KR101514282B1 - Ｐｔｐｒｔ 및 신탁신―결합 단백질 1을 이용한 시냅스 형성 조절제의 스크리닝 방법 - Google Patents

Ｐｔｐｒｔ 및 신탁신―결합 단백질 1을 이용한 시냅스 형성 조절제의 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단백질 타이로신 탈인산화효소 수용체 T(protein tyrosine phosphatase receptor T; PTPRT) 및 신탁신-결합 단백질 1(syntaxin-binding protein 1)을 이용한 시냅스 형성 조절제의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 구체적으로 PTPRT에 의해 탈인산화 되는 신규한 기질인 신탁신-결합 단백질 1이 신탁신 1(syntaxin 1)과 결합하여 SNARE 복합체 형성을 촉진함을 확인함으로써, 상기 PTPRT 및 PTPRT의 신규한 기질인 신탁신-결합 단백질 1은 SNARE 복합체 형성 촉진제를 포함한 시냅스 형성 조절제의 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ＰＴＰＲＴ 및 신탁신―결합 단백질 1을 이용한 시냅스 형성 조절제의 스크리닝 방법{A screening method of agent for regulating synaptogenesis using PTPRT and syntaxin-binding protein 1}
본 발명은 단백질 타이로신 탈인산화효소 수용체 T(protein tyrosine phosphatase receptor T; PTPRT) 및 PTPRT의 신규한 기질인 신탁신-결합 단백질 1(syntaxin-binding protein 1)을 이용한 시냅스 형성 조절제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
신경전달물질의 분비를 위해서는 신경전달물질을 담지하고 있는 소포 (vesicle)의 표면에 존재하는 시냅토브레빈(Synaptobrevin), VAMP(Vesicle-associate membrane protein)와 전시냅스 세포막 (pre-synaptic plasma membrane)에 존재하는 SNAP25, 신탁신(Syntaxin)의 3개의 단백질이 SNARE(soluble N-ethylmalei-44 mide-sensitive factor attachment protein receptor) 복합체를 형성하고 Ca2 +의 자극에 의해 세포외로 분비된다.
신탁신-결합 단백질 1(syntaxin-binding protein 1, Sec/Munc18-like protein)은 SNARE 복합체의 구성단백질로 잘 알려져 있지는 않지만, 신탁신 1과 단단한 결합 덕분에 시냅스 소포체 융합(synaptic vesicle fusion)과 연관지어 진다. 진핵 세포에서 세포막 융합은 SNAREs 및 신탁신-결합 단백질의 조립에 의해 매개된다. 신탁신-결합 단백질 1은 SNAREs와 결합하여 활성화를 조절한다. 원래, Sec1/Munc18 단백질(포유류 상동 unc-18, mammalian homologue of unc-18)은 신탁신에 안정하게 결합하는 뇌 단백질이다. 신탁신-결합 단백질 1에 결합된 신탁신 1은 신탁신 1의 파트너인 SNAREs가 접근할 수 없게 만드는 "닫힘(closed)" 형태를 취하는 것으로 보인다. 따라서, 신탁신 1은 신탁신-결합 단백질 1과 분리되고 "열림(open)" 형태로 바뀌어야 SNARE 복합체에 결합할 수 있다. 그러나, 열린 신탁신 1 돌연변이(L165A, E166A)는 신탁신-결합 단백질 1과 상호작용하는데 아무런 영향을 미치지 않으며, 그 대신, 신탁신 1의 N-말단 모티프가 변형되었을 때(L8A), 신탁신-결합 단백질 1과의 상호작용이 완화되고 SNARE-촉매화된 막 융합에 있어서 신탁신-결합 단백질 1의 촉진성 기능이 극단적으로 완화된다고 보고되고 있다. 최근 막 융합 동안 신탁신-결합 단백질 1의 1차 타겟이 3차 SNARE 복합체인 것으로 생각되며, 이는 신탁신 1의 N-말단 뿐만 아니라 t- 및 v-SNARE 서브유닛(subunit)으로부터 핵심 영역(core regions)을 포함한 신탁신-결합 단백질 1과 다중 접촉 부위를 형성한다고 보고되고 있다.
신탁신-결합 단백질 3(Munc18c)는 타이로신 인산화를 통해 조절되고, 신탁신-결합 단백질 3의 인산화는 신탁신 4로부터 신탁신-결합 단백질 3을 분리할 수 있다. 이러한 신탁신-결합 단백질의 활성화는 사이클린-의존적 키나아제 5(cyclin-dependent kinase 5) 또는 단백질 키나아제 C에 의해 세린/트레오닌(serine/threonine) 잔기의 인산화를 통해 조절된다. 그러나, 타이로신 키나아제 또는 타이로신 탈인산화효소에 의한 신탁신-결합 단백질의 조절 역할이 아직 알려져 있지 않으며, 인산화의 조절 기작 역시 알려져 있지 않다.
단백질 타이로신 탈인산화효소 수용체 T(protein tyrosine phosphatase receptor T; PTPRT)는 중추신경계에서 주로 발현되고, 시냅스 형성 및 시냅스 신호 전달을 조절한다. PTPRT 활성은 신경세포의 타이로신 인산화효소 Fyn에 의해 조절된다. PTPRT 기질은 암 세포에서 일부 확인되고 있지만, 신경세포 발달과 연관된 PTPRT 특이적 기질은 많이 알려져 있지 않다.
이에 본 발명자들은 PTPRT에 대한 신경세포의 기질을 찾기 위해 노력한 결과, PTPRT 항체에 의해 매개되는 면역침강반응을 적용한 프로테오믹스 접근법을 랫트 뇌 시냅토솜(synaptosome)에 적용하여 신탁신-결합 단백질 1이 PTPRT의 신규한 기질임을 확인하고, PRPRT에 의해 탈인산화 된 신탁신-결합 단백질 1이 신탁신 1과 결합하여 SNARE 복찹체 형성을 촉진함을 확인함으로써, 상기 PTPRT 및 PTPRT의 신규한 기질인 신탁신-결합 단백질 1이 시냅스 형성 조절제의 스크리닝에 유용하게 이용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은
1) 피검 물질을 단백질 타이로신 탈인산화효소 수용체 T(protein tyrosine phosphtase receptor T; PTPRT) 또는 이의 단편, 및 신탁신-결합 단백질 1(syntaxin-binding protein 1) 발현 세포주에 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 세포주에서 신탁신-결합 단백질 1의 탈인산화 정도를 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 결과를 대조군으로서 피검 물질을 처리하지 않는 PTPRT 또는 이의 단편, 및 신탁신-결합 단백질 1 발현 세포주와 비교하여 신탁신-결합 단백질 1의 탈인산화 정도를 증가시키는 피검 물질을 선별하는 단계를 포함하는 시냅스 형성 조절제 스크리닝 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
1) 피검 물질을 단백질 타이로신 탈인산화효소 수용체 T(protein tyrosine phosphtase receptor T; PTPRT) 또는 이의 단편, 및 신탁신-결합 단백질 1(syntaxin-binding protein 1) 발현 세포주에 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 세포주에서 신탁신-결합 단백질 1의 탈인산화 정도를 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 결과를 대조군으로서 피검 물질을 처리하지 않는 PTPRT 또는 이의 단편, 및 신탁신-결합 단백질 1 발현 세포주와 비교하여 신탁신-결합 단백질 1의 탈인산화 정도를 증가시키는 피검 물질을 선별하는 단계를 포함하는 시냅스 형성 조절제 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 피검 물질을 단백질 타이로신 탈인산화효소 수용체 T(protein tyrosine phosphtase receptor T; PTPRT) 또는 이의 단편, 및 신탁신-결합 단백질 1(syntaxin-binding protein 1) 발현 세포주에 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 세포주에서 신탁신-결합 단백질 1의 탈인산화 정도를 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 결과를 대조군으로서 피검 물질을 처리하지 않는 PTPRT 또는 이의 단편, 및 신탁신-결합 단백질 1 발현 세포주와 비교하여 신탁신-결합 단백질 1의 탈인산화 정도를 증가시키는 피검 물질을 선별하는 단계를 포함하는 SNARE 복합체 형성 조절제 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 피검 물질을 해마 신경세포주(hipoccampal neuron)에 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 세포주에서 신탁신-결합 단백질 1의 탈인산화 정도를 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 결과를 대조군으로서 피검 물질을 처리하지 않는 해마 신경세포주와 비교하여 신탁신-결합 단백질 1의 탈인산화 정도를 증가시키는 피검 물질을 선별하는 단계를 포함하는 시냅스 형성 조절제 스크리닝 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은
1) 피검 물질을 해마 신경세포주에 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 세포주에서 신탁신-결합 단백질 1의 탈인산화 정도를 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 결과를 대조군으로서 피검 물질을 처리하지 않는 해마 신경세포주와 비교하여 신탁신-결합 단백질 1의 탈인산화 정도를 증가시키는 피검 물질을 선별하는 단계를 포함하는 SNARE 복합체 형성 조절제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 신탁신-결합 단백질 1(syntaxin-binding proten 1)은 단백질 타이로신 탈인산화효소 수용체 T(protein tyrosine phosphtase receptor T; PTPRT)의 신규한 기질로서 해마 신경세포(hipoccampal neuron)의 신경시냅스(neuronal synapse)에서 나타나고, PTPRT에 의해 탈인산화된 신탁신-결합 단백질 1이 신탁신 1과 결합하여 SNARE 복합체 형성을 촉진하므로, 상기 PTPRT 및 PTPRT의 신규한 기질인 신탁신-결합 단백질 1을 SNARE 복합체 형성 촉진제를 포함한 시냅스 형성 조절제의 스크리닝에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1A는 항-단백질 타이로신 탈인산화효소 수용체 T(protein tyrosine phosphatase receptor T; PTPRT)-특이적 단일클론항체를 적용하여 랫트(rat) 뇌 시냅토솜(synaptosome) 단백질의 분석한 도이다.
