疫染色を使用して、脱髄病変中の乏突起膠細胞数を決定する。ＭＢＰ免疫染色を使用して、脱髄の程度を検証する。ＣＮＳ中の免疫応答を、ＣＤ１１ｂ免疫染色およびＣＤ３免疫染色によって評価する。さらに、ＣＣ１およびｐ−ＰＥＲＫ二重免疫染色またはＣＣ１およびｐ−ｅＩＦ２α二重免疫染色を行って、ＭＳ病変中のＰＥＲＫ−ｅＩＦ２α経路の活性化を証明する。

炎症性細胞および活性化小グリアの分布および密度に基づいて、ＭＳ誘導性脱髄病変を、以下の３つのカテゴリーに分類することができる：活動性（急性）、慢性活動性、および慢性非活動性（Ｌａｓｓｍａｎｎ，１９９８；Ｔｒａｐｐｅｔａｌ．，１９９９）。サンプル中のＩＦＮ−γレベルとＰＥＲＫ経路の活性との間の関係および病変中の脱髄の程度とＰＥＲＫ経路の活性との間の関係を決定する。

ＰＥＲＫ−ｅＩＦ２α経路がＭＳ病変の乏突起膠細胞中で活性化されると予想される。ＭＳ中の乏突起膠細胞の異種パターンのために、ＰＥＲＫ−ｅＩＦ２α経路の活性化は、いくつかの組織サンプルのみで検出されると予想される。

（実施例２５：ＧＡＤＤ３４の欠失は、乏突起膠細胞中のｐ−ｅＩＦ２αレベルを増加させ、ＥＡＥ誘導性脱髄を防御する）
１．ｉｎｖｉｖｏ研究
ｅＩＦ２αのリン酸化は、シグナル伝達経路の間で高度に保存された収束点（ｐｏｉｎｔｏｆｃｏｎｖｅｒｇｅｎｃｅ）である（Ｊｏｕｓｓｅｅｔａｌ（２００３）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６３：７６７−７７５；ＰｒｏｕｄＣＧ（２００５）Ｓｅｍｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６：３−１２）。４つのタンパク質キナーゼは、ＥＲ（ＰＥＲＫ）中のタンパク質不良折り畳み（ｍａｌｆｏｌｄｉｎｇ）、アミノ酸欠乏（ＧＣＮ２）、ウイルス感染（ＰＫＲ）、およびヘム欠損（ＨＲＩ）の他の非関連ストレスにｅＩＦ２αのリン酸化をつなぎ合わせることが公知である（ＰｒｏｕｄＣＧ（２００５）Ｓｅｍｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６：３−１２）。このｅＩＦ２αリン酸化依存性ストレス誘導性経路は、総合的ストレス応答（ＩＳＲ）と呼ばれている（Ｈａｒｄｉｎｇ，ｅｔａｌ（２００３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ１１：６１９−６３３；ＰｒｏｕｄＣＧ（２００５）Ｓｅｍｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６：３−１２）。ストレスから回復させるために、ｅＩＦ２αを、酵素ホスファターゼ（ＰＰ１）およびその不可欠な非酵素補因子である成長停止ＤＮＡ損傷３４（ｇｒｏｗｔｈａｒｒｅｓｔ
ａｎｄＤＮＡｄａｍａｇｅ３４）（ＧＡＤＤ３４）を含む複合体によって迅速に脱リン酸化する（Ｃｏｎｎｏｒ，ｅｔａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１：６８４１−６８５０；Ｎｏｖｏａｅｔａｌ（２００１）Ｊ．ＣｅｌｌＢＭ．１５３：１０１１−１０２２；Ｎｏｖｏａｅｔａｌ（２００３）ＥＭＢＯＪ．２２：１１８０−１１８７）。ＧＡＤＤ３４の発現を、サイトゾル転写因子ＡＴＦ４の誘導によって調節し、その翻訳を、ｅＩＦ２αリン酸化の存在下で上方制御し、それにより、強固な自己フィードバックループが作製される（Ｎｏｖｏａｅｔａｌ（２００３）ＥＭＢＯＪ．２２：１１８０−１１８７；Ｊｉａｎｇｅｔａｌ（２００４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２４：１３６５−１３７７）。ＧＡＤＤ３４欠失により、ストレス細胞中のｐ−ｅＩＦ２αレベルが増加し、細胞がストレスから防御される（Ｊｏｕｓｓｅ
ｅｔａｌ（２００３）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６３：７６７−７７５；Ｍａｒｃｉｎｉａｋｅｔａｌ（２００４）ＧｅｎｅｓＤｅｖ．１８：３０６６−３０７７）。

上記実施例に示すように、ＣＮＳ中でのＩＦＮ−γの初期誘導は、ＥＡＥを発症するように誘導した動物で防御効果を示し、この防御はＰＥＲＫに依存する。乏突起膠細胞中のＰＥＲＫの活性化によってＩＦＮ−γの初期の存在が総合的ストレス応答（ＩＳＲ）を活性化して炎症性脱髄から防御されるかどうかを試験するために、ＧＡＤＤ３４変異マウスにおけるＥＡＥの影響を試験した。ＧＡＤＤ３４の非存在下でのストレス応答の延長は有用であると予想される。

ａ．ＥＡＥの発症は、ＧＡＤＤ３４−ヌルマウスで有意に遅延される。

実施例１７に記載のように、ＧＡＤＤ３４−ヌルマウスおよびコントロールマウスにＥＡＥを誘導した。簡潔に述べれば、ＧＡＤＤ３４−ヌルマウスをＣ５７ＢＬ／６マウスと少なくとも６回戻し交配した。マウスの脇腹および尾の根元に、６００μｇの結核菌を補足した完全フロイントアジュバント中に乳化した２００μｇのＭＯＧ３５−５５ペプチドを皮下注射によって投与することによって、ＥＡＥを誘導する。４００ｎｇの百日咳毒素の腹腔内注射を、２４時間後および７２時間後に行った。臨床重症度スコアを０〜５ポイントのスケール（０＝健康、１＝弛緩した尾、２＝運動失調および／または後肢の不全麻痺、３＝後肢の麻痺および／または前肢の不全麻痺、４＝四肢の麻痺、および５＝瀕死または死亡）を使用して毎日記録した。

ＧＡＤＤ３４−ヌルマウスで発症した臨床疾患は、同腹仔コントロールマウスでの発症と比較した場合、有意に遅延する（図２６）。さらに、ＧＡＤＤ３４−ヌルマウスでの疾患の重症度は、コントロールマウスよりも軽度であった。したがって、ＧＡＤＤ３４機能の喪失は、ＥＡＥの発症を遅延させ、疾患の重症度を小さくする。

ｂ．ＧＡＤＤ３４の喪失は、乏突起膠細胞中のｐ−ｅＩＦ２αレベルが増加し、ＥＡＥ誘導性脱髄から防御される
脊髄組織を調製し、コントロールマウスが疾患重症度のピークにある時点で分析した。予想通り、ＧＡＤＤ３４の発現は、ＥＡＥを罹患したマウスの腰髄中の乏突起膠細胞中で上方制御され、これは、年齢適合ナイーブマウスの乏突起膠細胞中で検出不可能であった（図２７ａおよび２７ｂ）。さらに、ＣＣ１およびｐ−ｅＩＦ２αの二重標識により、ＧＡＤＤ３４欠失によってコントロールマウスと比較して、ＥＡＥを罹患したＧＡＤＤ３４ヌルマウスの腰髄中の乏突起膠細胞中のｐ−ｅＩＦ２αレベルが顕著に増加することが明らかとなった（図２７ｃおよび２７ｂ）。組織学的分析により、コントロールマウスの腰髄中に典型的なＥＡＥ脱髄病変（髄鞘の破壊（図２８ａおよび２８ｃ）、乏突起膠細胞の喪失（図８ｅ）、軸索損傷（図２８ｇ））が明らかとなった。対照的に、この時点でのＭＢＰ免疫染色およびトルイジンブルー染色によって、ＧＡＤＤ３４ヌルマウスの腰髄中に明らかな脱髄病変は認められなかった（図２８ｂおよび２８ｄ）。重要には、ＧＡＤＤ３４ヌルマウスの腰髄中の乏突起膠細胞は、ほとんどインタクトなままであった（図２８ｆ）。さらに、ＧＡＤＤ３４欠失により、コントロールマウスと比較してＧＡＤＤ３４ヌルマウスの腰髄中の軸索損傷は劇的に減少した（図２８ｇおよび２８ｈ）。まとめると、これらのデータは、ＧＡＤＤ３４欠失が乏突起膠細胞中のｐ−ｅＩＦ２αレベルを増加させ、したがって、総合的ストレス応答を延長し、ＥＡＥ誘導性脱髄から防御することを示す。

