CN102265806B - 抗阿尔茨海默症转基因果蝇模型及其在药物筛选中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及筛选阿尔茨海默病治疗药物的模型的建立及应用，目的是提供于针对阿尔兹海默病症的发病进程的分子通路的研究，和进行药物筛选的转基因果蝇模型。本发明通过将现有的转基因果蝇连续杂交获得稳定可遗传的新型果蝇品系。该新型的疾病模型可以模拟阿尔兹海默病症主要致病基因在体内的产生和代谢过程，重现疾病的发病过程，并通过与病症密切相关的各种指标，包括生存曲线、行动能力、学习记忆指数以及体内实验证明该果蝇模型在各方面明显有别于其他阿尔茨海默病果蝇。

Description

抗阿尔茨海默症转基因果蝇模型及其在药物筛选中的应用

技术领域

本发明属于医药及生物领域，具体地说，本发明涉及一种研究阿尔茨海默病(AD)致病基因APP在体内的剪切作用及其产物β-淀粉样蛋在发病过程中的分子机制以及筛选治疗AD的新药物的新型果蝇模型。

技术背景

阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease，AD)是一种中枢神经系统退行性疾病。近年来已成为仅次于血管病、癌症和脑卒中的第四大杀手。根据世界卫生组织的统计，目前全球阿尔茨海默症患病人数估计在1,800万左右。阿尔茨海默症病人临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征。

AD的组织病理学表现主要为老年斑(senileplaques，SP)、神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)，以及由凋亡引起的区域性神经细胞死亡等。其中淀粉样蛋白斑的主要成分是β-淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)。阿尔茨海默病的发病机制尚未十分清楚，目前主要有3种假说：β淀粉样蛋白级联假说、Tau蛋白假说和血管源性假说。其中，β淀粉样蛋白级联假说占主导地位，并且研究的较为成熟。

β-淀粉样蛋白由淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)经过β分泌酶(β-secretase，BACE)和γ分泌酶(γ-secretase)顺序剪切产生。脑内Aβ来源于其前体物质β淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)。从APP代谢为β淀粉样蛋白肽过程分两步：首先，β-分泌酶在Aβ的N末端裂解APP，产生可溶的分泌性的APP衍生物APPS-β和贯穿膜成分的C末端片段。C末端片段进一步由γ-分泌酶裂解为Aβ。在某些病理条件下，APP主要经β-分泌酶和γ-分泌酶顺序剪切产生过多的Aβ，导致AD病。γ-分泌酶在Aβ产生中起非常重要作用，决定了产生的Aβ42在其中所占的比例。现在认为，此酶至少由presenilin、nicastrin、APH1和Pen2共4种跨膜蛋白组成。Presenilin即早老蛋白，是γ-分泌酶的催化亚基，现已发现编码早老蛋白1的基因上的一百多个突变都能引起家族性老年痴呆，其致病机制很可能是因为突变体改变γ-分泌酶活性，增加Aβ42产生的比例。

在过去的几十年里，人们通过转基因小鼠模型成功的在动物身上模拟了多种神经退行性疾病，这使得人们对这些疾病以及治疗都有了深刻的理解。但是由于大多数应用于研究AD的转基因小鼠模型需要耗费大量的时间和金钱，严重的影响了研究的进展。

从1918年发现利用果蝇模型研究黑色素沉着细胞瘤以来，人类利用果蝇模型已经在肿瘤、神经变性病、睡眠障碍、糖尿病、肥胖症等的研究方面取得重大突破。新的果蝇模型已用来研究遗传性痉挛性截瘫(Hereditary spasticparaplegia，HSP)、脊髓小脑型共济失调(Spinocerebellar ataxia，SCA)、白血病、PDGF/VEGF受体分子(PVR)基因等，而更多人类遗传及变性疾病都可以利用果蝇得到复制。

转基因果蝇模型在研究以AD为代表的变性疾病方面具有许多独到的优势。首先在已知的人类714个遗传性疾病的致病基因中果蝇具有548个同源基因，如Amyloid percursor protein like(APPL)和Presenilin(AD)、huntingtin(Huntington’s disease，HD，亨廷顿氏病)等。除了具有大量的同源基因外，果蝇的神经退行性疾病模型与人类神经退行性疾病还有许多相似的表型，如迟发性(late onest)、进程性(progressive)、神经系统的高毒性。果蝇体内有一种与人类APP同源性的类似物-类淀粉前体蛋白类似物(amyloide precursorprotein like，APPL)，Luo实验证实，敲除了APPL基因的果蝇在行为学表型方面的缺陷可以在转入了APPL基因后有所改善。APPL基因突变的表达可以弥补大鼠行为学测试方面的不足，而同样也可以观察到APP基因突变后突触变性，轴突转运和细胞凋亡的改变。由于果蝇的生命周期短，使本发明人能够在很短的时间内就可以在果蝇模型上对神经退行性病变的全过程进行研究。

由此可见，综合现有的Aβ果蝇模型和果蝇内源PS1蛋白与人的高度相似性等优势，在果蝇体内重建基于APP蛋白的剪切的Aβ的产生过程。这些已经建立的AD果蝇模型，重现了AD病症的主要病理特征，包括寿命的缩短，行动能力的缺陷和学习记忆的缺陷，同时可以检测到由于表达Aβ而造成的神经元毒性。Crowther等人证明MK-801，一种谷氨酸受体的拮抗剂可以延长AD果蝇的寿命。Iijima等人证明阻止Aβ沉积的物质刚果红可以显著的缓解AD果蝇的行为缺陷，及Aβ毒性造成的神经元损伤。因此，本发明人可以在果蝇中研究AD进程中Aβ和APP及相关分泌酶的相互作用，并进行针对此过程中参与的各种蛋白为靶点的药物筛选研究，进而揭示致病相关基因和阿尔茨海默症之间可能的联系。

因此，本领域有必要开发新的适于实用的果蝇模型，从而有利于为AD的研究和治疗提供新的途径。

发明内容

本申请提供一种制备果蝇模型的方法，其特征在于，所述的方法包括：

(1)将UAS-APP品系果蝇与DB品系果蝇杂交，子代果蝇再与DB回交获得2号染色体为APP/Cyo、3号染色体为TM6B/TMII的果蝇；

(2)将UAS-BACE品系果蝇与DB品系果蝇杂交，子代果蝇再与DB回交获得2号染色体为B1/Cyo、3号染色体为BACE/TM6B的果蝇；

(3)将步骤(1)和(2)得到的果蝇品系杂交，然后将所得2号染色体为APP/Cyo、3号染色体为BACE/TM6B的子代果蝇再自交，获得2号染色体为纯合APP/APP、3号染色体为纯合BACE/BACE的可稳定遗传的果蝇；

(4)将UAS-BACE；DPsn品系果蝇与DB品系的果蝇杂交，再与DB品系回交，获得2号染色体为B1/Cyo、3号染色体为DPsn/TM6B的果蝇；

(5)将步骤(1)所获得的果蝇与步骤(4)所获得的果蝇杂交，获得2号染色体为APP/Cyo、3号染色体为DPsn/TM6B的果蝇；

(6)将步骤(5)所获得的果蝇与步骤(3)获得的2号染色体为APP/Cyo、3号染色体为BACE/TM6B的子代果蝇杂交，获得2号染色体为APP/Cyo、3号染色体发生染色体重组DPsn-BACE/DPsn-BACE的表现三性状的果蝇；

(7)将步骤(6)所得的果蝇与DB杂交，获得2号染色体为APP/Cyo、3号染色体为DPsn-BACE/TM6B的果蝇；和

(8)将步骤(7)所得果蝇自交，获得2号染色体为纯合APP/APP、3号染色体为纯合DPsn-BACE/DPsn-BACE的可稳定遗传的果蝇，从而制得果蝇模型。

在一个实施例中，所述方法还包括：

(9)将步骤(8)中获得的果蝇与DB杂交，获得子代果蝇与+/+；TM6B/TMII杂交后回交一次，所得到子代果蝇的2号染色体为+/+，3号染色体为DPsn-BACE/DPsn-BACE；所述的果蝇只表达β-分泌酶和早老素蛋白但不表达底物蛋白APP，由此制得双性状果蝇。

在一个实施例中，所述方法还包括：

(10)将步骤(8)所获得的果蝇与GAL4(cha)杂交，获得可在胆碱能神经元内特异的表达目标蛋白的子代；或者

(11)将步骤(8)所获得的果蝇与GAL4(elav)杂交，获得可在全神经元内特异的表达目标蛋白的子代。

本申请提供一种果蝇体细胞或组织，所述组织共表达APP蛋白和β分泌酶(BACE)且不过表达或过表达果蝇早老素蛋白(Dpsn)。

在一个实施例中，所述果蝇体细胞或组织得自采用包括所述步骤(10)或(11)的方法制得的果蝇。

在一个实施例中，所述组织选自果蝇的神经组织。

在一个实施例中，所述组织选自果蝇的脑组织。

本申请提供本文所述果蝇、其体细胞或组织的用途，用于研究底物APP及其剪切酶β-分泌酶和γ-分泌酶的相互作用、中间剪切产物βAPP-CTF(C99)和最终产物淀β-粉样蛋白过量表达相关疾病的病理过程中的作用、或用于研究APP蛋白剪切过程及β-淀粉样蛋白过量表达相关疾病的相关性、或用于研究APP蛋白剪切过程及β-淀粉样蛋白过量表达在特异的神经元组织内的病理过程。

