CN101861521A - 用于确定生物学上感兴趣的肽和蛋白质的高灵敏度免疫分析和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及免疫分析法，其使得能以比现有技术中分析法更高的灵敏度检测样品中的多肽。本发明还涉及试剂盒，其提供了进行所述免疫分析法所需的组分。

Description

用于确定生物学上感兴趣的肽和蛋白质的高灵敏度免疫分析和试剂盒

技术领域

本发明涉及免疫分析领域，其使得能检测样品中的肽和蛋白质并提供了比现有技术的分析法更高的灵敏度。本发明还涉及试剂盒，其提供进行所述免疫分析所需的组分。

发明背景

阿尔茨海默病(AD)为中枢神经系统的进行性的退行性疾病，特征为进行性和不断加重的记忆丧失，接着是四肢控制和身体功能的丧失以及最终死亡。它是目前为止最为常见的痴呆病因，影响到超过65岁人群的1％至6％，超过80岁人群的10至20％。

AD在几个病理特征方面与其它类型的痴呆不同，包括在患者脑内神经元之间的细胞外空隙进行性出现老年斑。该老年斑具有淀粉样沉积物中央核心，主要由称为淀粉样β肽(Aβ)的40-42氨基酸肽的纤维形成，周围是退化的神经炎和胶质细胞。这种肽源于称为β淀粉样前体蛋白(βAPP)的前体蛋白的蛋白水解加工。在生物体内发现βAPP有不同亚型，这些亚型源自βAPP编码基因的初级转录本的可变剪接。这些亚型主要是βAPP-695、βAPP-751和βAPP-770，其中数字指氨基酸的数量。βAPP基因存在于人21号染色体中，该染色体的三体型(唐氏综合征)导致βAPP蛋白的过表达以及患者脑内过早出现淀粉样斑(Selkoe D.J.(2001)Physiol.Rev.81，741-766)。βAPP为跨膜蛋白，可被不同的蛋白水解酶(分泌酶)加工而产生不同的产物。通常，βAPP在其胞外区被α分泌酶切割，产生可溶性长分泌片段和称为C83的较短膜锚定片段，C83被γ-分泌酶进一步切割产生p3肽(p3₄₀或p3₄₂)以及被其它蛋白酶进一步降解的57或59肽。当βAPP被β-分泌酶切割时，其产生可溶性分泌片段(sβAPP-β)和C99片段，该C99片段可被γ-分泌酶切割而产生淀粉样肽Aβ和锚定在膜内的57或59氨基酸肽(SelkoeD.J.(2001)Physiol.Rev.81，741-766)。

根据出现的年龄，可以将AD分类为早期发作型(低于60岁)和晚期发作型(高于60岁)，以及根据常染色体显性遗传的存在，可以将AD分类为家族性AD或散发性AD。早期发作的家族型AD可与编码βAPP、早老蛋白1和早老蛋白2的基因(分别位于第21、14和1号染色体上)中的已知突变相关。这些分类并不是相互排斥的。最常见的形式为散发性晚期发作型。

在临床实践中，采用基于典型的临床标志的存在来进行AD诊断，并采用神经成像技术和血液分析来排除其它类型的痴呆。采用这些标准，诊断可靠性是可接受的，尽管根据采用脑尸检进行的研究，有10-20％的诊断为AD的患者患有不同的疾病。另外，只有当神经退行性过程进展至患者患有严重痴呆和脑损伤广泛至治疗措施的数量有限时，目前的诊断方法才能实施。明确诊断有赖于对死后脑组织的病理检查。

因此，亟需鉴定用于AD早期诊断的灵敏和特异的生物标志物，其使得能区分年老引起的认知损害和与该过程的早期症状相关的认知损害，以及区分AD引起的变化和其它退行性疾病引起的变化。根据Growdon等人(Neurobiol.Aging，1998，19：109-116)，用于AD的理想标志物应满足以下条件：

-其应该检测神经病理学的基本特征

-其应该在该疾病的神经病理学证实的病例中得到验证

-对于检测AD，其应该显示至少80％的灵敏度

-对于区分AD和其它类型的痴呆，其应该显示至少80％的特异性，以及

-其应该是可靠的、可重复的、非侵入性的、易于操作的和廉价的。

现有技术中已知通过检测患者脑或CSF内存在的生物标志物的水平来诊断AD的方法。已经对在CSF内测定的不同生物标志物进行了表征。CSF直接反映了中枢神经系统的细胞外空隙的成分，因此提供了较高浓度的生物标志物。但是，只能通过腰椎穿刺获取CSF，这不是容易被患有痴呆的患者接受的常规诊断方法，更不用说具有记忆病症的患者。因此，亟需这样的AD生物标志物，其可在通过非侵入性方式从身体获取的样品中被检测到。

现有技术中描述的可在血浆中检测的适合AD生物标志物包括(i)源于淀粉样斑的标志物，(ii)针对Aβ或βAPP的自身抗体，(iii)炎性标志物，例如IL-6，其受体或gp 130，C反应性蛋白或氧化应激(异构前列腺素)，(iv)脂代谢的标志物(apoE，氧固醇)以及(v)血管性疾病标志物(同型半胱氨酸，脂蛋白b C1q)(Scheuner D et al.(1996)Nature Med 2，864-870)。

然而，鉴于Aβ在AD患者脑内累积并且为AD发病机制中的中心要素，该蛋白被认为是AD标志物的最适合候选者。但是，将Aβ用作AD的血浆生物标志物面临Aβ肽(Aβ(1-40)和Aβ(1-42))在血清中的浓度极低的问题，以致没有足够灵敏的能可靠检测所述肽类的分析法。

Scheuner等人(Nature Med.，1996，2：864-870)进行了初步研究来检测在携带家族性AD相关突变的家族患者中早老蛋白1、早老蛋白2或βAPP的胞外浓度是否升高。尽管在具有FAD相关PS1(P＜0.0001)、PS2_N141I(P＝0.009)、APP_{K670N，M671L}，(P＜0.0001)和APP_V7171(一例个体)突变的个体血浆中观察到升高水平的Aβ1-42(43)，但是这些研究对于分析其中Aβ肽在血清中的浓度低得多的散发性AD无效。本文中使用的测定试剂盒为Suzuki，N.等人(Science，1994，264：1336-1340)之前描述的ELISA夹心测定法，其使用捕获抗体和过氧化物酶结合的检测抗体。

已有人指出，Aβ水平与散发性AD之间没有关联性。相应地，Tamaoka A等人(J Neurol Sci.，1996，141，65-68)测量了来自28例散发性AD患者、40例具有不同神经学过程的痴呆患者以及40名健康对照的血浆中的Aβ水平。这些作者得出结论，Aβ40和Aβ42的血浆水平在对照个体和患有散发性AD的患者中是类似的。Kosaka等人(Neurology，(1997)48，741-745)得到了类似的结果。Tamaoka及其同事使用的测定法就测量血浆中的Aβ1-40在WO200722015中有进一步的说明。该测定法为ELISA夹心测定法，其中采用1A10单克隆抗体(mAb)将Aβ40和Aβ42肽捕获在固体支持物上并采用过氧化物酶结合的14F1mAb进行检测。这种测定法提供了个位数pg/ml范围内的灵敏度水平。

Vanderstichele H等人(Amyloid，2000，7，245-258)测定了12名健康对照、39例AD患者和6例患有路易体痴呆的患者、10例具有其它类型痴呆的患者以及9例具有其它神经学病状而不表现痴呆的患者的CSF、血浆和尿中的Aβ(1-42)水平，但是在Aβ(1-42)水平和诊断结果、性别或MMSE结果之间没有观察到关联性。对于这些研究，使用了基于ELISA夹心测定法的INNOTESTβ-淀粉样蛋白(1-42)测试，其中采用识别Aβ(1-42)的N-末端区的21F12mAb将Aβ(1-42)捕获在固体支持物上，并采用识别Aβ(42)C-末端区的生物素化3D6mAb和偶联至HRP的链霉抗生物素进行检测。

