CN102192985A

CN102192985A - 一种人体β淀粉样蛋白试剂盒

Info

Publication number: CN102192985A
Application number: CN2010101275770A
Authority: CN
Inventors: 秦俭
Original assignee: SHANGHAI EXCELL BIOLOGY PRODUCT CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI EXCELL BIOLOGY PRODUCT CO Ltd
Priority date: 2010-03-18
Filing date: 2010-03-18
Publication date: 2011-09-21

Abstract

本发明涉及一种人体β淀粉样蛋白试剂盒，该试剂盒包括抗体包被板条、标准品、浓缩生物素化抗体、浓缩酶结合物、试剂稀释液、浓缩洗涤液、显色剂及终止液。与现有技术相比，本发明的抗体包被板条制备方法采用两步法、室温振荡的反应模式，此方法具有操作简便，反应快捷，对实验室条件及设备要求不高，易于掌握和推广，检测范围较广，灵敏度较高，本发明的工艺、技术、质量及使用效果都达到了国内外领先的水平。

Description

一种人体β淀粉样蛋白试剂盒

技术领域

本发明涉及一种试剂盒，尤其是涉及一种人体β淀粉样蛋白试剂盒。

背景技术

人口老龄化是当今世界各国面临的重大社会问题，已经引起国际社会的广泛关注。据有关方面统计，我国北京、上海等大城市已迈入了老龄城市，下个世纪前半期我国就将进入老龄社会，老年人的心理及身体健康问题已提上了议事日程。人口老龄化一方面是我国经济和社会发展、人民生活水平提高、医疗卫生条件改善的结果，是社会文明进步的重要标志；另一方面，老年群体的增加关系国计民生，关系改革、发展、稳定大局，关系我国和谐建设。如今，“银色浪潮”正悄悄袭来，关注、关爱老人就更有具广泛而深远的意义。

老年痴呆症是老年人脑部功能失调的一种表现，是以智力衰退、行为及人格变化为特征。典型临床症状包括有记忆力、抽象思考、定向力障碍，同时伴有社会活动能力减退。主要表现为健忘、目光呆滞、口齿迟钝，继而影响知觉神经，失去自理能力。它已成为老年人健康的一大克星。据世界卫生组织估计，世界范围内65岁以上的老年人中，老年痴呆症患者已占到5％。国外的流行病学调查发现：老年痴呆是仅次于心血管病、脑血管病和恶性肿瘤，居第四位的老年人死因。有人预测，老年痴呆症将是下世纪最可怕的老年病。目前，老年痴呆症已引起许多老年病科学家、医学家们的关注，对其病因、诱发因素开展了广泛的实验研究。阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease AD)就是老年痴呆症中的一种。是我国各地区老年病研究中心重点关注的疾病之一。

阿尔茨海默病的特点是在脑细胞外有斑块存在与胞内有神经纤维原缠结存在。组成这些斑块的蛋白质是β-淀粉样蛋白(Aβ)，它是淀粉样前体蛋白经β-分泌酶和γ-分泌酶酶切后形成的40到43个氨基酸的多肽。在某些个体上，由于某些基因突变，或ApoE等位基因的表达，或其他尚未发现的因子的作用，导致了多肽的表达增加，而这些多肽Aβ42与Aβ43比Aβ40有更强聚集能力。所以，很多研究者推测Aβ42与Aβ43的增强释放导致了Aβ的异常沉积，并毒害受损个体的脑神经。在AD患者，脑脊液中Aβ42水平减少被认为是AD的前兆。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种操作方便、检测范围广、灵敏度高的人体β淀粉样蛋白试剂盒。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种人体β淀粉样蛋白试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括抗体包被板条、标准品、浓缩生物素化抗体、浓缩酶结合物、试剂稀释液、浓缩洗涤液、显色剂及终止液。

所述的抗体包被板条的制备包括以下步骤：用包被液将包被抗体稀释至1～2ug/ml，加在包被板上，用封板纸封板，在4-8℃放置12-24h后，将包被板置于洗板机上，用洗液洗板一次，然后加入封闭液并在室温下放置2h，甩净封闭液，风干，风干的包被板装入铝箔袋中，加入干燥剂，密封即得抗体包被板条。

所述的包被液为pH值为7.2-7.4磷酸盐缓冲液，所述的包被抗体为鼠抗人β淀粉单抗，所述的洗液为吐温20含量为0.1％(V/V)的磷酸盐缓冲液，所述的封闭液为含有血清白蛋白为2％(W/V)，蔗糖为3wt％的磷酸盐缓冲液。

所述的标准品的制备包括以下步骤：以pH值为7.2-7.4，含血清白蛋白为5wt％的磷酸盐缓冲液为溶剂，将人β淀粉重组蛋白配制成2000pg/50ul/支的溶液，将该溶液置于-70℃低温环境中冻干2h，然后将其置于冷冻干燥机中冻干8～12h，密封即得标准品。