도 1B는 펩타이드 이온의 결합된 MS/MS 스펙트럼의 아미노산 서열을 나타낸 도이다.
도 2A는 랫트 시냅토솜에서 항-PTPRT(RT) 항체에 의해 면역침강된 신탁신-결합 단백질 1(syntaxin-binding protein 1, STXBP1)을 나타낸 도이다.
도 2B는 랫트 시냅토솜에서 항-신탁신-결합 단백질 1 항체에 의해 면역침강된 PTPRT를 나타낸 도이다.
도 2C는 이종성 세포(heterologous cell)에서 항-신탁신-결합 단백질 1 항체에 의해 면역침강된 전장 PTPRT(RT-FL)을 나타낸 도이다.
도 2D는 이종성 세포에서 항-신탁신-결합 단백질 1 항체에 의해 면역침강된 PTPRT 촉매 도메인(RT-D)를 나타낸 도이다.
도 2E는 랫트 뇌 발달 동안 신탁신-결합 단백질 1 발현 변화를 나타낸 도이다.
도 3A는 해마 신경세포(hippocampal neuron)의 수상돌기(dendritic spine)에 위치한 신탁신-결합 단백질 1을 나타낸 도이다.
도 3B는 해마 신경세포의 축색돌기(axone)에 위치한 신탁신-결합 단백질 1을 나타낸 도이다.
도 3C는 후시냅스(post-synaptic)에 위치한 신탁신-결합 단백질 1을 나타낸 도이다.
도 3D는 전시냅스(pre-synaptic)에 위치한 신탁신-결합 단백질 1을 나타낸 도이다.
도 3E는 신경 시냅스(neuronal synapse)에서 PTPRT 및 신탁신-결합 단백질의 위치를 나타낸 도이다.
도 4A는 해마 신경세포에서 인산화된 신탁신-결합 단백질 1을 나타낸 도이다.
도 4B는 이종성 세포에서 신경 타이로신 키나아제(neuronal tyrosine kinase) Fyn에 의해 인산화되고 PTPRT에 의해 탈인산화 되는 신탁신-결합 단백질 1을 나타낸 도이다:
wtRT; 야생형 PTPRT; 및
2csRT: 비활성화 PTPRT.
도 4C는 이종성 세포에서 PTPRT의 신탁신-결합 단백질 1의 타이로신 타겟 부위를 나타낸 도이다:
STXBP1-WT: 야생형 신탁신-결합 단백질 1;
STXBP1-Y75F: 75 번째 타이로신을 페닐알라닌(phenylalanine)으로 변경한 신탁신-결합 단백질 1 돌연변이;
STXBP1-Y145F: 145 번째 타이로신을 페닐알라닌으로 변경한 신탁신-결합 단백질 1 돌연변이;
STXBP1-Y212F: 212 번째 타이로신을 페닐알라닌으로 변경한 신탁신-결합 단백질 1 돌연변이; 및
STXBP1-Y499F: 499 번째 타이로신을 페닐알라닌으로 변경한 신탁신-결합 단백질 1 돌연변이.
도 5는 PTPRT에 의한 신탁신-결합 단백질 1 및 신탁신 1(syntaxin 1, STX1)의 상호작용 조절을 나타낸 도이다:
STX1-WT: 야생형 신탁신 1;
STX1-LEAA: 신탁신 1의 열린(open) 형태 돌연변이; 및
STX1-L8A: 8 번째 루신(leucine)을 알라닌(alanine)으로 변경한 신탁신 1 돌연변이.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은
1) 피검 물질을 단백질 타이로신 탈인산화효소 수용체 T(protein tyrosine phosphtase receptor T; PTPRT) 또는 이의 단편, 및 신탁신-결합 단백질 1(syntaxin-binding protein 1) 발현 세포주에 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 세포주에서 신탁신-결합 단백질 1의 탈인산화 정도를 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 결과를 대조군으로서 피검 물질을 처리하지 않는 PTPRT 또는 이의 단편, 및 신탁신-결합 단백질 1 발현 세포주와 비교하여 신탁신-결합 단백질 1의 탈인산화 정도를 증가시키는 피검 물질을 선별하는 단계를 포함하는 시냅스 형성 조절제 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 단계 1)의 세포주는 형질전환에 의해 PTPRT 또는 이의 단편, 및 신탁신-결합 단백질 1이 과발현되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 PTPRT는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖으며, 이의 단편은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 2)의 탈인산화 정도 측정 방법은 면역침강 분석, 웨스턴 블럿팅, ELISA, 방사성 동위원소 검출법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 2)의 신탁신-결합 단백질 1의 탈인산화는 PTPRT가 신탁신-결합 단백질 1의 145 번째에 위치한 타이로신을 탈인산화시키는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 인간 PTPRT, PTPRT 촉매 도메인(catalytic domain)(RT-D), 신탁신-결합 단백질 1, 타이로신 비인산화(non-phosphorylation) 모방(mimicking) 신탁신-결합 단백질 1 돌연변이(Y75F, Y145F, Y212F 및 Y499F), 신탁신 1(syntaxin 1) 및 신탁신 1 돌연변이(L8A)를 포함한 벡터를 제조하였다.
또한, 본 발명자들은 PTPRT의 상호작용 파트너를 확인하기 위하여, 항-PTPRT-특이적 단일 클론항체를 적용하여 MS/MS 분석을 수행한 결과, 신탁신-결합 단백질 1이 신규한 상호작용 파트너임을 확인하였다(도 1A 및 도 1B 참조).
또한, 본 발명자들은 랫트(rat) 시냅토솜(synaptosome)에서 PTPRT와 신탁신-결합 단백질 1의 상호작용을 확인하기 위하여, 항-PTPRT 항체 및 항-신탁신-결합 단백질 1 항체를 이용하여 공동-면역침강(co-immunoprecipitation) 분석을 수행한 결과, 항-PTPRT 항체에 의해 신탁신-결합 단백질 1이 침전되고, 반대로, 항-신탁신-결합 단백질 1에 의해 PTPRT가 침전되는 것을 확인함으로써, 랫트 시냅토솜에서 상기 신탁신-결합 단백질 1이 PTPRT와 상호작용함을 확인하였다(도 2A 및 도 2B).
또한, 본 발명자들은 이종성 세포(heterologous cell)에서 PTPRT와 신탁신-결합 단백질 1의 상호작용을 확인하기 위하여, HEK293T 세포에 전장 PTPRT(RT-FL) 또는 PTPRT 촉매 도메인(RT-D), 및 신탁신-결합 단백질 1(STXBP1)을 포함한 벡터를 형질감염하고, 항-PTPRT 항체 및 항-신탁신-결합 단백질 1 항체를 이용하여 공동-면역침강 분석을 수행한 결과, 항-신탁신-결합 단백질 1 항체에 의해 전장 PTPRT 및 PTPRT 촉매 도메인 모두 침전되는 것을 확인함으로써, 이중성 세포에서 상기 신탁신-결합 단백질 1이 PTPRT의 촉매 도메인과 상호작용함을 확인하였다(도 2C 및 도 2D).
또한, 본 발명자들은 뇌 발달 동안 신탁신-결합 단백질 1의 발현 변화를 확인하기 위하여, 배자기 18일(E18) 랫트, 생후 1 및 3일(P1 및 P3)된 랫트, 및 생후 1, 2, 3 및 6주(1W, 2W, 3W 및 6W)된 랫트의 뇌 조직을 이용하여 웨스턴 블럿팅(western blotting)을 수행한 결과, 성인 단계로 갈수록 신탁신-결합 단백질 1 및 PTPRT의 발현이 증가하는 것을 확인함으로써, 뇌 발달 동안 상기 신탁신-결합 단백질 1이 PTPRT와 상호작용함을 확인하였다(도 2E).
또한, 본 발명자들은 PTPRT 및 신탁신-결합 단백질의 발현 위치를 확인하기 위하여, E18 랫트로부터 준비된 해마 신경세포에서 녹색 형광단이 접합된 수상돌기(dendritic spine) 마커인 항-MAP2 항체, 축색돌기(axon) 마커인 항-신경미세섬유 L(neurofilament L; NF-L) 항체, 후시냅스(post-synaptic) 마커인 항-PSD-95 항체, 전시냅스(pre-synaptic) 마커인 항-시냅토파이신(synaptophysin) 항체 및 항-PTPRT 항체, 및 빨강 형광단이 접합된 항-신탁신-결합 단백질 1 다클론 항체를 이용하여 면역형광분석을 수행한 결과, 신탁신-결합 단백질 1이 해마 신경세포의 수상돌기, 축색돌기, 신경 시냅스(neuronal synapses)에서 나타나고, 신경 시냅스에서 PTPRT와 동일한 위치에서 나타나는 것을 확인함으로써, 상기 신탁신-결합 단백질 1 및 PTPRT 모두 신경 시냅스에서 발현됨을 확인하였다(도 3A 내지 도 3E).