Fukomoto y col.(Arch.Neurol.2003，60，958-964)在146例AD患者、37例轻度认知损害患者和96例帕金森病患者中研究了血浆Aβ40和Aβ42水平与不同的临床、人口统计学和遗传变量的关联性。结果表明，随年龄有显著增加，但是相对于诊断、家族史、ApoE基因型或诸如乙酰胆碱酯酶抑制剂或他汀类的不同药物的治疗没有差异。这些测量使用ELISA夹心测定法完成，采用了识别Aβ的第11至28位氨基酸的mAb(BNT77)和特异识别Aβ40和Aβ42的HRP偶联的mAb(BA27和BC05mAb)。

Mehta等人(Arch.Neurol.57，2000，100-105)测量了78例AD患者和61名健康对照中血浆和CSF的Aβ40和Aβ42水平，观察到，具有ApoE4等位基因的AD患者中Aβ40血浆水平高于没有所述等位基因的对照组，Aβ42水平在AD患者和对照之间类似，就性别或简易精神状态检查(MMSE)评分而言无差异。这些测量使用ELISA夹心测定法完成，采用了作为捕获抗体的抗AβmAb 6E10和针对Aβ42和Aβ40特异的肽产生的生物素化抗血清。

Mayeux，R.等人(Ann Neurol.1999，46，412-416)采用了与Mehta等人(Arch.Neurol.57，2000，100-105)相同的ELISA测定法测量了个体队列(530)中的血浆Aβ40和Aβ42水平，并在18个月后再次测量(307例个体)。研究期间他们观察到患有AD的个体具有比未患有AD的个体更高的Aβ42水平。在确定的AD诊断三年后Aβ42水平下降。相对于AD表型未观察到差异。

Lanz，T.A和Schacthter，J.B.(J.Neuroscience Methods，2006，157：71-81)描述了用于检测Aβ肽总含量或Aβ40和Aβ42肽的单独含量的比色和荧光ELISA夹心测定法。对于检测Aβ肽的总量，利用6E10mAb捕获Aβ肽，然后采用生物素化的4G8和铕结合的链霉抗生物素或HRP-链霉抗生物素进行检测。对于检测Aβ40和Aβ42的量，6E10mAb被用作捕获抗体，并采用了对每一片段特异的生物素化兔多克隆抗体，接着是铕结合的链霉抗生物素或HRP-链霉抗生物素。但是，这种方法提供10pg/ml的最低检测限，并仅用于测量脑提取物中的Aβ。

WO200750359描述了检测多聚体形式的Aβ42的免疫分析法，其包括采用对所述多聚体形式特异的多克隆抗体捕获Aβ42衍生的肽并采用mAb和HRP结合的抗小鼠IgG检测所结合的肽的量。但是，这种分析法提供1000-3000pM的检测限，相当于4000pg/ml。

WO0162801描述了检测Aβ的ELISA夹心测定法，其将3D6mAb抗N-末端作为包被抗体，将识别成熟Aβ的第15至24位氨基酸的mAb用于检测，但是仅用于测量100至200pg/mL范围内的Aβ浓度值。

WO0315617描述了测量血浆中Aβ40和Aβ42的ELISA测定法，其使用识别成熟Aβ肽的第13至28位氨基酸的抗体，但是仅能够检测250-400pg/ml范围内浓度的所述肽，因此，仅适合于测量具有家族性AD的血浆中的Aβ。

WO0246237描述了测量脑匀浆液中总Aβ种类(Aβ40和Aβ42)的ELISA夹心测定法，其采用了作为捕获抗体的对Aβ42的第13至28位氨基酸特异的mAb以及对Aβ42肽的N-末端区特异的生物素化3D6mAb，然后采用了结合至过氧化物酶的链霉抗生物素。这篇文章还描述了Aβ42特异的ELISA夹心测定法，其将对Aβ42的第33-42位氨基酸特异的mAb 21F12用作捕获抗体，将生物素化的3D6mAb用作检测抗体。但是，这些分析法具有较低的灵敏度水平，对于总Aβ分析为50ng/ml，对于Aβ42特异的分析为125mg/ml，这使得它们不适合于测量血浆或血清中的总Aβ或Aβ42。

WO0413172描述了用于测量甲酸脑提取物和CSF中β-淀粉样蛋白(1-42)的ELISA夹心测定法，该方法将mAb 3D6用作检测抗体，将对成熟Aβ肽不同区域特异的多克隆抗体用作捕获抗体。

但是，迄今已知的所有基于ELISA的分析最多只具有个位数pg/mL范围的检测下限，这对于检测CSF中Aβ40和Aβ42以及对于检测患有家族性AD的患者血浆中所述种类是足够的，但是不适合于检测患有散发性AD的患者血浆中的Aβ42，其中的Aβ42血浆浓度低得多。具体地，INNOTESTβ淀粉样蛋白(1-42)测试具有20pg/ml的检测下限，这能够检测CSF中的Aβ42以及在患有家族性AD的患者中进行血浆测量，但是对于检测血浆中Aβ42浓度低得多的散发性AD患者中的Aβ42还不够灵敏。仅建议将这种试剂盒用于测量CSF中的Aβ肽水平。最近采用INNOTESTβ-淀粉样蛋白(1-42)的研究进一步验证了这种建议，这项研究显示，CSF中的肽水平比血浆中的高100至1000倍(Lewczuk，P et al.(2004)Neurobiol.Aging 25，273-281)。

另一种商品化试剂盒为Biosourceβ淀粉样蛋白(1-40)和β淀粉样蛋白(1-42)试剂盒。这些试剂盒提供ELISA夹心测定法，其中采用针对成熟肽的氨基末端的mAb将所述肽捕获在支持物上，并采用与成熟β-肽的C-末端区反应的兔多克隆抗体和抗兔IgG过氧化物酶进行检测。根据制造商的说明，这种试剂盒具有小于10pg/mL的灵敏度，但用于检测15.6至1000pg/mL的Aβ浓度。制造商建议所述Biosource试剂盒用于检测血清、CSF和细胞培养物中的Aβ肽。但是，散发性AD患者血清中Aβ40和Aβ42平均水平低于该测定的灵敏度下限，这样看起来就不可能将它们用于血清中的测量。

对应国际专利申请WO200646644的加拿大专利申请(CA2585148)描述了唯一的显示出检测下限为0.5pg/mL的Aβ肽分析法。这篇文献中使用的分析法为电化学发光(ECL)夹心分析法，其中将mAb 21F12(其识别Aβ42的第33-42位氨基酸)偶联至磁珠，然后将其用于在含有Aβ42的样品中捕获Aβ42肽，再与结合至钌复合物的3D6mAb进行接触。然后，通过施加电能时钌复合物发射的光来检测所结合的3D6抗体的量。采用这种测定法，发明人能够检测低至0.5pg/mL的Aβ42标准品。但是，当该测定法被用于比较来自AD患者和健康对照的血浆样品中的Aβ42时，在两组之间没有观察到显著差异，这使发明人推断由于降解导致血清中完整Aβ42的量非常低，并求助于采用21F12mAb的竞争ELISA测定法，其提供ng/mL范围内的灵敏度下限。

因此，本领域亟需用于检测Aβ衍生肽的改进免疫学测定法和试剂盒，它们克服现有技术中方法和试剂盒的问题，尤其是，以可靠的方式足够灵敏地检测患有散发性AD的患者血浆中的Aβ肽。

