JP2000512141A - パーレカン遺伝子組換え動物及びアミロイド症を治療するための化合物を同定する方法 - Google Patents

パーレカン遺伝子組換え動物及びアミロイド症を治療するための化合物を同定する方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、パーレカンをコードするトランスジーンを発現する非ヒトトランスジェニック動物を提供する。パーレカン及びマミロイドをコードするトランスジーンを発現する非ヒト二重トランスジェニック動物も提供する。また、アミロイドの沈着の速度または程度を変更させる化合物のスクリーニング方法も提供する。当該方法は、(ａ)パーレカントランスジェニック動物を製造し；(ｂ)該パーレカントランスジェニック動物に、有効量の試験化合物を投与し；そして(ｃ)該化合物がアミロイドの沈着の速度または程度を変更させるか調べることからなる。最後に、本発明はアミロイドの沈着の速度または程度を変更させる化合物のスクリーニング方法も提供する。当該方法は、(ａ)パーレカン／アミロイド二重トランスジェニック動物を製造し；(ｂ)該パーレカン／アミロイド二重トランスジェニック動物に、有効量の試験化合物を投与し；そして(ｃ)該化合物がアミロイドの沈着の速度または程度を変更させるか調べることからなる。

Description

【発明の詳細な説明】 パーレカン遺伝子組換え動物及びアミロイド症を治療するための化合物を同定す る方法 この発明は、アミロイド症のための先導的治療薬を同定するための検索手段と しての遺伝子組換え動物及びトランスフェクト動物細胞でのパーレカンの過産生 に関する。 発明の背景 アミロイド症 “アミロイド症”とは、すべて“アミロイド”として知られる不溶性の細胞外 物質の組織内への、通常、正常な器官の機能を損なうのに充分な量の蓄積が認め られる、臨床的にそして一般に無関係なヒトの病気群から成る。1842年に、Roki tanskyは色々な患者からの多くの組織に、蝋状で非晶質に見える組織沈着物を初 めて観察した(Rokitansky，"Handbuch der pathologischen Anatomie"，Vol．3 ，Braumuller and Seidel，Vierma)。しかし、1854年に初めて、Virchowは、セ ルロースを検出するために1850年代に用いられた硫酸沃素反応によって、これら の沈着物が陽性に染まったので、“澱粉様”を意味する“アミロイド”という表 現で呼んだ(Virchow，Arch．Path．Anat.，8:416(1854))。セルロースはアミロ イドの成分ではないが、Virchowが観察した染色は恐らくアミロイド沈着物のす べての型に関係していると思われるプロテオグリカン(PG)類の存在のためであろ う。1859年に、FriederichとKekuleがアミロイドの、蛋白質としての性質を発見 したという事実にもかかわらず、アミロイドという名称は残った(Friedrich and Kekule,Arch．Path．Anat．Physiol.，16:50(1859))。多年にわたり、すべての アミロイドが同じ染色及び構造的特性を有するという事実に基づいて、アミロイ ド沈着には単一の発病機構が関わっているという仮定が導かれ、アミロイド沈着 物は、単一組の成分から成ると考えられた。現在の研究は、アミロイドは一様な 沈着物ではなく、アミロイドはまったく無関係な種々の蛋白質類から成る可能 性を明らかに示した(Glenner，N．England，J．Med．302:1283-1292(1980))。 アミロイド自体の性質は、まったく異なる無関係な蛋白質類から成ることが見 出されたが、すべてのアミロイドが原線維状構造に適合するアミロイドの基礎と なる蛋白質の構造の故に、顕微鏡下で見ると、同じように見える。すべてのアミ ロイドは、基礎となる蛋白質の性質にかかわらず、1)コンゴー・レッド染料で特 徴的に染まり、偏光下で見ると古典的な赤／緑複屈折を示し(Puchtler et al，J ．Hystochem．Cytochem．10:355-364(1962))、2)超構造的には、直径7〜10nm、 不定長の原繊維から成り、3)主にβ折りたたみシート二次構造を取る。従って、 アルツハイマー病患者の死後脳に電子顕微鏡(倍率3万倍)下で見られるアミロイ ド原線維は、リウマチ様関節炎患者からの生検腎臓に存在するアミロイドの外観 とほとんど同じに見えるであろう。これらのアミロイドの両方が、7〜10nmの類 似した原繊維の直径を示すであろう。 1970年代の半ばから後半に、アミロイドは臨床的に四つの群に分類された。初 発性アミロイド、続発性アミロイド、家族性アミロイド、及び孤立性アミロイド である。初発性アミロイドは、前疾患なく初めて現れるアミロイドである。これ らの症例の25〜40％で、初発性アミロイドは多発性骨髄腫又は他のB細胞型悪性 腫瘍の発生のような形質細胞機能不全の前兆であった。明白な悪性化の後より、 むしろ前に、アミロイドが現れる。続発性アミロイドは、既存の疾患の合併症と して現れた。多発性骨髄腫で患者の10〜15％は、結局アミロイドを発達させる(H anada et al.，J．Histochem．Cytochem．19:1-15(1971))。慢性関節リウマチ、 変形性関節症、強直性脊椎患者は、結核、肺膿瘍、及び骨髄炎患者の場合のよう に続発性アミロイド症を発病する場合がある(Benson and Cohen，Arch，Rheum． 22:36-42(1979);Kamei et al.，Acta Path．Jpn．32:123-133(1982);McAdam et al.，Lancet 2:572-575(1975))。自分で注射をし、慢性皮膚膿瘍を発症させる静 脈薬剤使用者もまた、続発性アミロイドを発症させる場合がある(Novick，Mt．S in．J．Med．46:163-167(1979))。続発性アミロイドはまた、悪性リンパ腫及び 腎細胞癌のような特定の悪性腫瘍患者にも見られる(Husby et al.，Cancer Res ．42:1600-1603(1982))。最初は、これらはすべて続発性アミロイドとして分類 されたが、アミロイド蛋白が単離され、配列が決められた時、これら の多くが、種々のアミロイド蛋白を含むことが判明した。 また、アミロイドの家族性型は、沈着アミロイド原線維を引き起こすペプチド に関しては、まったく一様性を示さなかった。現在、アミロイドの遺伝型として 、いくつかの地理的集団が同定されている。一つの群は、イスラエルで発見され た。この疾患は家族性地中海熱と呼ばれ、アミロイド沈着を特徴とし、再発性炎 症と高熱を伴う(Mataxas，Kidney 20:676-685(1981))。遺伝アミロイドのもう一 つの型は、家族性アミロイド性多発性神経炎であり、スウェーデン人(Skinner a nd Cohen，Biochem．Biophys．Res．Comm．99:1326-1332(1981))、ポルトガル人 (Saraiva et al.，J．Lab．Clin．Med 102:590-603(1983)，J．Clin．Invest．7 4:104-119(1984))、及び日本人(Tawara et al.，J．Lab．Clin．Med．98:811-82 2(1981))で発見された。この病気ではアミロイド沈着が主に周辺及び自律神経で 起きる。アイスランド起源の遺伝的アミロイド脈管症は、脳の血管を初発的に冒 すアミロイド沈着の常染色体優性型で、西アイスランドで発見された一群の家系 で同定された(Jenngon et al.，Clin．Genet．36:368-377(1989))。これらの患 者は、臨床的には、若年で大量の脳出血を引き起こし、通常40才までに死亡する 。 上記のアミロイドの初発性型、続発性型、及び家族性型は、心臓、腎臓、肝臓 、脾臓、消化管、皮膚、膵臓、及び副腎等の体の多くの器官に関わる傾向がある 。体内の非常に多くの器官にアミロイド蓄積が認められるので、これらのアミロ イド症は“全身性アミロイド”とも呼ばれる。これらのアミロイド症の大部分に 対しては、明確な療法も有効な治療も無く、アミロイド沈着の結果は患者に有害 な場合がある。例えば、腎臓でのアミロイド沈着は腎機能不全を引き起こす恐れ があり、心臓でのアミロイド沈着は心不全を引き起こす恐れがある。これらの患 者は、全身の器官でのアミロイド蓄積のため結局、一般的に3〜5年内に死亡する 。 他方、アミロイドの孤立型は、単一の器官系に発生する傾向がある。孤立性ア ミロイド沈着物は、肺及び心臓で見出された(Wright et al.，Lab．Invest．30: 767-773(1974);Pitkanen et al.，Am．J．Path．117:391-399(1984))。II型糖尿 病患者(糖尿病の非インシュリン依存型)の90％までが、ランゲルハンス島の β細胞に制限された膵臓で孤立型アミロイド沈着物を有していた(Johnson et al .，New Engl．J．Med．321:513-515(1989);Lab．Invest．66:522-535(1992))。 アミロイドの孤立型は又、甲状腺の髄様癌での場合のようなポリペプチドホルモ ンを分泌する内分泌腫瘍で見出された(Butler and Khan，Arch．Path．Lab．Med ．110:647-649(1986);Berger at al.，Virch．Arch．A Path．Anat．Hist．412: 543-551(1988))。長期の血液透析の重大な合併症は、内側の神経に沈着し、手根 管圧迫症候群と臨床的に関係があるアミロイドである(Gejyo et al.，Biochem． Biophys．Res．Comm．129:701-706(1985);Kidney Int．30:385-390(1986))。器 官特異的アミロイド及びアミロイド全般で最も一般的な型及び臨床関連の型は、 断然アルツハイマー病患者の脳に見つかるアミロイドである(U.S．Patent No．4 ,666,829;Glenner and Wong，Biochem．Biophys．Res．Comm．120:885-890(1984 );Masters et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82:4245-4249(1985)を参照)。 この疾患では、アミロイドは主に中枢神経系に限定される。ダウン症患者が35才 に達すると、脳でアミロイドの似た沈着が起きる(Rumbleet al.，New Engl．J． Med．320:1446-1452(1989);Mann et al.，Neurobiol．Aging 10:397-399(1989)) 。中枢神経系アミロイド沈着の他の型には、クロイツフェルト−ヤコブ病、ゲル ストマン−シュトラウスラー症候群、及びクールーを含むプリオン病として知ら れ、希ではあるが、高度に感染性の疾患が含まれる(Gajdusek et al.，Science 197:943-960(1977);Prusiner et al.，Cell 38:127-134(1984)，Prusiner et al .，Scientific American 251:50-59(1984);Prusiner et al.，Micr．Sci．2:33- 39(1985);Tateishi et al.，Ann．Neurol.，24:35-40(1988))。 それらの臨床的特徴だけに基づいて種々のアミロイド的疾患を分類した結果、 誤解が生じた。関係する主要な蛋白質類が単離され、配列が決定された時、それ らは異なっていることが判明したからである。例えば、慢性関節リウマチ及び変 形性関節症で見られる、AAアミロイドとして現在知られるアミロイドは家族性地 中海熱として知られるアミロイドの家族性型の患者で同定される同じアミロイド 蛋白であった。アミロイドの最も良好な分類は、問題を混乱させないように、単 離し配列を決め同定して見出される主要な蛋白質に従ってなされるべきであると 決められた。 こうして今日、アミロイドは沈着した特異的アミロイド蛋白に従って分類され ている。アミロイド症には、アルツハイマー病、ダウン症、及びオランダ型のア ミロイド症を呈する遺伝的脳出血(ここで特異的アミロイドはβアミロイド蛋白( 又はＡβ)として現在知られている)に関係するアミロイド、慢性炎、悪性腫瘍の 種々な型、及び家族性地中海熱に関係するアミロイド(AAアミロイド又は炎症関 連のアミロイド症)、多発性骨髄腫及び他のB細胞異常に関係するアミロイド(AL アミロイド)、糖尿病II型に関係するアミロイド(アミリン又はランゲルハンス島 アミロイド)、クロイツフェルト−ヤコブ病、ゲルストマン−シュトラウスラー 症候群、クールー及び動物スクレピー等のプリオン病に関係するアミロイド(PrP アミロイド)、長期の血液透析及び手根管圧迫症候群に関係するアミロイド(β2 ミクログロブリン・アミロイド)、老齢心臓アミロイド及び家族性アミロイド性 多発性神経炎に関係するアミロイド(プレアルブミン又はトランスチレチン・ア ミロイド)、及び甲状腺髄様癌のような内分泌腫瘍に関係するアミロイド(プロカ ルシトニンの変異体)が含まれるが、これらに限定されない。 前述のようにアミロイド症には多くの異なる型があるが、二三の動物モデルが 、これらの病気での新しい治療薬を開発するためにあるのみである。炎症関連又 はAAアミロイド症には、明確な実験マウス・モデルがある。それは、脾臓、肝臓 、及び腎臓のような全身性器官でのアミロイド沈着を誘導するために用いられる (Snow and Kisilevsky，Lab．Invest．53:37-44(1985))。また、アルツハイマー 病神経病理現象のいくつかが、この病気の現在の動物モデルで観察されているに 過ぎない(後述)。従って、アルツハイマー病等のアミロイド症に対する新しい遺 伝子組換え動物モデルを開発する必要がある。また、速やかに各アミロイド症の 新しい先導的治療薬を検索し同定するための新しい細胞培養モデルも必要である 。 発明の概要 本発明は、形質転換遺伝子をコード化するパーレカンを発現する、ヒト以外の 遺伝子組換え動物を提供する。また、形質転換遺伝子をコード化するパーレカン 及びアミロイドを発現する、ヒト以外の二重トランスジェニック動物も提供する 。さらに、アミロイド沈着の速度又は程度を変える化合物を検索する方法も提供 する。その方法は、(a)パーレカン遺伝子組換え動物を構築し、(b)当該パーレカ ン遺伝子組換え動物に試験化合物の有効な量を投与し、そして(c)当該試験化合 物がアミロイド沈着の程度又は速度を変えるかどうかを判定することから成る。 また、本発明はアミロイド沈着の速度又は程度を変える化合物を検索する方法も 提供する。この方法は、(a)パーレカン／アミロイド二重トランスジェニック動 物を構築し、(b)当該パーレカン／アミロイド二重トランスジェニック動物に試 験化合物の有効な量を投与し、そして(c)当該試験化合物がアミロイド沈着の程 度又は速度を変えるかどうかを判定することから成る。 図面の簡単な説明 図1は、パーレカンの五つの構造的領域を示す概念図である。 図2A-2Gは、パーレカンの各部分を重ね合わせるためcDNA群を含むプラスミド ・クローンを用いてパーレカン・コア蛋白のための全長cDNAの構築戦略を示す概 念図である。 図3A-Cは、遺伝子組換えマウス及びトランスフェクト細胞でのマウスのパーレ カンを過剰発現させるために用いる発現ベクターpCA-DI-Vと連結されるサイトメ ガロウイルス・エンハンサー／ニワトリβアクチン・プロモーターのための構築 戦略を示す。 図4は、非トランスフェクト及びトランスフェクトCOS細胞の溶解液からのウェ スタン・ブロットのモノクロ写真である。トランスフェクトCOS細胞の細胞層で のパーレカンの過剰発現が認められる。 図5は、非トランスフェクト及びトランスフェクトCOS細胞の培地からのウェス タン・ブロットのモノクロ写真である。トランスフェクトCOS細胞の培地中での パーレカンの過剰発現が認められる。 図6は、非トランスフェクト及びトランスフェクトP19細胞の培地及び細胞溶解 液からのウェスタン・ブロットのモノクロ写真である。細胞層及び培地中でのパ ーレカンの過剰発現が認められる。 図7は、パーレカンとβＰＰ-695の両方を、及びβＰＰ-695だけを過剰発現す るP19細胞の培地及び細胞溶解液からβＰＰを検出するウェスタン・ブロットの モノクロ写真である。 図8は、パーレカンとβＰＰ-695の両方を、及びβＰＰ-695だけを過剰発現す るP19細胞から培地に分泌されたＡβを検出するウェスタン・ブロットのモノク ロ写真である。 図9は、パーレカンとβＰＰ-695の両方を、及びβＰＰ-695だけを過剰発現す るP19細胞から培地に分泌されたＡβのレベル比の棒グラフである。パーレカン 及びβＰＰ-695の両方を過剰発現する細胞中のＡβのレベルの顕著な増加(8〜10 倍)を示す。 図10は、パーレカンだけ、βＰＰ-695＋パーレカン、βＰＰ-695だけ、及び対 照の親の細胞(P19だけ)を過剰発現するP19細胞中に生残するニューロンの数を比 較する棒グラフである。パーレカンだけ又はパーレカン＋βＰＰ-655の過剰発現 が、ニューロンの生残を低下させた。 図11は、マウスのパーレカン(領域I〜V)を過剰発現する遺伝子組換えマウスか ら採取されるDNAのサザン・ブロットのモノクロ写真である。遺伝子組換えマウ スから採取されるDNAのサザン・ブロットでパーレカン形質転換遺伝子の染色体 統合が認められる。4匹のパーレカン遺伝子組換えの創始マウスを示す。 図12は、パーレカン遺伝子組換えマウス及び対照の同腹兄弟(姉妹)の組織から 単離したRNAのノーザン・ブロットのモノクロ写真である。いくつかの組織でパ ーレカンmRNAの過剰発現が認められる。 図13はパーレカン遺伝子組換えマウス及び、対照の同腹兄弟(姉妹)の組織から 単離した蛋白質のウェスタン・ブロットのモノクロ写真である。遺伝子組換えマ ウスの種々の器官のパーレカン・プロテオグリカンの過産生が認められる。 図14は、5カ月のパーレカン遺伝子組換えマウス及び対照の同腹兄弟(姉妹)の 脳及び腎臓組織のモノクロ顕微鏡写真である。組織を、パーレカンに特異的な抗 体で免疫染色し、その後ヘマトキシリンで対染色した。遺伝子組換えマウスの組 織で過産生されたパーレカンの蓄積が認められる。 図15A及び15Bは、βアミロイド前駆体蛋白質遺伝子組換えマウス(ＣＡ-ＳβＣ )を 作り出す例としてシグナルペプチド及びβアミロイド前駆体蛋白質のC末端の99 個のアミノ酸に連結したサイトメガロウイルス・エンハンサー／ニワトリβアク チン・プロモーターのための構築方法を示す。 図16は、βアミロイド前駆体蛋白質のC末端の99個のアミノ酸を過産生する遺 伝子組換えマウスとパーレカン遺伝子組換えマウスを交配することにより作り出 された二重遺伝子組換えマウスの尾のDNAのサザン・ブロットのモノクロ写真で ある。子#552は、パーレカン及びβアミロイド前駆体蛋白質のC末端の99個のア ミノ酸の両方のための遺伝子を含むことが見出された。 発明の詳細な説明 既に述べたように、パーレカンは特定のヘパラン硫酸プロテオグリカンであり 、特定のアミロイド蛋白にかかわらず、すべてのアミロイド沈着物の共通の成分 である。パーレカンはアミロイド症の発病に初発的な役割を演じると信じられ、 種々の組織及び種々の臨床環境で、アミロイドの形成、沈着、蓄積、及び／又は 残留に寄与する。特定のアミロイド蛋白を過剰発現する、これまでの動物モデル は、種々のアミロイド症に関係する病理のいくつかを希に作り出すだけであるか 、又はヒトに臨床的に観察されるのとは異なる部位に原線維状アミロイドを作り 出し、種々のアミロイド症に対する可能な治療薬を生体内で検索するのを極めて 難しくしている。さらに、パーレカンは純粋にかなりの量を単離するのが極めて 難しい高分子であり、パーレカンを過剰発現するトランスフェクト細胞系統によ り、多くの種々の生物検定で使用するのに充分な量、精製をするためのパーレカ ンを単離することが可能になろう。パーレカンは大型コア蛋白(〜400キロダルト ン)を含むプロテオグリカンであるので、首尾よくパーレカン・コア蛋白全体を 過剰発現する遺伝子組換えマウスを作り出す試みは、これまで成功しなかった。 全パーレカン・コア蛋白の過剰発現を成功させるためには、ネズミ・パーレカン ・コア蛋白の全12kbのメッセージ(又はヒト・パーレカン・コア蛋白の全14kbの メッセージ)をカバーするオーバーラップcDNAクローンをリゲートするための戦 略及びパーレカン遺伝子組換えマウスの構築戦略で使用するための特異的プロモ ーター及びエンハンサーの選択が必須であると思われる。本発明では、ユニーク な制限部位が、マウス・パーレカンの約400kDaのコア蛋白質をコード化する単一 の12kbのcDNAクローンを作り出すために7個のオーバーラップcDNAクローンを一 緒にライゲートするために用いられた。サイトメガロウイルス・エンハンサーと ニワトリβアクチン・プロモーターを利用する、pCA-DI-Vと称する新規な構造が 、トランスフェクト細胞及び遺伝子組換えマウスでのマウス・パーレカン過剰発 現(領域I〜V)の成功に結びついた。パーレカンの過産生は、COS細胞及びP19細胞 (レチノイン酸処理後、ニューロン様細胞に分化する胎児癌腫細胞)の両方で達成 された。P19細胞でのパーレカンの過剰発現は、分泌されたβアミロイド蛋白(A β)のレベルを8〜10倍増加させ、ニューロンの生残を著しく減少させた。これら の後者の研究は、動物細胞又はヒト以外の遺伝子組換え動物でのパーレカンの過 剰発現がアルツハイマー型のアミロイドの蓄積を引き起こし神経病理学的及び行 動的変化を生じさせるのに充分かもしれないことを示す。パーレカン遺伝子組換 えマウスの生産、及びこれらのマウスと、アミロイド発病に関係するある与えら れたアミロイド蛋白又はその前駆体蛋白質及び／又は他の成分を過剰発現する遺 伝子組換え動物との交配(すなわち、二重遺伝子組換えマウス)は、ある与えられ たアミロイド症の表現型的病理現象の多く又はすべてを発症する後代を作り出す であろう。アルツハイマー病に対する方法を検索するための例として、パーレカ ン遺伝子組換え動物、パーレカン遺伝子組換え動物由来の細胞、又はパーレカン ・トランスフェクト動物細胞が単独で又は他のアミロイド症関連成分と組み合わ せて、βアミロイド前駆体蛋白質(βＰＰ)類、Ａβ、及び動物での他の多数のア ルツハイマー病マーカに及ぼすそれらの効果、動物の神経病理学的現象、及び動 物の行動の変化によって測定することによって、アルツハイマー病の病理学的進 行過程を変更する化合物を検索するために用いられる。二重遺伝子組換えマウス の生産の例として、βＰＰのC末端の95個のアミノ酸を過産生する遺伝子組換え マウスとパーレカンの遺伝子組換え動物の交配が達成され、パーレカン及びβＰ Ｐの両方の遺伝子を有する後代の出産につながった。アミロイド症の新しい遺伝 子組換え動物モデル及び動物細胞の生産は、生体内及び生体外での検索手段とし てアミロイド症及びこれらの病気に関係する臨床徴候の治療のための先導的治療 薬の同定を支援するために用いられよう。また、トランスフェクト細胞でのパー レ カンの過産生の成功は、さまざまな生体外及び生体内分析のためのパーレカンの 使用に対して増加する要求を満たすパーレカンを単離するための新しい手段を提 供する。 アルツハイマー病の治療のための標的としての“アミロイド” アミロイド症の最も一般的な型は、アルツハイマー病患者の脳に見出される。ア ルツハイマー病は、中年及び老年期において、痴呆の最も一般的な原因であり、 記憶、言語、視覚空間的知覚、及び行動の進行性障害によって明白となる(A Gui de to the Understanding of Alzheimer's Disease and Related Disorders，Jo rm編，New York University Press，New York(1987))。臨床規準に基づいて(通 常他の病気の除外、記憶試験等により)推定アルツハイマー病の診断を行うこと ができるが、確定診断には通常剖検で得られる脳組織の特異的異常を組織学的に 検査する必要がある。 アルツハイマー病は、我々を人間たらしめる自主性等の多くのことを患者から 奪い、記憶、注意、言語、及び推理のような認識過程に必要な脳の部分を退化さ せる。アルツハイマー病のいくつかの遺伝型では開始は中年であるが、より一般 的には、症状は60代半ば以後に出現する。アルツハイマー病は、βアミロイド蛋 白、Ａβ又はβ／A4と呼ばれる39〜43個のアミノ酸のペプチドの沈着及び蓄積に より特徴付けられる(Glenner and Wong，Biochem．Biophys．Res．Comm．120:88 5-890(1984);Masters et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82:4245-4249(1985 );Husby et al.，Bull．WHO 71:105-108(1993))。この小ペプチドは、アルツハ イマー病患者の脳血管壁の神経突起“プラーク”のアミロイド沈着(脳血管性ア ミロイド沈着として知られている)を作る主要成分である。また、アルツハイマ ー病は、ニューロンの細胞質で異常に蓄積する対になった螺旋フィラメントから 成る多数の神経原繊維の“縺れ”の存在により特徴付けられる(Grundke-Iqbal e t al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 83:4913-4917(1986)，Kosik et al.，Notl ．Acad．Sci．USA 83:4044-4048(1986)，Lee et al.，Science 251:675-678(199 1))。従って、アルツハイマー病の病理学的な証拠は、アミロイドがプラークの 中心部及び血管壁内に沈着する“プラーク”及び“縺れ”の存在 である。いわゆる“正常に老化した脳”が、いくらかのアミロイドプラーク及び 神経原繊維の縺れを有することに注意することが重要である。しかしながら対照 的に、アルツハイマー病の脳はプラークと縺れを過剰に示す。従って、診断的観 点からのアルツハイマー病の脳と正常な脳との区別は、主として、“プラーク” 及び“縺れ”の定量的評価に基づく。 アルツハイマー病の脳には、通常、何千個もの神経突起プラーク(neuritic pl aque)がある。神経突起プラークは、拡大した軸索及び神経突起として知られて いるシナプスの末端で通常囲まれているアミロイド・コアから成る細胞外沈着物 、及び異常な樹枝状突起、及び可変数の浸潤小膠細胞及び囲んでいる星細胞から 出来ている。アルツハイマー病の脳に存在する神経原繊維の縺れは、微小管付属 蛋白質であるタウ蛋白質から主に成る(Grundke-Iqbal et al.，Proc．Nati．Aca d．Sci．USA 83:4913-4917(1986);Kosik et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 83:4044-4048(1986);Lee et al.，Science 251:575-678(1991))。超構造レベル では、縺れは80nmの周期の特異的に交差するリボンのように捻れる対の螺旋フィ ラメントから成る。多くの場合、神経原繊維の縺れ内には、対の螺旋フィラメン ト及び直線状フィラメントの両方が存在する。また多くの場合、フィラメントを 残したまま神経細胞が枯れることがある。これらの縺れは、死んだニューロンの 糸状の残存物であるので、“ゴースト縺れ”として知られている。 アルツハイマー病患者の脳に見出される病斑のもう一つの主要な型は、脳の実 質内の血管壁及び、脳の外に存在する、より大きい髄膜の脈管壁の両方の血管壁 へのアミロイドの蓄積である。血管壁に局在するアミロイド沈着物は、脳血管性 アミロイド又はコンゴフィリック脈管症と呼ばれる(Mandybur，J．Neuropath．E xp．Neurol．45:79-90(1986);Pardridge et al.，J．Neurochem．49:1394-1401, 1987))。 また、アルツハイマー病患者にはニューロンの減少及びシナプスの減少が認め られる。またさらに、これらの患者にはアセチルコリンのような神経伝達物質の 減少が認められる。