CN112034176A - Cntn1作为长期低剂量电离辐射暴露诊断的分子标记物的用途 - Google Patents

Cntn1作为长期低剂量电离辐射暴露诊断的分子标记物的用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了CNTN1作为长期低剂量电离辐射暴露诊断的分子标记物的用途，属于分子诊断技术领域。本发明确定了人体血清中CNTN1蛋白表达水平与长期低剂量电离辐射暴露紧密相关，血清中CNTN1蛋白表达水平高低可以区分长期低剂量电离辐射暴露人群，因此血清中CNTN1蛋白可以作为长期低剂量电离辐射暴露诊断的分子标记物，检测CNTN1蛋白的试剂及试剂盒，可应用于长期低剂量电离辐射暴露的检测。检测CNTN1蛋白的方式简便，可以采用芯片或其他蛋白分析技术开展大规模、高通量的人群筛查，具有良好的应用前景。

Description

CNTN1作为长期低剂量电离辐射暴露诊断的分子标记物的 用途
技术领域
本发明属于分子诊断技术领域，具体涉及CNTN1作为长期低剂量电离辐射暴露诊断的分子标记物的用途。
背景技术
电离辐射可对机体在分子、细胞、组织和器官等不同水平上发生影响，使机体产生不同程度的生物效应。高、低剂量(<100mGy)的辐射生物效应不尽相同。低剂量电离辐射对放射职业人群和公众的影响力更为普遍，其生物效应更加复杂。电离辐射引发的细胞突变、染色体畸变和基因表达等等不同水平的规律性变化，可以作为辐射生物标志物，应用于受照剂量评估、辐射分子流行病学调查等等。
辐射分子流行病学将传统流行病学研究和分子生物学技术相结合，从分子水平探讨电离辐射对机体的影响。辐射分子流行病学调查对于评估辐射易感性、维护人群健康、建立合理而有效的辐射防护策略等有着重要的应用价值。辐射分子流行病学研究中最重要的内容是辐射生物标志物，可以包括DNA、RNA、蛋白质、酶、代谢产物、其他生化分子，等等。目前常用的微核分析、染色体畸变等检测方法只能够反映细胞水平的生物效应，并且在低剂量条件下响应不足。免疫组化、原位杂交、实时荧光定量PCR、生物芯片、代谢组学等技术的发展为研究辐射标志物提供了更多可能。酶联免疫吸附(ELISA)技术利用抗体分子能与抗原分子特异性结合的特点，捕获目标蛋白并对其定性或定量分析。抗体芯片将ELISA高度集成，形成一种微型、高通量化的蛋白质分析技术，用于检测相关蛋白的表达丰度。
辐射分子流行病学研究的关键是适合的辐射生物标志物，目前有研究趋势利用组学技术(基因组学、蛋白组学、代谢组学)寻找一系列分子标识形成辐射生物效应的“指纹图谱”。但开发长期低剂量辐射生物标志物依然是一项挑战，其主要原因包括：低剂量辐射引发的生物效应不够明显，分子变化敏感性较低；许多辐射效应受到半衰期和接触时间的限制，随时间恢复或消失，分子变化具有时效性。
接触蛋白-1(Contactin-1，CNTN1)是一种神经细胞黏附因子，属于神经接触分子免疫超家族，参与介导多种神经细胞的功能和神经系统的生长发育。接触蛋白-1蛋白的UniProtKB编号为Q12860。尚未见到CNTN1与低剂量辐射生物效应的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供CNTN1作为长期低剂量电离辐射暴露诊断的分子标记物的用途。
本发明提供了CNTN1作为长期低剂量电离辐射暴露诊断的分子标记物的用途。
进一步地，所述CNTN1为人血清中的CNTN1蛋白。
本发明还提供了检测CNTN1蛋白的试剂在制备诊断长期低剂量电离辐射暴露的试剂盒中的用途。
进一步地，所述检测CNTN1蛋白的试剂为酶联免疫吸附试验用试剂或酶联免疫分析试剂。
进一步地，所述检测CNTN1蛋白的试剂为western blot试剂或蛋白芯片检测方法用试剂。
进一步地，所述检测CNTN1蛋白的试剂为检测人血清中CNTN1蛋白的试剂。
本发明还提供了一种诊断长期低剂量电离辐射暴露的试剂盒，它包括用于检测CNTN1蛋白的试剂。
进一步地，所述检测CNTN1蛋白的试剂为酶联免疫吸附试验用试剂或酶联免疫分析试剂。
进一步地，所述检测CNTN1蛋白的试剂为western blot试剂或蛋白芯片检测方法用试剂。
进一步地，所述检测CNTN1蛋白的试剂为检测人血清中CNTN1蛋白的试剂。
本发明中CNTN1是指人血清中的CNTN1蛋白；血清CNTN1水平是指人血清中CNTN1蛋白的表达水平。CNTN1蛋白的UniProtKB编号为Q12860。
本发明的目的在于针对电离辐射分子流行病学调查的需求，提供一种新型电离辐射生物标志物，用于长期低剂量电离辐射暴露诊断。本发明的关键在于，确定了人体血清中CNTN1蛋白表达水平与长期低剂量受照人群显著相关，血清中CNTN1蛋白表达水平高低可以区分长期低剂量电离辐射暴露人群，因此可以通过检测人体血清中CNTN1作为辐射分子流行病调查的生物标志物，即血清中CNTN1蛋白可以作为长期低剂量电离辐射暴露诊断的分子标记物。本发明实施例具体采用抗体芯片和酶联免疫分析(ELISA)方法进行检测人体血清中CNTN1，但不仅仅限于该手段，可以采用现有蛋白分析技术公开的各种手段，即任何能够检测CNTN1的方法均可用。