发明概述

在第一方面，本发明涉及用于确定或测定选自Aβ42、Aβ40及其混合物的靶多肽的试剂盒，所述试剂盒包括

(i)第一抗体或抗体组合，其识别所述靶多肽

(ii)第二抗体或抗体组合，其识别与所述第一抗体或抗体组合识别的区域不同的所述靶多肽的区域

(iii)对所述第二抗体显示出亲和性的试剂，其被偶联至结合对的第一成员，以及

(iv)结合对的第二成员，其被偶联至可检测的标签。

在第二方面，本发明涉及本发明试剂盒的用途，用于测定或检测样品中耙多肽以及用于诊断个体中的神经退行性病症。

在第三方面，本发明涉及用于测定或检测样品中选自Aβ42、Aβ40及其混合物的靶多肽的量的方法，包括以下步骤：

(i)用特异结合所述靶多肽的第一抗体或抗体组合捕获存在于样品中的所述靶多肽，

(ii)将步骤(a)中形成的免疫复合物与第二抗体或抗体组合接触，所述第二抗体或抗体组合识别与所述第一抗体或抗体组合识别的区域不同的所述靶多肽的区域，

(iii)将步骤(ii)中形成的复合物与对所述第二抗体显示出亲和性并被偶联至结合对的第一成员的试剂接触，

(iv)将步骤(iii)中形成的复合物与偶联至可检测标签的结合对的第二成员接触，以及

(v)测定或检测连接至所述结合对的第二成员的可检测标签的活性或量。

在第四方面，本发明涉及诊断个体中退行性病症的方法，其包括采用本发明的方法确定患者样品中Aβ40或Aβ42的量，并参照健康个体样品中一种肽或两种肽的浓度将所述患者样品中所述一种或两种肽的浓度与退行性病症的出现相关联。

附图说明

图1显示了ELISA夹心测定法的标准滴定曲线，其中将450nm处的吸光度值对Aβ40标准制剂的已知浓度(pg/mL)作图。

图2显示了ELISA夹心测定法的标准滴定曲线，其中将450nm处的吸光度值对Aβ42标准制剂的已知浓度(pg/mL)作图。

具体实施方式

本发明的作者出人意料地发现，通过使用具有权利要求1中定义的组分的试剂盒，有可能以低于0.1pg/ml的检测下限测定Aβ40和Aβ42的水平。这种试剂盒能够在任何个体的任何样品中，特别是在来自疑似患有散发性AD的个体的血浆中对所述分子种类进行可靠的定量，其中所述血浆浓度太低以至于迄今为止还不可能进行可靠的测量。

因此，在第一方面，本发明涉及用于确定或测定选自Aβ42、Aβ40及其混合物的靶多肽的试剂盒，所述试剂盒包括：

(i)第一抗体或抗体组合，其识别所述靶多肽，

(ii)第二抗体或抗体组合，其识别与所述第一抗体或抗体组合识别的区域不同的所述靶多肽的区域，

(iii)对所述第二抗体显示出亲和性的试剂，其被偶联至结合对的第一成员，以及

(iv)结合对的第二成员，其被偶联至可检测标签。

不希望被任何特定理论所束缚，可以认为该提高的灵敏度是由于使用了试剂(iii)，其使得源于检测抗体的信号被放大。

用在本文时，“Aβ42”指对应第672至713位氨基酸(SEQ IDNO：4)的42个氨基酸肽，其由β-和γ-分泌酶相继蛋白水解切割淀粉样前体蛋白(SEQ ID NO：6)而产生。

用在本文时，“Aβ40”指对应第672至711的氨基酸(SEQ IDNO：5)的40个氨基酸肽，其由β-和γ-分泌酶相继蛋白水解切割淀粉样前体蛋白(SEQ ID NO：6)而产生。

在本发明上下文中，第一抗体将被认为是“捕获”抗体，含义是该抗体被用于从样品中获取该抗体特异结合的所有分子种类。就可用作捕获抗体的抗体类型而言实际上没有任何限制，只要其含有至少一个对Aβ40和/或Aβ42特异的抗原结合部位。因此，适合用作捕获抗体的抗体分子包括

-“完整”抗体，其包含抗原结合可变区以及轻链恒定区(CL)和重链恒定区CH1、CH2和CH3，

-产生于木瓜蛋白酶消化完整抗体的“Fab”片段，其包含单一抗原结合部位以及CL和CH1区，

-产生于胃蛋白酶消化完整抗体的“F(ab’)₂”片段，其含有两个抗原结合部位，

-“Fab”’片段含有轻链恒定区和重链的第一恒定区(CH1)，并仅具有一个抗原结合位点。Fab’片段与Fab片段的不同之处是在重链CH1区的羧基末端添加了数个残基，包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸，

-“Fv”为最小的抗体片段，其含有完整的抗原识别和抗原结合部位。该区域由紧密、非共价结合的一个重链和一个轻链可变区的二聚体组成。其构型为每一可变区的三个超变区(CDR)相互作用以在VH-VL二聚体的表面上限定抗原结合部位。六个超变区共同赋予抗体抗原结合特异性。但是，即使是单一可变区(或仅包含三个特异于抗原的超变区的半个Fv)也能识别和结合抗原，尽管亲和性小于完整结合部位。

-单链FV或″scFv″抗体片段包含抗体的VL和VH区，其中这些区存在于单一多肽链中。优选地，该VL和VH区通过多肽接头连接，其使得scFv能形成抗原结合所需要的结构。

-“双抗体”(diabody)包含在同一多肽链(VH-VL)上通过肽接头相互连接的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中过短的肽接头使得同一链上的两结构域不能配对。这迫使与另一链的互补结构域配对，并促进具有两个功能性抗原结合部位的二聚体分子的组装。

-“双特异性抗体”(BAb)为单链双价抗体(或其免疫治疗上有效的片段)，其具有两个特异性不同的抗原结合部位。这两个抗原部位可以化学上连接在一起，或者通过现有技术中已知的遗传工程方法连接在一起。

所有这些抗体片段都可以单独或组合采用现有技术中已知的常规技术进一步修饰，例如通过采用现有技术中已知的氨基酸删除、插入、置换、添加、和/或重组(和/或任何其它修饰(例如，翻译后和化学修饰，例如糖基化和磷酸化)。向构成免疫球蛋白链氨基酸序列的基础的DNA序列中引入这类修饰的方法在现有技术中是已知的；例如参见，Sambrook等人；Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)；Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989第二版和2001年第三版。

适合作为捕获抗体的抗体包括多克隆和单克隆抗体。为了产生多克隆抗体，可以通过注射具有免疫原性质的对应于Aβ40或Aβ42的片段的肽来免疫各种宿主，包括山羊、兔、大鼠、小鼠、骆驼、单峰骆驼、美洲驼、人、鸟等。取决于宿主种类，可以使用不同的佐剂增强免疫反应。这类佐剂包括但不限于，弗氏佐剂，矿物凝胶如氢氧化铝，以及表面活性物质如溶血卵磷脂，聚阴离子，肽，油乳剂，KLH和二硝基酚。在人体内使用的佐剂中，BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)是尤其优选的。如果抗原是肽，则有益的是将其偶联至在待免疫物种中有免疫原性的蛋白。例如，采用双功能或衍生化试剂，如马来酰亚胺苯甲酸硫代琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基偶联)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酐或SOCl₂，抗原可以被偶联至钥孔戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)、蓝载体(Blue Carrier，从Concholepas concholepas分离的血蓝蛋白)、牛甲状腺球蛋白、或大豆胰蛋白酶抑制剂。

