JP6870852B2 - 遺伝子組換え無脊椎動物アルツハイマー病モデルおよびその利用 - Google Patents
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Description
本発明は、遺伝子組換え無脊椎動物アルツハイマー病モデル、および、それを用いたアルツハイマー病の治療薬のスクリーニング方法に関する。
現在、日本はかつて無いスピードで人口の高齢化が進展しており、それと共にアルツハイマー病を中心とする認知症患者の数も増えつつある。認知症患者の介護は、経済的にも大きな負担となることから、一日も早い有効な治療法の確立が急務である。現在、アルツハイマー型認知症の治療として、コリンエステラーゼ阻害薬やＮＭＤＡ阻害薬などを用いて一時的に認知症の症状を改善する対症療法が行われているものの、その効果は極めて限定的であり、アルツハイマー病の発症および進行を抑制する根本療法の確立が強く望まれている。
アルツハイマー病の根本療法を確立するためには、アルツハイマー病の発症機序の解明が必要である。アルツハイマー病患者に共通してみられる病理学的特徴としては、（１）脳の萎縮、（２）斑状のアミロイド蓄積物（老人斑）の形成、（３）神経細胞内における繊維状の塊（神経原線維変化：ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ｔａｎｇｌｅ（ＮＦＴ））の形成の３つが知られている。老人斑の形成はアミロイドβ（Ａβ）の凝集・蓄積によって引き起こされることが知られており、Ａβの凝集がアルツハイマー病の発症の発端であるとするアミロイド仮説が、特に有力な仮説として提唱されている。Ａβの凝集は、神経細胞膜を構成するＧＭ１ガングリオシド（ＧＭ１）に対してＡβが結合して複合体（ＧＭ１結合型Ａβ：ＧＡβ）が形成されることから開始されるとの知見が得られており（非特許文献１）、ＧＡβが「種（シード）」となってＡβの凝集が促進されるとする仮説を支持する多数の研究結果が得られている（非特許文献２、３）。
アルツハイマー病の発症機序のさらなる解明と、アルツハイマー病の根本療法のための治療薬の開発のためには、モデル動物が非常に有用である。これまでに、数多くのアルツハイマー病モデルマウスが作製され、研究に使用されている。しかし、哺乳動物では内在性のガングリオシドが大量に存在することが阻害要因となり、アルツハイマー病の病態関連したＡβとガングリオシドの相互作用を解析することは困難であった。さらに、大量の治療薬候補化合物を試験するには相当数のマウスが必要となるため、多大な時間的・経済的コストがかかることも問題となる。
一方、昆虫や線虫などの無脊椎動物においては、ガングリオシドの内在性発現はみられない。さらに、無脊椎動物は、哺乳動物と比べてライフサイクルが短く、安価かつ容易に飼育することができ、治療薬候補化合物の大規模スクリーニングには有益である。しかし、ガングリオシドを産生する無脊椎動物の作製に成功した例は、今までに報告されていない。
Yanagisawa, K. et al., Nat. Med., Vol. 1, pp. 1062-1066 (1995)
Hayashi, H. et al., J. Nuerosci., Vol. 24, pp. 4894-4902(2004)
Yanagisawa K., Glycoconj. J., Vol. 32, pp. 87-91(2015)
本発明は、従来技術の諸問題を解消し、ヒト脳内の生理的条件におけるＡβの凝集を再現した無脊椎動物を提供することを目的としてなされたものである。
本発明者らは、鋭意研究の結果、ガングリオシドを産生する遺伝子組換え無脊椎動物の作製に初めて成功した。本発明者らは、このガングリオシドガングリオシドを産生する遺伝子組換え無脊椎動物に、さらにアミロイドβを共発現させることにより、ヒト脳内の生理的条件におけるＡβの凝集を再現できることを見出した。
すなわち、本発明は、一実施形態によれば、ガングリオシド産生に関与する酵素をコードする遺伝子が導入され、ガングリオシドを発現する遺伝子組換え無脊椎動物を提供するものである。
前記ガングリオシド産生に関与する酵素は、β１，４−ガラクトース転移酵素およびα２，３−シアル酸転移酵素であり、前記ガングリオシドがＧＭ３ガングリオシドであることが好ましい。
前記遺伝子組換え無脊椎動物は、シアル酸合成に関与する酵素をコードする遺伝子がさらに導入されたものであることが好ましい。
前記遺伝子組換え無脊椎動物は、アミロイドβをコードする遺伝子がさらに導入され、ガングリオシドとアミロイドβを共発現することが好ましい。
前記アミロイドβは、オランダ型アミロイドβ変異体であることが好ましい。
前記無脊椎動物は、昆虫または線虫であることが好ましい。
前記昆虫は、ショウジョウバエであることが好ましい。