アルツハイマー病に対する最初のFDA認可薬剤タクリンは、 コリンエステラーゼ阻害剤である(Cutler and Sramek，New Engl．J．Med．328: 808-810(1993))。しかしながら、この薬剤はアルツハイマー病患者に、もしあ るとしても、認識の改善に部分的に成功しただけで、当初は肝臓毒性のような主 要な副作用を有していた。 何年もの間、アルツハイマー病における“アミロイド”の重要性に関して、そ して、この病気に特徴的な“プラーク”及び“縺れ”が病気の原因なのか単なる 結果なのかに関して科学的な議論が行われた。最近数年間の研究によって、アミ ロイドが単に無関係に存在するのではなく、実はアルツハイマー病の要因である ことが明らかになった。細胞培養中でβアミロイド蛋白(Ａβ)として知られるア ルツハイマー病の主要な蛋白質は、短時間で神経細胞の変性を引き起こすことが 示された(Pike et al.，Br．Res.:311-314(1991)，J．Neurochem．64:253-265(1 994))。研究は、原因は、神経毒性効果を引き起こす、すべてのアミロイドに特 徴的な原線維状構造物であることを示唆している。Ａβはまた、海馬(アルツハ イマー病で冒される主要な記憶領域)の切片培養における神経毒であり(Harrigan et al.，Neurobiol．Aging 16:779-789(1995))、遺伝子組換えマウスで神経細 胞死を引き起こすることが見出された(Games et al.，Nature 373:523-527(1995 )，Hsiao et al.，Neuron 15:1203-1218(1995))。また、ネズミ脳へのアルツハ イマーのＡβの注射は、アルツハイマー病の二つの証拠である記憶障害とニュー ロンの機能不全を引き起こす(Flood et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．88:3363- 3366(1991);Br．Res．663:271-276(1994))。アミロイド(すなわち、βアミロイ ド蛋白)が直接アルツハイマー病の発病に関わるという最も説得力のある証拠は 、恐らく最近の遺伝学的研究から来ている。Ａβの生産はβアミロイド前駆体蛋 白質として知られる、その前駆体をコード化する遺伝子の変異から生じる可能性 があることが発見された(Van Broeckhoven et al.，Science 248:1120-1122(199 0);Europ．Neurol．35:8-19(1995);Murrell et al.，Science 254:97-99(1991); Haass et al.，Nature Med．1:1291-1296(1995))。この前駆体蛋白質は、正常に 処理される時だけは通常、有毒なＡβをほとんど作り出さない。家族性早期発病 アルツハイマー病を引き起こすアミロイド前駆体蛋白質遺伝子の変異の同定は、 アミロイドがこの病気の発病過程の中心であるという最も強い主張である。病気 を引き起こす報告された四つの変異が現在発見され、それらは家族性アルツハイ マー病を引き起こすことにおけるβアミロイド蛋白の 重要性を示している(Hardy，Nature Genet．1:233-234(1992)を参照)。これらの 研究は、ヒト患者の脳における原線維状βアミロイド蛋白の形成、沈着、蓄積、 及び／又は残留を抑制、除去、又は防ぐための薬剤を提供することが有効な治療 法であると考えるべきであることを示している。プロテオグリカン類 プロテオグリカン(PG)類は、種々の異なる細胞型の細胞内であれ、さまざまな 機能のために送り出される細胞外マトリックス中であれ、すべての器官及び組織 に見出される複合高分子群である。プロテオグリカン類は、一つ以上のグリコサ ミノグリカン(GAG)鎖が共有結合によって連結した直鎖の蛋白質中心骨格から成 る(Hascall and Hascall，in Cell Biology of the racellular Matrix，Hay ed itor，New York，Plenum Press，pp．39，(1981);Hassell et al.，Ann．Rev．B iochem．55:539-567(1986))。高度にアニオン型のGAG鎖は、1)ヘキソサミン(D- グルコサミン又はD-ガラクトサミン)、及びヘキスロン酸(D-グルクロン酸又はL- イズロン酸)を含む繰り返し二糖類単位から成る。(Muir，Am．J．Med．47:673-6 90(1969))。PG類は、存在する主なGAGの同定に従って伝統的に命名され、数個の 主要なGAG類が同定された。これらは、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン 、コンドロイチン-4-硫酸、コンドロイチン-6-硫酸、デルマタン硫酸、及びケラ タン硫酸である。通常、GAG鎖と蛋白質中心骨格間の連結は、蛋白質コア上のセ リン残基の水酸基との共有結合によって連結されたキシロース分子を有するキシ ロース−ガラクトース−ガラクトース結合領域から成る(Roden and Armand，J． Biol．Chem．241:65-70(1966))。例外は、蛋白質成分が無くD-グルクロン酸とD- グルコサミン交互の単位から成る骨格を有するヒアルロン酸である。ケラタン硫 酸は、典型的なキシロース−セリン連結が欠けている一つのPGである。それは蛋 白質にセリン又はスレオニンと結合するN-アセチルガラクトサミン残基経由で( 軟骨の場合)、又は直接アスパラギン残基と結合するN-アセチルグルコサミン残 基経由で(角膜の場合)連結している(Hascall and Hascall，in Cell Biology of the Extracellular Matrix，Hay editor，New York，Plenum Press，pp．39，( 1981);Muir，Am．J．Med．47:673-690(1969))。ヘパラン硫酸プロテオグリカン類:すべてのアミロイド類の共通の成分 アミロイド形成、沈着、蓄積、及び残留に対する新規な治療法を見出すのこと が、今日、アルツハイマー病及び他のアミロイド症に対する適切な戦略であると 考えられていることは研究文献から明らかである。アミロイドの研究に依然とし て残る主要な疑問は、何故、無関係な蛋白質類を含むすべてのアミロイドが似た 特性を有するアミロイド原線維をすべて形成している(すなわち、すべてが7〜10 nmの原繊維から成り、支配的なβ折りたたみシート二次構造を含有している)の かであった。すべてのアミロイドの発病で似た役割を演じるかもしれない共通の 成分は存在するのか? アミロイド症に関わる機構の理解における、この中心的で重要な問題に対する 解答。初期の研究では、明確な実験マウスモデルにおいて高度に硫酸化したGAG 類(後に特定のヘパラン硫酸PG類と同定された)が、炎症関連アミロイド(すなわ ちAAアミロイド)と共に沈着した(Snow et al.，Lab．Invest．56:665-675(1987) )。後の研究はヘパラン硫酸PG類が種々の異なる組織でのAAアミロイドの沈着及 び蓄積に一時的に構造的に関係していることを示した(Snow et al.，J．Histoch em．Cytochem．39:1321-1330(1991))。特異的な染色技術及び免疫組織化学的方 法が次に、高度硫酸化PG類は関係する特定のアミロイド蛋白、アミロイド症の段 階、及びアミロイド沈着の組織部位にかかわらず、すべて又は、ほとんどのアミ ロイド類の共通の特徴であることを明らかにした(Snow et al.，Lab．Invest．5 6:120-123(1987);Am．J．Path．133:456-463(1988);Acta Neuropath．77:337-34 2(1980):Lab．Invest．63:601-611(1990))。 次に、さらにアルツハイマー病アミロイド症における特定のPG類の可能な係わ りを理解するための研究が行われた。特異的な免疫組織化学的プローブを用いる 初期の研究で、ヘパラン硫酸PG類は神経突起プラークと脳血管性アミロイド沈着 でのアミロイドの重要な成分であることが初めて、明らかにされた(Snow et al ．，Am．J．Path．133:456-463(1988))。後に、この初期の研究で用いられた抗 体が事実特に“パーレカン”として知られる大きいヘパラン硫酸PGのコア蛋白を 認識する抗体であることが明らかにされた。ヘパラン硫酸PG類(そして特にパー レカン)はまた、ゲルストマン−シュトラウスラー症候群、クロイツフェルト− ヤコブ病、クールー、及び動物スクレピーのプリオン蛋白質(PrP)アミロイドプ ラークに共に局在化していた(Snow et al.，Lab．Invest．63:601-611(1990))。 特定のヘパラン硫酸PG類はアミロイド症において、1)アミロイド産生蛋白質類が 主にβ折りたたみシート構造(すなわちアミロイドを示す)に適合するのに影響を 及ぼすこと、2)アミロイド沈着の解剖学的な位置を決定すること、そして3)組織 でのアミロイドの安定性と、蛋白分解に抵抗し体がこのようにして好ましくない アミロイド沈着を適切に分解して、取り除かせないようにすることに重要な役割 を果たすと初めに仮定された(Snow and Wight，Neurobiol．Aging 10:481-497(1 989))。 種々の異なるアミロイド蛋白に関連したパーレカン及び／又はヘパラン硫酸PG の蓄積は初発的な事象であり、単に続発的で非特異的沈着を示すわけではない。 実験的な炎症関連アミロイド症においては、パーレカン発現は実際に、AAアミロ イド沈着に先行し(Ailles et al.，Lab．Invest．69:443-447(1993))、特定のPG 類のアップレギュレーションが結果として生じるアミロイド形成及び／又は沈着 に通じる初期事象かもしれないことを示唆している。以前の研究で(Snow et a1. ，Am．J．Path．137:1253-1270(1990))、ダウン症候群患者(生後1日〜51才)の脳 が、βアミロイド蛋白(Ａβ)とPGの沈着に至る事象の可能な順序を決定するため に調べられた。Ａβ免疫反応性がまったくないダウン症候群患者は、生後1日で 既に、ニューロンが顕著なヘパラン硫酸免疫反応性を示し、それは類似する老化 適合非ダウン症候群の脳では観察されなかった。18才及び24才の、もっと年長の 患者では、細胞外マトリックス中の拡散したＡβ免疫反応性(コンゴーレッド陰 性で、従って非原線維状の沈着を示唆する)が共局在化ヘパラン硫酸沈着に伴っ ていた。35才以上の患者では、原線維状Ａβは神経突起プラークで沈着し、脳血 管性アミロイド蓄積がまた、共局在化ヘパラン硫酸免疫反応性とともに観察され た。この重要な研究は、ニューロン内でのヘパラン硫酸の蓄積が結局細胞外マト リックスでのヘパラン硫酸及びＡβの共蓄積に至る初発的な事象かもしれないこ とを示した。ヘパラン硫酸とＡβ(又はその前駆体蛋白質)間の相互作用がいった ん起こると、事象が連続して発生し、原繊維形成、付着、そして結果として残留 を引き起こすことはありそうである。アルツハイマーの病でのヘパラン硫酸プロテオグリカン類の重要性 現在までに、PG類／GAG類の少なくとも四つの異なる種類が、アルツハイマー 病のＡβ含有沈着物(すなわち、神経突起プラーク、脳血管性アミロイド)に存在 することが現在示された。1988年に、ヘパラン硫酸PG類が、アルツハイマー病の アミロイド沈着物及び神経原繊維の縺れに特に存在すると発見された(Snow et a l.，Am．J．Path．133:456-463(1988))。後年、見出されたヘパラン硫酸PGの特 別な型は、“パーレカン”として知られる全分子量約800,000の大きなPGであっ た。1992年に神経突起プラークの周辺及び神経原繊維の縺れ内に存在する第二の PGが発見された。デコリンとして知られる小さいデルマタン硫酸PGである(Snow et al.，Cytochem．40:105-113(1992))。1993年にPG類の第三の種類が発見され た。すなわち、コンドロイチン硫酸で、それらはアルツハイマー病の脳の神経突 起プラークの周辺及び神経原繊維の縺れ内に存在した(DeWitt et al.，Exp．Neu rol．121:149-152(1993))。今日までに存在するコンドロイチン硫酸PGの特定の 型は未同定である。1996年に、SV2PGとして知られるケラタン硫酸PGが発見され た。それは神経突起プラークの周辺のシナプス小胞に主として局在していた(Sno w et al.，Exp．Neurol．138:305-317(1996))。 以上述べたすべての異なる特定のPG類／GAG類の内、ヘパラン硫酸PG類がアル ツハイマー病に関係するPGの最も重要な種類らしいことが、極めて明白になった 。これは、ヘパラン硫酸PG類がまだ、1)アルツハイマー病の三つのすべての特徴 的病斑(すなわち、神経突起プラーク、神経原繊維の縺れ、及び脳血管性アミロ イド沈着物)及び、2)特に神経突起プラークと脳血管性アミロイド沈着物の両方 におけるＡβ含有アミロイド原線維に免疫局在化したPGの唯一の種類であるとい う事実のためである。データは、パーレカンが、神経突起プラークのアミロイド コア内に見つかる主要なヘパラン硫酸PGであり、全てでなくても、ほとんどの中 枢神経系及び全身性アミロイドに存在するように見えることを示唆する(Snow an d Wight，Neurobiol．Aging 10:481-497(1989)を参照)。遺伝子組換え動物又は トランスフェクト細胞系統におけるパーレカンの過産生は、まだ達成されてお らず、アミロイド症の治療法を開発するための新しいモデルを開発するために必 要である。種々の細胞型によるパーレカン生産及びアミロイド症の発病における、その仮定 された役割 パーレカンはすべての基底膜上に存在し(Dziadek et al.,EMBO J．4:905-912( 1985)，Kato et al.，J．Cell Biol．106:2203-2210(1988)，Murdoch et al.，J ．Histochem．Cytochem．42:239-249(1994))、ヒト(Murdoch et al.，J．Biol． Chem．267:8544-8557(1992);Kallunki and Tryggvason，J．Cell Biol．116:559 -571(1992))及びマウス(Noonan et al.，J．Biol．Chem．266:22939-22947(1991 ))の両方から既にクローン化された。パーレカンは、内皮細胞(Kinsella and Wi ght，Biochem．27:2136-2144(1988);Saku and Furthmayr，J．Biol．Chem．264: 3514-3523(1989);Rescan et al.，Am．J．Path．142:199-208(1993))、平滑筋細 胞(Nikkari et al.，Am．J．Path．144:1348-1356(1994))、繊維芽細胞(Murdoch et al.，J．Histochem．Cytochem．42:239-249(1994);Heremans et al.，J．Ce ll Biol．109:3199-3211(1989))，上皮細胞(Morris et al.，In Vitro Cell Dev ．Biol．30:120-128(1994);Ohji et al.，Invest．Opth．Vis．Sci．35:479-485 (1994);Van Det et al.，Biochem．J．307:759768(1995)),及び滑液細胞(Dodge et al.，Lab．Invest．73:649-657(1995))等の種々のタイプの細胞により作り出 されるのが知られている。パーレカンはまた、骨髄由来細胞により合成され(Gra ssel et al.，Mol．Cell．Biochem．145:61-68(1995))、転移性黒色腫(Cohen et al.，Cancer Res．54:5771-5774(1994))、ヒト胸部の腫瘍(Guelstein et al.， Int．J．Cancer 53:269-277(1993))、及び肝臓の腫瘍(Kovalsky et al.，Acta B iomed．Ateneo Rarmense 64:157-163(1993))等の腫瘍組織に存在する。F9胎生期 癌細胞(体壁の内胚葉を形成する)及びP19胎生期癌細胞(コリン作動性ニューロン を形成する)の両方もまた、分化によって著しい高パーレカン発現及び合成を示 す(Chakravarti et al.，Dev．Dyn．197:107-114(1993);Sekiguchi et al.，J． Neurosc．Res．38:670-686(1994))。 パーレカンは、アルツハイマー病(AD)アミロイド症の発病及び中枢神経系の他 の型と全身性アミロイド症において初発的な役割を果たすたすとみなされている (Snow and Wight，Neurobiol．Aging 10:481-497(1989)を参照)。PG類のヘパラ ン硫酸の種類だけが、アルツハイマー病の脳の三つのすべての主要な病斑(すな わち、神経突起プラーク、神経原繊維の縺れ、及び脳血管性アミロイド沈着物) に、そして特にアミロイド・プラーク及びコンゴフィリック脈管症の両方におい てβアミロイド蛋白(Ａβ)含有アミロイド原線維に免疫局在化していることが見 出された(Snow et al.，Am．J．Path．133:456-463(1988);Snow and Wight，Neu robiol．Aging 10:481-497(1989);Perlmutter and Chui，Brain Res．Bull．24: 677-686(1990);Snow et al.，Am．J．Path．137:1253-1270(1990);Su et al.，N euroscience 51:801-813(1992);Van Gool et al.，Dementia 4:308-314(1993)) 。蓄積しつつある証拠は、パーレカンがアルツハイマー病におけるＡβ含有アミ ロイド沈着物内に存在する主要なヘパラン硫酸PGであり(Snow et al.，Am．J．P ath．133:456-463(1988);Snow and Wight，Neurobiol．Aging 10:481-497(1989) ;Snow et al.，Am．J．Path．137:1253-1270(1990);Snow et al.，Am．J．Path ．144:337-347(1994))、Ａβ原繊維形成、沈着、蓄積、及び残留において初発的 な役割を演じているかもしれないことを示唆する。原線維状及び非原線維状(Sno w et al.，Am．J．Path．144:337-347(1994))の両方の型で存在するＡβ沈着物 に対するパーレカンの一致する共局在は、恐らくパーレカンのＡβ(Snow et al. ，J．Neuropath．Exp．Neurol．48:352（1989）Abstract;Buee et al.，Brain R es．601:154-163(1993);Buee et al.，Brain Res．627:199-204(1993);Snow et al.，Arch．Biochem．Biophys．320:84-95(1995))及びβアミロイド前駆体蛋白 質類(Narindrasorasak et al.，J．Biol．Chem．266:12878-12883(1991))との高 い親和的相互作用によるものであろう。Ａβの残基13〜16は、パーレカン結合部 位と同定された(Snow et al.，J．Neuropath．Exp．Neurol．48:352（1989）Abs tract;Brunden et al.，J．Neurochem．61:2147-2154(1993);Snow et al.，Arch ．Biochem．Biophys 320:84-95(1995))。この領域は、ヘパリン／ヘパラン硫酸 結合共通塩基配列(Cardin and Weintraub，Arterioscl．9:21-32(1989))を含み 、Ａβ(Lys-16で)上の仮定され たα分泌酵素解裂部位に隣接する。一度結合すると、パーレカンはＡβ及び／又 はβアミロイド前駆体蛋白質類の二次構造及び／又は集合特性に影響を及ぼすと 信じられている(Fraser et al.，J．Neurochem．59:1531-1540(1992))。パーレ カンはまた、生体内に沈着する時、原線維状Ａβアミロイドを安定化させる役割 を演じるように見え(Snow et al.，Neuron 12:219-234(1994);Snow et al.，Soc ．Neurosc．Abst．21:1292（1995）Abstract)、生体外で証明されるように蛋白 分解酵素による分解からＡβを保護している(Gupta-Bansal et al.，J．Biol．C hem．270:18666-18671(1995))。上記の結果をまとめると、パーレカンは、アル ツハイマー病のＡβアミロイド症の発病のいくつかの重要な段階で現在明らかに された重要な高分子であることが示された。しかしながら、パーレカンの大きな サイズと複雑な構造のために(後述)、パーレカンを過産生する遺伝子組換え動物 又はトランスフェクト細胞の生産はまだ達成されていない。パーレカンのDNA配列及び構造 ヒト・パーレカンのDNA配列は分子量約466.564kDaの蛋白質コアをコード化し( Murdoch et al.，J．Biol．Chem．267:8544-8557(1992))、他方マウス・パーレ カンのDNA配列は分子量約396kDaの蛋白質コアをコード化している(Noonan etal. ，J．Biol．Chem．266:22939-22947(1991))。パーレカンの五つの構造的領域を 示す概念図を図1に示す。ヒト(Murdoch et al.，J．Biol．Chem．267:8544-8557 (1992);Kallunki and Tryggvason，Cell Biol．116:559-571(1992))及びマウス( Noonan et al.，J．Biol．Chem．266:22939-22947(1991))のパーレカンの遺伝子 が、クローン化され、予測されるコア蛋白は五つの異なる領域(図1)から成る。 領域Iは、提案されたヘパラン硫酸GAG付着部位を含有し、他の既知の蛋白質配列 と、いかなる類似性も示さず、パーレカンに特有である。N末端の三つのSer-Gly コンセンサス・ヘパラン硫酸GAG結合部位の位置は、既知のGAG鎖(Kokenyesi and Silbert，Biochem．Biophys．Res．Comm．211:262-267(1995))の数及び位置に 対応する。領域IIはLDL受容体に存在するLDL結合領域と相同であるが、領域III はラミニン短腕の粒−棒領域との類似性を有する。領域IVは、神経細胞付着分子 (N-CAM)と最も高い類似性を示す多数の免疫グロブリン様 反復の高度な繰り返し領域である。領域Vは、ラミニンA鎖の領域Gの反復及びA鎖 の相同物、メロシン、の相当する断片に非常に類似した三つの粒状の反復及び、 二つの表皮増殖因子様領域を有する(Noonan and Hassell，Kidney Int．43:53-6 0(1993))。従って、パーレカン・コア蛋白は他の多くの既知の蛋白質類との類似 性を有するユニークで大きい高分子である。アルツハイマー病の神経病理の擬態を試みたトランスジェニックモデル ＡＤの神経病理のいくつかまたはすべての擬態を試みるために、数多くのトラ ンスジェニック動物モデルを作成した（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、Ｎｅｕｒｏｂｉ ｏｌ．Ａｇｉｎｇ．，１７，１５３−１７１、１９９６、で考察されている）。 これらのモデルの大多数の理論的根拠は、（βＰＰ配列のすべてまたは一部分を 含む）β−アミロイド前駆体タンパク質（βＰＰ)トランスジーンの過剰生産が 、その結果起こるマウスの脳内でのＡβ沈着物の発生、さらにそれに続いて起こ るプラーク(plaque)形成およびもつれ形成を導くことができることであった。第 一のβＰＰトランスジェニック動物モデルの研究のいくつかでは（Ｗｉｒａｋら 、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３，３２３−３２５，１９９１）、ヒトのβＰＰプロモ ーターの制御下でＡβ配列を含むトランスジェニックマウス系が作成された。１ 年後、これらのマウスは、海馬神経内にＡβ沈着物を発生し、アミロイド様原繊 維の凝集を形成した。Ｑｕｏｎら（Ｎａｔｕｒｅ，３５２，２３９−２４１、１ ９９１）は、ニューロン特異的エノラーゼプロモーターに連結された全長のβＰ Ｐ−７５１配列を用いた。この構築物を持つトランスジェニックマウスは、細胞 外にＡβ免疫反応性沈着物を示す。このＡβ免疫反応性沈着物は、稀にチオフラ ビン(Thioflavin)Ｓで染色されるが、コンゴレッド(Congo red)では染色されず 、アミロイド前駆体様組成物であることが示唆される。Ｋａｗａｂａｔａら（Ｎ ａｔｕｒｅ，３５４，４７６−４７８、１９９１）は、Ｔｈｙ−１エレメント制 御下でβＰＰのＣ−末端の１００アミノ酸をコードする構築物を大量に過剰発現 するトランスジェニックマウス系を開発した。これらのマウスは、海馬内、新皮 質内および脳内でさえ、アミロイドプラーク、神経原繊維のもつれならびに神経 崩壊を含むＡＤ内で認められるそれと著しく類似する病原性を示す。非常に有望 ではあるが、Ｋａｗａｂａｔａらの報告（Ｎａｔｕｒｅ，３５４，４７６−４７ ８、１９９１）は撤回され、Ｗｉｒａｋらの研究（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３，３ ２３−３２５、１９９１）には疑問が投げかけられた（Ｊｕｃｋｅｒら、Ｓｃｉ ｅｎｃｅ，２５５，１４４３−１４４５、１９９２）。 最近では、今までに動物で認められた最も進んだ神経病理学を提示する２種類 のトランスジェニック動物モデルについての記載がある。Ｇａｍｅｓら(Ｎａｔ ｕｒｅ，３７３，５２３−５２８、１９９５）は、家族性ＡＤと関連する（残基 ７１７のバリンをフェニルアラニンによって置換した）βＰＰ−７１７変異をコ ードするヒトのβＰＰミニジーンを支配する血小板誘導増殖因子（ＰＤＧＦ）− βを用いて、トランスジェニックマウスを創り出した。これらのマウスは、チオ フラビンＳ陽性Ａβ沈着物、神経炎性プラーク、神経樹状突起連合の損失、星状 細胞増加症および小神経膠細胞症を含むＡＤの神経病理学的に主要な目印のいく つかを漸進的に作り出した。このトランスジェニック動物モデルは、これらのマ ウスの脳実質内に形成された神経炎性プラークの超微細構造を示したＭａｓｌｉ ａｈら（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃ．，１６，５７９５−５８１１、１９９６）によっ て、より詳しく研究された。脳血管アミロイド沈着も神経原繊維のもつれも、こ れまでこれらのマウスには認められなかった。 もう一つのトランスジェニック動物モデルも、最近、報告されており（Ｈｓｉ ａｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４，９９−１０２、１９９６）、そのトランスジ ェニック動物モデルでは、アルツハイマー病を早期に発病するスウェーデン人の 大家族に認められる、二重変異（Ｌｙｓ670→Ａｓｎ、Ｍｅｔ671→Ｌｅｕ）を含 むヒトβＰＰの６９５−アミノ酸イソ型を、ハムスターのプリオンタンパク質コ スミドベクター内に挿入した。これらのマウスは、皮質および辺縁構造のコンゴ レッドで染色された多数のアミロイドプラークと共に、Ａβ（１−４０）で５倍 の増加およびＡβ（１−４２／４３）で１４倍の増加を示した。これらのトラン スジェニック動物は、３ヶ月の月齢では空間認識および交代課題(alternating t ask)について、正常な学習および記憶を持っていたが、９−１０ヶ月の月齢にお いて悪化を示した。これらのマウスでは、脳血管アミロイド沈着も神経原繊維の もつれも認められなかった。 