JP2016017801A - アルツハイマー型認知症に移行する危険性のある軽度認知障害を検出する方法及びそのためのキット - Google Patents

Abstract

【課題】侵襲性のより小さい方法で採取したサンプルにおいて、アルツハイマー型認知症に移行する危険性のある軽度認知障害を検出する方法及びそのためのキットの提供すること。
【解決手段】本発明は、対象者の血液サンプルにおいて銅イオン結合性アルブミン又は銅イオン非結合性アルブミンを定量することを特徴とする、アルツハイマー型認知症に移行する危険性のある軽度認知障害を検出する方法を提供する。本発明はまた、銅イオン結合性アルブミン又は銅イオン非結合性アルブミンを定量する手段を含んでなり、測定対象サンプルが血液サンプルであることを特徴とする、アルツハイマー型認知症に移行する危険性のある軽度認知障害の検出用キットを提供する。
【選択図】図１

Description

本発明は、アルツハイマー型認知症に移行する危険性のある軽度認知障害を検出する方法及びそのためのキットに関する。より具体的には、本発明は、対象者の血液サンプル中の遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンを定量することを特徴とする、アルツハイマー型認知症に移行する危険性のある軽度認知障害を検出する方法及びそのためのキットに関する。

アルツハイマー型認知症は、人口の高齢化に伴い、罹患率が高くなると予想されており、その有効な治療法の開発は急務であるが、現在治験段階にある候補薬は有望な効果が見出せていない。なぜなら、発症後からの治療介入では遅すぎる為である。

軽度認知障害は、認知症の前臨床期(前駆状態)として知られており、軽度認知障害からアルツハイマー型認知症へ進行する患者は、年間約15％といわれている。そして、軽度認知障害患者のうち、画像診断等によりアミロイドβ蛋白(Ａβ)の脳内集積が認められる者は、将来アルツハイマー型認知症に移行する危険性が高いと考えられている。
したがって、脳内Ａβ集積を伴う軽度認知障害を検出できれば、アルツハイマー型認知症の前段階をより的確に診断でき、その結果、早期の治療介入が可能になり、延いては発症を遅延させ又は症状を軽減させることが可能になると考えられる。
しかしながら、従来、脳内Ａβ集積の検出は、特定の薬剤を用いる画像診断(例えば、ピッツバーグ大学により開発されたＡβ凝集体を描写する薬剤「PiB」を用いるPiB-PET)を必要とし、よって大型で高価な装置が必要であり、費用も非常に高額である。また、髄液検査は、サンプル採取時の侵襲性が大きく、患者の心理的及び身体的負担が大きい。いずれもスクリーニングには適さず、また日常的に簡単に行えるものでない。

よって、侵襲性のより小さい方法で採取したサンプルを検査することにより、アルツハイマー型認知症に移行する危険性のある軽度認知障害を検出できる方法及びそのためのキットの開発が切望されていた。

本発明者らは、PiB-PET診断により脳内Ａβ集積が認められた軽度認知障害患者及びアルツハイマー型認知症患者の血液中で遷移金属イオンに結合性を示すアルブミンの量が、非認知症被検者に比べて低下していることを見い出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、対象者の血液サンプルにおいて遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンを定量することを特徴とする、アルツハイマー型認知症に移行する危険性のある軽度認知障害を検出する方法である。
本発明はまた、遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンを定量する手段を含んでなり、測定対象サンプルが血液サンプルであることを特徴とする、アルツハイマー型認知症に移行する危険性のある軽度認知障害の検出用キットである。

本発明の方法及びキットによれば、アルツハイマー型認知症に移行する危険性のある軽度認知障害を簡便及び/又は安価に検出できる。

本発明の一形態における遷移金属イオン結合性アルブミンの測定原理を説明する図である。 血液中の銅イオン結合性アルブミン及び銅イオン非結合性アルブミンの存在を示すカラムクロマトグラフである。 実施例における測定値を示す散布図である。 実施例における測定データを説明する統計学的グラフ(箱ひげ図)である。