２．ｉｎｖｉｔｒｏ研究
細胞のストレスからの防御におけるｅＩＦ２αのリン酸化の重要性により、いくつかのヒト疾患の治療に潜在的に有用であり得るｅＩＦ２αのリン酸化の小分子モジュレーターを探索した。Ｂｏｙｃｅｅｔａｌ．（Ｂｏｙｃｅ，ｅｔａｌ．（２００５）Ｓｃｉｅｎｃｅ３０７：９３５−９３９）は、薬物スクリーニングを使用し、このスクリーニングは、ＥＲストレス誘導性アポトーシスに対する細胞防御を付与する小分子を同定するであろう。彼らは、ｅＩＦ２α脱リン酸化の小分子インヒビターであるサルブリナール（ＳＡＬ）を同定した。これは、ＰＰ１−ＧＡＤＤ３４ホスファターゼ活性を特異的に阻害し、それによりｅＩＦ２αリン酸化が保持される。ＳＡｌでの処置により、ＥＲストレスおよびウイルス感染から細胞が防御される（Ｂｏｙｃｅ，ｅｔａｌ．（２００５）Ｓｃｉｅｎｃｅ３０７：９３５−９３９）。

本発明者らの仮説は、総合的ストレス応答が多発性硬化症（ＭＳ）患者における炎症反応の有害な影響から乏突起膠細胞を防御する可能性があるということである。上に示すように、ＧＡＤＤ３４がヌル変異したマウスは、ｅｌＦαリン酸化の増加およびＥＡＥ誘導に対する応答の遅延（疾患ピークでの重症性脱髄の減少が含まれる）を示す。ｅＩＦ２αリン酸化を延長する薬剤が有害な炎症因子から乏突起膠細胞を防御し得るかどうかを試験するために、免疫サイトカインＩＦＮ−γの存在下でのサルブリノール（Ｓａｌ）の影響を、髄鞘形成のｉｎｖｉｔｒｏモデルで試験した。

ｉｎｖｉｔｒｏで十分に髄鞘形成することが示されている海馬器官型培養物（ＨＯＣ）。ＨＯＣを以前に記載のように調製および維持し（ＫｕｎｋｌｅｒａｎｄＫｒａｉｇ（１９９７）ＪＣｅｒｅｂＢｌｏｏｄＦｌｏｗＭｅｔａｂ．１７：２６−４３）、使用前に７日間ｉｎｖｉｔｒｏで保持した。種々の濃度のＳＡＬを、１００Ｕ／ｍｌＩＦＮ−γと組み合わせ、ＨＯＣ培養物に７日間添加した。培養物中の豊富なレベルのミエリン特異的タンパク質であるミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）によって証明されるように、未処置ＨＯＣ中に健全な髄鞘形成が認められた（図２９）。１００Ｕ／ｍｌ
ＩＦＮ−γ曝露の７日後、ＭＢＰレベルは、ＨＯＣにおいて約８０％減少した（図２９）。ＳＡＬ処置のみではＭＢＰ発現に影響を及ぼさなかった。しかし、ＳＡＬ処置により、ＩＦＮ−γ曝露によって誘発されたＭＢＰ発現の減少が顕著に弱められた（図２９）。ＩＦＮ−γの存在は、脱髄病変中の再髄鞘形成を阻害することが示されている（実施例２〜７を参照のこと）。まとめると、これらのデータは、ｅＩＦ２αリン酸化を促進するか延長する薬剤での処置によって免疫媒介性脱髄疾患においてミエリン修復を促進することができることを示す。

（実施例２６：サイトカインシグナル伝達の阻害は、ＩＦＮ−γの有害な影響から乏突起膠細胞を防御する）
１．トランスジェニックマウスの作製および評価
ａ）乏突起膠細胞中でＳＯＣＳ１を発現するトランスジェニックマウスの作製
トランスジェニックマウス株ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１を、ＰＬＰ発現カセットおよびＳＯＣＳｌｃＤＮＡを含む構築物を使用して精製した（図３０Ａ）。ＰＬＰ発現カセットは、他の場所に記載されており、多数の導入遺伝子の乏突起膠細胞特異的発現のために使用されている（Ｗｉｇｈｔｅｔａｌ．，１９９３；Ｆｕｓｓｅｔａｌ．，２０００；Ｄｏｅｒｆｌｉｎｇｅｒｅｔａｌ．，２００３；Ｇｏｎｚａｌｅｓｅｔａｌ．，２００５）。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースまたは抗Ｆｌａｇ抗体ベースの検出方法におけるＳＯＣＳ１発現のためのマーカーとして役立つＦｌａｇ−エピトープ配列を含んでいたので、ＳＯＣＳｌｃＤＮＡクローン（Ｓｔａｒｒｅｔａｌ．，１９９８）を使用した（ＥｉｎｈａｕｅｒａｎｄＪｕｎｇｂａｕｅｒ，２００１）。簡潔に述べれば、Ｆｌａｇ−ＳＯＣＳｌｃＤＮＡを、ＸｂａＩを使用して元の発現ベクターｐＥＦ−ＦＬＡＧ−Ｉ／ｍ４Ａ２から切り出した。フラグメントにクレノウを充填し、中間ベクター（修飾ｐＮＥＢ／１９３ベクター）のＳｍａＩ制限部位にサブクローン化した。得られたｐＮＥＢ１９３／ＳＯＣＳｌベクターを、ＡｓｃＩおよびＰａｃＩでさらに消化して（部分消化）、Ｆｌａｇ−ＳＯＣＳ１フラグメントを放出し、ＰＬＰ発現カセットのポリリンカー領域の同一の制限部位にサブクローン化した。ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１ベクターを、ＡｐａＩおよびＳａｃＩＩで消化し（部分消化）、線状の１５ｋｂ導入遺伝子を、受精（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ×ＤＢＡ／２Ｊ）卵母細胞への微量注入のために単離した。導入遺伝子に陽性の子孫を、導入遺伝子特異的プライマーを使用したＰＣＲによるテールＤＮＡの増幅によって同定した。同定された樹立系統を、次に、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配させて（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＢａｒＨａｒｂｏｒ，ＭＥ）、トランスジェニック系統を確立した。

ｂ）ＣＮＳ中にＩＦＮ−γを発現するトランスジェニックマウス系統の作製
ＣＮＳ中にＩＦＮ−γを過剰発現するトランスジェニックマウスＭＢＰ／ＩＦＮ−γ（１７２系統）およびＧＦＡＰ／ｔＴＡ×ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ（１８４／１１０系統および１８４／６７系統）は、別の場所に記載されている（Ｃｏｒｂｉｎｅｔａｌ．，１９９６；Ｇａｏｅｔａｌ．，２０００；Ｌｉｎｅｔａｌ．，２００４，２００５）。簡潔に述べれば、ＭＢＰ／ＩＦＮ−γ（１７２系統）マウスは、ＩＦＮ−γ発現がミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）転写調節領域によって駆動されるトランスジェニック動物である（Ｇａｏｅｔａｌ．，２０００）。ＧＦＡＰ／ｔＴＡ×ＴＲＥ／ＩＦＮ−γは、単一トランスジェニックＧＦＡＰ／ｔＴＡ（１８４系統）と単一トランスジェニックＴＲＥ／ＩＦＮ−γ（１１０系統および６７系統）マウスとの交配によって得られた二重トランスジェニックマウスである。実験で使用した２つのＴＲＥ／ＩＦＮ−γマウス系統（１１０系統および６７系統）は、ＧＦＡＰ／ｔＴＡマウスと交配した場合に異なる量のＩＦＮ−γを産生する（１８４／１１０および１８４／６７）（Ｌｉｎｅａｌ．，２００４，２００５）。ＧＦＡＰ／ｔＴＡ×ＴＲＥ／ＩＦＮ−γは、テトラサイクリンオフ誘導系（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｏｆｆ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｓｙｓｔｅｍ）であり、この系は、グリア線維酸性遺伝子（ＧＦＡＰ）転写調節領域がｔＴＡの発現を駆動し、次いで、ＴＲＥ（ｔｅｔ応答エレメント）に結合してＩＦＮ−γの発現を開始する。ドキシサイクリンの投与により、ｔＴＡＤＮＡ結合およびＩＦＮ−γ発現が抑制され、ドキシサイクリンの除去によってＩＦＮ−γ発現の一過性調節誘導が可能である（Ｇａｏｅｔａｌ．，１９９９）。