また、本発明は、一実施形態によれば、（１）上記ガングリオシドとアミロイドβを共発現する遺伝子組換え無脊椎動物を準備するステップと、（２）前記遺伝子組換え無脊椎動物に候補化合物を投与するステップと、（３）前記（２）で候補化合物を投与された遺伝子組換え無脊椎動物を解析するステップとを含む、アルツハイマー病の治療薬のスクリーニング方法を提供するものである。
本発明に係る遺伝子組換え無脊椎動物は、内因性のガングリオシドが存在しないため、ヒト脳内と同レベルのガングリオシドおよびＡβを発現させることにより、ヒト脳内の生理的条件におけるＡβの凝集を再現することができる。また、本発明に係る遺伝子組換え無脊椎動物をアルツハイマー病の治療薬のスクリーニングに用いることにより、大量の候補化合物について、迅速かつ安価なハイスループットスクリーニングを行うことが可能となる。
以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は本明細書中に説明した実施形態に限定されるものではない。
本発明は、第一の実施形態によれば、ガングリオシド産生に関与する酵素をコードする遺伝子が導入され、ガングリオシドを発現する遺伝子組換え無脊椎動物である。
本実施形態において用いることができる「無脊椎動物」は、内在性のガングリオシドを実質的に発現していない、すなわち、棘皮動物よりも下位の無脊椎動物であれば、任意のものであってよい。内在性のガングリオシドを「実質的に発現していない」とは、通常行われる検出手段（例えば免疫化学的手法など）によって、内在性のガングリオシドを検出することができないことを意味する。内在性のガングリオシドを実質的に発現していない無脊椎動物としては、例えば、昆虫などの節足動物、線虫などの線形動物、環形動物、軟体動物が挙げられる。本実施形態において用いることができる無脊椎動物は、好ましくは、昆虫または線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）である。好ましい昆虫としては、例えば、ショウジョウバエなどの双翅目、カイコなどの鱗翅目、ミツバチなどの膜翅目、コクヌストモドキなどの甲虫目の昆虫が挙げられる。本実施形態において用いることができる昆虫は、好ましくはショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のハエであり、特に好ましくはキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）である。
「ガングリオシド」とは、セラミドに糖が結合した糖脂質であるスフィンゴ糖脂質の一種であって、糖鎖部分に少なくとも１つのシアル酸を含むものである。ガングリオシドは、糖鎖部分の構造の違いにより、ガングリオ系、ラクト系、グロボ系などに分類され、さらに、糖鎖部分に含まれるシアル酸の数によって分類される。例えば、シアル酸を１つ含むガングリオ系ガングリオシドとしては、ＧＭ１ａ、ＧＭ１ｂ、ＧＭ２、ＧＭ３など；シアル酸を２つ含むガングリオ系ガングリオシドとしては、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＤ２、ＧＤ３など；シアル酸を３つ含むガングリオ系ガングリオシドとしては、ＧＴ１ａ、ＧＴ１ｂ、ＧＴ１ｃ、ＧＴ２、ＧＴ３など；シアル酸を４つ含むガングリオ系ガングリオシドとしては、ＧＱ１ｂ、ＧＱ１ｃなど；シアル酸を５つ含むガングリオ系ガングリオシドとしては、ＧＰ１ｃなどが挙げられる。本実施形態におけるガングリオシドは、好ましくはＧＭ１ａ、ＧＭ１ｂ、ＧＭ２、ＧＭ３などのモノシアロガングリオ系ガングリオシドであり、特に好ましくはＧＭ３である。
「ガングリオシド産生に関与する酵素」には、糖転移酵素と糖質加水分解酵素とが含まれる。糖転移酵素としては、例えば、ガラクトース転移酵素、シアル酸転移酵素、フコース転移酵素、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素などが挙げられる。糖質加水分解酵素としては、例えば、ガラクトシダーゼ、グルコシダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼなどが挙げられる。ガングリオシドの生合成経路はすでに解明されており、発現させたいガングリオシドに応じて、適切な酵素を選択することができる。例えば、ＧＭ３であれば、β１，４−ガラクトース転移酵素およびα２，３−シアル酸転移酵素を発現させることにより産生させることができる。例えば、ＧＭ２であれば、β１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素を発現させることにより産生させることができる。例えば、ＧＭ１ａであれば、β１，３−ガラクトース転移酵素２を発現させることにより産生させることができる。
