CN104049082A - 人组织激肽释放酶活性检测试剂盒及其应用 - Google Patents

人组织激肽释放酶活性检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人组织激肽释放酶活性检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括：1)包被特异性抗人组织激肽释放酶克隆抗体酶标板；2)人组织激肽释放酶融合蛋白TK-4T1标准品；3)BAEE工作液。本发明的试剂盒采用免疫与化学相结合的方法，利用人尿液或血浆样本中的TK能与其特异性抗体结合的特性将其从样本中分离出来，进而催化底物苯甲酰精氨酸乙酯盐酸盐(BAEE)发生化学反应。

Description

人组织激肽释放酶活性检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及人组织激肽释放酶检测领域，具体地指一种人组织激肽释放酶活性检测试剂盒及其应用，用于检测人组织激肽释放酶的活性。
背景技术
人组织激肽释放酶(TK)是一类丝氨酸蛋白酶，能促进低分子激肽原释放血管活性肽从而发挥一系列生物活性作用，命名为KLK1。在人和动物的高血压、心血管疾病和肾脏疾病的模型中，均可见到TK含量的降低。我们在转基因的动物模型中发现TK具有降低血压，改善胰岛素抵抗，改善肾功能的作用。TK的水平在人的心血管疾病及肾脏疾病的发生发展的过程中可能具有重要的预测价值。
我们研究发现，TK的含量与脑卒中(缺血性脑卒中和出血性脑卒中)的发生呈剂量反应的负相关关系，并且这种现象能独立于传统的心脑血管疾病危险因素而存在。因此，TK可能是卒中患者的一个独立的保护因子。随后我们对所有卒中患者进行的5年随访中发现，血浆TK含量较高的患者具有较低的卒中复发率及较长的无事件生存时间。这说明TK不仅与脑卒中的发生有关还可能具有预防卒中复发的作用，并且降低的TK含量还可能作为脑卒中复发的预测因子。
研究发现TK启动子区的基因多态性与TK活性的降低及动脉的向心性重构密切相关。因此，TK基因的遗传变异可能会影响TK的表达、活性和功能改变。有文献报道尿中TK的活性与TK基因的遗传变异及高血压的发生密切相关。尿或血浆中的TK活性与脑卒中及其他心脑血管疾病的关系尚无相关研究报道。而由于血浆中的成分复杂，不利于直接检测TK的活性，所以有必要来建立一种能定量检测血浆中TK活性的试剂盒及其制备方法，从而解决血浆中蛋白成分复杂不利于TK活性检测的难题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题就是提供一种人组织激肽释放酶活性检测试剂盒及其应用，该试剂盒通过利用TK能与特异性抗体发生反应的特性与TK能催化底物苯甲酰精氨酸乙酯盐酸盐(BAEE)发生化学反应的特性相结合，从而解决血浆中蛋白成分复杂不利于TK活性检测的难题。
为解决上述技术问题，本发明提供的一种人组织激肽释放酶活性检测试剂盒，该试剂盒包括：
1)包被特异性抗人组织激肽释放酶多克隆抗体酶标板；
2)人组织激肽释放酶融合蛋白TK-4T1标准品；
3)BAEE工作液，
其中，包被特异性抗人组织激肽释放酶的克隆抗体酶标板中的抗TK的抗体为抗11P的单克隆抗体或者抗11P的多克隆抗体。研究表明：抗原具有不同的抗原表位，不同的抗原表位结合不同的抗体，针对人组织激肽释放酶(TK)具有不同的抗原表位。当我们利用已有的四种抗TK的抗体作为捕获抗体制备反应板来检测标准品中TK的活性时，只有将抗11P的兔抗作为捕获抗体时制备的反应板所绘制的标准曲线对线关系良好。这说明只有用抗11P兔抗所制备的反应板能与TK结合的同时还能与BAEE发生反应。