또한, 본 발명자들은 PTPRT의 신규한 기질로서 신탁신-결합 단백질 1의 타이로신 타겟을 확인하기 위하여, 타이로신 탈인산화 억제제인 펄바나데이트(pervanadate)를 처리한 해마 신경세포, 야생형 PTPRT(wtRT) 또는 비활성 PTPRT 돌연변이(2csRT), 신경 타이로신 키나아제(neuronal tyrosine kinase) Fyn 및 신탁신-결합 단백질 1(STXBP1)을 포함하는 벡터를 형질감염시킨 HEK293T 세포 및 신탁신-결합 단백질 1(STXBP1-WT) 또는 비인산화 타이로신 모방 신탁신-결합 단백질 1 돌연변이(STXBP1-Y75F, STXBP1-Y145F, STXBP1-Y212F 또는 STXBP1-Y499F), Fyn, PTPRT(wtRT) 또는 비활성 PTPRT 돌연변이(2scRT)를 포함하는 벡터를 형질감염시킨 HEK293T 세포를 이용하여 면역침강 분석을 수행한 결과, 탈인산화 억제제를 처리한 해마 신경세포에서 신탁신-결합 단백질 1의 타이로신 인산화가 증가하고(도 4A), Fyn 및 신탁신-결합 단백질 1을 동시 발현한 HEK293T 세포와 달리 Fyn, 신탁신-결합 단백질 1 및 PTPRT 동시 발현한 HEK293T 세포에서 인산화가 감소하며(도 4B), Fyn 및 신탁신-결합 단백질 1 비인산화 타이로신 모방 돌연변이 Y145F(STXBP1-Y145F)를 동시 발현한 HEK293T 세포에서 인산화가 감소하는 것을 확인함으로써(도 4C), 상기 신탁신-결합 단백질 1이 PTPRT의 새로운 기질이며, 신탁신-결합 단백질 1의 145 번 타이로신 잔기가 PTPRT의 주요한 탈인산화 타겟임을 확인하였다(도 4A 내지 4C).
또한, 본 발명자들은 PTPRT가 신탁신-결합 단백질 1 및 신탁신 1의 상호작용에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 신탁신 1(STX1-WT), 신탁신 1 돌연변이 (STX1-L8A) 또는 신탁신 1의 열린(open) 형태 돌연변이(LEAA), 및 신탁신-결합 단백질 1(STXBP1-WT) 또는 비인산화 타이로신 모방 신탁신 결합 단백질 1 돌연변이 Y145F(STXBP1-Y145F)를 포함하는 벡터를 형질감염시킨 HEK293T 세포를 이용하여 면역침강 분석을 수행한 결과, 타이로신 비인산화 모방 신탁신-결합 단백질 1 돌연변이(Y145F)와 신탁신 1 돌연변이(L8A)의 상호작용이 감소하지 않고, 타이로신 비인산화 모방 신탁신-결합 단백질 1 돌연변이(Y145F)가 신탁신 1(STX1-WT)과 더 강하게 결합하는 것을 확인함으로써, 상기 신탁신-결합 단백질 1이 PTPRT에 의해 탈인산화 되면 신탁신 1과의 결합이 증가하며, 이를 통해 PTPRT가 신탁신-결합 단백질 1 및 신탁신 1의 상호작용을 조절함을 확인하였다(도 5 참조).
따라서, 본 발명의 신탁신-결합 단백질 1은 PTPRT의 신규한 기질로서 해마 신경세포의 신경 시냅스에서 나타나고, PTPRT에 의해 145 번째 타이로신 잔기가 탈인산화된 신탁신-결합 단백질 1이 신탁신 1과 결합하여 SNARE 복합체 형성을 촉진하므로, 상기 PTPRT 및 PTPRT의 신규한 기질인 신탁신-결합 단백질 1을 시냅스 형성 조절제의 스크리닝에 유용하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은
1) 피검 물질을 단백질 타이로신 탈인산화효소 수용체 T(protein tyrosine phosphtase receptor T; PTPRT) 또는 이의 단편, 및 신탁신-결합 단백질 1(syntaxin-binding protein 1) 발현 세포주에 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 세포주에서 신탁신-결합 단백질 1의 탈인산화 정도를 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 결과를 대조군으로서 피검 물질을 처리하지 않는 PTPRT 또는 이의 단편, 및 신탁신-결합 단백질 1 발현 세포주와 비교하여 신탁신-결합 단백질 1의 탈인산화 정도를 증가시키는 피검 물질을 선별하는 단계를 포함하는 SNARE 복합체 형성 조절제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 신탁신-결합 단백질 1은 PTPRT의 신규한 기질로서 해마 신경세포의 신경 시냅스에서 나타나고, PTPRT에 의해 145 번 타이로신 잔기가 탈인산화된 신탁신-결합 단백질 1이 신탁신 1과 결합하여 SNARE 복합체 형성을 촉진하므로, 상기 PTPRT 및 PTPRT의 신규한 기질인 신탁신-결합 단백질 1을 SNARE 복합체 형성 조절제의 스크리닝에 유용하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은
1) 피검 물질을 해마 신경세포주(hipoccampal neuron)에 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 세포주에서 신탁신-결합 단백질 1의 탈인산화 정도를 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 결과를 대조군으로서 피검 물질을 처리하지 않는 해마 신경세포주와 비교하여 신탁신-결합 단백질 1의 탈인산화 정도를 증가시키는 피검 물질을 선별하는 단계를 포함하는 시냅스 형성 조절제 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 단계 2)의 탈인산화 정도 측정 방법은 면역침강 분석, 웨스턴 블럿팅, ELISA, 방사성 동위원소 검출법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 신탁신-결합 단백질 1은 PTPRT의 신규한 기질로서 해마 신경세포의 신경 시냅스에서 나타나고, PTPRT에 의해 145 번 타이로신 잔기가 탈인산화된 신탁신-결합 단백질 1이 신탁신 1과 결합하여 SNARE 복합체 형성을 촉진하므로, 해마 신경세포주에서 상기 PTPRT의 신규한 기질인 신탁신-결합 단백질 1을 시냅스 형성 조절제의 스크리닝에 유용하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은
1) 피검 물질을 해마 신경세포주에 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 세포주에서 신탁신-결합 단백질 1의 탈인산화 정도를 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 결과를 대조군으로서 피검 물질을 처리하지 않는 해마 신경세포주와 비교하여 신탁신-결합 단백질 1의 탈인산화 정도를 증가시키는 피검 물질을 선별하는 단계를 포함하는 SNARE 복합체 형성 조절제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 신탁신-결합 단백질 1은 PTPRT의 신규한 기질로서 해마 신경세포의 신경 시냅스에서 나타나고, PTPRT에 의해 145 번 타이로신 잔기가 탈인산화된 신탁신-결합 단백질 1이 신탁신 1과 결합하여 SNARE 복합체 형성을 촉진하므로, 해마 신경세포주에서 상기 PTPRT의 신규한 기질인 신탁신-결합 단백질 1을 SNARE 복합체 형성 조절제의 스크리닝에 유용하게 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 인간 단백질 타이로신 탈인산화효소 수용체 T( protein tyrosine phosphatase receptor T; PTPRT ) 및 신탁신 -결합 단백질 1( syntaxin - binding protein 1)을 포함하는 벡터의 제조
전장 인간 PTPRT(NM_133170, aa 1-1460; 서열번호 1), 전장 인간 신탁신-결합 단백질 1 아형(isoform) b(NM_001032221.3, aa 1-594; 서열번호 3) 및 전장 마우스 신탁신 1(syntaxin 1)(NM_016801, aa 1-288; 서열번호 4)을 GW1-CMV 내로 서브클론시켰다(A.R. Park, D. Oh, S.H. Lim, J. Choi, J. Moon, D.Y. Yu, S.G. Park, N. Heisterkamp, E. Kim, P.K. Myung, J.R. Lee, J. Cell Sci, 2012, 125, 4518-4531). PTPRT의 촉매 도메인(catalytic domain)(RT-D)(서열번호 2)을 p3xFLAG-CMV-7.1(Sigma, USA) 내로 PTPRT의 aa 921-1173을 암호화하는 DNA의 서브클로닝에 의해 구축하였다. 또한, 비활성 PTPRT(2cs PTPRT, C1103,1397S)를 p3xFLAG-CMV-7.1(Sigma, USA) 내로 암호화하는 DNA의 서브클로닝에 의해 구축하였다. 또한, 신탁신-결합 단백질 1의 타이로신(tyrosine) 비인산화(non-phosphorylation) 모방(mimicking) 돌연변이를 제조하기 위하여, Quick-Change system(Stratagene)(Oh et al., submitted)을 이용하여 위치지정돌연변이(site-directed mutagenesis)에 의해 75, 145, 212 및 499 번째 타이로신을 페닐알라닌(phenylalanine)으로 변경한 Y75F, Y145F, Y212F 및 Y499F 신탁신-결합 단백질 1 컨스트럭트를 제조하였다. 또한, 신탁신 1의 N-말단 돌연변이(L8A)를 제조하기 위하여, Quick-Change system을 이용하여 신탁신 1의 8 번째 루신(leucine)을 알라닌(alaine)으로 변경하였다. 또한, 신탁신 1의 열린(open) 형태 돌연변이(LEAA)를 제조하기 위하여, Quick-Change system을 이용하여 신탁신 1의 165 번째 루신 및 166 번째 글루탐산(glutamic acid)을 알라닌으로 변경하였다.
< 실시예 2> PTPRT 와 신탁신 -결합 단백질 1의 상호작용 확인
<2-1> PTPRT 의 상호작용 파트너 확인
PTPRT의 가능한 상호작용 파트너를 확인하기 위하여, 항-PTPRT-특이적 단일클론항체를 적용하여 MS/MS 분석을 수행하였다.