本実施形態におけるガングリオシド産生に関与する酵素は、任意の動物種由来のものであってよいが、好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、非ヒト霊長類、ヒトなどの哺乳動物由来のものであり、特に好ましくはヒト由来である。ガングリオシド産生に関与する酵素をコードする遺伝子はすでにクローニングされており、その塩基配列情報は、所定のデータベースから入手することができる。例えば、ヒトβ１，４−ガラクトース転移酵素については、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＢＣ０６９６２０．１、ヒトα２，３−シアル酸転移酵素については、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３８９６およびＮＭ＿００１０４２４３７、ヒトβ１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素については、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１５３４４６、ＮＭ＿００１１５９３８７．１およびＮＭ＿００１１５９３８８．１、ヒトβ１，３−ガラクトース転移酵素２については、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ２８８３９０が利用可能である。
本実施形態におけるガングリオシド産生に関与する酵素には、酵素活性が維持されていることを限度として、上述のようなデータベースに登録されているアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が包含され得る。アミノ酸配列の同一性は、配列解析ソフトウェアを用いて、または、当分野で慣用のプログラム（ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなど）を用いて算出することができる。また、本実施形態におけるガングリオシド産生に関与する酵素には、酵素活性が維持されていることを限度として、データベースに登録されているアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質が包含され得る。ここで、「１〜数個」とは、例えば「１〜３０個」、好ましくは「１〜１０個」、特に好ましくは「１〜５個」である。
上記ガングリオシド産生に関与する酵素をコードする遺伝子の無脊椎動物への導入は、当分野において周知の方法により行うことができる。例えば、プラスミド、ウイルス、トランスポゾンなどの公知のベクターに、プロモーターなどの転写調節配列とともに導入したい遺伝子配列を組み込み、対象の無脊椎動物へと導入することができる。特に、昆虫については、トランスポゾンを用いた遺伝子組換え技術が十分に確立されており、例えばショウジョウバエであれば、当分野において十分に確立されたＧＡＬ４−ＵＡＳ発現系を用いて作製することができる。具体的には、転写因子であるＧＡＬ４を発現するショウジョウバエ系統と、ＧＡＬ４の標的配列であるＵＡＳの下流にガングリオシド産生に関与する酵素をコードする遺伝子を組み込んだベクターを導入したショウジョウバエ系統とを交配させることにより、ガングリオシドを発現する遺伝子組換えショウジョウバエを作製することができる。
ＵＡＳの下流にガングリオシド産生に関与する酵素をコードする遺伝子を組み込んだベクターを導入したショウジョウバエ系統は、従来公知の方法により、例えばｐＵＡＳＴなどの形質転換ベクターに目的の酵素をコードする遺伝子を組み込んだものを、ショウジョウバエの胚に導入して作製することができる。ＧＡＬ４を発現するショウジョウバエ系統は、すでに存在する系統を入手して用いてもよいし、従来公知の方法により、プロモーター／エンハンサーの下流にＧＡＬ４遺伝子を組み込んだベクターを導入して作製してもよい。本実施形態においては、好ましくは、神経細胞特異的プロモーター／エンハンサーを用いることができ、特に限定されないが、ｅｌａｖ、Ａｐｐｌ、Ｒ５７Ｃ１０などを用いることができ、好ましくはｅｌａｖを用いることができる。また、ＧＡＬ４を神経細胞特異的に発現するショウジョウバエ系統として、すでに存在する系統を使用する場合には、例えば、ＧＡＬ４を神経細胞特異的に発現する系統であるｅｌａｖＣ１５５−ｇａｌ４系統（Ｌｉｎ，Ｄ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｎ，１３：５０７−５２３（１９９４））や、ＧＡＬ４を脳キノコ体の神経細胞特異的に発現する系統であるｍｂ２４７−ｇａｌ４系統（Ｓｃｈｕｌｚ，ＲＡ． ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１２：１８２７−１８３１（１９９６））などを用いることができる。
上記のショウジョウバエ系統は、例えば、京都工芸繊維大学ショウジョウバエ遺伝資源センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｇｒｃ．ｋｉｔ．ａｃ．ｊｐ／）や、ブルーミントンショウジョウバエストックセンター（ｈｔｔｐ：／／ｆｌｙｓｔｏｃｋｓ．ｂｉｏ．ｉｎｄｉａｎａ．ｅｄｕ／）などの国内外の公共ストックセンターから入手することができる。