＜アルツハイマー型認知症に移行する危険性のある軽度認知障害の検出法＞
本発明の検出法は、対象者の血液サンプルにおいて遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンを定量することを特徴とする。
「対象者」は、ヒト及び非ヒト哺乳動物を含むが、好ましくはヒトである。特定の実施形態において、対象者は、軽度認知障害を疑わせる症状(軽い物忘れなど)を示している患者であり得る。別の特定の実施形態において、対象者は、記憶障害を有する患者であり得、より具体的には、神経心理学的診断により(健忘型)軽度認知障害と診断された患者であり得る。
「血液サンプル」は、全血サンプル、血清サンプル又は血漿サンプルである。
「アルブミン」は、本発明に関しては、血清アルブミンをいう。本発明においては、単に「アルブミン」と表記したときは、文脈上そうでないことが明らかな場合を除き、遷移金属イオン結合性アルブミン及び遷移金属イオン非結合性アルブミンの両方を含む通常の意味でのアルブミンを意図するものとする。
「遷移金属イオン」は、本発明に関しては、アルブミンに結合し得る遷移金属のイオン、特に二価イオンをいう。遷移金属としては、特に、銅、ニッケル、亜鉛、鉄、コバルトが挙げられる。遷移金属イオンは、好ましくは銅イオン(II)、ニッケルイオン(II)及び亜鉛イオン(II)から選択され、より好ましくは銅イオン(II)又は亜鉛イオン(II)であり、特に好ましくは銅イオン(II)である。

血液サンプル中の遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンの定量は、イムノアッセイ、電気泳動法、クロマトグラフィー、色素結合法、質量分析法及びこれらの組合せなど種々の方法により行うことができる。
遷移金属イオン結合性アルブミンは、遷移金属イオンに結合した形態(遷移金属イオン-アルブミン複合体)で定量してもよい。

定量は、測定対象の遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンを、それぞれ、非測定対象の遷移金属イオン非結合性アルブミン又は遷移金属イオン結合性アルブミンと空間的に分離した状態で行うことが好ましい。
上記分離又は非測定対象のアルブミンの除去は、電気泳動法(例えば等電点電気泳動法)や、測定対象のアルブミンを固相に不動化することにより達成できる。
測定対象のアルブミンの不動化は、例えば、該アルブミンに結合可能な物質が固定された固相(支持体)を用いて行うことができる。より具体的には、例えば、遷移金属イオン結合性アルブミンは、遷移金属イオンを固定した支持体を用いて不動化し得る。
遷移金属イオン非結合性アルブミンと遷移金属イオン結合性アルブミンとは、例えば、遷移金属イオンの存在下に等電点電気泳動法を行うことで、遷移金属イオンに結合していないアルブミンと遷移金属イオンに結合したアルブミンとの間の等電点の差に基いて分離することができる。或いは、遷移金属イオンを固定した固相上を通過させることにより、通過画分と吸着画分(又は溶出画分)として分離可能である。

定量に際して、非測定対象のアルブミンが測定対象のアルブミンと位置的に分離されている場合(非測定対象のアルブミンが測定系から除去されている場合も含む)には、測定対象のアルブミンの定量に、遷移金属イオン結合性アルブミン及び遷移金属イオン非結合性アルブミンの両方を区別することなく定量する方法を使用しても差し支えない。
例えば、遷移金属イオン非結合性アルブミンは、遷移金属イオン固定化固相を充填したカラムを通過させることなどによりサンプル中から遷移金属イオン結合性アルブミンを吸着・除去した後であれば、アルブミン一般についての定量法を用いて定量可能である。

不動化されたか又は分離された測定対象のアルブミンの定量は、当該分野において公知のアルブミン定量法により行うことができる。
例えば、色素結合法では、アルブミンと反応して発色するか又は色調が変化する試剤を使用する。このような試剤としては、例えば、ブロムクレゾールグリーン(BCG)やブロムクレゾールパープル(BCP)が挙げられる。