所述的浓缩生物素化抗体为维生素H标记的抗人β淀粉抗体。

所述的浓缩酶结合物为辣根过氧化物酶标记的链亲和素。

所述的试剂稀释液为pH值为7.2-7.4，牛血清白蛋白含量为1％(W/V)的磷酸盐缓冲液。

所述的浓缩洗涤液为pH值为7.2-7.4，吐温20含量为0.1wt％(V/V)的磷酸盐缓冲液。

所述的显色剂为四甲基联苯二胺。

所述的终止液为1N HCL(1N盐酸)。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明的抗体包被板条制备方法采用两步法、室温振荡的反应模式，此方法具有操作简便，反应快捷，对实验室条件及设备要求不高，易于掌握和推广；

(2)本发明的检测范围较广，其检测范围为0～1000pg/ml；

(3)本发明的灵敏度较高，其检测灵敏度最高可达7pg/ml；

(4)本发明的工艺、技术、质量及使用效果都达到了国内外领先的水平。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

一种人体β淀粉样蛋白试剂盒，该试剂盒包括抗体包被板条、标准品、浓缩生物素化抗体、浓缩酶结合物、试剂稀释液、浓缩洗涤液、显色剂及终止液。另外还包括封板胶纸及使用说明书。具体组成如表1所示。

表1

名称	96 Tests	48 Tests	保存条件
				抗体包被板条	8×12	8×6	4℃
标准品	2支(冻干)	1支(冻干)	4℃
				浓缩生物素化抗体	2支	1支	4℃
浓缩酶结合物	2支	1支	4℃(避光)

试剂稀释液(25ml/瓶)	2瓶	1瓶	4℃
				浓缩洗涤液20×(30ml/瓶)	1瓶	1瓶	4℃
显色剂	1瓶(12ml)	1瓶(6ml)	4℃(避光)
				终止液	1瓶	1瓶	4℃
封板胶纸	3张	2张
				说明书	1份	1份

抗体包被板条的制备包括以下步骤：用pH值为7.2的磷酸盐缓冲液将鼠抗人体β淀粉单抗稀释至1ug/ml，加在包被板上，用封板纸封板，在4℃放置24h过夜后，将包被板置于洗板机上，用pH值为7.2的吐温20含量为0.1wt％(V/V)的磷酸盐缓冲液洗板一次，然后加入pH值为7.2，含牛血清白蛋白为2wt％(W/V)，蔗糖为3wt％(W/V)的磷酸盐缓冲液并在室温下放置2h，甩干封闭液，风干。风干的包被板装入铝箔袋中，加入干燥剂，密封即得抗体包被板条。

标准品的制备包括以下步骤：以pH值为7.2，含牛血清白蛋白为5wt％(W/V)的磷酸盐缓冲液为溶剂，将人体β淀粉重组蛋白配制成2000pg/50ul/支的溶液，将该溶液置于-70℃低温环境中冻干2h，然后将其置于冷冻干燥机中冻干8h，密封即得标准品。

浓缩生物素化抗体为生物素标记的抗人体β淀粉抗体，浓缩酶结合物为辣根过氧化物酶标记的链亲和素，试剂稀释液为pH值为7.2，牛血清白蛋白含量为1wt％(W/V)的磷酸盐缓冲液，浓缩洗涤液为pH值为7.2，吐温20含量为0.1wt％(V/V)的磷酸盐缓冲液，显色剂为四甲基联苯二胺，终止液为1NHCL(1N盐酸)。

利用本试剂盒进行人体β淀粉样蛋白检测，采用双抗体夹心ELISA法。抗人AβTotal单抗包被于酶标板上，同时加入标本、标准品和生物素化的抗人AβTotal抗体，标本、标准品中的AβTotal会与加入于孔中的生物素化的抗人AβTotal抗体及包被于酶标板上的单抗结合，形成免疫复合物，游离的成分被洗去；加入辣根过氧化物酶标记的亲合素，亲合素与生物素特异性结合，游离的成分被洗去。加入显色底物(显色剂)，若反应孔中有AβTotal，辣根过氧化物酶会使无色的显色剂变蓝，加终止液变黄。在450nm处测OD值，AβTotal浓度与OD₄₅₀值之间呈正相关，可通过绘制标准曲线求出标本中AβTotal浓度。具体包括以下步骤：