为了产生单克隆抗体，可以使用常规技术。例如，可以使用Kohleret al.，Nature，256：495(1975)最先描述的杂交瘤方法制备单克隆抗体，采用Ausubel，F.M等人(Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学规程)，John Wiley & Sons Inc；活页版，2003)的11.4至11.11单元中详细描述的步骤。或者，可以通过重组DNA操作从采用McCafferty等人，Nature，348：552-554(1990)描述的技术生成的抗体噬菌体文库中分离单克隆抗体。Clacksoii等人，Nature，352：624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)分别描述了采用噬菌体文库分离鼠和人抗体。后来的出版物描述了通过链替换产生高亲和性(nM范围)人抗体(Marks et al.，Bio/Technology，10：779-783(1992))，以及组合感染和体内重组作为构建极大噬菌体文库的策略(Waterhouse et al.，Nucl.Acids.Res.，21：2265-2266(1993))。因此，对于分离单克隆抗体，这些技术是传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行的替代方案。

在取血并去除纤维蛋白凝块后，从经免疫的宿主获得的抗血清可直接作为多克隆抗体使用。杂交瘤培养物上清液或在适合宿主腹膜腔内植入杂交瘤后的腹水可直接作为单克隆抗体使用。可选择地，不论是多克隆的还是单克隆的，免疫球蛋白分子都可在其使用前通过常规手段纯化，例如采用衍生自Aβ40或Aβ42的肽的亲和纯化，非变性凝胶纯化，HPLC或RP-HPLC，体积排阻，蛋白A柱纯化(purification onprotein A column)，或这些技术的任意组合。

在优选的实施方案中，捕获抗体识别Aβ40和Aβ42的共有区域，以便能够用单一抗体种类同时捕获这二者。原则上，任何对Aβ40和Aβ42的序列的共有区域特异的抗体都可用作捕获抗体。可被捕获抗体靶向的优选表位包括位于Aβ40或Aβ42的第1至16位、第1至17位、第13至28位、第15至24位、第1至5位和第1至11位氨基酸内的表位。在更优选的实施方案中，所述捕获抗体针对Aβ40和/或Aβ42中不同于C末端区的区域。在更优选的实施方案中，所述捕获抗体针对Aβ40和Aβ42肽的N-末端区的表位。在另一优选的实施方案中，所述捕获抗体为单克隆抗体。在更优选的实施方案中，所述捕获抗体识别对应Aβ肽的第1-16位氨基酸的区域。在更优选的实施方案中，用作捕获抗体的单克隆抗体为6E10mAb，其在Kim，K.S.(Neuroscience Res.Comm.1988，2：121-130)中已有描述。

本发明的试剂盒的第二组分对应于抗体或抗体组合，它们识别与第一抗体或抗体组合识别的区域不同的靶多肽的区域。在本发明上下文中，第二抗体被认为是“检测抗体”，因为这种抗体被用于检测捕获抗体保留的抗原的量。

如同捕获抗体，就可用作检测抗体的抗体类型而言实际上没有限制。但是，本领域技术人员还应了解的是，检测抗体(i)必须结合不被捕获抗体占据的抗原区域以及(ii)必须不仅含有抗原结合部位，还含有被对所述抗体显示出高亲和性结合的试剂可特异检测的一个或多个其它区域，以便能检测与由捕获抗体捕获的抗原结合的该抗体。优选地，被所述试剂特异结合的所述其它区域对应免疫球蛋白分子的恒定区。

适合的检测抗体包括完整抗体、Fab、F(ab’)2、Fab’和Fv片段、单链FV抗体、双抗体、双特异性抗体等，其中这些化合物如前文所定义的。与捕获抗体的情况类似，检测抗体采用与针对捕获抗体描述的方法相同的方法，可以为多克隆的或单克隆的，天然的或翻译后修饰的，以及纯的或富集抗原结合分子的。技术人员会意识到，为了使用检测抗体，其必须被稀释至适合的工作浓度，以及为每批抗体可以常规地确定所述稀释度。此外，显而易见的是，适当的工作稀释度将取决于使用抗血清还是纯化的IgG成分。通常的稀释度为1/1000、1/2000、1/3000、1/4000、1/5000、1/6000、1/7000、1/8000、1/9000、1/10000等。

在优选的实施方案中，所述检测抗体包含选自下组的任何多克隆抗体：

(i)针对对应Aβ42肽的C-末端区的肽制备的多克隆抗体，其特异结合Aβ42而不与Aβ40或Aβ43产生任何明显的交叉反应

(ii)针对对应Aβ40肽的C-末端区的肽制备的多克隆抗体，其特异结合Aβ40而不与Aβ42、Aβ39、Aβ38、Aβ41或Aβ43产生任何明显的交叉反应

(iii)同时识别Aβ40和Aβ42的C末端区的抗体，或

(iv)(i)和(ii)中抗体的组合。

在更优选的实施方案中，用于制备Aβ42特异抗体的对应Aβ42肽的C末端区的肽为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中定义的肽在另一优选的实施方案中，用于制备Aβ40特异抗体的对应Aβ40肽的C末端区的肽为SEQ ID NO：3中定义的肽。Aβ40和Aβ42特异性抗体以及它们的制备方法在WO2004024770和WO2004098631中有详细说明，通过参考将其内容并入本文。

本领域普通技术人员会理解，所述方法可用于检测Aβ40、Aβ42或同时检测二者，这取决于该方法中使用的捕获和检测抗体的类型。

为了特异性测定或确定Aβ40，捕获抗体可以是识别Aβ40的N-末端区(以及Aβ42的N-末端区，因为两种肽具有相同的N末端区)的抗体，检测抗体可以是特异识别Aβ40的C-末端区而不与Aβ42产生任何交叉反应的抗体。或者，可以采用识别Aβ40的C-末端区而不与Aβ42产生任何交叉反应的捕获抗体以及识别Aβ40和Aβ42共有的Aβ40区域(优选Aβ42/Aβ40的N-末端区)的检测抗体来特异性检测Aβ40。

为了特异性测定或确定Aβ42，捕获抗体可以是识别Aβ42的N-末端区(以及Aβ40的N-末端区，因为两种肽具有相同的N末端区)的抗体，检测抗体可以是特异识别Aβ42的C-末端区而不与Aβ40产生任何交叉反应的抗体。或者，可以采用识别Aβ42的C-末端区的捕获抗体以及识别Aβ42和Aβ40共有的Aβ42区域的检测抗体来特异性检测Aβ42。

为了同时测定或确定Aβ42和Aβ40，捕获抗体可以是识别Aβ42和Aβ40共有的N-末端区的抗体，而检测抗体可以是至少两种抗体的组合，其中第一抗体特异识别Aβ42的C-末端区而不与Aβ40产生任何交叉反应，第二抗体特异识别Aβ40的C-末端区而不与Aβ42产生任何交叉反应。或者，捕获抗体可以是识别Aβ42和Aβ40共有的N-末端区的抗体，而检测抗体可以是识别Aβ40和Aβ42二者的C-末端区的抗体。或者，可采用至少两种抗体的混合物作为捕获抗体以及识别Aβ42和Aβ40共有的N-末端区的检测抗体来同时检测Aβ42和Aβ40，其中所述混合物包含特异识别Aβ42的C-末端区而不与Aβ40产生任何交叉反应的第一抗体和特异识别Aβ40的C-末端区而不与Aβ42产生任何交叉反应的第二抗体。或者，可以采用识别Aβ42和Aβ40二者的C-末端区的抗体作为捕获抗体以及识别Aβ42和Aβ40二者的N-末端区的抗体作为检测抗体，来同时检测Aβ42和Aβ40。

