WO2006090918A1 - 糖尿病モデル動物 - Google Patents

糖尿病モデル動物 Download PDF

Info

Publication number
WO2006090918A1
WO2006090918A1 PCT/JP2006/304185 JP2006304185W WO2006090918A1 WO 2006090918 A1 WO2006090918 A1 WO 2006090918A1 JP 2006304185 W JP2006304185 W JP 2006304185W WO 2006090918 A1 WO2006090918 A1 WO 2006090918A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
animal
cells
diabetes
human
human animal
Prior art date
Application number
PCT/JP2006/304185
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hiromichi Yonekawa
Kunie Matsuoka
Hiroshi Shitara
Kenji Kohno
Original Assignee
Tokyo Metropolitan Organization For Medical Research
National University Corporation NARA Institute of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tokyo Metropolitan Organization For Medical Research, National University Corporation NARA Institute of Science and Technology filed Critical Tokyo Metropolitan Organization For Medical Research
Priority to US11/884,943 priority Critical patent/US20090217394A1/en
Priority to EP06715244A priority patent/EP1859677A4/en
Priority to JP2007504847A priority patent/JP4931153B2/ja
Publication of WO2006090918A1 publication Critical patent/WO2006090918A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0271—Chimeric vertebrates, e.g. comprising exogenous cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0362—Animal model for lipid/glucose metabolism, e.g. obesity, type-2 diabetes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/007—Vectors comprising a special translation-regulating system cell or tissue specific
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
    • G01N2800/042—Disorders of carbohydrate metabolism, e.g. diabetes, glucose metabolism