구체적으로, 항-PTPRT-특이적 단일클론항체(S.H. Lim, S.K. Kwon, M.K. Lee, J.Moon, D.G. Jeong, E. Park, S.J. Kim, B.C. Park, S.C. Lee, S.E. Ryu, D.Y. Yu, B.H. Chung, E. Kim, P.K. Myung, J.R. Lee, EMBO J, 2009, 28, 3564-3578)를 이용하여 면역침강된 랫트(rat) 뇌 시냅토솜 단백질의 분석을 위해 MS/MS 분석을 수행한 후, Mascot 데이타베이스 검색 프로그램을 이용하여, 펩타이드 이온의 결합된 MS/MS 스펙트럼의 아미노산 서열을 확인하였다.
그 결과, 도 1A 및 도 1B에 나타낸 바와 같이, 신탁신-결합 단백질 1이 PTPRT의 가능한 상호작용 파트너임을 확인하였다(도 1A 및 도 1B).
<2-2> 랫트 시냅토솜(synaptosome)에서 PTPRT 와 신탁신 -결합 단백질 1의 상호작용 확인
PTPRT와 신탁신-결합 단백질 1의 상호작용을 확인하기 위하여, 항-PTPRT 항체 및 항-신탁신-결합 단백질 1 항체를 이용하여 공동-면역침강(co-immunoprecipitation) 분석을 수행하였다.
구체적으로, 데옥시콜산나트륨(sodium deoxycholate)으로 용해시킨 랫트 시냅토솜(synaptosome)을 항-PTPRT 단일클론 항체 또는 비-면역 마우스 면역글로불린(IgG)과 반응시키고 SDS 시료 완충용액을 첨가하여 반응을 종결시킨 후, SDS-PAGE 겔(gel)을 이용하여 분리하고 nitrocellulose membraance(Amersham, UK)으로 전달시켰다. 그런 다음, 일차 항체로 항-신탁신-결합 단백질 1 항체(Pierce, USA)를 처리하여 반응시킨 후, 상기 막에 붙은 항체에 HRP-접합 이차 항체를 붙이고, 이를 ECL(Pierce chemical co, USA)를 이용하여 확인함으로써, 공동-면역침강된 신탁신-결합 단백질 1을 탐색하였다(도 2A). 또한, 데옥시콜산나트륨(sodium deoxycholate)으로 용해시킨 랫트 시냅토솜(synaptosome)을 항-신탁신-결합 단백질 1 단일클론 항체 또는 비-면역 마우스 면역글로불린(IgG)과 반응시킨 후, 상기와 같이 공동-면역침강된 PTPRT를 항-PTPRT 항체를 이용하여 탐색하였다(도 2B).
그 결과, 도 2A 및 도 2B에 나타낸 바와 같이, 랫트 시냅토솜에서 신탁신-결합 단백질 1이 항-PTPRT 항체에 의하여 침전되고, 반대로 PTPRT 역시 항-신탁신-결합 단백질 1 항체에 의해 침전되는 것을 확인함으로써, 랫트 시냅토솜에서 상기 신탁신-결합 단백질 1이 PTPRT와 상호작용하는 것을 확인하였다(도 2A 및 2B).
<2-3> 이종성 세포( heterologous cell )에서 PTPRT 와 신탁신 -결합 단백질 1의 상호작용 확인
이종성 세포에서 PTPRT와 신탁신-결합 단백질 1과의 상호작용을 확인하기 위하여, HEK293T 세포를 이용해 공동-면역침강 분석을 수행하였다.
구체적으로, 10% 우태혈청(fetal bovine serum, FBS)을 포함한 DMEM 배지에서 배양한 HEK293T 세포(ATCC, USA)에 상기 <실시예 1>에 기재된 방법으로 획득한 전장 PTPRT(RT-FL) 및 신탁신-결합 단백질 1(STXBP1)을 포함한 벡터를 인산칼슘 방법으로 형질감염시키고, 2일 후에 프로티아제 억제제(protease inhibitor) 및 탈인산화효소 억제제(phosphatase inhibitor), 1%(v/v) Triton X-100을 포함한 차가운 pH 7.4 DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline)(Invitrogen, USA)를 이용해 30분 동안 4℃에서 반응시켜 원심분리 후 세포 용해물을 수득하였다. 상기 용해된 세포의 세포잔해를 제거한 용해물(Cleared lysate)을 단백질 A-아가로즈에 결합된 항-신탁신-결합 단백질 1 항체와 반응시키고 SDS 시료 완충용액을 첨가하여 상기 반응을 종결시킨 후, 상기 실시예 <2-2>와 같이 공동-면역침강된 전장 PTPRT를 항-PTPRT 항체를 이용해 탐색하였다(도 2C). 또한, 상기와 같이 HEK293T 세포에 상기 <실시예 1>에 기재된 방법으로 획득한 PTPRT 촉매 도메인(RT-D) 및 신탁신-결합 단백질 1을 포함한 벡터를 형질감염 및 용해시키고, 용해된 세포의 세포잔해를 제거한 용해물을 항-신탁신-결합 단백질 1 항체와 반응시켜 공동-면역침강된 PTPRT 촉매 도메인을 항-PRPRT 촉매 도메인 항체를 이용하여 탐색하였다(도 2D).
그 결과, 도 2C 및 도 2D 에 나타낸 바와 같이, HEK293T 세포에서 발현된 전장 PTPRT 및 PTPRT 촉매 도메인 모두 항-신탁신-결합 단백질 1 항체에 의해 침전 되는 것을 확인함으로써, 상기 PTPRT와 신탁신-결합 단백질 1이 세포내 PTPRT의 촉매 도메인과 상호작용하는 것을 확인하였다(도 2C 및 2D).
<2-4> 뇌 발달 동안 신탁신 -결합 단백질 1의 발현 변화 확인
뇌 발달 동안 신탁신-결합 단백질 1의 발현 변화를 확인하기 위하여, 랫트 뇌 조직을 이용하여 웨스턴 블럿팅(western blotting)을 수행하였다.
구체적으로, 배자기(embryonic day) 18일(E18) 랫트, 생후 1 및 3일(P1 및 P3)된 랫트, 및 생후 1, 2, 3 및 6주(1W, 2W, 3W 및 6W)된 랫트로부터 뇌를 적출하고, 프로티아제 억제제, 0.32 M 수크로즈, 4 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 0.5 mM CaCl2를 포함한 차가운 완충 수크로즈(pH 7.3)로 조직 분쇄기를 이용해 용해하여 조직 용해물을 수득하고, 수득한 조직 용해물을 수득하였다. 상기 수득한 조직 용해물은 SDS 시료 완충용액을 첨가하여 반응을 종결시킨 후, SDS-PAGE 겔(gel)을 이용하여 분리하고 nitrocellulose membrane으로 시켰다. 각 인자의 일차 항체를 처리하여 반응시킨 후, 상기 막에 부은 일차 항체에 HRP-접한 이차 항체를 붙이고, 이를 ECL을 이용하여 확인하였다. 일차 항체로 항-신탁신-결합 단백질 1, 항-PSD-95 항체(Upstate, Germany) 및 항-α-tubulin 항체(Sigma, USA)를 사용하였다.
그 결과, 도 2E에 나타낸 바와 같이, 랫트 뇌 발달 동안 신탁신-결합 단백질 1의 발현이 PTPRT와 유사하게 증가하고, 성인 단계까지 점차적으로 신탁신-결합 단백질 1의 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 2E). 따라서, 상기 <실시예 2>의 결과들을 통해 신탁신-결합 단백질 1이 신경 시냅스(neuronal synapses)에서 뇌 특이적으로(brain-specific) 발현되는 타이로신 탈인산화효소인 PTPRT와 상호작용함을 확인하였다.
< 실시예 3> PTPRT 및 신탁신 -결합 단백질 1의 발현 위치 확인
PTPRT 및 신탁신-결합 단백질이 발현되는 위치를 확인하기 위하여, 해마 신경세포를 이용하여 면역형광분석을 수행하였다.
구체적으로, 배자기 18일(E18) 랫트로부터 준비된, 초기 해마 신경세포를 폴리-D-리신으로 사전 코팅된 유리 커버슬립(coverslip) 위에서 글루타민(glutamine) 및 B-27 무혈청 보충제(invitroten, USA)를 포함한 무혈청 신경기저 배지(neurobasal media)(Invitrogen, USA)로 체외배양법으로(in vitro) 15 일 동안 배양(15 DIV)하였다. 상기 15 DIV 해마 신경세포를 1×PBS로 세척하고 상온에서 20분 동안 4%(v/v) 파라포름알데하이드(paraformaldhyde)/4%(w/v) 수크로스(sucrose)로 고정하였다. 그 다음, 상기 해마 신경세포를 0.2% TritonX-100(Sigma, USA)으로 상온에서 15분 동안 침투하고 4℃에서 하루 동안, 수상돌기(dendritic spine) 마커인 항-MAP2 항체(Sigma, USA)(도 3A), 축색돌기(axon) 마커인 항-신경미세섬유 L(neurofilament L, NF-L) 항체(Cell singaling, USA)(도 3B), 후시냅스(post-synaptic) 마커인 항-PSD-95 항체(도 3C), 전시냅스(pre-synaptic) 마커인 항-시냅토파이신(synaptophysin, Synph) 항체(Santa Cruz, USA)(도 3D) 및 항-PTPRT 항체(도 3E), 및 항원의 C-말단 항원결정기(epitope)(aa 580 내지 594)에 결합하는 항-신탁신-결합 단백질 1 다클론 항체로 반응시킨 후, PBS로 세 번 세척하였다. 그 다음, 상온에서 2시간 동안 1:1000으로 희석한 Cy3-접합 이차 항체 및 FITC-접합 이차 항체(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Glove, PA, USA)와 함께 반응시키고, PBS로 세척한 후 LSM510 공초점 현미경(LSM 510 Meta, Zeiss, Gottingen, Germany)를 이용해 시각화하였다(Scale bar, 20 ㎛).