ｃ）トランスジェニック動物の交配および評価
ＩＦＮ−γ過剰発現マウスを、二重トランスジェニック交配系（ＭＢＰ／ＩＦＮ−γ×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１）および三重トランスジェニック交配系（ＧＦＡＰ／ｔＴＡ×ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１）でＰＬＰ／ＳＯＣＳ１マウスと交配させた。ＭＢＰ／ＩＦＮ−γ×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１（１７２×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１）交配を、標準的な交配プロトコールにしたがって行った。ＧＦＡＰ／ｔＴＡ×ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１交配を、以下の２工程交配過程で行った：ＧＦＡＰ／ｔＴＡマウス（１８４系統）を、ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１マウスと最初に交配し、次いで、二重陽性（１８４×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１）子孫を、ＴＲＥ／ＩＦＮ−γの１１０および６７系統と個別に交配させた。この第２の交配工程を、前に記載した「ｔｅｔオフ」プロトコールにしたがって行った。ドキシサイクリン０．０５ｍｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｉｃｈ）を、胚齢１４日目まで妊娠した雌マウスの水に添加し、その後、動物を正常な水に戻し、それにより、ＩＦＮ−γ転写が開始され、生後にピークになる（Ｌｉｎｅｔａｌ．，２００５）。

交配系の同腹仔（Ｆ１世代）を毎日試験し、生後２１日目で屠殺した。臨床評価は、挙動観察および振戦を誘発するための負荷梯子歩行（ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄｌａｄｄｅｒ
ｗａｌｋｉｎｇ）を含んでいた。組織学的試験は、乏突起膠細胞の数および密度の定量ならびに髄鞘形成パターンの試験を含んでいた。ＩＦＮ−γおよびＦｌａｇ−ＳＯＣＳ１の発現を検証および測定するために、脳組織を屠殺時点で各動物から同時に得た（以下を参照のこと）。その後、遺伝子型に従って臨床的および組織学的所見を階層化した。全動物手順は、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈＧｕｉｄｅ
ｆｏｒＣａｒｅａｎｄＵｓｅｏｆＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌｓを遵守して行い、これらの手順は、ＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＡｎｉｍａｌＣａｒｅ
ａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅａｔＴｈｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｈｉｃａｇｏによって承認されていた。

ｄ）トランスジェニック動物のポリメラーゼ連鎖反応および遺伝子型同定
全実験動物を、単位テール（Ｂｉｏｔｅｋ２０００ａｕｔｏｍａｔｉｃｓｙｓｔｅｍ，Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｔｌｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）を使用して遺伝子型同定を行った。導入遺伝子検出のためのＰＣＲ（ＱｉａｇｅｎＰＣＲキット、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を、以下の導入遺伝子特異的スクリーニングプライマーを使用して行った：

。

ｅ）ノーザンブロット分析および定量的ＰＣＲ法
総ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ試薬（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して実験動物から単離した。１．２％変性アガロースゲル中で２０μｇの総ＲＮＡを分離することによってノーザンブロットを行った。サンプルをナイロン膜に移し、ＰＣＲ（ＧｅｎＡｍｐ２４００；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｗｅｌｌｅｓｌａｙ，ＭＡ）によって［γ−^３２Ｐ］ｄＣＴＰおよび［γ−^３２Ｐ］ｄＡＴＰ（Ｎｅｗ
ＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ／Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｗｅｌｌｅｓｌａｙ，ＭＡ）で無作為に標識したＳＯＣＳ１プローブを使用して一晩ハイブリッド形成した。Ｋｏｄａｋフィルムを、ハイブリッド形成した膜に−８０℃で４８時間曝露し、Ｍ７ＢＫｏｄａｋ処理装置（Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を使用して現像した。各レーンに存在する総ＲＮＡの相対レベルを評価するために、膜を剥ぎ取り、２８ＳリボゾームＲＮＡに特異的な放射性標識プローブを使用してハイブリッド形成させた（Ｂａｅｒｗａｌｄｅｔａｌ．，１９９８）。

定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲ）を、オリゴ（ｄＴ）_{１２〜１８}およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＲＴ−ＰＣＲキット）を使用した１μｇのＤＮＡａｓｅＩ処置（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）総ＲＮＡの第１の逆転写によって行った。ｉＱＳｕｐｅｒｍｉｘおよび以下のＦｌａｇ−ＳＯＣＳ１およびＩＦＮ−γのためのプライマーおよびプローブを含む反応物での２０ｎｇのｃＤＮＡを使用してＱ−ＰＣＲを行った：

。
以下の実験下でＢｉｏＲａｄＩ−サイクラーリアルタイムＰＣＲユニットを使用して反応を行った：９５℃で３分間を１サイクル、９５℃で３０秒間を４０サイクル、および６０℃で３０秒間（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。Ｆｌａｇ−ＳＯＣＳ１およびＩＦＮ−γのｍＲＮＡレベルを、閾値サイクル（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｃｙｃｌｅｓ）（Ｆｌａｇ−ＳＯＣＳ１／ＧＡＰＤＨおよびＩＦＮ−γ／ＧＡＰＤＨ比）に基づいたＧＡＰＤＨの発現レベルに正規化した（Ｌｉｎｅｔａｌ．，２００５）。

ｆ）ウェスタンブロット分析および免疫沈降法
いくつかのＰＬＰ／ＳＯＣＳ１マウスおよび野生型マウスの脳および脾臓由来の総溶解物を、ＲＩＰＡ緩衝液（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＳａｎｔａＣｒｕｚ，ＣＡ）中での組織均質化によって得た。氷上で１５分間のインキュベーション後、溶解物を、１４，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上清を回収した。タンパク質サンプル（５０μｇ）を、１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動し、ＰＶＤＦ膜（Ｔｒａｎｓ−ｂｌｏｔＳＤａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に移し、マウス抗Ｆｌａｇ抗体（Ｍ２，１０００倍希釈）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と一晩インキュベートし、ＥＣＬＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ検出試薬（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で検出した。Ｆｌａｇタンパク質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（Ｆｌａｇオリゴペプチドのポリマー）を、反応のためのポジティブコントロールとして使用した。

免疫沈降キット（ＲｏｃｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用し、ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１および野生型マウスの脳および脾臓由来のタンパク質抽出物の抗Ｆｌａｇ抗体（Ｍ２）との４℃で４時間のインキュベーション、その後のタンパク質Ａ／Ｃアガロースとの４℃で一晩のインキュベーションによって免疫沈降を行った。免疫複合体を１４，０００ｒｐｍでの２０秒間遠心分離によって回収し、キットから提供された試薬を使用して、タンパク質Ａ／Ｃアガロースからタンパク質を分離した。免疫沈降タンパク質のウェスタンブロットを、上記のように行った。