Definitions

  • the present invention relates to a transgenic non-human animal and a diabetes model animal into which a recombinant DNA containing a gene encoding a diphtheria toxin receptor and a promoter that regulates the expression of the gene is introduced.
  • the present inventors have previously developed a method called the TRECK method (International Publication No. 9 8 3 3 8 9 9 Pamphlet K Saito M, et.al., (2001) Nat. Biotechnology 19: 746-750) 0
  • This method focuses on the fact that heparin-binding EGF is the main body of the receptor for diphtheria toxin (diphtheria toxin). Is to specifically destroy only a specific group of mice by utilizing the fact that it has a resistance of about 1,000 times more than human cells.
  • the outline of the TRECK method is as follows.
  • a recombinant DNA in which a mouse cell / tissue-specific promoter is bound to a human-specific diphtheria toxin receptor (DTR) is prepared and introduced into a mouse individual.
  • DTR diphtheria toxin receptor
  • Tg mice Mice are produced. This Tg mouse specifically expresses DTR on the cell surface by the introduced promoter. Therefore, when diphtheria toxin (DT) is administered to these Tg mice, only targeted cells can be removed at any time, or transient damage can be caused.
  • human disease models such as hepatitis have been created by using this method, and various models can be created by applying this method.
  • diabetes is one of lifestyle-related diseases, and it is said that the estimated number of affected people in Japan is 16 million. Diabetes is caused by insufficient insulin action, that is, insufficient supply of insulin and decreased sensitivity in the target organs of the insulin, resulting in too much glucose in the blood (hyperglycemia) and spilled sugar in the urine (Diabetes) 06 304185
  • the present invention provides a transgenic non-human animal into which a recombinant DNA containing a gene encoding a diphtheria toxin receptor and a promoter that regulates the expression of the gene is introduced.
  • the present inventor has intensively studied to solve the above problems. Then, when a transgenic animal into which a recombinant DNA containing an insulin promoter was introduced using the TRECK method, it was found that this animal developed diabetes, and the present invention was completed.
  • the present invention is as follows.
  • a transgenic non-human animal into which a recombinant DNA containing a gene encoding a diphtheria toxin receptor and an insulin promoter that regulates the expression of the gene is introduced.
  • the transgenic non-human animal of the present invention is characterized by developing diabetes by administration of diphtheria toxin.
  • the gene encoding the diphtheria toxin receptor is a primate-derived heparin-binding EGF gene, preferably a human heparin-binding EGF gene. It is any one selected from the group consisting of mice, rats, guinea pigs, hamsters, dogs, cats, goats, hidges, pigs, horses and horses, and is preferably a mouse.
  • the animal used in the present invention is preferably a severe combined immunodeficient animal.
  • a method for producing a transgenic non-human animal comprising introducing a recombinant DNA containing a gene encoding a diphtheria toxin receptor and an insulin promoter that regulates expression of the gene into a non-human animal.
  • a diabetic animal characterized by administering diphtheria toxin to the above-mentioned transgenic non-human animal of (1) or the transgenic non-human animal prepared by the method of (2) above. Manufacturing method.
  • a diphtheria toxin is administered to the transgenic non-human animal of (1) above or the transgenic non-human animal prepared by the method of (2) above, and the transgenic non-human animal is To develop diabetes in children.
  • a method for screening a therapeutic agent for diabetes which comprises administering a candidate substance to the animal with diabetes mellitus according to (3) above.
  • the blood glucose level of a diabetes model animal contacted with a candidate substance is measured, and the measured blood glucose level is lower than the blood glucose level of a control diabetes model animal not contacted with the candidate substance. Then, the candidate substance can be selected as a therapeutic agent for diabetes.
  • the insulin concentration for example, blood insulin concentration
  • the concentration of a control diabetes model animal that does not contact the candidate substance is measured, and the measured concentration of a control diabetes model animal that does not contact the candidate substance.
  • the candidate substance can be selected as a therapeutic agent for diabetes.
  • stem cells used for transplantation include hematopoietic stem cells.
  • the hematopoietic stem cells are preferably bone marrow derived cells or cord blood derived cells.
  • the knee cells of this non-human animal include cells derived from the transplanted hematopoietic stem cells of other animals.
  • Hematopoietic stem cells are preferably bone marrow cells or umbilical cord blood cells.
  • Fig. 1 is a schematic diagram of a method for developing diabetes using the TRECK method.
  • FIG. 2 ′ shows a part of the recombinant DNA for production of the transgenic mouse of the present invention.
  • Fig. 3 is a photograph showing detection of a transgene by PCR.
  • FIG. 4A is a graph showing the results of measuring blood glucose levels after administration of diphtheria toxin to the transgenic mice of the present invention.
  • FIG. 4B is a graph showing an increase in blood glucose level due to administration of diphtheria toxin.
  • FIG. 5A is a graph showing the blood glucose level measured after administering insulin to the transgenic mice of the present invention whose blood glucose level was increased by administration of diphtheria toxin.
  • FIG. 5B is a graph showing blood insulin concentration in SCID-Ins-TRECK-Tg.
  • FIG. 5C is a graph showing that hyperglycemia in SCID-Ins-TRECK-Tg mice is insulin dependent.
  • FIG. 6 is a photograph obtained by histological analysis of the rat viscera of the transgenic mouse of the present invention.
  • FIG. 7 is a photograph of immunohistochemical staining of knee tissue with anti-hHB-EGF antibody.
  • FIG. 8 is a photograph of immunohistochemical staining of the knee tissue of a SCID-Ins-TRECK-Tg mouse.
  • Figure 9 shows that transplantation of C57BL / 6 mouse bone marrow cells improves hyperglycemia.
  • FIG. 10 is a diagram showing changes in blood glucose level after transplantation of human umbilical cord blood-derived cells.
  • the present invention relates to a transgenic non-human animal into which a recombinant DNA containing a gene encoding a diphtheria toxin receptor and an insulin promoter that regulates the expression of the gene is introduced, and a diabetes model animal that develops diabetes.
  • the present invention is characterized in that a transgenic animal that develops diabetes is obtained by introducing a recombinant DNA containing a gene encoding a diphtheria toxin receptor and an insulin promoter that regulates the expression of the gene.
  • a transgenic animal that develops diabetes is obtained by introducing a recombinant DNA containing a gene encoding a diphtheria toxin receptor and an insulin promoter that regulates the expression of the gene.
  • the main body of the diphtheria toxin receptor of the present invention is primate-derived heparin-binding EGF (HB-EGF; heparin omding-epidermal growth factor).
  • Henoline-binding EGF genes exist in membrane-bound and free forms by proteolytic enzymes. In this study, membrane-bound ones are used.
  • the base sequence of the heparin-binding EGF gene that can be used in the present invention is known, and the sequence can be easily obtained through public databases such as GenBank.
  • GenBank GenBank
  • the base sequence of human heparin-binding EGF gene is shown in SEQ ID NO: 1 (NM_001945). However, those skilled in the art can select and use a partial fragment of the above base sequence, for example, a coding region (regions 262 to 888 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1).
  • the heparin-binding EGF gene of the present invention includes a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a partial sequence thereof, a sequence complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a partial partition sequence thereof. In contrast, it contains DNA that hybridizes under stringent conditions and encodes a region having heparin-binding EGF activity.
  • the heparin-binding EGF activity means an activity that functions as a membrane-bound diphtheria toxin receptor as described above.
  • Such a heparin-binding EGF gene can be obtained by using DNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof as a probe, such as cornice hybridization, plaque hybridization, Southern blot, etc. It can be obtained from a human cDNA library or a genomic library by a known hybridization method. For these methods, “Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))” can be referred to.
  • Examples of stringent conditions in the above hybridization include 1 X SSC to 2 X SSC, 0.1% to 0.5% SDS, and 42 ° C to 68 ° C. After prehybridization at 68 ° C for 30 minutes or more, perform probe hybridization and wash for 5-15 minutes at room temperature in 2 X SSC, 0.1% SDS 4-6 The conditions for performing the operation are listed.
  • a base sequence of a gene encoding a protein having 99% or more homology and having heparin-binding EGF activity as a diphtheria toxin receptor can also be used.
  • the insulin promoter used in the present invention refers to the spleen islets of Langerhans. It is a DNA element necessary for controlling specific expression in a cell.
  • the base sequence of the gene is known, and the sequence can be easily obtained through a public database such as GenBank.
  • GenBank a public database
  • the nucleotide sequence (1.9 kb) of the human promoter described in J. Exp. Med. (1998) 188 (8): 1445_1451 is represented by SEQ ID NO: 2. Shown in
  • the insulin promoter of the present invention hybridizes under stringent conditions to a sequence complementary to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 in addition to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, and the insulin promoter. Contains DNA that encodes the active region. Insulin promoter activity refers to activity that can promote the expression of a gene linked downstream of the promoter in the knee.
  • Such an insulin promoter can be obtained by a known hybridization method such as cochlear hybridization, blur, hybridization, Southern plot, etc., using DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a fragment thereof as a probe. It can be obtained from cDNA library and genomic library. For these methods, “Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))” can be referred to.
  • Examples of stringent conditions in the above hybridization include 1 X SSC to 2 X SSC, 0.1% to 0.5% SDS, and 42 ° C to 68 ° C. Prehybridize at 60-68 ° C for at least 30 minutes, then perform probe hybridization, and wash in 2 X SSC, 0.1% SDS at room temperature for 5-15 minutes 4 The conditions for performing 6 times are mentioned. Further, it has 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more, 98% or more or 99% or more homology with the base sequence shown in SEQ ID NO: 2. In addition, a nucleotide base sequence having the above insulin promoter activity can also be used.
  • the recombinant DNA of the present invention is obtained by binding an insulin promoter, which is a cell / tissue-specific promoter, to a heparin-binding EGF gene, which is a diphtheria toxin receptor specific to primates.
  • This insulin promoter allows heparin-binding EGF gene to be expressed specifically on the surface of cells.
  • diphtheria toxin (DT) is administered to an individual into which such recombinant DNA has been introduced, cells that express the insulin promoter can be specifically destroyed at any time.
  • DT diphtheria toxin
  • a method for preparing a cloning vector containing an expression cassette in which an insulin promoter is bound to a heparin-binding EGF gene is described below.
  • the heparin-binding EGF gene and the incinurin promoter which are genes encoding the diphtheria toxin receptor of the present invention, can be produced using ordinary chemical synthesis methods or biochemical synthesis methods.
  • a nucleic acid synthesis method using a DNA synthesizer generally used as a genetic engineering technique can be used.
  • a PCR method or a gene amplification method using a cloning vector can be used. If necessary, the sequence may be confirmed using a known method such as TA cloning.
  • the above method can be easily performed by those skilled in the art according to Moleculer cloning 2nd ed.
  • the obtained PCR product can be purified using GENE CLEAN (Funakoshi), QIAGEN (QIAGEN) or the like. If necessary, the base sequence of the expected gene can be confirmed using a sequencer or the like.
  • each of the above genes is known and cleaved with a restriction enzyme or the like.
  • the DNA fragment of the heparin-binding EGF gene thus excised is inserted into a known vector according to a known method.
  • the promoter DNA is cleaved using a restriction enzyme or the like, and inserted into a site where the promoter can be operated upstream of the gene inserted earlier.
  • DNA ligase can be used for DNA binding.
  • the vectors include plasmids derived from E.
  • coli such as pCR4, pCR2.1, pBluescript, pBR322, pBR325, pUC12, and pUCl3, plasmids derived from Bacillus subtilis such as pUB110, pTP5, and pC194, plasmids derived from yeast such as pSH19 and pSH15, and lambda And other animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, and baculovirus.
  • pBluescript and pAT153 are preferable.
  • the TRECK (toxin receptor-mediated cell knockout) method creates a transgenic animal that specifically expresses a diphtheria toxin receptor gene in a target cell group and administers diphtheria toxin at any time and quantitatively. It is a new and original method for clarifying the role of cell lineage within an individual that can be damaged. The principle of the TRECK method is explained below.
  • the amino acid sequence that constitutes HB-EGF is slightly different between primates such as hydrangea and rodents such as mice and rats, and diphtheria toxin is due to receptor-dependent endocytosis.
  • the binding affinity for diphtheria toxin when taken up into cells is also different.
  • mouse cells are resistant to diphtheria toxin, because mouse HB-EGF has a significantly lower affinity for diphtheria toxin than human and other receptors. This is because diphtheria toxin cannot bind to the above receptor and cannot enter the cell.
  • hHB-EGF human cell-derived HB-EGF
  • hHB-EGF a diphtheria toxin receptor
  • mouse cells can also be made sensitive to diphtheria toxin because they are taken up intracellularly. Taking advantage of this property, a mouse in which hHB-EGF is expressed in a target cell group is prepared, and when diphtheria toxin is administered at a time when the cell is to be damaged, only the target cell is removed. Or can cause temporary disabilities.
  • diphtheria toxin is a protein with a molecular weight of 58,000, consisting of fragment A and fragment B. Once incorporated into cells, fragment A is a target molecule, peptide chain elongation factor 2 (EF-2). ) Is ADP-ribosylated and inactivated, resulting in inhibition of protein synthesis and cell death.
  • EF-2 peptide chain elongation factor 2
  • mouse HB-EGF does not function as a diphtheria toxin receptor and diphtheria toxin cannot enter the cell. Therefore, when mouse-derived human HB-EGF (hHB-EGF), which is a diphtheria toxin receptor, is expressed, the mouse becomes sensitive to diphtheria toxin.
  • the TRECK method is based on this property, and if a mouse group in which hHB-EGF is expressed in a target cell group is produced and diphtheria toxin is administered at the time when it is desired to damage the cell, it is targeted. It can remove only cells or cause temporary damage.
  • the specific experimental procedure of the TRECK method is as follows. That is, a plasmid having a promoter region of a gene that is specifically expressed only in the target cell group is prepared.
  • the plasmid may contain an enhancer region if necessary.
  • the prepared plasmid is prepared by CsCl equilibrium density gradient centrifugation, etc., and the transgene portion is excised with a restriction enzyme, separated by agarose gel electrophoresis, and purified. This transgene is used for the production of Tonsienien animals.
  • the administration method of diphtheria toxin to the produced transgenic animal can be any of intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, and muscle muscle. The dose varies depending on the animal used.
  • mice no abnormality is observed even when diphtheria toxin is administered at 50 g / kg. It is about 50 ⁇ /] 3 ⁇ 4 to 5 ⁇ /] 3 ⁇ 4 corresponding to / 10.
  • the administration time can be adjusted according to the time when the transgene is desired to be destroyed.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram when the target tissue or cells are disrupted using the TRECK method of the present invention.
  • the insulin promoter may be used as a tissue / cell specific promoter / enhancer to develop diabetes. (5) Diabetes
  • Diabetes is caused by a lack of insulin action, in other words, a lack of supply of insulin, and a decrease in sensitivity in the insulin target organ, resulting in an excessive increase of pudosugar in the blood (hyperglycemia) and a spill of sugar in the urine. State (diabetes). Diabetes mellitus is caused by: (i) Insulin as a result of spleen cell destruction in childhood Type II diabetes that develops relatively rapidly as hyperglycemia due to inability to secrete, (ii) It develops because insulin secretion is decreased or insulin's blood glucose lowering action is weakened.
  • insulin-independent type II diabetes in which factors such as eating habits, lack of exercise, and stress are greatly related, and (iii) gestational diabetes that develops after pregnancy. It is type I diabetes that the transgenic non-human animal of the present invention develops.
  • the transgenic non-human animal of the present invention is characterized by developing diabetes by administration of diphtheria toxin.
  • the production method of the transgenic non-human animal of the present invention and its phenotype will be described below.
  • the transgenic non-human animal of the present invention can be obtained by introducing the recombinant DNA into the genome of a non-human animal using a gene recombination technique.
  • Animal plants used in the present invention are not particularly limited. Examples include laboratory animals or livestock such as mice, rats, monoremots, nomstar, inu, cats, puta, hidge, goats, horses and horses.
  • a mouse is preferable because it is easy to handle and easy to reproduce.
  • description will be made using a mouse as an example.
  • Transgenic non-human animals can be prepared by, for example, a standard method using mice, that is, a microinduction method using early fertilized eggs, or an introduction method using ES cells.
  • a transgene used for microinjection for producing a transgenic animal for example, a cloning vector containing an expression cassette prepared as shown in FIG.
  • the expression cassette is excised from the expression vector, and the purified DNA fragment is fertilized in the pronucleus of fertilized mouse egg cells.
  • the standard method Hogan, B. et al., (1994) Manipulating the Mouse Embryo 2nd ean., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Coia Spring Inject according to Harbor, New York).
  • Genomic DNA is prepared from ear-punched pieces or tail tissue for identification of transgenic mice. That is, perforated pieces or tail tissue pieces were mixed with PCR buffer / nonionic surfactant and proteinase K (50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl, (pH 8), 1.5 mM MgCl 2 , 0.1% gelatin, 0.45% Place in NP-40, 0.45% Tween-20, 100 / zg / nil proteinase K) and incubate at 55 ° C. After incubation, in order to inactivate protein kinase K, incubate at 95 ° C for 15 minutes, and use the resulting solution as a DNA sample.
  • proteinase K 50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl, (pH 8), 1.5 mM MgCl 2 , 0.1% gelatin, 0.45% Place in NP-40, 0.45% Tween-20, 100 / zg / nil proteinase
  • a primer for example, having the following base sequence
  • the introduced gene recombinant is used as a saddle type. Amplify by PCR reaction.
  • the PCR reaction composition used was TaKaRa ⁇ -Taq polymerase (Takarabai) and the accompanying reaction solution.