本申请提供本文所述果蝇、其体细胞或组织的用途，用于筛选β-分泌酶、γ-分泌酶和/或β-淀粉样蛋白在β-淀粉样蛋白过量表达相关疾病进程中相互作用的药物；或用于筛选通过调节β-分泌酶和/或γ-分泌酶的表达及与其相互作用的靶点蛋白来改善β-淀粉样蛋白过量表达相关疾病的药物。

本申请也提供本文所述的果蝇、其体细胞或组织在制备用于治疗β-淀粉样蛋白过量表达相关疾病用的药物中的用途。

在一实施例中，所述的β-淀粉样蛋白过量表达相关疾病是神经退行性疾病。

在一实施例中，所述神经退行性疾病是阿尔茨海默症。

本申请提供一种筛选改善β-淀粉样蛋白过量表达相关疾病的潜在物质的方法，所述的方法包括：

(1)将候选物质与表达β-分泌酶蛋白或γ-分泌酶组分蛋白的体系接触；

(2)检测候选物质对β-分泌酶蛋白或γ-分泌酶组分蛋白的影响；

其中，若所述候选物质可降低β-分泌酶蛋白或γ-分泌酶组分蛋白表达或活性，则表明该候选物质是可用于改善β-淀粉样蛋白过量表达相关疾病的潜在物质。

在一优选例中，上述步骤(2)中，若所述候选物质可降低β-分泌酶蛋白或γ-分泌酶组分蛋白的表达或活性，且不完全抑制β-分泌酶蛋白或γ-分泌酶组分蛋白的表达，则表明该候选物质是可用于改善β-淀粉样蛋白过量表达相关疾病的潜在物质。

在另一优选例中，所述方法还包括：在特异的大脑组织区域表达目标蛋白，所述候选物质可缓解β-淀粉样蛋白过量表达的毒性，则表明该候选物质是可用于改善β-淀粉样蛋白过量表达相关疾病的潜在物质。

在另一优选例中，所述方法包括：在测试组中，将候选物质加入到表达表达β-分泌酶蛋白或γ-分泌酶组分蛋白的体系中；和/或

步骤(2)包括：检测测试组的体系中β-分泌酶蛋白或γ-分泌酶组分蛋白的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达β-分泌酶蛋白或γ-分泌酶组分蛋白的体系；

如果测试组中β-分泌酶蛋白或γ-分泌酶组分蛋白的表达、活性在统计学上低于(优选显著低于，如低10％以上，较佳的低20％以上；更佳的低40％以上)对照组，就表明该候选物质是可用于改善β-淀粉样蛋白过量表达相关疾病的潜在物质。

在另一优选例中，所述的体系选自：细胞体系(或细胞培养物体系)、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

在另一优选例中，所述方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于改善β-淀粉样蛋白过量表达相关疾病有用的物质。

本申请还提供一种筛选改善β-淀粉样蛋白过量表达相关疾病的潜在物质的方法，所述的方法包括：

按本文所述的制备果蝇模型的方法制备果蝇模型，

给予所述果蝇模型候选物质；和

检测候选物质对该果蝇模型中β-分泌酶蛋白或γ-分泌酶组分蛋白的影响，或者检测该果蝇模型的行为学；

其中，若所述候选物质可降低该果蝇模型中β-分泌酶蛋白或γ-分泌酶组分蛋白表达或活性，则表明该候选物质是可用于改善β-淀粉样蛋白过量表达相关疾病的潜在物质；或者，若所述候选物质可改变该果蝇模型的行为学、生存率和/或记忆能力，则表明该候选物质是可用于改善β-淀粉样蛋白过量表达造成的神经退行性病变症状的潜在物质。

在一个实施例中，所述果蝇模型共表达APP蛋白和β分泌酶(BACE)且不过表达或过表达果蝇早老素蛋白(Dpsn)。

本申请也包括采用本申请制备方法获得的果蝇模型、其体细胞或组织，以及采用本申请筛选方法筛选得到的物质及其在制备治疗β-淀粉样蛋白过量表达相关疾病(例如，神经退行性疾病，例如阿尔茨海默症)用的药物中的用途。在本文中，当用于限定制药用途时，“制备”不仅包括将活性成分制成药物，其也可包括药品出厂前的研发、制药等过程。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示建立本发明的果蝇研究模型的具体过程。A、将UAS-APP品系果蝇与DB品系果蝇杂交，子代果蝇再与DB回交获得2号染色体为APP/Cyo，3号染色体为TM6B/TMII的果蝇过程。B、将UAS-BACE品系果蝇与DB品系果蝇杂交，子代果蝇再与DB回交获得2号染色体为B1/Cyo，3号染色体为BACE/TM6B的果蝇过程。C、将A图和B图得到的果蝇品系杂交后，子代果蝇再自交获得2号染色体为纯合APP/APP，3号染色体为纯合BACE/BACE的可稳定遗传的果蝇模型的过程。D、分离UAS-DPsn果蝇，将UAS-BACE/DPsn品系果蝇与DB品系的果蝇杂交，再与DB回交，获得2号染色体为B1/Cyo，3号染色体为DPsn/TM6B的果蝇的过程。E、获得2号染色体为APP/Cyo，3号染色体为DPsn/TM6B的果蝇的过程。F、获得2号染色体为APP/Cyo，3号染色体发生染色体重组DPsn-BACE/TM6B的果蝇品系的过程。G、获得2号染色体为纯合APP/APP，3号染色体为纯合DPsn-BACE/DPsn-BACE的可稳定遗传的果蝇模型的过程。

图2显示人源的APP蛋白，β-分泌酶蛋白在果蝇体内表达，果蝇模型的鉴定。A、APP蛋白上β-分泌酶和γ-分泌酶的剪切位点示意图。B、人源的APP，β-分泌酶蛋白在果蝇体内表达且能够剪切产生βAPP-C端产物。C、AD转基因果蝇体内β-淀粉样蛋白生成的酶联免疫法定量检测结果。D、在果蝇体内可以形成β-淀粉样蛋白沉淀及免疫荧光检测结果。

图3显示AD果蝇行为能力上表现明显的缺陷，而降低β-分泌酶蛋白活性可以一定程度缓解AD果蝇的病症。A、K-M曲线观察各种品系的雄性果蝇的生存指标，其中(a)是胆碱能神经元表达，(b)是全神经元表达；β、根据A图中的结果获得的各果蝇的寿命的柱形图；C、爬行实验检测各种果蝇品系的行动能力；其中，行动能力指标反映的是每个平行实验果蝇的爬行速率；D和E、降低β-分泌酶蛋白活性可以一定程度提高AD果蝇的生存能力。

图4显示安理申和NTI可以显著缓解AD果蝇的行为缺陷。A、安理申可以显著的延长AD果蝇的寿命，缓解AD果蝇行动能力上的缺陷(胆碱能神经元表达模型)，其中，与溶剂组果蝇相比，安理申可以显著的延长Aβ转基因AD果蝇的寿命。n＝6，^*P＜0.05。10μM和30μM安理申都可以显著的延长Aβ转基因果蝇的寿命，但是对于APP/分泌酶转基因AD果蝇的效果不明显。与溶剂组果蝇相比，安理申可以显著的缓解Aβ转基因AD果蝇和APP/分泌酶转基因AD果蝇的行动能力的缺陷。n＝6，^*P＜0.05。10μM和30μM安理申都可以显著的促进Aβ转基因果蝇和和APP/分泌酶转基因AD果蝇活动能力，30μM安理申效果更显著。B、安理申可以显著的延长AD果蝇的寿命，缓解AD果蝇行动能力上的缺陷(全神经元表达模型)，其中，与溶剂组果蝇相比，安理申可以显著的延长Aβ转基因AD果蝇的寿命。n＝6，^*P＜0.05。10μM和30μM安理申都可以显著的延长Aβ转基因果蝇的寿命，但是对于APP/分泌酶转基因AD果蝇的效果不明显。与溶剂组果蝇相比，安理申可以显著的缓解Aβ转基因AD果蝇和APP/分泌酶转基因AD果蝇的行动能力的缺陷。n＝6，^*P＜0.05。10μM和30μM安理申都可以显著的促进Aβ转基因果蝇和和APP/分泌酶转基因AD果蝇活动能力，30μM安理申效果更显著。C、NTI可以显著的延长AD果蝇的寿命，缓解AD果蝇行动能力上的缺陷(胆碱能神经元表达模型)，其中，与溶剂组果蝇相比，NTI可以显著的延长Aβ转基因AD果蝇和APP/分泌酶转基因AD果蝇的寿命。n＝6，^*P＜0.05。10μM和30μM的NTI都可以显著的促进Aβ转基因果蝇和和APP/分泌酶转基因AD果蝇延长寿命。与溶剂组果蝇相比，NTI可以显著的缓解Aβ转基因AD果蝇和APP/分泌酶转基因AD果蝇的行动能力的缺陷。n＝6，^*P＜0.05。10μM和30μM的NTI都可以显著的促进Aβ转基因果蝇和和APP/分泌酶转基因AD果蝇的活动能力，30μM的NTI效果更显著。D、NTI可以显著的延长AD果蝇的寿命，缓解AD果蝇行动能力上的缺陷(全神经元表达模型)，其中，与溶剂组果蝇相比，NTI可以显著的延长Aβ转基因AD果蝇和APP/分泌酶转基因AD果蝇的寿命。n＝6，^*P＜0.05。10μM和30μM的NTI都可以显著的促进Aβ转基因果蝇和和APP/分泌酶转基因AD果蝇延长寿命。与溶剂组果蝇相比，NTI可以显著的缓解Aβ转基因AD果蝇和APP/分泌酶转基因AD果蝇的行动能力的缺陷。n＝6，^*P＜0.05。10μM和30μM的NTI都可以显著的促进Aβ转基因果蝇和和APP/分泌酶转基因AD果蝇的活动能力，30μM的NTI效果更显著。E、安理申和NTI可以一定程度提高AD果蝇的学习记忆能力。