本実施形態の遺伝子組換え無脊椎動物がガングリオシドを十分に産生することができるためには、ガングリオシドの構成成分であるシアル酸を供給するシアル酸ドナー基質が十分に供給されていることが好ましい。シアル酸ドナー基質は、餌に添加することにより供給されてもよいし、遺伝子組換え無脊椎動物にシアル酸ドナー基質の合成に関与する酵素をコードする遺伝子をさらに導入することにより、シアル酸ドナー基質の生合成を補充してもよい。すなわち、本実施形態の遺伝子組換え無脊椎動物は、ガングリオシド産生に関与する酵素をコードする遺伝子に加え、シアル酸ドナー基質の合成に関与する酵素をコードする遺伝子がさらに導入されていてもよい。シアル酸ドナー基質の合成に関与する酵素をコードする遺伝子としては、例えば、ヒトＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＧ＿００８２４６．１）などが挙げられる。
本実施形態の遺伝子組換え無脊椎動物は、アミロイドβをコードする遺伝子がさらに導入され、ガングリオシドとアミロイドβを共発現していることが好ましい。アミロイドβ（以降、本明細書では「Ａβ」と記載する）とは、アミロイド前駆体タンパク質断片（ＡＰＰ）がβセクレターゼおよびγセクレターゼによって切断されて生成されるペプチドであり、ＡＰＰにおける切断点の相違により、アミノ酸数の異なるＡβ４０やＡβ４２などが含まれる。
「ＡＰＰ」には、ＮＣＢＩのＲｅｆＳｅｑデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＲｅｆＳｅｑ／）において、ＲｅｆＳｅｑアクセッション番号ＮＰ＿００１１２９６０１．１、ＮＰ＿００１１２９６０２．１、ＮＰ＿９５８８１７．１、ＮＰ＿００１１９１２３１．１、ＮＰ＿９５８８１６．１、ＮＰ＿００１１９１２３０．１、ＮＰ＿０００４７５．１、ＮＰ＿００１１２９４８８．１、ＮＰ＿００１１２９６０３．１として登録されているアミノ酸配列からなるヒトＡＰＰアイソフォームの他、家族性アルツハイマー病において見出される公知の変異を含むアイソフォームが包含される。
また、「ＡＰＰ」には、βセクレターゼおよびγセクレターゼによって切断されてＡβを生成するものであることを限度として、上記アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が包含され得る。アミノ酸配列の同一性は、配列解析ソフトウェアを用いて、または、当分野で慣用のプログラム（ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなど）を用いて算出することができる。
また、「ＡＰＰ」には、βセクレターゼおよびγセクレターゼによって切断されてＡβを生成するものであることを限度として、上記アミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質が包含され得る。ここで、「１〜数個」とは、例えば「１〜３０個」、好ましくは「１〜１０個」、特に好ましくは「１〜５個」である。
すなわち、本実施形態におけるＡβは、例えば、以下に限定されないが、野生型、オランダ型変異体（Ｅ２２Ｑ）、北極型変異体（Ｅ２２Ｇ）、イタリア型変異体（Ｅ２２Ｋ）、フランドル型変異体（Ａ２１Ｇ）、アイオワ型変異体（Ｄ２３Ｎ）のＡβ４０またはＡβ４２などであってよい。本実施形態におけるＡβは、好ましくはオランダ型変異体のＡβ４０またはＡβ４２である。
本実施形態の遺伝子組換え無脊椎動物は、ガングリオシドが関与する神経機能などの種々の生理機能を解析するためのモデル動物として使用することができる。また、本実施形態の遺伝子組換え無脊椎動物は、ヒト脳内と同程度の低レベルのＡβを共発現させることにより、ヒト脳内の生理的条件におけるＡβの凝集を再現することができるため、アルツハイマー病のモデル動物として有用である。
本発明は、第二の実施形態によれば、（１）上記ガングリオシドとアミロイドβを共発現する遺伝子組換え無脊椎動物を準備するステップと、（２）前記遺伝子組換え無脊椎動物に候補化合物を投与するステップと、（３）前記（２）で候補化合物を投与された遺伝子組換え無脊椎動物を解析するステップとを含む、アルツハイマー病の治療薬のスクリーニング方法である。本実施形態のスクリーニング方法は、Ａβとガングリオシドの相互作用を阻害できる化合物を、アルツハイマー病の根本的な治療または予防のために有用なＡβ凝集阻害剤として取得できるものである。
本実施形態における「無脊椎動物」、「ガングリオシド」および「アミロイドβ（Ａβ）」は、第一の実施形態において定義したものと同様である。
本実施形態のスクリーニング方法は、ガングリオシドとＡβを共発現する遺伝子組換え無脊椎動物を使用する。本実施形態におけるガングリオシドとＡβを共発現する遺伝子組換え無脊椎動物は、上で記載したように作製することができる。