그 결과, 도 3A 및 3B에 나타낸 바와 같이, 신탁신-결합 단백질 1과 MAP2 및 NF-L 단백질의 위치가 유사한 것을 확인함으로써, 상기 신탁신-결합 단백질 1이 해마 신경세포의 수상돌기 및 축색돌기에서 나타남을 확인하였다(도 3A 및 3B).
또한, 도 3C 및 3D에 나타낸 바와 같이, 신탁신-결합 단백질 1과 PSD-95 및 시냅토파이신과 동일한 위치에 존재하는 것을 확인함으로써, 상기 신탁신-결합 단백질 1이 신경 시냅스(neuronal synapses)에서 나타남을 확인하였다(도 3C 및 3D)
또한, 도 3E에 나타낸 바와 같이, 신탁신-결합 단백질 1이 신경 시냅스(neuronal synapses)에서 PTPRT와 동일한 위치에 나타나는 것을 확인하였다(도 3E). 따라서, 상기의 결과들을 통해 신탁신-결합 단백질 1 및 PTPRT 모두 신경 시냅스에서 발현되며 상호결합할 수 있다는 것을 확인하였다.
< 실시예 4> PTPRT 의 신경세포 기질로서의 신탁신 -결합 단백질 1 확인
<4-1> 해마 신경세포에서 신탁신 -결합 단백질 1의 인산화 확인
신탁신-결합 단백질 1의 타이로신 인산화 정도를 확인하기 위하여, 타이로신 탈인산화 억제제를 이용하여 면역침강 분석을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 3>에 기재된 방법으로 획득한 15 DIV 해마 신경세포에 15분 동안 타이로신 탈인산화 억제제인 200 μM 퍼바나데이트(pervanadate)를 처리하였다. 그 다음, 상기 실시예 <2-3>과 같이 용해된 세포의 세포 잔해를 제거한 용해물을 단백질 A-아가로즈에 결합된 항-신탁식-결합 단백질 1 항체(STXBP1) 또는 비 면역 마우스 면역글로블린(IgG)과 반응시켜 면역침강 분석을 수행하였다. 면역침강된 타이로신 인산화된 신탁신-결합 단백질 1을 항-인산화된 타이로신 항체(Upstate, Germany)를 이용하여 탐색하였다.
그 결과, 도 4A에 나타낸 바와 같이 탈인산화 억제제를 처리한 해마 신경세포에서 신탁신-결합 단백질 1의 타이로신 인산화가 증가하는 것을 확인함으로써, 신경세포에서 상기 신탁신-결합 단백질 1의 타이로신 잔기가 인산화됨을 확인하였다(도 4A).
<4-2> PTPRT 의 기질로서 신탁신 -결합 단백질 1 확인
신경 타이로신 키나아제(neuronal tyrosine kinase) Fyn은 PTPRT와 상호작용하며, PTPRT의 내생 기질을 인산화한다고 보고되고 있다(A.R. Park, D. Oh, S.H. Lim, J. Choi, J. Moon, D.Y. Yu, S.G. Park, N. Heisterkamp, E. Kim, P.K. Myung, J.R. Lee, J. Cell Sci, 2012, 125, 4518-4531., S.H. Lim, S.K. Kwon, M.K. Lee, J.Moon, D.G. Jeong, E. Park, S.J. Kim, B.C. Park, S.C. Lee, S.E. Ryu, D.Y. Yu, B.H. Chung, E. Kim, P.K. Myung, J.R. Lee, EMBO J, 2009, 28, 3564-3578). 따라서, 신탁신-결합 단백질 1이 PTPRT의 신경세포 기질인지 확인하기 위하여, Fyn을 이용하여 면역침강 분석을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <2-3>과 같이 HEK293T 세포에 <실시예 1>에 기재된 방법으로 획득한 신탁신-결합 단백질 1(STXBP1), Fyn, 야생형 PRPRT(wtRT) 또는 비활성 PTPRT 돌연변이(2csRT)를 포함하는 벡터를 형질감염하고 2일 후 세포 용해물을 수득하였다. 용해된 세포의 세포 잔해를 제거한 용해물을 단백질 A-아가로즈에 결합된 항-신탁신-결합 단백질 1 항체와 반응시켜 면역침강 분석을 수행하였다. 면역침강된 타이로신 인산화된 신탁신-결합 단백질 1을 항-인산화된 타이로신 항체를 이용하여 탐색하였다.
그 결과, 도 4B에 나타낸 바와 같이, Fyn 및 신탁신-결합 단백질 1을 동시 발현한 경우, Fyn에 의해 신탁신-결합 단백질 1이 인산화가 증가하는 반면, Fyn, 신탁신-결합 단백질 1 및 PTPRT를 동시 발현한 경우, PTPRT가 현저하게 신탁신-결합 단백질 1의 인산화를 감소시키는 것을 확인함으로써, 상기 신탁신-결합 단백질 1이 PTPRT의 새로운 기질이며, PTPRT에 의해 탈인산화 됨을 확인하였다(도 4B).
<4-3> PTPRT 의 기질로서 신탁신 -결합 단백질 1의 탈인산화 부위 확인
PTPRT의 기질로서 신탁신-결합 단백질 1의 타이로신 타겟 부위를 확인하기 위하여, 비인산화 타이로신 모방(mimicking) 신탁신-결합 단백질 1 돌연변이를 이용해 면역침강 분석을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <4-2>와 같이 HEK293T 세포에 상기 <실시예 1>에 기재된 방법으로 획득한 신탁신-결합 단백질 1(STXBP1-WT), 신탁신-결합 단백질 1 비인산화 타이로신 모방 돌연변이 Y75F, Y145F, Y212F 또는 Y499F(STXBP1-Y75F, STXBP1-Y145F, STXBP1-Y212F 및 STXBP1-Y499F), Fyn, PTPRT(wtRT) 및 비활성 PTPRT 돌연변이(2csRT)를 포함하는 벡터를 형질감염하고 2 일 후 세포 용해물을 수득하였다. 용해된 세포의 세포 잔해를 제거한 용해물을 단백질 A-아가로즈에 결합된 항-신탁신-결합 단백질 1 항체와 반응시켜 면역침강 분석을 수행하였다. 면역침강된 타이로신 인산화된 신탁신-결합 단백질 1을 항-인산화된 타이로신 항체를 이용하여 탐색하였다.
그 결과, 도 4C에 나타낸 바와 같이, Fyn 및 신탁신-결합 단백질을 동시 발현한 경우, Fyn에 의해 신탁신-결합 단백질의 인산화가 증가하는 반면, Fyn 및 신탁신-결합 단백질 1 비인산화 타이로신 모방 돌연변이 Y145F(STXBP-Y145F)를 동시 발현한 경우, 신탁신-결합 단백질 1 돌연변이의 인산화가 감소하는 것을 확인함으로써, 상기 신탁신-결합 단백질 1의 145 번째 타이로신 잔기가 Fyn 타이로신 키나아제 및 PTPRT 타이로신 탈인산화효소의 주요한 타겟임을 확인하였다(도 4C). 따라서, 상기 <실시예 4>의 결과들을 통해 신탁신-결합 단백질 1이 PTPRT의 새로운 기질이며, 145 번째 타이로신 잔기가 PTPRT의 주요한 탈인산화 타겟임을 확인하였다.
