JP7067800B2 - 神経障害性疼痛マーカー及びその使用 - Google Patents
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Description
本発明は、神経障害性疼痛マーカー及びその使用に関する。より具体的には、神経障害性疼痛マーカー、神経障害性疼痛の検出方法、及び、神経障害性疼痛の診断キットに関する。本願は、２０１７年４月１２日に米国に仮出願された仮出願第６２／４８４，４０６号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
神経障害性疼痛（ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ ｐａｉｎ）は、国際疼痛学会（ＩＡＳＰ：Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｐａｉｎ）により、「体性感覚神経系の病変や疾患によって生じる痛み」と定義される様々な病態を含む難治性疼痛の一つである（例えば、非特許文献１を参照。）。
末梢神経の神経線維は、髄鞘の有無、直径、伝導速度等により、Ａα線維、Ａβ線維、Ａδ線維、Ｂ線維、Ｃ線維に分類される。一般に、直径が太い神経線維の方が伝導速度が速く、また、有髄である神経線維の方が伝導速度が速い傾向にある。これらの神経線維のうち、Ａα線維、Ａβ線維、Ａδ線維、Ｂ線維は有髄線維であり、Ｃ線維は無髄線維である。
神経障害性疼痛は主にＡδ線維とＣ線維の障害により生じると考えられている。部位のはっきりする鋭い痛みは小径有髄線維であるＡδ線維が担っており、鈍く遅い痛みは無髄線維であるＣ線維が担っている。
しかしながら、一般的な末梢神経障害の検査である神経伝導検査では、大径有髄線維であるＡβ線維が検査される。このため、神経障害性疼痛の患者に一般的な末梢神経障害の検査を行っても異常を検出することができない。その結果、神経障害性疼痛の患者の多くが原因不明又は心因性と判断され、診断にまで至っていないのが現状である。
Baron R., et al., Neuropathic pain: diagnosis, pathophysiological mechanisms, and treatment., Lancet Neurol., vol. 9 (8), 807-819, 2010.
このような背景のもと、本発明は、神経障害性疼痛を検出する技術を提供することを目的とする。
本発明は以下の態様を含む。
［１］神経障害性疼痛マーカーとしての小型無髄後根神経節ニューロンに対する自己抗体の使用。
［２］前記自己抗体が抗Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１抗体である、［１］に記載の使用。
［３］神経障害性疼痛の検出方法であって、患者由来の血液試料中の、小型無髄後根神経節ニューロンに対する自己抗体を検出することを備え、前記自己抗体が検出されることが、前記患者が神経障害性疼痛に罹患していることを示す、方法。
［４］小型無髄後根神経節ニューロンに対する自己抗体を検出することが、ヒト又は非ヒト動物由来の後根神経節組織又は脊髄後角組織に患者由来の血液試料を接触させ、前記後根神経節組織又は前記脊髄後角組織に結合したヒトＩｇＧ抗体を検出することと、前記後根神経節組織又は前記脊髄後角組織における有髄後根神経節ニューロン又はその神経線維を検出することと、を含み、前記ヒトＩｇＧ抗体が前記有髄後根神経節ニューロン以外のニューロンに結合したことが、小型無髄後根神経節ニューロンに対する自己抗体が検出されたことを示す、［３］に記載の方法。
［５］有髄後根神経節ニューロンを検出することが、前記後根神経節組織を抗Ｓ１００β抗体で免疫染色することを含み、前記抗Ｓ１００β抗体で免疫染色されたニューロンが有髄後根神経節ニューロンである、［４］に記載の方法。
［６］小型無髄後根神経節ニューロンに対する自己抗体を検出することが、ヒト又は非ヒト動物由来の後根神経節組織又は脊髄後角組織に患者由来の血液試料を接触させ、前記後根神経節組織又は前記脊髄後角組織に結合したヒトＩｇＧ抗体を検出することと、前記後根神経節組織又は前記脊髄後角組織における無髄後根神経節ニューロン又はその神経線維を検出することと、を含み、前記ヒトＩｇＧ抗体が前記無髄後根神経節ニューロンに結合したことが、小型無髄後根神経節ニューロンに対する自己抗体が検出されたことを示す、［３］に記載の方法。
［７］無髄後根神経節ニューロンを検出することが、前記後根神経節組織にイソレクチンＢ４を接触させることを含み、前記イソレクチンＢ４が結合したニューロンが無髄後根神経節ニューロンである、［６］に記載の方法。
［８］前記ヒトＩｇＧ抗体がＩｇＧ２抗体である、［３］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］前記自己抗体が抗Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１抗体である、［３］～［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］神経障害性疼痛の検出方法であって、Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１を発現するヒト細胞又は非ヒト動物細胞に患者由来の血液試料を接触させ、前記細胞に結合したヒトＩｇＧ抗体を検出することを含み、検出された前記ヒトＩｇＧ抗体の量が、Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１を発現しない細胞に前記血液試料を接触させた場合に、当該細胞に結合するヒトＩｇＧ抗体の量と比較して多いことが、前記患者が神経障害性疼痛に罹患していることを示す、方法。
［１１］抗ヒトＩｇＧ抗体と、有髄後根神経節ニューロンの検出薬又は無髄後根神経節ニューロンの検出薬と、を備える、神経障害性疼痛の診断キット。
［１２］前記抗ヒトＩｇＧ抗体が、抗ヒトＩｇＧ２抗体である、［１１］に記載の診断キット。
［１３］前記有髄後根神経節ニューロンの検出薬が、抗Ｓ１００β抗体である、［１１］又は［１２］に記載の診断キット。
［１４］前記無髄後根神経節ニューロンの検出薬が、イソレクチンＢ４である、［１１］～［１３］のいずれかに記載の診断キット。
［１５］抗ヒトＩｇＧ抗体と、Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質と、を備える、神経障害性疼痛の診断キット。
［１６］前記抗ヒトＩｇＧ抗体が、抗ヒトＩｇＧ２抗体である、［１５］に記載の診断キット。
［１］神経障害性疼痛マーカーとしての小型無髄後根神経節ニューロンに対する自己抗体の使用。
［２］前記自己抗体が抗Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１抗体である、［１］に記載の使用。
［３］神経障害性疼痛の検出方法であって、患者由来の血液試料中の、小型無髄後根神経節ニューロンに対する自己抗体を検出することを備え、前記自己抗体が検出されることが、前記患者が神経障害性疼痛に罹患していることを示す、方法。