イムノアッセイでは、アルブミンに対する抗体(抗アルブミン抗体)を使用する。
本発明において、「抗体」とは、完全抗体及びその抗原結合部位を有するフラグメント(単鎖抗体(scFv)、Fab抗体、F(ab')₂抗体、Fab'抗体を含む)をいう。抗体は、既知の抗体であってもよいし、新たに作製された抗体であってもよい。抗体は、モノクローナルであってもポリクローナルであってもよい。使用する抗アルブミン抗体は、アルブミン(特に対象者由来のアルブミン、すなわち対象者がヒトである場合にはヒト由来アルブミン)に特異的に結合することが好ましいが、定量系における当該物質の検出に影響を与えない限り、交差反応性は許容され得る。

特定の蛋白又はペプチドに結合する抗体を作製する方法は、当該分野において公知である。簡潔には、そのような抗体は、当該蛋白又はペプチドを、単独で又は適切なキャリア(例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、ジフテリア毒素、破傷風毒素)に結合させて、必要に応じてアジュバント(例えば、完全若しくは不完全フロイントアジュバント、水酸化アルミニウム又はリン酸化アルミニウム(ミョウバン))と共に、１回又はそれ以上(皮下、静脈内、腹腔内などに)投与した動物(例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ラクダ、ニワトリ、ダチョウなど抗体産生に使用できる動物)の血清から、例えばアフィニティークロマトグラフィーのような精製法を用いて精製することにより(例えば、免疫グロブリン画分又は精製抗体として)取得することができる。精製することなく、全血清(抗血清)をそのまま用いてもよい。

モノクローナル抗体を作製する方法もまた当該分野において公知である(例えば、Kohler and Milstein(Nature, 256:495-497, 1975；Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane編, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)。簡潔には、当該蛋白又はペプチドで免疫した動物の脾臓細胞(Ｂ細胞)を、細胞融合法により適切な骨髄腫細胞と融合して不死化細胞(ハイブリドーマ)を作製し、所望の結合能を有する抗体を産生するハイブリドーマを選択する。このハイブリドーマを、インビトロ又はインビボ(例えば、マウス腹腔内)で増殖させて産生抗体を取得してもよい。

抗アルブミン抗体は、対象哺乳動物のアルブミンを認識する一方で、(例えばブロッキング剤などの他の試剤中に含まれ得る)その他の哺乳動物のアルブミンを認識しないことが好ましい。より好ましくは、抗アルブミン抗体は、ヒトアルブミンを認識するが、ウシ、ウサギ、ヤギ及び/又はヒツジのアルブミンを認識しない抗体である。このような抗ヒトアルブミン抗体は、標識又は非標識の抗ヒト血清アルブミン-マウスモノクローナル抗体又は抗ヒト血清アルブミン-ウサギ(ヤギ、ヒツジなど)ポリクローナル抗体若しくは血清として国内外の供給業者から入手可能であり、又は上記の方法で容易に作製することができる。

抗体は、検出可能な標識が付されていることが好ましい。抗体の標識は、当該分野で公知であり、使用する検出手段に応じて適宜選択できる。例えば、標識には、酵素、放射性同位体、蛍光物質、発色物質、発光物質などが使用できる。酵素としては、例えばペルオキシダーゼ(特にHRP)、β-ガラクトシダーゼ、ホスファターゼ(特にアルカリホスファターゼ)、ルシフェラーゼ、グルコースオキシダーゼ、β-グルコシダーゼ、β-グルクロニダーゼなどが挙げられる。放射性同位体としては、例えば、³Ｈ、¹⁴Ｃ、³²Ｐ、³⁵Ｓ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉが挙げられる。蛍光色素としては、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミン、Cy2、Cy3などが挙げられる。発色物質としては、3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)などが挙げられる。発光物質としては、ルミノール、ルシフェリンなどが挙げられる。

不動化されたアルブミンはまた、アルブミンに特異的に結合し得るアプタマー又はペプチドを用いて定量することも可能である。
アプタマーは、特定の標的を認識する一本鎖核酸(DNA、RNA又は核酸アナログ(例えばLNA))である。特定の標的に特異的に結合し得るアプタマーを作製する方法は、当該分野において公知である。簡潔には、ランダムな塩基配列(例えば30〜150塩基)を有する核酸群を作製し、この中から対象の標的を特異的に認識するものを、例えばSELEX法などのスクリーニング法により選定する。