进一步地，所述试剂盒还包括：PBST稀释洗涤液、稀盐酸、当量浓度为3.5N的氢氧化钠溶液、摩尔浓度为0.11M的氯化铁溶液和摩尔浓度为0.2M的盐酸羟胺溶液中任意一种或几种。
再进一步地，所述BAEE工作液的摩尔浓度为0.05M。
再进一步地，所述PBST稀释洗涤液中Tween-20质量分数为1％，所述稀盐酸的质量分数为13.73％，氢氧化钠溶液的当量浓度为3.5N、氯化铁溶液的摩尔浓度为0.11M和摩尔浓度为0.2M的盐酸羟胺溶液。
本发明还提供了一种包被特异性抗人组织激肽释放酶多克隆抗体酶标板的制备方法，包括以下步骤：
1)称取碳酸钠和碳酸氢钠，溶液水中得到pH为9.6且摩尔浓度为0.05的碳酸盐缓冲液；即包被缓冲液：
2)用上述包被缓冲液稀释抗TK的克隆抗体至3200倍，得到抗体溶液；
3)按每一孔加入100μl的比例吸取抗体溶液，并将抗体溶液加入96孔的酶标板内，在4℃条件下包被过夜，然后用BSA质量分数为1％的PBS液200μl于37℃封闭1h；
4)称取磷酸二氢钾、12水磷酸氢二钠、氯化钠。氯化钾和吐温-20制备得到Tween-20质量分数为0.1％的磷酸盐缓冲液PBST；
5)用步骤4)得到的PBST洗涤步骤3)中封闭的酶标板，用PBST洗涤2～3次，每次3分钟，拍干并密封，即得到包被特异性抗人组织激肽释放酶多克隆抗体酶标板。
本发明还提供了试剂盒在检测血浆及尿中TK活性的应用方法：包括以下步骤：
1)称取碳酸钠和碳酸氢钠，溶液水中得到pH为9.6且摩尔浓度为0.05的碳酸盐缓冲液；即包被缓冲液：
2)用上述包被缓冲液稀释抗TK的克隆抗体至3200倍，得到抗体溶液；
3)按每一孔加入100μl的比例吸取抗体溶液，并将抗体溶液加入96孔的酶标板内，在4℃条件下包被过夜，然后用BSA质量分数为1％的PBS液200μl于37℃封闭1h；
4)称取磷酸二氢钾、十二水磷酸氢二钠、氯化钠。氯化钾和吐温-20制备得到Tween-20质量分数为0.1％的磷酸盐缓冲液PBST；
5)用步骤4)得到的PBST洗涤步骤3)中封闭的酶标板，用PBST洗涤2～3次，每次3分钟，拍干并密封，即得到包被特异性抗人组织激肽释放酶多克隆抗体酶标板；
6)将步骤5)得到的酶标板置于4℃条件下孵育24h，然后用质量分数为1％的BSA溶液封闭1h；
7)利用PBST稀释洗涤液稀释标准品和样品，将稀释后的标准品、样品和空白对照分别加入步骤6)中封闭好的酶标板中，并将酶标板置于37℃条件下反应60min；
8)向步骤7)的酶标板中加入BAEE工作液，在37℃条件下反应60min；
9)向步骤8)中的酶标板中加入氢氧化钠和盐酸羟胺的混合液，使之与未消耗的BAEE充分反应；
10)向步骤9)的酶标板中加入稀盐酸终止反应后加入氯化铁溶液显色；
11)通过酶标仪读数并绘制标准曲线，同时计算出TK的活性。
本发明的原理：
本发明的试剂盒采用免疫与化学相结合的方法，利用人尿液或血浆样本中的TK能与其特异性抗体结合的特性将其从样本中分离出来并使其吸附在聚苯乙烯板上，然后BAEE经通过TK的醋介后作用，剩余的BAEE与盐酸羟胺及三氯化铁作用生成有色物质，最后通过酶标仪读数并计算出样本中TK的活性。
本发明的有益效果在于：
本发明试剂盒具有灵敏度高，其灵敏度为0.040Eu～1.27Eu，特异性强，重复性好的特点。人组织激肽释放酶融合蛋白TK-4T1标准品为原核表达并纯化的人组织激肽释放酶(TK-4T1融合蛋白)；利用该融合蛋白作为标准品，其标准曲线的相关系数高达0.993。利用此试剂盒检测了尿液样本中的TK活性，比较了其复孔间的组内差异均值为2.7％，其于当日重复检测TK活性后获得的板内差异的均值为3.8％。间隔6个月后再重复检测这些样本中TK的活性，其板间差异为6.9％。我们利用该试剂盒比较了尿液样本分别保存在4℃及-80℃时的板间差异为4.7％。