试验所需自备试验器材

1.酶标仪(450nm检测波长滤光片，570nm或630nm校正波长滤光片)；

2.高精度加液器及一次性吸头：0.5-10ul，2-20ul，20-200ul，200-1000ul；

3.微孔板振荡器，双蒸水或去离子水，坐标纸。

标本收集

1.收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管；

2.血浆抗凝剂推荐使用EDTA。避免使用溶血，高血脂标本；

3.标本应清澈透明，悬浮物应离心去除；

4.标本收集后若不及时检测，需按一次使用量分装，冻存于-20℃，-70℃电冰箱内，避免反复冻融；

5.可根据标本的实际情况，做适当倍数稀释；

注：血清或血浆样本冻存后聚合的蛋白会遮盖抗原的表位，建议用试剂稀释液将血清或血浆样本做1∶2稀释后检测。计算样本含量时应乘以稀释倍数。

注意事项：

1.试剂盒使用前请保存在2-8℃，除复溶后的标准品，其他成分不可冻结。

2.浓缩生物素化抗体，浓缩酶结合物体积小，运输中颠簸和可能的倒置，会使液体沾到管壁或瓶盖。因此使用前请用手甩几下或1000rpm离心1分钟，以使附着管壁或瓶盖的液体沉积到管底。

3.从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象，微加热至40℃使结晶完全溶解后再配制洗涤液。

4.若需要分次使用标准品，在标准品复溶后应按每一次用量分装，将其放在-20或-70℃贮存。避免反复冻融。

5.不同批号的试剂盒组份不能混用(洗涤液和反应终止液除外)。

6.充分轻微混匀对反应结果尤为重要，最好使用微量振荡器(使用最低频率)，如无微量振荡器，可在反应前手工轻轻晃动酶标板，使加入孔中的反应液混匀。

7.酶免试验中标准品和样本检测时建议作复孔。

检测前准备工作：

1.提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温。

2.将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1∶20)。未用完的放回4℃。

3.标准品：加入试剂稀释液1.0ml至冻干标准品中，静置15分钟，待其充分溶解后，轻轻混匀(浓度为2000pg/ml)。然后根据需要进行稀释。(建议标准曲线使用以下浓度：1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、0pg/ml)。

4.生物素化抗体工作液：按当次试验所需用量，用试剂稀释液稀释浓缩生物素化抗体(1∶100)配置成生物素化抗体工作液。使用前30分钟准备。仅供当日使用。

5.酶结合物工作液：按当次试验所需要用量，用试剂稀释液稀释浓缩酶结合物(1∶100)配置成酶结合物工作液。使用前30分钟准备。仅供当日使用。

洗涤方法：

1.自动洗板机：要求注入的洗涤液为350ul，注入与吸出间隔20-30秒。洗板4次。

2.手工洗板：每孔加洗涤液350ul，静置30秒后甩尽孔内液体，在厚迭吸水纸上拍干。洗板5次。

操作步骤：

1.从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，未用的板条和干燥剂请放回铝箔袋内封存于4℃。

2.留空白孔(若使用双波长读板，空白孔可以不设)。

3.提前准备好样本、标准品和生物素化抗体工作液。

4.先将不同浓度标准品(0mIU/ml孔加试剂稀释液)分别加入相应孔中(100ul/孔)；在每个样本孔中加入50ul样本稀释液和50ul样本(此时样本已做了1∶2倍稀释，计算结果时样本含量要乘以2)；随后在样本和标准品孔中加入50ul生物素化抗体工作液，用封板胶纸封住反应孔。

5.室温(20～25℃)孵育120分钟。最好使用微量振荡器(最低频率，100rpm)。

6.提前15分钟制备酶结合物工作液。室温避光放置。

7.洗板5次。

8.除空白孔外，加入酶结合物工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔。

9.室温(20～25℃)避光孵育60分钟。最好使用微量振荡器(最低频率，100rpm)。

10.洗板5次。

11.加入显色底物(包括空白孔)100ul/孔，室温(22～25℃)，避光孵育15分钟。

12.加入终止液(包括空白孔)100ul/孔，混匀后即刻测量OD450值(10分钟内)。

结果判断：

1.每个标准品和标本的OD值应减去零孔的OD值。(若不减零孔值，标准曲线的零孔应相交于Y轴)

2.手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。

3.若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。

实施例2

一种人体β淀粉样蛋白试剂盒，该试剂盒包括抗体包被板条、标准品、浓缩生物素化抗体、浓缩酶结合物、试剂稀释液、浓缩洗涤液、显色剂及终止液。

抗体包被板条的制备包括以下步骤：用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液将鼠抗人体β淀粉单抗稀释至2ug/ml，加在包被板上，用封板纸封板，在8℃放置12h过夜后，将包被板置于洗板机上，用pH值为7.4的吐温20含量为0.1wt％(V/V)的磷酸盐缓冲液洗板一次，然后加入pH值为7.4，含牛血清白蛋白为2wt％(W/V)，蔗糖为3wt％(W/V)的磷酸盐缓冲液并在室温下放置2h，甩干封闭液，风干。风干的包被板装入铝箔袋中，加入干燥剂，密封即得抗体包被板条。