  • the PCR reaction was performed at 96 ° C for 2 minutes, then at 96 ° C for 30 seconds, at 55 ° C for 30 seconds, 72 It is possible to amplify the target DNA fragment by performing 1 cycle at 35 ° C for 35 cycles, followed by 7 minutes at 72 ° C.
  • ES cells are derived from the inner cell mass of fertilized eggs at the blastocyst stage, and can be cultured and maintained in an undifferentiated state in vitro.
  • ES cells include already established cell lines and newly established cell lines! /, Can also be used for misalignment. For example, TT2 cell line, AB-1 cell line, J1 cell line, R1 cell line and the like can be used. Which ES cell line to use can be appropriately selected depending on the purpose or method of the experiment.
  • ES cells For gene transfer into ES cells, methods such as calcium phosphate coprecipitation method, electopore position method, lipofusion method, retrovirus infection method, agglutination method, mic mouth injection method, and particle gun method can be adopted.
  • the electroporation method is preferable because it can process a large number of cells.
  • recombinant DNA When recombinant DNA is introduced into ES cells, recombinant DNA in the ES cell genome When a homologous recombination occurs between a specific gene in a portion homologous to DNA and the recombinant DNA, the gene of the recombinant DNA is introduced into ES cells.
  • ES cells incorporating the transgene can be assayed by screening chromosomal DNA isolated from colonies obtained by culturing single cells on feeder cells by Southern hybridization or PCR. . ⁇ Alternatively, selection may be done by using a vector containing a drug resistance gene or reporter gene.
  • drug resistance genes include neomycin phosphotransferase Il (nptll) gene and hygromycin phosphotransferase (hpt) gene.
  • Reporter genes include, for example, the / 3-galactosidase (lacZ) gene, chloramphee- Examples include the coal acetyltransferase (cat) gene.
  • a chimeric transgenic mouse can be obtained by transplanting this to a parent and generating and growing it. Then, choose a chimera mass among the children born to temporary parents (in the case of mice, the children are born in about 17 days). Animals with a high chimera contribution rate are likely to be germline, but it is possible to confirm that they are germline chimeric mice by mating chimeric mice with normal animals. After that, they are mated with normal females to obtain F1 and establish mutant animal lines.
  • the chimeric transgenic mouse obtained as described above is obtained as a heterozygote having a transgene only in one of the homologous chromosomes.
  • a homozygote having recombinant DNA in both homologous chromosomes it is only necessary to cross heterozygous siblings of heterozygote having the introduced DNA only in one of the homologous chromosomes in the animal.
  • the introduction of the recombinant DNA can be confirmed by PCR.
  • the transgenic mouse of the present invention is produced by subculturing the transgenic mouse by natural mating or in vitro fertilization.
  • the transgenic animal of the present invention (for example, a transgenic mouse) can pass on the genotype to offspring by passage (natural mating or external fertilization) as described above. Therefore, the transgenic animal of the present invention includes its offspring.
  • SID Severe combined immunodeficiency
  • SCID Severe combined immunodeficiency
  • SCID animals are useful as animal models for various diseases, and can also be applied to studies on infection protection using immunodeficiency, and studies using transplanted human cells and tumors.
  • Examples of such animals include mice, rats, and dogs.
  • mice are commercially available for SCID animals, and these SCID mice can be purchased from the animal trader, Japan Marie.
  • SCID animals are immunodeficient, human organs can be transplanted.
  • the present inventors developed diabetes in SCID mice and tried to transplant stem cells or progenitor cells of knee cells from various animal species including humans. We thought that applying the TRECK method to the above transplantation method could establish a more reproducible and technically easy system.
  • diabetes can be developed by introducing the recombinant DNA shown in Fig. 2 into the genome of the animal using the above SCID animal, Since stem cells or progenitor cells of knee spleen j3 cells from various animal species including humans can be transplanted, it is preferable as a model animal for developing diabetes.
  • the animal By administering diphtheria toxin to the transgenic non-human animal of the present invention, the animal develops diabetes.
  • the diphtheria toxin to be administered to the transgenic non-human animal of the present invention is an ammonium sulfate precipitate obtained by concentrating a diphtheria bacterium (C. diphtheriae PW8) concentrated filtrate by ultrafiltration. After further purification by DEAE-Sepharose column chromatography, use an appropriately diluted solution. Diphtheria toxin is also available from Sigma Aldrich (# D0564).
  • mice do not show any abnormalities even after administration of diphtheria toxin at 50 g / kg, so the ability to use diphtheria up to this amount is usually 1 / 1,000 to 1/10 the amount 50 ng / kg It is recommended to administer ⁇ 5 ig / kg.
  • Diphtheria toxin can be administered intravenously, intraperitoneally, subcutaneously, or intramuscularly.
  • the onset of diabetes can be easily determined by measuring the blood glucose level (glucose concentration in the blood) using the blood glucose measuring device Dexter ⁇ (Bayer) by puncturing the mouse tail vein with an injection needle. it can.
  • the blood glucose level measuring device other commercially available devices for human diabetes patients may be used.
  • Urine sugar can be detected by using a pre-test (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Nyauries (Terumo Corporation).
  • 50 ng / kg to 50 / g / kg of diphtheria toxin may be intraperitoneally administered to the transgenic mouse of the present invention.
  • the transgenic mouse of the present invention diphtheria toxin Within 2 days after administration of 13 ⁇ 4 intraperitoneally, the blood glucose level rises to 200 mg / dl or more, and the urinary saccharide and ketone bodies are detected.
  • the mice that have developed diabetes also have phenomena such as polydipsia, polyuria and weight loss, which are common in many human diabetics. Therefore, a mouse that has developed diabetes can be used as a diabetes model mouse. 3. Screening method for antidiabetic drugs
  • a therapeutic drug for diabetes is screened by contacting (for example, administering) a drug candidate substance (test substance) for the treatment of diabetes with a transgene animal that has developed diabetes due to administration of diphtheria toxin.
  • a drug candidate substance is brought into contact with a transgene non-human animal or part thereof of the present invention that has developed diabetes due to administration of diphtheria toxin, and the non-human animal or part thereof brought into contact with the candidate substance
  • Measure the index value of a substance that correlates with the target disease in eg, blood glucose level, or insulin concentration in the blood or other tissues
  • Candidate substances can be screened by checking whether they are reduced or eliminated. Specifically, when the blood glucose level of a non-human animal contacted with a candidate substance is measured and the measured blood glucose level is lower than the blood glucose level of a control animal not in contact with the candidate substance, the candidate The substance can be selected as an antidiabetic agent.
  • the candidate substance is treated as an antidiabetic drug.
  • the tissue for measuring insulin is not particularly limited, but blood insulin is preferable.
  • Transgenic non-human animal or part thereof includes both the whole body of an animal's body and limited tissues or organs. In the case of limited tissues or organs, this includes those removed from animals. In the present invention, the knee is preferable.
  • Candidate substances include, for example, peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, cell culture supernatants, plant extracts, mammals (eg, mice, rats, pigs) , Ushi, Hedge, monkey, human, etc.), plasma, etc. These compounds may be novel compounds or known compounds. These candidate substances may form salts, and the salts of candidate substances include salts with physiologically acceptable acids (for example, organic acids or inorganic acids) and bases (for example, metal acids).
  • physiologically acceptable acids for example, organic acids or inorganic acids
  • bases for example, metal acids
  • Preferred acid addition salts are: Examples of such salts include salts with inorganic acids (for example, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (for example, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid). And salts with succinic acid, tartaric acid, succinic acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.).
  • inorganic acids for example, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.
  • organic acids for example, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid.
  • Examples of methods for contacting a test animal with a candidate substance include oral administration, intravenous injection, application, subcutaneous administration, intradermal administration, and intraperitoneal administration, depending on the symptoms of the test animal and the nature of the candidate substance. It can be selected appropriately.
  • the dosage of the candidate substance can be appropriately selected according to the administration method, the nature of the candidate substance, and the like.
  • the candidate substance used can be selected as a therapeutic agent for diabetes. 4.
  • the present invention provides a method for producing an animal having a spleen cell derived from another animal, characterized by transplanting a cell derived from the other animal into the above-mentioned diabetes model animal.
  • the “other animal” means an animal that is different from the animal used for the production of the diabetes model animal, and an animal of the same species and a different species.
  • heterologous animals include humans, mice, monkeys, humans, mice, pigs, hidges, goats, usagis, inu, cats, guinea pigs, hamsters, rats, horses, etc. However, it is not limited to these.
  • “Homogeneous and heterogeneous animals” means animals of the same animal species but of different strains. For example, if the mouse used to produce the model animal is C3H, the mouse used for transplantation is C57BL / 6 and so on.
  • Cells used for transplantation are undifferentiated cells such as spleen cells (including ⁇ cells and cells) and stem cells, but hematopoietic stem cells (particularly bone marrow cells and umbilical cord blood cells) are preferred.
  • stem cells include spleen cells (including ⁇ cells and cells) and stem cells, but hematopoietic stem cells (particularly bone marrow cells and umbilical cord blood cells) are preferred.
  • donor-derived cells are regenerated and engrafted in the recipient's broken spleen cells or tissue, and the recipient has normal knee function.
  • the present invention provides a transgene prepared as described above. Non-human animals are also provided.
  • mice As undifferentiated cells, mouse (Nature 292: 154-156, 1981), rat (Dev. Biol. 163 (1): 288.292, 1994), monkey (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (17): 7844-7848, 1995) and Usagi (Mol. Reprod. Dev. 45 (4): 439-443, 1996) have established ES cells and the like. In addition, EG (embryonic germ) cells have been established for puta (Biol. Reprod 57 (5): 1089 ⁇ 1095, 1997), but are not limited thereto. Whether or not the undifferentiated state is maintained can be confirmed, for example, by various known markers established in mammals (for example, mice or mice).
  • Hematopoietic stem cells include bone marrow-derived cells, cord blood-derived cells, and peripheral blood hematopoietic stem cells.
  • Hematopoietic stem cells used in the present invention can be collected from bone marrow, umbilical cord blood or peripheral blood and purified, and methods using various surface antigens present on the cell surface are known. Representative methods include Osawa's method (Osawa M, Nakamura K, Nishi N, Takahasi N, Tokuomoto Y, ⁇ noue H, Nakauchi H. in vivo self-renewal of c-Kit + Sca-1 + Lin (low /- ) hemopoietic stem cells. J
  • nucleated cells are separated from bone marrow, umbilical cord blood or peripheral blood, and an antibody against a surface antigen is allowed to act on the nucleated cells, which are then separated by a cell separator.
  • the cells obtained here can be cultured as they are.
  • the hematopoietic stem cells used in the present invention may be undifferentiated.
  • the number of cells to be transplanted is not limited, but when the recipient animal is a mouse, the number of donor cells is, for example, 10 4 to 10 9 cells, preferably 10 6 to: L 0 8 cells.
  • methods for transplanting the above cells into animals are well known, and those skilled in the art can perform the methods according to known methods. For example, a method of culturing bone marrow and administering it intravenously can be employed.
  • transplanted cells or the transgenic animal of the present invention After transplantation, observe the transplanted cells or the transgenic animal of the present invention to determine whether the transplanted stem cells have differentiated into the target cells. ⁇ The ability to establish the stem cells in the transplanted tissue, etc. Whether the transplanted cells have been affected by transplantation, whether the transplanted cells have a therapeutic effect on the developed diabetes, and the force that the transplanted cells have moved to. Items such as To evaluate. For example, observation of the transgenic animal of the present invention with the naked eye, observation of transplanted cells and surrounding tissues with a microscope, markers (for example, diabetic pathogenic genes, genes that serve as indicators of differentiation into specific cells) It is evaluated by detecting the expression, etc.
  • markers for example, diabetic pathogenic genes, genes that serve as indicators of differentiation into specific cells
  • transplanted tissue of the animal produced by the above method is not derived from the recipient, but it is' donor-derived tissue.
  • the mass spectrum analysis can be performed to confirm the existence of molecules that match the molecular weight of the donor animal species, the molecular weight of the donor animal species is the National Center for Biotechnology Information (NCBI).
  • the mouse of the present invention (SCID-Ins-TRECK-Tg mouse) of the present invention injured by administration of DT is transplanted with, for example, human knee spleen i3 cell as a cell derived from a different animal. Human knee cells are engrafted in the mouse. In this way, it is possible to create a model animal (eg, SCID-Hu (human) mouse model) having human-derived spleen cells.
  • SCID-Hu (human) mouse model having human-derived spleen cells.
  • the recombinant gene constructed for the production of a diabetes model SCID mouse is arranged in the order of the human insulin promoter Usagi j3-globinintron HB EGF cDNA—usagi] 3-globin poly (A +) signal. Mutation that replaces 148th leucine with serine and 149th proline with threonine by site directed mutagenesis using plasmid pRcHBEGF (EMBO J. (1994) 13: 2322-2330) The human HB-EGF (L148S / P149T) cDNA (SEQ ID NO: 3) was obtained. This was inserted downstream of the human insulin promoter (1.9 kb) of plasmid plns'l (J. Exp. Med. (1998) 188: 1445-1451) to construct plasmid pIns-TR2 (Fig. 2). )
  • the DNA fragment used for the production of the transgenic animal was obtained by double cleavage of the plasmid pIns-TR2 described in Example 1 with Sphl and Xhol, separated from the cloning vector by agarose gel electrophoresis, and then isolated. Purified by QIAEX II (QIAGEN, CA). Mouse fertilized with purified DNA fragment (CB-17 / Icr-scid / scid) Standard technique (Hogan, B. ri, ⁇ 994) Manipulating the Mouse Embryo 2nd edn., Cold Spring Injection according to Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). For identification of the transgenic mice, genomic DNA was prepared using the force of ear-punched pieces.
  • the perforated piece was PCR buffer / nonionic surfactant and proteinase K (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, (pH 8), 1.5 mM MgCl 2 , 0.1% gelatin, 0.45% NP-40, It was placed in 0.45% Tween-20 and 100 ⁇ g / ml proteinase K) and incubated at 55 ° C. After the incubation, in order to inactivate protein kinase K, it was incubated at 95 ° C for 15 minutes, and the resulting solution was used as a DNA sample.
  • proteinase K 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, (pH 8), 1.5 mM MgCl 2 , 0.1% gelatin, 0.45% NP-40, It was placed in 0.45% Tween-20 and 100 ⁇ g / ml proteinase K
  • primers having the following base sequences were used and amplified by PCR reaction using the transgene recombinant as a saddle.
  • PCR reaction composition is TaKaRa ⁇ -Ta polymerase (Takarabai) and attached reaction solution.
  • PCR reaction is 96 ° C for 2 minutes, then 96 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds
  • the target DNA fragment (0.7 kb) was amplified by performing a set of 1 minute at .72 ° C for 35 cycles, followed by apportionment at 72 ° C. After the PCR reaction, agarose gel electrophoresis was performed to determine the presence or absence of the transgene.
  • the amount of diphtheria toxin inoculated was set within a small range (513 ⁇ 4 / 13 ⁇ 4-50 / 13 ⁇ 4) and administered intraperitoneally.
  • mice with increased blood glucose level by administration of lig / kg diphtheria toxin were treated with fast-acting insulin (Novorapid Note). ; Novo Nordisk Pharma).
  • Transgenic mice (with blood glucose levels of 500 mg / dl or more) that developed diabetes rapidly dropped to normal levels after administration of 100 mU of insulin Fig. 5A.
  • mice Before administration of diphtheria toxin, 7 days after administration of opidiphtheria toxin 5 ⁇ g / kg, the mouse was euthanized by cervical dislocation, the knee was removed, fixed with 10% neutral buffered formalin solution, and fixed according to the standard method. It was embedded in paraffin and a 5 ⁇ thick piece was prepared using a microtome. Guinea Pig Anti-Swine Insulin (DAKO) and Rabbit Anti-Human Glucagon (DAKO) as primary antibodies, Alexa Fluor 488 goat anti-guinea pig IgG (H + L) and Alexa Fluor 594 goat as secondary antibodies anti-rabbit Double staining with IgG (H + L) and observation with a laser scanning confocal microscope.
  • DAKO Guinea Pig Anti-Swine Insulin
  • DAKO Rabbit Anti-Human Glucagon
  • Tg mouse and non-TSCID mouse knee slices were immunostained with anti-hHB-EGF antibody, anti-syringurin antibody, and anti-glucagon antibody, respectively.
  • cells stained with insulin antibody were stained with hHB-EGF antibody.
  • Expression of hHB-EGF was not observed in 3 cells of non-Tg-SCID mice (Fig. 8).
  • Bone marrow cells (2 ⁇ 10 7 cells) from which cells of C57BL / 6 mice were removed were transferred from the tail vein to hyperglycemia-induced mice on day 7 after DT administration.
  • Tg mouse-2 garden
  • iS cells were regenerated on the islet of Langerhans (Fig. 9, Photo panel). No increase in blood glucose level was observed in this individual even after re-administration of DT Thus, it was shown that the regenerated rat spleen cells were derived from C57BL / 6, which is a donor, rather than from the recipient.
  • SCID-Ins-TRECK-Tg mice that induced hyperglycemia by DT administration were transferred with human cord blood-derived CD34-positive cells or CD34-negative cells from the tail vein on the 7th day after DT administration. It was measured. Individuals transferred with CD34 negative cells had blood glucose levels of 300 mg / dl or more even 100 days after transfer, but those with CD34 positive cells had decreased blood glucose levels starting 40 days after transfer, and 70-80 days after transfer. It was below 200 mg / dl in the eyes (Fig. 10).
  • transplantation of human umbilical cord blood-derived cells showed that human-derived cells engrafted in mice and differentiated into spleen cells, thereby restoring spleen cell function and improving hyperglycemia. .
  • the diabetes model animal of the present invention has three conditions as an animal model for type I diabetes using regenerative medicine: '(i) that it can surely induce diabetes, (ii) any effect other than diabetes. And (iii) sufficiently clear that other mammalian cells can be transplanted, its usefulness is high, and it can be used to elucidate the pathology of diabetes and to develop therapeutic drugs for diabetes It has an extremely excellent effect.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)