上記の最も最近のトランスジェニックモデルは、ＡＤの病因への有益な洞察を 将来もたらすことが期待でき、結局、これを用いると、ＡＤを治療する新しい治 療法を選択し同定することができるであろう。しかしながら、これらのトランス ジェニックモデルは、主要な欠点を持つ。これらのモデルは、いずれ、脳血管ア ミロイド沈着および脳の神経原繊維のもつれ形成を示すよう改良する必要がある 。このことは、これらのトランスジェニックモデルでは、ＡＤの主な神経病理の 主要な目印３つの内２つが欠けていることを示唆している（即ち、もう一つは神 経炎性プラークである）。これらのトランスジェニックモデルには、さらに考慮 しなければならない欠失要因があるのではなかろうか？ヘパラン硫酸を含むプロテオグリカンは、アルツハイマー病のアミロイドプラー クおよび神経原繊維のもつれ形成に必要なさらなる要因になりうる。 ２つのごく最近の研究（Ｇｏｅｄｅｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ，３８３，５５０− ５５３，１９９６；Ｐｅｒｅｚら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，６７，１１８３ −１１９０、１９９６）は、ヘパラン硫酸を含むｐＧｓが神経原繊維のもつれ形 成に役割を果たしうる、必要なさらなる要因であることを示唆する。一つの研究 では、Ｇｏｅｄｅｒｔら（Ｎａｔｕｒｅ，３８３，５５０−５５３、１９９６） は、インビトロで、ヘパリンおよびヘパラン硫酸の様な高硫酸化ＧＡＧｓが異な る組換えイソ型ｔａｕタンパク質を刺激すると、対合ヘリカルフィラメントを形 成することが見出された。対合ヘリカルフィラメントの形成は、ＧＡＧ−依存性 、および、リン酸化−非依存性であることが見出され、このことは、ヘパラン硫 酸ＧＡＧｓの存在が、神経原繊維のもつれ形成の重要な要因であることを示唆し ている。ヘパリンおよびヘパラン硫酸のような高硫酸化ＧＡＧｓは、対合ヘリカ ルフィラメント形成の潜在的誘導物質であるが、これに対してコンドロイチン硫 酸およびデルマタン硫酸のような低硫酸化ＧＡＧｓは、有効性はほとんどない。 ヒアルロン酸のような非硫酸化ＧＡＧｓは、如何なる対合ヘリカルフィラメント 形成も誘導せず、このことは、硫酸化が重要な要素であることを示している。ま た、Ｇｏｅｄｅｒｔら（Ｎａｔｕｒｅ，３８３，５５０−５５３、１９９６）は 、神経原繊維のもつれの出現前にはヘパラン硫酸がニューロンの細胞質内に蓄積 するという、いくつかの先に行われた仕事（Ｓｎｏｗら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ． ，１３７，１２５３−１２７０，１９９０）を、確認した。ヘパラン硫酸および コンドロイチン硫酸はまた、アルツハイマー病のもつれを持つニューロン内で（ Ｐｅｒｒｙら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃ．，１１，３６７９−３６８３、１９９１） 、および、進行性核状性麻痺のようなその他の非アルツハイマー病のもつれを持 つニューロン内で（Ｄｅｗｉｔｔら、Ｂｒ．Ｒｅｓ．，６５６，２０５−２０９ 、１９９４）、検出された。Ｐｒｅｚら（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，６７，１ １８３−１１９０、１９９６）はまた、ヘパリンが、インビトロで対合ヘリカル フィラメントとして蓄積される種々のｔａｕタンパク質フラグメントを誘導する ことも見出した。ヘパリン／ヘパラン硫酸による対合ヘリカルフィラメントの誘 導は、この特別なクラスのＧＡＧｓを含むＰＧ類が、トランスジェニック動物内 のアミロイドプラークおよび神経原繊維のもつれの両方の誘導に重要な失われた 要素であることを、示唆している。それ故、トランスジェニック動物内でのパー レカン(perlecan)（特定のヘパラン硫酸を含む−ＰＧ）の過剰発現は、アミロイ ドプラークおよび神経原繊維もつれ形成の両方を導き、その結果、アルツハイマ ー病の新規の動物モデルとして有用である。アルツハイマー病およびその他のアミロイド病内に存在するその他の共通成分 アルツハイマー病は、様々なタンパク質の発現レベル、生化学的活性および脳 組織の組織病理、ならびに罹患した個体の認識の変化を特徴とする。アルツハイ マー病と関係するそのような特徴的変化は、文献に良く報告されている。本明細 書中で討議される最も顕著な変化は、アミロイドプラーク内でのＡβの沈着であ る（ＨａａｓｓおよびＳｅｌｋｏｅ、Ｃｅｌｌ，７５，１０３９−１０４２、１ ９９３）。また、特定のＰＧ類の他に、様々なその他の分子もまた、アルツハイ マー病のアミロイドまたは神経原繊維のもつれの重要な成分であることが知られ ており、ｔａｕタンパク質（Ｇｒｕｎｄｋｅ−Ｉｇｂａｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３，４９１３−４９１７、１９８６；Ｋｏｓ ｉｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３，４０４４−４ ０４８；Ｌｅｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１，６７５−６７８、１９９１）およ びアポリポタンパク質Ｅ（Ｃｏｒｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６１，９２１− ９２３、１９９３；Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，８０９８−８１０２、１９９３）、α1−抗キモト リプシン（Ａｂｒａｈａｍら，Ｃｅｌｌ，５２，４８７−５０１、１９８８）、 アミロイドＰ成分（Ｃｏｒｉａら、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，５８，４５４−４ ５８、１９８８）、ユビキチン（Ｍｏｒｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５，１６４ １−１６４４、１９８７）、サイトカイン（ＭｃＧｅｅｒら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｎｅ ｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．，１６，５１６−５２７、１９８９；レビュー、Ｒｏｎｇｅ ｒｓ，ＣＮＳ Ｄｒｕｇｓ，４，２４１−２４４、１９９４）、増殖因子（Ｈｅ ｆｔｉおよびＷｅｉｎｅｒ，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，２０，２７５−２８１、 １９８６）；Ｈｅｆｔｉら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ，１０，５１５− ５３３、１９８９；Ｋａｔｏら、Ｎｅｕｒｏｓｃ．，１２２，３３−３６、１９ ９１；Ｔｏｏｙａｍａら、Ｎｅｕｒｏｓｃ．Ｌｅｔｔ．，１２１，１５５−１５ ８、１９９１）、および補体因子（Ｅｉｋｅｎｂｌｏｏｍら、Ｖｉｒｃｈ．Ａｒ ｃｈ．Ｂ Ｃｅｌｌ Ｐａｔｈｏｌ．，５６，２５９−２６２、１９８９）が含 まれる。上記のこれらの成分のそれぞれは、新規のトランスジェニック動物およ び／またはトランスフェクトされた細胞の作成に利用することができる。上記の もう一つのアミロイドまたは神経原繊維のもつれ成分と共にパーレカンの過剰発 現もまた、（アルツハイマー病および／またはその他のアミロイド症の）アミロ イドーシスの新しいモデルおよび／またはもつれの神経病理モデルに導くことが できる。アルツハイマー病の遺伝子変異 Ａ）βＰＰ変異 ある家族は、アルツハイマー病に遺伝的にかかりやすく、全長タンパク質の７ １７位のアミノ酸の置換を結果として生ずる変異（Ｇｏａｔｅら、上記、１９９ １；Ｍｕｒｒｅｌｌら、上記、１９９１）を通して、この状態は家族性アルツハ イマー病と呼ばれる。もう一つのＦＡＤ変異は、全長のタンパク質の６７０およ び６７１位のアミノ酸の変化を含む（Ｍｕｌｌａｎら、上記、１９９２）。この 変異の一つの形では、６７０位のリジンがアスパラギンで置換され、６７１位の メチオニンがロイシンで置換されている。この変異による影響は、培養された細 胞内のＡβの生成をおおよそ７倍に増加することである（Ｃｉｔｒｏｎら、Ｎａ ｔｕｒｅ，３６０，６７２−６７４、１９９２；Ｌａｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２ ５９，５１４−５１６、１９９２）。βＰＰのアミノ酸６６９、６７０および６ ７１のさらなる変異は、βＰＰから作られるＡβの量が減少することを示した（ Ｃｉｔｒｏｎら、Ｎｅｕｒｏｎ，１４，６６１−６７０、１９９５）。アミノ酸 ６９０にＶａｌを持つβＰＰ構築物は、先端切除型のＡβの量を増加させる。 βＰＰ発現クローンは、全長のタンパク質のアミノ酸６６９、６７０、６７１ 、６９０、６９２または７１７に変異を持つように、構築されうる。アミノ酸６ ７０および６７１のＬｙｓからＡｓｎへの、およびＭｅｔからＬｅｕへの変異は 、それぞれ、時折、Ｓｗｅｄｉｓｈ変異と呼ばれる。また、βＰＰから作り出さ れるＡβの量を増加させるかまたは減少させるかのいずれかの、さらなる変異を 、アミノ酸６６９、６７０または６７１に導入することができる。アミノ酸７１ ７のいくつかの変異は、時には、Ｈａｒｄｙ変異と呼ばれている。そのような変 異は、野生型Ｖａｌ７１７コドンのＩｌｅ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、 Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｎまたはＧｌｎのコド ンへの転化を含むことができ、Ｖａｌ７１７の好ましい置換はＰｈｅである。こ れらの変異は、変異タンパク質を発現する個体が、アルツハイマー病を発病しや すくする。変異は、βＰＰの発現および／またはプロセシングに影響を与え、ア ルツハイマーの病理の方向に平衡をシフトさせる、と考えられる。アミノ酸６６ ９の変異は、野生型Ｖａｌ６６９コドンのＴｒｐコドンへの転化、または当該コ ドンの欠失を含むことができる。アミノ酸６７０の変異は、野生型Ｌｙｓ６７０ コドンのＡｓｎまたはＧｌｕコドンへの転化、または当該コドンの欠失を含むこ とができる。アミノ酸６７１での変異は、野生型Ｍｅｔ６７１コドンのコドンＬ ｅｕ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、ＧｌｕまたはＩｌｅへの転化、または当該コド ンの欠失を含むことができる。Ｌｙｓ６７０の好ましい置換は、Ａｓｎであり、 Ｍｅｔ６７１の好ましい置換は、Ｌｅｕである。これらの変異は、変異タンパク 質を発現する個体が、アルツハイマー病を発病しやすくする。 Ｂ）プレセニリン１およびプレセニリン２ １９９２年に、早期発症アルツハイマー病の原因となる座に関する証明が、染 色体１４の長腕上に報告された（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ，２５８，６６８−６７１、１９９２）。この結果は、様々なグループによって すぐに確認された。次いで、ポジショナルクローニング戦略を用いて、コード領 域変異が早期発症のアルツハイマー病に多大な影響を及ぼす、家族内に保因され た候補遺伝子（Ｓ１８２、後にプレセニリン１またはＰＳ１と再命名された）が 単離された（Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３７５，７５４−７６ ０、１９９５）。その後、次に３５より多い異なるミスセンス変異が異なる人種 を起源とする５０以上の家族のＰＳ１遺伝子内に認められた（Ｖａｎ Ｂｒｏｅ ｃｋｈｏｖｅｎ、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１１．２３０−２３２、１９９５；Ｃｌ ａｒｋら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，１１，２１９−２２２、１９９６）。報告さ れたＰＳ１遺伝子変異は、一つを除いてすべて、ミスセンス変異である。 ＰＳ１変異を持つ個体の内、病気を発症する平均年齢は、一般的にβＰＰ変異 を持つ個体のそれより早いが、無視できない重なりが存在する（ＰＳ１の年齢の 範囲は、２９から６２歳であり、βＰＰでは４３から６２歳である）。いくつか のＰＳ１遺伝子変異は、異なる人種を起源とする家族内に認められ、このことは 、独立的変異が同じヌクレオチドで起こっていることを示唆している。 ＰＳ１遺伝子は、タンパク質をコードする１０のエキソンおよび５’−非翻訳 領域をコードする２または３のさらなるエキソンを含む。ＰＳ１遺伝子の主なＲ ＮＡ転写物は、約３キロベースであり、様々なヒトの脳領域に発現する。ＰＳ１ タンパク質は、４６７アミノ酸を持ち、さらに細胞膜を８回横切ると考えられる が、その機能は未知である。 ＰＳ１遺伝子の単離後、間もなく、ＰＳ１が遺伝子ファミリーの一部分である ことが、配列相同性から明らかになった。ＰＳ１遺伝子に対する配列相同性は、 ヒト染色体１のマップ上に見出され、このことから第二のプレセニリン遺伝子、 ＰＳ２（また、ＳＴＭ２遺伝子とも呼ばれる）の存在が示唆された。ほとんど同 時に、アルツハイマー病と染色体１上のＤＮＡマーカーとの間の遺伝的関連が、 アルツハイマー病を有するＶｏｌｇａ Ｇｒｍａｎｓグループ内で検出された（ Ｌｅｖｙ−Ｌａｈａｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９，９７０−９７３、１９９５ ）。ＰＳ２遺伝子とＶｏｌｇａ Ｇｅｒｍａｎアルツハイマー病の座と連結した マーカーとは、互いに非常に近い関係にあるので、いくつかのＶｏｌｇａ Ｇｅ ｒｍａｎ家族からの罹患した個体内のＰＳ２遺伝子が配列決定され、そしてコド ン１４１のアスパラギンのイソロイシンによる置換を原因とするミスセンス変異 が同定された（Ｌｅｖｙ−Ｌａｈａｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９，９７３−９ ７７、１９９５）。第二の変異、Ｍ２３９Ｖは、早期に発症する家族性アルツハ イマー病のイタリア人の家系で同定された（Ｒｏｇａｃｖら、Ｎａｔｕｒｅ，３ ７６，７７５−７７８、１９９６）。 ＰＳ２タンパク質は、４４８アミノ酸を含み、ＰＳ１タンパク質と６７％の同 一性を示す。また、ＰＳ２遺伝子は、多くの組織内で広範囲に発現されるが、Ｐ Ｓ１より、より大規模な選択的スプライシングを示す（Ｐｒｏｈａｒら、Ｎｅｕ ｒｏｒｅｐ．，７，１６８０−１６８４、１９９６）。しかしながら、ＰＳ１お よびＰＳ２タンパク質の全体構造は、類似しており、すべてのＡＤを原因とする 変異は、２つの遺伝子間で保存されているアミノ酸をコードするヌクレオチド内 にあり、このことは、２つのタンパク質が類似した機能に供され、変異体アミノ 酸は、機能上重要なタンパク質部位に位置すると考えられる。 前述のように、パーレカンは、特定のヘパラン硫酸プロテオグリカンであり、 および、含まれる特定のアミロイドタンパク質に関係なく、すべてのアミロイド 沈着物に共通な成分である。パーレカンは、アミロイドーシスの病因に最も重要 な役割を演じ、そして様々な組織内および異なる臨床状況の中で、アミロイドの 形成、沈着、蓄積および／または持続を提供する、と考えられる。以前の動物モ デルまたは特定のアミロイドタンパク質の過剰発現は、様々なアミロイド病と関 連するいくつかの病理を稀に作り出すのみであるか、または、ヒト内に臨床的に 認められる原繊維性アミロイドとは異なる位置に原繊維性アミロイドを生成し、 このことは、様々なアミロイド病に関する可能性のある治療法をインビボで選択 することを非常に困難にしている。本発明では、ユニークな制限部位を用いて、 ７つのオーバーラップするｃＤＮＡクローンを共に連結し、マウスのパーレカン −４００ｋＤａコアタンパク質をコードする単一の１２ｋｂ ｃＤＮＡクローン を作成した。好ましい実施態様では、サイトメガロウイルスエンハンサーおよび ニワトリβ−アクチンプロモーターを利用する新規の構築物（ｐＣＡ−ＤＩ−Ｖ と称する）は、トランスフェクト細胞およびトランスジェニックマウス内でのマ ウスのパーレカン（ドメインＩ−Ｖ）の過剰発現を成功に導いた。 これらの研究では、構築物は、マイクロインジェクションのような標準的技術 を用いて、動物の胚内にまたは胚幹細胞に導入される。細胞培養物に基づくモデ ルもまた、２つの方法によって調製することができる。細胞培養物は、トランス ジェニック動物から単離されるか、または標準細胞トランスフェクション技術で 同一構築物を用いて確立された細胞培養物から調製することができる。 記載されている具体的構築物は、好ましくは、脳を含むすべての組織内でのパ ーレカンの高発現の原因となる、ニワトリのβ−アクチンプロモーターを用いて いる。しかしながら、その他のプロモーターを、以下のプロモーター:ヒトのβ ＰＰ遺伝子プロモーター、マウスのβＰＰ遺伝子プロモーター、ラットのβＰＰ 遺伝子プロモーター、メタロチオネインIII遺伝子プロモーター、メタロチオネ インＩプロモーター、ラットのニューロン特異的エノラーゼ遺伝子プロモーター 、マウスのニューロン特異的エノラーゼ遺伝子プロモーター、ヒトのβアクチン 遺伝子プロモーター、ヒトの血小板誘導増殖因子Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）鎖遺伝子プ ロモーター、ラットのナトリウムチャンネル遺伝子プロモーター、ＲＮＡポリメ ラーゼＩプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼIIプロモーター、ポリペプチド鎖伸 長因子１−αプロモーター、神経フィラメントＭプロモーター、神経フィラメン トＬプロモーター、グリアの原繊維酸性タンパク質プロモーター、プリオンタン パク質プロモーター、インスリンプロモーター、低アフィニティーの神経増殖因 子レセプター（ｐ７５）プロモーター、マウスのミエリン塩基性タンパク質遺伝 子プロモーター、ヒトの銅−亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子プロモー ター、および哺乳動物のＰＯＵドメイン調節遺伝子プロモーター：から選択して 、用いることもできる。 記載されている具体的構築物には、好ましくは、サイトメガロウイルスエンハ ンサーを用いる。しかしながら、その他のエンハンサーを、以下のエンハンサー ：イムノグロブリンκ３’−エンハンサー、λエンハンサー、ＩｇＨ ３’−エ ンハンサー、Ｔ細胞レセプターαエンハンサー、αＨＳ−２６エンハンサー、α ＨＳ−４０エンハンサー、およびラットのインスリンII遺伝子エンハンサー：か ら選択して用いることもできる。 記載されている具体的構築物では、ＣＯＳ細胞およびＰ１９細胞（レチノイン 酸処理に続いてニューロン様細胞に分化する胎生期癌細胞）の両方でパーレカン の過剰生成を導く。Ｐ１９細胞でのパーレカンの過剰生成は、分泌されるＡβレ ベルを明らかに増加させ、神経の生残を明らかに減少させる。アルツハイマー病 のスクリーニング法の例としては、パーレカントランスジェニック動物またはパ ーレカン−トランスフェクト動物細胞を、単独でまたはその他のアミロイド病共 通成分と組み合わせてのいずれかで用いて、βＰＰｓ、Ａβ、および、動物での その他の数多くのアルツハイマー病マーカーへのそれらの影響、動物の神経病理 、ならびに動物での行動変化、によって測定されるような、アルツハイマー病の 病理経過を変化させる化合物をスクリーニングする。新しいトランスジェニック 動物モデルおよびアミロイド病の動物細胞の作成は、アミロイドーシスおよびこ れらの病気と関連する臨床的発現処置に関する先導的治療薬の同定を可能ならし める、インビボでおよびインビトロでのスクリーニング手段として、用いること ができる。また、トランスフェクトされた細胞でのパーレカンの過剰生成の成功 は、パーレカンを単離するための新規手段として提供され、様々なインビトロお よびインビボでのアッセイへのパーレカンの使用は、増加する要求を満たすであ ろう。 一つの実施態様では、本発明の目的は、その細胞がパーレカンまたはその類似 体の遍在的あるいは細胞型特異的発現をコードする組換えＤＮＡ配列を含む、ト ランスフェクトされた細胞系を提供することである。特定のアミロイドタンパク 質あるいはその前駆体を過剰発現するかまたは病気とかかわるもう一つの成分を 過剰生成するトランスジェニックマウス、とパーレカントランスジェニックマウ スとの交配は、パーレカンおよび特定のアミロイドタンパク質（あるいはその前 駆体）の両方またはパーレカンおよび特定のアミロイド共通成分の両方を過剰発 現する、新しいトランスジェニックマウスの子孫を作り出すであろう。パーレカ ンおよび特定のアミロイドタンパク質（あるいはその前駆体タンパク質）の両方 またはパーレカンおよび特定のアミロイド共通成分の両方を過剰発現するこれら のトランスジェニック動物は、特定のアミロイド病と関連するより多くのまたは すべての病状を提示する新しいトランスジェニック動物の生成に導くであろう。 さらに、パーレカンを過剰発現するトランスジェニック動物を、特定のアミロイ ドタンパク質またはその前駆体を過少発現するかまたは病気にかかわるその他の 成分を過少生成する、トランスジェニック動物と交配することもできる。これら の新しい動物の作成は、様々なアミロイドーシスの病因およびそれぞれのアミロ イド病治療における薬剤の効果、の研究に有効であろう。アミロイド病には、制 限するつもりはないが、アルツハイマー病、ダウン症候群およびＤｕｔｃｈ型の アミロイドーシスによる遺伝性脳出血（これに特異的なアミロイドは、β−アミ ロイドタンパク質またはＡβと呼ばれている）、慢性の炎症と関連するアミロイ ド、悪性および家族性の地中海熱（これに特異的なアミロイドは、ＡＡアミロイ ドまたは炎症関連アミロイドーシスと呼ばれている）、多発性骨髄腫およびその 他のＢ細胞悪血質と関連するアミロイド（これに特異的なアミロイドは、ＡＬア ミロイドと呼ばれている）、糖尿病II型と関連するアミロイド（これに特異的な アミロイドはアミリンまたは膵島アミロイドと呼ばれている）、クロイツフェル ト・ヤコブ病、ゲルストマン−シュトラウスラー症候群、クル、および動物スク ラピーを含むプリオン病と関係するアミロイド（これに特異的なアミロイドは、 ＰｒＰアミロイドと呼ばれている）、長期間の血液透析および手根管症候群と関 連するアミロイド（これに特異的なアミロイドは、β2−ミクログロブリンアミ ロイドと呼ばれている）、老人性心臓アミロイドおよび家族性アミロイド多発性 神経障害（これに特異的なアミロイドは、プレアルブミンまたはトランスチレチ ンアミロイドと呼ばれている）、および甲状腺の髄様癌のような内分泌癌と関連 するアミロイド（これに特異的なアミロイドは、プロカルシトニン変異体と呼ば れる）が含まれる。 パーレカントランスジェニックマウスおよびパーレカントランスフェクト細胞 の作成を試みるにあたっての過去の主な問題の一つは、パーレカンコアタンパク 質のサイズが大きいことであった（−４００ｋＤａ）。４００ｋＤａのパーレカ ンコアタンパク質の全体をコードする単一の１２ｋｂの（マウスからの）ｃＤＮ Ａクローンの作成を可能にするユニークな戦略を開発しなければならなかった。 本発明のもう一つの目的は、オーバーラップするｃＤＮＡクローン内のユニーク な制限部位を用いて、パーレカンコアタンパク質全体をコードする単一の１２ｋ ｂ ｃＤＮＡクローンを作成するための構築戦略を開発することである。 本発明のその他の目的は、パーレカン（またはその部分）および特定のアミロ イドタンパク質（またはその前駆体）の両方、またはパーレカンおよび特定のア ミロイド共通成分の両方を過剰発現する、新しいトランスジェニック動物を作成 する方法を提供することである。これらの新しいトランスジェニック動物は、様 々なアミロイドーシスの病因およびそれぞれのアミロイド病を治療する薬剤の効 果に関する研究のために用いることができる。 本発明のその他の目的は、すべての型の組織の至る所でパーレカンを発現する ことができるか、または特定の型の組織内にパーレカンを発現することができる かのいずれかの、ユニークなプロモーター／コード配列を細胞内に持つ、トラン スジェニック動物を提供することである。これらのパーレカントランスジェニッ ク動物は、パーレカンおよび／またはその部分が、発病に、および数多くの関連 する生物学的および／または病理学的プロセスに演ずる役割を評価するために用 いることができる。 本発明のさらなる目的は、パーレカンを単独で、または特定のアミロイドタン パク質（あるいは前駆体タンパク質）と組み合わせて、またはその他のアミロイ ド共通成分を、ゲノム内にそのような構築物を組み込むトランスジェニック動物 の様々な組織内に発現する、プロモーター／コード構築物の合成および使用に関 係する。パーレカンおよび特定のアミロイドタンパク質の両方、またはパーレカ ンおよび特定のアミロイド共通成分の両方を共に発現するであろうトランスジェ ニック動物の特徴は、これらの新規の動物が異なるアミロイド病を研究するため の、およびヒトの患者の特定のアミロイドーシスを治療する医薬薬剤の効果を決 定するための、予後判定および診断手段の両方を提供することであろう。最初に 、トランスジェニック動物は、特定のアミロイド病に対する保因と関連する特定 のアミロイドタンパク質の形成、沈着、蓄積および／または維持続を阻害する能 力を持つ一つまたはそれより多くの候補化合物の同定を助ける、インビボでのス クリーニングの道具として用いることができる。 本発明のもう一つの目的は、様々なアミロイドの（生成および沈着を導く）メ カニズムおよびその所在に関する情報が得られるヒト以外のトランスジェニック 哺乳動物を提供すること、ならびに特定の組織および器官内でのそのような形成 、沈着、蓄積および／または持続を干渉または予防する能力を持つ潜在的薬剤を 試験するために必要なインビボでのモデルを提供すること、に関連する。 本発明のさらなるもう一つの目的は、マウスまたはヒト（および／またはパー レカンｃＤＮＡ配列が既知であるかまたは既知になるであろう任意のその他の種 ）のパーレカンを過剰発現する非ヒト−哺乳動物の作成に関係する。 本発明のさらなるもう一つの目的は、トランスジェジェニック技術を用いて構 築されるアルツハイマー病の動物モデルを提供することである。 本発明のさらなる目的は、アルツハイマー病の組織病理と類似した一つまたは それより多くの組織病理を提示するトランスジェニック動物を提供することであ る。 本発明のさらなる目的は、細胞培地内に一つまたはそれより多くのＡβを含む タンパク質を高レベルで発現するトランスフェクト細胞を提供することである。 本発明のさらなる目的は、脳組織内に一つまたはそれより多くのＡβを含むタン パク質を高レベルで発現するトランスジェニック動物を提供することである。 本発明のさらなる目的は、トランスジェニック動物モデルおよびトランスフェ クトされた細胞系を用いて、アルツハイマー病を治療するための潜在的薬剤のス クリーニング法を提供することである。 本発明のさらなるもう一つの目的は、細胞をトランスフェクトすることによる 、マウスおよび／またはヒト（またはパーレカンｃＤＮＡ配列が既知であるかま たは既知になるであろう任意のその他の種）のパーレカンの作成に関する。本発 明は、ＡβまたはβＰＰ（およびその構成成分）の形成、沈着、蓄積および／ま たは維持を干渉または予防する能力を持つ潜在的薬剤を試験するための細胞培養 モデルを提供する、新規の手段として提供される。さらに、これらの細胞培養物 は、インビトロおよびインビボでの様々な種々のアッセイに用いるための充分量 のパーレカンを単離するために用いることもできる。 本発明は、単独で、または、特定のアミロイドタンパク質あるいはその前駆体 を過剰生産または過小生産する、または、特定のアミロイド病にかかわるその他 の成分を過剰生産または過小生産する、その他のトランスジェニック動物または トランスフェクトされた動物細胞と組み合わせて、のいずれかで用いることがで きる。例として、パーレカンおよびアルツハイマー病のβ−アミロイド前駆体タ ンパク質のＣ−末端の９９アミノ酸の両方のトランスジーンを持つ、二重のトラ ンスジェニックマウスを作成した。