［４］小型無髄後根神経節ニューロンに対する自己抗体を検出することが、ヒト又は非ヒト動物由来の後根神経節組織又は脊髄後角組織に患者由来の血液試料を接触させ、前記後根神経節組織又は前記脊髄後角組織に結合したヒトＩｇＧ抗体を検出することと、前記後根神経節組織又は前記脊髄後角組織における有髄後根神経節ニューロン又はその神経線維を検出することと、を含み、前記ヒトＩｇＧ抗体が前記有髄後根神経節ニューロン以外のニューロンに結合したことが、小型無髄後根神経節ニューロンに対する自己抗体が検出されたことを示す、［３］に記載の方法。
［５］有髄後根神経節ニューロンを検出することが、前記後根神経節組織を抗Ｓ１００β抗体で免疫染色することを含み、前記抗Ｓ１００β抗体で免疫染色されたニューロンが有髄後根神経節ニューロンである、［４］に記載の方法。
［６］小型無髄後根神経節ニューロンに対する自己抗体を検出することが、ヒト又は非ヒト動物由来の後根神経節組織又は脊髄後角組織に患者由来の血液試料を接触させ、前記後根神経節組織又は前記脊髄後角組織に結合したヒトＩｇＧ抗体を検出することと、前記後根神経節組織又は前記脊髄後角組織における無髄後根神経節ニューロン又はその神経線維を検出することと、を含み、前記ヒトＩｇＧ抗体が前記無髄後根神経節ニューロンに結合したことが、小型無髄後根神経節ニューロンに対する自己抗体が検出されたことを示す、［３］に記載の方法。
［７］無髄後根神経節ニューロンを検出することが、前記後根神経節組織にイソレクチンＢ４を接触させることを含み、前記イソレクチンＢ４が結合したニューロンが無髄後根神経節ニューロンである、［６］に記載の方法。
［８］前記ヒトＩｇＧ抗体がＩｇＧ２抗体である、［３］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］前記自己抗体が抗Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１抗体である、［３］～［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］神経障害性疼痛の検出方法であって、Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１を発現するヒト細胞又は非ヒト動物細胞に患者由来の血液試料を接触させ、前記細胞に結合したヒトＩｇＧ抗体を検出することを含み、検出された前記ヒトＩｇＧ抗体の量が、Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１を発現しない細胞に前記血液試料を接触させた場合に、当該細胞に結合するヒトＩｇＧ抗体の量と比較して多いことが、前記患者が神経障害性疼痛に罹患していることを示す、方法。
［１１］抗ヒトＩｇＧ抗体と、有髄後根神経節ニューロンの検出薬又は無髄後根神経節ニューロンの検出薬と、を備える、神経障害性疼痛の診断キット。
［１２］前記抗ヒトＩｇＧ抗体が、抗ヒトＩｇＧ２抗体である、［１１］に記載の診断キット。
［１３］前記有髄後根神経節ニューロンの検出薬が、抗Ｓ１００β抗体である、［１１］又は［１２］に記載の診断キット。
［１４］前記無髄後根神経節ニューロンの検出薬が、イソレクチンＢ４である、［１１］～［１３］のいずれかに記載の診断キット。
［１５］抗ヒトＩｇＧ抗体と、Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質と、を備える、神経障害性疼痛の診断キット。
［１６］前記抗ヒトＩｇＧ抗体が、抗ヒトＩｇＧ２抗体である、［１５］に記載の診断キット。
本発明により、神経障害性疼痛を検出する技術を提供することができる。
［神経障害性疼痛マーカー］
１実施形態において、本発明は、神経障害性疼痛マーカーを提供する。実施例において後述するように、発明者らは、小型無髄後根神経節ニューロンに対する自己抗体が神経障害性疼痛のマーカーであることを明らかにした。したがって、患者血清中に、小型無髄後根神経節ニューロンに対する自己抗体が検出されることは、当該患者が神経障害性疼痛を有することを示す。
１実施形態において、本発明は、神経障害性疼痛マーカーを提供する。実施例において後述するように、発明者らは、小型無髄後根神経節ニューロンに対する自己抗体が神経障害性疼痛のマーカーであることを明らかにした。したがって、患者血清中に、小型無髄後根神経節ニューロンに対する自己抗体が検出されることは、当該患者が神経障害性疼痛を有することを示す。
従来、神経障害性疼痛を検出することは困難であった。これに対し、本実施形態のマーカーにより、神経障害性疼痛を容易に検出することができる。
本実施形態は、神経障害性疼痛マーカーとしての小型無髄後根神経節ニューロンに対する自己抗体の使用を提供するものであるということもできる。あるいは、小型無髄後根神経節ニューロンに対する自己抗体を、神経障害性疼痛マーカーとして使用する方法を提供するものであるということもできる。
小型無髄後根神経節ニューロンに対する自己抗体は、抗Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１抗体であってもよいし、抗Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１抗体以外の小型無髄後根神経節ニューロンに対する自己抗体であってもよい。実施例において後述するように、発明者らは、神経障害性疼痛を有する患者の血清中に、抗Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１抗体が存在することを明らかにした。しかしながら、小型無髄後根神経節ニューロンに対する全ての自己抗体がＰｌｅｘｉｎＤ１だけを認識しているわけではないと推定される。
なお、ヒトＰｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質のＲｅｆＳｅｑＩＤはＮＰ＿０５５９１８であり、マウスＰｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質のＲｅｆＳｅｑＩＤはＮＰ＿０８０６５２である。
患者由来の血液試料中の抗Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１抗体は、例えば、ラテラルフローイムノアッセイ法、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング法等により検出してもよい。例えば、Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質を固定した固相に、患者由来の血液試料を反応させた後、Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質に結合した自己抗体を抗ヒトＩｇＧ抗体で検出する方法等が挙げられる。
Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１は、従来、神経発生のガイダンス因子、免疫細胞の分化や活性化に関わるセマフォリンの受容体等として知られていた分子である。従来、Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１と痛みとの関係は報告されていない。
患者の血清中に存在する抗ＰｌｅｘｉｎＤ１抗体、又は、抗原未同定の、小型無髄後根神経節ニューロンに対する自己抗体の存在が検出されることは、当該患者が神経障害性疼痛を有することを示す。すなわち、患者の血清中に存在する抗ＰｌｅｘｉｎＤ１抗体、又は、抗原未同定の、小型無髄後根神経節ニューロンに対する自己抗体を検出することにより、従来原因不明と診断されていた神経障害性疼痛を診断することが可能となる。
本実施形態は、患者が神経障害性疼痛に罹患しているか否かを診断するためのデータ収集方法であって、患者の血清中に存在する抗ＰｌｅｘｉｎＤ１抗体、又は、抗原未同定の、小型無髄後根神経節ニューロンに対する自己抗体の存在を検出することを含む方法であるということもできる。なお、データ収集方法は、医師が患者の状態を判断する工程を含まない。
患者の血清中に、抗小型無髄後根神経節ニューロン抗体が検出された場合、ｓｍａｌｌ ｆｉｂｅｒ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ（小径線維ニューロパチー）であると診断することができる。小径線維ニューロパチーは免疫療法により治療することができる。
したがって、小型無髄後根神経節ニューロンに対する自己抗体の存在を指標とすることにより、神経障害性疼痛の治療に対する免疫療法の適応を速やかに判断することが可能となり、神経障害性疼痛の早期診断・早期治療が可能となる。
Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１に対する自己抗体陽性、又は、抗原未同定の、小型無髄後根神経節ニューロンに対する自己抗体陽性の神経障害性疼痛の患者は、他の原因による神経障害性疼痛患者と異なり、治療が可能である。
これらの患者の神経障害性疼痛は、副腎皮質ステロイド薬の投与、免疫抑制剤の投与、大量免疫グロブリン療法、血漿交換療法等の免疫療法により治療することができる。また、対症療法として、小径無髄線維を標的とする、ＳＣＮ９Ａ阻害剤、ＳＣＮ１０Ａ阻害剤、Ｐ２Ｘ３受容体アンタゴニスト等の鎮痛剤を投与することが効果的である。
［神経障害性疼痛の検出方法］
（第１実施形態）
１実施形態において、本発明は、神経障害性疼痛の検出方法であって、患者由来の血液試料中の、小型無髄後根神経節ニューロンに対する自己抗体を検出することを備え、前記自己抗体が検出されることが、前記患者が神経障害性疼痛に罹患していることを示す方法を提供する。以下、本実施形態の方法を、蛍光間接抗体法（ｔｉｓｓｕｅ－ｂａｓｅｄ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓａｙ、ＩＦＡ）という場合がある。
（第１実施形態）
１実施形態において、本発明は、神経障害性疼痛の検出方法であって、患者由来の血液試料中の、小型無髄後根神経節ニューロンに対する自己抗体を検出することを備え、前記自己抗体が検出されることが、前記患者が神経障害性疼痛に罹患していることを示す方法を提供する。以下、本実施形態の方法を、蛍光間接抗体法（ｔｉｓｓｕｅ－ｂａｓｅｄ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓａｙ、ＩＦＡ）という場合がある。
第１実施形態の方法は、患者が神経障害性疼痛に罹患しているか否かを診断するためのデータ収集方法であるということもできる。なお、データ収集方法は、医師が患者の状態を判断する工程を含まない。
本実施形態の方法において、小型無髄後根神経節ニューロンに対する自己抗体を検出することは、ヒト又は非ヒト動物由来の後根神経節組織又は脊髄後角組織に患者由来の血液試料を接触させ、前記後根神経節組織又は前記脊髄後角組織に結合したヒトＩｇＧ抗体を検出することと、前記後根神経節組織又は前記脊髄後角組織における有髄後根神経節ニューロン又はその神経線維を検出することと、を含み、前記ヒトＩｇＧ抗体が前記有髄後根神経節ニューロン以外のニューロンに結合したことが、小型無髄後根神経節ニューロンに対する自己抗体が検出されたことを示すものであってもよい。
第１実施形態の方法によれば、後根神経節組織又は前記脊髄後角組織に反応する自己抗体を検出するため、抗原未同定の、小型無髄後根神経節ニューロンに対する自己抗体を検出することができる。
非ヒト動物としては、特に限定されず、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ等が挙げられる。
実施例において後述するように、発明者らは、神経障害性疼痛を有する患者由来の血清を、ヒト後根神経節の組織切片、ヒト脊髄後角の組織切片、マウス後根神経節の組織切片、マウス脊髄後角の組織切片等と反応させて、その結合を検出することにより、小型無髄後根神経節ニューロンに対する自己抗体を検出できることを明らかにした。
また、有髄後根神経節ニューロンを検出することが、前記後根神経節組織を抗Ｓ１００β抗体で免疫染色することを含み、前記抗Ｓ１００β抗体で免疫染色されたニューロンを有髄後根神経節ニューロンであると判断してもよい。実施例において後述するように、発明者らは、神経障害性疼痛を有する患者由来の自己抗体が、抗Ｓ１００β抗体とは共局在しないことを明らかにした。
本実施形態の方法において、小型無髄後根神経節ニューロンに対する自己抗体を検出することは、ヒト又は非ヒト動物由来の後根神経節組織又は脊髄後角組織に患者由来の血液試料を接触させ、前記後根神経節組織又は前記脊髄後角組織に結合したヒトＩｇＧ抗体を検出することと、前記後根神経節組織又は前記脊髄後角組織における無髄後根神経節ニューロン又はその神経線維を検出することと、を含み、前記ヒトＩｇＧ抗体が前記無髄後根神経節ニューロンに結合したことが、小型無髄後根神経節ニューロンに対する自己抗体が検出されたことを示すものであってもよい。
非ヒト動物については上述したものと同様である。また、無髄後根神経節ニューロンを検出することが、前記後根神経節組織にイソレクチンＢ４を接触させることを含み、前記イソレクチンＢ４が結合したニューロンが無髄後根神経節ニューロンであると判断してもよい。実施例において後述するように、発明者らは、神経障害性疼痛を有する患者由来の自己抗体が、イソレクチンＢ４と共局在することを明らかにした。
本実施形態の方法において、患者由来の血液試料に含まれる、小型無髄後根神経節ニューロンに対する自己抗体は、ＩｇＧ２抗体であってもよい。実施例において後述するように、発明者らは、神経障害性疼痛を有する患者由来の自己抗体のＩｇＧサブクラスがＩｇＧ２であることを明らかにした。