次いで、ガングリオシドとＡβを共発現する遺伝子組換え無脊椎動物に、候補化合物を投与する。候補化合物には、合成化合物、ペプチド性化合物、核酸、抗体などが挙げられ、これらの候補化合物は新規なものであってもよいし、公知のものであってもよい。候補化合物を遺伝子組換え無脊椎動物に投与するには、種々の濃度の候補化合物を、餌に添加して摂取させればよい。餌に添加される候補化合物の濃度は、化合物の種類により異なるが、例えば、０．１〜１００ｍＭの範囲で適宜選択することができる。候補化合物の投与は、例えば７〜３０日間にわたって行うことができる。
次いで、候補化合物を投与された遺伝子組換え無脊椎動物を解析することにより、候補化合物のＡβ凝集阻害効果を評価する。凝集Ａβの蓄積は、公知の手順により、例えば抗Ａβ抗体を用いて生化学的または病理学的に脳組織を解析することにより、検出および定量することができる。また、本実施形態における遺伝子組換え無脊椎動物は、凝集Ａβの蓄積と相関して運動機能や学習記憶能力が低下するため、運動機能や学習記憶能力を測定することによって、脳組織中の凝集Ａβの蓄積の度合いを評価してもよい。運動機能や学習記憶能力の測定方法はすでに十分に確立されており、従来公知の方法を適宜選択することができる。例えば、無脊椎動物としてショウジョウバエを用いる場合であれば、運動機能の測定は、当分野において十分に確立された方法であるクライミングアッセイにより、負の重力走性（負の走地性）を評価することによって行うことができ、学習記憶能力の測定は、匂いと電気ショックを組み合わせた匂い嫌悪学習試験により行うことができる。
候補化合物を投与された遺伝子組換え無脊椎動物において凝集Ａβの蓄積が減少したかどうかを判定するためには、候補化合物を投与しなかった遺伝子組換え無脊椎動物の解析を並行して実施して比較してもよいし、候補化合物を投与しなかった遺伝子組換え無脊椎動物について過去に実施した解析結果と比較してもよい。
本実施形態のスクリーニング方法において、候補化合物の投与により、候補化合物を投与しなかった遺伝子組換え無脊椎動物と比較して凝集Ａβの蓄積量が有意に減少した場合には、当該候補化合物は、アルツハイマー病の根本的な治療または予防のために有用なＡβ凝集阻害剤として有望であると評価することができる。一方、候補化合物の投与により、候補化合物を投与しなかった遺伝子組換え無脊椎動物と比較して凝集Ａβの蓄積量に変化が見られないまたは増加した場合には、当該候補化合物は、アルツハイマー病の根本的な治療または予防のために有用なＡβ凝集阻害剤として有望ではないと評価することができる。
本実施形態の方法の概略を図７に示す。無脊椎動物には内因性のガングリオシドが存在しないため、目的の部位（例えば神経組織）のみに特異的にガングリオシドを産生させることができ、その結果、ヒト脳内と同程度の低レベルのＡβ発現における凝集Ａβの蓄積を検出することができる。そのため、本実施形態の方法は、ヒト脳内の生理的条件と同様の条件において候補化合物のＡβ凝集阻害効果を評価することができ、アルツハイマー病の治療薬のスクリーニングに有用である。
以下に実施例を挙げ、本発明についてさらに説明する。なお、これらは本発明を何ら限定するものではない。
＜１．遺伝子組換えショウジョウバエの作製および飼育＞
哺乳類動物においてＧＭ３ガングリオシド合成経路に関与する酵素であるβ１，４−ガラクトース転移酵素（公式略称：Ｂ４ＧＡＬＴ６、以下「ＧＡＬＴ６」と記載する）、α２，３−シアル酸転移酵素（公式略称：ＳＴ３ＧＡＬ５、以下「ＳＡＴ１」と記載する）、およびＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ（公式略称：ＧＮＥ）を発現する遺伝子組換えショウジョウバエを、以下の手順により作製した。本実施例で作製した遺伝子組換えショウジョウバエにおけるＧＭ３ガングリオシドの合成経路を図１に示す。本実施例で作製した遺伝子組換えショウジョウバエでは、導入遺伝子ＧＡＬＴ６（Ｔｇ−ＧＡＬＴ６）によりグルコシルセラミド（ＧｌｃＣｅｒ）からラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ）が合成されるようになり、導入遺伝子ＳＡＴ１（Ｔｇ−ＳＡＴ１）によりＬａｃＣｅｒからＧＭ３ガングリオシドが合成されるようになる。また、導入遺伝子ＧＮＥ（Ｔｇ−ＧＮＥ）により、ＧＭ３ガングリオシド合成のためのシアル酸ドナー基質であるＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃが合成されるようになる。