これらのモデルシステムは、アルツハイマー 病およびその他のアミロイド病の治療に関する潜在的薬剤をスクリーニングおよ び評価するための、ならびに生物システム内で用いられる培地内でのパーレカン の生成に関する、インビボおよびインビトロでの新しい方法を提供する。 そのようなトランスジェニックマウスおよびトランスフェクトされた細胞を作 製し使用するためのプロセスを記載する前に、これらの発明がそのような方法お よび物質として記載される様な特定のプロセスまたは物質に限定されるものでは なく、変化させることができることを理解されたい。また、本明細書に用いられ る専門用語は、特定の実施態様を述べる目的のためのみにあり、制限するつもり はないことを、理解されたい。 本発明のユニークな特徴は、マウスのパーレカンの４００ｋＤａのコアタンパ ク質をコードする単一の１２ｋｂ ｃＤＮＡクローンを作成するために用いられ る戦略である。マウスのパーレカンの最初のｃＤＮＡクローンを、Ｅｎｇｅｌｂ ｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）癌のｍＲＮＡから調製された発現ベ クターライブラリーから、マウスのパーレカンに対するウサギ抗体でこのライブ ラリーをスクリーニングすることによって、単離した。パーレカンペプチドから のアミノ酸配列とｃＤＮＡクローンから推定される配列のそれとの正確な対合を 証明することによって、クローンの信頼性を確認した。プライマー伸長ライブラ リーを作成し、それらを存在するクローンでスクリーニングし、さらなるｃＤＮ Ａクローンを得て、パーレカンの１２ｋｂメッセージをカバーする７つのオーバ ーラップするクローンを作成した。次いで、オーバーラップ領域内の唯一の制限 部位を用いて、これらのオーバーラップするクローンを互いに連結し、パーレカ ンの〜４００ｋＤａのコアタンパク質をコードする単一の１２ｋｂ ｃＤＮＡク ローンを作成した。単一の１２−ｋｂパーレカンｃＤＮＡを、ｐＢｌｕｅｓｃｒ ｉｐｔ II ＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）の ＮｏｔＩ／ＸｂａＩ部位にクローン化して、ｐＢＳＤＩ−Ｖを創り出した。 本発明のトランスジェニックマウスのもう一つのユニークな特徴は、マウスま たはヒトのパーレカンのドメインＩからＶまでをコードする配列の前に一般的ま たは細胞特異的プロモーターを含むことに関連する。本発明のトランスジェニッ クマウスは、パーレカンコアタンパク質（任意のそれのフラグメントを含む）を 選択的に発現するトランスジェニックマウスの能力によって、その他のトランス ジェニックマウスから識別される。 本発明に関連して用いられるクローン化された組換えおよび／または合成ＤＮ Ａ配列は、生物活性を持つ折り畳み状態のプロテオグリカンをコードし、そのタ ンパク質コア骨格に結合した一つまたはそれより多くのグリコサミングリカン鎖 を含む、配列である。 発現ベクターの構築 トランスジェニックマウスおよびトランスフェクトされた細胞の作成に用いら れた好ましいｃＤＮＡクローンは、複製のためにおよびタンパク質の生成を確認 するために、適当な発現ベクター内に最初に挿入されたコード配列を含む。好ま しい実施態様では、マウスのパーレカンコアタンパク質の全長のｃＤＮＡを、マ ウスのｃＤＮＡライブラリーより単離したパーレカンのオーバーラップ部分のｃ ＤＮＡより構築した（Ｎｏｏｎａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，２ ２９３９−２２９４７、１９９１）。そのようなクローンは、ｐＢｌｕｅｓｃｒ ｉｐｔＩベクター（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅの製品）内にあり、図２Ａ−２Ｇに示 している。下記のように構築されたすべてのクローンは、シークエンシングおよ び／または制限マッピングによって、確かめられた。最初に、パーレカンのドメ インＩ、IIおよびIIIのｃＤＮＡを含むプラスミド（ｐ Ｆｒｏｎｔ Ｅｎｄ） を、クローン１９−Ｊ（−ＸｂａＩ）、クローン５４およびクローンDIIIより構 築した（図２Ｂおよび２Ｃ）。１．４キロベースのＮｏｔＩ／ＢｃｌＩ ＤＮ Ａフラグメントを、クローン１９−Ｊ（ＸｂａＩ）から単離し、そしてクローン ５４のＮｏｔＩおよびＢｃｌＩ部位内にクローン化して、クローン１９−Ｊ／５ ４を作成した（図２Ｂ）。１．８キロベースのＮｏｔＩ／ＳａｌＩ ＤＮＡフラ グメントを、クローン１９−Ｊ／５４から単離し、そしてクローンＤ IIIから単 離した３．３キロベースのＳａｌＩ／ＸｂａＩフラグメントのＳａｌＩ部位上に 連結した。得られた５．１キロベースのＮｏｔＩ／ＸｂａＩフラグメントを、ｐ ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩのＮｏｔＩおよびＸｂａＩ部位内にクローン化して、ク ローンｐＦｒｏｎｔ Ｅｎｄを作成する（図２Ｃ）。第二に、パーレカンのドメ インＩＶの大部分およびドメインＶのすべてのｃＤＮＡを含むプラスミドクロー ン（ｐ Ｂａｃｋ Ｅｎｄ）を、クローンＤＶおよびクローン１２から構築する （図２Ｄ）。クローンＤＶ内にＨｉｎｄ III部位を導入するために、Ｈｉｎｄ I IIリンカーを用いてクローンＤＶ内のＸｈｏＩ部位をＨｉｎｄ III部位で置き換 えて、クローンＤＶ ｗＨ３を作成する。クローン12から単離された３．２キロ ベースのＸｂａＩ／ＣｌａＩフラグメントを、前もってより小さいＸｂａＩ／Ｃ ｌａＩフラグメントを除去したＨ３と共にクローンＤＶのＸｂａＩ／ＣｌａＩ部 位内にクローン化した。得られたクローンを、ｐ Ｂａｃｋ Ｅｎｄと名付ける （図２Ｄ）。第三に、ＦｒｏｎｔおよびＢａｃｋ Ｅｎｄｓを、共につなぎ、パ ーレカンのコアタンパク質からドメインＩＶのＮ−末端部分の小領域を除いたコ アタンパク質の全体のｃＤＮＡを含むクローンｐＦ＋Ｂを作成する（図２Ｅ）。 ｐ Ｆｒｏｎｔ Ｅｎｄから単離された５．０キロベースのＮｏｔＩ／ＸｂａＩ フラグメントを、ｐ Ｂａｃｋ Ｅｎｄの同一制限酵素部位内にクローン化し、 ｐＦ＋Ｂを作成する（図２Ｅ）。次に、パーレカンのドメインＩＶのＮ−末端部 分の小領域のｃＤＮＡを含むプラスミド（ｐ Ｍｉｓｓｉｎｇ Ｌｉｎｋ）を、 クローン７２およびクローン７から構築する（図２Ｆ）。クローン７２から単離 した１．５キロベースのＮｏｔI／Ｈｉｎｄ IIIフラグメントおよびクローン７ から単離した２．２ｋｂのＨｉｎｄ III／ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐＢｌｕ ｅｓｃｒｉｐｔIのＮｏｔIおよびＢａｍＨＩ部位内にクローン化して、クローン ７２／７を作成する（図２Ｆ）。クローン７から単離された１９０塩基対Ｐｐｕ ＭＩフラグメントを、より小さいＰｐｕＭＩフラグメントを前もって除去し たクローン７２／７の同一制限酵素部位内に挿入する。得られたプラスミドを、 ｐ Ｍｉｓｓｉｎｇ Ｌｉｎｋと名付ける（図２Ｆ）。最後に、ｐ Ｍｉｓｓｉ ｎｇ Ｌｉｎｋ内のｃＤＮＡを、ｐＦ＋Ｂ内に挿入し、パーレカンの全長ｃＤＮ Ａを含むｐＢＳ ＤＩ−Ｖを作成する（図２Ｇ）。ｐ Ｍｉｓｓｉｎｇ Ｌｉｎ ｋから単離した２．８キロベースのＮｒｕｌ／ＢｓｓＨIIフラグメントを前もっ てより小さいＮｒｕＩ／ＢｓｓＨIIフラグメントを取り除いたｐＦ＋Ｂの同一制 限部位内にクローン化する。得られたプラスミドをｐＢＳＤＩ−Ｖと名付ける（ 図２Ｇ）。 次いで、パーレカンコアタンパク質全体をサイトメガロウイルスエンハンサー およびニワトリのβ−アクチンプロモーターの制御下で過剰発現する、発現ベク ター、ｐＣＡ−ＤＩ−Ｖを構築した（図３Ａ−３Ｃ）。この発現ベクターは、ニ ワトリのβ−アクチン遺伝子のイントロン１およびウサギのβ−グロブリン遺伝 子のイントロン３を含む。第一に、ＸｈｏＩ、Ｈｉｎｄ IIIおよびＳａｌＩ部位 を含むポリリンカーを用いて、ｐＣＡＧＧＳｎｃ（Ｆｕｋｕｃｈｉら、Ｅｘｐ． Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１２７，２５３−２６４、１９９４）のＳａｌＩ部位 の次に、Ｈｉｎｄ III制限酵素部位を加えた（図３Ａ）。ｐＣＡＧＧＳｎｃをＳ ａｌＩ消化によって直線化し、ウシの腸のアルカリホスファターゼで処理する。 ＸｈｏＩ、Ｈｉｎｄ IIIおよびＳａｌＩ部位を含むポリリンカーを、ＸｈｏＩお よびＳａｌＩで消化し、ｐＣＡＧＧＳｎｃのＳａｌＩ部位上に連結して、ｐＣＡ ＧＧｈｎｃを作り出した。これとは別に、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ（ Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）内の全長のパーレカン ｃＤＮＡを含むｐＢＳＤＩ−Ｖを、ＡｓｎＩで消化し、そしてパーレカンｃＤＮ Ａを含む１１．５ｋｂのＤＮＡフラグメントを単離する（図３Ｂ）。ＡｓｎＩ、 ＮｈｅＩおよびＳｆｕＩ部位を含むポリリンカーをＡｓｎＩで消化し、そして単 離された１１．５ｋｂのＤＮＡフラグメントの同一制限酵素部位上に連結する（ 図３Ｂ）。次いで、単離されたフラグメントをＮｏｔＩおよびＳｆｕＩで消化し 、そして前もってＮｏｔＩおよびＣｌａＩで切断したｐＣＡＧＧＳｈｎｃのＮｏ ｔｌおよびＣｌａＩ部位に連結する（図３Ｃ）。ＣｌａＩはＳｆｕＩと適合する 。得られたベクターはｐＣＡ−ＤＩ−ＤＶと名付けられ；ｐＣＡ−ＤＩ−ＤＶを 用いて、トランスジェニックマウスおよび細胞の系を確立する。 もう一つの好ましい実施態様では、ヒトのパーレカンコアタンパク質の全長の ｃＤＮＡを、ヒトのｃＤＮＡライブラリーから単離したパーレカンのオーバーラ ップする部分のｃＤＮＡから構築することができる。Ｍｕｒｄｏｃｈら（Ｊ．Ｂ ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，８５４４−８５５７、１９９２）によって証明さ れたように、商品として入手可能なヒト結腸のｃＤＮＡライブラリー（ＨＬ１０ ３ｂ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈの製造品）の様なｃＤＮＡライブラリー、またはヒト繊 維芽細胞系（ＣＲＬ１２６２、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手できる）およびヒト羊膜細胞系（ＷＩＳＨ、これ もまたＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎか ら入手できる）から調製されたｃＤＮＡライブラリーを用いて、ヒトのパーレカ ンコアタンパク質のコード配列の全体をカバーするオーバーラップするクローン を単離することができる。当業者らに既知の任意の方法でクローン内の適当な制 限部位を用いて、これらのオーバーラップクローンを連結すると、単一のｃＤＮ Ａを形成することができる。次いで、単一の１４ｋｂのｃＤＮＡクローンをｐＣ ＡＧＧＳまたはｐＣＡＧＧＳｈｎｃのマルチプルクローニング部位内にクローン 化して、ヒトのパーレカンの発現ベクターを創り出す。発現ベクターは、ｐＣＡ ＧＧＳまたはｐＣＡＧＧＳｈｎｃに限定されない。事実、下に列挙したプロモー ター（または当業者らによって適当と考えられる任意のその他のプロモーター） を含む任意のその他の発現ベクターを用いることができ、これらの発現ベクター の構築は、当業者らに既知の任意の様式で成し遂げられることができる。 もう一つの好ましい実施態様では、ウシのパーレカンコアタンパク質の全長の ｃＤＮＡを、同様に構築することができ、そしてトランスジェニックマウスおよ び培養細胞内でウシのパーレカンを過剰発現するために用いることができる。例 えば、プローブとしてマウスのｃＤＮＡのいくつかの部分を用いて、ウシ腎臓の ｃＤＮＡライブラリー（ＢＬ３００１ｂ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈの製品）をスクリー ニングすることによって、ウシのパーレカンｃＤＮＡを単離することができる。 単離されたオーバーラップするクローンを、ウシのパーレカンの全体をコードす る単一のｃＤＮＡ内に連結し、次いで、当業者らに既知の任意の様式で、任意の 発現ベクター内にクローン化することができる。 プロモーター／パーレカン配列融合構築物 Ａ）トランスジーンの遍在発現を許すプロモーター 以下のプロモーターは、トランスジーンが事実上すべての組織内に高レベルで 発現することを可能にする。それ故、そのような遍在プロモーターを用いて、任 意の型のアミロイド動物モデルを作り出すことができる。構築物を作り出すため に用られ、本発明に関連してトランスジェニック動物内に挿入することができる 、そのような有益なプロモーターには、限定するわけではないが、以下に記載の プロモーターが含まれる。 β−アクチンプロモーター β−アクチンは、事実上すべての細胞に必須であり、豊富に発現される。β− アクチンプロモーターを含むｐＣＡＧＧＳ（Ｎｉｗａら、Ｇｅｎｅ，１０８，１ ９３−２００、１９９１）は、実施例１０に記載の方法に従って、マウスのパー レカンおよびβ−アミロイド前駆体タンパク質の発現ベクターを構築するために 用いられる。 ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター ＲＮＡポリメラーゼＩは、リボソームＲＮＡの合成を触媒する。それ故、この プロモーターは、赤血球を除く遍在するすべての組織内でのトランスジーンの発 現を許す。しかしながら、ＲＮＡポリメラーゼＩ転写物は、ｍＲＮＡとしてはほ とんど翻訳されない、なぜなら、それらはそれらの５’末端にトリメチルＧキャ ップを受け取ることなくトリホスフェートを残しているからである。トリメチル Ｇキャップが存在しないと、リボソームは、メッセージとしての転写物を認識し ないらしく、その結果、翻訳開始が妨害される。ＲＮＡポリメラーゼＩ転写物の ５’リーダー内へのＩＲＥＳ(Internal ribosome entry sites)の挿入は、ＲＮ ＡポリメラーゼＩプロモーター制御下で高レベルのタンパク質生産を可能にする （Ｐａｌｍｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２１，３４５１−３ ４５７、１９９３）。ＩＲＥＳを持つそのようなＲＮＡポリメラーゼプロモータ ーは、プラスミドｐＭＥＮＡ（Ｐａｌｍｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒ ｅｓ．，２１，３４５１−３４５７、１９９３）から入手できる。 ＲＮＡポリメラーゼIIプロモーター ＲＮＡポリメラーゼは、遺伝子からのＲＮＡ転写物の合成を触媒し、それ故、 そのプロモーターは、赤血球を除いてトランスジーンの遍在発現を許す。ＲＮＡ ポリメラーゼIIプロモーターはｐＨＢII ＣＡＴｍ内にクローン化されている（ Ａｈｅａｒｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，１０６９５−１０７０５ 、１９８７）。 ポリペプチド鎖伸長因子１−αプロモーター ポリペプチド鎖伸長因子１−α（ＥＦ−１−α）は、アミノアシル−ｔＲＮＡ のリボソームへのＧＴＰ−依存性結合を促進する。ＥＦ−１−αは、真核生物細 胞内では最も豊富なタンパク質の一つであり、哺乳動物細胞のすべての種類の内 で発現する。ＥＦ−１−αプロモーターを含む発現ベクターとしては、ｐＥＦ− ＢＯＳが構築され、強力な遍在プロモーターが存在することが証明されている（ ＭｉｚｕｓｈｉｍａおよびＮａｇａｔａ、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．， １８，５３２２、１９９０）。 Ｂ）特定の組織への発現を制限するプロモーター また、その他の有益なプロモーターを用いて、アミロイド病を擬態した新しい トランスジェニック動物の最終的開発に、有用に提供することのできるパーレカ ンのトランスジェニック動物を作り出すこともでぎる。また、構築物を作り出す ために用いられ、本発明に関連するトランスジェニック動物内に挿入することの できる、いくつかの有用なプロモーターには、限定するわけではないが、以下の プロモーターが含まれる。 血小板−誘導増殖因子（ＰＤＧＦ）プロモーター 最近、このプロモーターを用いて、β−アミロイド前駆体タンパク質を過剰発 現し、細胞外位置に原繊維性β−アミロイドタンパク質沈着物を沈積させる、ト ランスジェニックマウスが作成された（Ｇａｍｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３７３， ５２３−５２７、１９９５）。パーレカンの発現をＰＤＧＦプロモータ−によっ て指令すれば、生じるトランスジェニックマウスは、アルツハイマー病およびダ ウン症候群（即ちβ−アミロイドタンパク質）アミロイドーシスのトランスジェ ニックマウスモデルの最終的開発に、より役立つであろう。ＰＤＧＦ−β鎖プロ モーターを含むプラスミドｐｓｉｓＣＡＴ６ａは、入手可能である（Ｓａｓａｈ ａｒａら、Ｃｅｌｌ，６４，２１７、１９９１）。 神経フィラメントＭまたはＬプロモーター これらのプロモーターは、高レベルの発現を示し、最も豊富な神経タンパク質 と関連して見出される。それらは、中枢神経系／末梢神経系神経−特異的発現を 特徴とする。このプロモーターのマウス遺伝子は、公表された配列であるが、本 発明に関連してこのプロモーターを用いるためには、プロモーター領域の単離が 必要である。神経フィラメントＬプロモーター（Ｂｅｇｅｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，９０４２−９０４６、１９９０ ）およびＭプロモーター（Ｂｅｇｅｍａｎｎら、Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ．Ｒｅｓ． ，１５，９９−１０７、１９９２）の特徴が調べられており、入手も可能である 。 神経膠原繊維性酸性タンパク質(Glial Fibrillary Acidic Protein)（ＧＦＡＰ ）プロモーター そのようなプロモータ−は、マウス特異性およびＣＮＳ／ＰＮＳ神経膠−特異 的発現を特徴とする。プロモーターはその特徴が調べられ、入手も可能である（ Ｂａｌｃａｒｅｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３，５５２７ −５５４３、１９８５）。 メタロチオネインＩＩＩ（ＭＴ−ＩＩＩ）プロモーター ＭＴ−ＩＩＩは、メタロチオネイン遺伝子ファミリーの第三の構成員であり、 その発現は、マウスの脳に制限されると考えられる。ＭＴ−IIIは、ヒトの脳内 に豊富に存在し、免疫組織化学的には、灰白質内の星状細胞に位置する（Ｕｃｈ ｉｄａら、Ｎｅｕｒｏｎ，７，３３７−３４７，１９９１）。アルツハイマー病 の皮質内では、ＭＴ−ＩＩＩ陽性星状細胞の数が劇的に減少し、この減少は、神 経原繊維のもつれおよび縮れた繊維の豊富さと高度に関連する（Ｕｃｈｉｄａら 、Ｎｅｕｒｏｎ，７，３３７−３４７、１９９１）。アルツハイマー病内に認め られるようなβ−アミロイドタンパク質アミロイドーシス内での星状細胞の関わ り合いは、以前から示唆されていた（Ｐｏｔｔｅｒら、Ｐｒｏｇ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，９４，４４７−４５８、１９９２）。ＭＴ−ＩＩＩプロモーターはク ローン化され、その特徴が調べられている（Ｐａｌｍｉｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎ ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，６３３３−６３３７、１９９２）。 プリオンタンパク質プロモーター このプロモーターは、マウス脳内で、位置−非依存性、コピー数依存性のトラ ンスジーン生成物発現を指令することが示された（Ｓｃｏｔｔら、Ｃｅｌｌ，５ ９，８４７−８５７、１９８９；Ｐｒｕｓｉｎｅｒら、Ｃｅｌｌ，６３，６７３ −６８６、１９９０）。このプロモーターは、また、β−アミロイド前駆体タン パク質を過剰発現するトランスジェニックマウスを創り出すために用いられた（ Ｈｓｉａｏら、Ｎｅｕｒｏｎ，１５，１２０３−１２１８、１９９５）。 インスリンプロモーター インスリンプロモーターは、糖尿病II型の患者内に認められるような膵島アミ ロイドーシスを擬態するトランスジェニックマウスモデルを開発するために用い ることができる（Ｖｅｒｃｈｅｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ．ＵＳＡ，印刷中、１９９６）。インスリンプロモーターを用いると、β−細胞 内でトランスジーンの特異的発現を達成することができる（Ｓａｒｖｅｔｎｉｃ ｋら、Ｃｅｌｌ，５２，７７３−７８２、１９８８）。ヒトのインスリンプロモ ーターは、その特徴が調べられ、入手も可能である。 神経−特異的エノラーゼプロモーター このプロモーターは、トランスジェニックマウス内のレポーター遺伝子の神経 −特異的発現に関係し（Ｆｒｏｓｓ−Ｐｅｔｔｅｒら、Ｎｅｕｒｏｎ，５，１８ ７−１９７、１９９０）、そしてβ−アミロイド前駆体タンパク質を過剰発現す るトランスジェニックマウスを作成するために用いられた（Ｑｕｏｎら、Ｎａｔ ｕｒｅ，３５２，２３９−２４１、１９９１）。 低アフィニティー神経増殖因子レセプター（ｐ７５）プロモーター ｐ７５は、主に中枢および末梢のコリン作動性ニューロンで発現する。ｐ７５ プロモーターの活性は、培養されたニューロン内で試験されている（Ｔａｉｊｉ ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１２，２１９３−２２０２、１９９２）。 脳内のコリン作用ニューロンの損失は、アルツハイマー病の重要な形態を表して いるので、このプロモーターは、そのようなモデルの創造に有用である。 メタロチオネインＩプロモーター このプロモーターを用いて、家族性アミロイドーシス多発性神経障害Ｉ型の可 能なモデルとして、ヒトのトランスチレチンの変異体型を創り出すトランスジェ ニックマウスが創り出されている（Ｙｉら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．，１３８，４ ０３−４１２、１９９１）。これらのマウスは、胃腸管、心臓血管系および腎臓 内にアミロイド沈着を進行させるが、ヒトにおいてアミロイド沈着の起こる末梢 神経系では、アミロイド沈着が進行しない。それ故、このプロモーターは、プレ アルブミン／トランスチレチンアミロイドーシスの新規動物モデルとして、パー レカントランスジェニックマウス、および／または、パーレカンおよびトランス チレチンの両方を過剰発現するパーレカントランスジェニックマウスの作成に有 効であることができる。 組織特異的であるその他の既知のプロモーターもまた、特定の器官システムに 影響を与えるアミロイドーシスの動物モデルを作成するために用いることができ る。当業者らは、そのようなプロモーターを、用いることができる。さらに、ま た、当業者らによって用いられうる新しいプロモーターも入手できるようになり 、アミロイドトランスジェニックマウスの最終的生成物を好ましい組織および器 官内で発現するように指令することができる。 本発明の様々な実施態様の活性に実質的な影響を与えない修飾は、また、ここ に提供される本発明の定義内に含まれる。従って、以下の実施例は、本発明を説 明するためのものであって、制限的なものではない。 実施例１ ＣＯＳ細胞とＰ１９細胞におけるネズミパーレカンのドメインＩ−Ｖの発現 哺乳動物細胞におけるネズミパーレカンの発現を促進するために、ｐＣＡ−Ｄ Ｉ−Ｖと呼ばれる発現ベクターをアフリカ緑サルの腎臓細胞系統（ＣＯＳ）と、 適当量のレチノイン酸によって刺激すると、ニューロン様細胞に分化する胚性癌 細胞（Ｐ１９細胞）とにトランスフェクトした。このトランスフェクションはリ ポソーム仲介遺伝子トランスファー（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの製品）によって製造者のプロトコールに従っておこ なった。Ｇ４１８耐性を与えるネオマイシン耐性遺伝子もｐＣＡ−ＤＩ−Ｖベク ４ターと共にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞をＧ４１８に よってスクリーニングすることによって、各細胞系統（ＣＯＳ細胞とＰ１９細胞 ）の２０クローンを単離して、ウェスタン・ブロット分析を受けさせて、パーレ カン発現レベルを測定した。さらに正確には、ＣＯＳ−７細胞（アフリカ緑サル 腎臓細胞系統；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅ ｃｔｉｏｎから入手可能、ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１６５１）とＰ１９細胞（Ｒｕｄ ｎｉｃｋｉとＭｃＢｕｒｍｙ，Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｎｄ Ｅｍ ｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏ ａｃｈ ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９〜５０頁 （１９８７））とを、１０％ウシ胎児血清と、１００μｇ／ｍｌのストレプトマ イシンと、１００単位／ｍｌのペニシリンとを含有するＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅ ａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）（レギュラー培地）中で培養した。ＤＮＡのトランス フ ェクションの１日前に１〜２ｘ１０5細胞／６０ｍｍディッシュを接種した。培 養物から血清を除去するために、トランスフェクションの前に細胞をＯｐｔｉ− ＭＥＭ Ｉ小血清培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの製品）によって 洗浄した。３μｇのｐＣＡ−ＤＩ−Ｖと、０．１μｇのｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏ ｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．の製品）と、２０μｌのＬｉ ｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅとを混合して、室温において１５分間インキュベートし て、Ｏｐｔｉｍ−ＭＥＭ Ｉ小血清培地中で培養した細胞に加えた。ＣＯＳ−７ 細胞とＰ１９細胞とを５％ＣＯ2の湿った雰囲気中３７℃において、それぞれ、 １８時間と６時間インキュベートして、Ｏｐｔｉｍ−ＭＥＭ Ｉ小血清培地をレ ギュラー培地と交換した。トランスフェクションの２日後に、細胞を０．０５％ トリプシンと５３０μＭのＥＤＴＡとによって処理して、１０，０００細胞／１ ００ｍｍディッシュの濃度において選択培地（８００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含 むレギュラー培地）と交換した。トランスフェクションの２〜３週間後に、出現 した耐性コロニーをクローン・リング(clonal ring)を用いて単離して、保存と ウェスタン・ブロット分析のために増殖させた。各細胞系統に関して、約２０ク ローンを単離した。 実施例２ ウェスタン・ブロット分析によって表示される、トランスフェクトされたＣＯＳ 細胞とＰ１９細胞におけるパーレカン・レベルのアップ−レギュレーション トランスフェクトされたＣＯＳ細胞とＰ１９細胞対トランスフェクトされない ＣＯＳ細胞とＰ１９細胞におけるパーレカン・レベルの可能な差異を判定するた めに、培地層と細胞層とをパーレカン・コアタンパク質に対して特異的モノクロ ーナル抗体（ＨＫ−１０２）をウェスタン・ブロッティングすることによって、 分析した。