附图说明
图1为人组织激肽释放酶融合蛋白TK-4T1的SDS-PAGE图；
图2为抗TK-4T1重组蛋白多克隆抗体(抗11P的兔抗)的SDS-PAGE图；
图3为不同抗体包被的酶标板检测时BAEE的量与OD450值之间的标准曲线图；
图4为不同抗体包被的酶标板检测标准品与OD450值之间的标准曲线图；
图5为使用TK活性检测试剂盒检测尿和血标本中TK活性差异图。
具体实施方式
为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
人组织激肽释放酶活性检测试剂盒的制备
1、试剂
1)包被缓冲液(pH＝9.6/0.05碳酸盐缓冲液)：
2)PBST稀释洗涤液(pH＝7.4/0.15M)
3)BAEE工作液
利用pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液将1.7191g的BAEE粉剂稀释至100ml，即为0.05M BAEE。
4)其他试剂
稀盐酸是由浓盐酸(浓度约37％)与水按照体积比1:2兑成，其质量分数为13.73％，
氢氧化钠溶液的当量浓度为3.5N、氯化铁溶液的摩尔浓度为0.11M和摩尔浓度为0.2M的盐酸羟胺溶液。
人组织激肽释放酶融合蛋白TK-4T1标准品为原核表达并纯化的人组织激肽释放酶(TK-4T1融合蛋白)(参考文件《Plasma tissuekallikrein level is negatively associated with incident and recurrent stroke:A multicenter case-control study in China》和专利《人组织激肽释放酶ELISA试剂盒的制备》)。
2.主要仪器
(1)酶标仪：ELX800Μniversal Microplate reader
(2)酶标板：Corning incorporated costar R96Well EIA/RIA plate
3.试剂盒在检测血浆及尿中TK活性的应用方法：包括以下步骤：
1)称取碳酸钠和碳酸氢钠，溶液水中得到pH为9.6且摩尔浓度为0.05的碳酸盐缓冲液；即包被缓冲液：
2)用上述包被缓冲液稀释抗TK的克隆抗体至3200倍，得到抗体溶液；
3)按每一孔加入100μl的比例吸取抗体溶液，并将抗体溶液加入96孔的酶标板内，在4℃条件下包被过夜，然后用BSA质量分数为1％的PBS液200μl于37℃封闭1h；
4)称取磷酸二氢钾、十二水磷酸氢二钠、氯化钠。氯化钾和吐温-20制备得到Tween-20质量分数为0.1％的磷酸盐缓冲液PBST；
5)用步骤4)得到的PBST洗涤步骤3)中封闭的酶标板，用PBST洗涤2～3次，每次3分钟，拍干并密封，即得到包被特异性抗人组织激肽释放酶多克隆抗体酶标板；
6)将步骤5)得到的酶标板置于4℃条件下孵育24h，然后用质量分数为1％的BSA溶液封闭1h；
7)利用PBST稀释洗涤液稀释标准品和样品，将稀释后的标准品、样品和空白对照分别加入步骤6)中封闭好的酶标板中，并将酶标板置于37℃条件下反应60min；
8)向步骤7)的酶标板中加入BAEE工作液，在37℃条件下反应60min；
9)向步骤8)中的酶标板中加入氢氧化钠和盐酸羟胺的混合液，使之与未消耗的BAEE充分反应；
10)向步骤9)的酶标板中加入稀盐酸终止反应后加入氯化铁溶液显色；
11)通过酶标仪读数并绘制标准曲线，同时计算出TK的活性。
4.验证方法
4.1四种抗体的兔抗制备
4.11抗11P的兔抗和抗12P的兔抗(参考文件《人组织激肽释放酶的生物信息学分析及其不同抗原表位的多克隆抗体的制备及纯化》和专利《一种抗人组织激肽释放酶单克隆抗体及其制备》)；