CNTN1可作为长期低剂量电离辐射暴露诊断的分子标记物，检测CNTN1蛋白的试剂及试剂盒，可应用于长期低剂量电离辐射暴露检测。检测CNTN1蛋白的方式简便，可以采用芯片或其他蛋白分析技术开展大规模、高通量的人群筛查，具有良好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为抗体芯片一次性筛查16个样本中的蛋白因子示意图。
图2为抗体芯片检测放射组(R，×)与对照组(C，●)的CNTN1水平差异(n＝8；*p<0.05)，纵坐标为芯片信号值，芯片信号值越大说明CNTN1水平越高。
图3为放射组(R，×)与对照组(C，●)人血清CNTN1水平差异(n＝20；*p<0.05)。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
实施例1、抗体芯片初筛血清CNTN1水平与长期低剂量电离辐射暴露的关系
选取放射职业人员(工作年限为10～30年，即长期低剂量电离辐射暴露)和非放射职业人员(非长期低剂量电离辐射暴露)各8名男性，分别作为放射组和对照组。采集空腹晨间静脉血，置于高速冷冻离心机(贝克曼，JXN-30)迅速离心(3000rpm，15min)分离获得血清1mL，保存于-80℃冰箱(赛默飞，TSE240V-ULTS)。
采用广州瑞博奥(RayBiotech)公司的高密度抗体筛选芯片Human Array L-1000(试剂盒)，对每个血清样品可检测包括CNTN1在内的1000个细胞因子。
1、试剂盒内容包括：
玻璃芯片——
Figure BDA0002577580160000031
Biotin label-based human antibody array 1and 2，Item E；
标记试剂——Labeling Reagent，Item B，1张玻片配1管；
终止液——Stop Solution，Item D，50μL；
封闭缓冲液——Blocking Buffer，Item F，每瓶8mL，2张玻片配2瓶；
标记缓冲液——Serum Buffer，Item K，每瓶8mL，2张玻片配1瓶；
1500×荧光标记链霉亲和素——Cy3 equivalent，1张玻片配1管；
透析管和浮漂——Dialysis tube and Floating Rack，Item A；
20×的洗液I——20X Wash Buffer I，Item G，30mL；
20×的洗液II——20X Wash Buffer II，Item H，30mL。
2、主要实验步骤
主要实验步骤如图1所示。
2.1样品透析：取200μL血清样品置于透析管在4000mL的1×PBS(pH＝8)中4℃边搅拌边透析，间隔3h更换透析液，透析三次以后收集样品，测定总蛋白浓度。(1×PBS的配制：1.0g KCl、40g NaCl、1.0g KH2PO4、5.75g Na2HPO4用4500ml去离子水溶解，用1M NaOH调节pH＝8.0，最后用去离子水定容至5000ml。)
2.2生物素标记样品：将适量(40～50μL，根据透析后总蛋白浓度确定)血清样品与140～150μL标记缓冲液混合(二者总体积190μL)，并加入22μL标记试剂，快速混匀，摇床上室温孵育30min。每5min轻弹离心管，混合反应试剂。加入3μL终止液，在4000mL的1×PBS(pH＝8)中4℃边搅拌边透析，间隔3h更换透析液，透析三次以后收集样品。
2.3芯片干燥：将玻片芯片在室温平衡1h后，打开包装袋，揭开密封条，放在真空干燥器干燥1h。
2.4封闭和孵育：
1)每个芯片孔中加入400μL的封闭缓冲液，室温摇床上孵育1h；
2)抽去封闭缓冲液，标记后的血清样品用封闭缓冲液稀释80倍后，每孔中添加400μL，4℃振荡过夜孵育；
3)抽去样品，每个孔中加入1mL的1×洗液I(20×洗液I用去离子水稀释)室温振荡，洗玻片4次，每次5min；
4)抽去1×洗液I，每个孔中加入1mL的1×洗液II(20×洗液II用去离子水稀释)室温振荡，洗玻片4次，每次5min；
5)抽去1×洗液II，Cy3-链霉亲和素管中加入1ml的封闭缓冲液，再用封闭缓冲液稀释5倍。每孔加入400μL上述稀释液室温避光振荡孵育2h；
6)按照步骤3)和4)洗玻片，待检测。
2.5荧光检测：采用激光扫描仪例如InnoScan 300扫描信号，采用Cy3或者绿色通道(激发频率＝532nm)检测。
3、数据分析