ｇ）免疫組織化学
動物を、腹腔内投与した０．０１ｍｌ／ｇの２．５％アベルチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で麻酔し、生理食塩水およびその後の２％パラホルムアルデヒドで１０分間潅流した。脳を取り出し、２％パラホルムアルデヒドで１時間後固定し、３０％スクロース中で４８時間低温保存し、凍結ブロックとして調製し（ＯＣＴｃｏｍｐｏｕｎｄ，Ｓａｃｕｒａ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）、−２０℃で厚さ７μｍの切片にした（Ｌｅｉｃａ
ＣＭ１８００ｃｒｙｏｓｔａｔ，ＬｅｉｃａＭｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）。免疫染色前に、切片を０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で１０分間処置し、１０％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）またはヤギ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と３０分間インキュベートした。一次抗体（室温で２時間または４℃で一晩）およびＦＩＴＣ抱合またはＣｙ３抱合二次抗体（３０分間）との連続インキュベーションによって、間接的免疫染色を行った。本研究で使用した全ての以下のプライマーおよび二次抗体は市販されている：マウスおよびウサギ抗Ｆｌａｇ抗体（１００倍希釈；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、マウス抗ＣＣ１抗体（２０倍希釈；Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、マウスＭＨＣクラスＩ抗体（１００倍希釈；ＣｈｅｍｉｃｏｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）、マウス抗ＰＬＰ、プロテオリピドタンパク質、高アイ（１００倍希釈；ＣｈｅｍｉｃｏｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、マウスおよびウサギ抗ＳＯＣＳ１抗体（１００倍希釈；ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＳａｎｔａＣｒｕｚ，ＣＡ）、ウサギ抗Ｓｔａｔ１抗体（１００倍希釈；ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｙ）、抗マウスまたは抗ウサギＦＩＴＣ抱合二次抗体（１００倍希釈；ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｂａｒ
Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）、および抗マウスまたは抗ウサギＣｙ３抱合抗体（５００倍希釈；ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）。免疫染色切片を、ＤＡＰＩ核スタチン（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を含むＶｅｃｔｏｒｓｈｉｅｌｄマウント培地を使用してマウントし、蛍光顕微鏡（Ａｘｏｐｌａｎ；ＣａｒｌＺｅｉｓｓＭｉｃｒｏｉｍａｇｉｎｇ）を使用して試験した。

以前に記載のように、Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウェアを使用して、生後２１日目の乏突起膠細胞の密度を評価した（Ｌｉｎｅｔａｌ．，２００５）。脳を、脳梁を通過して２つの左右対称の半球に分割して矢状切片にした。各半球由来の１０個の凍結切片を、厚さ７μｍに調製し、その調製順に番号をつけた。研究群あたり３匹の動物の脳を、この様式で調製した。ＣＣ１免疫染色後、各切片の脳梁の対応領域を、デジタル処理で選択し、対応する全領域を得た。各切片の選択領域内のＣＣ１細胞を手作業で計数し、平方領域（ｍｍ^２）あたりのＣＣ１陽性細胞数を計算した。結果を、ＣＣ１（＋）細胞／ｍｍ^２の平均±ＳＤ（研究群あたりｎ＝３）として示した。

ｈ）電子顕微鏡法
電子顕微鏡法研究のために選択したマウスを、４％パラホルムアルデヒドおよび２．５％グルタルアルデヒドで潅流した。脳を採取し、白質構造を、ステレオタイプ顕微鏡（ＷｉｌｄＭ３Ｃ；ＷｉｌｄＡＧ，Ｈｅｅｂｒｕｇｇ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して切片にした。組織を、四酸化オスミウム中でさらに後固定し、新たに調製したエポキシ樹脂（Ｅｐｏｎ−８１２；ＥｌｅｃｔｒｏｎＭｉｃｒｏｓｃｏｐｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＦｏｒｔＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）中に６０℃で４８時間包埋した。樹脂ブロックを、ＬｅｉｃａＵｌｔｒａｃｕｔｕｌｔｒａｍｉｃｒｏｔｏｍｅ（ＬｅｉｃａＭｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して９０ｎｍの切片にし、５％酢酸ウラシルおよび２．５％クエン酸鉛で染色した。組織サンプルの超微細構造を、Ｔｅｃｎａｉ−Ｆ３０透過型電子顕微鏡（ＦＥＩＣｏｍｐａｎｙ，Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏ，ＯＲ）を使用して試験した。

生後２１日目の試験した動物の髄鞘形成パターンを、以前に記載のように（Ｌｉｎａｔａｌ．，２００５）、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）を使用した非有髄軸索の比率および軸索／線維の直径の比（Ｇ比）の計算によって評価した。脳を、脳梁を通過して２つの左右対称の半球に分割して矢状切片にした。脳梁の両半球の脳梁膝および脳梁膨大由来の約２ｍｍ^３のサンプルを、ＷｉｌｄＭ３Ｃステレオタイプ顕微鏡を使用して得た。軸索断面が得られる（ミエリン環（ｍｙｅｌｉｎｒｉｎｇ）が十分に見える）樹脂ブロック中の標本の方向を選択し、少数のサンプル切片のトルイジンブルー染色によって確立した。選択した方向の樹脂ブロックを、電子顕微鏡試験のために処理した。無作為に選択した領域を試験し、脳梁膝および脳梁膨大の両方由来の１０個の代表的な写真を、１２０００倍で得た。非有髄軸索数を、ミエリンを欠き、且つそれ自体の原形質膜のみによって富化された軸索の手作業の計数によって評価した。代表的画像中に存在する全ての非有髄軸索を計数し、その比率を、組織サンプルあたり全部で５００個の軸索の試験によって計算した。有髄軸索のＧ比（軸索の直径／線維の直径比）を、髄鞘の内面および外面によって富化された領域のデジタル処理で選択すること、軸索（内面）および線維（外面）の直径を得ること、その対応する値を割ること（軸索直径／線維直径比）によって評価した。群あたり３匹の動物の脳を試験し、脳梁膝および脳梁膨大の両方由来の全部で１５０の神経線維のＧ比を試験した。結果を、Ｇ比および非有髄軸索の平均±ＳＤ（研究群あたりｎ＝３）で示した。

ｉ）混合初代乏突起膠細胞培養物およびＳＴＡＴ１転位置アッセイ
混合初代乏突起膠細胞培養物を、以前に記載のように調製した（Ｂａｅｒｗａｌｄｅｔａｌ．，２０００）。簡潔に述べれば、ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１およびＣ５７Ｂ１／６Ｊ交配の２〜３日齢の新生児から脳組織を採取した。同腹仔がトランスジェニックの仔および野生型の仔を含んでいたので、各動物の脳を個別に処理し、個別に培養し、その後に表現型を適合させた。各脳を、０．２５％トリプシンおよび１０μｇ／ｍｌＤＮＡａｓｅＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を使用して３７℃で２０分間個別に消化し、細胞を、ポリＤ−リジンコーティング７５ｍｍ^２フラスコ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）上で培養した。培養物を、１０％ウシ胎児血清ＤＭＥＭを使用して３７℃、５％ＣＯ_２で１２日間維持し、次いで、５μｌ／ｍｌのインスリン、５０μｌ／ｍｌのトランスフェリン、３０ｎＭのセレン、１０ｎＭのビオチン、１０ｎＭのプロゲステロン、１５ｎＭのＴ３、０．１％ウシ血清アルブミン、および１％アンピシリン−ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む合成培地に交換した。分化５日目に、培養物を、１００Ｕ／ｍＬのＩＦＮ−γ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で３０分間処置した。抗ＰＬＰ抗体および抗Ｓｔａｔ１抗体の二重免疫染色ならびにＤＡＰＩ核染色を、上記のように行った。Ｓｔａｔ１核転位置アッセイを、６つの個別の培養調製物で行った。野生型およびＰＬＰ／ＳＯＣＳ１培養物中の１００個のＰＬＰ陽性細胞を手作業で計数した。結果を、Ｓｔａｔ１核転位置に陽性を示す細胞の平均±ＳＤ％として示す。

ｊ）統計分析
全データを、３つの独立した実験から作成した。平均、標準偏差、およびｐ値を、ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ）のＡｖｅｒａｇｅ、Ｓｔｄｅｖ、およびＡｎｏｖａを使用して計算した。統計的有意差を、０．０５未満のｐ値と定義した。

２．ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１トランスジェニックマウス系統の特徴付け
実施例２５に記載のように作製したＰＬＰ／ＳＯＣＳ１トランスジェニックマウスを、髄鞘形成細胞中でＦｌａｇエピトープタグ化ＳＯＣＳ１を発現する用にデザインした（図３０Ａ）。これらのマウスは、表現型異常を示さず、メンデルの法則において交配してトランスジェニック子孫を作製し、通常の寿命である。１歳までの異なる時点で行った組織学的評価（電子顕微鏡法が含まれる）により、トランスジェニック同腹仔と野生型同腹仔との間で、髄鞘形成パターンまたは乏突起膠細胞の数、密度、もしくは形態学（以下を参照のこと）に有意差は認められなかった。