本実施形態の方法において、患者由来の血液試料に含まれる、小型無髄後根神経節ニューロンに対する自己抗体は、抗Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１抗体であってもよい。実施例において後述するように、発明者らは、神経障害性疼痛を有する患者由来の自己抗体が抗Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１抗体であることを明らかにした。
（第２実施形態）
１実施形態において、本発明は、神経障害性疼痛の検出方法であって、Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１を発現するヒト細胞又は非ヒト動物細胞に患者由来の血液試料を接触させ、前記細胞に結合したヒトＩｇＧ抗体を検出することを含み、検出された前記ヒトＩｇＧ抗体の量が、Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１を発現しない細胞に前記血液試料を接触させた場合に、当該細胞に結合するヒトＩｇＧ抗体の量と比較して多いことが、前記患者が神経障害性疼痛に罹患していることを示す方法を提供する。
１実施形態において、本発明は、神経障害性疼痛の検出方法であって、Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１を発現するヒト細胞又は非ヒト動物細胞に患者由来の血液試料を接触させ、前記細胞に結合したヒトＩｇＧ抗体を検出することを含み、検出された前記ヒトＩｇＧ抗体の量が、Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１を発現しない細胞に前記血液試料を接触させた場合に、当該細胞に結合するヒトＩｇＧ抗体の量と比較して多いことが、前記患者が神経障害性疼痛に罹患していることを示す方法を提供する。
第２実施形態の方法は、患者が神経障害性疼痛に罹患しているか否かを診断するためのデータ収集方法であるということもできる。なお、データ収集方法は、医師が患者の状態を判断する工程を含まない。
第２実施形態の方法は、第１実施形態の方法と比較して、自己抗体の抗原がＰｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質に限定されている点において主に異なる。
非ヒト動物については上述したものと同様である。Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１を発現する細胞は、本来Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１を発現する細胞であってもよいし、Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１の発現ベクターを導入した結果、Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１を発現するようになった細胞であってもよい。例えば、実施例において後述するように、ＨｅＬａ細胞をＰｌｅｘｉｎ Ｄ１を発現する細胞として用いることができる。
また、Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１を発現しない細胞は、本来Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１を発現しない細胞であってもよいし、Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質をコードする遺伝子である、ＰＬＸＮＤ１遺伝子が破壊された細胞であってもよいし、Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１の発現量が低下した細胞であってもよい。具体的には、例えば、実施例において後述するように、ＰＬＸＮＤ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡを導入したＨｅＬａ細胞をＰｌｅｘｉｎ Ｄ１を発現しない細胞として用いることができる。
第２実施形態の方法において、患者由来の血液試料に含まれる自己抗体は、ＩｇＧ２抗体であってもよい。
［神経障害性疼痛の診断キット］
（第１実施形態）
１実施形態において、本発明は、抗ヒトＩｇＧ抗体と、有髄後根神経節ニューロンの検出薬又は無髄後根神経節ニューロンの検出薬と、を備える、神経障害性疼痛の診断キットを提供する。
（第１実施形態）
１実施形態において、本発明は、抗ヒトＩｇＧ抗体と、有髄後根神経節ニューロンの検出薬又は無髄後根神経節ニューロンの検出薬と、を備える、神経障害性疼痛の診断キットを提供する。
本実施形態のキットは、上述した第１実施形態の神経障害性疼痛の検出方法に好適に用いることができる。具体的には、ヒト又は非ヒト動物由来の後根神経節組織又は脊髄後角組織に患者由来の血液試料を接触させた後、抗ヒトＩｇＧ抗体により患者由来のＩｇＧ抗体を検出すればよい。抗ヒトＩｇＧ抗体が、抗ヒトＩｇＧ２抗体であってもよい。
また、有髄後根神経節ニューロンの検出薬又は無髄後根神経節ニューロンの検出薬により、患者由来のＩｇＧ抗体が有髄後根神経節ニューロンに結合したか、無髄後根神経節ニューロンに結合したかを判断することができる。有髄後根神経節ニューロンの検出薬としては、抗Ｓ１００β抗体が挙げられる。また、無髄後根神経節ニューロンの検出薬としては、イソレクチンＢ４が挙げられる。
小型無髄後根神経節ニューロンに対する自己抗体が検出された場合、当該患者は神経障害性疼痛患者であると判断することができる。
（第２実施形態）
１実施形態において、本発明は、抗ヒトＩｇＧ抗体と、Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質と、を備える、神経障害性疼痛の診断キットを提供する。
１実施形態において、本発明は、抗ヒトＩｇＧ抗体と、Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質と、を備える、神経障害性疼痛の診断キットを提供する。
本実施形態のキットによれば、例えば、ラテラルフローイムノアッセイ法、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング法等により、患者由来の血液試料中に、Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質に対する自己抗体が存在するか否かを容易に検出することができる。
より具体的には、例えば、Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質を固定した固相に、患者由来の血液試料を反応させた後、Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質に結合した自己抗体を抗ヒトＩｇＧ抗体で検出することにより、自己抗体の存在を検出することができる。