图5显示安理申和NTI不影响外源Aβ的表达，可以一定程度缓解β-淀粉样蛋白沉淀造成的神经元损伤形成的空斑化。A、免疫蛋白印迹检测安理申和NTI处理后果蝇脑内β-淀粉样蛋白沉积；B、免疫荧光观察安理申和NTI处理后Aβ在各品系的果蝇脑内的表达情况；C、苏木精-伊红染色检测安理申和NTI处理后各品系果蝇脑内神经元损伤空斑化情况。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，首次开发出了一种新的以果蝇为研究对象的动物模型，所述的果蝇动物模型表达人源的APP蛋白和β-分泌酶蛋白，在果蝇体内重现β-淀粉样蛋白的产生过程及病理特征，从而为神经退行性疾病的研究提供了新的途径。

果蝇动物模型

为了研究β-淀粉样蛋白在神经退行性疾病的发生或发展中的作用，本发明人经过广泛的研究，确定β-淀粉样蛋白前体蛋白APP及其剪切酶形成的完整体系是一个非常重要的影响因素。在此基础上，本发明人进一步开发了适于研究β-淀粉样蛋白产生过程的动物模型。

为了获得合适的动物模型，在动物种类的选择上本发明人作了大量的研究工作，最终确定以果蝇来制备动物模型。首先，将转基因果蝇用于研究神经退行性疾病，其表现出来的病理症状与在病人身上表现的症状有着惊人的相似；其次，果蝇的遗传背景清晰，基因操作简单，生命周期短，消耗少，这些特点使果蝇成为了研究神经退行性疾病的便利工具；第三，人源Psn蛋白(参见GenBank登录号：NM_000021.3)与果蝇DPsn蛋白(参见GenBank登录号：NM_079460.2)的同源性高，相同性超过50％。人源APP蛋白(参见GenBank登录号：NM_201414.1)与果蝇APPL蛋白(参见GenBank登录号：NM_057278.3)的同源性也很高，相同性达到40％，说明了它们的保守性，可见利用果蝇研究可以准确地反映人类的实际情况，具有良好的借鉴意义。上述特点使得果蝇成为研究β-淀粉样蛋白产生过程的调节，以及筛选新的神经退行性疾病(如AD)治疗药物的有利工具。

在确定了动物模型后，本发明人进一步确定了建立模型的方案，即制备表达APP及剪切酶的、在体的重现APP的剪切过程及生成β-淀粉样蛋白沉淀，(Aβ形成的老年斑是神经退行性疾病的标志)，又是分泌酶蛋白表达异常的模型以观察调节分泌酶蛋白的异常对于Aβ产生的影响，以及观察APP蛋白及其产物βAPP-C端产物(C99和C83)，β-淀粉样蛋白的异常对于神经退行性疾病(如AD疾病)的发生和发展的影响。为了实现该方案，本发明人利用现有技术中已知的果蝇品系，通过GAL4/UAS转基因体系以及平衡致死体系等，经过多代杂交获得稳定的、可遗传的亲本果蝇品系。一种果蝇品系的2号染色体为APP/APP，3号染色体为BACE/BACE；另一种果蝇品系的2号染色体为APP/APP，3号染色体为DPsn-BACE/DPsn-BACE。本发明人最终获得了适于研究神经退行性疾病(如AD)的两种果蝇模型，一种果蝇品系的2号染色体为APP/APP，3号染色体为BACE/BACE；APP经过BACE的剪切产物βAPP-C端产物可以通过果蝇内源的DPsn进一步剪切产生β-淀粉样蛋白；另一种果蝇品系的2号染色体为APP/APP，3号染色体为DPsn-BACE/DPsn-BACE，对比第一种果蝇模型具有更显著的病理表型。本发明人通过行为学实验和生存实验发现，两种果蝇模型在生存及行为能力上，以及学习记忆能力(此症状病理表现与AD病人的症状相符)明显有别于以前的AD果蝇模型。

以往的果蝇模型主要是毒性模型，通过在果蝇眼睛内表达看Aβ的毒性作用。本申请的APP/BACE果蝇模型明显不同于以往的Aβ过表达的模型(仅仅是毒性模型)，本模型可以同时模拟Aβ的产生过程及Aβ的毒性作用，不仅能够真实的反映AD病理特征，而且可以进行有效地行为学指标检测(之前眼睛表达的模型不能做行为检测)，这些指标可以作为药物处理后与AD病人相关的指标进行高效的筛选。

此外，研究表明AD的发病过程中胆碱能受体有非常重要的作用，前者胆碱能表达模型可以用作靶向胆碱能神经元的药物筛选和机制的研究，后者全神经元表达模型可以在果蝇体内重现AD神经退行性病变的过程。而采用本申请的果蝇模型进行的行为学检测是建立在胆碱能神经元和全神经元表达的基础上。如本文所用，各基因标记解释如下：

“Cyo”：位于果蝇的2号染色体上，为果蝇的卷翅标记物，带有该标记的纯合致死，杂合子果蝇表现为卷翅，不能飞行，不带有该标记的果蝇表现为正常直翅。

“TM6B”：位于果蝇的3号染色体上，带有该标记的纯合子果蝇表现为死亡，杂合子果蝇表现为第一胸节两侧形成多且短的毛簇，不带有该标记的果蝇表现为第一胸节两侧为正常的2根长的刚毛。

“TMII”：位于果蝇的3号染色体上，带有该标记的纯合子果蝇表现为死亡，杂合子果蝇表现为平衡棒末端长有两根短毛，不带有该标记的果蝇表现为第一胸节两侧为平衡棒末端无毛。

“B1”：位于果蝇的2号染色体上，带有该标记的纯合子果蝇表现为死亡，杂合子果蝇表现为胸节短毛，不带有该标记的果蝇表现为胸节刚毛正常。

“Elavc155”：为全神经元表达驱动GAL4，具有红眼筛选标记。

“UAS-APP”：在UAS下为APP表达基因，具有红眼筛选标记。

“UAS-BACE”：在UAS下为BACE表达基因，具有红眼筛选标记。

“x”：表示果蝇的一条性染色体，即X染色体。

“y”：表示果蝇的一条性染色体，即Y染色体。

“+”：其连接于基因标记的后面，表示该基因标记存在于果蝇染色体上；或者其单独存在，表示野生型的染色体。

“-”：其连接于基因标记的后面，表示该基因标记不存在于果蝇染色体上。

本发明还提供了所述的果蝇模型或其体细胞或组织(如脑组织)的用途，用于研究β-淀粉样蛋白过量表达相关疾病中β-淀粉样蛋白产生过程的相互作用；或用于筛选通过调节(优选降低)分泌酶的表达来改善β-淀粉样蛋白过量表达相关疾病的药物。

对本发明的果蝇模型进行研究发现，对于分泌酶的调节可以显著改变转基因生成Aβ产生的AD的病理进程。因此，可利用该果蝇模型筛选治疗AD疾病的新型靶点药物。

因此，本发明人通过降低或拮抗分泌酶蛋白在AD转基因果蝇中的活性或者表达，显著的缓解了AD的病症，证明APP的剪切过程在AD进程中的重要作用以及正常的生理功能中有着至关重要的作用，从而证明它作为筛选药物新靶点的必要性。

可如本文所述的方法制备果蝇模型，并可采用本领域常规的技术手段来检测所制备的果蝇是否具有所需的基因型。例如，可如本申请“实验材料和方法”部分所述的方法对所制得的果蝇的基因型进行鉴定。也可采用本申请“实验材料和方法”部分所述的方法来测定本文所述筛选方法中各种酶的表达情况。

药物筛选

在得知了所述的APP的剪切过程及对于分泌酶蛋白的调节在β-淀粉样蛋白过量表达相关疾病中的作用后，可以采用本领域熟知的多种方法来筛选调节APP剪切过程的物质，所述物质可用于改善β-淀粉样蛋白过量表达相关疾病。