Abstract

本発明は、糖尿病モデル動物の提供に関する。具体的には、ジフテリア毒素受容体をコードする遺伝子及び前記遺伝子の発現を調節するインシュリンプロモーターを含む組換体DNAが導入された、トランスジェニック非ヒト動物に関する。

Description

明 細 書 糖尿病モデル動物 技術分野
本発明は、 ジフテリァ毒素受容体をコードする遺伝子及ぴ前記遺伝子の発現 を調節するプロモーターを含む組換体 DNAが導入された、 トランスジエニック 非ヒト動物、 並びに糖尿病モデル動物に関する。 背景技術
本発明者らは、 以前 TRECK法という方法を開発した （国際公開 9 8ダ3 3 8 9 9号パンフレツ K Saito M, et.al., (2001) Nat.Biotechnology 19: 746-750) 0 すなわち、 この方法は、 へパリン結合性 EGFがジフテリア菌の庫生する毒素 (ジフテリア毒素） に対する受容体の本体であるという点に着目し、 細胞外か ら加えたジフテリア毒素に対して、 マウスの細胞がヒトの細胞に比べ約 1, 0 0 0倍以上の耐性を有することを利用し、 マウスの特定の細胞群のみを特異的に 破壊するものである。 TRECK法の概略は以下の通りである。 まず、 マウスの 細胞 ·組織特異的プロモーターをヒ トに特異的なジフテリァ毒素受容体（DTR) に結合させた組換え体 DNAを作製し、 それをマウス個体に導入することによ り トランスジエニック （Tg) マウスを作製する。 この Tgマウスは導入された プロモーターにより DTRを細胞の表面上に特異的に発現する。 そのため、 こ の Tgマウスにジフテリア毒素 （DT) を投与すると任意の時期に狙った細胞だ けを除去したり、 一過的な障害を与えたりすることができる。 これまでも、 こ の方法を用いることにより、 肝炎などのヒト疾患モデルが創出されており、 こ の方法の応用によってさらに様々なモデルが創出可能である。
ところで、 糖尿病は生活習慣病のひとつであり、 わが国でも推定罹患者数が 1600万人ともいわれている。糖尿病は、 インシュリン作用の不足、 つまりイン シュリンの供給不足と、ィンシュリン標的臓器での感受性の低下が原因となり、 血液中のブドウ糖が増えすぎて （高血糖）尿の中に糖が溢れてきた状態（糖尿） 06 304185
をいう。 実際は血液中のブドウ糖の量 （血糖値） を測定することにより診断さ れる。 さらに、 糖尿病は、 神経障害、 網膜症、 腎症などの合併症を引き起こす ことも知られており、 また、 他の生活習慣病である、 肥満、 高脂血症及ぴ高血 圧などと重複した代謝症候群 （metabolic syndrome) は、 心筋梗塞、 脳梗塞な どの心血管疾患の主要な原因になるといわれている。 したがって、 糖尿病の原 因解明とそれに立脚した根本的な予防法や治療法の確立がきわめて重要であり、 糖尿病のモデル動物の作製が望まれてきた。 特に、 I型糖尿病の根本的治療に は、 再生医学を利用した膝 B蔵 細胞の幹細胞、 あるいは前駆細胞の移植が有望 視されてきていた。 再生医学を利用した I型糖尿病のための適当な動物モデル としては、 以下の条件を満たす必要がある。
1 ) 動物の遺伝的背梟の違い、 あるいは種差、 性差にかかわらず、 1回の薬 剤の投与によつて確実に糖尿病を惹起できること。
2 ) 糖尿病を起こした後の短い時間に投与した薬剤が体内から速やかに排泄 され、 糖尿病以外の何らの影響も及ぼさないこと。
3 ) ヒトをはじめ、 ほとんどの哺乳類細胞を移植することが可能なこと。
し力 し、 上記の条件を満たす適当な動物モデルは確立されていなかった。 発明の開示
本発明は、 ジフテリァ毒素受容体をコードする遺伝子及ぴ前記遺伝子の発現 を調節するプロモーターを含む組換体 DNAが導入された、 トランスジェ-ッ ク非ヒト動物を提供する。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。そして、 TRECK 法を用いてィンシュリンプロモーターを含む組換え DNAを導入したトランス ジエニック動物を作製したところ、この動物が糖尿病を発症することを見出し、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は以下のとおりである。
( 1 ) ジフテリァ毒素受容体をコードする遺伝子及び前記遺伝子の発現を調節 するインシュリンプロモーターを含む組換体 DNAが導入された、 トランスジ エニック非ヒト動物。 本発明のトランスジエニック非ヒ ト動物は、 ジフテリア毒素が投与されるこ とにより糖尿病を発症することを特徴とする。 また、 ジフテリア毒素受容体を コードする遺伝子は霊長類由来のへパリン結合性 EGF遺伝子であり、 ヒトへ パリン結合性 EGF遺伝子であることが好ましい。 マウス、 ラット、 モルモッ ト、 ハムスター、 ィヌ、 ネコ、 ャギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ及ぴゥマからなる群 から選択されるいずれか一種であり、 マウスであることが好ましい。 また、 本 発明に用いられる動物は、 重度複合免疫不全動物であることが好ましい。
( 2 ) ジフテリァ毒素受容体をコードする遺伝子及び前記遺伝子の発現を調節 するインシュリンプロモーターを含む組換体 DNAを非ヒト動物に導入するこ とを特徴とする、 トランスジエニック非ヒト動物の作製方法。
( 3 ) 上記 ( 1 ) のトランスジエニック非ヒト動物又は上記 ( 2 ) の方法によ り作製されたトランスジヱニック非ヒト動物に、 ジフテリァ毒素を投与するこ とを特徴とする糖尿病発症動物の作製方法。
( 4 ) 上記 （1 ) のトランスジヱニック非ヒ ト動物又は上記 （2 ) の方法によ り作製されたトランスジエニック非ヒト動物にジフテリア毒素を投与して当該 トランスジヱニック非ヒト動物に糖尿病を発症させる方法。
( 5 ) 上記 （3 ) 記載の方法により作製された糖尿病発症動物。
( 6 )上記（3 ) の糖尿病発'症動物に、候補物質を投与することを特徴とする、 糖尿病治療薬のスクリ一二ング方法。
本発明のスクリーニング方法において、 例えば、 候補物質を接触させた糖尿 病モデル動物の血糖値を測定し、 当該測定された血糖値が候補物質を接触させ ない対照の糖尿病モデル動物の血糖値よりも低下したときは、 前記候補物質を 糖尿病治療薬として選択することができる。
また、 本発明のスクリーニング方法において、 候補物質を接触させた糖尿病 モデル動物のインシュリン濃度 （例えば血中インシュリン濃度） を測定し、 当 該測定された濃度が候補物質を接触させない対照の糖尿病モデル動物のインシ ュリン濃度よりも増加したときは、 前記候補物質を糖尿病治療薬として選択す ることも可能である。
( 7 ) 上記 ( 5 ) 記載の動物に他の動物由来の幹細胞を移植することを特徴と する、 当該他の動物由来の膝臓細胞を有するトランスジエニック非ヒト動物を 作出する方法。
移植に使用される幹細胞としては、 例えば造血幹細胞が挙げられる。 造血幹 細胞は、 骨髄由来細胞又は臍帯血由来細胞であることが好ましい。
( 8 ) 上記 （7 ) 記載の方法により作製された、 他の動物由来の脖臓細胞を有 するトランスジエニック非ヒト動物。
この非ヒト動物の膝臓細胞は、 移植された他の動物の造血幹細胞由来の細胞 を含む。造血幹細胞としては、骨髄細胞又は臍帯血細胞であることが好ましい。 図面の簡単な説明
図 1は、 TRECK法を用いて糖尿病を発症させる方法の模式図である。
図 2'は、 本発明のトランスジェニックマウスの作製用組換体 DNAの一部を 示す。
図 3は、 PCR法による導入遺伝子の検出を示す写真である。
図 4 Aは、 本発明のトランスジエニックマウスにジフテリア毒素の投与した 後の血糖値を測定した結果を示すグラフである。
図 4 Bは、 ジフテリァ毒素投与による血糖値の上昇を示すグラフである。 図 5 Aは、 ジフテリア毒素の投与により血糖値が上昇した本発明のトランス ジエニックマウスにィンシュリンを投与した後の血糖値を測定したグラフであ る。
図 5 Bは、 SCID-Ins-TRECK-Tgにおける血中ィンシュリン濃度を示すダラ フである。
図 5 Cは、 SCID-Ins-TRECK-Tgマウスの高血糖症が、 インシュリン依存性 であることを示すグラフである。
図 6は、 本発明のトランスジヱニックマウスの藤臓を組織学的に解析した写 真である。
図 7は、 膝臓組織の抗 hHB-EGF抗体による免疫組織染色の写真である。 図 8は、 SCID-Ins-TRECK-Tgマウス膝臓組織の免疫組織染色の写真である。 図 9は、 C57BL/6マウス骨髄細胞の移植によつて高血糖症が改善することを 示す図である。
図 1 0は、ヒト臍帯血由来細胞を移植した後の血糖値の推移を示す図である 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を実施するための最良の形態について説明する。 以下の実施の 形態は、 本発明を説明するための例示であり、 本発明をこの実施の形態にのみ 限定する趣旨ではない。 本発明は、 その要旨を逸脱しない限り、 さまざまな形 態で実施をすることができる。
なお、 本明細書において引用した文献、 及び公開公報、 特許公報その他の特 許文献は、 参照として本明細書に組み込むものとする。 また、 本明細書は、 本 願優先権主張の基礎と る日本国出願 2005-51692号に記載の明細書、 請求の 範囲及び/又は図面の内容を包含する。
本発明は、 ジフテリア毒素受容体をコードする遺伝子及び前記遺伝子の発現 を調節するィンシュリンプロモーターを含む組換体 DNAが導入された、 トラ ンスジエニック非ヒト動物、及ぴ糖尿病を発症する糖尿病モデル動物に関する。
1 . 組換え体 DNA
本発明は、 ジフテリァ毒素受容体をコードする遺伝子及び前記遺伝子の発現 を調節するィンシュリンプロモーターを含む組換え体 DNAが導入されたこと により糖尿病を発症するトランスジエニック動物が獲得されたことを特徴とす る。 以下に、 本発明の組換え体 DNAについて説明する。
( 1 ) ジフテリア毒素受容体をコードする遺伝子
本発明のジフテリァ毒素受容体の本体とは、霊長類由来のへパリン結合性 EGF (HB-EGF; heparin omding-epidermal growth factor)でめる。へノ リン結合 性 EGF遺伝子には膜結合型と蛋白質分解酵素により遊離型となったものが存 在するが、 本研究では膜結合型のものを利用する。 本発明に用いることのでき るへパリン結合性 EGF遺伝子の塩基配列は公知であり、その配列は GenBank 等の公共データベースを通じて容易に入手することができる。その例示として、 ヒトへパリン結合性 EGF遺伝子の塩基配列を配列番号 1 (NM_001945)に示す。 但し、 当業者であれば上記塩基配列の部分断片、 例えばコード領域 （配列番号 1に示す塩基配列の 262〜888番の領域） を選択して使用することが可能であ る。
また、 本発明のへパリン結合性 EGF遺ィ云子は、 配列番号 1に示される塩基 配列又はその部分配列のほか、 配列番号 1で示される塩基配列又はその部分配 列に相補的な配列に対してストリンジヱントな条件下でハイブリダイズし、 か つへパリン結合性 EGF活性を有する領域をコードする DNAを含む。
へパリン結合性 EGF活性とは、 上記のように膜結合型のジフテリァ毒素受 容体として機能する活性を意味しする。
このようなへパリン結合性 EGF遺伝子は、 配列番号 1で表される塩基配列 からなる DNA又はその断片をプローブとして、 コ口ニーハイブリダイゼーシ ヨン、 プラークハイブリダイゼ一ション、 サザンブロット等の公知のハイブリ ダイゼーション法により、 ヒトの cDNAライブラリー及ぴゲノムライブラリー から得ることができる。 これらの方法については、 「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))」 を参照することができる。
上記ハイブリダイゼーションにおいてストリンジェントな条件としては、 た とえば、 1 X SSC〜2 X SSC、 0.1%〜0.5%SDS及び 42°C〜68°Cの条件が挙げ られ、 より詳細には、 60〜68°Cで 30分以上プレハイブリダィゼーシヨンを行つ た後、プローブによるハイブリダィゼーシヨンを行い、 2 X SSC、 0.1%SDS中、 室温で 5〜15分の洗浄を 4〜6回行う条件が挙げられる。 また、 配列番号 1に示 す塩基配列又はその部分配列 （例えばコード領域の配列） と 50%以上、 60%以 上、 70%以上、 80%以上、 90%以上、 95%以上、 98%以上又は 99%以上の相 同性を有し、 かつジフテリア毒素受容体としてのへパリン結合性 EGF活性を有 するタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列も用いることができる。
( 2 ) インシュリンプロモーター
本発明で用いるィンシュリンプロモーターとは、 脖臓ランゲルハンス島 i3細 胞における特異的な発現を制御するために必要な DNAエレメントであり、 そ の遺伝子の塩基配列は公知であり、 その配列は GenBank等の公共データべ一 スを通じて容易に入手することができる。 例えば本発明に用いることのできる ィンシュリンプロモーターの例示として、 J. Exp. Med. (1998) 188(8):1445_1451 に記載されているヒ トインシュリンプロモーターの塩基配列 （1.9kb) を配列 番号 2に示す。
また、 本発明のインシュリンプロモーターは、 配列番号 2に示される塩基配 列のほか配列番号 2で示される塩基配列に相補的な配列に対してストリンジェ ントな条件下でハイブリダイズし、 かつィンシュリンプロモーター活性を有す る領域をコードする DNAを含む。 ィンシュリンプロモーター活性とは、 膝臓 において、 そのプロモーターの下流に連結された遺伝子の発現を促進しうる活 性をい'う。