采用微阵列显著性分析方法(SAM)对抗体芯片表达谱进行统计学分析处理。差异表达倍数在1.5倍以上，即≥1.5或≤0.67，确定为差异表达的蛋白因子。
4、结果
结果如图2所示：放射组人员(R-CNTN1)人血清中CNTN1蛋白的平均表达水平显著高于对照组(C-CNTN1)平均表达水平，其差异表达倍数为1.5倍，具有统计学意义(p＝0.01)，表明人血清中CNTN1蛋白的表达水平可以区分放射职业人群和普通对照人群。
实施例2、酶联免疫吸附测定(ELISA)血清CNTN1水平与长期低剂量电离辐射暴露的关系
选取放射职业人员(工作年限为10～30年，即长期低剂量电离辐射暴露)和非放射职业人员(非长期低剂量电离辐射暴露)各20名男性，分别作为放射组和对照组。采集空腹晨间静脉血，置于高速冷冻离心机(贝克曼，JXN-30)迅速离心(3000rpm，15min)分离获得血清1mL，保存于-80℃冰箱(赛默飞，TSE240V-ULTS)。
CNTN1酶联免疫试剂盒购自美国瑞博奥(EIA-CNTN1)，检测方法按照说明书的实验步骤进行，具体步骤如下：按照说明书的方法稀释血清样品、制备标准液及其它试剂；在96孔板(康宁，353072)每孔中加入100μl的血清样品或者标准品，于25℃置于LED圆周数显摇床(大龙，SK-O180-S)轻微振荡孵育2.5h；将96孔板置于自动微孔洗板机(美谷分子，MultiWash+)洗板4次，每孔中加入100μl的生物素标记抗体，于25℃轻微振荡孵育1h；洗板4次，每孔中加入100μl的链霉亲和素溶液，于25℃轻微振荡孵育45min；洗板4次，每孔中加入100μl的反应物溶液，于25℃轻微振荡避光孵育30min；每孔中加入50μl的反应终止液，立即使用多功能读板机(美谷分子，I3X)在450nm处读取光信号；根据标准曲线计算获得样品CNTN1浓度，结果如表1和图3所示。
表1.放射组和对照组血清CNTN1水平对比
Figure BDA0002577580160000051
结果表明：放射组人员的平均血清CNTN1水平为6.16±6.12ng/ml，显著高于对照组平均水平(3.41±1.93ng/ml)，其差异具有统计学意义(p<0.05)。表明血清中CNTN1水平可以区分放射职业人群和普通对照人群，长期低剂量电离辐射暴露人群血清CNTN1水平高于非长期低剂量电离辐射暴露的普通人群。
实施例3、CNTN1检测试剂盒的组成及使用方法
任何检测CNTN1蛋白的试剂都可以用于制备诊断长期低剂量电离辐射暴露的试剂盒。
如实施例2所述试剂盒：
(1)试剂盒组成：同实施例2，主要有标准品、生物素标记抗体、链霉亲和素溶液、反应物溶液、反应终止液。
(2)试剂盒的使用方法：同实施例2。
综上，本发明确定了人体血清中CNTN1蛋白表达水平与长期低剂量电离辐射暴露紧密相关，血清中CNTN1蛋白表达水平高低可以区分长期低剂量电离辐射暴露人群，因此血清中CNTN1蛋白可以作为长期低剂量电离辐射暴露诊断的分子标记物，检测CNTN1蛋白的试剂及试剂盒，可应用于长期低剂量电离辐射暴露的检测。检测CNTN1蛋白的方式简便，可以采用芯片或其他蛋白分析技术开展大规模、高通量的人群筛查，具有良好的应用前景。

Claims (10)

1.CNTN1作为长期低剂量电离辐射暴露诊断的分子标记物的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述CNTN1为人血清中的CNTN1蛋白。
3.检测CNTN1蛋白的试剂在制备诊断长期低剂量电离辐射暴露的试剂盒中的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述检测CNTN1蛋白的试剂为酶联免疫吸附试验用试剂或酶联免疫分析试剂。
5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述检测CNTN1蛋白的试剂为westernblot试剂或蛋白芯片检测方法用试剂。
6.根据权利要求3～5任一项所述的用途，其特征在于：所述检测CNTN1蛋白的试剂为检测人血清中CNTN1蛋白的试剂。
7.一种诊断长期低剂量电离辐射暴露的试剂盒，其特征在于：它包括用于检测CNTN1蛋白的试剂。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述检测CNTN1蛋白的试剂为酶联免疫吸附试验用试剂或酶联免疫分析试剂。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述检测CNTN1蛋白的试剂为westernblot试剂或蛋白芯片检测方法用试剂。
10.根据权利要求7～9所述的试剂盒，其特征在于：所述检测CNTN1蛋白的试剂为检测人血清中CNTN1蛋白的试剂。
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