在本发明的一种优选方式中，提供一种筛选改善β-淀粉样蛋白过量表达相关疾病的潜在物质的方法，所述的方法包括：将候选物质与表达分泌酶蛋白及产物蛋白的体系接触，检测候选物质对分泌酶蛋白及产物蛋白的影响；若所述候选物质可降低分泌酶的活性蛋白的表达或活性，缓解产物的毒性，则表明该候选物质是可用于改善β-淀粉样蛋白过量表达相关疾病的潜在物质。更优选地，若所述候选物质可降低分泌酶蛋白的表达或活性，且不完全抑制其表达，则表明该候选物质是可用于改善β-淀粉样蛋白过量表达相关疾病的潜在物质优选的，在观察时，可同时设置不加入候选物质但表达分泌酶蛋白的体系，从而可更清晰地分析蛋白表达状况。

在本发明中，所述的体系包括(但不限于)：溶液体系、亚细胞体系、细胞体系、组织体系、器官体系、或动物体系。所述的体系中可含有APP蛋白和分泌酶蛋白，用于在其中加入候选物质，观察候选物质对分泌酶蛋白的影响；或者，所述的体系中可同时含有分泌酶蛋白以及产物Aβ蛋白，用于在其中加入候选物质，同时观察候选物质对于分泌酶蛋白以及Aβ蛋白的影响。

为了进一步选择和确定对于改善β-淀粉样蛋白过量表达相关疾病真正有用的物质，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验。

在另一种方法中，可如前文所述使用采用本申请所述的方法制备得到的果蝇模型、通过检测果蝇模型的行为学、生存率和/或记忆能力的变化或改变来筛选可用于改善β-淀粉样蛋白过量表达造成的神经退行性病变症状的潜在物质。通常，对于果蝇模型的行为学的变化或改变，如果较溶剂对照组AD果蝇的爬行能力显著性提高5％以上(效果佳)、10％以上(效果较佳)、20％以上(效果极佳)，则认为该候选物质为可用于改善β-淀粉样蛋白过量表达造成的神经退行性病变症状的潜在物质；对于生存率，如果较溶剂对照组AD果蝇的生存率显著性提高5％以上(效果佳)、10％以上(效果较佳)、20％以上(效果极佳)，则认为该候选物质为可用于改善β-淀粉样蛋白过量表达造成的神经退行性病变症状的潜在物质；对于学习能力，如果较溶剂对照组AD果蝇的学习能力显著性改善5％以上(效果佳)、10％以上(效果较佳)、20％以上(效果极佳)，则认为该候选物质为可用于改善β-淀粉样蛋白过量表达造成的神经退行性病变症状的潜在物质。

可对上述单一指标进行检测，也可检测行为学、生存率和学习能力中的任意两种或所有三种。

这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于改善β-淀粉样蛋白过量表达相关疾病确实有用的物质。

因此，本发明还包括通过所述的筛选方法获得的物质，所述的物质可用于改善β-淀粉样蛋白过量表达相关疾病。

本发明的主要优点在于：

(1)提供了一种用于研究神经退行性疾病(如AD疾病)中Aβ和产生过程中的关键酶蛋白相互作用及以两者作为筛选药物的靶点的果蝇动物模型。将神经退行性疾病疾病中的主要标志即Aβ形成的老年斑及其产生过程作为研究对象，同时可针对机制的研究和未知的神经退行性疾病治疗药物的筛选。

(2)所述的动物模型制备成本低廉，具有极可靠的研究价值。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)或William Sullivan等人的《果蝇实验指南》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

本发明中所使用的果蝇品系UAS-Aβ1是来自英国剑桥大学D.A.Lomas实验室，果蝇品系UAS-APP，UAS-BACE来自于果蝇遗传及分子生物学数据库(Indiana University)。

本发明人在实施例中所使用的一些果蝇带有GAL4-UAS表达系统，其中，UAS-APP，UAS-BACE用于将外源的APP或BACE转入子代果蝇；GAL4(elavc155)果蝇用于将UAS所带基因表达于子代果蝇神经元中的elavc155果蝇系；GAL4(cha)果蝇用于将UAS所带基因表达于子代果蝇胆碱能神经元中的cha果蝇系果蝇品系。实施例中所用DB果蝇(购自中国科学院上海神经所)为平衡子转基因果蝇，其2、3号染色体上插入了带有不同筛选标记(Cyo、B1、TM6B、TMII)的平衡子，用于果蝇的杂交和稳定遗传。

以下将以具体实施例的方式对本发明进行详细的说明。应理解，本发明并不限于这些具体实施方式。

实验材料和实验方法

转基因果蝇品系

·实验所用的Aβ转基因果蝇模型包括：表达野生型Aβ42低表达的转基因果蝇(UAS-Aβ1)，Aβ₄₂高表达的转基因果蝇(UAS-Aβ2)和表达arctic突变体Aβ₄₂的转基因果蝇(UAS-Aβarc)。

·APP/BACE转基因果蝇模型包括：表达APP蛋白的转基因果蝇(UAS-APP)，共表达APP和BACE的转基因果蝇(UAS-APP；BACE)，共转APP、BACE和果蝇的突变基因PSn1L235P  的转基因果蝇(UAS-APP；BACE；dPSnL235P)。实验用了两种GAL4品系的果蝇，分别是全神经元表达的elav^c155-GAL4和胆碱能神经元表达的cha-GAL4。交配后子一代F1经基因型和蛋白表达鉴定后用于实验。文中所使用的果蝇品系UAS-Aβarc是来自英国剑桥大学Dr.D.A.Lomas实验室，果蝇品系UAS-Aβ2由剑桥大学医学研究所Dr.Damian Crowther提供。所有文中用到的转基因果蝇列表参见图表1。

表1

	文中简称	表达蛋白	拷贝数	表达位置
					cha-GAL4 UAS-Aβ42.2	cAβ1-1	Aβ1-42野生型	1	胆碱能神经元
cha-GAL4UAS-Aβ42.3	cAβ1-2	Aβ1-42野生型	1	胆碱能神经元
					cha-GAL4UAS-Aβ42.2；UAS-Aβ42.3	cAβ2	Aβ1-42野生型	2	胆碱能神经元
elavc155-GAL4UAS-Aβ42.2	Aβ1-1	Aβ1-42野生型	1	全神经元
					elavc155-GAL4UAS-Aβ42.3	Aβ1-2	Aβ1-42野生型	1	全神经元
elavc155-GAL4UAS-Aβ42.2；UAS-Ab42.3	Aβ2	Aβ1-42野生型	2	全神经元
					cha-GAL4UAS-Aβarc	cAβarc	arcAβ1-42突变体	1	胆碱能神经元
elavc155-GAL4U4S-Aβarc	Aβarc	arcAβ1-42突变体	1	全神经元
					cha-GAL4/+	CTL1	-	0	-
elavc155-GAL4/+	CTL2	-	0	-

果蝇分组及药物干预

·取孵育成成虫第1天雄性果蝇，随机分组：Aβ1转基因果蝇组、Aβ1转基因果蝇加药组、Aβ2转基因果蝇组、Aβ2转基因果蝇加药组、APP/BACE转基因果蝇组、APP/BACE转基因果蝇加药组、正常对照组、正常果蝇加药组。安理申Aricept(英国Tocris Cookson Ltd公司)和NTI(Sigma公司)分别溶解稀释到10μM和30μM工作浓度，药物干预组的果蝇连续定量喂食，非药物干预组果蝇用溶剂连续定量喂养。

·加药方法：用药剂配制0.34mg/ml的酵母泥铺于标准培养基上，培养基每隔两天换一次。用药剂配制0.55mg/ml的速溶米粉培养基，培养基每隔七天换一次。

主要试剂

·Aβ鼠源单抗6E10购自Covance公司，Cat.#SIG-39320；

·APP-CTF兔源多抗购自Sigma公司，Cat.#A8717；

·Actin兔源多抗购自Sigma公司，Cat.#A2066；

·IRDye800CW偶联山羊抗小鼠IgG二抗购自Rockland公司，Cat.#610-131-121；

·IRDye800CW偶联山羊抗兔IgG二抗购自Rockland公司，Cat.#611-131-122；

·FITC偶联的山羊抗小鼠IgG二抗购自Jackson ImmunoResearch公司，Cat.#115-095-146；

·2×PCR mix购自天根生化科技有限公司

·酶联免疫吸附实验试剂盒：检测人源Aβ40和Aβ42用酶联免疫吸附实验试剂盒购自Biosource公司；

·Naltrindole购自Sigma公司；

·Aricept购自Tocris公司

·γ-Secretase抑制剂L-685，458购自Calbiochem公司；

·Secretase荧光底物购自Calbiochem公司；

·质粒抽提试剂盒购自Qiagen公司；

仪器和设备

·PCR扩增仪购自Bio-Rad公司；

·水平核酸电泳槽购自Bio-Rad公司；

·台式离心机购自Ependoff公司；

·垂直电泳系统购自Bio-Rad公司；

·凝胶成像分析系统购自Bio-Rad公司；

·低温台式冷冻离心机购自Ependoff公司；

·Odyssey远红外分析仪；

·DNA浓度测定仪购自Thermo Scientific公司

·人工气候箱购江南宁波仪器厂；

·S88双路输出刺激器电刺激器购自GrassTechnologies公司

实验方法

果蝇的培养及交配

扩增亲本果蝇，视实验规模将一定数量的亲本放入新培养基中。大约12天之后，取亲本处女蝇进行交配。处女果蝇为白腹，比成熟果蝇大，略带透明。交配后第5-6天左右，亲本果蝇倒入新管，以获得更多子代果蝇。亲本交配约12天左右，F1子代果蝇出生，从第一天出生开始，将子代果蝇分为20只每管，标明出生日期。所有实验用转基因果蝇均饲养在人工气候箱中，37℃，70％湿度饲养条件，白天12小时：晚上12小时的昼夜周期，果蝇食物每两天更换一次。