アルブミンに特異的に結合し得るペプチドは、例えば、WO96/14416[特表平10-509311号公報]やWO2009/016043[特表2010-534486号公報]に記載のような細菌由来のアルブミン結合性ドメインを含むものや、WO2008/096158[特表2010-518062号公報]に記載のような抗アルブミン抗体由来の可変ドメインを含むものである。
アルブミンに特異的に結合し得るアプタマー又はペプチドは、検出可能な標識が付されていることが好ましい。例えば、標識には、上記のような放射性同位体、蛍光物質、発色物質、化学発光物質などが用いられる。核酸標識法は当該分野で公知である。

標識からのシグナルの測定は、分光光度計、蛍光光度計、CCDカメラ、CMOSカメラ、フォトダイオード、光電子増倍管などから適宜選択したものを、必要に応じて光源及び/又はフィルターと共に使用して行うことができる。

定量を、上記のような色素結合法、イムノアッセイ、アプタマーを用いる方法などにより行う場合、特に、当該方法を実施するためのキット(後述)を用いて行う場合には、簡便かつ安価で、比較的迅速な検出が可能になる。このため、本発明の方法は、臨床検査用の設備・機器の充実した病院のような大規模な医療機関や検査機関のみならず、診療所や医院などの小規模の医療機関においても比較的容易に実施できる。とりわけ、遷移金属イオン結合性アルブミンを、遷移金属イオンと抗アルブミン抗体とを用いて定量する場合には、高価な試剤を必要としないので特に安価に実施でき、定期的な(継続的な)血液検査での使用が可能となる。

後述する実験・実施例から明らかなように、脳内Ａβ集積を伴う軽度認知障害患者及びアルツハイマー型認知症患者からの血液サンプル中の遷移金属イオン結合性アルブミン量は、非認知障害患者の血液サンプル中の量より有意に低い一方、血液サンプル中の総アルブミン量は３群間で有意差はない。よって、血液サンプル中の遷移金属イオン結合性アルブミン量又は遷移金属イオン非結合性アルブミン量は、アルツハイマー型認知症及び/又はアルツハイマー型認知症に移行する危険性のある軽度認知障害の検出用指標として有用である。

具体的には、本発明の方法は、例えば下記のように実施する。
本具体的実施形態では、血液サンプル中の遷移金属イオン結合性アルブミンを不動化するために、遷移金属イオンが固定された支持体を用いる。
血液サンプルは、予め、希釈剤(例えば緩衝液)で希釈してもよい。緩衝液は、当該分野において公知のものから適宜選択するが、例えば、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸-クエン酸緩衝液、炭酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、酢酸緩衝液などである。緩衝液は、必要に応じて、NaCl、界面活性剤(例えば、Tween 20、Triton X-100)及び/又は防腐剤(例えば、アジ化ナトリウム)を含んでいてもよい。緩衝液の具体例は、PBS、PBS-T、TBS又はTBS-Tである。
希釈は、総アルブミン量に対する遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンの量(比)を測定するため、総アルブミン量が所定値となるように行なってもよい。

血液サンプルを支持体と、該サンプル中の遷移金属イオン結合性アルブミンが支持体上の遷移金属イオンと結合するに適切な条件(例えば、温度：20℃〜40℃、より好ましくは25〜38℃；時間：５〜120分間、より好ましくは10〜90分間、より好ましくは30〜60分間)下に接触させる(インキュベーション；図１Ａ)。インキュベーションの間に、サンプル中の遷移金属イオン結合性アルブミンは支持体上の遷移金属イオンと結合する一方、遷移金属イオン非結合性アルブミンは結合できない(図１Ｂ)。

インキュベーション後、支持体上に不動化されなかった物質(遷移金属イオン非結合性アルブミンを含む)を除去するために、洗浄液(例えば、上記のような緩衝液)で、支持体を１回以上洗浄する。
この時点で、サンプル中の遷移金属イオン非結合性アルブミンは除去され、遷移金属イオン結合性アルブミンのみが支持体上に不動化される(図１Ｃ)。よって、支持体上に不動化されたアルブミンの量は、血液サンプル中の遷移金属イオン結合性アルブミンの量を反映する。