本実施形態のキットにおいて、Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質としては、Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質の全長を用いてもよいし、Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質の細胞外ドメインを用いてもよいし、自己抗体の検出に有効なＰｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質のエピトープ部を特定し、より短い部分ペプチドを用いてもよい。Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質としては、例えば、実施例において後述する組換えヒトＰｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質（型式「４１６０－ＰＤ」、Ｒ＆Ｄシステムズ社、アミノ酸配列を配列番号８に示す。）等を用いることができる。
Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質に対する自己抗体が検出された場合、当該患者は神経障害性疼痛患者であると判断することができる。上記の抗ヒトＩｇＧ抗体は、抗ヒトＩｇＧ２抗体であってもよい。
［その他の実施形態］
１実施形態において、本発明は、患者の神経障害性疼痛の診断及び治療を行う方法であって、前記患者から血液試料を採取することと、前記血液試料中に小型無髄後根神経節ニューロンに対する自己抗体が存在するか否かを検出することと、前記自己抗体が存在した場合に、前記患者は神経障害性疼痛であると診断することと、神経障害性疼痛であると診断された場合に、前記患者に、有効量の、副腎皮質ステロイド薬、免疫抑制剤、ＳＣＮ９Ａ阻害剤、ＳＣＮ１０Ａ阻害剤、Ｐ２Ｘ３受容体アンタゴニストからなる群より選択される薬物を投与するか、又は、大量免疫グロブリン療法若しくは血漿交換療法を実施することを含む、方法を提供する。
１実施形態において、本発明は、患者の神経障害性疼痛の診断及び治療を行う方法であって、前記患者から血液試料を採取することと、前記血液試料中に小型無髄後根神経節ニューロンに対する自己抗体が存在するか否かを検出することと、前記自己抗体が存在した場合に、前記患者は神経障害性疼痛であると診断することと、神経障害性疼痛であると診断された場合に、前記患者に、有効量の、副腎皮質ステロイド薬、免疫抑制剤、ＳＣＮ９Ａ阻害剤、ＳＣＮ１０Ａ阻害剤、Ｐ２Ｘ３受容体アンタゴニストからなる群より選択される薬物を投与するか、又は、大量免疫グロブリン療法若しくは血漿交換療法を実施することを含む、方法を提供する。
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実験例１］
（血液試料の採取）
神経障害性疼痛を有する患者から血液試料を採取した。神経障害性疼痛を有する患者としては、国際疼痛学会が提唱する神経障害性疼痛の診断基準（Finnerup N. B., et al., Neuropathic pain: an updated grading system for research and clinical practice., Pain, vol. 157 (8), 1599-1606, 2016.）において、ｐｒｏｂａｂｌｅ及びｄｅｆｉｎｉｔｅの基準を満たす１１０名の患者を対象とした。
（血液試料の採取）
神経障害性疼痛を有する患者から血液試料を採取した。神経障害性疼痛を有する患者としては、国際疼痛学会が提唱する神経障害性疼痛の診断基準（Finnerup N. B., et al., Neuropathic pain: an updated grading system for research and clinical practice., Pain, vol. 157 (8), 1599-1606, 2016.）において、ｐｒｏｂａｂｌｅ及びｄｅｆｉｎｉｔｅの基準を満たす１１０名の患者を対象とした。
神経障害性疼痛を有する患者の内訳は、アトピー性脊髄炎患者２２名、視神経脊髄炎（ＮＭＯＳＤ）患者１７名、再発寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）患者１５名、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）患者１４名、脊髄根末梢神経炎を有するシェーグレン症候群患者１０名、神経サルコイドーシス患者１０名、チャーグストラウス患者６名、脊髄炎と末梢神経炎を有する全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者４名、神経ベーチェット病（ｎＢＤ）患者３名、肢端紅痛症患者２名、薬物誘導性ニューロパチー患者２名、ビタミン欠乏性ニューロパチー患者２名、抗ＳＧＰＧ抗体陽性ニューロパチー患者１名、ギラン・バレー症候群患者１名、クリオグロブリン血症患者１名であった。
また、対照として、健常人及び神経障害性疼痛のない患者（合計５０名）からも血液試料を採取した。５０名の内訳は、健常人２０名、神経変性疾患患者２０名（うち、６名は筋萎縮性側索硬化症であり、４名は多系統萎縮症であり、３名は脊髄小脳変性症であり、２名はパーキンソン病であり、２名は正常圧水頭症であり、１名はアルツハイマー病であり、１名は認知症であり、１名は大脳皮質基底核変性症であった。）、コラーゲン血管疾患患者１０名（うち、４名が全身性エリテマトーデスであり、４名がベーチェット病であり、２名がシェーグレン症候群であった。）であった。
［実験例２］
（後根神経節ニューロンに対する自己抗体の検出）
マウス後根神経節（Ｄｏｒｓａｌ ｒｏｏｔ ｇａｎｇｌｉｏｎ、ＤＲＧ）の組織切片及びマウス脊髄（ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ、ＳＣ）の組織切片を用いて、実験例１で採取した血液試料中の、後根神経節ニューロンに対する自己抗体を検出した。
（後根神経節ニューロンに対する自己抗体の検出）
マウス後根神経節（Ｄｏｒｓａｌ ｒｏｏｔ ｇａｎｇｌｉｏｎ、ＤＲＧ）の組織切片及びマウス脊髄（ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ、ＳＣ）の組織切片を用いて、実験例１で採取した血液試料中の、後根神経節ニューロンに対する自己抗体を検出した。
《組織切片の調製》
８～１０週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６マウスに麻酔をかけた。続いて、リン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）で潅流した。続いて、４％のパラホルムアルデヒドで潅流固定を行った。続いて、腰髄レベル（Ｌ４－Ｌ６）の脊髄と後根神経節を摘出し、各組織を１０％のホルムアルデヒドで固定した。続いて、各組織をパラフィン包埋し、４μｍ厚の組織切片を作製し、スライドガラスに張り付けた。