生後２１日目のＰＬＰ／ＳＯＣＳ１導入遺伝子の発現を、いくつかの方法を使用して特徴づけた。ＳＯＣＳ１ｃＤＮＡハイブリッド形成プローブを使用したノーザンブロット分析により、コントロール脳サンプルと比較してトランスジェニックマウス脳由来のＲＮＡサンプル中のバンドの強度の増加が明らかとなったが、他の組織ではそうではなかった（図３０Ｂ）。導入遺伝子特異的プライマーを使用したリアルタイムＰＣＲ分析により、脳、脊髄、および座骨神経中で導入遺伝子由来のＳＯＣＳ１ｍＲＮＡの濃度が最も高く、他の器官（心臓、胸腺、脾臓、および肝臓が含まれる）では有意により低いことが明らかとなった（図３０Ｃ）。導入遺伝子の発現は、１２月齢まで安定なようであった（データ示さず）。

Ｆｌａｇタグに対する抗体を使用したウェスタンブロット分析により、ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１脳溶解物中のＳＯＣＳ１の推定サイズに対応する１９ｋＤのバンドが明らかとなったが、野生型脳溶解物やＰＬＰ／ＳＯＣＳ１脾臓溶解物では層ではなかった（図３０Ｄ）。Ｆｌａｇ−ＳＯＣＳ１タンパク質発現をさらに確認するために、本発明者らは、抗Ｆｌａｇ抗体を使用した免疫沈降を行い、これにより、ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１脳免疫沈降物中に１９ｋＤの陽性バンドが再度検出されたが、野生型脳やＰＬＰ／ＳＯＣＳ１脾臓免疫沈降物中には検出されなかった（図３０Ｅ）。

抗ＳＯＣＳ１抗体および抗Ｆｌａｇ抗体を使用した野生型およびＰＬＰ／ＳＯＣＳ１脳の間接的免疫沈降も、導入遺伝子の発現が証明された（図３０Ｆ〜Ｉ）。本発明者らは、ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１脳のみにおいて抗Ｆｌａｇおよび抗ＳＯＣＳ１免疫陽性を検出した。

ＣＮＳ中にＦｌａｇ−ＳＯＣＳ１発現を局在化するために、本発明者らは、野生型およびＰＬＰ／ＳＯＣＳ１脳組織の抗Ｆｌａｇ抗体および抗ＰＬＰ抗体（ミエリンのマーカー）または抗ＣＣ１抗体（乏突起膠細胞の細胞体のマーカー）のいずれかとの二重免疫染色を行った。抗ＰＬＰ抗体と抗Ｆｌａｇ抗体の間および抗ＣＣ１抗体と抗Ｆｌａｇ抗体との間に強い共存が認められ（データ示さず）、Ｆｌａｇ−ＳＯＣＳ１が白質および乏突起膠細胞に局在することが示唆された（図３１）。抗Ｆｌａｇ抗体、抗ＰＬＰ抗体、または抗ＣＣ１抗体の非共存免疫陽性は検出されなかった。

抗ＰＬＰ抗体および抗Ｆｌａｇ抗体での二重免疫染色によってトランスジェニック動物から確立した初代混合乏突起膠細胞培養物中でのＦｌａｇ−ＳＯＣＳ１の発現も検出された（図３２）。Ｆｌａｇ−ＳＯＣＳ１の発現は、ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１動物由来の培地のみおよびＰＬＰを発現する細胞のみで検出された。実質的に全てのＰＬＰ陽性細胞もＦｌａｇ−ＳＯＣＳ１陽性を示した。抗Ｆｌａｇと抗ＰＬＰ免疫反応との間の共存は、細胞体および細胞突起の両方を含むようであった（図３２Ｆ）。

３．ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１マウス由来の乏突起膠細胞はＩＦＮ−γに対する反応性が減少する
初代混合グリア培養物におけるＩＦＮ−γに対するＰＬＰ／ＳＯＣＳ１乏突起膠細胞の反応性を研究した。トランスジェニックＳＯＣＳ１の発現がＩＦＮ−γシグナル伝達分子Ｓｔａｔ１の核転位置を妨害するかどうかを決定するために、細胞培養物を、１００Ｕ／ｍＬのＩＦＮ−γで３０分間処置し、抗ＰＬＰ抗体および抗Ｓｔａｔ１抗体をＤＡＰＩ核色素と共に使用して免疫染色を行った（図３３）。野生型培養物におけるＳｔａｔ１細胞内局在の実験により、全ての細胞（ＰＬＰ陽性乏突起膠細胞が含まれる）におけるＤＡＰＩ陽性核との強い共存が明らかとなった。対照的に、ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１培養物中のＳｔａｔ１細胞内局在化により、ＩＦＮ−γに対する差分応答が明らかとなった。トランスジェニックＰＬＰ陽性乏突起膠細胞では、Ｓｔａｔ１が細胞質中に残存し、ＩＦＮ−γの存在下で細胞核と共存しなかった（図３３Ｅ〜Ｈ）。これは、野生型細胞と類似してＳｔａｔ１核局在化を伴ってＩＦＮ−γに応答した周囲のＰＬＰ陰性細胞の応答と対照的であった。野生型培養物中の実質的に全てのＰＬＰ陽性乏突起膠細胞（９６±３細胞）がＳｔａｔ１核転位置を伴ってＩＦＮ−γ刺激に応答した。対照的に、Ｓｔａｔ１核転位置は、ＩＦＮ−γ刺激後の偶発的（ｏｃｃａｓｉｏｎａｌ）ＰＬＰ陽性乏突起膠細胞（６±２細胞）においてのみ検出された（ｐ＜０．０５）。

本発明者らは、次に、ＩＦＮ−γ感受性の指標としての主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ（ＭＨＣクラスＩ）分子発現の誘導を使用して、ｉｎｖｉｖｏでのＩＦＮ−γに対するＰＬＰ／ＳＯＣＳ１乏突起膠細胞の反応性を特徴づけた。ＳＯＣＳ１がＭＨＣクラスＩ分子のＩＦＮ−γ媒介性誘導を阻害する能力を、二重トランスジェニック系で試験した。ＣＮＳ中で低レベルのＩＦＮ−γを発現するＭＢＰ／ＩＦＮ−γ（１７２系統）単一トランスジェニックマウス（Ｇａｏｅｔａｌ．，２０００）をＰＬＰ／ＳＯＣＳ１マウスと交配し、単一および二重トランスジェニック子孫を、ＭＨＣクラスＩ分子発現の相違について試験した（図３４）。ＭＨＣクラスＩ分子発現は、コントロール野生型マウスおよびＰＬＰ／ＳＯＳＣ１マウスのいずれでも検出できなかった（図３４Ａ〜Ｄ）。以前の報告と一致して、ＭＢＰ／ＩＦＮ−γマウスは、ＭＨＣクラスＩ分子の発現が上方制御され、髄鞘に沿って散在性タンパク質が局在した（図３４Ｅ、Ｆ）（Ｃｏｒｂｉｎｅｔａｌ．，１９９６）。しかし、二重トランスジェニックマウス（ＭＢＰ／ＩＦＮ−γ×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１）は、差分パターンのＭＨＣクラスＩ分子発現を示した（図３４Ｇ〜Ｊ）。図３４に示すように、Ｆｌａｇタグ化ＳＯＣＳ１に陽性を示す乏突起膠細胞およびミエリンは、検出可能なレベルのＭＨＣクラスＩ分子を発現しなかったのに対して、導入遺伝子発現に陰性を示し、且つＳＯＣＳ１陽性細胞に極めて近接した細胞は、強い免疫反応性を示した（図３４Ｇ〜ｊ）。ＭＨＣクラスＩ分子発現の類似の差分上方制御は、ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１マウスの脳内のＩＦＮ−γの直接投与後に認められた（データ示さず）。まとめると、これらのデータは、ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１マウス由来の乏突起膠細胞がＩＦＮ−γに対する反応性の減少を示す。