支持体上に不動化されたアルブミンは、BCG法、BCP法、BCP改良法のような色素結合法を用いて定量することができる。

或いは、支持体上に不動化されたアルブミンは、イムノアッセイにより、例えば下記のように定量することができる。
標識抗アルブミン抗体を(遷移金属イオン結合性アルブミンが不動化された)支持体と、抗アルブミン抗体とアルブミンとの結合に適切な条件(例えば、温度：20℃〜40℃、より好ましくは25〜38℃；時間：５〜120分間、より好ましくは10〜60分間)下に接触させる(図１Ｄ)。
支持体を洗浄液で１回以上洗浄することにより未結合の抗アルブミン抗体を除去する。
抗アルブミン抗体に付された標識に応じた方法により、標識からのシグナルを定量する。例えば、必要に応じて光源及び/又はフィルターと共に、マイクロプレートリーダーを用いて測光する。

支持体上に不動化されたアルブミンを定量する前、間又は後に、使用する定量方法(遷移金属イオン結合性アルブミンに結合可能な物質)に応じて、ブランク及び標準物質(標準溶液)を用いて標準曲線(検量線)を作成してもよい。

上記の実施形態では、支持体上に不動化した遷移金属イオン結合性アルブミンを色素結合法又はイムノアッセイにより定量する方法について具体的に説明したが、
サンプル中の遷移金属イオン結合性アルブミンは、他の方法(例えばウェスタンブロッティングなど)によっても定量可能であることは言うまでもない。
また、上記のイムノアッセイを用いる形態では、抗アルブミン抗体及び遷移金属イオンを使用する形態を説明したが、遷移金属イオン結合性アルブミン若しくは遷移金属イオン非結合性アルブミンに特異的に結合する抗体や遷移金属イオン-アルブミン複合体に対する抗体が開発されれば、そのような抗体を、抗アルブミン抗体及び/又は遷移金属イオンに代えて使用できることは当業者であれば容易に理解できる。
また、抗アルブミン抗体に代えて、アルブミンに特異的に結合し得るアプタマー又はペプチドを用い得ることは当業者に容易に理解される。

好ましい場合には、測定したアルブミン量と、同一対象者からの別のサンプルにおいて測定した総アルブミン(遷移金属イオン結合性アルブミン＋遷移金属イオン非結合性アルブミン)量とから、当該血液サンプルにおける比(遷移金属イオン結合性アルブミン量又は遷移金属イオン非結合性アルブミン量)/(総アルブミン量)を求める。

対象者の血液サンプル中の遷移金属イオン結合性アルブミンの量若しくは比が所定の閾値を下回っているか又は遷移金属イオン非結合性アルブミンの量若しくは比が所定の閾値を上回っているとき、当該対象者は、アルツハイマー型認知症に移行する危険性のある軽度認知障害である蓋然性が高いと判断できる。
閾値(カットオフ値)は、統計学的に有意な数の、脳内Ａβ集積を伴う軽度認知障害(又は健忘型軽度認知障害)であると確定診断された患者と非認知症被検者とについての測定データに基づいて決定できる。

本発明の方法は、脳内Ａβ集積に関してのより精密な検査(例えば、PiB-PET診断のような画像診断や髄液検査)を必要とする患者を抽出するための(一次)スクリーニング方法として用いることもできる。上記のような精密検査を追加的に行うことで、アルツハイマー型認知症に移行する危険性のある軽度認知障害を、より特異的に検出することができる。
対象者は、本発明の方法による検査の前又は後に、神経心理学的検査により記憶障害について診断されてもよい。
本発明の方法は、小さい侵襲性で実施し得るので、例えば定期健康診断に際して実施することにより、アルツハイマー型認知症予備軍をスクリーニングすることができる。その結果、予防及び/又は発症遅延に向けた取り組みを早期に喚起することが可能になる。

本発明の方法はまた、軽度認知障害(特に健忘型軽度認知障害)と診断された対象者(患者)からの２以上の時点での血液サンプルについて実施して、血液サンプル中の遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンを経時的に定量し比較することにより、アルツハイマー型認知症への移行をモニターする方法としても利用することができる。より後の時点のサンプル中の遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンの量又は比が、より前の時点のサンプル中と比較してそれぞれ減少又は増加しているとき、アルツハイマー型認知症への移行が進行中であると推定でき、逆にそれぞれ増加若しくは減少しているか又は同程度であるとき、移行は少なくとも停止状態にあると推定できる。