哺乳類動物においてＧＭ３ガングリオシド合成経路に関与する酵素であるβ１，４−ガラクトース転移酵素（公式略称：Ｂ４ＧＡＬＴ６、以下「ＧＡＬＴ６」と記載する）、α２，３−シアル酸転移酵素（公式略称：ＳＴ３ＧＡＬ５、以下「ＳＡＴ１」と記載する）、およびＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ（公式略称：ＧＮＥ）を発現する遺伝子組換えショウジョウバエを、以下の手順により作製した。本実施例で作製した遺伝子組換えショウジョウバエにおけるＧＭ３ガングリオシドの合成経路を図１に示す。本実施例で作製した遺伝子組換えショウジョウバエでは、導入遺伝子ＧＡＬＴ６（Ｔｇ−ＧＡＬＴ６）によりグルコシルセラミド（ＧｌｃＣｅｒ）からラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ）が合成されるようになり、導入遺伝子ＳＡＴ１（Ｔｇ−ＳＡＴ１）によりＬａｃＣｅｒからＧＭ３ガングリオシドが合成されるようになる。また、導入遺伝子ＧＮＥ（Ｔｇ−ＧＮＥ）により、ＧＭ３ガングリオシド合成のためのシアル酸ドナー基質であるＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃが合成されるようになる。
ヒトＧＡＬＴ６、ヒトＳＡＴ１、およびヒトＧＮＥのコード配列を、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリー（コード番号９５０３、タカラバイオ社製）を鋳型として、以下のプライマーセットを用いたＰＣＲにより増幅することにより取得した。
（ｉ）ＧＡＬＴ６
（ｉｉ）ＳＡＴ１
（ｉｉｉ）ＧＮＥ
ＰＣＲ産物を、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ−ＩＩ ＴＯＰＯベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）にクローニングし、続いてｐＵＡＳＴベクター（Ｂｒａｎｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｉｍｏｎ， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， １９９３）のＥｃｏＲＩサイトにサブクローニングした。ｐＵＡＳＴベクターをｙｗ系統のショウジョウバエ胚に注入し、得られた成体をさらにｗ１１１８系統のショウジョウバエと交配することにより、遺伝子組換えショウジョウバエＵＡＳ−ＧＡＬＴ６、ＵＡＳ−ＳＡＴ１およびＵＡＳ−ＧＮＥを得た。
また、オランダ型変異（Ｅ２２Ｑ）Ａβ４０（以下、「Ｄｕｔ４０」と記載する）を発現する遺伝子組換えショウジョウバエを、以下の手順により作製した。ヒトＡβのコード配列をＨｅＬａ細胞のｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、ラットプロエンケファリンＡの分泌シグナルペプチド配列を融合させた（Ｆｉｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．， ２００４）。さらに、以下のプライマーセットを用いたＰＣＲにより、オランダ型変異（Ｅ２２Ｑ）を導入した。得られたＰＣＲ産物をｐＵＡＳＴベクターのＢｇｌＩＩサイトにサブクローニングし、上記手順と同様にして遺伝子組換えショウジョウバエＵＡＳ−Ｄｕｔ４０を得た。
（ｉｖ）Ｄｕｔ４０（下線は変異導入部位を示す）
上記ＵＡＳ系統とＧＡＬ４系統とを交雑させることにより、上記導入遺伝子を発現するショウジョウバエを作製した。ＧＡＬ４を神経細胞特異的に発現するショウジョウバエ系統として、ｅｌａｖＣ１５５−ｇａｌ４系統（ブルーミントンショウジョウバエストックセンターより入手）を用いた。
上記導入遺伝子を発現するショウジョウバエをさらに交雑することにより、ＧＡＬＴ６およびＳＡＴ１を発現する遺伝子組換えショウジョウバエ；ＧＡＬＴ６、ＳＡＴ１およびＧＮＥを発現する遺伝子組換えショウジョウバエ；ならびにＧＡＬＴ６、ＳＡＴ１およびＤｕｔ４０を発現する遺伝子組換えショウジョウバエを作製した。ＧＡＬＴ６、ＳＡＴ１およびＧＮＥの発現を免疫染色により確認した結果を図２に示す。免疫染色は、抗ＧＡＬＴ６抗体（２０１４８−１−ＡＰ、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社製）、抗ＳＡＴ１抗体（ａｂ１０７５３４、Ａｂｃａｍ社製）、抗ＧＮＥ抗体（２５０７９−１−ＡＰ、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社製）を用い、通常の手順により行った（Ｙａｍａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ．， ２０１１）。この結果から、ＧＡＬＴ６、ＳＡＴ１およびＧＮＥが神経組織特異的に発現していることが確認された。
得られたショウジョウバエを、温度２５℃、１２時間の明暗サイクルの環境下において、一般的なエビオス・コーンミール・ショ糖・寒天培地を用いて飼育した。また、シアル酸ドナー基質であるＮｅｕ５Ａｃを摂食させる場合には、１０ｍＭのＮｅｕ５Ａｃ／１５０ｍＭスクロース溶液をろ紙にしみ込ませ、１日おきに２４時間ずつ、１〜２週間にわたり自由摂食させた。
＜２．遺伝子組換えショウジョウバエにおけるＧＭ３ガングリオシド産生＞