4.12抗TK-4T1的兔抗和TK的单抗(参考文件《Plasma tissue kallikreinlevel is negatively associated with incident and recurrent stroke:A multicenter case-control studyin China》和专利《人组织激肽释放酶ELISA试剂盒的制备》)。
本实施中，使用兔子来生产多克隆抗体，在现实过程中，还可以选用其他动物来生产多克隆抗体，如小白鼠等。
4.2检测人组织激肽释放酶融合蛋白TK-4T1标准品的TK活性时BAEE的量与OD450值之间的关系
(1)针对TK不同表位的各种多克隆抗体及单克隆抗体(抗11P的兔抗及抗12P的兔抗，抗TK-4T1的兔抗，TK的单抗)均由本实验室制备；
(2)将抗TK的各种抗体分别用包被缓冲液稀释至3200倍；
(3)分别吸取抗TK的各种抗体100μl，将其加入到96孔酶标板中于4℃过夜；
(4)质量分数为1％的BSA封闭1小时，用PBST稀释洗涤液洗涤3次；
(5)分别吸取0、10、20、40、60、80μl的BAEE工作液到酶标板中；
(6)分别加入0.025M pH8.0的Tris-Hcl至100μl；
(7)将酶标板置入37℃温箱中孵育1小时；
(8)将酶标板置于冰上，每孔中分别加入3.5N氢氧化钠(50μl)与0.2M盐酸羟胺(50μl)的混合液100μl，混匀后室温静置15分钟；
(9)加入稀盐酸50μl，混匀后加入0.11M氯化铁100μl，室温反应30分钟；
(10)通过酶标仪测其450nm波长处吸光度，并绘制标准曲线。
4.3最佳包被抗体的选择
(1)针对TK不同表位的各种多克隆抗体及单克隆抗体(抗11P的兔抗及抗12P的兔抗，抗TK-4T1的兔抗，TK的单抗)均由本实验室制备。
(2)将抗TK的各种抗体分别用0.05M pH9.6碳酸盐包被缓冲液稀释致3200倍；
(3)分别吸取抗TK的各种抗体100μl，将其加入到96孔酶标板中于4℃过夜；
(4)质量分数为1％的BSA封闭1小时，用PBST稀释洗涤液洗涤3次；
(5)将标准品(TK-4T1)用PBS稀释至1.00μg/ml，然后对其进行倍比稀释至0.031μg/ml；
(6)分别吸取各浓度的标准品100μl到酶标板中，于37℃充分反应1小时，洗板3次；
(7)选择绘制反映BAEE的量和OD450值标准曲线的孔中分别加入Tris-Hcl缓冲液及BAEE工作液：100μl+0、90μl+10μl、80μl+20μl、60μl+40μl、40μl+60μ、80μl+20μl。有标准品的孔则加入Tris-Hcl缓冲液40μl，BAEE工作液60μl；37℃充分反应1小时；
(8)加入氢氧化钠和盐酸羟胺的混合液100μl，使之与未消耗的BAEE充分反应15分钟；
(9)加入稀盐酸50μl终止反应后加入FeCl3显色；
(10)分别利用已有的四种抗TK的抗体作为包被抗体制备反应板来检测标准品中TK的活性：分别以标准品1.00μg/ml、0.500μg/ml、0.250μg/ml、0.125μg/ml、0.063μg/ml、0.031μg/ml的值为横坐标，其对应的OD值为纵坐标绘制标准曲线同时计算出不同浓度标准品TK活性，Eu＝(T-M)/t。(Eu：为TK活性单位，即在0.025M pH8.0的Tris-Hcl缓冲液中，在37℃每分钟水解lμmol的BAEE的量时为一个酶单位；T：加入BAEE的总量(μmol)；M：被TK作用后反应液中剩余的BAEE的量(μmol)也就是直接测得的量；t：孵育时间(分)。
4.4样品测定(方法见表3)
(1)取10μl的待测样本，用PBST稀释至100μl；