在优选的实施方案中，所述第一和/或第二抗体或抗体组合被亲和纯化，其中采用了包含用于制备它们的多肽的序列的多肽。

试剂盒的第三组分对应于对所述检测抗体显示出亲和性并偶联至结合对的第一成员的试剂。该抗体结合试剂可以非共价地结合至抗体或抗体片段的特定型、特定类和/或特定亚类。或者，该抗体结合试剂可以非共价地结合对特定抗原特异的抗体。在某些实施方案中，抗体结合试剂非共价地结合检测抗体的Fc区或F(ab)区。优选的抗体结合试剂包括蛋白A、蛋白G、蛋白V、蛋白L、抗Fc抗体或抗体结合片段以及Fc受体(FcR)或其抗体结合片段。可以非共价地结合检测抗体的抗体的非限定性实例包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单结构域抗体、单链Fvs(scFv)单链抗体、Fab片段、F(ab′)片段、二硫键连接的Fvs(sdFv)、内抗体和抗独特型(抗-Id)抗体，以及任何上述抗体的表位结合片段。Fc受体的非限定性实例包括FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIC、FcγRIIIAα、FcγRIIIB、Fc∈RIα、Fc∈RIξ和FcγRIIIAξ。

本发明的试剂盒的第四方面对应于结合对的第二成员，其被偶联至可检测标签。适合的结合对包括

■半抗原或抗原/抗体，例如地高辛和抗地高辛抗体

■生物素或生物素类似物(例如，氨基生物素、亚氨基生物素或脱硫生物素)/抗生物素蛋白或链霉抗生物素

■糖/凝集素

■酶和辅因子

■叶酸/叶酸盐

■选择性结合蛋白质的双链寡核苷酸/转录因子。

■核酸或核酸类似物/互补核酸，

■受体/配体，例如，甾类激素受体/甾类激素。

应理解的是，术语“结合对”的“第一”和“第二”成员是相对的，上述成员的每一个都可看作该结合对的第一或第二成员。在优选的实施方案中，结合对的第一成员为生物素或其功能上的等同变体，结合对的第二成员为抗生物素蛋白、链霉抗生物素或其功能上的等同变体。

在优选的实施方案中，结合对的第二成员为链霉抗生物素。

适合的可检测标签包括，但不限于，荧光部分(例如，荧光素、若丹明、藻红蛋白、香豆素、噁嗪、试卤灵(resorufin)、菁蓝及其衍生物)，发光部分(例如，Quantum Dot Corporation，Palo Alto，CA提供的Qdot^TM纳米颗粒)。如果可检测标签为酶，则该酶必须能够在例如添加激活剂、底物、放大剂(amplifying agent)等时生成可检测的信号。适合用作本发明可检测标签的酶和对应底物包括：

●碱性磷酸酶类：

○生色底物：基于对硝基苯磷酸盐(p-NPP)、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐/硝基蓝四氮唑(BCIP/NPT)、固红/萘酚-AS-TS磷酸盐的底物

○荧光底物：4-甲基伞形酮酰磷酸盐(4-MUP)、2-(5′-氯-2’-磷酰基氧基苯基)-6-氯-4-(3H)-喹唑酮(CPPCQ)、3，6-荧光素二磷酸盐(3，6-FDP)、固蓝BB、固红TR或固红紫色LB重氮盐类

●过氧化物酶类：

○基于2，2-连氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、邻苯二胺(OPT)、3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)、邻联茴香胺、5-氨基水杨酸、3-二甲基氨基苯甲酸(DMAB)和3-甲基-2-苯并噻唑啉腙(MBTH)、3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)-和3，3′-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)的生色底物。

○荧光底物：4-羟基-3-甲氧基苯基乙酸、还原吩噁嗪和还原苯并噻嗪，包括Red试剂、Amplex UltraRed和还原二氢呫吨。

●糖苷酶类：

○生色底物：邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷(o-NPG)、对硝基苯基-β-D-半乳糖苷和4-甲基伞形酮酰基-β-D-半乳糖苷(MUG)，用于β-D-半乳糖苷酶。

○荧光底物：试卤灵β-D-吡喃半乳糖苷、荧光素二半乳糖苷(FDG)、荧光素二葡萄糖苷酸、4-甲基伞形酮酰基β-D-吡喃半乳糖苷、羧基伞形酮酰基β-D-吡喃半乳糖苷和氟化香豆素β-D-吡喃半乳糖苷类。

●氧化还原酶类(荧光素酶)：

○发光底物：虫荧光素。

在优选的实施方案中，可检测标签为辣根过氧化物酶，检测试剂为TMB。

在优选的实施方案中，所述试剂盒还包括固体支持物。用在本文时，术语“支持物”或“表面”指固体相，其为多孔或无孔的水不溶性材料，可具有多种形状中的任一种，例如狭条、棒、颗粒，包括乳胶颗粒、磁性颗粒、微粒、小珠、膜、微量滴定孔和塑料管。原则上，任何材料都适合用作固体支持物，只要其能够结合足够量的捕获抗体。因此，对固体相材料的选择基于所希望的测定形式工作特性来确定。适合用于固体支持物的材料包括聚合物材料，尤其是纤维质材料和纤维素衍生材料，例如含纤维的纸，例如滤纸、色谱纸、玻璃纤维纸等；合成的或经改性的天然产生的聚合物，例如硝酸纤维素、醋酸纤维素、聚氯乙烯、聚丙烯酰胺、交联葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚对苯二甲酸乙二酯、尼龙、聚乙烯基丁醛等；它们单独使用或者与其它材料联合使用；玻璃，例如可作为生物玻璃获得的玻璃，陶瓷，金属，等等。优选苯乙烯和羧化苯乙烯或以其它活性基团如氨基、羟基、卤素等功能化的苯乙烯的未交联聚合物。某些情况下，将使用取代的苯乙烯与二烯如丁二烯的共聚物。

固体支持物和捕获抗体在试剂盒中可以分开提供，或者支持物可以在交货时已经被捕获抗体预包被。这种情况下，该支持物可能在结合捕获抗体后已经用封闭溶液处理过。如果该支持物是预包被的，则优选该支持物被浓缩的海藻糖溶液处理，并经干燥，这种情况下，干燥的海藻糖在支持物上形成晕圈(halo)。这些含有干燥的海藻糖的支持物极其稳定，避光4℃存放时可保存长达2年。

试剂盒的其它组分可以包括：

·从患者获取待分析样品的装置

·用于制备靶肽的标准曲线的缓冲剂和溶液

·在测定期间洗涤和封闭固体支持物的缓冲剂和溶液

·用于以包被抗体包被固体支持物的缓冲剂和溶液

·用于显示来自可检测标签的颜色或荧光信号的试剂

·终止来自可检测标签的颜色或荧光产物的形成的试剂(如1NH₂SO₄)

·维持肽为未折叠状态的试剂(如，浓盐酸胍)

·含有Aβ40或Aβ42A肽或其组合的储备液的样品

在优选的实施方案中，捕获抗体被固定至固体支持物上。该固定可以在结合待检测靶多肽之前进行，或者在肽/蛋白质结合至捕获抗体时进行。任一情况下，如果使用固体支持物，则合适的是在添加含有待测定靶多肽的样品之前封闭载体上多余的蛋白结合位点。优选地，采用补加了大分子化合物(例如，牛血清白蛋白、脱脂奶粉、western封闭试剂、酪蛋白、乳清蛋白、卵清蛋白)的与每次结合反应后用于洗涤复合物相同的缓冲液(例如，50mM Tris-HCl，pH 8，PBS或TBS，任选地包含Tween 20)进行支持物上肽结合位点的封闭或淬灭，该大分子化合物在缓冲液中的浓度为约0.05％至10％，优选1至5％，更优选约3％。如果包含固定的捕获抗体的支持物要保存一定时间，则优选用浓海藻糖溶液处理该支持物并使其干燥，这种情况下干燥的海藻糖在支持物上形成晕圈(halo)。这些含有干燥的海藻糖的支持物极其稳定，避光4℃存放时可保存多至2年。