转基因果蝇基因型鉴定

按照标准方法提取果蝇基因组DNA。取一种基因型果蝇雌雄各10只，每个EP管放入1只果蝇，加入50μl裂解液(10mM Tris盐酸，pH 8.2，1mM EDTA，25mM氯化钠，and 200ug/ml蛋白酶K)，充分研磨后置于37℃水浴孵育30分钟。然后95℃孵育5分钟，于4℃以8,000rpm离心15min。取上清。溶解DNA后测定浓度。

Aβ转基因果蝇基因型鉴定

PCR鉴定Aβ基因引物为：

Abeta-PCR-F：GAC TGA CCA CTC GAC CAG GTT CTG(SEQ ID NO：1)

Abeta-PCR-R：CTT GTA AGT TGG ATT CTC ATA TCC G(SEQ ID NO：2)

PCR反应体系：

2×PCR mix缓冲液   10μl，

DNA模板            100ng，

10μM Abeta-PCR-F  0.5μl，

10μM Abeta-PCR-R  0.5μl，

加水补足20μl。

PCR反应条件：

94℃初始变性5min，

94℃变性    30s，

60℃复性    60s，

72℃扩增    60s，

循环30次。

APP/BACE转基因果蝇基因型鉴定

PCR鉴定APP基因引物为：

APP-F：CTTGTAGGTTGGATTTTCGTAGC(SEQ ID NO：3)

APP-R：ATGGTGGGCGGTGTTGTC(SEQ ID NO：4)

PCR反应体系：

2×PCR mix缓冲液  10μl，

DNA模板           100ng，

10μM APP-F       0.5μl，

10μM APP-R       0.5μl，

加水补足20μl。

PCR反应条件：

94℃初始变性    5min，

94℃变性        30s，

58℃复性        60s，

72℃扩增        60s，

循环30次。

PCR鉴定PS1基因引物为：

dPSnL235P-F：CAGCTTTGTGGTGCTGGCTTCC(SEQ ID NO：5)

dPSnL235P-R：GGAAGCCAGCACCACAAAGCTG(SEQ ID NO：6)

PCR反应体系：

2×PCR mix缓冲液    10μl，

DNA模板             100ng，

10μM dPSnL235P-F   0.5μl，

10μM dPSnL235P-R   0.5μl，

加水补足20μl。

PCR反应条件：

94℃初始变性    5min，

94℃变性        30s，

58℃复性        60s，

72℃扩增        60s，

循环30次。

免疫印迹

将成年果蝇麻醉，分离头部并收集，将100个左右的特定基因型果蝇头部放置于1.5mL EP管中。加入200μL RIPA裂解液(100mM Tris pH 7.4，1mMEGTA，0.5mM MgSO₄，0.75mM NaCl，1％SDS，0.02mM NaF以及cocktail蛋白酶抑制剂)。超声裂解后在4℃旋转孵育40分钟，24，000g离心1小时，收集上清。BCA法测定蛋白浓度。蛋白样品用4×上样缓冲液处理后95℃煮5分钟，获得热稳定的蛋白裂解液。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，检测Aβ蛋白表达用Aβ鼠源单抗6E10一抗处理，检测APP蛋白用APP-CTF兔源多抗处理，检测BACE蛋白用兔源BACE多抗处理。

对于细胞表达产物提取，弃去细胞培养基，用预冷的PBS洗两遍细胞后，向细胞中加入裂解缓冲液(含有50mM Tris-HCl(pH 7.5)、150mM NaCl、5mMEDTA、10％甘油、0.5mg/ml牛血清蛋白、1％Triton X-100和蛋白酶抑制剂)。收集细胞后于4℃裂解1h。细胞裂解完毕后，以12,000g于4℃离心15min。取上清，BCA蛋白定量，用免疫印迹杂交方法检测提取蛋白产物。

对于免疫印迹，蛋白条带通过IRDye800CW偶联二抗激发远红外荧光，由Odyssey远红外图像系统取得，随后在Scion Image软件上进行定量分析。

酶联免疫吸附实验检测Aβ水平

稳定表达Aβ和APP/BACE的转基因果蝇，适当日龄后取样进行检测。用人源Aβ40和Aβ42酶联免疫吸附实验试剂盒按照厂商提供方法检测转基因果蝇的Aβ水平。

通过液氮速冻分离果蝇大脑，保存于-80℃。实验前向大脑组织加入2％SDS溶液，置于室温解冻，然后超声波破碎组织。待组织完全破碎后以100,000g于4℃离心1h。上清为SDS可溶性蛋白质组分。SDS可溶组分稀释后用人源Aβ40和Aβ42酶联免疫吸附实验试剂盒按照厂商提供方法进行实验。

免疫荧光和免疫组织化学实验

将培养至合适日龄的果蝇麻醉，取下头部放入4％PFA中浸泡预固定15分钟，取出移至PBS中在显微镜下解剖暴露出大脑[30]，4％PFA中固定30分钟。PBS洗3次，每次30分钟。移至70％甲酸中室温处理30分钟暴露抗原。用封闭液PBS-0.5％TritonX100-5％BSA室温洗三次，每次30分钟。用封闭液稀释的一抗(6E10，1∶500)4℃处理样品过夜。移去一抗，封闭液洗三次，每次30分钟，用封闭液稀释的二抗(FITC-M，1∶100)室温处理2小时。移去二抗，封闭液洗三次，每次30分钟，PBS洗15分钟。DAPI室温处理10分钟，PBS洗三次，每次5分钟。将果蝇大脑移至载玻片上，封片，样品用激光共聚焦显微镜(Leica TCS SP2AOBS)观察并获得图像。

图像中的染色反应阳性信号面积用Image-Pro Plus 5.1软件分析和统计。每组果蝇取3-5只果蝇，每只果蝇取5-10张切片统计，其平均值作为该组果蝇的测量值。

苏木精-伊红组织染色实验

果蝇麻醉后取头，4％多聚甲醛(4％PFA)4℃固定过夜，PBS缓冲液洗三次，每次1小时，于30％、50％乙醇中各1小时，4℃保存于70％乙醇中。固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，54℃石蜡包埋，常规切片，切片厚6μm，贴于处理过的干净载玻片上，37℃烤片过夜，之后收集于载片盒中，4℃密封保存。

切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水，于苏木精中室温染色30秒钟，迅速用水冲洗切片，至组织切片变蓝，镜检。用0.1-0.5％盐酸乙醇分色1～2秒钟，之后用流水冲洗切片，直至切片变蓝，此称蓝化。切片经梯度乙醇至95％乙醇中，于0.5％伊红中染色2秒或更长时间，95％乙醇洗去残色，若颜色太深，可在低浓度的乙醇中脱色，镜检。无水乙醇脱水、二甲苯透明，中性树胶封片。普通光镜观察，室温干燥条件下保存染色切片。

每组果蝇取3-5只果蝇，每只果蝇取5-10张切片统计，其平均值作为该组果蝇的测量值。

果蝇的生存率统计

以每管20只果蝇的数量将100只果蝇培养在5个食物管中，并且保持培养温度为25℃，湿度为70％。食物管每2-3天换一次，以保持食物新鲜。每天统计果蝇数量，重复3次。

果蝇爬行实验

同样每管20只果蝇的数量将200只果蝇培养在10个食物管中，并且保持培养温度为25℃，湿度为70％，保持果蝇的数量多于实验需要的果蝇数量。实验前将果蝇以10只/管装于5个干净的空管子中，放置在同一个水平的支架上。实验时，将果蝇轻轻地振至管底，摄像记录，持续30秒。每次实验重复6次。将管子平分成5等份，记录第10秒时，在各等份中果蝇的数量并计算比例。

果蝇的学习记忆检测实验

在果蝇嗅觉相关的学习记忆测试试验中，测试果蝇被放在T迷宫测试装置中，给予两种不同的气味三辛醇四甲基环己醇。训练阶段其中一种气味与电刺激相偶联给予60秒钟的训练，休息45秒钟，再通给另一种气味不加电刺激偶联60秒，休息30秒。学习指数测试阶段，同时通入两种气味，给予测试果蝇120秒钟的时间进行选择，然后将电刺激偶联气体交换在进行一次训练和测试，分别计算两次测试的学习指数，平均值作为一个完整的学习指数。连续测定8个完整的学习指数，取平均值作为改组果蝇的学习指数。学习指数(PI值)的计算方法为：