作製した遺伝子組換えショウジョウバエにおいてＧＭ３ガングリオシドが産生されているかどうかを確認するために、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）による解析を行った。解析は、以下のショウジョウバエについて行った：（１）野生型（Ｎｅｕ５Ａｃ摂食（−））（陰性対照）、（２）ＧＡＬＴ６のみを発現する遺伝子組換えショウジョウバエ（Ｎｅｕ５Ａｃ摂食（−））、（３）ＧＡＬＴ６およびＳＡＴ１を発現する遺伝子組換えショウジョウバエ（Ｎｅｕ５Ａｃ摂食（−））、（４）ＧＡＬＴ６およびＳＡＴ１を発現する遺伝子組換えショウジョウバエ（Ｎｅｕ５Ａｃ摂食（＋））、（５）ＳＡＴ１のみを発現する遺伝子組換えショウジョウバエ（Ｎｅｕ５Ａｃ摂食（＋））、（６）ＧＡＬＴ６、ＳＡＴ１およびＧＮＥを発現する遺伝子組換えショウジョウバエ（Ｎｅｕ５Ａｃ摂食（−））。
作製した遺伝子組換えショウジョウバエにおいてＧＭ３ガングリオシドが産生されているかどうかを確認するために、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）による解析を行った。解析は、以下のショウジョウバエについて行った：（１）野生型（Ｎｅｕ５Ａｃ摂食（−））（陰性対照）、（２）ＧＡＬＴ６のみを発現する遺伝子組換えショウジョウバエ（Ｎｅｕ５Ａｃ摂食（−））、（３）ＧＡＬＴ６およびＳＡＴ１を発現する遺伝子組換えショウジョウバエ（Ｎｅｕ５Ａｃ摂食（−））、（４）ＧＡＬＴ６およびＳＡＴ１を発現する遺伝子組換えショウジョウバエ（Ｎｅｕ５Ａｃ摂食（＋））、（５）ＳＡＴ１のみを発現する遺伝子組換えショウジョウバエ（Ｎｅｕ５Ａｃ摂食（＋））、（６）ＧＡＬＴ６、ＳＡＴ１およびＧＮＥを発現する遺伝子組換えショウジョウバエ（Ｎｅｕ５Ａｃ摂食（−））。
各遺伝子組換えショウジョウバエにつき、２００〜１０００匹の成虫の頭部を採集し、ＴＢＳ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），１５０ｍＭのＮａＣｌ）を添加し、ホモジナイズ後、乾燥させた。得られたペレットをクロロホルム：メタノール混合液（ｖ／ｖ＝２：１）に懸濁し、脂質抽出液を回収し、さらに、ペレットをクロロホルム：メタノール：水混合液（ｖ／ｖ／ｖ＝２：１：０．８）に再懸濁し、脂質抽出液を回収した。回収された脂質抽出液を窒素ガス中４２℃で乾燥させ、脂質抽出物を得た。脂質抽出物を０．１ＮのＮａＯＨ／メタノールに溶解させ、４０℃で２時間処理した後、０．１ｍＬの２Ｎ酢酸で中和し、窒素ガス中で蒸発濃縮し、Ｃ１８ ＢｏｎｄＥｌｕｔ ３００ｍｇカートリッジ（アジレント・テクノロジー社製）により脱塩した。その後、脂質抽出物をメタノールに溶解し、ＬＣ−ＭＳ用サンプルとした。ＬＣ−ＭＳには、液体クロマトグラフ質量分析計ＬＣＭＳ−８０５０（島津製作所）を用いた。
結果を図３および表１に示す。ＧＡＬＴ６およびＳＡＴ１を発現する遺伝子組換えショウジョウバエにおいて、シアル酸ドナー基質であるＮｅｕ５Ａｃを摂食させなかった場合にはＧＭ３ガングリオシドの産生が見られなかったが（図３（ａ））、シアル酸ドナー基質であるＮｅｕ５Ａｃを摂食させることにより、ＧＭ３ガングリオシドが産生されることが確認された（図３（ｂ））。また、ＧＡＬＴ６およびＳＡＴ１に加え、ＧＮＥを発現する遺伝子組換えショウジョウバエにおいて、ＧＭ３ガングリオシドが産生されることが確認された（表１）。
表１．遺伝子組換えショウジョウバエにおけるＬａｃＣｅｒおよびＧＭ３産生
＜３．遺伝子組換えショウジョウバエにおけるＧＭ３ガングリオシド依存性Ａβ凝集＞
ＧＭ３ガングリオシドとＤｕｔ４０を共発現する遺伝子組換えショウジョウバエにおいて、ＧＭ３ガングリオシドに依存した凝集Ａβの蓄積が見られるかどうかを確認するために、ＧＡＬＴ６、ＳＡＴ１およびＤｕｔ４０を発現する遺伝子組換えショウジョウバエの脳組織から調製したサンプルについてウェスタンブロッティングを行った。ＧＡＬＴ６、ＳＡＴ１およびＤｕｔ４０を発現する遺伝子組換えショウジョウバエ（Ｎｅｕ５Ａｃ摂食（−））と、ＧＡＬＴ６、ＳＡＴ１およびＤｕｔ４０を発現する遺伝子組換えショウジョウバエ（Ｎｅｕ５Ａｃ摂食（＋））のそれぞれにつき、１００匹以上の成虫の頭部を採集し、ＴＢＳ緩衝液中でホモジナイズした。これを超遠心し（１００，０００ｇ、１時間、４℃）、上清を回収した（ＴＢＳ可溶性分画）。一方、残った沈殿物を１００％ギ酸中で再度ホモジナイズし、遠心により不要成分を除去し（１４，０００ｒｐｍ、２０分間、２５℃）、上清を回収し、乾燥させた（ＴＢＳ不溶性分画）。Ａβは、凝集していない状態ではＴＢＳ可溶性画分に分離され、凝集して不溶化した状態ではＴＢＳ不溶性分画に分離される。