< 실시예 5> PTPRT 에 의한 신탁신 -결합 단백질 1 및 신탁신 1( syntaxin 1)의 상호작용 조절 확인
신탁신-결합 단백질 1은 신탁신 1의 결합 표면을 제공하는 도메인 1 및 3a에 의해 형성된 중앙 공동(central cavity)을 가지는 아치모양의(arch-shaped) 분자이다(K.M.S. Misura, R.H. Scheller, W.I. Weis, Nature 404, 2000, 355-362). 또한, 도메인 1 및 2 사이의 상호작용은 아치모양 및 신탁신 1을 위한 중앙 공동을 형성하기 위한 패킹 준비를 위해 중요하며, 145 번째 타이로신은 도메인 1 및 2 사이의 연결자(linker) 주변에 위치하기 때문에, 상기 145 번째 타이로신의 인산화 및 탈인산화는 신탁신-결합 단백질 1 및 신탁신 1과의 상호작용을 조절한다. 한편, 신탁신 1의 N-말단은 신탁신-결합 단백질 1과 상호작용하기 위한 주된 도메인이며, 루신(leucine) 8번을 알라닌으로 바꾼 신탁신 1 돌연변이(L8A)에 의해 상호작용이 억제된다고 보고되고 있다(J. Shen, D.C. Tareste, F. Paumet, J.E. Rothman, T.J. Melia, Cell 128, 2007, 183-195). 따라서, PTPRT에 의한 탈인산화가 신탁신-결합 단백질 1과 신탁신 1의 상호작용에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 신탁신 1 돌연변이 및 신탁신-결합 단백질 1 돌연변이를 이용하여 면역침강 분석을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <4-3>과 같이 HEK293T 세포에 상기 <실시예 1>에 기재된 방법으로 획득한 신탁신 1(STX1-WT), 신탁신 1 돌연변이(STX1-L8A) 또는 신탁신 1의 열린(open) 형태 돌연변이(LEAA), 및 신탁신-결합 단백질 1(STXBP1-WT)(도 5 위) 또는 신탁신-결합 단백질 1 비인산화 타이로신 모방 돌연변이 Y145F(STXBP1-Y145F)(도 5 아래)를 포함하는 벡터를 형질감염하고 2 일 후 세포 용해물을 수득하였다. 용해된 세포의 세포 잔해를 제거한 용해물을 단백질 A-아가로즈에 결합된 항-신탁신-결합 단백질 1 항체와 반응시켜 면역침강 분석을 수행하였다. 면역침강된 신탁신 1을 항-신탁신 1 항체(Santa Curz, USA)를 이용하여 탐색하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 신탁신 1 돌연변이(L8A)가 야생형 신탁신 1에 비해 신탁신-결합 단백질 1과의 상호작용이 감소하는 반면, 타이로신 비인산화 모방 신탁신-결합 단백질 1 돌연변이(Y145F)와 신탁신 L8A 돌연변이의 상호작용이 감소하지 않는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라, 신탁신-결합 단백질 1 돌연변이 Y145F는 야생형 신탁신-결합 단백질 1보다 더 강하게 야생형 신탁신 1과 결합하는 것을 확인함으로써, 상기 신탁신-결합 단백질 1이 PTPRT에 의하여 탈인산화 되면 신탁신 1과의 결합이 증가하며, 따라서 상기 PTPRT가 타이로신 탈인산화를 통해 신탁신-결합 단백질 1과 신탁신 1의 상호작용을 조절함을 확인하였다(도 5).
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> A screening method of agent for regulating synaptogenesis using PTPRT and syntaxin-binding protein 1 <130> 13p-07-52 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1460 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Ser Leu Ala Ala Leu Ala Leu Ser Leu Leu Leu Arg Leu Gln 1 5 10 15 Leu Pro Pro Leu Pro Gly Ala Arg Ala Gln Ser Ala Ala Gly Gly Cys 20 25 30 Ser Phe Asp Glu His Tyr Ser Asn Cys Gly Tyr Ser Val Ala Leu Gly 35 40 45 Thr Asn Gly Phe Thr Trp Glu Gln Ile Asn Thr Trp Glu Lys Pro Met 50 55 60 Leu Asp Gln Ala Val Pro Thr Gly Ser Phe Met Met Val Asn Ser Ser 65 70 75 80 Gly Arg Ala Ser Gly Gln Lys Ala His Leu Leu Leu Pro Thr Leu Lys 85 90 95 Glu Asn Asp Thr His Cys Ile Asp Phe His Tyr Tyr Phe Ser Ser Arg 100 105 110 Asp Arg Ser Ser Pro Gly Ala Leu Asn Val Tyr Val Lys Val Asn Gly 115 120 125 Gly Pro Gln Gly Asn Pro Val Trp Asn Val Ser Gly Val Val Thr Glu 130 135 140 Gly Trp Val Lys Ala Glu Leu Ala Ile Ser Thr Phe Trp Pro His Phe 145 150 155 160 Tyr Gln Val Ile Phe Glu Ser Val Ser Leu Lys Gly His Pro Gly Tyr 165 170 175 Ile Ala Val Asp Glu Val Arg Val Leu Ala His Pro Cys Arg Lys Ala 180 185 190 Pro His Phe Leu Arg Leu Gln Asn Val Glu Val Asn Val Gly Gln Asn 195 200 205 Ala Thr Phe Gln Cys Ile Ala Gly Gly Lys Trp Ser Gln His Asp Lys 210 215 220 Leu Trp Leu Gln Gln Trp Asn Gly Arg Asp Thr Ala Leu Met Val Thr 225 230 235 240 Arg Val Val Asn His Arg Arg Phe Ser Ala Thr Val Ser Val Ala Asp 245 250 255 Thr Ala Gln Arg Ser Val Ser Lys Tyr Arg Cys Val Ile Arg Ser Asp 260 265 270 Gly Gly Ser Gly Val Ser Asn Tyr Ala Glu Leu Ile Val Lys Glu Pro 275 280 285 Pro Thr Pro Ile Ala Pro Pro Glu Leu Leu Ala Val Gly Ala Thr Tyr 290 295 300 Leu Trp Ile Lys Pro Asn Ala Asn Ser Ile Ile Gly Asp Gly Pro Ile 305 310 315 320 Ile Leu Lys Glu Val Glu Tyr Arg Thr Thr Thr Gly Thr Trp Ala Glu 325 330 335 Thr His Ile Val Asp Ser Pro Asn Tyr Lys Leu Trp His Leu Asp Pro 340 345 350 Asp Val Glu Tyr Glu Ile Arg Val Leu Leu Thr Arg Pro Gly Glu Gly 355 360 365 Gly Thr Gly Pro Pro Gly Pro Pro Leu Thr Thr Arg Thr Lys Cys Ala 370 375 380 Asp Pro Val His Gly Pro Gln Asn Val Glu Ile Val Asp Ile Arg Ala 385 390 395 400 Arg Gln Leu Thr Leu Gln Trp Glu Pro Phe Gly Tyr Ala Val Thr Arg 405 410 415 Cys His Ser Tyr Asn Leu Thr Val Gln Tyr Gln Tyr Val Phe Asn Gln 420 425 430 Gln Gln Tyr Glu Ala Glu Glu Val Ile Gln Thr Ser Ser His Tyr Thr 435 440 445 Leu Arg Gly Leu Arg Pro Phe Met Thr Ile Arg Leu Arg Leu Leu Leu 450 455 460 Ser Asn Pro Glu Gly Arg Met Glu Ser Glu Glu Leu Val Val Gln Thr 465 470 475 480 Glu Glu Asp Val Pro Gly Ala Val Pro Leu Glu Ser Ile Gln Gly Gly 485 490 495 Pro Phe Glu Glu Lys Ile Tyr Ile Gln Trp Lys Pro Pro Asn Glu Thr 500 505 510 Asn Gly Val Ile Thr Leu Tyr Glu Ile Asn Tyr Lys Ala Val Gly Ser 515 520 525 Leu Asp Pro Ser Ala Asp Leu Ser Ser Gln Arg Gly Lys Val Phe Lys 530 535 540 Leu Arg Asn Glu Thr His His Leu Phe Val Gly Leu Tyr Pro Gly Thr 545 550 555 560 Thr Tyr Ser Phe Thr Ile Lys Ala Ser Thr Ala Lys Gly Phe Gly Pro 565 570 575 Pro Val Thr Thr Arg Ile Ala Thr Lys Ile Ser Ala Pro Ser Met Pro 580 585 590 Glu Tyr Asp Thr Asp Thr Pro Leu Asn Glu Thr Asp Thr Thr Ile Thr 595 600 605 Val Met Leu Lys Pro Ala Gln Ser Arg Gly Ala Pro Val Ser Val Tyr 610 615 620 Gln Leu Val Val Lys Glu Glu Arg Leu Gln Lys Ser Arg Arg Ala Ala 625 630 635 640 Asp Ile Ile Glu Cys Phe Ser Val Pro Val Ser Tyr Arg Asn Ala Ser 645 650 655 Ser Leu Asp Ser Leu His Tyr Phe Ala Ala Glu Leu Lys Pro Ala Asn 660 665 670 Leu Pro Val Thr Gln Pro Phe Thr Val Gly Asp Asn Lys Thr Tyr Asn 675 680 685 Gly Tyr Trp Asn Pro Pro Leu Ser Pro Leu Lys Ser Tyr Ser Ile Tyr 690 695 700 Phe Gln Ala Leu Ser Lys Ala Asn Gly Glu Thr Lys Ile Asn Cys Val 705 710 715 720 Arg Leu Ala Thr Lys Ala Pro Met Gly Ser Ala Gln Val Thr Pro Gly 725 730 735 Thr Pro Leu Cys Leu Leu Thr Thr Gly Ala Ser Thr Gln Asn Ser Asn 740 745 750 Thr Val Glu Pro Glu Lys Gln Val Asp Asn Thr Val Lys Met Ala Gly 755 760 765 Val Ile Ala Gly Leu Leu Met Phe Ile Ile Ile Leu Leu Gly Val Met 770 775 780 Leu Thr Ile Lys Arg Arg Arg Asn Ala Tyr Ser Tyr Ser Tyr Tyr Leu 785 790 795 800 Lys Leu Ala Lys Lys Gln Lys Glu Thr Gln Ser Gly Ala Gln Arg Glu 805 810 815 Met Gly Pro Val Ala Ser Ala