このようなィンシュリンプロモーターは、 配列番号 2で表される塩基配列か らなる DNA又はその断片をプローブとして、 コ口ニーハイブリダイゼーショ ン、 ブラー,クハイブリダイゼーション、 サザンプロット等の公知のハイブリダ ィゼーシヨン法により、 ヒ の cDNAライブラリー及びゲノムライブラリーか ら得ることができる。 これらの方法については、 「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))」 を参照することができる。
上記ハイブリダィゼーシヨンにおいてストリンジェントな条件としては、 た とえば、 1 X SSC〜2 X SSC、 0.1%〜0.5%SDS及び 42°C〜68°Cの条件が挙げ られ、 より詳細には、 60〜68°Cで 30分以上プレハイブリダィゼーシヨンを行つ た後、プローブによるハイブリダィゼーションを行い、 2 X SSC, 0.1%SDS中、 室温で 5〜15分の洗浄を 4〜6回行う条件が挙げられる。 また、 配列番号 2に示 される塩基配列と 50%以上、 60%以上、 70%以上、 80%以上、 90%以上、 95% 以上、 98%以上又は 99%以上の相同性を有し、 かつ上記ィンシュリンプロモー タ一活性を有するヌクレオチドの塩基配列も用いることができる。
( 3 ) 遺伝子発現の調節 本発明の組換え体 DNAは、 細胞 ·組織特異的プロモーターであるィンシュ リンプロモーターを霊長類に特異的なジフテリア毒素受容体であるへパリン結 合性 EGF遺伝子に結合させたものである。 このィンシュリンプロモーターに よりへパリン結合性 EGF遺伝子が細胞の表面上に特異的に発現する。 そのよ うな組換え体 DNAが導入された個体にジフテリア毒素 （DT) を投与すると任 意の時期にィンシュリンプロモーターを発現する細胞を特異的に破壊すること が可能になる。 以下に、 インシュリンプロモーターをへパリン結合性 EGF遺 伝子に結合させた発現カセットを含むクローニングベクターの作製方法を示す。 本発明のジフテリァ毒素受容体をコードする遺伝子であるへパリン結合性 EGF遺伝子及びィンシユリンプロモーターは通常の化学合成法または生化学的 合成法を用いて製造することができる。 例えば、 遺伝子工学的手法として一般 的に用いられている DNA合成装置を用いた核酸合成法を使用することができ る。 また、 錶型となる塩基配列を単離又は合成した後に、 PCR法又はクロー二 ングベクターを用いた遺伝子増幅法を用いることができる。必要に応じて、 TA クローニング等の公知の方法を用いて配列を確認してもよい。 上記方法は、 Moleculer cloning 2nd ed. Cold Spring narbor Laboratory Press (1989)等に 従い、 当業者ならば容易に行うことができる。 なお、 得られた PCR産物は、 GENE CLEAN (フナコシ） 、 QIAGEN (QIAGEN社） 等を用いて精製する ことができる。 必要に応じて、 シークェンサ一等を用いて期待された遺伝子の 塩基配列を確認することができる。
その後、 上記のようにして得られた各々の遺伝子を所定の順序となるように 連結させる。 まず、 上記各々の遺伝子をを公知め制限酵素等で切断する。 この ように切出したへパリン結合性 EGF遺伝子の DNA断片を公知のベクターに公 知の方法に従って挿入する。 そして、 プロモーターの DNAを、 制限酵素等を 用いて切断し、 これを先ほど挿入した遺伝子の上流に、 上記プロモーターが作 動可能な部位に揷入する。 DNAの結合には、 DNAリガーゼを用いることがで きる。 ベクターとしては pCR4、 pCR2.1、 pBluescript 、 pBR322、 pBR325、 pUC12、 pUCl3等の大腸菌由来のプラスミ ド、 pUB110、 pTP5、 pC194等の 枯草菌由来のプラスミド、 pSH19、 pSH15 等の酵母由来プラスミド、 λファ ージなどのバタテリオファージ、 レトロウイルス、 ワクシニアウィルス、 バキ ュロウィルス等の動物ウイルスなどが挙げられ、これらのベクターの他、 p A1 - 11、 pXTl、 pRc/CMV、 pRc/RSV, pcDNAI/Neoなどを用いることができる。 本発 明においては、 pBluescriptや pAT153などが好ましい。
( 4 )- TRECK法
TRECK(toxin receptor-mediated cell knockout)法は、 ジフテリァ毒素受容 体遺伝子を標的細胞群に特異的に発現させたトランスジエニック動物を作製し、 ジフテリァ毒素を投与することにより任意の時期かつ定量的に障害を与えるこ とができるという、 個体内での細胞系列の役割を明らかにするための新しい独 創的な手法である。 以下に TRECK法の原理を説明する。
ヒ ドゃサルのような霊長類とマウスゃラットなどのげつ歯類動物とでは、 HB-EGFを構成するアミノ酸配列が微妙に異なっており、ジフテリア毒素が受 容体依存的なエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれる際のジフテリア 毒素に対する結合親和性も異なる。 例えば、 マウスの細胞は、 ジフテリア毒素 に耐性を示すが、 それは、 ウスの HB-EGF はジフテリア毒素との親和性が ヒ トなどの受容体に比べ著しく低いために、 ジフテリア毒素受容体としての機 能が非常に微弱となり、 ジフテリア毒素が上記受容体に結合できず、 細胞内に 入れないためである。 しかし、 マウス細胞にジフテリア毒素受容体であるヒ ト 由来の HB-EGF (hHB-EGF) を発現させると、 マウス細胞も導入されたヒト 由来の HB-EGF により、 ジフテリア毒素がヒトと全く同様に細胞内に取り込 まれるため、 マウスの細胞もジフテリア毒素感受性にさせることができる。 こ の性質を利用して、標的となる細胞群に hHB-EGFを発現させたマウスを作製 し、 その細胞に障害を与えたい時期にジフテリア毒素を投与すると、 標的とす る細胞だけを除去したり、 一過性的な障害を与えたりすることができる。
具体的には、 ジフテリア毒素は、 分子量 58,000 のタンパク質でフラグメン ト Aとフラグメント Bからなるが、いったん細胞内に取り込まれると、 フラグ メント Aが標的分子であるべプチド鎖伸長因子 2(EF-2)を ADP リボシル化し 不活化するため、 結果としてタンパク質合成が阻害され細胞が死ぬ。 マウスの 細胞がジフテリァ毒素に耐性を示すのは、 マウスの HB-EGFがジフテリア毒 素受容体としての機能をもたず、 ジフテリア毒素が細胞内に入れないためであ る。 そこで、 マウス細胞にジフテリア毒素受容体であるヒト由来の HB-EGF (hHB-EGF)を発現させると、マウスもジフテリァ毒素感受性になる。 TRECK 法は、 この性質を利用したもので、 標的となる細胞群に hHB-EGFを発現させ たマウスを作製し、 その細胞に障害を与えたい時期にジフテリア毒素を投与す ると、 標的とする細胞だけを除去したり、 一過性的な障害を与えたりすること ができる。
TRECK法の具体的な実験手順は以下のとおりである、 すなわち、 標的にす る細胞群のみに特異的に発現する遺伝子のプロモーター領域を有するプラスミ ドを作製する。 プラスミドには、 必要に応じてェンハンサー領域を含めてもよ い。 このとき、 作製したプラスミドを CsCl平衡密度勾配遠心法等で調製し、 導入遺伝子部分を制限酵素で切り出し、 ァガロースゲル電気泳動によって分離 し、 精製する。 この導入遺伝子をトヲンスジエニック動物の作製に供する。 作製したトランスジエニック動物に対するジフテリア毒素の投与方法は、 静- 脈内、 腹腔内、 皮下、 筋肉內のいずれも可能である。 投与量は、 用いる動物に よって異なるが、 例えば、 マウスの場合は、 ジフテリア毒素を 50 g/kg投与 しても異常は認められないため、 通常は、 50 g/kgの 1/1000〜： 1/10にあたる 50η /]¾〜5 ^/]¾程度である。 また、投与時期は、導入遺伝子を破壊させたい 時期にあわせて投与することができる。
本発明の TRECK法を用レ、て標的組織又は細胞を破壌する場合の模式図を図 1に示す。 図 1において、 糖尿病を発症させるには、 組織/細胞特異的プロモー ター/ェンハンサとしてィンシュリンプロモーターを使用すればよい。 ( 5 ) 糖尿病
糖尿病とは、 インシユリン作用の不足、 つまりインシユリンの供給不足と、 ィンシュリン標的臓器での感受性の低下が原因となり、 血液中のプドウ糖が増 えすぎて （高血糖） 尿の中に糖が溢れてきた状態 （糖尿） をいう。 糖尿病は、 (i)小児期に、脖臓 細胞がなんらかの原因で破壌された結果、ィンシュリンを 分泌できなくなり、 高血糖として比較的急激に発症する I型糖尿病、 （ii) ィン シュリンの分泌量が低下しているか、 インシュリンの血糖を下げる作用が弱く なって発症するもので、 遺伝素因の他に、 食生活、 運動不足、 ス トレス等の要 因が大きく関わっているィンシュリン非依存型である II型糖尿病、 （iii)妊娠 をきっかけに発症する妊娠糖尿病などに分類されている。 本発明のトランスジ ヱニック非ヒト動物が発症するのは I型糖尿病である。
2 . トランスジエニック非ヒ ト動物
本発明のトランスジエニック非ヒト動物は、 ジフテリア毒素を投与すること により、 糖尿病を発症することを特徴とする。 以下に本発明のトランスジェ- ック非ヒト動物の製法及びその表現形質について説明する。
( 1 ) トランスジエニック非ヒト動物の作製方法
本発明のトランスジエニック非ヒト動物は、 遺伝子組換え技術を用いて上記 組換体 DNAを非ヒト動物のゲノムに導入することによって得ることができる。 本発明に用いられる動物の植類は、 特に限定されるものではない。 たとえば、 マウス、 ラッ ト、 モノレモット、 ノヽムスター、 ィヌ、 ネコ、 プタ、 ヒッジ、 ャギ、 ゥシ及びゥマなどの実験動物又は家畜が挙げられる。
本発明では取り扱いが容易で繁殖しやすい点でマウスが好ましい。 以下、 マ ウスを例に説明する。
トランスジエニック非ヒト動物の作製は、 例えばマウスを用いた標準的な方 法、 すなわち初期受精卵を用いたマイクロインジヱクシヨン法、 又は ES細胞 による導入法で行うことができる。 マイクロインジェクション法では、 トラン スジエニック動物作製のためのマイクロインジェクションに用いる導入遺伝子、 例えば本発明における図 2に示すごとく作製された発現カセットを含むクロー ユングベクターを作製し、 次いで制限酵素切断等により、 該発現べクタ一から 発現カセットを切り出し、 精製した DNA断片を受精したマウス卵細胞の前核 中に例えば、 標準的手法 (Hogan, B.ら, (1994) Manipulating the Mouse Embryo 2nd ean., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Coia Spring Harbor, New York) に従って注入する。 ，
トランスジエニックマウスの同定のために、 耳穿孔片 (ear-punched pieces) もしくは尾組織からゲノム DNAを調製する。 すなわち、 穿孔片もしくは尾組 織片を PCR緩衝液/非イオン性界面活性剤及ぴプロティナーゼ K (50 mM KC1、 10 mM Tris-HCl, (pH8)、 1.5 mM MgCl2、 0.1% ゼラチン、 0.45% NP-40、 0.45% Tween-20,及ぴ 100 /z g/nilプロティナーゼ K) 中に入れ、 55°Cでー晚 インキュベートする。 インキュベート後、 プロティンキナーゼ Kを失活させる ために、 95°Cで 15分間ィンキュベートし、得られた溶液を DNA試料とする。 導入遺伝子の確認のために、 例えば本発明における導入した遺伝子組換え体の 一部を増幅するためのプライマー （例えば下記塩基配列のもの） を使用し、 導 入した遺伝子組換え体を鎳型として PCR反応によつて増幅する。
5'- CAACTACATCCTGGTCATCATC -3' (配列番号 4) 及ぴ
5'- CAGACAGATGACAGCACCACAG -3' (配列番号 5)
PCRの反応組成は TaKaRa Εχ-Taqポリメラーゼ （タカラバイォ社） および 付随の反応液を使用し、 PCR反応は 96°Cで 2分の後、 96°Cで 30秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 1分のセッ卜を 35サイクル、 続き 72°Cで 7分行うことにより 目的とする DNA断片を増幅することが可能である。
ES細胞による導入法では、得られた組換体 DNAを ES細胞に導入する。 ES 細胞は胚盤胞期の受精卵の内部細胞塊に由来し、 vitroで未分化状態を保つ たまま培養維持できる細胞である。 ES 細胞としては、 既に樹立された細胞株 及び新しく樹立した細胞株の！/、ずれをも使用することができる。例えば TT2細 胞株、 AB-1細胞株、 J1細胞株、 R1細胞株等を使用することができる。 これら のどの ES細胞株を用いるかは、 実験の目的又は方法により適宜選択すること ができる。 ES細胞への遺伝子導入は、 リン酸カルシウム共沈殿法、 エレクト 口ポレーシヨン法、 リポフエクシヨン法、 レトロウイルス感染法、 凝集法、 マ イク口インジェクション法、 パーティクルガン法などの方法を採用することが できるが、 簡便に多数の細胞を処理できる点でエレクトロポレーシヨン法が好 ましい。
組換体 DNAを ES細胞中に導入した場合、 ES細胞のゲノム中の、 組換体 DNAと相同な部分の特定遺伝子と、組換体 DNAとの間で相同的組換えが起こ ることによって、 組換体 DNAの遺伝子が ES細胞に導入される。
導入遺伝子が組み込まれた ES細胞は、 単一細胞をフィーダー細胞上で培養 して得られるコロニーから分離抽出した染色体 DNAをサザンハイブリダィゼ ーション又は PCR法によりスクリーニングすることによって検定することが できる。 · あるいは、 薬剤耐性遺伝子又はレポーター遺伝子を含むベクターを用 いることによってセレクションを行ってもよレ、。 薬剤耐性遺伝子としては、 例 えばネオマイシンホスホトランスフェラーゼ Il(nptll)遺伝子、 ハイグロマイシ ンホスホトランスフェラーゼ (hpt)遺伝子などが挙げられ、 レポーター遺伝子と しては、 例えば /3—ガラク トシダーゼ (lacZ)遺伝子、 クロラムフエ-コールァ セチルトランスフェラーゼ (cat)遺伝子などが挙げられる。