数据统计分析

实验数据表示为平均值±标准误差。对于行为实验的数据，用ANOVA分析数据，并用Tukey post hoc tests进行事后检验。生存分析采用SPSS软件中的kaplan-meier法，生存率的比较采用log-rank检验，以p＜0.05为差异有显著性。

实施例1：通过杂交转基因果蝇获得稳定的双性状果蝇系

本实例中将原有的转基因果蝇的果蝇分别与DB果蝇杂交，获得带有转入基因和平衡子筛选标记的子代果蝇，筛选特定的筛选标记获得需要保留的品系保存(F2)。将2种品系的F2代果蝇杂交获得第二代子代果蝇，通过同时筛选两种不同的平衡子获得可稳定遗传的不纯和的双转基因果蝇(F3)，经过自交一代获得纯和的工具双转基因果蝇(F4)，可用于交配产生子代果蝇模型。

通过连续杂交获得的工具双转基因果蝇(F3)有两种，分别为(APP/APP；BACE/BACE)和(APP/APP；DPsn/DPsn)，将2种工具转基因果蝇杂交产生的子代即为APP/分泌酶果蝇模型即APP/APP；DPsn-BACE/DPsn-BACE。

制备方法具体如下：

A.分别制备F2代果蝇：

(1)分别将UAS-APP品系果蝇(APP在2号染色体)和UAS-BACE(BACE在3号染色体)品系果蝇与DB品系果蝇(含有4种平衡子)杂交，分离两种F1代果蝇，一种果蝇的APP在2号染色体APP/Cyo，3号染色体为+/TM6B；另一种果蝇的BACE在3号染色体BACE/TM6B，2号染色体为+/Cyo；将上述两种F1代果蝇分别再与DB果蝇进行回交，该F1代果蝇的染色体分别为APP/Cyo；TM6B/TMII和B1/Cyo；BACE/TM6B，均含有3个平衡子。将上述F1代果蝇进行杂交，获得F2代的果蝇，该F2代的果蝇的2号染色体为APP/Cyo，3号染色体为BACE/TM6B；见图1A，B；

(2)分别将UAS-BACE/DPsn品系果蝇，该果蝇的2号BACE在染色体，DPsn在3号染色体，与DB品系果蝇(含有4种平衡子)杂交，分离F1代果蝇，该F1代果蝇的APP在2号染色体APP/Cyo，3号染色体为BACE/TM6B；将上述F1代果蝇再与DB果蝇进行回交，该F 1代果蝇的染色体分别为B1/Cyo；DPsn/TM6B，含有3个平衡子；将该F1与上述(1)中F1相杂交，得到F2代果蝇，该F2代果蝇的APP在2号染色体APP/Cyo，DPsn在3号染色体DPsn/TM6B；见图1D；

B.分别制备F3代果蝇：

(i)将A步骤中(1)获得的F2代果蝇与(2)获得的F2代果蝇杂交，分离F3代果蝇，该F3代的果蝇的2号染色体为APP/Cyo，3号染色体为DPsn/BACE；其中部分F3代的果蝇在受精过程中分别来自父本和母本的3号染色体可能发生了染色体重组，及这部分的F3代的果蝇中，2号染色体为APP/Cyo，3号染色体为DPsn-BACE/DPsn-BACE；

(ii)将(i)步骤中获得的所有F3代果蝇与DB果蝇品系杂交，分离F3代果蝇进行PCR鉴定，得到的目的F3果蝇代果蝇，2号染色体上是APP/Cyo，3号染色体上是DPsn-BACE/TM6B；见图1F；

C.分别制备可稳定遗传的F4代果蝇：

(I)将A步骤中(1)和(2)获得的两种F2代果蝇杂交，获得F3代果蝇，该F3代果蝇的2号染色体为APP/APP，3号染色体为BACE/BACE；另一种F3代的果蝇2号染色体为APP/APP，3号染色体为DPsn/DPsn。

(II)将B步骤(ii)中鉴定阳性的F3代果蝇进行自交，获得F4代果蝇，该F4代果蝇2号染色体为纯合APP/APP，3号染色体为纯合DPsn-BACE/DPsn-BACE，见图1G。

D.分别制备双/三性状果蝇模型：

将C步骤中(I)获得的F4代果蝇与GAL4-cha杂交，获得子代果蝇2号染色体为APP/+，3号染色体为BACE/+；所述的果蝇在胆碱能神经元同时表达底物蛋白APP和β-分泌酶。

将C步骤中(I)获得的F4代果蝇与GAL4-elav杂交，获得子代果蝇2号染色体为APP/+，3号染色体为BACE/+；所述的果蝇在全神经元同时表达底物蛋白APP和β-分泌酶。

将C步骤中(II)获得的F4代果蝇与GAL4-cha杂交，获得子代果蝇2号染色体为APP/+，3号染色体为BACE-DPsn/+；所述的果蝇在胆碱能神经元同时表达底物蛋白APP和β-分泌酶和DPsn蛋白。

将C步骤中(II)获得的F4代果蝇与GAL4-elav杂交，获得子代果蝇2号染色体为APP/+，3号染色体为BACE-DPsn/+；所述的果蝇在全神经元同时表达底物蛋白APP和β-分泌酶和DPsn蛋白。

上述产生的子代果蝇模型可用于神经退行性疾病机制和药物治疗等研究。

实施例2：果蝇模型的鉴定

1.人源的APP蛋白，β-分泌酶蛋白在果蝇体内表达

人源的APP蛋白C端包含β-淀粉样蛋白的片段，如图2黑色区域所示，在体内经过β-分泌酶和γ-分泌酶剪切后，产生两种形式的β-淀粉样蛋白，Aβ40和Aβ42。在表达UAS-APP的转基因果蝇中，本发明人用抗人源的APP蛋白的APP基因C末端抗体可以在100kDa左右检测到两种糖基化的APP(图2B上图的11，15泳道)，在共表达了人源的BACE蛋白之后，高分子量的糖基化APP表达量明显减少。说明在果蝇体内，人源的BACE分泌酶易于剪切高分子量的APP。同时在共表达了APP和BACE的果蝇体内可以检测到β-分泌酶剪切生成的APP的C末端片段[β-C末端片段(CTF)](图2B上图泳道1，2和5，6)。而在分别低表达量的UAS-Aβ1-1，UAS-Aβ1-2果蝇中，高表达量的UAS-Aβ2果蝇中和表达了突变性的UAS-Aβarc(E22G)果蝇中，用β淀粉样蛋白N端的抗体6E10可以在果蝇大脑内检测到β淀粉样蛋白的生成，分子量约3.5kDa(图2B下图，泳道1，2，3，4和6，7，8，9)。其中在胆碱能神经元表达量较低，而在全神经元表达量较高。

同时，本发明人通过酶联免疫吸附实验测定Aβ转基因AD果蝇大脑组织中的Aβ40和Aβ42水平。本发明人发现，在SDS可溶组分中，表达Aβ的AD转基因果蝇大脑中表达了较高的Aβ42，而在APP；BACE和APP；BACE-DPsn的AD转基因果蝇大脑中的Aβ40和Aβ42均有生成(图2C)。

2.随着年龄的增长在AD转基因果蝇体内检测到淀粉样蛋白斑的生成

为了检测AD果蝇大脑内的Aβ淀粉样蛋白斑的生成，本发明人用全组织的免疫荧光实验进行反应。对于高表达Aβ的转基因果蝇(Aβ2)在20天寿命时，在神经网区域和kenyon神经元胞体区域可以明显的检测到大量的Aβ淀粉样斑的形成(图2D(b)箭头所示)。而对于低表达Aβ的转基因果蝇(Aβ1)在10天寿命时仅检测到少量的荧光信号(图2D(a))，而到20天寿命时在神经网区域可以明显的检测到部分的Aβ淀粉样斑的形成(图2D(c))。在表达了APP和分泌酶的果蝇(APP；BACE和APP；BCE-DPsn)中也能检测到明显的Aβ淀粉样斑的形成(图2D(d)和(e))。然而在野生型果蝇中这样的淀粉样沉积是检测不到的。

实施例3：通过生存和行为实验验证APP剪切生成Aβ引起的淀粉样蛋白的沉积造成的神经毒性，调节β-分泌酶对保护神经元有重要的作用。

本实施例中使用的生存及行为学实验的方法参考文献Dissecting thepathological effects of human A{beta}40and A{beta}42in Drosophila：A potentialmodel for Alzheimer’s disease(PNAS，2004，Zhong Yi et al.)，具体方案如下：

实验果蝇如下：

野生型果蝇(WT)：elav^c155/CS(CS为普通野生型果蝇，参见前述PNAS，2004，Zhong Yi et al.的文献)；AD果蝇(Aβ)：elav^c155/+(y)；Aβ1/+，elav^c155/+(y)；Aβ2/+(参见前述PNAS，2004，Zhong Yi et al.的文献)；AD/APP；BACE果蝇(APP/+；BACE/+)：实施例1制备；AD/APP；DPsn-BACE果蝇(APP/+；DPsn-BACE/+)：实施例1制备。