Asp Lys Pro Thr Thr Lys Leu Ser Ala 820 825 830 Ser Arg Asn Asp Glu Gly Phe Ser Ser Ser Ser Gln Asp Val Asn Gly 835 840 845 Phe Thr Asp Gly Ser Arg Gly Glu Leu Ser Gln Pro Thr Leu Thr Ile 850 855 860 Gln Thr His Pro Tyr Arg Thr Cys Asp Pro Val Glu Met Ser Tyr Pro 865 870 875 880 Arg Asp Gln Phe Gln Pro Ala Ile Arg Val Ala Asp Leu Leu Gln His 885 890 895 Ile Thr Gln Met Lys Arg Gly Gln Gly Tyr Gly Phe Lys Glu Glu Tyr 900 905 910 Glu Ala Leu Pro Glu Gly Gln Thr Ala Ser Trp Asp Thr Ala Lys Glu 915 920 925 Asp Glu Asn Arg Asn Lys Asn Arg Tyr Gly Asn Ile Ile Ser Tyr Asp 930 935 940 His Ser Arg Val Arg Leu Leu Val Leu Asp Gly Asp Pro His Ser Asp 945 950 955 960 Tyr Ile Asn Ala Asn Tyr Ile Asp Gly Tyr His Arg Pro Arg His Tyr 965 970 975 Ile Ala Thr Gln Gly Pro Met Gln Glu Thr Val Lys Asp Phe Trp Arg 980 985 990 Met Ile Trp Gln Glu Asn Ser Ala Ser Ile Val Met Val Thr Asn Leu 995 1000 1005 Val Glu Val Gly Arg Val Lys Cys Val Arg Tyr Trp Pro Asp Asp Thr 1010 1015 1020 Glu Val Tyr Gly Asp Ile Lys Val Thr Leu Ile Glu Thr Glu Pro Leu 1025 1030 1035 1040 Ala Glu Tyr Val Ile Arg Thr Phe Thr Val Gln Lys Lys Gly Tyr His 1045 1050 1055 Glu Ile Arg Glu Leu Arg Leu Phe His Phe Thr Ser Trp Pro Asp His 1060 1065 1070 Gly Val Pro Cys Tyr Ala Thr Gly Leu Leu Gly Phe Val Arg Gln Val 1075 1080 1085 Lys Phe Leu Asn Pro Pro Glu Ala Gly Pro Ile Val Val His Cys Ser 1090 1095 1100 Ala Gly Ala Gly Arg Thr Gly Cys Phe Ile Ala Ile Asp Thr Met Leu 1105 1110 1115 1120 Asp Met Ala Glu Asn Glu Gly Val Val Asp Ile Phe Asn Cys Val Arg 1125 1130 1135 Glu Leu Arg Ala Gln Arg Val Asn Leu Val Gln Thr Glu Glu Gln Tyr 1140 1145 1150 Val Phe Val His Asp Ala Ile Leu Glu Ala Cys Leu Cys Gly Asn Thr 1155 1160 1165 Ala Ile Pro Val Cys Glu Phe Arg Ser Leu Tyr Tyr Asn Ile Ser Arg 1170 1175 1180 Leu Asp Pro Gln Thr Asn Ser Ser Gln Ile Lys Asp Glu Phe Gln Thr 1185 1190 1195 1200 Leu Asn Ile Val Thr Pro Arg Val Arg Pro Glu Asp Cys Ser Ile Gly 1205 1210 1215 Leu Leu Pro Arg Asn His Asp Lys Asn Arg Ser Met Asp Val Leu Pro 1220 1225 1230 Leu Asp Arg Cys Leu Pro Phe Leu Ile Ser Val Asp Gly Glu Ser Ser 1235 1240 1245 Asn Tyr Ile Asn Ala Ala Leu Met Asp Ser His Lys Gln Pro Ala Ala 1250 1255 1260 Phe Val Val Thr Gln His Pro Leu Pro Asn Thr Val Ala Asp Phe Trp 1265 1270 1275 1280 Arg Leu Val Phe Asp Tyr Asn Cys Ser Ser Val Val Met Leu Asn Glu 1285 1290 1295 Met Asp Thr Ala Gln Phe Cys Met Gln Tyr Trp Pro Glu Lys Thr Ser 1300 1305 1310 Gly Cys Tyr Gly Pro Ile Gln Val Glu Phe Val Ser Ala Asp Ile Asp 1315 1320 1325 Glu Asp Ile Ile His Arg Ile Phe Arg Ile Cys Asn Met Ala Arg Pro 1330 1335 1340 Gln Asp Gly Tyr Arg Ile Val Gln His Leu Gln Tyr Ile Gly Trp Pro 1345 1350 1355 1360 Ala Tyr Arg Asp Thr Pro Pro Ser Lys Arg Ser Leu Leu Lys Val Val 1365 1370 1375 Arg Arg Leu Glu Lys Trp Gln Glu Gln Tyr Asp Gly Arg Glu Gly Arg 1380 1385 1390 Thr Val Val His Cys Leu Asn Gly Gly Gly Arg Ser Gly Thr Phe Cys 1395 1400 1405 Ala Ile Cys Ser Val Cys Glu Met Ile Gln Gln Gln Asn Ile Ile Asp 1410 1415 1420 Val Phe His Ile Val Lys Thr Leu Arg Asn Asn Lys Ser Asn Met Val 1425 1430 1435 1440 Glu Thr Leu Glu Gln Tyr Lys Phe Val Tyr Glu Val Ala Leu Glu Tyr 1445 1450 1455 Leu Ser Ser Phe 1460 <210> 2 <211> 253 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Ser Trp Asp Thr Ala Lys Glu Asp Glu Asn Arg Asn Lys Asn Arg 1 5 10 15 Tyr Gly Asn Ile Ile Ser Tyr Asp His Ser Arg Val Arg Leu Leu Val 20 25 30 Leu Asp Gly Asp Pro His Ser Asp Tyr Ile Asn Ala Asn Tyr Ile Asp 35 40 45 Gly Tyr His Arg Pro Arg His Tyr Ile Ala Thr Gln Gly Pro Met Gln 50 55 60 Glu Thr Val Lys Asp Phe Trp Arg Met Ile Trp Gln Glu Asn Ser Ala 65 70 75 80 Ser Ile Val Met Val Thr Asn Leu Val Glu Val Gly Arg Val Lys Cys 85 90 95 Val Arg Tyr Trp Pro Asp Asp Thr Glu Val Tyr Gly Asp Ile Lys Val 100 105 110 Thr Leu Ile Glu Thr Glu Pro Leu Ala Glu Tyr Val Ile Arg Thr Phe 115 120 125 Thr Val Gln Lys Lys Gly Tyr His Glu Ile Arg Glu Leu Arg Leu Phe 130 135 140 His Phe Thr Ser Trp Pro Asp His Gly Val Pro Cys Tyr Ala Thr Gly 145 150 155 160 Leu Leu Gly Phe Val Arg Gln Val Lys Phe Leu Asn Pro Pro Glu Ala 165 170 175 Gly Pro Ile Val Val His Cys Ser Ala Gly Ala Gly Arg Thr Gly Cys 180 185 190 Phe Ile Ala Ile Asp Thr Met Leu Asp Met Ala Glu Asn Glu Gly Val 195 200 205 Val Asp Ile Phe Asn Cys Val Arg Glu Leu Arg Ala Gln Arg Val Asn 210 215 220 Leu Val Gln Thr Glu Glu Gln Tyr Val Phe Val His Asp Ala Ile Leu 225 230 235 240 Glu Ala Cys Leu Cys Gly Asn Thr Ala Ile Pro Val Cys 245 250 <210> 3 <211> 594 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Ala Pro Ile Gly Leu Lys Ala Val Val Gly Glu Lys Ile Met His 1 5 10 15 Asp Val Ile Lys Lys Val Lys Lys Lys Gly Glu Trp Lys Val Leu Val 20 25 30 Val Asp Gln Leu Ser Met Arg Met Leu Ser Ser Cys Cys Lys Met Thr 35 40 45 Asp Ile Met Thr Glu Gly Ile Thr Ile Val Glu Asp Ile Asn Lys Arg 50 55 60 Arg Glu Pro Leu Pro Ser Leu Glu Ala Val Tyr Leu Ile Thr Pro Ser 65 70 75 80 Glu Lys Ser Val His Ser Leu Ile Ser Asp Phe Lys Asp Pro Pro Thr 85 90 95 Ala Lys Tyr Arg Ala Ala His Val Phe Phe Thr Asp Ser Cys Pro Asp 100 105 110 Ala Leu Phe Asn Glu Leu Val Lys Ser Arg Ala Ala Lys Val Ile Lys 115 120 125 Thr Leu Thr Glu Ile Asn Ile Ala Phe Leu Pro Tyr Glu Ser Gln Val 130 135 140 Tyr Ser Leu Asp Ser Ala Asp Ser Phe Gln Ser Phe Tyr Ser Pro His 145 150 155 160 Lys Ala Gln Met Lys Asn Pro Ile Leu Glu Arg Leu Ala Glu Gln Ile 165 170 175 Ala Thr Leu Cys Ala Thr Leu Lys Glu Tyr Pro Ala Val Arg Tyr Arg 180 185 190 Gly Glu Tyr Lys Asp Asn Ala Leu Leu Ala Gln Leu Ile Gln Asp Lys 195 200 205 Leu Asp Ala Tyr Lys Ala Asp Asp Pro Thr Met Gly Glu Gly Pro Asp 210 215 220 Lys Ala Arg Ser Gln Leu Leu Ile Leu Asp Arg Gly Phe Asp Pro Ser 225 230 235 240 Ser Pro Val Leu His Glu Leu Thr Phe Gln Ala Met Ser Tyr Asp Leu 245 250 255 Leu Pro Ile Glu Asn Asp Val Tyr Lys Tyr Glu Thr Ser Gly Ile Gly 260 265 270 Glu Ala Arg Val Lys Glu Val Leu Leu Asp Glu Asp Asp Asp Leu Trp 275 280 285 