本发明的试剂盒使得能以高灵敏度测定或确定被试剂盒的第一和第二抗体组分特异识别的多肽。因此，在另一方面，本发明涉及本发明的试剂盒用于测定样品中蛋白或蛋白的用途。在优选的实施方案中，该试剂盒被用于测定样品中选自Aβ40、Aβ42及其组合的肽。

“样品”在本发明中理解为包括组织培养物、血浆、血清、唾液、精液、痰、脑脊液(CSF)、泪液、黏液、汗液、乳汁、脑提取物等中的任一种。在优选的实施方案中，该样品为血浆样品。

鉴于本发明试剂盒提供了对任何样品中Aβ40和Aβ42浓度的高灵敏度测定的能力，其可被用于诊断这两种肽的任何一种在任一细胞液或组织中有浓度变化的任何疾病，尤其是退行性疾病，更具体地，神经退行性疾病。基于存在改变的Aβ40和/或Aβ42水平可以诊断的退行性疾病的非限制性实例包括：

·骨退行性病症，例如骨质减少、骨软化、骨质疏松、骨髓瘤、骨营养不良、佩吉特氏病、成骨不全、骨硬化、再生障碍性骨病、体液高钙性骨髓瘤、多发性骨髓瘤和转移后的骨变稀。

·软骨退行性病症，例如Gorham-Stout综合征；关节炎疾病；骨关节炎；类风湿性关节炎；银屑病关节炎；类风湿病；以及脆骨病。

·肌肉退行性疾病，例如肌肉萎缩症、肌肉萎缩、充血阻塞性肺病、肌肉消耗综合征、肌肉减少症、恶病质。

·心脏退行性疾病，包括缺血导致的心脏细胞死亡，移植排斥导致的组织和器官死亡，自毒作用导致的听力损失。

·视网膜退行性疾病，例如视网膜色素变性

·神经系统的退行性疾病，例如亚历山大病、Alper病、阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化、共济失调毛细血管扩张症、Batten病、牛海绵状脑病(BSE)、Canavan病、科凯恩综合征(Cockayne syndrome)、皮质基底节变性、Creutzfeldt-Jakob病、亨廷顿病、HIV相关痴呆、肯尼迪病、克拉伯病、路易体痴呆、Machado-Joseph病(脊髓小脑共济失调3型)、多发性硬化、多系统萎缩、神经疏螺旋体病、帕金森病、Pelizaeus-Merzbacher病、皮克氏病、原发性侧索硬化、朊病毒病、雷夫苏姆病、桑德霍夫病、希尔德病、精神分裂症、Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten病(也称为Batten病)、脊髓小脑共济失调、脊髓性肌萎缩、Steele-Richardson-Olszewski病、脊髓痨。在优选的实施方案中，采用本发明的试剂盒诊断的神经退行性疾病为阿尔茨海默病。

应意识到，判定一种可能的疾病所需的参数不仅是绝对Aβ40和Aβ42浓度，还有源于所述值的组合的参数，例如Aβ40/Aβ42或Aβ42/Aβ40比，Aβ42和Aβ40相对于总Aβ肽的百分比或Aβ42和Aβ40浓度的总和。

在优选的实施方案中，基于在AD患者样品中出现较低浓度的Aβ40和/或Aβ42肽(与从健康个体获得的相同来源的生物学样品中所述一种或多种肽的量相比)，可被诊断的疾病为阿尔茨海默病，更尤其是散发性AD。

使用时，本发明的试剂盒允许进行五步法来测定样品中选自Aβ42、Aβ40及其组合的靶多肽的量。所述方法为本发明的另一目的，包括以下步骤：

(i)用特异结合所述靶多肽的第一抗体或抗体组合捕获存在于样品中的靶多肽，

(ii)将步骤(a)中形成的免疫复合物与第二抗体或抗体组合接触，所述第二抗体或抗体组合与第一抗体或抗体组合识别靶多肽的不同区域，

(iii)将步骤(ii)中形成的复合物与对第二抗体显示出亲和性并被偶联至结合对的第一成员的试剂接触，

(iv)将步骤(iii)中形成的复合物与偶联至可检测标签的结合对的第二成员接触，以及

(v)检测连接至结合对的第二成员的酶的活性或化合物的荧光发射。

在优选的实施方案中，所检测的肽为所述肽的非寡聚体形式，更优选地，为Aβ40或Aβ42的单体形式。

用在所述方法每一步骤中的试剂已在上文中详细说明。

在本发明所述方法的第一步骤中，含有Aβ40和/或Aβ42肽的样品与第一抗体接触，以便形成第一免疫复合物。

在进行了第一结合步骤后，可以洗涤复合物以除去原始样品中存在的未与捕获抗体结合的任何剩余的蛋白质/肽。优选的可用于本发明中的洗涤缓冲液包括pH接近生理值的任何缓冲液(例如50mMTris-HCl)，任选地包含盐(例如150mM NaCl)并任选地包含低浓度的去垢剂(例如，0.05％Tween-20)。

在第二步骤中，接着将捕获抗体和样品中的一种或多种Aβ肽形成的复合物与第二抗体接触，以便形成“夹心型”免疫复合物。

在进行了第二步骤后，可以采用与前文描述基本上相同的缓冲液和操作来洗涤免疫复合物，以去除非特异结合的抗体。

在第三步骤中，本发明的方法包括将捕获的一种或多种肽与检测抗体之间形成的复合物与对检测抗体显示出亲和性且偶联至结合对的第一成员的试剂接触。

在第四步骤中，本发明的方法包括将抗体结合试剂与检测抗体之间形成的复合物与偶联至可检测标签的结合对的第二成员接触。

在本发明所述方法的第五步骤中，该方法包括测定所述可检测标签。应理解的是，对可检测标签的检测和/或定量取决于标签的性质，并且在现有技术中是已知的。当完整底物或可检测标签含有发光或染料组分，可以通过在UV透射仪上目测或通过使用基于UV的电子耦合器件(CCD)相机检测系统、基于激光的凝胶扫描仪、基于氙弧的CCD相机检测系统、与UV透射仪联合的波拉德相机以及各种用于光检测的其它设备来检测。当可检测标签为酶时，本发明所述方法的第五步骤包括将标签标记的免疫复合物(例如，捕获的肽、检测抗体和用可检测标签标记的试剂)与所述用作可检测标签的酶的激活剂、底物或放大剂接触。公知的能产生可检测信号的可检测标签包括酶标记的抗体。公知的用于该目的的示例性酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和糖苷酶，包括β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酸酶。例如，特异结合检测抗体的试剂可带有辣根过氧化物酶标签。在形成捕获部分-检测抗体-试剂复合物后，接着可利用所述作为可检测标签的酶的多种公知底物的任一种来进行测定。

在另一方面，本发明涉及诊断神经退行性疾病的方法，其包括测量疑似患有所述疾病的个体的样品中Aβ40和/或Aβ42的水平，并参照健康个体样品中所述一种或两种肽的浓度将所述患者样品中所述一种和/或两种肽的浓度与退行性病症的出现相关联。

在优选的实施方案中，该神经退行性疾病为阿尔茨海默病，其中如果所述样品中肽Aβ40、Aβ42或其组合的量低于来自健康个体的样品中所述一种或多种肽的量，则表明所述个体患有阿尔茨海默病。优选地，所述测定在血浆或血清中进行。