８～１０週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６マウスに麻酔をかけた。続いて、リン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）で潅流した。続いて、４％のパラホルムアルデヒドで潅流固定を行った。続いて、腰髄レベル（Ｌ４－Ｌ６）の脊髄と後根神経節を摘出し、各組織を１０％のホルムアルデヒドで固定した。続いて、各組織をパラフィン包埋し、４μｍ厚の組織切片を作製し、スライドガラスに張り付けた。
《血液試料との反応》
調製した組織切片をキシレンに５分間浸漬することを３回繰り返し、脱パラフィンした。続いて、組織切片を１００％のエタノールに５分間浸漬することを２回繰り返し、水和させた。続いて、抗原賦活化処理を行った。具体的には、組織切片をクエン酸バッファー（ｐＨ６．０）中で１２０℃、１０分間煮沸し、室温で１５分かけて徐冷し、ＰＢＳで５分間の洗浄を２回行った。
調製した組織切片をキシレンに５分間浸漬することを３回繰り返し、脱パラフィンした。続いて、組織切片を１００％のエタノールに５分間浸漬することを２回繰り返し、水和させた。続いて、抗原賦活化処理を行った。具体的には、組織切片をクエン酸バッファー（ｐＨ６．０）中で１２０℃、１０分間煮沸し、室温で１５分かけて徐冷し、ＰＢＳで５分間の洗浄を２回行った。
続いて、組織切片に１０％ヤギ血清／ＰＢＳを接触させて室温で３０分間静置し、ブロッキングした。続いて、組織切片に、１次抗体として６０倍希釈した血液試料（血清）を接触させて３７℃で１時間静置し、抗原抗体反応を行った。続いて、ＰＢＳで５分間の洗浄を２回行った。
続いて、組織切片に５００倍希釈した２次抗体（Ａｌｅｘａ４８８標識抗ヒトＩｇＧ抗体、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を接触させて室温で１時間静置し、抗原抗体反応を行った。続いて、ＰＢＳで５分間の洗浄を２回行った。
続いて、組織切片を封入し、共焦点レーザ顕微鏡（型式「ＬＳＭ５１０」、カールツァイス社）で観察した。その結果、健常者由来の血清には、マウス後根神経節の組織切片やマウス脊髄の組織切片に反応する自己抗体がほとんど存在しないことが明らかとなった。
一方、神経障害性疼痛を有する１１０名の患者由来の血清のうち、１１名の患者由来の血清が、マウス後根神経節の組織切片の小型無髄後根神経節ニューロン及び脊髄後角に存在するその神経終末に反応する自己抗体を含んでいたことが明らかとなった。
図１（ａ）は、対照血清を反応させたマウス後根神経節の組織切片の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは５０μｍを示す。また、図１（ｂ）～（ｆ）は、神経障害性疼痛を有する患者（それぞれ、症例１～５）由来の血清を反応させたマウス後根神経節の組織切片のうち、自己抗体が検出された代表的な結果を示す蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは５０μｍを示す。
また、図２（ａ）は、図１（ａ）と同じ健常者由来の血清を反応させたマウス脊髄の組織切片の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは５０μｍを示す。図２（ｂ）は図２（ａ）と同じ試料を高倍率で撮影した蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは５０μｍを示す。
また、図２（ｃ）は、図１（ｆ）と同じ患者（症例５）由来の血清を反応させたマウス脊髄の組織切片の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは５０μｍを示す。図２（ｄ）は図２（ｃ）と同じ試料を高倍率で撮影した蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは５０μｍを示す。
以下、本実験例の方法を蛍光間接抗体法（ｔｉｓｓｕｅ－ｂａｓｅｄ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓａｙ、ＩＦＡ）という場合がある。
下記表１に結果をまとめた。表１中、「ＮｅＰ」は神経障害性疼痛を表し、「ＮＳ」は有意差がないことを表し、「ＩＦＡ」は蛍光間接抗体法を表す。連続変数の比較にはマン・ホイットニーのＵ検定を用いた。また、ＮｅＰを有する患者と有しない患者の間のカテゴリー間の変数の比較にはカイ二乗検定を用い、カイ二乗検定を適用できない場合にはフィッシャーの正確確率検定を用いた。
また、下記表２に、マウス後根神経節の組織切片に反応する自己抗体を含んでいた１１名の患者の臨床的特徴を示す。
［実験例３］
（後根神経節ニューロンに対する自己抗体のサブクラスの検討）
実験例２において検出された、マウス後根神経節の組織切片に反応する自己抗体を含んでいた１１名の患者由来の血清について、自己抗体のＩｇＧサブクラスを検討した。
（後根神経節ニューロンに対する自己抗体のサブクラスの検討）
実験例２において検出された、マウス後根神経節の組織切片に反応する自己抗体を含んでいた１１名の患者由来の血清について、自己抗体のＩｇＧサブクラスを検討した。
具体的には、２次抗体反応において、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４にそれぞれ特異的なＦＩＴＣ標識マウスモノクローナル抗体（シグマアルドリッチ社）を、それぞれ５０倍希釈して反応させた点以外は実験例２と同様の蛍光間接抗体法を行った。
図３（ａ）～（ｄ）は、それぞれ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４である自己抗体を検出した代表的な結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは５０μｍを示す。その結果、１１名の患者由来の血清全てにおいて、自己抗体のＩｇＧサブクラスがＩｇＧ２であることが明らかとなった。
［実験例４］
（自己抗体が反応する後根神経節ニューロンのサブタイプの検討）
実験例２において検出された、マウス後根神経節の組織切片に反応する１１名の患者由来の自己抗体について、小型無髄後根神経節ニューロン（無髄Ｃ線維型後根神経節ニューロン）に選択的に結合するか否かを検討した。
（自己抗体が反応する後根神経節ニューロンのサブタイプの検討）
実験例２において検出された、マウス後根神経節の組織切片に反応する１１名の患者由来の自己抗体について、小型無髄後根神経節ニューロン（無髄Ｃ線維型後根神経節ニューロン）に選択的に結合するか否かを検討した。
《イソレクチンＢ４との二重染色》
１次抗体反応において、６０倍希釈した患者血清に加え、非ペプチド性Ｃ線維型後根神経節ニューロンのマーカーであるイソレクチンＢ４（Ｉｓｏｌｅｃｔｉｎ ＧＳ－ＩＢ４ Ｆｒｏｍ Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ、 Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を５００倍希釈して反応させた点以外は実験例２と同様の蛍光間接抗体法を行った。