経時的な定量は、例えば、５、10、15若しくは20日ごと、１、２若しくは３週間ごと、１、２、３、４、５若しくは６ヶ月ごと、１、２、３、４若しくは５年ごとに行う。
患者が治療を受けている場合には、この方法は、当該治療の有効性を評価するために利用できる。治療は、薬物療法に限られず、例えば食事療法、運動療法のような非薬物療法、及び薬物療法と非薬物療法との組合せを含む。

＜アルツハイマー型認知症に移行する危険性のある軽度認知障害の検出用キット＞
本発明の検出キットは、遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンを定量する手段を含んでなり、測定対象サンプルが血液サンプルであることを特徴とする。
本キットは、上述した本発明の方法の実施に適切である。

遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンを定量する手段は、好ましくは、遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンに結合可能な少なくとも１種の物質である。

遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンに結合可能な物質は、例えば、アルブミンと反応して発色するか又は色調が変化する試剤(例えば、BCGやBCP)、上記のような抗アルブミン抗体、上記のようなアルブミンに特異的に結合し得るアプタマー、上記のようなアルブミンに特異的に結合し得るペプチドであり得、好ましくは抗アルブミン抗体である。
遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンに結合可能な物質は、遷移金属イオンでもあり得る。

遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンに結合可能な物質は、溶液形態で提供されてもよいし、凍結乾燥形態で提供されてもよい。
キットが、支持体(固相)を更に含む場合には、遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンに結合可能な物質は該支持体に固定された状態で提供されてもよい。
遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンに結合可能な物質はまた、必要であれば、上記のような標識が付されていてもよい。或いは、遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンに結合可能な物質は、(ストレプト)アビジン-ビオチンのような結合対の一方のパートナー(例えば、ビオチン)が付着されており、他方のパートナー(例えば、(ストレプト)アビジン)が付着した標識と結合可能にされていてもよい。

キットに含まれる、遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンに結合可能な物質は、好ましくは１種又は２種であり、より好ましくは２種(例えば、遷移金属イオンと抗アルブミン抗体との組合せ)である。

本発明のキットは、好ましくは、上記のような遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンに結合可能な物質が固定された支持体を更に含んでなる。
支持体の形態は、当該分野において公知のものから適宜選択でき、例えば、マイクロタイタープレート、チューブ、キャピラリチューブ、ビーズ、粒子、濾紙、フィルター、膜、ディスク、スティック、ストリップ、スライドグラス、チップなどであり得る。

支持体の材料は、当該分野において公知のものをいずれも使用でき、例えば、ガラス、樹脂(例えば、ポリスチレン、ポリエステル、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリプロピレン、ポリビニルブチレート、ポリ塩化ビニル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、レーヨン)、セルロース及びその誘導体(例えば、ニトロセルロース)などであり得る。
支持体への遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンに結合可能な物質の固定は、物理的吸着、共有結合若しくは非共有結合(イオン結合、静電結合、疎水性相互作用など)のいずれであってもよい。

支持体は非特異的吸着を防止するためにブロッキング処理されていることが好ましい。ブロッキング剤は、当該分野において公知のものをいずれも使用できるが、例えば対象の哺乳動物以外の哺乳動物の血清アルブミン(対象がヒトである場合、例えばウシ血清アルブミン(BSA))、脱脂粉乳、カゼインなどであり得る。
遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンに結合可能な物質が固定され、ブロッキング処理された支持体の表面は、水溶性ポリマー(例えば、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、又はヒドロキシプロピルメチルセルロース及びヒドロキシエチルセルロースのようなセルロースエステル)又は非還元多糖類(例えば、スクロース、トレハロース、ラフィノース)などでコーディングされていてもよい。このようなコーディングにより、支持体上の遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンに結合可能な物質を含む固相は非常に安定化し、長期間の保存に適する。