标准品的制备包括以下步骤：以pH值为7.4，含牛血清白蛋白为5wt％(W/V)的磷酸盐缓冲液为溶剂，将人体β淀粉重组蛋白配制成2000pg/50ul/支的溶液，将该溶液置于-70℃低温环境中冻干2h，然后将其置于冷冻干燥机中冻干12h，密封即得标准品。

浓缩生物素化抗体为生物素标记的抗人体β淀粉抗体，生物素为Biotin，又称Vitamin H，结构式：C₁₀H₁₆N₂O₃S，浓缩酶结合物为辣根过氧化物酶标记的链亲和素，试剂稀释液为pH值为7.4，牛血清白蛋白含量为1wt％(W/V)的磷酸盐缓冲液，浓缩洗涤液为pH值为7.4，吐温20含量为0.1wt％(V/V)的磷酸盐缓冲液，显色剂为四甲基联苯二胺，终止液为1N HCL(1N盐酸)。

利用本试剂盒进行人体β淀粉样蛋白检测，采用双抗体夹心ELISA法。双抗体夹心法ELISA试验时一种经典的酶联免疫吸附试验，与间接法和竞争法ELISA相比，具有特异性更强，灵敏度更高的特点，是定量检测小分子物质的首选。

抗人AβTotal单抗包被于酶标板上，同时加入标本、标准品和生物素化的抗人AβTotal抗体，标本、标准品中的AβTotal会与加入于孔中的生物素化的抗人AβTotal抗体及包被于酶标板上的单抗结合，形成免疫复合物，游离的成分被洗去；加入辣根过氧化物酶标记的亲合素，亲合素与生物素特异性结合，游离的成分被洗去。加入显色底物(显色剂)，若反应孔中有AβTotal，辣根过氧化物酶会使无色的显色剂变蓝，加终止液变黄。在450nm处测OD值，AβTotal浓度与OD₄₅₀值之间呈正相关，可通过绘制标准曲线求出标本中AβTotal浓度。

Claims

1.一种人体β淀粉样蛋白试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括抗体包被板条、标准品、浓缩生物素化抗体、浓缩酶结合物、试剂稀释液、浓缩洗涤液、显色剂及终止液。

2.根据权利要求1所述的一种人体β淀粉样蛋白试剂盒，其特征在于，所述的抗体包被板条的制备包括以下步骤：用包被液将包被抗体稀释至1～2ug/ml，加在包被板上，用封板纸封板，在4-8℃放置12-24h后，将包被板置于洗板机上，用洗液洗板一次，然后加入封闭液并在室温下放置2h，甩净封闭液，风干，风干的包被板装入铝箔袋中，加入干燥剂，密封即得抗体包被板条。

3.根据权利要求2所述的一种人体β淀粉样蛋白试剂盒，其特征在于，所述的包被液为pH值为7.2-7.4磷酸盐缓冲液，所述的包被抗体为鼠抗人β淀粉单抗，所述的洗液为吐温20含量为0.1％(V/V)的磷酸盐缓冲液，所述的封闭液为含有血清白蛋白为2％(W/V)，蔗糖为3wt％的磷酸盐缓冲液。

4.根据权利要求1所述的一种人体β淀粉样蛋白试剂盒，其特征在于，所述的标准品的制备包括以下步骤：以pH值为7.2-7.4，含血清白蛋白为5wt％的磷酸盐缓冲液为溶剂，将人β淀粉重组蛋白配制成2000pg/50ul/支的溶液，将该溶液置于-70℃低温环境中冻干2h，然后将其置于冷冻干燥机中冻干8～12h，密封即得标准品。

5.根据权利要求1所述的一种人体β淀粉样蛋白试剂盒，其特征在于，所述的浓缩生物素化抗体为维生素H标记的抗人β淀粉抗体。

6.根据权利要求1所述的一种人体β淀粉样蛋白试剂盒，其特征在于，所述的浓缩酶结合物为辣根过氧化物酶标记的链亲和素。

7.根据权利要求1所述的一种人体β淀粉样蛋白试剂盒，其特征在于，所述的试剂稀释液为pH值为7.2-7.4，牛血清白蛋白含量为1％(W/V)的磷酸盐缓冲液。

8.根据权利要求1所述的一种人体β淀粉样蛋白试剂盒，其特征在于，所述的浓缩洗涤液为pH值为7.2-7.4，吐温20含量为0.1wt％(V/V)的磷酸盐缓冲液。

9.根据权利要求1所述的一种人体β淀粉样蛋白试剂盒，其特征在于，所述的显色剂为四甲基联苯二胺。

10.根据权利要求1所述的一种人体β淀粉样蛋白试剂盒，其特征在于，所述的终止液为盐酸。