各种果蝇培养于培养管中，管中加入少量食物，食物中包括玉米粉50g，白糖20g，酵母粉15克，琼脂10g，另外需要水600毫升，然后按10-20毫升/5管分装于培养管中。果蝇培养环境为25℃，湿度为60～70％。将果蝇20只一管培养，其中5管用于生存率实验，每天统计一次果蝇的数量，死去的果蝇数，用K-M曲线观察果蝇的生存能力指标，如图3A，B所示。结果表明在果蝇体内重建APP蛋白的剪切过程，生成有毒性的淀粉样蛋白沉积，能够显著的缩短此AD果蝇的寿命。另外6管果蝇用于统计果蝇的爬行能力实验，实验方法为：在黑暗条件下，将每管20只果蝇移入空管中，每个管长9.5厘米，直径2.5厘米，实验中将果蝇震动落至管底，利用果蝇的反向地性本能，使果蝇向上爬行，将测试管平均分成5格，统计10秒后每一格的果蝇数量，用果蝇爬行的总路程除以时间计算每管果蝇的平均速度，记为其爬行指数，用折线图统计果蝇的爬行指数，如图3C所示，随着年龄的增长，AD果蝇的行动能力明显的下降。然而，给AD/APP；BACE果蝇喂食β分泌酶的抑制剂可以显著的延长AD果蝇的寿命，实验结果表明降低BACE蛋白的活性可以显著的提高AD果蝇的生存时间。总结以上结果，可以得出结论AD/APP；BACE及AD/APP；BACE-DPsn的果蝇表现出明显的年龄依赖的退行性病变，从而表现出行为能力上的缺陷，而抑制分泌酶的活性可以缓解其症状。

为了验证上述的表型作为对抗Aβ毒性和靶向调节Aβ产生过程的药物筛选的有效方法和途径，本发明人在饲养果蝇的培养基中加入了β-分泌酶的抑制剂[Sinha，S.，等，Purification and cloning of amyloid precursor protein beta-secretasefrom human brain.Nature，1999.402(6761)：p.537-40；Dovey，H.F.，et al.，Functional gamma-secretase inhibitors reduce beta-amyloid peptide levels in brain.J Neurochem，2001.76(1)：p.173-81]。给APP/BACE转基因果蝇喂食10nM和30nM的β-分泌酶的抑制剂，本发明人发现β-分泌酶的抑制剂可以显著的延长AD果蝇的寿命，且随着喂食剂量的增加，延长作用更加明显(n＝100，P＜0.01)。3nM和10nM的β-分泌酶的抑制剂分别延长溶剂对照组的果蝇寿命3天和9天(图3D深蓝色和浅蓝色线显示)。β-分泌酶的抑制剂处理表达了Aβ的果蝇，并没有改变它们的生存时间(图3E)。以上结果提示，β-分泌酶的抑制剂并没有直接作用于Aβ而缓解其毒性，而是通过抑制β-分泌酶(BACE)的活性，调节了Aβ的产生过程中的关键酶从而缓解了Aβ产生的毒性作用。同时，这一结果表明，应用APP/BACE的转基因果蝇不仅可以作为一种研究AD发生过程和机理的实验动物模型，而且可以成为很好的抗AD药物筛选的动物模型。

实施例4：将果蝇疾病模型用于药物筛选

该疾病模型的特征是子I代果蝇表现明显的年龄依赖的退行性病变，从而表现出行为能力上的缺陷(实施例3中证明)。本实例中，使用前述各果蝇品系进行有效药物的筛选，能够缓解年龄依赖的退行性病变的进程，抑制对于神经元毒性造成的损伤。

1.安理申可以显著的延长AD果蝇的寿命，缓解AD果蝇行动能力上的缺陷。

用同样的方法在AD果蝇模型上验证其他可能的抗AD病理病变的药物，并进行筛选。发明人在饲养果蝇的培养基中加入了安理申，安理申是一种乙酰胆碱酯酶的抑制剂，是现在已经广泛应用于轻中度老年痴呆的临床用药。因此，本发明人给胆碱能神经元特异表达Aβ或APP/BACE的两种转基因雄性果蝇模型分别喂食10μM和30μM的安理申，然后本发明人发现安理申可以显著的延长Aβ低表达转基因果蝇的寿命，且随着喂食剂量的增加，延长作用更加明显(n＝100，P＜0.01)。10μM和30μM的安理申分别延长溶剂对照组的果蝇寿命5天和6天(图4A(a)左图深蓝色和浅蓝色线显示生存曲线，中间是生存曲线的统计学结果)。同样，10μM和30μM的安理申可以显著的缓解Aβ低表达转基因果蝇的行动能力缺陷，如图4A(a)右图所示。

安理申可以显著的延长Aβ高表达转基因果蝇的寿命，且随着喂食剂量的增加，延长作用更加明显(n＝100，P＜0.01)。10μM和30μM的安理申分别延长溶剂对照组的果蝇寿命6天和7天(图4A(b)左图深蓝色和浅蓝色线显示生存曲线，中间是生存曲线的统计学结果)。同样，10μM和30μM的安理申可以显著的缓解Aβ高表达转基因果蝇的行动能力缺陷，如图4A(b)右图所示。

对于APP/BACE的转基因果蝇，安理申的作用并不显著(n＝100)。但是，10μM和30μM的安理申可以显著的缓解APP/BACE转基因果蝇的行动能力缺陷，如图4A(c)右图所示。

安理申处理野生型果蝇的果蝇，并没有改变它们的生存时间(图4A(d))。以上结果提示，10μM和30μM的安理申通过某种机制缓解了Aβ的毒性作用。

2.对于全神经元特异表达Aβ或APP/BACE的两种转基因雄性果蝇模型分别喂食10μM和30μM的安理申，本发明人同样发现安理申可以显著的延长Aβ低表达转基因果蝇的寿命，且随着喂食剂量的增加，延长作用更加明显(n＝100，P＜0.01)。10μM和30μM的安理申分别延长溶剂对照组的果蝇寿命6天和7天(图4B(a)左图深蓝色和浅蓝色线显示生存曲线，中间是生存曲线的统计学结果)。同样，10μM和30μM的安理申可以显著的缓解Aβ低表达转基因果蝇的行动能力缺陷，如图4B(a)右图所示。

安理申可以显著的延长Aβ高表达转基因果蝇的寿命，且随着喂食剂量的增加，延长作用更加明显(n＝100，P＜0.01)。10μM和30μM的安理申分别延长溶剂对照组的果蝇寿命4天和6天(图4B(b)左图深蓝色和浅蓝色线显示生存曲线，中间是生存曲线的统计学结果)。尽管，延长寿命的作用不如在胆碱能神经元表达的情况，由于全神经元表达外源蛋白表达量更高，产生更强的毒性作用，安理申的药效无法完全对抗这种毒性造成的。另外，10μM和30μM的安理申可以显著的缓解Aβ高表达转基因果蝇的行动能力缺陷，如图4B(b)右图所示。

对于APP/BACE的转基因果蝇，安理申的作用同样不显著(n＝100)。但是，10μM和30μM的安理申可以显著的缓解APP/BACE转基因果蝇的行动能力缺陷，如图4B(c)右图所示。

安理申处理野生型果蝇的果蝇，并没有改变它们的生存时间(图4B(d))。以上结果提示，10μM和30μM的安理申可能通过某种机制直接缓解了Aβ的毒性，起到了神经保护的作用。

3.NTI可以显著的延长AD果蝇的寿命，缓解AD果蝇行动能力上的缺陷。

近期本发明人研究组发现β-AR与γ-分泌酶需与δ阿片受体形成复合物，再共同促进淀粉样蛋白的生成。该研究发现使用抵抗δ阿片受体的药物Naltrindole(NTI)可有效地缓解淀粉样蛋白的生成，在此过程中，没有出现副作用，本发明人认为，这将是阿尔茨海默病的一个潜在治疗靶位。对于这一机理，本发明人希望在AD转基因果蝇中在体进一步验证，并且应用AD转基因果蝇，还可以研究阿片受体拮抗剂对于下游Aβ产生毒性的影响。

同样，本发明人给胆碱能神经元特异表达Aβ或APP/BACE的两种转基因雄性果蝇模型分别喂食10μM和30μM的NTI，然后本发明人发现NTI可以显著的延长Aβ低表达转基因果蝇的寿命，且随着喂食剂量的增加，延长作用更加明显(n＝100，P＜0.01)。10μM和30μM的安理申分别延长溶剂对照组的果蝇寿命4天和5天(图4C(a)左图深红色和浅红色线显示生存曲线，中间是生存曲线的统计学结果)。同样，10μM和30μM的NTI可以显著的缓解Aβ低表达转基因果蝇的行动能力缺陷，如图4C(a)右图所示。

NTI可以显著的延长Aβ高表达转基因果蝇的寿命，且随着喂食剂量的增加，延长作用更加明显(n＝100，P＜0.01)。10μM和30μM的NTI分别延长溶剂对照组的果蝇寿命3天和5天(图4C(b)左图深红色和浅红色线显示生存曲线，中间是生存曲线的统计学结果)。同样，10μM和30μM的NTI可以显著的缓解Aβ高表达转基因果蝇的行动能力缺陷，如图4C(b)右图所示。