１次抗体反応において、６０倍希釈した患者血清に加え、非ペプチド性Ｃ線維型後根神経節ニューロンのマーカーであるイソレクチンＢ４（Ｉｓｏｌｅｃｔｉｎ ＧＳ－ＩＢ４ Ｆｒｏｍ Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ、 Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を５００倍希釈して反応させた点以外は実験例２と同様の蛍光間接抗体法を行った。
図４（ａ）は、神経障害性疼痛を有する患者由来の血清を反応させたマウス後根神経節の組織切片の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。図４（ｂ）は、図４（ａ）と同一の視野において、イソレクチンＢ４（ＩＢ４）の結合を検出した結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。図４（ｃ）は、図４（ａ）及び図４（ｂ）の写真をマージしたものである。スケールバーは５０μｍを示す。その結果、患者由来の自己抗体は、イソレクチンＢ４と共局在したことが明らかとなった。
《抗ＣＧＲＰ抗体との二重染色》
１次抗体反応において、６０倍希釈した患者血清に加え、ペプチド性Ｃ線維型後根神経節ニューロンのマーカーであるカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ ｇｅｎｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ、ＣＧＲＰ）に対する抗体（ウサギポリクローナル抗体、矢内原研究所）を５００倍希釈して反応させた点以外は実験例２と同様の蛍光間接抗体法を行った。
１次抗体反応において、６０倍希釈した患者血清に加え、ペプチド性Ｃ線維型後根神経節ニューロンのマーカーであるカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ ｇｅｎｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ、ＣＧＲＰ）に対する抗体（ウサギポリクローナル抗体、矢内原研究所）を５００倍希釈して反応させた点以外は実験例２と同様の蛍光間接抗体法を行った。
図５（ａ）は、神経障害性疼痛を有する患者由来の血清を反応させたマウス後根神経節の組織切片の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。図５（ｂ）は、図５（ａ）と同一の視野において、抗ＣＧＲＰ抗体の結合を検出した結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。図５（ｃ）は、図５（ａ）及び図５（ｂ）の写真をマージしたものである。スケールバーは５０μｍを示す。その結果、患者由来の自己抗体は、ＣＧＲＰと一部のみ共局在したことが明らかとなった。
《抗Ｓ１００β抗体との二重染色》
１次抗体反応において、６０倍希釈した患者血清に加え、有髄神経線維である、Ａβ線維型後根神経節ニューロン及びＡδ線維型後根神経節ニューロン、並びにサテライトグリア細胞のマーカーであるＳ１００βに対する抗体（ウサギポリクローナル抗体、アブカム社）を５００倍希釈して反応させた点以外は実験例２と同様の蛍光間接抗体法を行った。
１次抗体反応において、６０倍希釈した患者血清に加え、有髄神経線維である、Ａβ線維型後根神経節ニューロン及びＡδ線維型後根神経節ニューロン、並びにサテライトグリア細胞のマーカーであるＳ１００βに対する抗体（ウサギポリクローナル抗体、アブカム社）を５００倍希釈して反応させた点以外は実験例２と同様の蛍光間接抗体法を行った。
図６（ａ）は、神経障害性疼痛を有する患者由来の血清を反応させたマウス後根神経節の組織切片の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。図６（ｂ）は、図６（ａ）と同一の視野において、抗Ｓ１００β抗体の結合を検出した結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。図６（ｃ）は、図６（ａ）及び図６（ｂ）の写真をマージしたものである。スケールバーは５０μｍを示す。その結果、患者由来の自己抗体は、Ｓ１００βと共局在しないことが明らかとなった。
《抗ＴＲＰＶ１抗体との二重染色》
以上の結果から、神経障害性疼痛を有する患者由来の自己抗体は、小型無髄後根神経節ニューロンに特異的に結合することが明らかとなった。
以上の結果から、神経障害性疼痛を有する患者由来の自己抗体は、小型無髄後根神経節ニューロンに特異的に結合することが明らかとなった。
そこで、１次抗体反応において、６０倍希釈した患者血清に加え、痛みの知覚に関与することが知られているｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｖａｎｉｌｌｏｉｄ １（ＴＲＰＶ１）に対する抗体（ウサギポリクローナル抗体）を１，０００倍希釈して反応させた点以外は実験例２と同様の蛍光間接抗体法を行った。
図７（ａ）は、神経障害性疼痛を有する患者由来の血清を反応させたマウス後根神経節の組織切片の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。図７（ｂ）は、図７（ａ）と同一の視野において、抗ＴＲＰＶ１抗体の結合を検出した結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。図７（ｃ）は、図７（ａ）及び図７（ｂ）の写真をマージしたものである。スケールバーは５０μｍを示す。その結果、患者由来の自己抗体の一部は、ＴＲＰＶ１陽性の後根神経節ニューロンと反応したことが明らかとなった。この結果は、患者由来の自己抗体が、神経障害性疼痛と関連することを更に支持するものである。
《抗Ｐ２Ｘ３抗体との二重染色》
１次抗体反応において、６０倍希釈した患者血清に加え、痛みの知覚に関与することが知られているＰ２Ｘ ｐｕｒｉｎｏｃｅｐｔｏｒ ３（Ｐ２Ｘ３）に対する抗体（ウサギポリクローナル抗体、アブカム社）を５００倍希釈して反応させた点以外は実験例２と同様の蛍光間接抗体法を行った。
１次抗体反応において、６０倍希釈した患者血清に加え、痛みの知覚に関与することが知られているＰ２Ｘ ｐｕｒｉｎｏｃｅｐｔｏｒ ３（Ｐ２Ｘ３）に対する抗体（ウサギポリクローナル抗体、アブカム社）を５００倍希釈して反応させた点以外は実験例２と同様の蛍光間接抗体法を行った。
図８（ａ）は、神経障害性疼痛を有する患者由来の血清を反応させたマウス後根神経節の組織切片の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。図８（ｂ）は、図８（ａ）と同一の視野において、抗Ｐ２Ｘ３抗体の結合を検出した結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。図８（ｃ）は、図８（ａ）及び図８（ｂ）の写真をマージしたものである。スケールバーは５０μｍを示す。その結果、患者由来の自己抗体は、主にＰ２Ｘ３陽性後根神経節ニューロンと反応したことが明らかとなった。この結果は、患者由来の自己抗体が、神経障害性疼痛と関連することを更に支持するものである。