(2)预留的标准曲线的12个孔(包括复孔)加入100μl的PBST,剩余的孔分别加入样本(20例血浆样本及20例尿样本)稀释液100μl，于37℃充分反应1小时，洗板3次；
(3)选择做标准曲线的12个孔分别加入Tris-Hcl缓冲液100μl、90μl、80μl、60μl、40μl及20μl；剩余的样品孔全部加入40μl；
(4)样品孔分别加入60μl的BAEE，37℃充分反应1小时；
(5)加入氢氧化钠和盐酸羟胺的混合液100μl，使之与未消耗的BAEE充分反应15分钟；
(6)加入50μl的稀盐酸终止反应后加入FeCl3显色；
(7)通过酶标仪读数并绘制标准曲线，同时计算出TK的活性，Eu＝(T-M)*1000/tv。(Eu：为TK活性单位,即在0.025M pH8.0的Tris-Hcl缓冲液中,在37℃每分钟水解lμmol BAEE的量时为一个酶单位；T：加入BAEE的总量(μmol)；M：被TK作用后反应液中剩余的BAEE的量(μmol)也就是直接测得的量；t：孵育时间(分)；v：定时所用的尿量(μl))。
4.5试剂盒的质量鉴定
(1)试剂盒的灵敏度：根据标准品进行倍比稀释后绘制的TK活性与OD450值之间关系的标准曲线计算出的本试剂盒的检测范围。
(2)组间差异及组内差异的比较：分别检测20例血浆及尿样液中的TK活性，其中每组做三个复孔，并于当日重复检测。然后比较其组内差异及组间差异。
(3)试剂盒的稳定性检测：将成品试剂盒于4℃保存，并于第6个月后对其质量进行检测。
(4)样品保存条件的检测：将新收集的15例尿液样本分别保存于4℃及-80℃，于次日检测尿中TK的活性。
4.6结果
4.6.1表1检测标准品的TK活性时BAEE的量与OD450值之间的关系
利用已有的四种抗TK的抗体作为捕获抗体制备反应板来检测标准品中TK的活性，以0、0.005M、0.01M、0.02M、0.03M、0.04MBAEE对应的值为横坐标，其对应的OD值为纵坐标绘制标准曲线，这四条标准曲线均对线良好(表1图3)。
4.6.2表2标准品的TK活性OD450值之间的关系
当以标准品TK-4T1的浓度为横坐标，其对应的OD值为纵坐标绘制标准曲线时，只有将抗11P的兔抗(anti-11P)作为捕获抗体时制备的反应板所绘制的标准曲线对线关系良好(r＝0.990，表2图4)。这说明只有用抗11P兔抗(anti-11P)所制备的反应板才能与TK结合的同时还能与BAEE发生反应。
4.6.3表3TK活性检测
表3提示使用人组织激肽释放酶活性检测试剂盒监测样本TK活性时，制作标准曲线的标准孔和检测样本的样本孔各试剂的加入方法。
4.6.4血浆及尿中TK活性检测
分别检测了20例血浆样本及尿液中的TK活性，结果发现尿中TK的活性为1.11±0.53Eu/ml；血浆中TK活性为2.28±0.61Eu/ml。血浆中的TK活性明显高于尿TK活性(P<0.001；图5)。
4.6.5试剂盒的质量鉴定
本发明试剂盒的灵敏度为1.271Eu～0.0401Eu。利用此试剂盒检测了20例尿液样本中的TK活性，比较了其复孔间的组内差异均值为2.7％,于当日重复检测TK活性后获得的板内差异的均值为3.8％。间隔6个月后再重复检测这些样本中TK的活性，其板间差异为6.9％。我们利用该试剂盒比较了15例尿液样本分别保存在4℃及-80℃时的板间差异为4.7％。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (7)

1.一种人组织激肽释放酶活性检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括：
1)包被特异性抗人组织激肽释放酶克隆抗体酶标板；
2)人组织激肽释放酶融合蛋白TK-4T1标准品；