本発明のキットは、必要に応じて、標識シグナル生成剤(例えば発色剤)及び/又は反応停止液を更に含んでいてもよい。
標識シグナル生成剤は、標識に応じて公知のものから適宜選択できる。例えば、標識がペルオキシダーゼである場合には、TMB、DAB、o-フェニレンジアミン(OPD)、2,2-アジノ-ジ-(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)(ABTS)、10-アセチル-3,7-ジヒドロキシフェノキサジン(ADHP)などであり得、アルカリホスファターゼである場合には、p-ニトロフェニルリン酸(pNPP)、4-メチルウンベリフェリルリン酸(4-MUP)などであり得る。
反応停止液は、例えば、硫酸又は水酸化ナトリウムであり得る。

本発明のキットはまた、標準曲線(検量線)作成用の標準溶液、任意に標準溶液希釈剤を含んでいてもよい。
本発明のキットはまた、洗浄液(例えば、上記のような緩衝液)や、インキュベーションの間に支持体をシールするシーリング材(例えば、支持体がプレートである場合、プレートシール)を含んでいてもよい。
本発明のキットは、上記のように、アルツハイマー型認知症に移行する危険性のある軽度認知障害を検出するための他、軽度認知障害のアルツハイマー型認知症への移行をモニターするため、及び/又はアルツハイマー型認知症への移行を防止又は遅延させる薬剤又は治療法の有効性を評価するためにも使用することができる。

＜予備実験＞
非認知症被検者の血清を10倍希釈したサンプルを、銅イオン固定化固相を充填したアフィニティカラム(Hitrap IMAC HP)に流し、先ず通過画分を回収し、次いでグラジエント(20〜500mMイミダゾール)下で溶出画分を回収した。図２にクロマトグラムを示す。
電気泳動及びCBB染色により、通過画分(銅イオンに結合しない画分)及び溶出画分(銅イオンに結合する画分)の両方ともが、分子量66kDaのアルブミンを含んでいることが確認された。このことから、血清アルブミンには、銅イオンに結合できるものと結合できないものが存在すると理解できる。

ところで、最近、血中Ａβ量の減少に伴い脳内Ａβが血中に引き抜かれるという「引き抜き」仮説が提唱されている。この仮説に基づけば、血中Ａβ量は脳内Ａβ量を反映していると考えられる。また、血液中のＡβ蛋白は約90％がアルブミンと結合しているとの報告がある(Biere, A. L.ら，J. Biol. Chem., 1996, 271(51): 32916-32922)。そして、アルブミンには、Ａβ結合性のものとＡβ非結合性のものが存在することが最近明らかとなった(特開2014-13190号公報)。

一方、銅イオン、亜鉛イオン、鉄イオンなどの遷移金属は、Ａβ蛋白に結合し、アルツハイマー型認知症における脳内Ａβ集積(老人斑の形成)に関与していることも報告されている(例えば、J. Neurol. Sci., 1998, 158: 47-52；Chembiochem., 2009, 10(18): 2837-2845；Brit. . Phamacol., 2011, 163: 211-219；Metallomics., 2011, 3(2): 250-261)。加えて、銅イオン、亜鉛イオン及び鉄イオンを含む種々の遷移金属イオンがアルブミンに結合することが知られている(例えば、Prog. Food Nutr. Sci., 1987, 11(3-4): 363-400；Biochm. Soc. Trans., 2008, 36(Pt 6); 1317-21)。
したがって、Ａβ-アルブミン複合体の形成には、銅イオンのような遷移金属イオンの存在が必要であると考えられる。

このことを上記予備実験の結果を併せて考えると、アルツハイマー型認知症患者は、非認知症被検者と比べて、血中における遷移金属イオン非結合性アルブミンの割合が高い(換言すれば、遷移金属イオン結合性アルブミンの割合が低い)ことに起因して、脳内Ａβを血中に引き抜く能力が低下しており、そのため脳内にＡβが集積するという仮説が立てられる。
この仮説に基づけば、血中の遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンの量が脳内Ａβ集積を反映しており、血中の遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンの量を測定することで、脳内Ａβ集積を伴う軽度認知障害及びアルツハイマー型認知症の検出が可能であると考えられたので、以下で検証した。