Ile Ala Leu Arg His Lys His Ile Ala Glu Val Ser Gln Glu Val Thr 290 295 300 Arg Ser Leu Lys Asp Phe Ser Ser Ser Lys Arg Met Asn Thr Gly Glu 305 310 315 320 Lys Thr Thr Met Arg Asp Leu Ser Gln Met Leu Lys Lys Met Pro Gln 325 330 335 Tyr Gln Lys Glu Leu Ser Lys Tyr Ser Thr His Leu His Leu Ala Glu 340 345 350 Asp Cys Met Lys His Tyr Gln Gly Thr Val Asp Lys Leu Cys Arg Val 355 360 365 Glu Gln Asp Leu Ala Met Gly Thr Asp Ala Glu Gly Glu Lys Ile Lys 370 375 380 Asp Pro Met Arg Ala Ile Val Pro Ile Leu Leu Asp Ala Asn Val Ser 385 390 395 400 Thr Tyr Asp Lys Ile Arg Ile Ile Leu Leu Tyr Ile Phe Leu Lys Asn 405 410 415 Gly Ile Thr Glu Glu Asn Leu Asn Lys Leu Ile Gln His Ala Gln Ile 420 425 430 Pro Pro Glu Asp Ser Glu Ile Ile Thr Asn Met Ala His Leu Gly Val 435 440 445 Pro Ile Val Thr Asp Ser Thr Leu Arg Arg Arg Ser Lys Pro Glu Arg 450 455 460 Lys Glu Arg Ile Ser Glu Gln Thr Tyr Gln Leu Ser Arg Trp Thr Pro 465 470 475 480 Ile Ile Lys Asp Ile Met Glu Asp Thr Ile Glu Asp Lys Leu Asp Thr 485 490 495 Lys His Tyr Pro Tyr Ile Ser Thr Arg Ser Ser Ala Ser Phe Ser Thr 500 505 510 Thr Ala Val Ser Ala Arg Tyr Gly His Trp His Lys Asn Lys Ala Pro 515 520 525 Gly Glu Tyr Arg Ser Gly Pro Arg Leu Ile Ile Phe Ile Leu Gly Gly 530 535 540 Val Ser Leu Asn Glu Met Arg Cys Ala Tyr Glu Val Thr Gln Ala Asn 545 550 555 560 Gly Lys Trp Glu Val Leu Ile Gly Ser Thr His Ile Leu Thr Pro Gln 565 570 575 Lys Leu Leu Asp Thr Leu Lys Lys Leu Asn Lys Thr Asp Glu Glu Ile 580 585 590 Ser Ser <210> 4 <211> 288 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Met Lys Asp Arg Thr Gln Glu Leu Arg Thr Ala Lys Asp Ser Asp Asp 1 5 10 15 Asp Asp Asp Val Thr Val Thr Val Asp Arg Asp Arg Phe Met Asp Glu 20 25 30 Phe Phe Glu Gln Val Glu Glu Ile Arg Gly Phe Ile Asp Lys Ile Ala 35 40 45 Glu Asn Val Glu Glu Val Lys Arg Lys His Ser Ala Ile Leu Ala Ser 50 55 60 Pro Asn Pro Asp Glu Lys Thr Lys Glu Glu Leu Glu Glu Leu Met Ser 65 70 75 80 Asp Ile Lys Lys Thr Ala Asn Lys Val Arg Ser Lys Leu Lys Ser Ile 85 90 95 Glu Gln Ser Ile Glu Gln Glu Glu Gly Leu Asn Arg Ser Ser Ala Asp 100 105 110 Leu Arg Ile Arg Lys Thr Gln His Ser Thr Leu Ser Arg Lys Phe Val 115 120 125 Glu Val Met Ser Glu Tyr Asn Ala Thr Gln Ser Asp Tyr Arg Glu Arg 130 135 140 Cys Lys Gly Arg Ile Gln Arg Gln Leu Glu Ile Thr Gly Arg Thr Thr 145 150 155 160 Thr Ser Glu Glu Leu Glu Asp Met Leu Glu Ser Gly Asn Pro Ala Ile 165 170 175 Phe Ala Ser Gly Ile Ile Met Asp Ser Ser Ile Ser Lys Gln Ala Leu 180 185 190 Ser Glu Ile Glu Thr Arg His Ser Glu Ile Ile Lys Leu Glu Thr Ser 195 200 205 Ile Arg Glu Leu His Asp Met Phe Met Asp Met Ala Met Leu Val Glu 210 215 220 Ser Gln Gly Glu Met Ile Asp Arg Ile Glu Tyr Asn Val Glu His Ala 225 230 235 240 Val Asp Tyr Val Glu Arg Ala Val Ser Asp Thr Lys Lys Ala Val Lys 245 250 255 Tyr Gln Ser Lys Ala Arg Arg Lys Lys Ile Met Ile Ile Ile Cys Cys 260 265 270 Val Ile Leu Gly Ile Ile Ile Ala Ser Thr Ile Gly Gly Ile Phe Gly 275 280 285

Claims (10)

1) 피검 물질을 단백질 타이로신 탈인산화효소 수용체 T(protein tyrosine phosphtase receptor T; PTPRT) 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 PTPRT의 단편, 및 신탁신-결합 단백질 1(syntaxin-binding protein 1) 발현 세포주에 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 세포주에서 신탁신-결합 단백질 1의 탈인산화 정도를 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 결과를 대조군으로서 피검 물질을 처리하지 않는 PTPRT 또는 이의 단편, 및 신탁신-결합 단백질 1 발현 세포주와 비교하여 신탁신-결합 단백질 1의 탈인산화 정도를 증가시키는 피검 물질을 선별하는 단계를 포함하는 시냅스 형성 조절제 스크리닝 방법.
제 1항에 있어서, 단계 1)의 세포주는 형질전환에 의해 PTPRT 또는 이의 단편, 및 신탁신-결합 단백질 1이 과발현되는 것을 특징으로 하는 시냅스 형성 조절제의 스크리닝 방법.
제 1항에 있어서, 상기 PTPRT는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 시냅스 형성 조절제의 스크리닝 방법.
삭제
제 1항에 있어서, 단계 2)의 탈인산화 정도 측정 방법은 면역침강 분석, 웨스턴 블럿팅, ELISA, 방사성 동위원소 검출법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 시냅스 형성 조절제의 스크리닝 방법.
제 1항에 있어서, 단계 2)의 신탁신-결합 단백질 1의 탈인산화는 PTPRT가 신탁신-결합 단백질 1의 145 번째에 위치한 타이로신을 탈인산화시키는 것을 특징으로 하는 시냅스 형성 조절제의 스크리닝 방법.
1) 피검 물질을 단백질 타이로신 탈인산화효소 수용체 T(protein tyrosine phosphtase receptor T; PTPRT) 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 PTPRT의 단편, 및 신탁신-결합 단백질 1(syntaxin-binding protein 1) 발현 세포주에 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 세포주에서 신탁신-결합 단백질 1의 탈인산화 정도를 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 결과를 대조군으로서 피검 물질을 처리하지 않는 PTPRT 또는 이의 단편, 및 신탁신-결합 단백질 1 발현 세포주와 비교하여 신탁신-결합 단백질 1의 탈인산화 정도를 증가시키는 피검 물질을 선별하는 단계를 포함하는 SNARE 복합체 형성 조절제 스크리닝 방법.
1) 피검 물질을 해마 신경세포주(hipoccampal neuron)에 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 세포주에서 신탁신-결합 단백질 1의 탈인산화 정도를 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 결과를 대조군으로서 피검 물질을 처리하지 않는 해마 신경세포주와 비교하여 신탁신-결합 단백질 1의 탈인산화 정도를 증가시키는 피검 물질을 선별하는 단계를 포함하는 시냅스 형성 조절제 스크리닝 방법.
제 8항에 있어서, 단계 2)의 탈인산화 정도 측정 방법은 면역침강 분석, 웨스턴 블럿팅, ELISA, 방사성 동위원소 검출법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 시냅스 형성 조절제의 스크리닝 방법.
1) 피검 물질을 해마 신경세포주에 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 세포주에서 신탁신-결합 단백질 1의 탈인산화 정도를 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 결과를 대조군으로서 피검 물질을 처리하지 않는 해마 신경세포주와 비교하여 신탁신-결합 단백질 1의 탈인산화 정도를 증가시키는 피검 물질을 선별하는 단계를 포함하는 SNARE 복합체 형성 조절제의 스크리닝 방법.
KR1020130111072A 2013-09-16 2013-09-16 Ｐｔｐｒｔ 및 신탁신―결합 단백질 1을 이용한 시냅스 형성 조절제의 스크리닝 방법 KR101514282B1 (ko)

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JP2005504529A (ja) 2001-08-10 2005-02-17 ノバルティス フォルシュンクスティフトゥング，ツバイクニーダーラスンク フリードリッヒ ミーシャー インスティチュート フォー バイオメディカル リサーチ マーカー及びスクリーニング
JP2006067944A (ja) 2004-09-03 2006-03-16 Japan Science & Technology Agency シナプス成熟障害モデル動物
JP2007534323A (ja) 2004-04-23 2007-11-29 バック インスティチュート アルツハイマー病のトランスジェニックモデル及び種々の神経変性疾患の治療におけるその使用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JP2005504529A (ja) 2001-08-10 2005-02-17 ノバルティス フォルシュンクスティフトゥング，ツバイクニーダーラスンク フリードリッヒ ミーシャー インスティチュート フォー バイオメディカル リサーチ マーカー及びスクリーニング
JP2007534323A (ja) 2004-04-23 2007-11-29 バック インスティチュート アルツハイマー病のトランスジェニックモデル及び種々の神経変性疾患の治療におけるその使用
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