各細胞培養ディッシュから、培地を分析のために以下に述べるように 回収し、トランスフェクトされた又はトランスフェクトされない細胞から等量の 培地を分析することを確実にした。細胞層は尿素緩衝剤（尿素緩衝剤は７Ｍ尿素 と、０．２Ｍ ＮａＣｌと、０．１％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳと、５０ｍＭ Ｔｒ ｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ ８．０とを含有し、１０ｍＭ ＥＤＴＡと、１０ｍＭ Ｎ ＥＭと、１０ｍＭ ６−アミノヘキサン酸と、５．０ｍＭ ベンズアミジン−Ｈ Ｃｌと、１ｍＭ ＰＭＳＦとから成るプロテアーゼカクテルを含有する）中にス クラッピングすることによって回収した。 ＣＯＳ細胞に関して、次に細胞層からのＰＧ類と培地抽出物とをＤＥＡＥ−Ｓ ｅｐｈａｃｅｌイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。簡単には、細 胞層と培地抽出物とを別々にプールし、Ｏ．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ｖ ／ｖ）を補充し、尿素緩衝剤（尿素緩衝剤は７Ｍ尿素と、０．２Ｍ ＮａＣｌと 、０．１％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳと、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ ８． ０とを含有し、１０ｍＭ ＥＤＴＡと、１０ｍＭ ＮＥＭと、１０ｍＭ ６−ア ミノヘキサン酸と、５．０ｍＭ ベンズアミジン−ＨＣｌと、１ｍＭ ＰＭＳＦ とから成るプロテアーゼカクテルを含有する）と平衡させた、プラスチック・シ リンジ中に充填した１ｍｌ ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌに塗布した。カラムを 最初に、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００と０．２５Ｍ ＮａＣｌとを含有する尿 素緩衝剤（上記）の５カラム量によって洗浄することによって、タンパク質と非 ＰＧｓとを取り出した。次に、結合ＰＧ類を３Ｍ ＮａＣｌを含有する尿素緩衝 剤の５カラム量によって溶出させた。次に、等しい割合の各サンプルを３．５量 の９５％エタノール、１．５％酢酸カリウム（ｗ／ｖ）を加えることによって沈 降させ、ドライアイス上で１時間冷却し、１４，０００Ｘｇにおいて２０分間遠 心分離した（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ５４１５Ｃデスクトップ遠心分離機を使用）。 次に、サンプルを消化させずに残したか、又はヘパリナーゼ／ヘパリチナーゼ及 び／又はコンドロイチナーゼＡＢＣによって消化させた。ヘパリナーゼ／ヘパリ チナーゼ消化に関しては、サンプルを５０μｌの０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、 ５ｍＭ 酢酸カルシウム（ｐＨ７．０）中に懸濁させ、３０μｌのグリセロール ：蒸留水（１：１）中で各１Ｕ（約１０ｍＵ／μｇタンパク質）において用いた ヘパリナーゼＩ、ＩＩ及びＩＩＩ（即ち、ヘパリチナーゼ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈ ｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）の混合物によって消化させた。１０μｌの１０Ｘプロテ アーゼ阻害剤カクテル（上記と同様）を添加した後に、ヘパリナーゼ／ヘパリチ ナーゼ含有サンプルを４１℃において一晩インキュベートし、エタノール沈降さ せてから（上記と同様）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離させた。コンドロイチ ナーゼＡＢＣ処理したサンプルをＴｒｉｓ緩衝化溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５ ０ｍＭ酢酸ナトリウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、及び上述したようなプロテアーゼ 阻害剤カクテル、ｐＨ７．５）中の１００ｍＵのコンドロイチンＡＢＣリアーゼ （ＩＣＮ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）によって３７℃において２時間、消化さ せた。次に、各サンプルを沸騰する水浴中で５分間加熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上 に負荷させ、予備染色した(pre-stained)分子量タンパク質標準（Ｂｉｏ−Ｒａ ｄの製品）と共に１００Ｖにおいて４５分間電気泳動した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは Ｌａｅｍｍｌｉの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２２７：６８０〜６８５（１９７０）） に応じて、プレキャスト(precast)４〜１５％ポリアクリルアミドゲルを含むＭ ｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ ＩＩ電気泳動系を用いておこなった。サンプルをパー レカン・コアタンパク質に対するモノクローナル抗体（ＨＫ−１０２）と共に用 いるために非還元性条件下で泳動させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に、分離したタン パク質をＭｉｎｉトランスブロット電気泳動輸送セル(Mini transblot electrop horesis transfer cell)を用いてニトロセルロースに移した。エレクトロトラ ンスファー(electrotransfer)は１００Ｖにおいて２時間実施した。トランスフ ァー後に、膜を水中ですすぎ洗いし、０．１５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン 、１％（ｖ／ｖ）正常ヤギ血清、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ及び３ｍＭ Ｎ ａＮ3（ｐＨ７．４）によって一晩ブロックした。１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ ｌと、５０ｍＭ ＮａＣｌと、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０と、３ｍＭ ＮａＮ3 （ｐＨ ７．４）とを含有するＴＢＳ（ＴＴＢＳ）中で１：３０００に希釈し た、パーレカン・コアタンパク質を認識するモノクローナル抗体（ＨＫ−１０２ ）によって、ブロットを検査した。ブロットを一次抗体(primary antibody)と共 に３時間インキュベートし、ＴＴＢＳによって３回（各１０分間）洗浄した後に 、ＴＴＢＳによって１：１０００に希釈したビオチニル化ヤギ抗ラットＩｇ（Ｉ ｇＧとＩｇＭ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅｎ，ＰＡ）中で１時間インキュベーションした。次に、膜をＴＴＢＳ によって３回（各１０分間）洗浄し、アビジンアルカリホスファターゼ・コンジ ュゲート（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ）によって３０分間検査し、再びリンスした（ 前記と同様）後に、アルカリホスファターゼ基質溶液（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ） を 添加した。発色後に、膜を二重蒸留水によってフラッシュすることによって、反 応を停止させた。再現性を判定するために、モノクローナル（ＨＫ−１０２）抗 体を用いたパーレカン・コアタンパク質の免疫検出(immunodetection)を少なく とも３回の異なる細胞培養実験に用いた。比較のために、パーレカンをＥｎｇｅ ｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ腫瘍から既述したように（Ｃａｓｔｉｌｌ ｏ等，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２０：４３３〜４４４（１９９６））単離させ、 ヘパリナーゼＩ、ＩＩ及びＩＩＩ（上記と同様）によって消化させてから、ウェ スタン・ブロッティングした。 図４に示すように、非トランスフェクトＣＯＳ細胞の細胞層から単離したＰＧ 類のウェスタン・ブロット分析は、パーレカン・コアタンパク質を認識するモノ クローナル抗体（ＨＫ−１０２）によって検査したところ、ウェスタン・ブロッ トに対する免疫反応性を実証しなかった（図４、レーン１と３）。他方では、全 パーレカン・コアタンパク質を過剰発現したトランスフェクトＣＯＳ細胞の細胞 層から単離されたＰＧ類のウェスタン・ブロット分析は、パーレカン・コアタン パク質に対して特異的なモノクローナル抗体（ＨＫ−１０２）を用いた場合に、 〜４００ｋＤａ帯を明らかにした（図４、レーン２とレーン４）。コンドロイチ ナーゼＡＢＣ消化は、非消化サンプルと比較した場合に（図示せず）、トランス フェクト細胞の細胞層に〜４００ｋＤａ帯においてシフトを生じないように思わ れ、このことは生成したパーレカン・コアタンパク質上にコンドロイチン硫酸鎖 が殆ど又は全く存在しないことを示唆した。他方では、ヘパリナーゼ／ヘパリチ ナーゼ消化後のトランスフェクト細胞の細胞層（図４、レーン４）では、非消化 サンプルと比較した場合に（図４、レーン２）、軽度のシフト及び／又はより緊 密な(tighter)〜４００ｋＤａ帯が観察され、トランスフェクト細胞の細胞層中 で生成したパーレカン・コアタンパク質が正常よりも短い又は少ない数のヘパリ ン硫酸鎖を含有することを示唆した（即ち、パーレカンは通常、そのコアタンパ ク質に結合した３つのグリコサミノグリカン鎖を含有すると考えられる）。トラ ンスフェクトＣＯＳ細胞の細胞層からのイムノブロット上のパーレカン・コアタ ンパク質帯（図４、レーン２と４）は、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗ ａｒｍ腫瘍から単離された純粋なパーレカンの位置（図４、レーン５）と、位置 において類似した。しかし、単離されたパーレカンは〜４００ｋＤａに特徴的な 二重線を生じた（図４、レーン５）が、トランスフェクトＣＯＳ細胞からの細胞 層は〜４００ｋＤａに単一の主要な帯を示した（図４、レーン２とレーン４）。 同様な結果は、非トランスフェクトＣＯＳ細胞（図５、レーン１と３）とトラ ンスフェクトＣＯＳ細胞（図５、レーン２と４）の培地から単離したＰＧ類のウ ェスタン・ブロット分析（図５）によって、パーレカン・コアタンパク質に対し てモノクローナル抗体（ＨＫ−１０２）によって検査したときに、得られた。パ ーレカン・コアタンパク質免疫反応性の顕著な累積が、非トランスフェクト細胞 （図５、レーン１と３）に比べて、トランスフェクトＣＯＳ細胞（図５、レーン ２と４）には観察された。コンドロイチナーゼＡＢＣ消化は、トランスフェクト ＣＯＳ細胞の培地から単離された〜４００ｋＤａ帯に、非消化サンプル（図５、 レーン２）に比べた場合に、シフトを生じなかった（図５、レーン４）、このこ とは分泌されたパーレカン・コアタンパク質にコンドロイチン硫酸鎖が殆ど又は 全く存在しないことを示唆した。他方では、ヘパリナーゼ／ヘパリチナーゼ消化 後のトランスフェクト細胞の培地では、トランスフェクト培地からの非消化サン プルと比較した場合に（図示せず）、軽度のシフト及び／又はより緊密な〜４０ ０ｋＤａ帯が観察され、このことは、トランスフェクト細胞の培地中で生成した パーレカン・コアタンパク質が正常よりも短い又は少ない数のヘパリン硫酸鎖を 含有することを示唆した。トランスフェクトＣＯＳ細胞の培地からのイムノブロ ット上のパーレカン・コアタンパク質帯（図５、レーン２と４）は、純粋なパー レカンから得られた位置（図５、レーン５）と、位置において類似し、トランス フェクトＣＯＳ細胞からの培地では〜４００ｋＤａにおいて同様な、特徴的な二 重帯が観察された（図５、レーン２とレーン４）。 単離のためにＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌにパーレカンが結合したという事実 は、パーレカンがグリコサミノグリカン鎖を含有した可能性が大きいことを意味 した。トランスフェクトＣＯＳ細胞からの培地と細胞層の両方のウェスタン・ブ ロット上の〜４００ｋＤａコアタンパク質の位置にヘパリナーゼ／ヘパリチナー ゼ消化が軽度なシフトを生じたが、コンドロイチナーゼＡＢＣは生じなかったの で、このことは、ヘパリン硫酸ＧＡＧ鎖（正常より長さが短く、数が少ないが） がトランスフェクト細胞のパーレカン・コアタンパク質上に存在したことを示唆 した。それにも拘わらず、この研究は、全パーレカン・コアタンパク質の有効な トランスフェクションが達成されており、全〜４００ｋＤａコアタンパク質を過 剰発現するパーレカン・トランスジェニック・マウスを開発するための最初の重 要な決定的工程を表すことを初めて示す。 Ｐ１９細胞に関しては、細胞層及び培地からのＰＧ類の単離と、上述したよう なＳＤＳ−ＰＡＧＥとの後に、タンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅの 製品）に、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｔｒａｎｓｂｌｏｔ系を用いて２６０ｍＡにおいて １８時間かけて移した。これらの膜を、５％脱脂ドライミルク（ｗ／ｖ）と、０ ．０２％アジ化ナトリウムと、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０とを含有するＰＢＳに よってブロックし、一次抗体（パーレカン・コアタンパク質を認識するポリクロ ーナル又はモノクローナル抗体）と共に４°において１８時間インキュベートし 、強化された化学発光系（Ａｍｅｒｓｈａｍの製品）によって免疫染色した(imm unostained)。トランスフェクトＣＯＳ細胞におけるパーレカン・コアタンパク 質の過剰発現によって見い出されるように、Ｐ１９細胞層と培地のウェスタン・ ブロット分析はトランスフェクト細胞における高レベルのパーレカン産生を明ら かにしたが、非トランスフェクト細胞は免疫反応性を殆ど〜全く示さなかった（ 図示せず）。これらの研究は、本発明において用いた構築方法(construction st rategy)によって、トランスフェクトされたＣＯＳ及びＰ１９細胞においてパー レカン・コアタンパク質の過剰発現が達成されうることを実証した。 実施例３ パーレカンとβＰＰ−６９５の両方を過剰発現する、Ｐ１９細胞の培地における 分泌Ａβのアップ−レギュレーション Ｐ１９由来細胞クローンは既に確立され、Ｐ１９ ６９５Ｂ２と呼ばれており 、これはヒトβ−アミロイド前駆体タンパク質の６９５アミノ酸アイソフォーム （βＰＰ−６９５）を過剰発現する（Ｆｕｋｕｃｈｉ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅ ｍ．６６：２２０１〜２２０４（１９９６））。この実施例では、Ｐ１９ ６９ ５Ｂ２細胞をｐＣＡ−ＤＩ−Ｖベクターによってトランスフェクトし、パーレカ ンとβＰＰ−６９５の両方を過剰発現する、Ｐ１９ ６９５Ｂ２ ＰＣＢ６及び Ｐ１９ ６９５Ｂ２ ＰＣＤ３と名付けられた安定な形質転換体が実施例１に述 べた方法を用いて確立された。βＰＰとパーレカンとの過剰発現が実施例２にお けるようなウェスタン・ブロッティングによって確認された。 Ｐ１９ ６９５Ｂ２ Ｄ３におけるパーレカンの過剰発現がパーレカン・タン パク質産生の増加を生じたことを実証するために、パーレカンを単離し、実施例 ２で述べたようにヘパリチナーゼ及び／又はコンドロイチナーゼＡＢＣ予備処理 （ヘパラン硫酸及び／又はコンドロイチン／デルマタン硫酸ＧＡＧ類をそれぞれ 分解するため）の存在又は不存在下でのウェスタン・ブロッティングによって実 施例２に述べたように分析した。図６に示すように、βＰＰ−６９５のみを過剰 発現するＰ１９細胞（即ち、Ｐ１９ ６９５Ｂ２）は細胞溶解物(cell lysate) 又は培地中の検出可能なパーレカンを実証しなかった。他方では、パーレカンと βＰＰ−６９５の両方を過剰発現するＰ１９細胞（即ち、Ｐ１９ ６９５Ｂ２Ｐ Ｃ Ｄ３）は、特異的パーレカン・ポリクローナル抗体を用いたウェスタン・ブ ロットによって実証されるように（図６）、細胞溶解物と培地の両方においてパ ーレカン・タンパク質の顕著な増加を実証した。細胞パーレカンは特異的パーレ カン抗体を用いて〜４００ｋＤａ帯又はスミア(smear)として同定された（図６ ）。ヘパリチナーゼ消化（ヘパラン硫酸ＧＡＧ鎖を除去するため）は細胞パーレ カンの免疫検出をごく僅かに増加させ、このことは細胞パーレカンが全長ヘパラ ン硫酸ＧＡＧ鎖を欠失している可能性があることを示唆する。他方では、培地か ら単離されたパーレカンの〜４００ｋＤａ帯はヘパリチナーゼ処理及びヘパリチ ナーゼ／コンドロイチナーゼＡＢＣ処理後にのみ可視化され（図６、矢印）、こ のことは、これらの細胞で産生された分泌パーレカンがヘパラン硫酸ＧＡＧ鎖を 有することを示した。したがって、Ｐ１９細胞におけるパーレカンの過剰発現は 、比較的多量のパーレカン単離のために有用な培地中へのパーレカンの過剰産生 を生じる。 Ｐ１９細胞におけるβＰＰレベルとＡβレベルに対するパーレカン過剰発現の 可能な影響を判定するために、パーレカンとβＰＰ−６９５の両方を過剰発現す るＰ１９細胞（即ち、Ｐ１９ ６９５Ｂ２ ＰＣ Ｂ６とＰ１９ ６９５Ｂ２ ＰＣ Ｄ３）の培地と細胞層と、βＰＰ−６９５のみを過剰発現する細胞（即ち 、Ｐ１９ ６９５ Ｂ２ ＰＣ）とを、免疫沈降とその後の特異的抗体（ヒトＡ βを認識する６Ｅ１０と、βＰＰのＣ末端を認識する６５６１）によるウェスタ ン・ブロッティングによって比較した。全ての細胞（Ｐ１９ ６９５Ｂ２、Ｐ１ ９ ６９５Ｂ２ ＰＣ Ｂ６、及びＰ１９ ６９５Ｂ２ ＰＣ Ｄ３）を、既述 されたように（Ｆｕｋｕｃｈｉ等，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５８：１８６３〜 １８７３（１９９６））レチノイン酸による処理によって誘導して、ニューロン に分化させた。分化の８日目に、培地を回収して、１２，０００Ｘｇにおいて１ 時間遠心分離して、上澄み液を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ −４０、０．５％コール酸、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５ｍ Ｍ ＥＤＴＡ，２μｇ／ｍｌロイペプチン及び０．１μｇペプスタイン（ｐＨ８ ．０）となるように処理した。５０μｌのタンパク質Ａ−アガロース（マウスＩ ｇＧに対するウサギ抗体に予め結合）によって予備吸収させた後に、培地を一次 抗体６Ｅ１０及び４０μｌのタンパク質Ａ−アガロース（上述したように前処理 ）と共に１６時間インキュベートした。沈降物を１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０ 、５ｍＭ ＥＤＴＡ、２μｇ／ｍｌロイペプチン、２ｍＭフェニルメチルスルホ ニルフルオリドを含有するＴＢＳによって３回洗浄し、２０μｌの２ＸＬａｅｍ ｍｌｉ緩衝剤中で５分間沸騰させてから、７．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲ ル（高分子量帯を検出するため）又は１６．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル （低分子量帯を検出するため）上に負荷させた。２ＸＬａｅｍｍｌｉ緩衝剤（１ Ｘ＝６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、１０％グリセ ロール、５％ ２−メルカプトエタノール、０．００１％ブロモフェノールブル ー）を加えて、細胞を溶解し、５分間沸騰させ、２６ゲージ針によって剪断した 。タンパク質濃度をＢｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒ ａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの製品）によって測定した。３０μｇのタンパ ク質に相当するアリコートを７．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動 （ＰＡＧＥ）とＴｒｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅ １６．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥのため に使用した。電気泳動後に、タンパク質をポリビニリジンジフルオリド（ＰＶＤ Ｆ）膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅの製品）にエレクトロト ランスファーした(electrotransferred)。この膜を５％脱脂ドライミルク（ｗ／ ｖ）、０．０２％アジ化ナトリウム及び０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するリ ン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）によってブロックして、６５６１抗体（βＰＰ− ６９５のアミノ酸６８１〜６９５を認識する）又は６Ｅ１０抗体（ヒトＡβを認 識する）と共に４℃において１６時間インキュベートして、強化化学発光系（Ａ ｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏ．の製品）によって免疫染色した。タンパク質の相対濃度 をデンシオメトリツク・スキャニング(densitometric scanning)（Ｍｏｌｅｃｕ ｌａｒ Ａｎａｌｙｓｔ／ＰＣ、Ｂｉｏ−Ｒａｄの製品）によって測定した。 図７に示したように、βＰＰはβＰＰ−６９５を過剰発現するトランスフェク トＰ１９細胞（即ち、Ｐ１９ ６９５Ｂ２）の細胞溶解物と培地の両方中で、６ ５６１又は６Ｅ１０抗体を用いたウェスタン・ブロット後に、〜１００キロダル トン及び１３０キロダルトン（矢印）における個別の帯又はスミア帯(smeared b and)として明白であった。他方では、パーレカンとβＰＰ−６９５の両方を過剰 発現するトランスフェクトＰ１９細胞（即ち、Ｐ１９ ６９５Ｂ２ ＰＣ Ｂ６ とＰ１９ ６９５Ｂ２ ＰＣ Ｄ３）では、培地中のβＰＰレベルの〜４倍の上 昇が明らかであった（図７）。Ｐ１９ ６９５Ｂ２ ＰＣ Ｄ３細胞クローンは 細胞溶解物中のβＰＰレベルも〜４倍の上昇を実証した。これらの研究は、パー レカンとβＰＰ−６９５の両方の過剰発現がＰ１９細胞の培地と細胞層とにおけ るβＰＰレベルを、βＰＰ−６９５のみを過剰発現するＰ１９細胞に比べて、顕 著に上昇させることを示す。それ故、パーレカンの過剰発現はβＰＰ代謝とレベ ルとの変化の一因であると考えられる。 培地と細胞の両方におけるβＰＰレベルの上昇に対する影響の他に、パーレカ ンの過剰発現は培地中へのＡβ分泌をも顕著に増加させた。図８に示すように、 ６Ｅ１０抗体を用いるウェスタン・ブロット分析は、βＰＰ−６９５のみを過剰 発現する細胞（即ち、Ｐ１９ ６９５Ｂ２）から培地へのＡβを殆ど検出しなか った（図８）。他方では、パーレカンとβＰＰ−６９５の両方の過剰発現（即ち 、Ｐ１９ ６９５Ｂ２ ＰＣ Ｂ６とＰ１９ ６９５Ｂ２ ＰＣ Ｄ３）は培地 におけるＡβの顕著な増加を生じた（図８、矢印）。分泌Ａβを細胞βＰＰ及び 分泌βＰＰのレベルに標準化した場合には、パーレカンとβＰＰ−６９５の両方 を過剰発現するＰ１９細胞における８〜１０倍の上昇が実証された（図９）。こ れらの結果は、パーレカンの過剰発現が分泌Ａβレベルを上昇させることを示す 。 実施例４ パーレカンの過剰発現はＰ１９由来ニューロンの変性を生じる ニューロン生残率(neuronal survival)に対するパーレカン過剰発現の影響を 研究するために、パーレカンのみを過剰発現するＰ１９細胞（Ｐ１９ ＰＣ Ｃ ２とＰ１９ ＰＣ Ｄ２）もニューロンに分化するように誘導させた。これらの 付加的な細胞系統をｐＣＡ−ＤＩ−Ｖの安定なトランスフェクションによって単 離し、これらの２クーロンにおけるパーレカン過剰発現を実施例１と実施例２に 述べたようにウェスタン・ブロット分析によって実証した。パーレカンのみを過 剰発現する形質転換細胞クローン（Ｐ１９ ＰＣ Ｃ２、Ｐ１９ ＰＣ Ｄ２） 、パーレカンとβＰＰ−６９５を過剰発現する形質転換細胞クローン（Ｐ１９６ ９５Ｂ２ ＰＣ Ｂ６とＰ１９ ６９５Ｂ２ ＰＣ Ｄ３）、βＰＰ−６９５の みを過剰発現する形質転換細胞クローン（Ｐ１９ ６９５Ｂ２）及びこれらの親 細胞（Ｐ１９）をも、レチノイン酸による処理によってニューロン細胞に分化す るように誘導させた。非ニューロン細胞の増幅は、１０μＭのシトシンβ−Ｄ− アラビノフラノシド（Ａｒａ Ｃ）による処理によって培養物から除外する。レ チノイン酸による最初の処理の８日間後に、生残ニューロンをＭＴＳからの生成 フォルマザンを製造者のプロトコールに従って測定することによって定量した（ Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａの 製品）。各細胞クローンに関して、５個の独立した培養物を用意して、統計分析 をおこなった。結果を図１０に示す。パーレカンのみを過剰発現するクローンの 細胞生残率（即ち、Ｐ１９ ＰＣ Ｃ２、Ｐ１９ ＰＣ Ｄ２）は対照Ｐ１９細 胞（即ち、Ｐ１９）よりも、及びβＰＰ−６９５のみを過剰発現する細胞（即ち 、Ｐ１９ ６９５Ｂ２）に比べて有意に低かった。パーレカンとβＰＰ−６９５ の両方を過剰発現するＰ１９ ６９５Ｂ２ ＰＣ Ｄ３系統も、βＰＰ−６９５ のみを過剰発現する細胞（即ち、Ｐ１９ ６９５Ｂ２）に比べたときに特に、 ニューロン生残率の低下を示した。パーレカンとβＰＰ−６９５の両方を過剰発 現するＰ１９ ６９５Ｂ２ ＰＣＢ６の細胞の全ては死亡した。それ故、これら の研究は、パーレカンの過剰発現もニューロン細胞の生残率に影響を有すること を実証した。それ故、パーレカンのみを過剰発現する細胞と、パーレカン及びβ ＰＰを過剰発現する細胞とはアルツハイマー疾患の新規な治療剤及び予防剤を開 発するためのスクリーニング・ツールに用いることができる。好ましい実施態様 では、抗アルツハイマー化合物を試験して、それらが培地中の分泌Ａβレベルを 低下させ、及び／又はニューロン生残率を増加させるならば、それらは有効に思 われる。 実施例５ パーレカン・トランスジェニック発現プラスミドの構築 発現ベクター、ｐＣＡ−ＤＩ−Ｖ（図３Ｃ）を用いて、マウス受精卵にミクロ 注入(microinjection)するためのＤＮＡを作製した。ｐＣＡ−ＤＩ−ＶをＨｉｎ ｄＩＩＩ酵素によって消化させ、アガロース上で電気泳動させて、ミクロ注入に 用いるための細菌ＤＮＡ配列をＤＮＡ構築体から分離した。サイトメガロウイル ス・エンハンサー／β−アクチン・プロモーターと、全パーレカン・コアタンパ ク質のｃＤＮＡと、ポリアデニル化シグナルとを含有したＤＮＡ構築体をＤＥＡ Ｅセルロース膜上に電気泳動させた。膜上のＤＮＡを高塩緩衝剤(high salt buf fer)（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１Ｍ ＮａＣｌ、及び１０ｍ Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）によって溶出させて、フェノールとクロロホルムと によって抽出した。ＤＮＡをエタノールによって沈降させた後に、ＤＮＡをＴｒ ｉｓ−ＥＤＴＡ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．