導入遺伝子の組込みが確認された ES細胞を同種のマウス由来の胚内に戻す ことにより、 宿主胚の細胞塊に組み込まれてキメラ胚が形成される。 これを仮 親に移植して発生及び生育させることにより、 キメラトランスジェニックマウ スが得られる。 そして、 仮親から生まれた子 （マウスの場合は約 17 日で子が 生まれる) のうちキメラマ スを選ぶ。 キメラの寄与率が高い動物は、 生殖系 列の可能性が高いが、 キメラマウスを正常な動物と交配することにより、 生殖 系列のキメラマウスであることの確認が可能である。 その後、 正常な雌と交配 し、 F1を得て変異動物系統を樹立する。
上記のようにして得られるキメラトランスジエニックマウスは、 相同染色体 の一方にのみ導入遺伝子を有するヘテロ接合体として得られる。 相同染色体の 両方に組換体 DNAを有するホモ接合体を得る めには、 動物のうち相同染 色体の一方にのみ導入 DNAを有するヘテロ接合体の兄妹同士を交雑すればよ い。 組換体 DNAの導入は、 PCRにより確認することができる。
このトランスジエニックマウスを自然交配あるいは体外受精により継代する ことにより、 本発明のトランスジエニックマウスが作製される。 本発明のトラ ンスジェエック動物 （例えばトランスジエニックマウス） は、 上記の通り継代 (自然交配又は対外受精） により遺伝子型を子孫に引き継ぐことができる。 従 つて、 本発明のトランスジエニック動物には、 その子孫も含まれる。 ( 2 ) 重度複合免疫不全 （SCID； Severe Combined ImmunoDeficiency) 動 物
重度複合免疫不全 （以下、 SCID という場合もある) 動物とは、 遺伝子組換 えによる再構成の段階で断片化した DNAの結合を行う DNA依存性蛋白質リ ン酸化酵素のサブュニット P350の変異により得られ、 常染色体劣性の遺伝様 式をとる、 自然発症の突然変異体動物をいう。この動物は、最初に、 Dr. Melvin Bosmaらによって 1980年に C.B-17系統マウスで発見された。 このマウスは T細胞及ぴ B細胞がないことから、 重度の免疫不全を呈し、 その異種細胞、 組 織の移植に対する拒絶が少ないため、 ヒトの正常造血細胞ですら移植可能であ る。 従って、 SCID動物は、 各種疾患モデル動物として有用であるほか、 免疫 不全で ることを利用した感染防御に関する研究、 移植ヒト細胞、 腫瘍を用い た研究にも応用可能である。 このような動物としては、 例えば、 マウス、 ラッ ト、 ィヌなどが挙げられる。 SCID動物では現在のところマウスのみが巿販さ れ、 それら SCIDマウスは動物業者の日本クレアから購入することができる。 このように SCID動物は、 免疫不全であるため、 ヒ ト臓器などを移植するこ とができる。
従来、 （i) SCIDマウスを用いて、 ストレプトゾシン （streptozocin) 投与に より、 糖尿病を発症することができるという Gerling らの報告 （Diabetes, 43：433-440, 1994)、及ぴ、（ii) SCIDマウスにヒト、あるいは他の動物の滕臓、 骨髄その他を移植し、 勝臓 細胞の幹細胞、 または前駆細胞を検索 ·同定する といった報告（例えば、 Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 100:7253-7258. 2003) 等が知られている。 '
そこで本発明者は、 SCIDマウスに糖尿病を発症させ、 そこにヒトをはじめ とする様々な動物種からの膝臓 ]3細胞の幹細胞、 または前駆細胞を移植するこ とを試みた。 そして、 TRECK法を上記移植方法に適用すれば、 より再現性の 高い、 技術的にも容易な系が確立できると考えた。
従って、 上記 SCID動物を用いて図 2に示すような組換え体 DNAを動物の ゲノムに導入することにより糖尿病を発症させることができれば、 この動物に ヒトをはじめとする様々な動物種からの膝臓 j3細胞の幹細胞、 または前駆細胞 を移植することができるため、 糖尿病発症モデル動物等として好ましい。
( 3 ) 糖尿病モデル動物
本発明のトランスジエニック非ヒト動物にジフテリァ毒素を投与することに より、 当該動物は、 糖尿病を発症する。 具体的には、 本発明のトランスジェ- ック非ヒト動物に投与するジフテリア毒素は、 ジフテリア菌 （C. diphtheriae PW8) の培養上堉ろ液から、 限外ろ過により濃縮したものを、 硫安沈殿させ、 さらに DEAE-セファロースカラムクロマトグラフィーにより精製したのち、 適当に希釈したものを使用する。 ジフテリァ毒素は Sigma Aldrich(#D0564) からも入手しうる。
通常、 マウスはジフテリア毒素を 50 g/kg投与しても全く異常は認められ ないので、この量までジフテリアを使用することができる力 通常はその 1/1000 〜1/10量である 50ng/kg〜5 i g/kg程度投与するのがよい。 ジフテリア毒素の 投与方法は、 静脈内、 腹腔内、 皮下、 筋肉内のどれでも可能である。
糖尿病の発症は、 マウス尾静脈を注射針で穿刺して得られる血液を、 血糖測 定機器デキスター ΖΠ (バイエル社）を用いて血糖値（血液中のグルコース濃度） を測定することで容易に判定できる。 血糖値測定用機器は、 その他ヒ ト糖尿病 患者用に広く市販されているものを用いても差し支えない。 尿中の糖は、 プレ テスト （和光純薬社）ゃゥリエース （テルモ社）などを用いて検出可能である。 本発明のトランスジエニック非ヒト動物に糖尿病を発症させるには、 たとえ ば、 本発明のトランスジエニックマウス対して、 ジフテリア毒素 50ng/kg〜50 / g/kgを腹腔内に投与すればよい。 具体的には、 本発明のトランスジヱニック マウス対して、 ジフテリア毒素
Figure imgf000016_0001
1¾を腹腔内に投与後 2日以内 に血糖値が 200mg/dl以上に上昇し、 尿中に糖およびケトン体が検出されるな ど、 糖尿病に特有な所見を呈する。 糖尿病を発症した当該マウスは、 多飲，多 尿 ·体重減少など、 ヒ トの糖尿病患者の多くに見られる現象も認められる。 従 つて、 糖尿病を発症したマウスは糖尿病モデルマウスとして利用することがで さる。 3 . 糖尿病治療薬のスクリーニング方法
本発明は、 ジフテリア毒素を投与されたことにより糖尿病を発症したトラン スジ ニック動物に、 糖尿病治療のための薬物の候補物質 （被験物質） を接触 (例えば投与） することにより、 糖尿病治療薬をスクリーニングすることがで きる。 例えば、 ジフテリア毒素を投与されたことにより糖尿病を発症した本発 明のトランスジエニック非ヒト動物またはその一部に薬物候補物質を接触させ、 前記候補物質を接触させた非ヒト動物又はその一部において標的とする疾患と 相関関係を有する物質の指標値 （例えば血糖値、 あるいは血中又は他組織のィ ンシュリン濃度） を測定し、 対照と比較し、 この比較結果に基づいて、 糖尿病 の症状を軽減または消滅させるか否かを確認することで、 候補物質をスクリー ニングすることができる。 具体的には、 候補物質を接触させた非ヒト動物の血 糖値を測定し、 当該測定された血糖値が候補物質を接触しない対照動物におけ る血糖値よりも低下したときは、 前記候補物質を、 糖尿病治療薬.として選択す ることができる。
また、 候補物質を接触させた非ヒト動物のインシュリン濃度を測定し、 当該 測定された濃度が候補物質'を接触しない対照動物におけるィンシュリン濃度よ りも増加したときは、 前記候補物質を糖尿病治療薬として選択することができ る。 インシュリンを測定するための組織は特に限定されるものではないが、 血 中インシュリンが好ましい。
「トランスジエニック非ヒト動物又はその一部」 とは、 動物の生体の全身、 及び限定された組織又は器官の両者を含む。限定された組織又は器官の場合は、 動物から摘出されたものも含む。 本発明では、 膝臓が好ましい。
候補物質としては、 例えば、 ぺプチド、 タンパク、 非ぺプチド性化合物、 合 成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、細胞培養上清、植物抽出液、哺乳動物 （例 えば、 マウス、 ラット、 ブタ、 ゥシ、 ヒッジ、 サル、 ヒトなど） の組織抽出液、 血漿などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の 化合物であってもよい。 これら候補物質は塩を形成していてもよく、 候補物質 の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例えば、 有機酸又は無機酸など） や 塩基 （例えば、 金属酸など） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容 される酸付加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸 (例えば、 酢 酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン 酸、 リンゴ酸、蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） との塩などが用いられる。
試験動物を候補物質で接触させる方法としては、 例えば、 経口投与、 静脈注 射、 塗布、 皮下投与、 皮内投与、 腹腔投与などが用いられ、 試験動物の症状、 候補物質の性質などにあわせて適宜選択することができる。 また、 候補物質の 投与量は、 投与方法、 候補物質の性質などにあわせて適宜選択することができ る。
例えば、 ある候補物質を投与した場合に、 糖尿病の症状が緩和もしくは消失 したことが確認できる結果が得られれば、 用いた候補物質を、 糖尿病治療薬と して選択することが可能である。 . 4 . 細胞移植
本発明は、 上記糖尿病モデル動物に、 他の動物由来の細胞を移植することを 特徴とする、他の動物由来の膝臓細胞を有する動物を作出する方法を提供する。 「他の動物」 とは、糖尿病モデル動物の作製に使用された動物とは異種の動物、 及び同種で異系の動物のいずれをも意味する。 「異種の動物」 は、 例えばヒト のほか、 マウス、 サル、 ヒ ト、 ゥシ、 ブタ、 ヒッジ、 ャギ、 ゥサギ、 ィヌ、 ネ コ、 モルモット、 ハムスター、 ラット、 ゥマなどが挙げられるが、 これらに限 定されるものではない。 「同種で異系の動物」 は、 同じ動物種ではあるが異な る系統の動物を意味し、 例えば、 モデル動物の作製に使用したマウスが C3Hで あれば、 移植に使用されるマウスとして C57BL/6などが挙げられる。
移植に使用される細胞は、 瞎臓細胞 （α細胞、 細胞を含む） 、 幹細胞など の未分化細胞であるが、造血幹細胞 （特に骨髄細胞、臍帯血細胞） が好ましい。 幹細胞を移植することにより、 レシピエントの破壌された勝臓細胞又は組織に おいてドナー由来の細胞が再生され、 生着して、 レシピエントは正常な膝臓機 能を有するようになる。 本発明は、 このようにして作製されたトランスジェニ ック非ヒト動物も提供する。
ここで、 未分化細胞としては、 マウス （Nature 292:154-156， 1981) 、 ラッ ト （Dev. Biol. 163(1): 288.292, 1994) 、 サル （Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92(17)：7844-7848, 1995) 、 ゥサギ （Mol. Reprod. Dev. 45(4) :439-443, 1996) については ES細胞等が確立している。 また、 プタについては EG(embryonic germ)細胞が確立している （Biol. Reprod 57(5) :1089· 1095, 1997) がこれらに 限定されない。 なお、 未分化状態を維持しているか否かは、 例えば、 哺乳動物 (例えばマウス又はゥシ） で確立されている、 公知の各種マーカーにより確認 することができる。
造血幹細胞は、 骨髄由来細胞や、 臍帯血由来細胞のほか、 末梢血造血幹細胞 などが含まれる。 本発明で用いる造血幹細胞は、 骨髄、 臍帯血又は末梢血から 採取し、 純化することが可能であり、 細胞表面に存在する様々な表面抗原を用 いる方法が知られている。 代表的な方法として Osawa らの方法 （Osawa M, Nakamura K, Nishi N, Takahasi N, Tokuomoto Y,丄 noue H, Nakauchi H. in vivo self-renewal of c-Kit+ Sca-1+ Lin(low/-) hemopoietic stem cells. J
Immunol. 156:3207-3214, i996) が知られている。 この方法では骨髄、 臍帯血 又は末梢血から有核細胞を分離し、 これに表面抗原に対する抗体を作用させ、 細胞分離器で分離する。 ここで得られた細胞はそのまま培養可能である。なお、 本発明で用いる造血幹細胞は未分化のものでもよレ、。
移植する細胞数は限定されるものではないが、 レシピエント動物がマウスの 場合、 ドナー細胞の個数は、例えば 104〜109個、好ましくは 106〜： L08個である。 また、 上記細胞を動物に移植する方法はよく知られており、 当業者は公知の 方法に従って行うことができる。 例えば、 骨髄細脍を培養して静脈内へ投与す る方法を採用することができる。