４．ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１マウスは、成長中にＩＦＮ−γによる損傷の影響から防御される
成長中のマウスのＣＮＳにおけるＩＦＮ−γのトランスジェニック発現により、乏突起膠細胞が喪失し、髄鞘低形成が起こる（Ｃｏｒｂｉｎｅｔａｌ．，１９９６；Ｌｉｎ
ｅｔａｌ２００５）。ＳＯＣＳ１発現がＩＦＮ−γによる損傷の影響から成長中の乏突起膠細胞を防御することができるかどうかを決定するために、本発明者らは、ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１マウスを、異なるレベルでＣＮＳ中でＩＦＮ−γを過剰発現する以下の３つのトランスジェニックマウス系統と交配させた：ＭＢＰ／ＩＦＮ−γ（１７２系統）、ＧＦＡＰ／ｔＴＡ×ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ（１８４／１１０系統）、およびＧＦＡＰ／ｔＴＡ×ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ（１８４／６７系統）。以下の３つの交配系を確立した（材料と方法に詳述）：ＭＢＰ／ＩＦＮ−γ×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１（１７２×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１、二重トランスジェニック系）およびＧＦＡＰ／ｔＴＡ×ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１（１８４／１１０×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１および１８４／６７×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１、２つの三重トランスジェニック系）。各交配系の同腹仔（Ｆ１世代）を、その表現型に応じて以下の４つの研究群に分類した：野生型／単一トランスジェニックコントロール、ＳＯＣＳ１のみを発現するマウス、ＩＦＮ−γのみを発現するマウス、ＩＦＮ−γおよびＳＯＣＳ１の両方を発現するマウス。交配系あたり全部で４０匹の動物（各研究群あたり１０匹）を回収し、生後２１日目に臨床的および組織学的に試験した。

誕生から生後２１日目まで同腹仔の表現型比較を行った。評価は、挙動観察および振戦を誘発するための負荷梯子歩行からなった。別の場所で報告された所見（Ｃｏｒｂｉｎｅｔａｌ．，１９９６）と一致して、ＭＢＰ／ＩＦＮ−γ（１７２系統）マウスは、ＣＮＳ中に低レベルのＩＦＮ−γを発現し、挙動の異常性は示されなかった。ＭＢＰ／ＩＦＮ−γ×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１（１７２×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１）交配系のＦ１世代由来のマウスは、表現型に関係なく挙動異常は示されなかった。二重トランスジェニックＧＦＡＰ／ｔＴＡ×ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ（１８４／１１０系統）およびＧＦＡＰ／ｔＴＡ×ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ（１８４／６７系統）マウスは、軽度から中等度の振戦を示し、これは、出生後第２週中に出現し、２１日齢までにピークに達する（Ｌｉｎｅｔａｌ．，２００４；２００５）。ＧＦＡＰ／ｔＴＡ×ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１交配系のＦ１世代由来のマウスは、振戦を示し、その発生は、表現型に依存した（表２）。

３つのトランスジェニック交配系（１７２×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１、１８４／１１０×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１、および１８４／６７×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１）由来の同腹仔を、その表現型に従って以下の４つの群に階層化した：野生型／コントロールマウス、ＳＯＣＳ１のみを発現するマウス、ＩＦＮ−γのみを発現するマウス、ＩＦＮ−γおよびＳＯＣＳ１の両方を発現するマウス。群あたり１０匹のマウスを生後から最初の３週間臨床的に追跡し、振戦の発生を記録した。

野生型マウスおよび単一トランスジェニックコントロールマウス（ＧＦＡＰ／ｔＴＡ［１８４］、ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ［６７および１１０］）、およびＰＬＰ／ＳＯＣＳ１マウスの表現型は臨床的に正常であった。振戦表現型（重症度は多様である）を、ＩＦＮ−γを過剰発現するほとんど全ての二重トランスジェニックＧＦＡＰ／ｔＴＡ×ＴＲＥ／ＩＦＮ−γマウスで同定された（８０％（８／１０）の１８４／１１０マウスおよび１００％（１０／１０）の１８４／６７マウス）。ＩＦＮ−γおよびＳＯＣＳ１の両方を過剰発現する三重トランスジェニックＧＦＡＰ／ｔＴＡ×ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１マウスは、防御されるようであった。なぜなら、１０％（１／１０）の１８４／１１０×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１マウスおよび３０％（３／１０）の１８４／６７×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１マウスしか振戦を発症しなかったからである（表２）。

３つ全てのトランスジェニック交配系の臨床的に試験された同腹仔を、生後２１日目の組織学的異常についてさらに評価した。各交配系由来の研究群あたり３匹の動物を、乏突起膠細胞およびミエリンの異常性について組織学的に試験した。屠殺時（固定潅流前）に各動物から脳組織を単離し、総ＲＮＡを単離した。ＳＯＣＳ１発現がＩＦＮ−γ導入遺伝子の発現に影響を及ぼす可能性を、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）を使用して、３つ全てのトランスジェニック交配系において試験した（図３５Ａ）。ＩＦＮ−γ発現は、１７２×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１トランスジェニック系でのＭＢＰ／ＩＦＮ−γ単一トランスジェニックおよびＭＢＰ／ＩＦＮ−γ×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１二重トランスジェニック同腹仔、ｌ８４／１１０×ＰＬＰ／ＳＯＣＳトランスジェニック系のＧＦＡＰ／ｔＴＡ×ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ二重トランスジェニックおよびＧＦＡＰ／ｔＴＡ×ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１三重トランスジェニック同腹仔、１８４／６７×ＰＬＰ／ＳＯＣ１トランスジェニック系のＧＦＡＰ／ｔＴＡ×ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ二重トランスジェニックおよびＧＦＡＰ／ｔＴＡ×ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１三重トランスジェニック同腹仔で検出された。ＩＦＮ−γ発現の２つの特徴が認められた。第１に、３つの交配系はその発現レベルが異なっていた。ＭＢＰ／ＩＦＮ−γ×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１（１７２×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１）は最も低いＩＦＮ−γレベルを発現し、ＧＦＡＰ／ｔＴＡ×ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１（１８４／６７×ＰＬＰ／ＳＯＣ１）は最も高いＩＦＮ−γレベルを発現した。第２に、ＩＦＮ−γのみまたはＩＦＮ−γおよびＳＯＣＳ１の両方を発現する同一交配系の同腹仔は、その発現レベルが異ならなかった。野生型、ＧＦＡＰ／ｔＴＡ、およびＴＲＥ／ＩＦＮ−γ単一トランスジェニックおよびＰＬＰ／ＳＯＣＳ１同腹仔で検出可能レベルのＩＦＮ−γは見出されなかった。（図３５Ａ）。

全トランスジェニック交配系由来の研究群あたり３匹の動物の大脳を、乏突起膠細胞密度を決定するためのＣＣ１抗体を使用した免疫組織化学分析のために処理した（図３５Ｂおよび図３３）。ＭＢＰ／ＩＦＮ−γマウスは、以前に報告された結果に一致して（Ｇａｏｅｔａｌ．，２０００）、ＧＦＡＰ／ｔＴＡ×ＴＲＥ／ＩＦＮ−γマウスと比較してＣＮＳ中で最も低いレベルのＩＦＮ−γを発現し、ＣＣ１陽性細胞密度に有意な異常は認められなかった。本発明者らは、ＭＢＰ／ＩＦＮ−γ×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１（１７２×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１）交配系のＦ１世代由来のマウスの間で乏突起膠細胞密度の統計的有意差は見出さなかった。三重トランスジェニック系（ＧＦＡＰ／ｔＴＡ×ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１）では、本発明者らは、Ｆ１世代由来のマウスにおける乏突起膠細胞密度が遺伝子型に応じて異なることを見出した（図３５Ｂおよび図３６）。野生型マウスおよび単一トランスジェニックマウス（ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１、ＧＦＡＰ／ｔＴＡ、およびＴＲＥ／ＩＦＮ−γ）は、類似の乏突起膠細胞密度を有していた。本発明者らは、野生型および単一トランスジェニック同腹仔と比較してＩＦＮ−γを過剰発現するＧＦＡＰ／ｔＴＡ×ＴＲＥ／ＩＦＮ−γマウスで厳格な用量依存性の乏突起膠細胞喪失を見出した。１８４／１１０マウスで約２０％の乏突起膠細胞が喪失し（野生型マウスの１４６±６ＣＣ１（＋）細胞／ｍｍ^２からＩＦＮ−γマウスの１１５±８ＣＣ１（＋）細胞／ｍｍ^２まで）、１８４／６７マウスで約４０％が喪失した（野生型マウスの１４４±５ＣＣ１（＋）細胞／ｍｍ^２からＩＦＮ−γ過剰発現マウスの７９±９ＣＣ１（＋）細胞／ｍｍ^２まで）。対照的に、ＩＦＮ−γおよびＳＯＣＳ１の両方を過剰発現するＧＦＡＰ／ｔＴＡ×ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１三重トランスジェニック同腹仔は、ＩＦＮ−γのみを過剰発現するマウスと比較して統計的に有意により少数の乏突起膠細胞を喪失した。１８４／１１０×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１マウスで約８％の乏突起膠細胞を喪失し（ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１マウスの１４１±６ＣＣ１（＋）細胞／ｍｍ^２からＩＦＮ−γおよびＳＯＣＳ１過剰発現マウスの１２９±６ＣＣ１（＋）細胞／ｍｍ^２まで）、１８４／６７×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１マウスで約１５％喪失した（ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１マウスの１４２±５ＣＣ１（＋）細胞／ｍｍ^２からＩＦＮ−γおよびＳＯＣＳ１過剰発現マウスの１１２±７ＣＣ１（＋）細胞／ｍｍ^２まで）（図３５Ｂおよび図３６）。