对于APP/BACE的转基因果蝇，NTI的作用更加显著(n＝100，P＜0.01)。0μM和30μM的NTI分别延长溶剂对照组的果蝇寿命3天和5天，如图4C所示。同样，10μM和30μM的NTI可以显著的缓解APP/BACE转基因果蝇的行动能力缺陷，如图4C(c)右图所示。

相同的得到，用NTI处理野生型果蝇的果蝇，并没有改变它们的生存时间(4C(d))。以上结果提示，10μM和30μM的NTI通过某种机制既可以缓解了下游Aβ的毒性作用，又可能从APP剪切过程进行干预和调节，从而缓解了APP/BACE转基因果蝇的病理症状。

4.同样，本发明人给全神经元特异表达Aβ或APP/BACE的两种转基因雄性果蝇模型分别喂食10μM和30μM的NTI，本发明人发现NTI可以显著的延长Aβ低表达转基因果蝇的寿命，且随着喂食剂量的增加，延长作用更加明显(n＝100，P＜0.01)。10μM和30μM的NTI分别延长溶剂对照组的果蝇寿命4天和3天图4D(a)左图深红色和浅红色线显示生存曲线，中间是生存曲线的统计学结果)。同样，10μM和30μM的安理申可以显著的缓解Aβ低表达转基因果蝇的行动能力缺陷，如图图4D(a)右图所示。

NTI可以显著的延长Aβ高表达转基因果蝇的寿命，且随着喂食剂量的增加，延长作用更加明显(n＝100，P＜0.01)。10μM和30μM的NTI分别延长溶剂对照组的果蝇寿命3天和4天(图4D(b)左图深红色和浅红色线显示生存曲线，中间是生存曲线的统计学结果)。同样，10μM和30μM的NTI可以显著的缓解Aβ高表达转基因果蝇的行动能力缺陷，如图4D(b)右图所示。

同样的，对于APP/BACE的转基因果蝇，NTI的作用更加显著(n＝100，P＜0.01)。0μM和30μM的NTI分别延长溶剂对照组的果蝇寿命5天和4天，如图4D所示。同样，10μM和30μM的NTI可以显著的缓解APP/BACE转基因果蝇的行动能力缺陷，如图4D(c)右图所示。

相同的得到，用NTI处理野生型果蝇的果蝇，并没有改变它们的生存时间(图4D(d))。

5.安理申和NTI可以显著改善AD果蝇的学习能力的衰退

在果蝇嗅觉相关的学习记忆测试试验方法如下：测试果蝇被放在T迷宫测试装置中，给予两种不同的气味三辛醇四甲基环己醇。训练阶段其中一种气味与电刺激相偶联给予60秒钟的训练，休息45秒钟，再通给另一种气味不加电刺激偶联60秒，休息30秒。学习指数测试阶段，同时通入两种气味，给予测试果蝇120秒钟的时间进行选择，然后将电刺激偶联气体交换在进行一次训练和测试，分别计算两次测试的学习指数，平均值作为一个完整的学习指数。连续测定8个完整的学习指数，取平均值作为改组果蝇的学习指数。学习指数(PI值)的计算方法如前所述。

实验结果显示在图4E中。结果表明，安理申和NTI均能有效地对抗β-淀粉样蛋白的毒性，安理申的效果更明显，而对于AD/APP；BACE的果蝇模型NTI通过不同于安理申的作用机制更显著的缓解了学习指数的衰退，有效地增强了AD果蝇的学习能力。

6.安理申和NTI的神经元保护作用不是通过直接降低Aβ量实现的

在这一实施例中，本发明人还用免疫蛋白印迹的方法检测了喂药组果蝇(Aβ2)脑内生成Aβ的没有减少，见图5A。免疫荧光显示β-淀粉样沉积也没有明显的降低，说明安理申和NTI没有直接清除已经生成的Aβ(图5B)。同时，本发明人还进行了苏木精-伊红染色实验检测AD转基因果蝇大脑内的神经元凋亡损伤造成的空斑化现象。在AD果蝇25天寿命时，神经网区域和Kenyon神经元胞体区域可以明显的检测到大量的空斑的形成(图5C箭头所示)。经过安理申和NTI处理的果蝇脑内的空斑化明显的降低和减少，暗示了可能通过其他的途径而非直接作用缓解了β-淀粉样沉积造成的毒性，起到了神经保护的作用。

综上所述，通过调节分泌酶蛋白的内源表达或者活性，可以有效地缓解β-淀粉样蛋白毒性所引起的果蝇AD病理症状。由此证实了APP蛋白及其剪切过程在病理、生理过程中的重要作用，进一步说明了APP蛋白剪切动态过程中的关键蛋白作为AD疾病的一个治疗靶点的重要性和可行性。同时，该疾病模型的行为指标和病理检测指标可以作为药物治疗效果的直接反应，为疾病相关的发生过程和治疗效果提供了有效而快捷的工具。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.一种制备果蝇模型的方法，其特征在于，所述的方法包括：

（1）将UAS-APP品系果蝇与DB品系果蝇杂交，子代果蝇再与DB回交获得2号染色体为APP/Cyo、3号染色体为TM6B/TMII的果蝇；

（2）将UAS-BACE品系果蝇与DB品系果蝇杂交，子代果蝇再与DB回交获得2号染色体为B1/Cyo、3号染色体为BACE/TM6B的果蝇；

（3）将步骤（1）和（2）得到的果蝇品系杂交，然后将所得2号染色体为APP/Cyo、3号染色体为BACE/TM6B的子代果蝇再自交，获得2号染色体为纯合APP/APP、3号染色体为纯合BACE/BACE的可稳定遗传的果蝇；

（4）将UAS-BACE;DPsn品系果蝇与DB品系的果蝇杂交，再与DB品系回交，获得2号染色体为B1/Cyo、3号染色体为DPsn/TM6B的果蝇；

（5）将步骤（1）所获得的果蝇与步骤（4）所获得的果蝇杂交，获得2号染色体为APP/Cyo、3号染色体为DPsn/TM6B的果蝇；

（6）将步骤（5）所获得的果蝇与步骤（3）获得的2号染色体为APP/Cyo、3号染色体为BACE/TM6B的子代果蝇杂交，获得2号染色体为APP/Cyo，3号染色体发生染色体重组DPsn-BACE/DPsn-BACE的表现三性状的果蝇；

（7）将步骤（6）所得的果蝇与DB杂交，获得2号染色体为APP/Cyo、3号染色体为DPsn-BACE/TM6B的果蝇；和

（8）将步骤（7）所得果蝇自交，获得2号染色体为纯合APP/APP、3号染色体为纯合DPsn-BACE/DPsn-BACE的可稳定遗传的果蝇，从而制得果蝇模型。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：

（9）将步骤（8）中获得的果蝇与DB杂交，获得子代果蝇与+/+；TM6B/TMII杂交后回交一次，所得到子代果蝇的2号染色体为+/+，3号染色体为DPsn-BACE/DPsn-BACE；所述的果蝇只表达β-分泌酶和早老素蛋白但不表达底物蛋白APP。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：

（10）将步骤（8）所获得的果蝇与cha-GAL4杂交，获得可在胆碱能神经元内特异地表达目标蛋白的子代；或者

（11）将步骤（8）所获得的果蝇与elav-GAL4杂交，获得可在全神经元内特异地表达目标蛋白的子代。

4.一种果蝇体细胞或组织，其特征在于，所述果蝇细胞或组织来自采用权利要求1和3中任一项所述的方法制备得到的果蝇，且所述组织共表达APP蛋白和β分泌酶（BACE）且不过表达或过表达果蝇早老素蛋白（Dpsn）。

5.如权利要求4所述的果蝇体细胞或组织，其特征在于，所述组织选自果蝇的神经组织。

6.权利要求1－3中任一项方法所制备得到的果蝇、或权利要求4或5所述的果蝇体细胞或组织的用途，其特征在于，

（a）用于研究底物APP及其剪切酶β-分泌酶和γ-分泌酶的相互作用；

（b）用于研究中间剪切产物βAPP-CTF和最终产物β-淀粉样蛋白过量表达相关疾病的病理过程中的作用；

（c）用于研究APP蛋白剪切过程及β-淀粉样蛋白过量表达相关疾病的相关性；

（d）用于研究APP蛋白剪切过程及β-淀粉样蛋白过量表达在特异的神经元组织内的病理过程；

（e）用于筛选β-分泌酶、γ-分泌酶和/或β-淀粉样蛋白在β-淀粉样蛋白过量表达相关疾病进程中相互作用的药物；

（f）用于筛选通过调节β-分泌酶和/或γ-分泌酶的表达及与其相互作用的靶点蛋白来改善β-淀粉样蛋白过量表达相关疾病的药物；或

（g）用于制备用于治疗β-淀粉样蛋白过量表达相关疾病用的药物。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的β-淀粉样蛋白过量表达相关疾病是神经退行性疾病。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述神经退行性疾病是阿尔茨海默症。

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