２５ｍＭ Ｅ ＤＴＡ）中に再懸濁させて、受精卵中にミクロ注入するために用いた。 実施例６ ＤＮＡ構築体の回収と卵への注入 本発明のトランスジェニック生物の全ては、複数個のそれらの細胞中に、アミ ロイド疾患の病因に関係すると考えられるクローン化組換えＤＮＡ配列又は合成 ＤＮＡ配列を包含する。さらに詳しくは、トランジェニック生物は、パーレカン ・コアタンパク質の産生を可能にする特異的プロモーター配列を含む外来遺伝子 要素の特異的配列を含有する。本発明のトランスジェニック生物を作製すること が可能であるので、一般的に外来遺伝子要素を挙げることによって、トランスジ ェニック生物の作製を一般的に説明する。この一般的説明は、当業者によって、 上記要素と方法とを用いて上記特異的ＤＮＡ配列を生物に組み入れて、このよう な配列を発現させるために適用されることができる。トランスジェニック・マウ スの作製に関するさらに詳しい情報に関しては、１９８９年１０月１０日発行の 米国特許第４，８７３，１９１号（トランスジェニック・マウスの作製方法の開 示に関して本明細書に援用される）と、それに関係し、引用された科学刊行物を 参照のこと。 単細胞ステージ胚(one-cell stage embryo)（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ Ｘ ＳＪＬ のＦ２）を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ Ｘ ＳＪＬ／ＪのＦ１雄マウスと既に交尾させ たＣ５７ＢＬ／６Ｊ Ｘ ＳＪＬ／ＪのＦ１雌マウスの輸卵管から回収した。こ れらの胚は雌の前核から雄の前核を区別するために充分に初期のものであるべき である。卵母細胞を囲む堆積細胞(cumulus cell)をヒアルロニダーゼ処理によっ て除去して、適当に洗浄して、ＤＮＡ注入の前のある一定の時間、５％ＣＯ2の 雰囲気中、３７℃においてインキュベートした。外来遺伝子要素の添加を可能に する任意の方法を、細胞、核膜又は他の存在する細胞的若しくは遺伝的構造に対 して非破壊的であるかぎり、用いることができる。外来遺伝子要素を好ましくは 、ミクロ注入によって核遺伝子要素(nucleic genetic material)中に挿入する。 細胞及び細胞構造のミクロ注入は公知であり、当該技術分野において用いられて いる。実施例５において作製された、約１〜２ピコリットル（ｐｌ）のＤＮＡ構 築体（約１００〜２００コピーの導入遺伝子／ｐｌ）を雄の前核中にミクロ注入 した。約１００個の胚を実施例５に述べたＤＮＡ構築体と共に注入した。注入し た胚を数時間から１日間までインキュベートしてから、妊娠１日目の偽妊娠ＩＣ Ｒ育ての母(pseudopregnant ICR forster mothers of Day1 of pregnancy)の輸 卵管に移植した。膣栓が認められた日を１日目として記録した。移植された育て の母を胎児の分娩まで飼育した。分娩後に、新生児（２５匹の子ネズミ）は育て の母によって離乳まで４週間授乳された。離乳時に、新生児の尾をサザン・ブロ ット分析のために切断して、マウス染色体中への導入遺伝子の組込みを判定した 。サザン・ブロット分析によって導入遺伝子と判定された、創始マウス(founder mice)をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと戻し交配して、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ遺伝的背景 を有するトランスジェニック・マウスの系統を確立した。 実施例７ 導入遺伝子コピー数の決定 ＤＮＡ構築体（ｐＣＡ−ＤＩ−Ｖ）のミクロ注入から産生した子ネズミを生後 ４〜６週間まで成長させてから、子ネズミの尾を切断した。ＱＩＡａｍｐ組織キ ット（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．の製品）を用いて、尾からＤＮＡを単離した。マ ウスの尾から単離した１０μｇのＤＮＡをＳｃａＩ制限酵素によって消化させ、 ０．９％アガロースゲル上での電気泳動によって分離させた。さらに、ｐＣＡ− ＤＩ−ＶをＳｃａＩ制限酵素によって消化させ、消化されたｐＣＡ−ＤＩ−Ｖの ０．０４５ｎｇ（１コピー）と、０．２２５ｎｇ（５コピー）と、０．４５ｎｇ （１０コピー）も、基準陽性対照(reference positive control)として同じアガ ロースゲル上で分離させた。次に、分離したＤＮＡをナイロン膜上にブロットし た。この膜を５０％ホルムアミド、５Ｘ生理食塩水クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ ；１ＸＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ ７．０）、５Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液（１ＸＤｅｎｈａｒｄｔ溶液＝各０．０ ２％のＦｉｃｏｌｉ、ポリビニルピロリドン及びウシ血清アルブミン）、０．１ ％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、及び１００ｍｇ／ｍｌの変性ニシン精子 ＤＮＡ中で４２℃において６時間プレハイブリダイズし(prehybridized)、次に 、１０％硫酸デキストランと〜１０7ｃｐｍの放射性標識プローブとを含有する 上記溶液中で４２℃において１８時間ハイブリダイズした。放射性標識プローブ はマウス・パーレカンｃＤＮＡの１．７−ｋｂ ＳｃａＩフラグメント（パーレ カンｃＤＮＡのｂｐ５５２３〜７２１５）であった（Ｎｏｏｎａｎ等，Ｊ．Ｂｉ ｏｌ．Ｃｈｅｍ ．２６６：２２９３９〜２２９４７（１９９１））。次に、膜を ０．２ＸＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳ中で６５℃において洗浄した。膜をエンハン サースクリーン付きＫｏｄａｋ ＸＡＲフィルムに−８０℃において４日間暴露 させた。図１１に示すように、約２５匹の子ネズミから、マウスゲノム中の組込 み導入遺伝子は４匹の創始マウス（図１１において＃３５９５、３６９７、３７ ６３及び３６９４と表示）においてサザン・ブロット上の１．７−ｋｂフラグメ ントとして同定された。創始マウス＃３５９５はｐＣＡ−ＤＩ−Ｖの５〜１０コ ピーを有することが発見され、創始マウス＃３６９７、３７６３及び３６９４は ｐＣＡ−ＤＩ−Ｖの約１コピーを有した。 実施例８ パーレカン・トランスジェニックマウスにおけるパーレカン過剰発現の確認 創始マウス（＃３５９５、３６９７、３７６３及び３６９４）をＣ５７ＢＬ／ ６Ｊマウスと交配させた。雄創始マウス（＃３６９４と３５９５）の各々を１匹 のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウスと共に１つのケージに入れた。交配させた全ての雌 は８〜１２匹のマウスを産み、創始マウスに生殖能力があることを実証した。子 孫からのマウス尾を切断して、上述したようにサザン・ブロット分析をおこなっ て、導入遺伝子の分離を実証した。サザン・ブロット分析によってトランスジェ ニックと決定されたマウスに、繁殖のために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを交配さ せた。 トランスジェニック・マウスにおける導入遺伝子発現レベルをｍＲＮＡに関す るノーザン・ブロッティング、ウェスタン・ブロッティング及びタンパク質の免 疫染色によって判定した。ノーザン及びウェスタン・ブロット分析の大部分は当 該技術分野において広くおこなわれており、大抵の実施者はこれらの方法に用い られる標準的材料並びに特定条件を熟知している。 ノーザン・ブロッティング：３匹のマウスを麻酔下で頚部脱臼によって殺害し た：Ｔ２１３、パーレカン・トランスジェニック創始３５９５（５コピー創始マ ウス）からの生後３か月子孫と；Ｔ１５６、パーレカン・トランスジェニック創 始３６９４（１コピー創始マウス）からの生後３か月子孫と；Ｃ１９６、Ｔ２１ ３の３か月非トランスジェニック対照同腹児(litter-mate)。脳、心臓、肝臓、 腎臓、脾臓及び腸を包含する組織を迅速に取り出し、４Ｍチオシアン酸グアニジ ニウム、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０；０．５％サルコシル、０． １Ｍ２−メルカプトエタノールから成る変性溶液(denaturing solution)中でホ モジナイズして、２７ゲージ針を備えたシリンジに通した。酢酸ナトリウムを加 えた後に、ＲＮＡをフェノール／クロロホルムによって抽出して、イソプロパノ ールによって沈降させた。沈降したＲＮＡを上記変性溶液によって再び再懸濁さ せ、イソプロパノールによって沈降させた。ＲＮＡを７５％エタノールによって すすぎ洗いした後に、ＲＮＡを滅菌二重蒸留水によって再懸濁させた。各組織か らの２０μｇの総ＲＮＡを１％アガロース−ホルムアルデヒドゲルに通して電気 泳動させた後に、ナイロン膜に毛管トランスファー(capillary transfer)した。 パーレカン・プローブ（マウス・パーレカンｃＤＮＡ、Ｎｏｏｎａｎ等のＪ．Ｂ ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２２９３９〜２２９４７（１９９１）に述べられて いるようなパーレカンｃＤＮＡのｂｐ５５２３〜７２１５）を、ランダル・プラ イムド標識キット(random primed labeling kit)（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａ ｎｎｈｅｉｍの製品）を用いて、４Ｘ１０8ｃｐｍ／μｇの比活性まで32Ｐ ｄ ＣＴＰで放射性標識した。膜を５０％ホルムアミド５ＸＳＳＣ（１ＸＳＳＣ＝０ ．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．１ ％ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌの変性ニシン精子ＤＮＡ中で４２℃において２０ 時間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後に、膜を０．２ＸＳＳＣ及 び０．２％ＳＤＳ中でそれぞれ３０分間、６５℃において２回洗浄した。次に、 膜をエンハンサースクリーン付きＫｏｄａｋ ＸＡＲフィルムに−７０℃におい て６時間暴露させた。結果は図１２に示す。予想される１１．６ｋｂサイズを有 する導入遺伝子ｍＲＮＡの高レベルの発現がＴ２１３（５コピーの導入遺伝子を 有する創始マウスの子孫）の脳、心臓、肝臓、腎臓、脾臓及び腸において観察さ れた。Ｔ１５６（１コピーの導入遺伝子を有する創始マウスの子孫）におけるパ ーレカンｍＲＮＡレベルはＴ２１３におけるレベルよりも非常に低かった（図１ ２）。Ｃ１９６組織のいずれにおいてもパーレカンの内因性ｍＲＮＡは検出され なかった。この研究は、パーレカン過剰発現が〜５コピーの導入遺伝子を有する トランスジェニック・マウスの脳及び他の組織において特に明白であった。 ウェスタン・ブロッティング：トランスジェニック・マウスにおける導入遺伝 子からのタンパク質産物レベルをウェスタン・ブロット分析によって測定した。 トランスジェニックＴ２１３と対照Ｃ１９６とから単離された組織（即ち、脳、 心臓、肝臓、腎臓、脾臓及び腸）を２ＸＬａｅｍｍｌｉ緩衝剤（１Ｘ＝６２．５ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、５％ ２−メルカプトエタノール、０．００１％ブロモフェノールブルー）中でホモジ ナイズし、５分間沸騰させ、２６ゲージ針によって剪断した。Ｂｉｏ−ＲａｄＰ ｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄの製品）によってタンパク質濃度を 測定した。３０μｇのタンパク質に相当するアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥのた めに４〜２０％勾配ゲルに塗布した。電気泳動後に、タンパク質をポリビニリジ ンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ の製品）にエレクトロトランスファーした。この膜を５％脱脂ドライミルク（ｗ ／ｖ）、０．０２％アジ化ナトリウム及び０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する リン酸緩衝生理食塩水によってブロックして、パーレカン・コアタンパク質を認 識するパーレカン・モノクローナル又はポリクローナル抗体と共に４℃において １６時間インキュベートして、強化化学発光系（Ａｍｅｒｓｈａｍの製品）によ って免疫染色した。結果を図１３に示す。対照（即ち、Ｃ１９６）に比べて、Ｔ ２１３の脳、心臓、肝臓、腎臓及び膵臓において実質的に増加した量の導入遺伝 子タンパク質産物（即ち、〜４００ｋＤａ帯又はスミアとして検出されるパーレ カン）が観察された。この研究は、パーレカン過剰産生が、脳及び他の組織にお いて首尾よく生じて、生後３か月パーレカン・トランスジェニック・マウスにお いて明確に現れることを実証した。 免疫染色：免疫染色研究のために、深い麻酔によって動物を最初に殺した。３ ５９５（５コピー創始マウス）からの２匹の生後５か月トランスジェニック子孫 と２匹の生後５か月非トランスジェニック同腹児との組織に免疫染色をおこなっ た。脳、心臓、腸、腎臓及び膵臓を包含する組織を取り出し、１０％ホルマリン によって固定し、当業者に周知の方法によってパラフィン中に包埋した。次に、 １０μｍ切片を切断して、これらの切片に、以下に説明するように、パーレカン 特異的抗体とＶｅｃｔａｓｔａｉｎＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｉｅｓの製品）とを用いてアビジンービオチン・イムノペルオキシダーゼ 方法をおこなって、パーレカンを検出した。切片の脱パラフィン(deparaffiniza tion)後に３％過酸化水素による３０分間の処理によって、内因性ペルオキシダ ーゼを除去した。切片を蒸留水によってすすぎ洗いした後に、切片をＴｒｉｓ緩 衝生理食塩水（ＴＢＳ）中の１５％ヤギ血清によって室温において６０分間ブロ ックしてから、１５％ヤギ血清を含有する０．１Ｍ ＴＢＳ中でパーレカン一次 ポリクローナル抗体(perlecan primary polyclonal antibody)（パーレカンのコ アタンパク質を特異的に認識する；Ｄｒ．Ｊ．Ｈａｓｓｅｌｌの抗体）と共に、 ４℃において１６時間インキュベートした。次に、切片を１％ヤギ血清を含有す る０．１Ｍ ＴＢＳ中ですすぎ洗いして、ビオチニル化ヤギ抗ウサギＩｇＧ二次 抗体(biotinylated goat antirabbit IgG secondary antibody)と共に室温にお いて１時間インキュベートした。洗浄した後に、切片をＶｅｃｔａｓｔａｉｎ試 薬と共に室温において６０分間インキュベートした。次に、３，３’−ジアミノ ベンジジンによる処理によってペルオキシダーゼ活性を検出した。パーレカンに 対する強い免疫反応性が、特に脈絡叢の上皮、心臓の筋原線維、胃腺の好酸細胞 、腎臓の糸球体、及び膵臓のランゲルハンス島の細胞において、トランスジェニ ック・マウスにおいて明白であったが、対照の同腹児には見られなかった。さら に、トランスジェニック・マウスは海馬のＣ３Ａニューロン層、小脳のＰｕｒｋ ｉｎｊｅ細胞層及び脳幹のラージニューロンにおける中等度の免疫染色を実証し たが、対照の同腹児は示さなかった。図１４は生後５か月のパーレカン・トラン スジェニック・マウスの腎臓の糸球体（図１４Ａ、矢印）及び海馬のＣ３Ａニュ ーロン層（図１４Ｃ、矢印）における強い免疫染色を示す。これに比べて、対照 の同腹児は腎臓の糸球体（図１４Ｂ）及び海馬ニューロン（図１４Ｄ）において パーレカンに関する弱い染色〜無染色を示す。これらの結果は、パーレカン過剰 発現が脳及び全身器官の特異的部位におけるパーレカン・タンパク質蓄積を生じ ることを実証する。 実施例９ アルツハイマー病アミロイドーシスの新規な動物モデル作製の第１工程としての β−アミロイド前駆体タンパク質マウスの作出 ヒトβ−アミロイド前駆体タンパク質のシグナル配列と９９アミノ酸Ｃ末端領 域とを構成的に過剰産生するトランスジェニック・マウスの４つの創始系統(fou nder line)が確立された。ヒトβ−アミロイド前駆体タンパク質（以下ではβＰ Ｐと呼ぶ）のシグナル配列と９９アミノ酸Ｃ末端領域（ＳβＣと呼ばれる構築体 ）に関するｃＤＮＡをｐＣＡＧＧＳにおけるサイトメガロウイルス・エンハンサ ーとニワトリβ−アクチン・プロモーターとの制御下に置いた（図１５Ａ）（Ｎ ｉｗａ等，Ｇｅｎｅ，１０８：１９３〜２００（１９９１））。サイトメガロウ イルス・エンハンサーとニワトリβ−アクチン・プロモーターとの制御下でＳβ Ｃを過剰発現させるために、発現ベクター、ｐＣＡ−ＳβＣを構築した。ＬＭＧ ２ヒト脳幹λｇｔｌｌ ｃＤＮＡライブラリー（ＡＴＣＣ、カタログ＃ＡＴＣＣ ３７４３２の製品）を用いて、塩基対９０１〜２８５１から伸長する、ヒトβＰ Ｐの部分ｃＤＮＡ（Ｋａｎｇ等，Ｎａｔｕｒｅ，３２５：７３３〜７３６（１９ ８７））を単離した。このｃＤＮＡのＥｃｏＲＩ／ＣＩａＩフラグメント（ｂｐ １７９６〜２４７３；Ｋａｎｇ等，Ｎａｔｕｒｅ，３２５：７３３〜７３６（１ ９８７））をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅの製品）に 同じ制限酵素部位においてサブクローン化して、ｐＫＳ−βＣを作製した（図１ ５Ａ）。別の反応において、βＰＰのシグナルペプチド・コーディング配列と、 β−アミロイドタンパク質の最初の３アミノ酸（ＢａｍＨＩ部位＋ｂｐ−４〜５ １＋ｂｐ１７８９〜１７９５＋ＥｃｏＲＩ部位；ｂｐは、Ｋａｎｇ等，Ｎａｔｕ ｒｅ ，３２５：７３３〜７３６（１９８７）に記載）を化学的に合成した（図１ ５Ａ）。この合成フラグメントをさらに、ｐＫＳ−βＣにおけるβＰＰのＥｃｏ ＲＩ／ＣＩａＩフラグメント（ｂｐ１７９６〜２４７３）に、ＢａｍＨＩ部位と ＥｃｏＲＩ部位を用いてライゲートして、ｐＫＳ−ＳβＣプラスミドを作製した 。このプラスミドをＢａｍＨＩとＳａＩＩとによって消化させて、βＰＰのＳβ Ｃをコードする０．８−ｋｂフラグメントを単離した。０．８−ｋｂフラグメン トのＳａＩＩ部位を、予めＸｈｏＩによって消化させた発現ベクター、ｐＣＡＧ ＧＳ（Ｎｉｗａ等，Ｇｅｎｅ，１０８：１９３〜２００（１９９１））のＸｈｏ Ｉ部位の１つにライゲートした（図１５Ｂ）。他の末端はＫｌｅｎｏｗフィル− イン反応(fill-in reaction)による平滑末端形成後に、ライゲートして、ｐＣＡ −ＳβＣを作製した（図１５Ｂ）。ｐＣＡ−ＳβＣから細菌配列を取り出した後 のｐＣＡ−ＳβＣ中に受精卵を注入した。４種類の独立したトランスジェニック ・マウス系統を確立した。導入遺伝子からのｍＤＮＡ発現レベルを測定するため に、トランスジェニック・マウスからの総ＲＮＡを単離し、放射性標識したヒト ｃＤＮＡプローブ（ｂｐ１７９５〜２８５１；Ｋａｎｇ等，Ｎａｔｕｒｅ，３２ ５：７３３〜７３６（１９８７））を用いてノーザン・ブロットによって分析し た。導入遺伝子からの予想サイズ、１．０６−ｋｂを有するｍＲＮＡの高レベル の発現が、脳を包含する試験した実際に全ての組織中で観察された（Ｆｕｋｕｃ ｈｉ等，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１４９：２１９〜２２７（１９９６））。３．２ ｋｂのサイズを有するネイティブｍＲＮＡはさらに脳及び腎臓においても観察さ れた。ウェスタン・ブロットでは、導入遺伝子からの〜１１−１７ｋＤａタンパ ク質産物がトランスジェニック・マウスの肺、筋肉、腸、肝臓及び腎臓において 観察されたが、非トランスジェニック・マウスの同じ組織からのウェスタン・ブ ロットでは対応フラグメントが観察されなかった。トランスジェニック・マウス の脳には、対照に比べて、βＰＰ（７）Ｃ末端フラグメントの３〜５倍の増加が 観察された。腸におけるＣ末端フラグメントの量はトランスジェニック・マウス の脳において観察された量よりも少なくとも５０倍大きく、トランスジェニック 動物の心臓において観察された量よりも少なくとも３倍大きかった（Ｆｕｋｕｃ ｈｉ等，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１４９：２１９〜２２７（１９９６））。 ＣＡ−ＳβＣを有する生後６か月、生後９か月、生後１２か月、１４か月及び １６か月のトランスジェニック・マウスを免疫組織化学的及び組織病理学的分析 のために殺した。１２〜１６か月の範囲内の非トランスジェニックきょうだい(s ibling)を対照として用いた。免疫組織化学的分析によって、抗体１２８２（β −アミロイドタンパク質に対して作成されたウサギポリクローナル抗血清；Ｔａ ｍａｏｋａ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１３４ ５〜１３４９（１９９２））と、１０Ｄ５（β−アミロイドタンパク質に対する 抗体；Ｈｙｍａｎ等，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．５１： ７６〜８３（１９９２））とを用いて、大きい免疫反応性付着物が生後＞１２か 月のトランスジェニック・マウスからの小腸の粘膜固有層において検出されたが 、これより若いマウスでは検出されなかった。これらの付着物はＣｏｎｇｏ ｒ ｅｄに関しては陽性（アミロイドを示唆）であり、偏光下で観察すると、赤／緑 複屈折を示し、電子顕微鏡で観察すると、直径７〜１０ｎｍのフィブリルから成 るものであった。意外にも、これらのβ−アミロイド付着物はパーレカン特異的 コアタンパク質抗体を用いるとパーレカンに関しても陽性であることが判明した 。これらの付着物中のβ−アミロイドとパーレカンの両方の堆積は、両成分がア ミロイド付着(deposition)のために必要であり、本発明の基礎のさらなる証拠と して役立つことを示唆する。これらのトランスジェニック・マウスの小腸ではフ ィブリル状β−アミロイド付着物が観察されたが、トランスジェニック・マウス の脳では病的変化は観察されず、このことは、例えばパーレカンのような、他の 補因子が脳におけるフィブリル状β−アミロイドタンパク質の最終的形成、付着 及び持続のために恐らく必要であることを意味した。 実施例１０ パーレカン−アミロイドタンパク質二重トランスジェニック動物の作出 パーレカン−アミロイドタンパク質トランスジェニック動物は、パーレカント ランスジェニック・マウスと例えばβ−アミロイド前駆体タンパク質トランスジ ェニック動物との交配によって作出される。両方の導入遺伝子（ＣＡ−ＳβＣと パーレカン）を有する二重トランスジェニック・マウスは２系統のトランスジェ ニック・マウスを交配させることによって作出される。一般に、各導入遺伝子の ヘテロ接合両親の交配から出現する子ネズミの２５％が両方の導入遺伝子を有す る筈であり、一方の導入遺伝子のヘテロ接合マウスと他方の導入遺伝子のホモ接 合マウスとの交配から出現する子ネズミの５０％が両方の導入遺伝子を有する筈 である。ＣＡ−ＳβＣ導入遺伝子のホモ接合マウスはＣＡ−ＳβＣのヘテロ接合 マウスの交配によって確立された。ＣＡ−ＳβＣのホモ接合マウスは、ＣＡ−Ｓ βＣのホモ接合マウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊ非トランスジェニック・マウスに交雑 させる(crossing)ことによって確立された。ＣＡ−ＳβＣのホモ接合雄をパーレ カン導入遺伝子のヘテロ接合雌（創始３５９５からの子孫）に交雑させた。交配 によって８匹の子ネズミが産まれ、子ネズミから尾を切断して、サザン・ブロッ ト分析のためにＤＮＡを抽出した。このＤＮＡを放射性標識パーレカン（Ｎｏｏ ｎａｎ等のＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２２９３９〜２２９４７（１９９ １）におけるパーレカンｃＤＮＡのｂｐ５５２３〜７２１５）と、β−アミロイ ド（Ｋａｎｇ等のＮａｔｕｒｅ，３２５：７３３〜７３６（１９８７）における ｂｐ１７９６〜２４７３）プローブとにハイブリダイズさせた。結果は表１６に 示す。子ネズミ＃５５２はパーレカンとβ−アミロイド前駆体タンパク質（Ａβ 領域を含有するＣ末端部分）の両方に関して陽性である（図１６に示す）ことが 判明し、パーレカンとβ−アミロイドの両方の導入遺伝子を有する二重トランス ジェニック・マウスの成功した作出を実証した。 実施例１１ アルツハイマー病と他のアミロイド疾患の治療のための化合物のスクリーニング トランスジェニック・マウス、トランスフェクト細胞、又はトランスジェニッ ク動物由来の動物細胞を用いて、アルツハイマー病と他のアミロイドーシス疾患 の治療における可能な効果に関して化合物を標準方法によってスクリーニングす ることができる。このようなスクリーニング分析では、一定の期間にわたって、 種々な用量で、化合物を動物に投与するか、又はトランスフェクト細胞若しくは これらの動物由来の細胞の培養培地に供給する。次に、動物又は動物細胞をアミ ロイドタンパク質若しくはアミロイド前駆体タンパク質のプロセシングの変化、 発現レベル、又はアルツハイマー病若しくは他のアミロイド疾患のマーカーの局 在(localization)、及び／又は組織病理学に関して検査する。アルツハイマー病 に関して用いた動物の場合には、当業者に知られた公知の標準記憶試験を用いて 、挙動試験(behavior test)をおこなう。一般に、挙動試験における改善、アル ツハイマー病関連マーカーの変化、アルツハイマー病関連組織病理学の重症度の 軽減、Ａβ若しくはβＰＰ切断生成物(cleavage product)の発現の減少、及び／ 又は治療されない動物に比べて、治療された動物に観察される、アルツハイマー 病に相関する他の化合物の存在、不存在若しくはレベルの変化が、アルツハイマ ー病の治療に有用な化合物であることを示す。アルツハイマー病に関連し、アル ツハイマー病の特徴である、特異的タンパク質及び／又はこのようなタンパク質 の組織病理学を本明細書ではマーカーと呼ぶ。アルツハイマー病に特徴的な、こ れらのマーカーの発現又は局在は、開示されたトランスジェニック動物に既に検 出されているか、又は存在すると予想される。これらのマーカーを測定又は検出 して、このような測定値を治療されたトランスジェニック動物と治療されないト ランスジェニック動物との間で比較して、試験化合物の効果を評価することがで きる。 アルツハイマー病スクリーニング分析のために有用なマーカーは、アルツハイ マー病に関連する、これらのマーカーの検出可能な変化に基づいて選択される。 多くのこのようなマーカーがアルツハイマー病において同定されており、開示さ れた動物に存在すると期待される。これらのマーカーはそれらの性質(nature)、 位置又は機能に基づいて幾つかのカテゴリーに分類される。アルツハイマー病ス クリーニング分析に有用なマーカーの好ましい例を、Ａβ関連マーカー、プラー ク関連マーカー、細胞骨格及び神経突起(neuritic)マーカー、炎症マーカー、並 びにニューロン及び神経伝達物質関連マーカーとして分類して、以下で説明する 。 Ａ．Ａβ関連マーカー 種々な形態のβＰＰ及びＡβの発現は、治療されたトランスジェニック動物と 治療されないトランスジェニック動物とにおいて、イムノサイトケミストリー(i mmunocytochemistry)と定量的ＥＬＩＳＡ測定の両方によって直接測定すること ができる。現在、２つの形態のβＰＰ産物、βＰＰとＡβとが検出されている（ ＨａａｓｓとＳｅｌｋｏｅ，Ｃｅｌｌ，７５：１０３９〜１０４２（１９９３） ）。これらはアルツハイマー病の病理学に時間依存的な形式で本質的に関連する ことが判明している。それ故、好ましい分析法はトランスジェニック・マウスに おけるβＰＰ及びＡβの発現の年齢関連変化(age-related change)を比較する。 