採取した大脳における髄鞘形成パターンを、電子顕微鏡法を使用してさらに評価し、髄鞘形成レベルを、Ｇ比（軸索直径／線維直径比）および非有髄軸索の比率の計算によって評価した（図３５ＣおよびＤ、および図３７）。本発明者らは、野生型、単一トランスジェニック、およびＭＢＰ／ＩＦＮ−γ×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１（１７２×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１）交配系由来の二重トランスジェニック同腹仔の間のＧ比に統計的有意差は見出さなかった。三重トランスジェニック系（ＧＦＡＰ／ｔＴＡ×ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１）では、表現型に応じてＦ１世代マウスの間でＧ比に有意差が見出された（図３５Ｃおよび図３６）。野生型、ＧＦＡＰ／ｔＴＡ、ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ、ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１単一トランスジェニック同腹仔の間のＧ比は類似していた。ＩＦＮ−γ過剰発現ＧＦＡＰ／ｔＴＡ×ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ同腹仔は、髄鞘低形成（０．８を超えるＧ比と定義する）を示す有意に増加したＧ比を示した：１８４／１１０マウスについては０．８９±０．０２、１８４／６７マウスについては０．９５±０．０４）（図３５Ｃ）。対照的に、ＩＦＮ−γおよびＳＯＣＳ１を過剰発現するその三重トランスジェニック（ＧＦＡＰ／ｔＴＡ×ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１）同腹仔は、有意に低いＧ比を示した：１８４／１１０×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１マウスについては０．７５±０．０３（正常範囲内）、１８４／６７×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１マウスについては０．８２±０．０８（図３５Ｃおよび図３７）。

ミエリン異常を、種々のトランスジェニック遺伝子型における非有髄軸索の比率の決定によってさらに定量した（図３５Ｄ）。遺伝子型と無関係に、ＭＢＰ／ＩＦＮ−γ×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１（１７２×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１）二重トランスジェニック系のＦ１世代の同腹仔間の非有髄軸索（９％未満）の比率に有意差は認められなかった（図３５Ｄ）。しかし、三重トランスジェニックＧＦＡ／ｔＴＡ×ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ×ＰＬＦＶＳＯＣＳ１系では、非有髄軸索の分布は、遺伝子型に応じて異なった（図３５Ｄ）。野生型および単一トランスジェニックコントロールマウスと比較して、ＧＦＡＰ／ｔＴＡ×ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ同腹仔を過剰発現するＩＦＮ−γの非有髄軸索の比率は有意に増加した：１８４／１１０マウスで４１％±６、１８４／６７マウスで５７％±７。対照的に、ＩＦＮ−γおよびＳＯＣＳ１の両方を過剰発現する三重トランスジェニックＧＦＡＰ／ｔＴＡ×ＴＲＥ／ＩＦＮ−γ×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１は、ＩＦＮ−γのみを過剰発現するマウスと比較して、非有髄軸索の比率が有意により低かった：１８４／１１０×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１マウス１３％±３のみ、および１８４／６７×ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１マウスで１７％±４．５（図３５Ｄ）。まとめると、これらのデータは、ＳＯＣＳ１の乏突起膠細胞発現が成長中のＣＮＳにおけるＩＦＮ−γ発現の臨床的および形態学的結果からマウスを防御することを証明する。

ＣＮＳ内のＴ細胞由来サイトカインＩＦＮ−γの存在は、免疫媒介性脱髄障害の病理発生に極めて重要な役割を果たすと考えられている（Ｐａｎｉｔｃｈｅｔａｌ，１９８７；Ｇａｌｂｉｎｓｋｉｅｔａｌ．，１９９９；Ｔｒａｎｅｔａｌ．，２０００；Ｖａｒｔａｎｉａｎｅｔａｌ．，１９９６；Ｈｏｒｗｉｔｚｅｔａｌ．１９９７；Ｓｔｅｉｎｍａｎ，２００１）。それにもかかわらず、サイトカインの影響を受ける細胞標的は未解決のままである。この報告では、本発明者らは、乏突起膠細胞がＩＦＮ−γに応答する能力の有意な低下を示すトランスジェニックマウスの作製を記載している。これらのマウスは、ＣＮＳ内のＩＦＮ−γの異所性発現の障害作用から防御され、このことは、乏突起膠細胞に及ぼすＩＦＮ−γの直接的な悪影響が免疫媒介性疾患の病理発生に寄与する。以下に考察するように、記載の研究は有意な臨床上の意義を有する。

生後発育中のＣＮＳ中にＩＦＮ−γを異所的に発現するトランスジェニック動物は、髄鞘を低形成し、乏突起膠細胞数が減少する（Ｃｏｒｂｉｎｅｔａｌ．，１９９６；ＬｅＦｅｒｌａｅｔａｌ．，２０００；Ｌｉｎｅｔａｌ．，２００５）。さらに、脱髄傷害後のＣＮＳ中のＩＦＮ−γ発現の誘導により、脱髄病変の乏突起膠細胞の再増殖の減少および再髄鞘形成障害を引き起こす（Ｌｉｎｅｔａｌ．，印刷中）。以前に報告した本発明者らのデータにより、ＣＮＳ中のＩＦＮ−γの存在が乏突起膠細胞中のＥＲストレス応答を活性化し、このことが認められた病理学的影響に寄与することが示唆される。（Ｌｉｎｅｔａｌ，２００５；印刷中）。しかし、乏突起膠細胞に及ぼすＩＦＮ−γの障害作用が直接作用の結果であるのかどうか、または恐らく小グリア活性化による二次的効果に相当するのかどうかは不明である。

ＩＦＮ−γはまた、ｉｎｖｉｔｒｏでの乏突起膠細胞およびその子孫に悪影響を及ぼすことが示されている。少なくともこのサイトカインの障害作用の一部が小グリア細胞の活性化を通して仲介されることを示す、無視できない証拠が存在する。ＩＦＮ−γ処置小グリアは細胞傷害因子（一酸化窒素および腫瘍壊死因子αが含まれる）を放出し、細胞傷害因子は乏突起膠細胞を損傷することが知られている（Ｍｅｒｒｉｌｌｅｔａｌ．，１９９１，１９９３，Ｌｏｕｇｈｌｉｎｅｔａｌ．，１９９７）。ｉｎｖｉｔｒｏで精製乏突起膠細胞を使用した研究により、サイトカインが乏突起膠細胞に直接的な悪影響を及ぼし得ることが示唆される（Ｔｏｒｒｅｓｅｔａｌ．，１９９５；Ａｇｒｅｓｔｉｅｔａｌ．，１９９６；Ｂａｅｒｗａｌｄｅｔａｌ．，１９９８；Ａｎｄｒｅｗｓｅｔａｌ．，１９９８；Ｌｉｎｅｔａｌ．，２００５）。ＩＦＮ−γは、アポトーシス死を生じる傾向があり得る乏突起膠細胞前駆細胞の細胞周期からの離脱を阻害することが示されている（Ｃｈｅｗｅｔａｌ．，２００５）。さらに、ＩＦＮ−γは、乏突起膠細胞成長のための非常に強力なアポトーシス誘導因子であることが示されている（Ｂａｅｒｗａｌｄｅｔａｌ．，１９９８，２０００；Ｌｉｎｅｔａｌ．，２００５）。ｉｎｖｉｔｒｏで成熟乏突起膠細胞マーカーの発現点まで分化することが可能な乏突起膠細胞は、サイトカインの存在に対する感受性が低いが、最終的には壊死に至る（Ｂａｅｒｗａｌｄｅｔａｌ．，１９９８）。