优选平行采用待测定样品和具有逐渐增加的已知浓度的待测定化合物的多个样品进行该方法的另外步骤。如果Aβ40和/或Aβ42为待测定的，则必须采用逐渐增加的浓度来制备每种肽的标准曲线。该标准曲线实现两个目的：(i)确定信号随靶肽的浓度线性增加的浓度范围和(ii)通过在曲线中内推用测试样品获得的信号获得浓度值，来确定肽的浓度。鉴于本发明所述分析法的高灵敏度，优选的测试样品浓度为例如3.125；6.25；12.5；25；50；100和200pg/mL。应意识到，用于获得标准曲线的样品的浓度将随每种测试底物而变化。但是，技术人员可通过常规手段容易地确定分析的线性范围。由于与具有散发性AD的患者血清相比，Aβ42和Aβ40肽在CSF样品中以及在具有家族形式AD的患者血清样品中具有较高的量，因此优选地，如果本发明的试剂盒被用于确定CSF或来自患有家族性AD的患者血清样品中的Aβ肽，则这些样品应被稀释，以便Aβ40/Aβ42的最终浓度范围落入所述分析的线性边线(linear side)内。

以下的实施例用来解释说明，而不应被认为是限制本发明的范围。

实施例

实施例1

具有生物素-链霉抗生物素放大的比色ELISA夹心法

为了增加灵敏度，可以采用生物素-链霉抗生物素来放大信号。采用识别淀粉样Aβ40和淀粉样Aβ42肽的第1-17位氨基酸的6E10mAb捕获抗体包被板。在溶于100mM pH＝9.6的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中的5μg/ml浓度下于4℃过夜进行所述包被。然后用300μl的封闭液(50mM Tris-HCl，pH 8，0,2％ Tween-20，0,5％BSA)室温下摇动封闭板3h或37℃下封闭板2h。需要时，在封闭后，可用100μl含20mg/ml海藻糖的50mM Tris-HCl溶液(pH 8)处理板。使板蒸发至海藻糖特征性的白色晕圈出现。这样处理的板可在4℃下以铝箔覆盖保存，可稳定2年。

在6E10mAb包被并经海藻糖处理的板上从肽Aβ40y Aβ42的200pg/ml储备液制备标准曲线样品。由这些溶液在SDB中进行1∶2的连续稀释，以便产生200、100、50、25、12.5、6.25和3.125pg/ml的浓度。将100μl的每种稀释或未稀释的样品稀释或不稀释地添加在SDB中(1/1.000.000)并在4℃孵育过夜(或37℃2h)。

将检测抗体(针对对应Aβ42肽的C-末端区的肽制备的多克隆抗体，或针对对应Aβ40肽的C-末端区的肽制备的多克隆抗体，这取决于检测Aβ42还是Aβ40)在SDB中稀释。取100μl添加至各孔中并室温孵育1h。

接着，加入100μl在SDB中以1/5000稀释的生物素标记的抗兔IgG抗体(SIGMA)，并在室温下摇动孵育1h。然后向每孔中加入100μl在SDB中以1/4000稀释的HRP偶联的链霉抗生物素(来自SIGMA)，并室温孵育1h。

为了让板显色，加入100μl的生色底物TMB(ZEU Inmunotec)并避光孵育15-30分钟。向每孔加入作为终止液的50μl 1N H2SO4。在酶标仪Synergy HT(BioTek Instruments)上读取450nm处的吸光度。

各个步骤之间，采用自动洗板仪(Elx50 Bio Tek Instruments)洗涤板，设定为每次进行5遍清洗。洗涤溶液含有50mM de Tris-HCl pH 8，0,05％ Tween-20和150mM NaCl(使用前过滤)。

实施例2

荧光ELISA夹心测定法

将板用溶于碳酸氢盐缓冲液中的6E10(5μg/ml)于4℃包被过夜。然后在室温下摇动封闭板3h(300μl/孔)。接着向板添加测试和标准曲线样品，并于4℃孵育过夜。向每孔加入检测抗体(抗Aβ40或抗Aβ42血清)的1/4000稀释液，并在室温下摇动孵育1h。添加FITC偶联抗抗体(1/1000，1/5000，1/10000稀释)的连续稀释液，室温下避光孵育1h。采用485nm的激发波长产生荧光，发射波长为528。

可选择地，可以采用Quanta-Blu(PIERCE)荧光底物进行该测定，这提高了ELISA测定的灵敏度。最大激发波长为325nm，最大发射波长为420nm。可在315-340nm激发范围和370-470nm发射范围内检测。通过将9份QuantaBlu底物溶液与1份QuantaBlu稳定过氧化物酶溶液混合制备QuantaBlu工作溶液(溶液室温下稳定24小时)。可在室温下孵育1.5分钟至90分钟，并且可在终止反应或不终止情况下读数(产生蓝色)。

将板用溶于碳酸氢盐缓冲液(5μg/ml)中的6E10mAb于4℃包被过夜，然后在室温下摇动封闭3h(300μl/孔)。用以下浓度的Aβ42和Aβ40肽制备不同标准曲线：

·1000，500，250，125，62.5，31.25和15.65pg/mL

·200，100，50，25，12.5，6.25和3.125pg/mL

·25，12.5，6.25，3.125，1.56，0.78和0.39pg/mL

·10，5，2.5，1.25，0.625，0.3125和0.156pg/mL

·5，2.5，1.25，0.625，0.3125，0.156和0.078pg/mL

·1，0.5，0.25，0.125，0.0625，0.03125和0.0156pg/mL

加入(1/4000稀释的)检测抗体(抗Aβ40或抗Aβ42血清)于室温下摇动1h。然后添加HRP偶联的抗兔IgG的1/1000稀释液，在室温下摇动孵育1h。为了使反应显色，添加100μl的Quanta-Blue工作溶液，接着在室温下避光孵育30’、60’和90’。然后在不终止反应或以STOP溶液终止反应情况下读取30’、60’和90’时的荧光(激发：360/40nm；发射：460/40nm)。

实施例3

制备Aβ40和Aβ42标准曲线

为了制备Aβ40标准曲线，将人Aβ40的冻干样品重溶至10μg/mL。由该储备液制备含有以下浓度(pg/mL)的样品：25,000pg/ml、2,500pg/ml、25pg/ml、12.5pg/ml、6.25pg/ml、3.125pg/ml、1.56pg/ml、0.78pg/ml。在1mM蛋白酶抑制剂AEBSF存在下制备样品。然后根据前面的实施例中定义的方法处理样品。结果显示在图1中。

为了制备Aβ42标准曲线，将人Aβ42的冻干样品重溶至10μg/mL。由该储备液制备含有以下浓度(pg/mL)的样品：25,000pg/ml、2,500pg/ml、25pg/ml、12.5pg/ml、6.25pg/ml、3.125pg/ml、1.56pg/ml、0.78pg/ml。在1mM蛋白酶抑制剂AEBSF存在下制备样品。然后根据前面的实施例中定义的方法处理样品。结果显示在图2中。

实施例4

AD诊断与Aβ40/Aβ42水平的关联性

采用前文实施例中描述的ELISA夹心测定法，确定来自对照个体队列和来自采用简易精神状态检查(MMSE)评分(分界值为24)诊断为患有AD的患者队列的血浆样品中Aβ40和Aβ42水平。以pg/mL表示的Aβ40和Aβ42浓度显示在表1中。

表1

计算了平均值，结果显示在表2中。

表2

	健康的	AD患者
			Aβ40(pg/mL)	167，70	30，78
Aβ42(pg/mL)	169，75	50，53

Claims (45)