移植後は、 移植細胞又は本発明のトランスジヱニック動物を観察して、 移植 した幹細胞が目的の細胞へ分化したかどう力 \ 幹細胞が移植した組織等へ定着 したどう力 \ 幹細胞が癌化していないかどう力、 移植によりクローン動物の健 康状態が損なわれていないかどうか、 発症させた糖尿病に対し移植細胞が治療 効果を発揮したかどう力 移植細胞が体内のどの部分へ移動した力、 等の項目 を評価する。 例えば、 本発明のトランスジヱニック動物の肉眼による観察、 移 植細胞やその周辺組織の顕微鏡による観察、 マーカー （例えば、 糖尿病病態マ 一力一遺伝子、 特定細胞への分化の指標となる遺伝子の発現の検出などを行う ことにより評価する。 また、 上記方法により作出された動物の移植組織がレシ ピエント由来でなく、 'ドナー由来の組織であることは、 血液中にドナー動物種 のィンシュリンを検出することで確認できる。 例えば、 マススぺク トル解析を 行い、 ドナー動物種のィンシュリンの分子量と一致する分子の存在を確認すれ ばよい。 ドナー動物種のィンシュリンの分子量は National Center for Biotechnology Information (NCBI)や SwissPlot等の公共のデータベースを通 じて遺伝子の塩基配列ゃァミノ酸配列を入手することにより容易に得られる。 あるいはレシピエントから DNAを抽出し、 ドナー動物種特異的なプライマー を用いて PCRを行うことによつても確認できる。 また、 ドナー動物種由来の タンパク質を特異的に認識する抗体 （例えば、 抗サイトケラチン 18抗体、 抗 Ma£A抗体、 抗 Pdxl抗体など） を用いて、 組織切片の免疫染色を行うことに よっても確認できる。 マウスおょぴラット由来の細胞を移植した場合には、 上 記動物に DTを投与するこ'とにより容易に確認できる。 具体的には、 上記動物 に DTを投与すると血糖値が低下するか、 又は血糖値の上昇が認められないこ とが確認できればよい。
本発明において、 DTを投与して膝臓 細胞を傷害した本発明の上記マウス (SCID-Ins-TRECK-Tgマウス） に、 異種動物由来の細胞として、 例えば、 ヒ ト膝臓 i3細胞を移植すると、 マウスの生体内にヒト膝臓 細胞が生着する。 こ のようにして、 ヒト由来の脾臓 細胞を有するモデル動物 （例えば、 SCID-Hu (ヒト） マウスモデルなど) を作出することが可^となる。
上記のように膝臓細胞又は幹細胞を移植したモデル動物を用いて、 ドナー由 来の細胞が膝臓細胞の機能を有するに至る分化過程を解析することができ、 こ れにより、 瞎臓細胞や幹細胞の探索 ·同定に利用することもできる。 以下、 実施例により本発明をさらに具体的に説明する。 ただし、 本発明は、 これら実施例に限定されるものではない。 〔実施例 1〕 発現カセットを含むクローニングベクターの構築
糖尿病モデル SCIDマウスの作製のために構築した遺伝子組み換え体は、 ヒ トインシュリンプロモータ ゥサギ j3 -グロビンィントロンーヒ ト HB EGF cDNA—ゥサギ ]3 -グロビンポリ（A+)シグナルの順に配列される。 プラスミ ド pRcHBEGF ( EMBO J. (1994) 13:2322-2330 ) を材料に site directed mutagenesis により、 合成される HB-EGFタンパク質の 148番目のロイシン をセリンに、 149 番目のプロリンをスレオニンに置換する変異を入れ、 ヒ ト HB-EGF(L148S/P149T) cDNA (配列番号 3) を得た。これをプラスミ ド plns'l (J. Exp. Med. (1998) 188:1445-1451) のヒ トインシュリ ンプロモーター (1.9kb) の下流に揷入し、 プラスミ ド pIns-TR2を構築した （図 2 ) 。
〔実施例 2〕 トランスジエニックマウスの作製
トランスジエニック動物作製のために用いる DNA断片を、 実施例 1に記載 したプラスミ ド pIns-TR2の Sphl及び Xholによる二重切断によって取得し、 クローニングベクターからァガロースゲル電気泳動によって分離し、 次いでこ れを QIAEX II (QIAGEN, CA) によって精製した。 精製した DNA断片を受 精したマウス （C.B- 17/Icr-scid/scid) 卵細胞の前核中に標準的手法 （Hogan, B. り,、丄994) Manipulating the Mouse Embryo 2nd edn., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold. Spring Harbor, New York) に従って注入した。 トフ ンスジエニックマウスの同定のために、 耳穿孔片 （ear-punched pieces) 力、ら ゲノム DNAを調製した。すなわち、穿孔片を PCR緩衝液/非イオン性界面活 性剤及ぴプロティナーゼ K (50 mM KCl、 10 mM Tris-HCl, (pH8)、 1.5 mM MgCl2、 0.1% ゼラチン、 0.45% NP-40、 0.45% Tween-20、及び 100 μ g/ml プ ロティナーゼ K) 中に入れ、 55°Cでー晚インキュベートした。 インキュベート 後、 プロテインキナーゼ Kを失活させるために、 95°Cで 15分間インキュベー トし、 得られた溶液を DNA試料とした。 導入遺伝子の確認のためには以下の 塩基配列を有するプライマーを使用し、導入遺伝子組み換え体を铸型として PCR 反応によって増幅した。 フォワード： 5'-CAACTACATCCTGGTCATCATC-3' (配列番号 4) リバース ： 5'-CAGACAGATGACAGCACCACAG-3' (配列番号 5)
PCRの反応組成は TaKaRa Εχ-Ta ポリメラーゼ （タカラバイォ社） およぴ 付随の反応液を使用し、 PCR反応は 96°Cで 2分の後、 96°Cで 30秒、 55°Cで 30秒、 .72°Cで 1分のセットを 35サイクル、 続き 72°Cで Ί分行うことにより 目的とする DNA断片 （0.7kb) を増幅した。 PCR反応後、 ァガロースゲル電 気泳動を行い、 導入遺伝子の有無を判定した。
判定結果を図 3に示す （レーン 1 ： DNAサイズマーカー （ λ DNA Hindlll 消化物 + (i> X174 HaeIII消化物混合液） 、 レーン 2 ： C.B-17/Icrscid/scidゲノ ム DNA、 レーン 3 ：導入遺伝子と C.B-17/Icr-scid/scidゲノム DNA、 レーン 4〜6 '：サンプル DNA) 。 4番および 5番のマウスゲノムに当該遺伝子が導 入されたことを示す。 〔実施例 3〕 ジフテリア毒素の投与
(1) 血糖値 （血中ダルコー 濃度） の測定
作製したトランスジエニックマウス （SCID-Ins'TRECK-Tgマウス） に各種 濃度のジフテリア毒素 （PBSに溶解） を腹腔内投与した、 血糖値の変化を、 デ キスター ZII (バイエル社） を用いて測定した。 結果を図 4Aに示す。 トランス ジエニックマウスでは、 50ng/kg〜20 μ g/kgのジフテリア毒素の投与によって、 いずれの場合にも投与後 2日後には血糖値が 200mg/dl以上に上昇し、 4日目 以降は 400mg/dl以上の高値が 50日以上持続した。同腹の非トランスジェニッ クマウスでは毒素投与による血糖値の変化は認められなかつた。
また、 上記と同様にして、 さらにジフテリア毒素の接種量を少ない範囲に設 定して （51¾/1¾〜50 /1¾) 腹腔内投与した。
その結果、 1回の DT投与によって、 2ヶ月以上高血糖状態が持続した。 こ れにより、高血糖を引き起こすために必要な最低 DT量は 50 ng/kgであること が示された （図 4 B) 。 (2) インシュリン投与による血糖値の降下
ジフテリア毒素投与によるトランスジエニックマウスの血糖値の上昇がイン シュリンに依存的なものか否かを調べるため、 l i g/kg のジフテリア毒素投与 により血糖値の上昇したマウスに超速攻型インシュリン（ノボラピッド 注；ノ ボ ノルディスク ファーマ社） の投与を行った。 糖尿病を発症したトランスジ エニックマウス （血糖値 500mg/dl以上） は、 100mUのィンシュリンの投与に よって速やかに正常値まで降下した （図 5 A) 。
さらに、 SCID-Ins-TRECK-Tgマウスと非 Tgマウスの血中インスリン濃度 を比較した。 DT非投与時には差は認められなかった。 し力 し、 DTを投与する と、 投与後 5 日目で、 非 Tgマウスでは変化しないが、 SCID-Ins-TRECK-Tg マウスでは顕著に減少した。 これらのマウスにブドウ糖を 2 g/k 経口投与して 10分後の血中ィンスリン濃度を測定すると、 非 Tgマウスでは速やかに上昇す るが、 SCID-Ins-TRECK-Tgマウスでは、 インスリンの分泌ができず、 血中ィ ンスリン濃度に変化は見られなかった （図 5 B) 。
次に、 SCID-Ins-TRECK-Tgマウスに DTを 1 g/kg投与して 7 日目の高 血糖誘導マウスに、超即効 '[4ィンスリン（ノボラピッド注）を腹腔内投与した。 血糖値が 500 mg/dlの個体では、 100 mUの投与で血糖値の正常化が認められ た。 高血糖症がより重篤な個体 （血糖値〉 600 mg/dl) では、 100 mUインスリ ン投与では血糖値が認められなかったが、 1 Uの投与で正常血糖値まで低下し た。 従って、 SCID-Ins-TRECK-Tgマウスの高血糖症はインスリン依存性であ ることが示された （図 5 C) 。
(3) トランスジエニックマウス藤臓の組織学的解桁
ジフテリア毒素投与前おょぴジフテリア毒素 5 μ g/kg投与後 7日目のマウス を頸椎脱臼により安楽死させ、膝臓を摘出、 10% 中性緩衝ホルマリン液にて一 晚固定後、定法に従いパラフィンで包埋し、 ミクロトームを用いて 5 μ πι厚の切 片を作製した。 1次抗体として Guinea Pig Anti-Swine Insulin (DAKO社） お よび Rabbit Anti-Human Glucagon (DAKO社）を、 2次抗体として Alexa Fluor 488 goat anti-guinea pig IgG (H+L)および Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) を用いて二重染色し、 レーザースキャン共焦点顕微鏡で観察した。 毒素投与前のトランスジエニックマウスの脾臓ランゲルハンス島においては正 常マウスと同様に約 70%が抗ィンシュリン抗体で染色される β細胞であつたが、 毒素投与後はィンシュリン陽性細胞が著明に減少し、 抗グルカゴン抗体で染色 される α細胞の数が増加していた （図 6パネル Α) 。
ジフテリア毒素投与前おょぴジフテリア毒素 40 /z g/kg投与後 7日目のマウ スを頸椎脱臼により安楽死させ、膝臓を摘出、 10% 中性緩衝ホルマリン液にて ー晚固定後、 定法に従いパラフィンで包埋し、 ミクロトームを用いて 5 /z m厚 の切片を作製した。 その後、 HE染色を行い、 顕微鏡で観察した。 その結果、 DT非投与の Tgマウスのランゲルハンス島は正常であつたが、 DTを投与した Tgマウスでは、ランゲルハンス島内の細胞が損傷されていた（図 6パネル B )。 次に、 糖尿病モデルマウス (SCID-Ins-TRECK-Tgマウス) と同腹 SCIDマウ スの膝臓切片を抗 hHB-EGF抗体を用いて免疫染色した。 その結果、
SCID-Ins-TRECK-Tgマウスのランゲルハンス島にのみ、 hHB-EGF抗体で染色 される細胞が認められた （図 7 ) 。
さらに、 Tgマウスと非 T SCIDマウス膝臓切片を抗 hHB-EGF抗体、 抗ィン シユリン抗体、 抗グルカゴン抗体でそれぞれ免疫染色を行つた。 その結果、 ィ ンシュリン抗体で染色される 細胞が hHB-EGF抗体で染色された。非 Tg-SCID マウスの 3細胞には、 hHB-EGFの発現は認められなかった （図 8 ) 。
〔実施例 4〕 糖尿病モデルマウスへの造血細胞の移植
(1)骨髄細胞の移植
DT投与後 7日目の高血糖誘導マウスに、 C57BL/6マウスの 細胞を除去し た骨髄細胞 (2 X 107個)を尾静脈より移入した。図 9において、 Tgマウス- 2 (園） は移植後 9週 （54日） 後には血糖値が顕著に低下し、 移植後 12週 （82日） で ほぼ正常値となった。 従って、 C57BL/6マウス骨髄細胞の移植によって、 高血 糖症が改善することが示された。
組織化学的にも、 膝臓ランゲルハンス島に iS細胞が再生していた （図 9、 写 真のパネル） 。 この個体に、 DT を再投与しても血糖値の上昇が認められなか つたことから、 再生した藤臓 細胞はレシピエント由来の細胞ではなく、 ドナ 一である C57BL/6由来の細胞であることが示された。
(2) ヒト臍帯血由来未分化細胞の移植
DT投与により高血糖症を誘導した SCID-Ins-TRECK-Tgマウスに、 DT投与 後 7日目にヒト臍帯血由来 CD34陽性細胞又は CD34陰性細胞を尾静脈より移入 し、 経時的に血糖値を測定した。 CD34陰性細胞移入個体は、 移入後 100日後で も血糖値 300 mg/dl以上であつたが、 CD34陽性細胞移入個体は、 移入後 40日か ら血糖値が低下し、 移入後 70〜80日目には 200 mg/dl以下となった （図 1 0 ) 。
従って、 ヒ ト臍帯血由来細胞の移植によって、 ヒト由来細胞がマウスに生着 して勝臓細胞に分化することにより睦臓細胞機能が回復し、 高血糖症が改善す ることが示された。 産業上の利用可能性
本発明の糖尿病モデル動物は、 再生医学を利用した I型糖尿病のための動物 モデルとしての 3つの条件、'すなわち、（i)確実に糖尿病を惹起できること、（ii) 糖尿病以外の何らの影響も及ぼさないこと、 及び (iii)他の哺乳類細胞を移植す ることが可能なことを十分にクリアしたものであり、 その有用性は高く、 糖尿 病の病態解明及び糖尿病治療薬の開発に利用できるという極めて優れた効果を 有する。
さらに、 本発明の糖尿病モデル動物に DTを投与して脖臓 ]3細胞を傷害した 後にヒト B萃臓 細胞を移植すると、 マウスの生体内にヒト脖臓 細胞が生着す るため、 本発明のモデル動物は SCID-Hu (ヒ ト）'モデルとして極めて有用で ある。 配列表フリーテキスト
配列番号 3 ：変異体
配列番号 4 ：プライマー
配列番号 5 ：プライマー