ＧＭ３ガングリオシドとＤｕｔ４０を共発現する遺伝子組換えショウジョウバエにおいて、ＧＭ３ガングリオシドに依存した凝集Ａβの蓄積が見られるかどうかを確認するために、ＧＡＬＴ６、ＳＡＴ１およびＤｕｔ４０を発現する遺伝子組換えショウジョウバエの脳組織から調製したサンプルについてウェスタンブロッティングを行った。ＧＡＬＴ６、ＳＡＴ１およびＤｕｔ４０を発現する遺伝子組換えショウジョウバエ（Ｎｅｕ５Ａｃ摂食（−））と、ＧＡＬＴ６、ＳＡＴ１およびＤｕｔ４０を発現する遺伝子組換えショウジョウバエ（Ｎｅｕ５Ａｃ摂食（＋））のそれぞれにつき、１００匹以上の成虫の頭部を採集し、ＴＢＳ緩衝液中でホモジナイズした。これを超遠心し（１００，０００ｇ、１時間、４℃）、上清を回収した（ＴＢＳ可溶性分画）。一方、残った沈殿物を１００％ギ酸中で再度ホモジナイズし、遠心により不要成分を除去し（１４，０００ｒｐｍ、２０分間、２５℃）、上清を回収し、乾燥させた（ＴＢＳ不溶性分画）。Ａβは、凝集していない状態ではＴＢＳ可溶性画分に分離され、凝集して不溶化した状態ではＴＢＳ不溶性分画に分離される。
各分画をＬａｅｍｍｌｉバッファーにより調製したサンプルと、合成Ａβペプチド（対照）を４−２０％トリス−トリシンゲル（コスモバイオ社製）に供し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて泳動後、ニトロセルロース膜（ＮｉｔｒｏＢｉｎｄ、ＭＳＩ社製）に転写した。その後、ニトロセルロース膜をＰＳＢ中で５分間煮沸し、５％スキムミルクおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ溶液にてブロッキングし、一次抗体として抗Ａβモノクローナル抗体（クローン８２Ｅ１、免疫生物研究所製）（１：１００希釈）、二次抗体としてＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ社製）（１：３０００希釈）を用いてウェスタンブロッティングを行った。バンドの検出は、ＥＣＬウェスタンブロッティング検出システム（ＧＥヘルスケア・ライフサイエンス社製）により行った。検出されたバンドを画像解析ソフト（ＩｍａｇｅＪ、アメリカ国立衛生研究所製）により数値化し、各群のＡβ量を比較定量した。
結果を図４に示す。ＧＡＬＴ６、ＳＡＴ１およびＤｕｔ４０を発現する遺伝子組換えショウジョウバエ（Ｎｅｕ５Ａｃ摂食（−））から調製したサンプル１および２（各３レーン）に比べ、ＧＡＬＴ６、ＳＡＴ１およびＤｕｔ４０を発現する遺伝子組換えショウジョウバエ（Ｎｅｕ５Ａｃ摂食（＋））から調製したサンプル３および４（各３レーン）において、Ｄｕｔ４０の凝集が増加していることが示された。図４の結果を定量化したグラフを図５に示す。この結果から、ＧＭ３ガングリオシドに依存してＤｕｔ４０の凝集が有意に増加していることが示された。
Ｄｕｔ４０の凝集がＮｅｕ５Ａｃの摂食によるものではないことを確認するために、Ｄｕｔ４０を発現する遺伝子組換えショウジョウバエ（Ｎｅｕ５Ａｃ摂食（−）または（＋））について、上記と同様にしてサンプルを調製し、ウェスタンブロッティングを行った。結果を図６に示す。この結果、Ｎｅｕ５Ａｃの摂食はＤｕｔ４０の凝集に影響しないことが確認された。
以上の結果から、ガングリオシドとＡβを共発現する遺伝子組換えショウジョウバエにおいて、ヒト脳におけるガングリオシドに依存した凝集Ａβの蓄積を再現できることが示された。
Claims (8)
- ガングリオシド産生に関与する酵素をコードする遺伝子が導入され、ガングリオシドを発現する遺伝子組換え無脊椎動物。
- 前記ガングリオシド産生に関与する酵素が、β１，４−ガラクトース転移酵素およびα２，３−シアル酸転移酵素であり、前記ガングリオシドがＧＭ３ガングリオシドである、請求項１に記載の遺伝子組換え無脊椎動物。
- シアル酸合成に関与する酵素をコードする遺伝子がさらに導入された、請求項１または２に記載の遺伝子組換え無脊椎動物。
- アミロイドβをコードする遺伝子がさらに導入され、ガングリオシドとアミロイドβを共発現する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子組換え無脊椎動物。
- 前記アミロイドβがオランダ型アミロイドβ変異体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の遺伝子組換え無脊椎動物。
- 前記無脊椎動物が昆虫または線虫である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の遺伝子組換え無脊椎動物。
- 前記昆虫がショウジョウバエである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の遺伝子組換え無脊椎動物。
- （１）請求項４〜７のいずれか１項に記載の遺伝子組換え無脊椎動物を準備するステップと、
（２）前記遺伝子組換え無脊椎動物に候補化合物を投与するステップと、
（３）前記（２）で候補化合物を投与された遺伝子組換え無脊椎動物を解析するステップと
を含む、アルツハイマー病の治療薬のスクリーニング方法。
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