＜実施例＞
いずれもインフォームドコンセントが得られた14例の非認知症(NC)被検者、22例の脳内Ａβ集積が認められる軽度認知障害(MCI)患者及び26例のアルツハイマー型認知症(AD)患者から血清を採取した。MCI及びADの確定診断は神経心理学的診断及び画像診断(PiB-PET；脳内Ａβ集積について)、その他認知症を来す疾患の除外診断によった。

採取したサンプルを３つに小分けして、１つを総アルブミン濃度の測定に、２つを銅イオン結合性アルブミンの定量に使用した。
BCP改良法で測定した総アルブミン濃度は、NC被検者群で4.24±0.38mg/dl、MCI患者群で4.16±0.29mg/dl、AD患者群で4.15±0.30mg/dlであり、各群間で有意差はなかった。

一方、銅イオン結合性アルブミンの定量のために、個々の血清サンプルをトリス緩衝液で300倍に希釈した。
この希釈溶液を、銅イオンを固定した96穴マイクロプレート(Thermo Fisher Scientific Inc.)にウェルあたり100μl投入し、37℃で１時間保温した。その後、未結合のものを洗い流すため、トリス緩衝液/Tween 20にて４回洗浄し、30000倍希釈の抗ヒトアルブミンポリクローナルHRP結合抗体を投入し、37℃で１時間インキュベートした。再度、未結合のものを洗い流すため、トリス緩衝液/Tween 20にて４回洗浄した。

その後、TMB/H₂O₂溶液を各ウェルに投入して発色反応を開始させ、15分後にTMB stop solutionを添加して発色反応を停止させた。
マイクロプレートリーダーにて450nmのフィルターを用いて0.1秒間測光して、吸光度を求めた。
結果を、図３及び４に示す。図３は散布図であり、図４は箱ひげ図である。結果は、同一サンプルについて独立して行った２回の測定データの平均として示す。
独立した２群のｔ検定により、MCI患者群とNC被検者群との間及びAD患者群とNC患者群との間で銅イオン結合性アルブミンの血中量の差は95％の信頼区間で有意であった(いずれもp<0.001)。
したがって、銅イオン結合性アルブミンの血中量は、MCI及びADの検出に利用できることが判明した。
また、各群間で総アルブミン量に差がなかったことから、MCI患者群及びAD患者群においては、銅イオン結合性アルブミン量の減少量に応じて、銅イオン非結合性アルブミン量が増加したものと考えられる。よって、銅イオン非結合性アルブミンの血中量も、MCI及びADの検出に利用可能であると考えられる。

上記の実施形態及び実施例は、本発明の理解を容易にするために例示として記載されたものであって、本発明は本明細書又は添付図面に記載された具体的形態及び例のみに限定されるものではない。本明細書に記載された具体的な構成、手段及び方法は、本発明の要旨を逸脱することなく、当該分野において公知の他の多くのものと置換可能である。

Claims (10)

1. 対象者の血液サンプルにおいて遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンを定量することを特徴とする、アルツハイマー型認知症に移行する危険性のある軽度認知障害を検出する方法。
2. 前記定量が、遷移金属イオンに結合した遷移金属イオン結合性アルブミンを定量することにより行われる請求項１に記載の方法。
3. 前記定量が、遷移金属イオンを介して支持体上に不動化された遷移金属イオン結合性アルブミンを定量することにより行われる請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記遷移金属イオンが銅イオン又は亜鉛イオンである請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記遷移金属イオンが銅イオンである請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンを定量する手段を含んでなり、測定対象サンプルが血液サンプルであることを特徴とする、アルツハイマー型認知症に移行する危険性のある軽度認知障害の検出用キット。
7. 前記遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンを定量する手段が、遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンに結合可能な少なくとも１種の物質である請求項６に記載のキット。
8. 支持体を更に含み、該支持体に前記遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンに結合可能な少なくとも１種の物質が固定されている請求項７に記載のキット。
9. 前記遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンに結合可能な少なくとも１種の物質が抗アルブミン抗体である請求項７又は８に記載のキット。
10. 前記遷移金属イオン結合性アルブミンに結合可能な少なくとも１種の物質が遷移金属イオンである請求項７〜９のいずれか１項に記載のキット。