一般に、特異的形態のＡβは特異的抗体を用いて定量的又は定性的に分析するこ とができる。Ａβの形態におけるアミノ酸組成に言及する場合に、位置はβＰＰ のＡβ領域に対応する。Ａβのアミノ酸１はβＰＰのアミノ酸６７２に対応し、 Ａβのアミノ酸４２はβＰＰのアミノ酸７１４に対応する。 βＰＰマーカーは分析測定のターゲットとしても好ましい。例えば、異なる形 態の分泌βＰＰ（βＰＰ−α及びβＰＰ−βと呼ばれる）を測定することもでき る（Ｓｅｕｂｅｒｔ等，Ｎａｔｕｒｅ，３６１：２６０〜２６３（１９９３）） 。βＰＰ形態は、アルツハイマー病に影響を与える化合物の可能性を評価するた めの分析の好ましいターゲットでもある。βＰＰとβＰＰ転写体の絶対的レベル 、異なるβＰＰ形態とそれらの切断生成物の相対的レベル、βＰＰ発現又はプロ セシングの局在は全て、可能な治療化合物による治療の効果を評価するために使 用可能な、アルツハイマー病に関連したマーカーである。プラーク及び神経突起 組織(neuritic tissue)へのβＰＰの局在は、これらの分析の特に好ましいター ゲットである。 定量的測定は多くの標準分析法を用いて達成することができる。例えば、ＲＮ アーゼ保護分析法、ノーザン・ブロット分析法及びＲ−ドット分析法を含めた、 ＲＴ−ＰＣＲ及びハイブリダイゼーション方法を用いて、転写体レベルを測定す ることができる。βＰＰレベルとＡβレベルとは、ＥＬＩＳＡ、ウェスタン・ブ ロット分析法によって及び免疫組織化学的に染色された組織切片の比較によって 分析することができる。特定の組織及び細胞種類へのβＰＰとＡβとの局在を分 析するために、免疫組織化学的染色を用いることもできる。 Ｂ．プラーク関連マーカー 多様な他の分子もアルツハイマー病を有する個体のプラーク中に存在し、プラ ーク及び神経突起組織におけるそれらの存在を検出することができる。好ましい プラーク・マーカーはτタンパク質（Ｇｒｕｎｄｋｅ−Ｉｑｂａｌ等，Ｐｒｏｃ ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ，８３：４９１３〜４９１７（１９８６ ）；Ｋｏｓｉｋ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：４ ０４４〜４０４８（１９８６）；Ｌｅｅ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：６７５〜 ６７８（１９９１））、アポリポタンパク質Ｅ（Ｃｏｒｄｅｒ等，Ｓｃｉｅｎｃ ｅ，２６１：９２１〜９２３（１９９３）；Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ等，Ｐｒ ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ，９０：８０９８〜８１０２（１９ ９３））、α1−アンチキモトリプシン（Ａｂｒａｈａｍ等，Ｃｅｌｌ，５２： ４８７〜５０１（１９８８））、アミロイドｐ成分（Ｃｏｒｉａ等，Ｌａｂ．Ｉ ｎｖｅｓｔ ．５８：４５４〜４５８（１９８８））、ユビキチン（Ｍｏｒｉ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ ，２３５：１６４１〜１６４４（１９８７））、サイトカイン（ ＭｃＧｅｅｒ等，Ｃａｎ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１６：５１６〜５２７（ １９８９）；Ｒｏｇｅｒｓ．ＣＮＳ Ｄｒｕｇｓ，４：２４１〜２４４（１９９ ４）において再検討）、増殖因子（ＨｅｆｔｉとＷｅｉｎｅｒ，Ａｎｎ．Ｎｅｕ ｒｏｌ ．２０：２７５〜２８１（１９８６）；Ｈｅｆｔｉ等，Ｎｅｕｒｏｂｉｏ ｌ．Ａｇｉｎｇ ，１０：５１５〜５３３（１９８９）；Ｋａｔｏ等，Ｎｅｕｒｏ ｓｃ ．１２２：３３〜３６（１９９１）；Ｔｏｏｙａｍａ等，Ｎｅｕｒｏｓｃ． Ｌｅｔｔ ．１２１：１５５〜１５６（１９９１））、補体因子（Ｅｉｋｅｎｂｌ ｏｏｍ等，Ｖｉｒｃｈ．Ａｒｃｈ．Ｂ Ｃｅｌｌ Ｐａｔｈｏｌ．５６：２５９ 〜２６２（１９８９））、進行グリコシル化最終生成物(advanced glycosylatio n end products)（Ｓｍｉｔｈ等，，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ，９１：５７１０（１９９４））、進行グリコシル化生成物の受容体、増 殖阻害因子並びにヘパラン硫酸ＰＧ類（Ｓｎｏｗ等，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１３ ３：４５６〜４６３（１９８８））、コンドロイチン硫酸ＰＧ類（ＤｅＷｉｔｔ 等，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１２１：１４９〜１５２（１９９３））、デルマタ ン硫酸ＰＧ類（Ｓｎｏｗ等，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４０ ：１０５〜１１３（１９９２））、及びケラタン硫酸ＰＧ類（Ｓｎｏｗ等，ＥＸ Ｐ．Ｎｅｕｒｏｌ ．１３６：３０５〜３１７（１９９６））である。上記マーカ ーを用いて、プラーク及び神経突起組織の特異的成分を検出することができるが 、プラークの位置と程度も周知の組織化学的ステイン、例えばＣｏｎｇｏ ｒｅ ｄ及びＴｈｉｏｆｌａｖｉｎ Ｓを用いて測定することができる。 Ｃ．細胞骨格及び神経突起マーカー 細胞骨格マーカーの変化もアルツハイマー病スクリーニング分析に用いて、ア ルツハイマー病に対する化合物の効果を判定することができる。細胞骨格マーカ ーの変化の多くは、神経フィブリルのもつれ又は、プラークに関連したジストロ フィー神経突起において生ずる。アルツハイマー病の変化及び／又はアルツハイ マー病との関連を示す、好ましい細胞骨格及び神経突起マーカーを下記に挙げる 。開示されたトランスジェニック動物、又は開示された動物との交配によって作 出されたトランスジェニック動物に対する化合物の効果を測定するために、これ らのマーカーを検出して、変化を測定することができる。スペクトリンはアルツ ハイマー病において増加した分解を示す。τフィラメントと神経フィラメントは アルツハイマー病において高ホスホリル化の増加を示し、ユビキチンのレベルは アルツハイマー病患者(Alzheimer's)において上昇する。τタンパク質、ユビキ チン、ＭＡＰ−２、神経フィラメント、ヘパラン硫酸ＰＧ類、デルマタン硫酸Ｐ Ｇ類、コンドロイチン硫酸ＧＡＧ類及びケラタン硫酸ＰＧ類はアルツハイマー病 におけるプラークと神経突起組織に局在して、一般に、それらの正常な位置から 変化する。ＧＡＰ４３レベルはアルツハイマー病では海馬において低下する。 Ｄ．炎症マーカー アルツハイマー病はまた、炎症反応を刺激し、炎症マーカーを対応して増加さ せることが知られる（ＭｃＧｅｅｒ等，Ｃａｎ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１ ６：５１６〜５２７（１９８９）；Ｒｏｇｅｒｓ，ＣＮＳ Ｄｒｕｇｓ，４：２ ４１〜２４４（１９９４））。アルツハイマー病の変化及び／又はアルツハイマ ー病との関連を示す、好ましい炎症マーカーを下記に挙げる。これらのマーカー の変化の検出はアルツハイマー病スクリーニング分析に有用である。急性期タン パク質及びグリアマーカー、例えばα１−アンチトリプシン、Ｃ反応性タンパク 質、α２−マクログロブリン（Ｔｏｏｙａｍａ等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｈｅｍ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ ．１８：１５３〜１６０（１９９３））、グリ ア線維酸性タンパク質、Ｍａｃ−１、Ｆ４／８０及びサイトカイン、例えば、イ ンターロイキン−１αとβ、ＴＮＦ−α、インターロイキン−８、ＭＩＰ−１α （Ｋｉｍ等，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５６：１２７〜１３４（１ ９９５））、ＭＣＰ−１（Ｋｉｍ等，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１２８：２８ 〜３５（１９９５）；Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．５６：１２７〜１３４（ １９９５））及びインターロイキン−６、これらは全てアルツハイマー病におい て増加し、開示された動物において増加すると期待される。例えばＣ３ｄ、Ｃ１ ｑ、Ｃ５、Ｃ４ｄ、Ｃ４ｂｄ及びＣ５ａ−Ｃ９のような補体マーカーはプラーク 及び神経突起組織に局在する。例えばＨＬＡ−ＤＲ及びＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｄ ，ＨＬＡ−Ｃのような主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）糖タンパク質は、ア ルツハイマー病において増加する。例えばＣＲ３受容体、ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ 、ＣＤ３１、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ６８、ＣＤ４５ＲＯ、 ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＤ、ＣＤ１８，ＣＤ５９、ＣＲ４、ＣＤ４５、ＣＤ６ ４及びＣＤ４４のようなミクログリアマーカー（Ａｋｉｙａｍａ等，Ｂｒ．Ｒｅ ｓ ．６３２：２４９〜２５９（１９９３））はアルツハイマー病において増加す る。アルツハイマー病スクリーニング分析に有用な、他の炎症マーカーは、α２ −マクログロブリン受容体、線維芽細胞増殖因子（Ｔｏｏｙａｍａ等，Ｎｅｕｒ ｏｓｃ．Ｌｅｔｔｓ ．１２１：１５５〜１５８（１９９１））、ＩＣＡＭ−１（ Ａｋｉｙａｍａ等，Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．８５：６２８〜６３４（１ ９９３））、ラクトトランスフェリン（Ｋａｗａｍａｔａ等，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔ ｈ ．１４２：１５７４〜１５８５（１９９３））、Ｃ１ｑ、Ｃ３ｄ、Ｃ４ｄ、Ｃ ５ｂ−９、Ｐｃ ７ ＲＩＩ、ＣＤ８（ＭｃＧｅｅｒ等，Ｃａｎ．Ｊ．Ｎｅｕｒ ｏｌ．Ｓｃ ．１６：５１６〜５２７（１９８９））、ＬＣＡ（ＣＤ４５）（Ａｋ ｉｙａｍａ等，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．５０：１９５〜２０１（１９９ ４））、ＣＤ１８（β−２インテグリン）（ＡｋｉｙａｍａとＭｃＧｅｅｒ，Ｊ ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ，３０：８１〜９３（１９９０））、ＣＤ５ ９（ＭｃＧｅｅｒ等，Ｂｒ．Ｒｅｓ．５４４：３１５〜３１９（１９９１））、 ビトロネクチツク(vitronectic)（ＭｃＧｅｅｒ等，Ｃａｎ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ ．Ｓｃｉ ．１８：３７６〜３７９（１９９１））、ビトロネクチン受容体、β− ３インテグリン、Ａｐｏ Ｊ、クラステリン(clustein)（ＭｃＧｅｅｒ等，Ｂｒ ．Ｒｅｓ ．５７９：３３７〜３４１（１９９２））、２型プラスミノーゲン・ア クチベーター・インヒビター（Ａｋｉｙａｍａ等，Ｎｅｕｒｏｓｃ．Ｌｅｔｔ． １６４：２３３〜２３５（１９９３））、ＣＤ４４（Ａｋｉｙａｍａ等，Ｂｒ． Ｒｅｓ ．６３３：２４９〜２５９（１９９３））、ミドカイン(midkine)（Ｙａ ｓｕｈａｒａ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９２ ：２４６〜２５１（１９９３））、マクロファージ・コロニー刺激因子受容体（ Ａｋｉｙａｍａ等，Ｂｒ．Ｒｅｓ．６３９：１７１〜１７４（１９９４））、Ｍ ＲＰ１４、２７Ｅ１０及びインターフェロン−α（Ａｋｉｙａｍａ等，Ｊ．Ｎｅ ｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ ．５０：１９５〜２０１（１９９４））である。炎症又は 酸化ストレスに関連する他のマーカーは、４−ヒドロキシノネナール−タンパク 質コンジュゲート（ＵｃｈｉｄａとＳｔａｄｔｍａｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．２３ ３：３７１〜３８０（１９９４））、Ｉ−κ−Ｂ、ＮＦ−κ−Ｂ（Ｋａｌｔｓｃ ｈｍｉｄｔ等，Ｍｏｌ．Ａｓｐｅｃｔｓ．Ｍｅｄ．１４：１７１〜１９０（１９ ９３））、ｃＰＬＡ2（Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ等，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ ．３：５１〜６３（１９９６））、ＣＯＸ−２（Ｃｈｅｎ等，Ｎｅｕｒｏｒｅｐ ｏｒｔ ，６：２４５〜２４８（１９９５））、マトリックスメタロプロテイナー ゼ（Ｂａｃｋｓｔｒｏｍ等，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５８：９８３〜９９２（ １９９２））、膜脂質過酸化(membrane lipid peroxidation)、タンパク質酸化 （Ｓｍｉｔｈ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１０ ５４０〜１０５４３（１９９１））及び低下したＡＴＰアーゼ活性（Ｍａｒｋ等 ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃ．１５：６２３９（１９９５））を包含する。これらのマ ーカーは検出することができ、変化を測定して、開示されたトランスジェニック 動物に対する化合物の効果を評価することができる。 Ｅ．ニューロン及び神経伝達物質関連マーカー ニューロン及び神経伝達物質の生化学の変化はアルツハイマー病に関連づけら れている。アルツハイマー病患者では、皮質及び海馬のコリン作動性神経支配(c holinergic innervation)の大きい低下が存在する。このことは合成酵素コリン アセチルトランスフェラーゼの劇的な損失と、アセチルコリンエステラーゼの減 少、シナプトソームのコリン吸収(synaptosomal choline uptake)の減少及びア セチルコリンの合成と放出の低下（Ｓｉｍｓ等，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．４０ ：５０３〜５０９（１９８３））によって実証され、これらのマーカーの全ては 有用なマーカーである。これらのマーカーをアルツハイマー病スクリーニング分 析に用いて、アルツハイマー病に対する化合物の効果を判定することができる。 アルツハイマー病では基底前脳ニューロンの損失も生じ、ガラニン系は肥厚性に なる。 アルツハイマー病における上記マーカーの変化の他に、皮質及び海馬にまで突 出する基底前脳ニューロンの萎縮及び損失（Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ等，Ｓｃｉｅ ｎｃｅ ，２１５：１２３７〜１２３９（１９８２））並びに鼻腔内(entorhinal) 皮質ニューロンの変化（Ｖａｎ Ｈｏｅｓａｎ等，Ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ １ ：１〜８（１９９１））も存在する。これらの観察に基づくと、これらの酵素活 性の測定、ニューロンサイズ及びニューロンカウント数は、開示されたトランス ジェニック・マウスでは低下すると予想されるので、アルツハイマー病スクリー ニング分析における検出の有用なターゲットである。基底前脳ニューロンは神経 増殖因子に依存する。脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）も海馬において減少する ので、アルツハイマー病スクリーニング分析における検出の有用なターゲットで ある。さらに、神経伝達物質受容体に対する化合物の効果を測定するスクリーニ ング分析は、アルツハイマー病の治療に有用な化合物の同定に使用可能であると 考えられる。 コリン作動性系における充分に記録が残された変化の他に、例えばセロチン作 動性系、アドレナリン作動性系、アデノシン及びニコチン受容体系のような他の 受容体系の機能不全も記録されている。これらの変化の特徴的なマーカー、並び にアルツハイマー病における代謝的変化と構造的変化の両方を示す他のニューロ ンマーカーを以下に挙げる。これらのマーカーのレベル及び／又は局在の変化を 、従来のマーカーの測定と検出のために述べられた方法と同様な方法を用いて測 定することができる。 アルツハイマー病における変化及び／又はアルツハイマー病との関連を示す、 好ましい細胞骨格及び神経突起マーカーを以下に挙げる。カテプシンＤ、カテプ シンＢ、カテプシンＧ及びニューロン・スレッドタンパク質(neuronal thread p rotein)のレベルと、延長因子−２のホスホリル化とはアルツハイマー病患者で は上昇する。カテプシンＤ、カテプシンＢ、タンパク質キナーゼＣ及びＮＡＤＰ Ｈは、アルツハイマー病ではプラーク及び神経突起組織に局在する。ニコチン受 容体、５−ＨＴ2受容体、ＮＭＤＡ受容体、α2−アドレナリン受容体、シナプト フィジン、シナプトグリカン（ＳＶ２ＰＧ）、ｐ６５、グルタミンシンテターゼ 、グルコース輸送体、ＰＰＩキナーゼ、ドレブリン(drebrin)、ＧＡＰ４３、シ トクロムオキシダーゼ、ヘムオキシゲナーゼ、カルビンジン、アデノシンＡ１受 容体、モノアミン代謝産物、コリンアセチルトランスフェラーゼ、アセチルコリ ンエステラーゼ及びシンプトソームコリン(symptosomal choline)は全てアルツ ハイマー病では減少する。 アルツハイマー病に、又はＡβによる細胞の処理後に関連する他のマーカーは 、（ａ）アルツハイマー病においてアップレギュレートする(upregulated)ｃＰ ＬＡ２（Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ等，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．３：５１〜６ ３（１９９６））、（ｂ）ヘムオキシゲナーゼ−１（Ｓｍｉｔｈ等，Ａｍ．Ｊ． Ｐａｔｈ ．１４５：４２〜４７（１９９４））、ｃ−ｊｕｎ（Ａｎｄｅｒｓｏｎ 等，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１２５：２８６〜２９５（１９９４））、ｃ−ｆｏ ｓ（Ｚｈａｎｇ等，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４６：９〜２１（１９９２））、ＨＳＰ ２７（Ｒｅｎｋａｗｅｋ等，Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．８７：５１１〜５ １９（１９９４））、ＨＳＰ７０（Ｃｉｓｓｅ等，Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔ ｈ ．８５：２３３〜２４０（１９９３））及びＭＡＰ５（Ｇｅｄｄｅｓ等，Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃ．Ｒｅｓ ．３０：１８３〜１９１（１９９１））（これらはアル ツハイマー病において及びＡβ処理後の皮質細胞において誘導される）、及び（ ｃ）ｊｕｎＢ、ｊｕｎＤ、ｆｏｓＢ、ｆｒａｌ（Ｅｓｔｕｓ等，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ．１２７：１７１７〜１７２７（１９９４））、サイクリンＤ１（Ｆｒ ｅｅｍａｎ等，Ｎｅｕｒｏｎ，１２：３４３〜３５５（１９９４））、ＮＧＦＩ −Ａ（Ｖａｃｃａｒｉｎｏ等，Ｍｏｌ．Ｂｒ．Ｒｅｓ．１２：２３３〜２４１（ １９９２））及びＮＧＦＩ−Ｂ（これらはＡβ処理後の皮質細胞において誘導さ れる）を包含する。 Ｆ．アルツハイマー病マーカーの量と局在との測定 多くの標準分析法を用いて、定量的測定をおこなうことができる。例えば、転 写体レベルは、ＲＮアーゼ保護、ノーザン分析及びＲ−ドット分析を包含する、 ＲＴ−ＰＣＲ及びハイブリダイゼーション方法を用いて測定することができる。 タンパク質マーカーレベルはＥＬＩＳＡ、ウェスタン分析、及び免疫組織化学的 に染色した切片の比較によって分析することができる。免疫組織化学的染色を用 いて、特定の組織及び細胞種類へのタンパク質マーカーの局在を分析することも できる。アルツハイマー病マーカーの局在と組織病理学的関連とは、例えば抗体 染色、レーザー走査共焦点イメージング(laser scanning confocal imaging)、 及び電子顕微鏡検査とイムノエレクトロン(immunoelectron)顕微鏡検査のような 組織化学的検出方法によって評価することができる。 受容体と酵素マーカーの場合には、受容体又は酵素の活性を測定することがで きる。例えば、コリンアセチルトランスフェラーゼとアセチルコリンエステラー ゼのような神経伝達物質代謝酵素の活性は、標準の放射能測定酵素活性分析を用 いて測定することができる。 Ｇ．培養細胞を用いるスクリーニング分析 化合物の治療能力を判定するためのスクリーニング分析は、開示されたパーレ カン構築体に関するトランスジェニック動物由来の細胞若しくは開示された構築 体によって安定にトランスフェクトされた細胞培養物から、又はパーレカン・ト ランスジェニック・マウスと、アルツハイマー病に関係する他のトランスジェニ ック動物(transgenics)との交配に由来する子孫から得られた細胞を用いておこ なうこともできる。例えば、パーレカンを過剰産生するＰ１９細胞は、培地中の Ａβレベルの顕著な上昇をも実証する。好ましい実施態様では、アルツハイマー 病に対する可能な治療化合物をパーレカン・トランスフェクトＰ１９細胞、又は パーレカン・トランスフェクションのためにＡβ産生の増加を示す他の細胞種類 に対して試験する。このような試験に関して、導出されたトランスジェニック細 胞又はトランスフェクト細胞培養物を、５％二酸化炭素と平衡させたインキュベ ーター中で３７℃において一晩インキュベートした後に、培地を取り出し、細胞 による２時間の予備処理期間のために試験すべき化合物を含有する培地と交換し て、上述のようにインキュベートする。予備処理期間の終了時に、培地を再び取 り出し、試験すべき化合物を含有する新鮮な培地と交換して（上記と同様）、細 胞をさらに２〜１６時間インキュベートする。処理後に、プレートをＢｅｃｋｍ ａｎＧＰＲ中で１２００ｒｐｍ、室温において５分間遠心分離して、条件培地(c onditioned media)から細胞破片をペレット化させる。各穴から、１００μｌの 条件培地又はその適当な希釈物を、国際特許出願第５４／１０５６９号に述べら れているように、抗体２６６（Ａβのアミノ酸１３〜２８に対する抗体）を予め 供給したＥＬＩＳＡプレートに移し、４℃に一晩貯蔵する。Ａβに対する任意の 標識抗体（例えば、Ｓｅｎｅｔｅｋからの４Ｇ８）を用いるＥＬＩＳＡ分析をお こなって、産生したＡβ量を測定することができる。異なる捕捉抗体(capture a ntibody)と検出抗体とを用いることもできる。さらに、例えば、開示された発明 の実施例６に述べられたＭＴＳ分析のような、種々な細胞傷害性分析を用いて、 化合物が細胞を神経変性(neurodegeneration)又はニューロン死亡から保護する かどうかを判定することができる。 Ｈ．他のアミロイド疾患に有効な化合物のスクリーニング パーレカン・トランスジェニック・マウス、トランスフェクト細胞、若しくは 本発明において開示するようなトランスジェニック・マウス由来細胞を単独で、 又は他のトランスジェニック・マウス、トランスフェクト細胞、若しくはある一 定のアミロイド疾患に関係する他のトランスジェニック・マウス由来細胞と組合 せて用いて、アミロイド疾患（アミロイド疾患のうちのアルツハイマー病型以外 ）の新規な動物モデル及び細胞培養物モデルを作出することができる。例えば、 パーレカン・マウスと、島アミロイド(islet amyloid)（アミリン）を過剰産生 するトランスジェニック動物との交配は、膵臓における島アミロイド沈着を完全 に模倣した新規な動物モデルを示す子孫を作出することができる。このようなト ランスジェニック動物のアミロイド形成では、アミロイドタンパク質（アルツハ イマー病Ａβ以外）の沈着、蓄積及び／又は持続は末梢組織で生じ、このことは これらの動物を、抗アミロイド化合物が組織における特異的アミロイドタンパク 質の蓄積に影響を与えるか又はこのような蓄積を減じるかどうかを判定するため の抗アミロイド化合物のスクリーニングに有用なものにする。初期の分析は、非 限定的に、ＡＡアミロイド、ＡＬアミロイド、島アミロイド（即ち、アミリン） 、β2−ミクログロブリン、トランスチレチン／プレアルブミン、プロカルシト ニン及びＰｒＰアミロイド（脳アミロイドーシス）に対するものを含めて、商業 的に入手可能な特異的抗アミロイド抗体を用いる、ある一定のアミロイドタンパ ク質のレベル及び免疫局在(immunolocalization)の検出と、化合物処理動物とプ ラセボ処理動物との比較を包含しうる。さらに、例えばＣｏｎｇｏ ｒｅｄ（偏 光下で観察）又はＴｈｉｏｆｌａｖｉｎ Ｓ（蛍光下で観察）のような特異的ア ミロイドステインによる検出後に、アミロイドの程度の定性的及び定量的評価を おこなうことができる。このような評価では、ある一定の化合物を種々な用量で 、種々な処理期間にわたって、組織中でのアミロイド形成、沈着、蓄積及び持続 の種々なステージにおいて動物に投与する。ある一定の化合物は、アミロイドタ ンパク質の免疫染色、Ｃｏｎｇｏ ｒｅｄ染色（偏光下で観察）又はＴｈｉｏｆ ｌａｖｉｎ Ｔ蛍光の相関的な減少又は排除による、アミロイドの減少又は排除 によって有効であるといわれる。さらに、電子顕微鏡分析をある一定の組織中の アミロイド・フィブリルの検出と局在のために用いることができ、動物群におけ る化合物治療の前及び後に定性的及び定量的評価をおこなうことができる。上記 スクリーニング分析の全てにおいて、有効な化合物は特定の組織又は動物におけ るアミロイドを減少又は排除する化合物である。 新規なアミロイド疾患モデル パーレカン・トランスジェニック・マウスを、他のアミロイドタンパク質又は ある一定のアミロイド疾患に関係する他の成分を過剰産生するトランスジェニッ ク・マウスと交雑させる方法も、アミロイドーシスの治療のための新規な治療剤 を同定するためのスクリーニング・ツールとして使用可能である、種々なアミロ イドーシスの新規な動物モデルを作出する。 好ましい１実施態様では、β−アミロイド前駆体タンパク質の任意のアイソフ ォーム（及び／又はその一部）を過剰産生するトランスジェニック・マウスと交 配させたパーレカン・トランスジェニック・マウスは、パーレカンとβＰＰの両 方を過剰産生するトランスジェニック子孫を作出する。この新規なトランスジェ ニック動物モデルをスクリーニング・ツールとして用いて、アルツハイマー病、 Ｄｏｗｎ症候群及びＤｕｔｃｈ型のアミロイドーシスによる大脳出血に観察され るＡβアミロイドーシスをターゲットとする可能な治療薬を同定することができ る。 他の好ましい実施態様では、パーレカン・トランスジェニック・マウスを、Ａ β含有タンパク質がβＰＰ−７７０、アミノ酸６６９、６７０、６７１、６９０ 、６９２及び７１７から成る群から選択される１つ以上のアミノ酸に突然変異を 有するβＰＰ−７７０、βＰＰ−７５１、アミノ酸６６９、６７０、６７１、６ ９０、６９２及び７１７から成る群から選択される１つ以上のアミノ酸に突然変 異を有するβＰＰ−７５１、βＰＰ−６９５、アミノ酸６６９、６７０、６７１ 、６９０、６９２及び７１７から成る群から選択される１つ以上のアミノ酸に突 然変異を有するβＰＰ−６９５から成る群から選択されるタンパク質の全て又は 連続する部分から構成され、Ａβ含有タンパク質はヒトβＰＰのアミノ酸６７２ 〜７１４を包含するトランスジェニック・マウスと交配させる。 