1.测定选自Aβ42、Aβ40及其混合物的靶多肽的试剂盒，其包含：

(i)第一抗体或抗体组合，其识别所述靶多肽，

(ii)第二抗体或抗体组合，其识别与所述第一抗体或抗体组合识别区域不同的所述靶多肽的区域，

(iii)对所述第二抗体显示出亲和性的试剂，其被偶联至结合对的第一成员，以及

(iv)结合对的第二成员，其被偶联至可检测标签。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述第一抗体或抗体组合识别Aβ40和/或Aβ42中不同于C-末端区的区域。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述第一抗体识别所述Aβ42和Aβ40肽的N-末端区。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其中所述第一抗体针对位于Aβ40和Aβ42的第1至16位氨基酸内的表位。

5.如权利要求1至4中任一项所述的试剂盒，其中所述第一抗体为单克隆抗体。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其中所述单克隆抗体为6E10mAb。

7.如权利要求1至6中任一项所述的试剂盒，其中所述第二抗体选自：

(i).针对对应所述Aβ42肽的C-末端区的肽制备的多克隆抗体，其特异结合Aβ42而不与Aβ40产生任何明显的交叉反应，

(ii).针对对应所述Aβ40肽的C-末端区的肽制备的多克隆抗体，其特异结合Aβ40而不与Aβ42产生任何明显的交叉反应，

(iii).同时识别Aβ40和Aβ42的C末端区的抗体，以及

(iv).(i)和(ii)中所述抗体的组合。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其中用于制备所述第二抗体的所述Aβ42肽的C-末端区为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的肽。

9.如权利要求7所述的试剂盒，其中用于制备所述第二抗体的所述Aβ40肽的C-末端区为SEQ ID NO：3的肽。

10.如权利要求1至9中任一项所述的试剂盒，其中所述第一和/或第二抗体或抗体组合已采用包含用于制备它们的所述多肽的序列的多肽亲和纯化。

11.如权利要求1至10中任一项所述的试剂盒，其中对所述第二抗体显示出亲和性的所述试剂选自抗IgG抗体、蛋白A或蛋白G或其功能上的等同变体。

12.如权利要求1至11中任一项所述的试剂盒，其中所述结合对的第一成员为生物素。

13.如权利要求12所述的试剂盒，其中所述结合对的第二成员为抗生物素蛋白、链霉抗生物素或其功能上的等同变体。

14.如权利要求1至13中任一项所述的试剂盒，其中所述可检测标签选自：

(i)酶，

(ii)荧光分子。

15.如权利要求1至14中任一项所述的试剂盒，还包含固体支持物。

16.如权利要求15所述的试剂盒，其中所述抗体或抗体组合之一被预先结合至所述固体支持物。

17.如权利要求16所述的试剂盒，其中所述第一抗体被预先结合至所述固体支持物。

18.如权利要求17所述的试剂盒，其被浓缩的海藻糖溶液处理过并经过干燥。

19.如权利要求1至18中任一项所述的试剂盒，还包括含有Aβ40和/或Aβ42肽的样品。

20.如权利要求14所述的试剂盒，其中，如果所述可检测标签为酶，则所述试剂盒还包含能被所述酶转化为可检测产物的底物。

21.权利要求1至20中任一项所述的试剂盒确定或测定样品中多肽的用途，其中所述待确定或测定的靶多肽选自Aβ40、Aβ42或其混合物。

22.如权利要求21所述的用途，其中所述样品选自血液、血浆、血清或CSF。

23.权利要求1至20所述的试剂盒用于诊断个体中退行性病症的用途。

24.如权利要求23所述的用途，其中所述退行性病症为神经退行性病症。

25.如权利要求24所述的用途，其中所述神经退行性病症为阿尔茨海默病。

26.用于确定或测定样品中选自Aβ42、Aβ40及其混合物的靶多肽的量的方法，包括以下步骤：

(i)用特异结合所述靶多肽的第一抗体或抗体组合捕获存在于所述样品中的所述靶多肽，

(ii)将步骤(a)中形成的免疫复合物与第二抗体或抗体组合接触，所述第二抗体或抗体组合识别与所述第一抗体或抗体组合识别的区域不同的所述靶多肽的区域，

(iii)将步骤(ii)中形成的复合物与对所述第二抗体显示出亲和性并被偶联至结合对的第一成员的试剂接触，

(iv)将步骤(iii)中形成的复合物与偶联至可检测标签的结合对的第二成员接触，以及

(v)测定或确定连接至所述结合对的第二成员的可检测标签的活性或量。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述第一抗体识别Aβ40和Aβ42共有的区域，其不同于C-末端区。

28.如权利要求27所述的方法，其中所述第一抗体识别所述Aβ42和Aβ40肽的N-末端区。

29.如权利要求26至28中任一项所述的方法，其中所述第一抗体针对位于Aβ40和Aβ40的第1至16位氨基酸内的表位。

30.如权利要求26至29中任一项所述的方法，其中所述第一抗体为单克隆抗体。

31.如权利要求30所述的方法，其中所述单克隆捕获抗体为6E10mAb。

32.如权利要求26至31中任一项所述的方法，其中所述第二抗体选自：

(i).针对对应所述Aβ42肽的C-末端区的肽制备的多克隆抗体，其特异结合Aβ42而不与Aβ40产生任何明显的交叉反应，

(ii).针对对应所述Aβ40肽的C-末端区的肽制备的多克隆抗体，其特异结合Aβ40而不与Aβ42产生任何明显的交叉反应，

(iii).同时识别Aβ40和Aβ42的C末端区的抗体，以及

(iv).(i)和(ii)中所述抗体的组合。

33.如权利要求32所述的方法，其中用于制备所述第二抗体的所述Aβ42肽的C-末端区为选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2的肽。

34.如权利要求32所述的方法，其中用于制备所述第二抗体的所述Aβ40肽的C-末端区为选自SEQ ID NO：3的肽。

35.如权利要求26至34中任一项所述的方法，其中所述第一和/或第二抗体已采用包含用于制备它们的所述多肽的序列的多肽亲和纯化。

36.如权利要求26至35中任一项所述的方法，其中对所述第二抗体显示出亲和性的所述试剂选自抗IgG抗体、蛋白A或蛋白G或其功能上的等同变体。

37.如权利要求26至36中任一项所述的方法，其中所述结合对的第一成员为生物素。

38.如权利要求37所述的方法，其中所述结合对的第二成员为抗生物素蛋白、链霉抗生物素或其功能上的等同变体。

39.如权利要求26至38中任一项所述的方法，其中所述可检测标签选自：

(i)酶，

(ii)荧光分子。

40.如权利要求26至39中任一项所述的方法，其中所述生物样品选自血液、血清、血浆和CSF。

41.如权利要求26至40中任一项所述的方法，其中所述第一抗体已被预先固定在固体支持物中。

42.诊断个体中退行性病症的方法，包括采用权利要求26至40中任一项所述的方法确定患者样品中Aβ40或Aβ42的量，并参照健康个体样品中一种或两种肽的浓度将所述患者样品中所述一种或两种肽的浓度与所述退行性病症的出现相关联。

43.如权利要求42所述的方法，其中所述退行性病症为神经退行性病症。

44.如权利要求43所述的方法，其中所述神经退行性病症为阿尔茨海默病，并且其中如果所述样品中Aβ40和/或Aβ42的量低于从健康个体获得的相同来源的生物学样品中所述一种或两种肽的量，则表明所述个体患有阿尔茨海默病。

45.如权利要求42至44中任一项所述的方法，其中所述样品为血浆或血清样品，在所述样品中，所述Aβ40和/或Aβ42待检测。

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