Claims

請求 の 範囲
1 . ジフテリァ毒素受容体をコードする遺伝子及ぴ前記遺伝子の発現を調節す るインシュリンプロモーターを含む糸且換体 DNAが導入された、 トランスジ ： ニック非ヒト動物。
2 . ジフテリア毒素が投与されることにより糖尿病を発症することを特徴とす る、 請求項 1記載のトランスジェユック非ヒト動物。
3 . ジフテリァ毒素受容体をコードする遺伝子が霊長類由来のへパリン結合性 EGF遺伝子である請求項 1記載のトランスジヱニック非ヒト動物。
4 . ジフテリァ毒素受容体をコードする遺伝子がヒ トへパリン結合性 EGF遺伝 子である請求項 1記載のトランスジヱニック非ヒト動物。
5 . 動物が重度複合免疫不全動物である、 請求項 1記載のトランスジヱニック 非ヒト動物。
6 . 動物がマウス、 ラット、 モノレモット、 ハムスター、 ィヌ、 ネコ、 ャギ、 ヒ ッジ、 ブタ、 ゥシ及びゥマからなる群から選択されるいずれか一種である、 請求項 1記載のトラン^ジヱニック非ヒト動物。
7 . 動物がマウスである、 請求項 1記載のトランスジエニック非ヒト動物。
8 . ジフテリァ毒素受容体をコードする遺伝子及び前記遺伝子の発現を調節す るインシュリンプロモーターを含む組換体 DNAを非ヒト動物に導入するこ とを特徴とする、 トランスジエニック非ヒト動物の作製方法。
9 . 請求項 1〜 7のいずれか 1項記載のトランスジエニック非ヒト動物又は請 求項 8記載の方法により作製されたトランスジェニック非ヒト動物に、 ジ フテリァ毒素を投与することを特徴とする糖尿病モデル動物の作製方法。
1 0 . 請求項 1〜 7のいずれか 1項記載のトランスジエニック非ヒト動物又は 請求項 8記載の方法により作製されたトランスジエニック非ヒト動物にジフ テリア毒素を投与して当該トランスジエニック非ヒト動物に糖尿病を発症さ せる方法。
1 1 . 請求項 9記載の方法により作製された糖尿病モデル動物。
1 2 . 請求項 1 1記載の糖尿病モデル動物又はその一部に候補物質を投与する ことを特徴とする、 糖尿病治療薬のスクリーニング方法。
1 3 .候補物質を接触させた糖尿病モデル動物又はその一部の血糖値を測定し、 当該測定された血糖値が候補物質を接触させない対照の糖尿病モデル動物 の血糖値よりも低下したときは、 前記候補物質を糖尿病治療薬として選択 する、 請求項 1 2記載の方法。
1 4 . 候補物質を接触させた糖尿病モデル動物又はその一部のィンシュリン濃 度を測定し、 当該測定された濃度が候補物質を接触させない対照の糖尿病 モデル動物のィンシュリン濃度よりも増加したときは、 前記候補物質を糖 尿病治療薬として選択する、 請求項 1 2記載の方法。
1 5 . 請求項 1 1記載の動物に他の動物由来の幹細胞を移植すること.を特徴と する、 当該他の動物由来の藤臓細胞を有するトランスジエニック非ヒト動 物を作出する方法。
1 6 . 幹細胞が造血幹細胞である請求項 1 5記載の方法。
1 7 . 造血幹細胞が骨髄由来細胞又は臍帯血由来細胞である、 請求項 1 6記載 の方法。
1 8 . 請求項 1 5記載の方^により作製された、 他の動物由来の膝臓細胞を有 するトランスジエニック非ヒト動物。
1 9 . 脾臓細胞が、 移植された他の動物の造血幹細胞由来である請求項 1 8記 載のトランスジエニック非ヒ ト動物。
2 0 . 造血幹細胞が骨髄細胞又は臍帯血細胞である、 請求項 1 9記載のトラン スジエニック非ヒト動物。
PCT/JP2006/304185 2005-02-25 2006-02-27 糖尿病モデル動物 WO2006090918A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11/884,943 US20090217394A1 (en) 2005-02-25 2006-02-27 Diabetes Model Animal
EP06715244A EP1859677A4 (en) 2005-02-25 2006-02-27 ANIMAL MODEL OF DIABETES
JP2007504847A JP4931153B2 (ja) 2005-02-25 2006-02-27 糖尿病モデル動物

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005051692 2005-02-25
JP2005-051692 2005-02-25

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2006090918A1 true WO2006090918A1 (ja) 2006-08-31

Family

ID=36927537

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2006/304185 WO2006090918A1 (ja) 2005-02-25 2006-02-27 糖尿病モデル動物

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20090217394A1 (ja)
EP (1) EP1859677A4 (ja)
JP (1) JP4931153B2 (ja)
WO (1) WO2006090918A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013118859A (ja) * 2011-12-08 2013-06-17 Primetech Kk 高脂血症モデルブタ
JP7117704B1 (ja) * 2021-02-22 2022-08-15 ロート製薬株式会社 糖尿病の予防及び／又は治療剤
WO2022176735A1 (ja) * 2021-02-22 2022-08-25 ロート製薬株式会社 糖尿病の予防及び／又は治療剤

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08322427A (ja) * 1995-01-19 1996-12-10 Fujita Gakuen トランスジェニック動物においてマークをつけた細胞及び組織を標的とする方法
WO1998033899A1 (fr) 1997-01-31 1998-08-06 Dnavec Research Inc. Animaux presentant une inactivation genique
JP2005051692A (ja) 2003-07-31 2005-02-24 Toppan Printing Co Ltd 非接触式個体識別システム

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7642401B2 (en) * 2005-01-31 2010-01-05 National University Corporation NARA Institute of Science and Technology Diabetes model animal

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08322427A (ja) * 1995-01-19 1996-12-10 Fujita Gakuen トランスジェニック動物においてマークをつけた細胞及び組織を標的とする方法
WO1998033899A1 (fr) 1997-01-31 1998-08-06 Dnavec Research Inc. Animaux presentant une inactivation genique
JP2005051692A (ja) 2003-07-31 2005-02-24 Toppan Printing Co Ltd 非接触式個体識別システム

Non-Patent Citations (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Molecular Cloning", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
"Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
AKAZAWA H. ET AL.: "Diphtheria toxin-induced autophagic cardiomyocyte death plays a pathogenic role in mouse model of heart failure", J. BIOL. CHEM., vol. 279, no. 39, 2004, pages 41095 - 41103, XP003000259 *
APOSTOLOU I. ET AL.: "Effective destruction of Fas-deficient insulin-producing beta cells in type 1 diabetes", J. EXP. MED., vol. 198, no. 7, 2003, pages 1103 - 1106, XP003000261 *
BIOL. REPROD, vol. 57, no. 5, 1997, pages 1089 - 1095
DEV. BIOL., vol. 163, no. 1, 1994, pages 288 - 292
DIABETES, vol. 43, 1994, pages 433 - 440
EMBO J., vol. 13, 1994, pages 2322 - 2330
HOGAN, B. ET AL.: "Manipulating the Mouse Embryo", 1994, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
J. EXP. MED., vol. 188, 1998, pages 1445 - 1451
J. EXP. MED., vol. 188, no. 8, 1998, pages 1445 - 1451
MATHIS D. ET AL.: "beta-Cell death during progression to diabetes", NATURE, vol. 414, no. 6865, 13 December 2001 (2001-12-13), pages 792 - 798, XP003000260 *
MOL. REPROD. DEV., vol. 45, no. 4, 1996, pages 439 - 443
NATURE, vol. 292, 1981, pages 154 - 156
OSAWA M, NAKAMURA K, NISHI N, TAKAHASI N, TOKUOMOTO Y: "Inoue H, Nakauchi H, In vivo self-renewal of c-Kit+Sca-1+Lin(Low/-) hemopoietic stem cells", J. IMMUNOL., vol. 156, 1996, pages 3207 - 3214
PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A. 2003, vol. 100, 2003, pages 7253 - 7258
PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A., vol. 92, no. 17, 1995, pages 7844 - 7848
RAJASALU T. ET AL.: "Experimental autoimmune diabetes: a new tool to study mechanisms and consequences of insulin-specific autoimmunity", ANN. N. Y. ACAD. SCI., vol. 1037, 2004, pages 208 - 215, XP008067727 *
SAITO M, NAT. BIOTECHNOLOGY, vol. 19, 2001, pages 746 - 750
SAITO M. ET AL.: "Diphtheria toxin receptor-mediated conditional and targeted cell ablation in transgenic mice", NAT. BIOTECHNOL., vol. 19, no. 8, 2001, pages 746 - 750, XP002994353 *
See also references of EP1859677A4 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013118859A (ja) * 2011-12-08 2013-06-17 Primetech Kk 高脂血症モデルブタ
JP7117704B1 (ja) * 2021-02-22 2022-08-15 ロート製薬株式会社 糖尿病の予防及び／又は治療剤
WO2022176735A1 (ja) * 2021-02-22 2022-08-25 ロート製薬株式会社 糖尿病の予防及び／又は治療剤
CN115811982A (zh) * 2021-02-22 2023-03-17 日本乐敦制药株式会社 糖尿病的预防和/或治疗剂

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2006090918A1 (ja) 2008-08-07
EP1859677A1 (en) 2007-11-28
US20090217394A1 (en) 2009-08-27
JP4931153B2 (ja) 2012-05-16
EP1859677A4 (en) 2011-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Cemal et al. YAC transgenic mice carrying pathological alleles of the MJD1 locus exhibit a mild and slowly progressive cerebellar deficit
CN107529739B (zh) 表达人特定分子和人Fcγ受体家族的转基因非人动物
Inoue et al. A mouse line expressing Sall1‐driven inducible Cre recombinase in the kidney mesenchyme
JPH06507782A (ja) アルツハイマー病のアミロイド形成開症状を示すヒト以外の組換え哺乳動物
KR20040015711A (ko) 약물학적 및 독성학적 연구용 트랜스제닉 비인간 동물
JP2010029219A (ja) 動物モデルの開発のための方法
CN104797132B (zh) 基因敲入非人动物
JP4292401B2 (ja) 体重または摂食量の調節に関与するヒスタミン受容体ｈ３遺伝子の利用
JP2002533130A (ja) Ｈｉｖ共受容体を発現するトランスジェニック齧歯類動物および齧歯類細胞株
JPH10504701A (ja) トランスジェニック関節炎マウス
US8487087B2 (en) Model animal in which state of disease condition is observable in real time, gene construct for achieving the same and use of the same
CN113105555B (zh) Mhc分子人源化的非人动物的构建方法及应用
JP5075641B2 (ja) 遺伝子改変動物およびその用途
JP4931153B2 (ja) 糖尿病モデル動物
JP5030792B2 (ja) 糖尿病モデル動物
US7550649B2 (en) Transgenic non-human mammal
WO2022057903A1 (en) Genetically modified non-human animal with human or chimeric glp1r
JP2003204796A (ja) 非ヒト遺伝子改変動物およびその利用
US6610905B1 (en) Transgenic mouse model for Kaposi's sarcoma
WO2002074071A2 (fr) Modele animal transgenique des reponses allergiques mediees par les ige
AU741340B2 (en) Non human transgenic animal in which the expression of the gene coding for insulin is deleted
JP5046413B2 (ja) ヒトｆａｄプレセニリン突然変異をもつ標的遺伝子組換え非ヒト哺乳動物および生殖による子孫
US20030110524A1 (en) Transgenic organisms and their uses
JP2007505640A (ja) 排出可能なレポーターシステム
US20090320147A1 (en) Nonhuman transgenic animal as type 2 diabetes model

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DPE1 Request for preliminary examination filed after expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007504847

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006715244

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11884943

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2006715244

Country of ref document: EP

DPE1 Request for preliminary examination filed after expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)