3)BAEE工作液；
其中，包被特异性抗人组织激肽释放酶克隆抗体酶标板中的抗TK的克隆抗体为抗11P的单克隆抗体或者至少含有抗11P的多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的人组织激肽释放酶活性检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括：PBST稀释洗涤液、稀盐酸、氢氧化钠溶液、氯化铁溶液和盐酸羟胺溶液中任意一种或几种。
3.根据权利要求1或2所述的人组织激肽释放酶活性检测试剂盒，其特征在于：所述BAEE工作液的摩尔浓度为0.05M。
4.根据权利要求2所述的人组织激肽释放酶活性检测试剂盒，其特征在于：所述PBST稀释洗涤液中Tween-20质量分数为1％，所述稀盐酸的质量分数为13.73％，氢氧化钠溶液的当量浓度为3.5N、氯化铁溶液的摩尔浓度为0.11M和摩尔浓度为0.2M的盐酸羟胺溶液。
5.一种包被特异性抗人组织激肽释放酶多克隆抗体酶标板的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)称取碳酸钠和碳酸氢钠，溶液水中得到pH为9.6且摩尔浓度为0.05的碳酸盐缓冲液；即包被缓冲液：
2)用上述包被缓冲液稀释抗TK的克隆抗体至3200倍，得到抗体溶液；
3)按每一孔加入100μl的比例吸取抗体溶液，并将抗体溶液加入96孔的酶标板内，在4℃条件下包被过夜，然后用BSA质量分数为1％的PBS液200μl于37℃封闭1h；
4)称取磷酸二氢钾、十二水磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾和吐温-20制备得到Tween-20质量分数为0.1％的磷酸盐缓冲液PBST；
5)用步骤4)得到的PBST洗涤步骤3)中封闭的酶标板，用PBST洗涤2～3次，每次3分钟，拍干并密封，即得到包被特异性抗人组织激肽释放酶多克隆抗体酶标板。
6.一种权利要求1～4任意一项所述的试剂盒在检测血浆及尿中TK活性的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：包括以下步骤：
1)称取碳酸钠和碳酸氢钠，溶液水中得到pH为9.6且摩尔浓度为0.05的碳酸盐缓冲液；即包被缓冲液：
2)用上述包被缓冲液稀释抗TK的克隆抗体至3200倍，得到抗体溶液；
3)按每一孔加入100μl的比例吸取抗体溶液，并将抗体溶液加入96孔的酶标板内，在4℃条件下包被过夜，然后用BSA质量分数为1％的PBS液200μl于37℃封闭1h；
4)称取磷酸二氢钾、12水磷酸氢二钠、氯化钠。氯化钾和吐温-20制备得到Tween-20质量分数为0.1％的磷酸盐缓冲液PBST；
5)用步骤4)得到的PBST洗涤步骤3)中封闭的酶标板，用PBST洗涤2～3次，每次3分钟，拍干并密封，即得到包被特异性抗人组织激肽释放酶多克隆抗体酶标板；
6)将步骤5)得到的酶标板置于4℃条件下孵育24h，然后用质量分数为1％的BSA溶液封闭1h；
7)利用PBST稀释洗涤液稀释标准品和样品，将稀释后的标准品、样品和空白对照分别加入步骤6)中封闭好的酶标板中，并将酶标板置于37℃条件下反应60min；
8)向步骤7)的酶标板中加入BAEE工作液，在37℃条件下反应60min；
9)向步骤8)中的酶标板中加入氢氧化钠和盐酸羟胺的混合液，使之与未消耗的BAEE充分反应；
10)向步骤9)的酶标板中加入稀盐酸终止反应后加入氯化铁溶液显色；
11)通过酶标仪读数并绘制标准曲线，同时计算出TK的活性。
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