他の好ましい実施態様では、パーレカン・トランスジェニック・マウスを、プ レセニリン(presenilin)１、プレセニリン２を過剰産生するトランスジェニック ・マウスと交配させる、又はプレセニリン１若しくはプレセニリン２に対する突 然変異を含有するトランスジェニック動物と交配させる。 別の好ましい実施態様では、パーレカン・トランスジェニック・マウスを、ラ ミニン、ＩＶ型コラーゲン、ヘパラン硫酸ＰＧ類、コンドロイチン硫酸ＰＧ類、 デルマタン硫酸ＰＧ類、ケラタン硫酸ＰＧ類、グリピカン、シンデカン、シンデ カン−３、ニューロカン(neurocan)、ホスファカン(phosphacan)、アグレカン(a ggrecan)、デコリン(decorin)、ビグリカン、ヒアルロナン、アミロイドＰ成分 、α1−アンチキモトリプシン、カテプシンＤ、カテプシンＧ、カテプシンＢ、 ニューロン・スレッド・タンパク質、ニコチン受容体、５−ＨＴ2受容体、ＮＭ ＤＡ受容体、α２−アドレナリン受容体、シナプトフィシン、ｐ６５、グルタミ ン・シンテターゼ、グルコース輸送体、ＰＰＩキナーゼ、ＧＡＰ４３、シトクロ ムキナーゼ、ヘムオキシゲナーゼ、カルビンジン、アデノシンＡ１受容体、コリ ンアセチルトランスフェラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グリア線維酸性 タンパク質、α１−アンチトリプシン、Ｃ−反応性タンパク質、α２−マクログ ロブリン、インターロイキン−１α、インターロイキン−１β、ＴＮＦ−α、イ ンターロイキン−６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｄ、ＨＬＡ−Ｃ、Ｃ Ｒ３受容体、ＭＨＣ Ｉ、ＭＨＣ ＩＩ、ＣＤ３１、ＣＲ４、ＣＤ４５、ＣＤ６ ４、ＣＤ４、スペクトリン、τタンパク質、ユビキチン、ＭＡＰ−２、アポリポ タンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ｅ４、アポリポタンパク質Ｅ２、アポリポタ ンパク質Ｅ３、神経増殖因子、脳由来神経栄養因子、進行グリコシル化最終生成 物、進行グリコシル化最終生成物の受容体、ＣＯＸ−２、ＣＤ１８、Ｃ３線維芽 細胞増殖因子、ＣＤ４４、ＩＣＡＭ−１、ラクトトランスフェリン、Ｃ１ｑ、Ｃ ３ｄ、Ｃ４ｄ、Ｃ５ｂ−９、γＲ１、Ｐｃ−ｆＲＩＩ、ＣＤ８、ＣＤ５９、ビト ロネクチン、ビトロネクチン受容体、β−３インテグリン、ＡｐｏＪ、クラステ リン、２型プラスミノーゲンアクチベーター・インヒビター、ミドライン(midli ne）、マクロファージ・コロニー刺激因子受容体、ＭＲＰ１４、２７Ｅ１０、イ ン ターフェロン−α、Ｓ１００β、ｃＰＬＡ2、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｆｏｓ、ＨＳＰ ２７、ＨＳＰ７０、ＭＡＰ５、膜脂質ペルオキシダーゼ、タンパク質カルボニル 形成(protein carbonyl formation)、ｊｕｎＢ、ｊｕｎＤ、ｆｏｓＢ、ｆｒａｌ 、サイクリンＤ１、ｐ５３、ＮＧＦＩ−Ａ、ＮＧＦＩ−Ｂ、Ｉ−κ−Ｂ、ＮＦ− κ−Ｂ、インターロイキン−８、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、マトリックス・メ タロプロテイナーゼ及び４−ヒドロキシノネナール−タンパク質コンジュゲート から成る群から選択されたタンパク質を過剰発現するトランスジェニック・マウ スと交配させる。 他の好ましい実施態様では、ＡＬアミロイド（及び／又はその一部）を過剰発 現するトランスジェニック・マウスと交配させたパーレカン・トランスジェニッ ク・マウスは、パーレカンとＡＬアミロイドの両方を過剰発現するトランスジェ ニック子孫を作出する。この新規なトランスジェニック動物モデルは、多発性骨 髄腫及び他のβ細胞悪液質において観察されるようなＡＬアミロイドーシスをタ ーゲットとする可能な治療薬を同定するためのスクリーニング・ツールとして使 用可能である。 他の好ましい実施態様では、島アミロイド（アミリン）を過剰発現するトラン スジェニック・マウスと交配させたパーレカン・トランスジェニック・マウスは 、パーレカンとアミリンの両方を過剰発現するトランスジェニック子孫を作出す る。この新規なトランスジェニック動物モデルは、Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ−Ｊ ａｃｏｂ疾患、Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ症候群、クールー及 び動物スクラピーにおいて観察されるようなＰｒＰアミロイドーシスをターゲッ トとする可能な治療薬を同定するためのスクリーニング・ツールとして使用可能 である。 さらに他の好ましい実施態様では、β2−ミクログロブリンを過剰発現するト ランスジェニック・マウスと交配させたパーレカン・トランスジェニック・マウ スは、パーレカンとβ2−ミクログロブリンの両方を過剰発現するトランスジェ ニック子孫を作出する。この新規なトランスジェニック動物モデルは、長期間血 液透析及び手根管症候群において観察されるようなβ2−ミクログロブリン・ア ミロイドーシスをターゲットとする可能な治療薬を同定するためのスクリーニン グ・ツールとして使用可能である。 他の好ましい実施態様では、プレアルブミン／トランスチレチンを過剰発現す るトランスジェニック・マウスと交配させたパーレカン・トランスジェニック・ マウスは、パーレカンとプレアルブミン／トランスチレチンの両方を過剰発現す るトランスジェニック子孫を作出する。この新規なトランスジェニック動物モデ ルは、老人性心臓アミロイドと家族性アミロイドーシス性多発性神経障害におい て観察されるようなプレアルブミン／トランスチレチン・アミロイドーシスをタ ーゲットとする可能な治療薬を同定するためのスクリーニング・ツールとして使 用可能である。 さらに他の好ましい実施態様では、種々なプロカルシトニンを過剰発現するト ランスジェニック・マウスと交配させたパーレカン・トランスジェニック・マウ スは、パーレカンと種々なプロカルシトニンの両方を過剰発現するトランスジェ ニック子孫を作出する。この新規なトランスジェニック動物モデルは、例えば甲 状腺の髄質癌におけるような内分泌腫瘍に関連するアミロイドをターゲットとす る可能な治療薬を同定するためのスクリーニング・ツールとして使用可能である 。 さらに他の好ましい実施態様では、パーレカン・トランスジェニック・マウ スを、特定のアミロイドタンパク質を、又は上述したようなアミロイド疾患にお いて重要であるように関係するタンパク質を発現しないか、さもなくば通常より も非常に低いレベルで発現する“ノックアウト(knock-out)”トランスジェニッ ク・マウスと交配させる。これらの新規なトランスジェニック動物モデルは、種 々なアミロイド疾患をターゲットとする可能な治療薬を同定するためのスクリー ニング・ツールとして使用可能である。 さらに他の好ましい実施態様では、マウス受精卵（単細胞ステージ胚）中にパ ーレカンとアミロイドタンパク質の両方のＤＮＡ構築体を注入することによって 、パーレカンと任意のアミロイドタンパク質（アミロイド前駆体タンパク質及び ／又はそのフラグメント）の両方を過剰発現するトランスジェニック・マウスを 作出する。両方のＤＮＡ構築体を有する胚を偽妊娠した育ての母親の輸卵管に移 す。産まれた子ネズミの尾をサザン・ブロット分析又はＰＣＲ分析のために切断 して、両方の導入遺伝子の染色体組込みを調べる。両方の導入遺伝子に関して陽 性と判定された子ネズミを他のマウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と交雑させ て、両方のＤＮＡ構築体を有するトランスジェニック・マウスの系統を確立する 。 本出願を通して、種々な刊行物を括弧に入れて参照している。これらの刊行物 は、本発明が属する技術分野の状態をより詳しく説明するために、それらの全体 において本明細書に援用される。 本発明を開示した実施態様に関連して説明してきたが、詳述した特定の実験が 本発明の例示に過ぎないことを、当業者は理解するであろう。種々な改変が本発 明の要旨から逸脱せずになされうることを理解すべきである。したがって、本発 明は以下の請求の範囲によってのみ限定される。
【手続補正書】特許法第１８４条の４第４項 【提出日】平成９年１１月２０日（１９９７．１１．２０） 【補正内容】 １．パーレカンをコードする導入遺伝子(transgene)を発現するトランスジ ェニック非ヒト動物。 ２．遺伝子構築体が、β−アクチンプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩプ ロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、ポリペプチド鎖延長因子１ −αプロモーター、神経線維Ｍプロモーター、神経線維Ｌプロモーター、グリア 線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、メタロチオネインＩプロモータ ー、メタロチオネインＩＩプロモーター、プリオンタンパク質プロモーター、イ ンスリンプロモーター、低アフィニティＮＧＦ受容体（ｐ７５）プロモーター、 ヒトβＰＰプロモーター、マウスβＰＰプロモーター、ラットβＰＰプロモータ ー、メタロチオニンプロモーター、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター、 ヒトβアクチン遺伝子プロモーター、ヒトＴｈｙ−Ｉ遺伝子プロモーター、ヒト 血小板由来増殖因子β（ＰＤＧＦ−β）鎖遺伝子プロモーター、ラットナトリウ ムチャンネル遺伝子プロモーター、マウスミエリン塩基性タンパク質遺伝子プロ モーター、ヒト銅−亜鉛スーパーオキシド・ジスムターゼ遺伝子プロモーター及 び哺乳動物ＰＯＵドメイン制御遺伝子プロモーター；又はこれらの組合せから選 択されるプロモーターに結合している、請求項１記載のトランスジェニック非ヒ ト哺乳動物。 ３．前記導入遺伝子がニワトリβ−アクチンプロモーターとヒトサイトメガ ロウイルスエンハンサーとの転写制御下にある、請求項１記載のトランスジェニ ック非ヒト哺乳動物。 ４．前記導入遺伝子がＲＮＡプロセシングシグナルをコードするＤＮＡを含 有する、請求項１記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。 ５．前記ＤＮＡがニワトリβ−アクチンイントロン配列とウサギβ−グロビ ンイントロン配列とを含む、請求項４記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物 。 ６．前記ニワトリβ−アクチンイントロンとウサギβ−グロビンイントロン が、パーレカンをコードするＤＮＡに近位である、請求項５記載のトランスジェ ニック非ヒト哺乳動物。 ７．前記ニワトリβ−アクチンイントロンとウサギβ−グロビンイントロン が、パーレカンをコードするＤＮＡに遠位である、請求項６記載のトランスジェ ニック非ヒト哺乳動物。 ８．前記ＤＮＡがウサギβ−グロビンポリアデニル化シグナルを含む、請求 項３記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。 ９．前記ウサギβ−グロビンポリアデニル化シグナルが、パーレカンをコー ドするＤＮＡに遠位である、請求項３記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物 。 １０．固有の制限部位を用いて、７つの重複するｃＤＮＡクローンを一緒に ライゲートさせて、パーレカンの〜４００キロダルトンコアタンパク質をコード する単一〜１２ｋｂ ｃＤＮＡクローンを作製する、トランスジェニック非ヒト 哺乳動物の作出方法。 １１．前記パーレカンＤＮＡがパーレカンをコードする配列を含む、請求項 １記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。 １２．前記パーレカンＤＮＡがマウスパーレカンをコードする配列を含む、 請求項１１記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。 １３．前記パーレカンＤＮＡがヒトパーレカンをコードする配列を含む、請 求項１１記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。 ２９．パーレカンと、β−アミロイド前駆体タンパク質とをコードする導入 遺伝子を発現する、二重トランスジェニック非ヒト哺乳動物。 ３０．β−アミロイド前駆体タンパク質導入遺伝子が、βＰＰ−７７０、ア ミノ酸６６９、６７０、６７１、６９０、６９２及び７１７から成る群から選択 される１つ以上のアミノ酸に突然変異を有するβＰＰ−７７０、βＰＰ−７５１ 、アミノ酸６６９、６７０、６７１、６９０、６９２及び７１７から成る群から 選択される１つ以上のアミノ酸に突然変異を有するβＰＰ−７５１、βＰＰ−６ ９５、並びにアミノ酸６６９、６７０、６７１、６９０、６９２及び７１７から 成る群から選択される１つ以上のアミノ酸に突然変異を有するβＰＰ−６９５か ら成る群から選択されるタンパク質の全て又は連続する一部をコードし、Ａβ含 有タンパク質力化トβＰＰのアミノ酸６７２〜７１４を包含している、請求項２ ９記載の二重トランスジェニック非ヒト哺乳動物。 ３１．パーレカン導入遺伝子と、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、グリピカン 、シンデカン、シンデカン−３、ニューロカン、ホスファカン、アグレカン、デ コリン、ビグリカン、ヒアルロナン、アミロイドＰ成分、α1−アンチキモトリ プシン、カテプシンＤ、カテプシンＧ、カテプシンＢ、ニューロン・スレッド・ タンパク質、ニコチン受容体、５−ＨＴ2受容体、ＮＭＤＡ受容体、α２−アド レナリン受容体、シナプトフィシン、ｐ６５、グルタミン・シンテターゼ、グル コース輸送体、ＰＰＩキナーゼ、ＧＡＰ４３、ＴＧＦ−β、プレセニリンＩ、プ レセニリンＩＩ、ＮＡＣ（非アミロイドβ−タンパク質成分）、シトクロムキナ ーゼ、ヘモオキシゲナーゼ、カルビンジン、アデノシンＡ１受容体、コリンアセ チルトランスフェラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グリア線維酸性タンパ ク質、α１−アンチトリプシン、Ｃ−反応性タンパク質、α２−マクログロブリ ン、インターロイキン−１α、インターロイキン−１β、ＴＮＦ−α、インター ロイキン−６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｄ、ＨＬＡ−Ｃ、ＣＲ３受 容体、ＭＨＣ Ｉ、ＭＨＣ ＩＩ、ＣＤ３１、ＣＲ４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、Ｃ Ｄ４、スペクトリン、τタンパク質、ユビキチン、ＭＡＰ−２、アポリポタンパ ク質Ｅ、アポリポタンパク質Ｅ４、アポリポタンパク質Ｅ２、アポリポタンパク 質Ｅ３、神経増殖因子、脳由来神経栄養因子、進行グリコシル化最終生成物、進 行グリコシル化最終生成物の受容体、ＣＯＸ−２、ＣＤ１８、Ｃ３線維芽細胞増 殖因子、ＣＤ４４、ＩＣＡＭ−１、ラクトトランスフェリン、Ｃ１ｑ、Ｃ３ｄ、 Ｃ４ｄ、Ｃ５ｂ−９、γＲ１、Ｐｃ７ＲＩＩ、ＣＤ８、ＣＤ５９、ビトロネクチ ン、ビトロネクチン受容体、β−３インテグリン、ＡｐｏＪ、クラステリン、２ 型プラスミノーゲンアクチベーター・インヒビター、ミドライン、マクロファー ジ・コロニー刺激因子受容体、ＭＲＰ１４、２７Ｅ１０、インターフェロン−α 、Ｓ１００β、ｃＰＬＡ2、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｆｏｓ、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ７０ 、ＭＡＰ５、膜脂質ペルオキシダーゼ、タンパク質カルボニル形成、ｊｕｎＢ、 ｊｕｎＤ、ｆｏｓＢ、ｆｒａｌ、サイクリンＤ１、ｐ５３、ＮＧＦＩ−Ａ、ＮＧ ＦＩ−Ｂ、Ｉ−κ−Ｂ、ＮＦ−κ−Ｂ、インターロイキン−８、ＭＣＰ−１、Ｍ ＩＰ−１α、マトリックス・メタロプロテイナーゼ及び４−ヒドロキシノネナー ル−タンパク質コンジュゲートから成る群から選択されたタンパク質をコードす る導入遺伝子とを発現する二重トランスジェニック非ヒト哺乳動物。 ３２．パーレカン導入遺伝子を発現するが、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、 グリピカン、シンデカン、シンデカン−３、ニューロカン、ホスファカン、アグ レカン、デコリン、ビグリカン、ヒアルロナン、アミロイドＰ成分、α1−アン チキモトリプシンＤ、カテプシンＧ、カテプシンＢ、ニューロン・スレッド・タ ンパク質、ニコチン受容体、５−ＨＴ2受容体、ＮＭＤＡ受容体、α２−アドレ ナリン受容体、シナプトフィシン、ｐ６５、グルタミン・シンテターゼ、グルコ ース輸送体、ＰＰＩキナーゼ、ＧＡＰ４３、ＴＧＦ−β、プレセニリンＩ、プレ セニリンＩＩ、ＮＡＣ（非アミロイドβ−タンパク質成分）、シトクロムキナー ゼ、ヘモオキシゲナーゼ、カルビンジン、アデノシンＡ１受容体、コリンアセチ ルトランスフェラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グリア線維酸性タンパク 質、α１−アンチトリプシン、Ｃ−反応性タンパク質、α２−マクログロブリン 、インターロイキン−１α、インターロイキン−１β、ＴＮＦ−α、インターロ イキン−６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｄ、ＨＬＡ−Ｃ、ＣＲ３受容 体、ＭＨＣ Ｉ、ＭＨＣ ＩＩ、ＣＤ３１、ＣＲ４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ ４、スペクトリン、τタンパク質、ユビキチン、ＭＡＰ−２、アポリポタンパク 質Ｅ、アポリポタンパク質Ｅ４、アポリポタンパク質Ｅ２、アポリポタンパク質 Ｅ３、神経増殖因子、脳由来神経栄養因子、進行グリコシル化最終生成物、進行 グリコシル化最終生成物の受容体、ＣＯＸ−２、ＣＤ１８、Ｃ３線維芽細胞増殖 因子、ＣＤ４４、ＩＣＡＭ−１、ラクトトランスフェリン、Ｃ１ｑ、Ｃ３ｄ、Ｃ ４ｄ、Ｃ５ｂ−９、γＲ１、Ｐｃ７ＲＩＩ、ＣＤ８、ＣＤ５９、ビトロネクチン 、ビトロネクチン受容体、β−３インテグリン、ＡｐｏＪ、クラステリン、２型 プラスミノーゲンアクチベーター・インヒビター、ミドライン、マクロファージ ・コロニー刺激因子受容体、ＭＲＰ１４、２７Ｅ１０、インターフェロン−α、 Ｓ１００β、ｃＰＬＡ2、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｆｏｓ、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ７０、 ＭＡＰ５、膜脂質ペルオキシダーゼ、タンパク質カルボニル形成、ｊｕｎＢ、ｊ ｕｎＤ、ｆｏｓＢ、ｆｒａ１、サイクリンＤ１、ｐ５３、ＮＧＦＩ−Ａ、ＮＧＦ Ｉ−Ｂ、Ｉ−κ−Ｂ、ＮＦ−κ−Ｂ、インターロイキン−８、ＭＣＰ−１、ＭＩ Ｐ−１α、マトリックス・メタロプロテイナーゼ及び４−ヒドロキシノネナール −タンパク質コンジュゲートから成る群から選択されたタンパク質をコードする 導入遺伝子を発現しない（即ち、ノックアウトマウス）二重トランスジェニック 非ヒト哺乳動物。 ３３．パーレカンとアミロイドとをコードする導入遺伝子を発現する二重ト ランスジェニック非ヒト哺乳動物。 ３４．アミロイドをコードする導入遺伝子が、アルツハイマー病（Ａβ、プ レセニリン１及びプレセニリン２を包含する）、Ｄｏｗｎ症候群及びＤｕｔｃｈ 型アミロイドーシスによる遺伝性大脳出血（Ａβを包含する）に関連したアミロ イドタンパク質及びその前駆体タンパク質（βＰＰ）と、慢性炎症、種々な形態 の悪性疾患及び家族性地中海熱（ＡＡアミロイド）に関連したアミロイドタンパ ク質と、多発性骨髄腫及び他のＢ細胞異常（ＡＬアミロイド）に関連したアミロ イドタンパク質と、ＩＩ型糖尿病（アミリン又は島アミロイド）に関連したアミ ロイドタンパク質と、Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ−Ｊａｃｏｂ疾患、Ｇｅｒｓｔｍ ａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ症候群、クールー及び動物スクラピー（ＰｒＰア ミロイド）を包含するプリオン疾患に関連したアミロイドタンパク質と、長期間 血液透析及び手根管症候群（β2−ミクログロブリン）に関連したアミロイドタ ンパク質と、老人性心臓アミロイド及び家族性アミロイドーシス性多発性神経障 害（プレアルブミン又はトランスチレチン・アミロイド）に関連したアミロイド タンパク質と、例えば甲状腺の髄質癌のような内分泌腫瘍（種々なプロカルシト ニン）に関連するアミロイドと、これらの全てのフラグメントと、組合せ又は突 然変異とから成る群から選択されるアミロイドタンパク質をコードする、請求項 ３３記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ， ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 ハッセル，ジョン アメリカ合衆国ペンシルバニア州15217, ピッツバーグ，モルヴァーン・アベニュー 1212

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．パーレカンをコードする導入遺伝子を発現するトランスジェニック非ヒ ト動物。 ２．パーレカンとアミロイドとをコードする導入遺伝子を発現する二重トラ ンスジェニック非ヒト動物。 ３．アミロイド沈着の速度又は程度を変化させる化合物のスクリーニング方 法であって、 （ａ）パーレカン・トランスジェニック動物を構築する工程と； （ｂ）有効量の試験化合物を前記パーレカン・トランスジェニック動物に投与 する工程と； （ｃ）前記試験化合物がアミロイド沈着の程度又は速度を変化させるかどうか を判定する工程と を含む上記方法。 ４．アミロイド沈着の速度又は程度を変化させる化合物のスクリーニング方 法であって、 （ａ）パーレカン／アミロイド・二重トランスジェニック動物を構築する工程 と； （ｂ）有効量の試験化合物を前記パーレカン／アミロイド・二重トランスジェ ニック動物に投与する工程と； （ｃ）前記試験化合物がアミロイド沈着の程度又は速度を変化させるかどうか を判定する工程と を含む上記方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003522737A (ja) * 1999-11-05 2003-07-29 ワイエス アミロイド阻害化合物を同定しそして使用するための方法

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030017998A1 (en) * 1997-05-16 2003-01-23 Snow Alan D. Proanthocyanidins for the treatment of amyloid and alpha-synuclein diseases
AU1159601A (en) * 1999-11-03 2001-05-14 Metris Therapeutics Limited Agents implicated in endometriosis
US20010047032A1 (en) * 1999-12-30 2001-11-29 Castillo Gerardo M. Polyhydroxylated aromatic compounds for the treatment of amyloidosis and alpha-synuclein fibril diseases
CA2408124A1 (en) * 2000-05-05 2001-11-15 Harry M. Meade Transgenically produced decorin
WO2002005634A2 (en) * 2000-07-13 2002-01-24 University Of South Florida Transgenic animal and methods
US20070208087A1 (en) 2001-11-02 2007-09-06 Sanders Virginia J Compounds, compositions and methods for the treatment of inflammatory diseases
WO2003101927A1 (en) * 2002-05-31 2003-12-11 Proteotech, Inc. Compounds, compositions and methods for the treatment of amyloid diseases and synucleinopathies such as alzheimer's disease, type 2 diabetes, and parkinson's disease
CA2499549C (en) * 2002-10-11 2012-01-24 Proteotech, Inc. Isolation, purification and synthesis of procyanidin b2 and uses thereof
GB2434578A (en) * 2006-01-26 2007-08-01 Univ Basel Transgenic animals
WO2010009279A1 (en) * 2008-07-15 2010-01-21 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Methods and compositions for treating alzheimer's disease
CA2804154C (en) 2010-07-01 2021-06-01 The Texas A&M University System Perlecan domain v protects, repairs and restores ischemic brain stroke injury and motor function
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CA3137761A1 (en) 2019-06-04 2020-12-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ttr locus with a beta-slip mutation and methods of use

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5672805A (en) 1991-07-18 1997-09-30 The Regents Of The University Of California Transgenic mice expressing the neurotoxic C-terminus of β-amyloid precursor protein
CA2127450C (en) 1992-01-07 2007-04-17 Samuel Wadsworth Transgenic animal models for alzheimer's disease
JPH07132033A (ja) 1993-11-12 1995-05-23 Hoechst Japan Ltd アルツハイマー病モデルトランスジェニック動物

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003522737A (ja) * 1999-11-05 2003-07-29 ワイエス アミロイド阻害化合物を同定しそして使用するための方法

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