ｉｎｖｉｖｏでの乏突起膠細胞に及ぼすＩＦＮ−γの直接的対間接的影響を区別するために、本発明者らは、ＩＦＮ−γに対する乏突起膠細胞特異的応答性が減少したトランスジェニックマウスを作製した。ＩＦＮ−γ受容体サブユニット１のドミナントネガティブ形態（ＩＦＮＧＲ１）またはサイトカインシグナル伝達１の抑制因子（ＳＯＣＳ１）のいずれかをコードするトランスジェニックマウスが以前に記載されている（Ｆｌｏｄｓｔｒｏｍｅｔａｌ．，２００１；Ｇｏｎｚａｌｅｓａｔａｌ．，２００５，Ｈｉｎｄｉｎｇｅｒｅｔａｌ．，２００５）。ＩＦＮＧＲ１のドミナントネガティブ形態の過剰発現により、野生型ＩＦＮＧＲ１の分解およびＩＦＮ−γ細胞結合部位の消失が促進された（Ｄｉｇｈｅｅｔａｌ．，１９９４）。ＳＯＣＳ１は、ＪａｋキナーゼによってＩＦＮ−γ媒介性Ｓｔａｔ１活性化（すなわち、リン酸化）を阻害する細胞内タンパク質である（Ｓｔａｒｒｅｔａｌ．，１９９７；ＳｏｎｇａｎｄＳｈｕａｉ１９９８；Ｓａｋａｍｏｔｏｅｔａｌ．，２０００；Ｙａｓｕｋａｗａｅｔａｌ．，２０００；Ｋｕｂｏｅｔａｌ．，２００３；Ｓｔａｒｋｅｔａｌ．，１９９８；ＬｅｖｙａｎｄＤａｒｎｅｌｌ，２００２）。ＳＯＣＳ１遺伝子のターゲティングされたヌル変異を有するマウス変異体は、ＩＦＮ−γに対して異常な過敏症を示し、正常レベルのサイトカインの存在下で多臓器不全にて死亡する（Ｓｔａｒｒｅｔａｌ．，１９９８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒｅｔａｌ．，１９９９；Ｂｕｌｌｅｎｅｔａｌ．，２００１）。さらに、ＳＯＣＳ１の強制発現により、種々の細胞型でＩＦＮ−γ無反応状態が得られることが示されている（Ｔｕｎｌｅｙｅｔａｌ．，２００１，２００２；Ｃｈｏｎｇｅｔａｌ．，２００１，Ｆｅｄｅｒｉｃｉｅｔａｌ．，２００２；Ｆｌｏｄｓｔｏｍｅｔａｌ．，２００１）。

ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１マウスは表現型異常または組織学的異常を示さず、このことは、ｉｎｖｉｔｒｏでの成長因子のシグナル伝達への関与が示唆されるにもかかわらず、Ｓｔａｔ１活性化が正常な乏突起膠細胞成長に必要ではないことが示された（Ｄｅｌｌ’Ａｌｂａｎｉｅｔａｌ．，１９９８）。本発明者らの所見は、乏突起膠細胞またはミエリン異常を示さないが、ＩＦＮ−γ細胞応答が有意に損なわれたというＳｔａｔ１（−／−）ノックアウトマウスの表現型特性によって支持される（Ｍｅｒａｚｅｔａｌ．，１９９６）。したがって、Ｓｔａｔ１活性化が乏突起膠細胞の損傷および成長に差分的役割を果たすようである。

ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１マウスの機能試験により、ＩＦＮ−γに対する乏突起膠細胞特異的応答性（Ｓｔａｔ１活性化（すなわち、リン酸化）の阻害および核転位置、ならびにＭＨＣクラスＩ分子の上方制御が含まれる）がさらに証明された。ＣＮＳ中のＩＦＮ−γを過剰発現するトランスジェニックマウスと交配した場合、ＰＬＰ／ＳＯＣＳ１マウスは、ＩＦＮ−γの有害な臨床上の影響および組織学的影響から防御された。ＰＬＰ／ＰＯＣＳ１導入遺伝子も有するＩＦＮ−γ過剰発現トランスジェニックマウスは、ＰＬＰ／ＰＯＣＳ１導入遺伝子を持たないＩＦＮ−γ発現マウスと比較して、有意な乏突起膠細胞およびミエリン保存ならびにより低い振戦発症を示した。それにより、本発明者らの研究結果は、ＩＦＮ−γが成長中の乏突起膠細胞に障害作用を及ぼすことを示す。

ＳＯＣＳ１の過剰発現によって乏突起膠細胞が防御され、ＩＦＮ−γシグナル伝達の阻害によって細胞への影響が軽減することが示唆された。他で報告され、且つ本発明者らも認めるように、野生型乏突起膠細胞は、正常な条件下でほぼ検出不可能な量のＳＯＣＳ１を発現し、炎症性条件下でさえも、周囲のグリア細胞および炎症細胞と比較してＳＯＣＳ１発現が非常に低かった（Ｐｏｌｉｚｚｏｔｔｏｅｔａｌ．，２０００；ＷａｎｇａｎｄＣａｍｐｂｅｌｌ２００２；Ｍａｉｅｒｅｔａｌ．，２００２）。このような低構成性発現は、ＩＦＮ−γ／Ｊａｋ／Ｓｔａｔ１シグナル伝達の有効な下方制御のための乏突起膠細胞の能力を制限し、それにより、ＩＦＮ−γ細胞の影響が増大し得る。本発明者らの実験系で認められた乏突起膠細胞におけるＳＯＣＳ１過剰発現の救済効果は、この可能性を支持する。

環境および実験による証拠により、ＩＦＮ−γが免疫媒介性脱髄障害である多発性硬化症で有害な役割を果たすことが示唆される（Ｐｏｐｋｏｅｔａｌ．，１９９７，Ｓｔｅｉｎｍａｎ２００１）。ＩＦＮ−γは脱髄病変中に見出され、脳脊髄液中のそのレベルが疾患の重症度に相関する（Ｖａｒｔａｎｉａｎｅｔａｌ．，１９９６；Ｃａｌａｂｒｅｓｉｅｔａｌ．，１９９８；Ｂｅｃｈｅｒｅｔａｌ．，１９９９；Ｍｏｌｄｏｖａｎｅｔａｌ．，２００３）。ＭＳ患者へのＩＦＮ−γの投与によって疾患が悪化し、ＩＦＮ−γの中和抗体が疾患進行を遅延させることが示されている（Ｐａｎｉｔｅｈｅｔａｌ，１９８７；Ｓｋｕｒｋｏｖｉｃｈｅｔａｌ．，２００１）。おそらく乏突起膠細胞によるＳＯＣＳ１のターゲティングされた発現によるＩＦＮ−γの局所効果の減少は、治療的に有益であり得る。脱髄障害後の乏突起膠細胞の再髄鞘形成は、ＩＦＮ−γの存在に対してより高い感受性を示し（Ｌｉｎｅｔａｌ．，ｉｎｐｒｅｓｓ）、したがって、このような防御は再髄鞘形成の促進に特に有用であろう。

幹細胞療法は、脱髄障害（多発性硬化症および副腎白質ジストロフィなど）の潜在的治療アプローチとして急速に興味が持たれつつある（ｒｅｖｉｅｗｉｎＫｅｉｒｓｔｅａｄ２００５）。損傷ＣＮＳの細胞外環境に存在する有害サイトカインに耐性を示すように操作された幹細胞は、生存および再髄鞘形成の可能性がより高くなると予想される。したがって、乏突起膠細胞の損傷および成長に差分的役割を果たすシグナル伝達経路を同定することが興味深い。いかなる観察可能な乏突起膠細胞またはミエリン異常を誘導することのないＩＦＮ−γ媒介性乏突起膠細胞損傷の阻害を記載した本発明者らの結果は、このようなアプローチを支持する。

まとめると、本発明者らは、トランスジェニックマウスの乏突起膠細胞中のＳＯＣＳ１の共生発現が乏突起膠細胞および髄鞘形成過程に及ぼす悪影響を防御することを証明した。本発明者らの結果は、髄鞘形成乏突起膠細胞に及ぼすＩＦＮ−γお悪影響の少なくとも一部がこれらの細胞に及ぼす直接的悪影響に起因することを強く示す。さらに、本発明者らの研究により、乏突起膠細胞中のＳＯＣＳ１の強制発現が免疫媒介性脱髄障害中の過酷な環境を防御することが示唆される。

Claims

本願明細書に記載された発明。