［実験例５］
（背側脊髄の組織切片に対する自己抗体の反応性の検討）
実験例２において検出された、マウス後根神経節の組織切片に反応する１１名の患者由来の自己抗体について、マウス背側脊髄の組織切片への反応性を検討した。
（背側脊髄の組織切片に対する自己抗体の反応性の検討）
実験例２において検出された、マウス後根神経節の組織切片に反応する１１名の患者由来の自己抗体について、マウス背側脊髄の組織切片への反応性を検討した。
《抗ＣＧＲＰ抗体との二重染色》
１次抗体反応において、６０倍希釈した患者血清に加え、ペプチド性Ｃ線維型後根神経節ニューロンのマーカーであるカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ ｇｅｎｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ、ＣＧＲＰ）に対する抗体（ウサギポリクローナル抗体、矢内原研究所）を５００倍希釈して反応させた点以外は実験例２と同様の蛍光間接抗体法を行った。
１次抗体反応において、６０倍希釈した患者血清に加え、ペプチド性Ｃ線維型後根神経節ニューロンのマーカーであるカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ ｇｅｎｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ、ＣＧＲＰ）に対する抗体（ウサギポリクローナル抗体、矢内原研究所）を５００倍希釈して反応させた点以外は実験例２と同様の蛍光間接抗体法を行った。
図９（ａ）は、神経障害性疼痛を有する患者由来の血清を反応させたマウス背側脊髄の組織切片の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。図４（ｂ）は、図４（ａ）と同一の視野において、抗ＣＧＲＰ抗体の結合を検出した結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。図４（ｃ）は、図４（ａ）及び図４（ｂ）の写真をマージしたものである。スケールバーは５０μｍを示す。その結果、患者由来の自己抗体の一部は、脊髄後角第Ｉ層及び第ＩＩｏ層に位置するＣＧＲＰ陽性の軸索末端と反応したことが明らかとなった。
《イソレクチンＢ４との二重染色》
１次抗体反応において、６０倍希釈した患者血清に加え、非ペプチド性Ｃ線維型後根神経節ニューロンのマーカーであるイソレクチンＢ４（Ｉｓｏｌｅｃｔｉｎ ＧＳ－ＩＢ４ Ｆｒｏｍ Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ、 Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を５００倍希釈して反応させた点以外は実験例２と同様の蛍光間接抗体法を行った。
１次抗体反応において、６０倍希釈した患者血清に加え、非ペプチド性Ｃ線維型後根神経節ニューロンのマーカーであるイソレクチンＢ４（Ｉｓｏｌｅｃｔｉｎ ＧＳ－ＩＢ４ Ｆｒｏｍ Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ、 Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を５００倍希釈して反応させた点以外は実験例２と同様の蛍光間接抗体法を行った。
図１０（ａ）は、神経障害性疼痛を有する患者由来の血清を反応させたマウス背側脊髄の組織切片の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。図１０（ｂ）は、図１０（ａ）と同一の視野において、イソレクチンＢ４の結合を検出した結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。図１０（ｃ）は、図１０（ａ）及び図１０（ｂ）の写真をマージしたものである。スケールバーは５０μｍを示す。その結果、患者由来の自己抗体の多くは、脊髄後角第ＩＩｉ層に位置するイソレクチンＢ４染色性の軸索末端と反応したことが明らかとなった。
《抗ＰＫＣγ抗体との二重染色》
１次抗体反応において、６０倍希釈した患者血清に加え、抗ＰＫＣγ抗体（ウサギポリクローナル抗体、サンタクルーズ社）を５００倍希釈して反応させた点以外は実験例２と同様の蛍光間接抗体法を行った。
１次抗体反応において、６０倍希釈した患者血清に加え、抗ＰＫＣγ抗体（ウサギポリクローナル抗体、サンタクルーズ社）を５００倍希釈して反応させた点以外は実験例２と同様の蛍光間接抗体法を行った。
図１１（ａ）は、神経障害性疼痛を有する患者由来の血清を反応させたマウス背側脊髄の組織切片の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。図１１（ｂ）は、図１１（ａ）と同一の視野において、抗ＰＫＣγ抗体の結合を検出した結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。図１１（ｃ）は、図１１（ａ）及び図１１（ｂ）の写真をマージしたものである。スケールバーは５０μｍを示す。
その結果、患者由来の自己抗体の大部分は、腹部側の脊髄後角第ＩＩｉ層及び脊髄後角第ＩＩＩ層に位置するＰＫＣγ陽性のバンドとは重複せず、より背側に反応したことが明らかとなった。
以上の結果は、患者由来の自己抗体の結合が、Ｃ線維型求心性神経の軸索末端が位置する脊髄後角第Ｉ層及び第ＩＩｏ層に限られていることを示す。
［実験例６］
（自己抗体の節後自律神経Ｃ線維への反応性の検討）
実験例２において検出された、マウス後根神経節の組織切片に反応する１１名の患者由来の自己抗体について、節後自律神経Ｃ線維への反応性を検討した。
（自己抗体の節後自律神経Ｃ線維への反応性の検討）
実験例２において検出された、マウス後根神経節の組織切片に反応する１１名の患者由来の自己抗体について、節後自律神経Ｃ線維への反応性を検討した。
自律神経Ｃ線維は真皮（皮膚の内層）に存在し、一般的な神経線維マーカーであるｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ９．５（ＰＧＰ９．５）と類似の分布パターンを示す。
まず、患者由来の自己抗体の後足足底の皮膚における結合パターンを検討した。図１２（ａ）は、マウスの後足足底の皮膚の組織切片のヘマトキシリン・エオジン染色の結果を示す光学顕微鏡写真である。スケールバーは５０μｍを示す。図１２（ａ）中、「ｄｅｒｍｉｓ」は真皮を示し、「ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ」は表皮を示す。
図１２（ｂ）は、対照血清の免疫染色の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。１次抗体反応において、６０倍希釈した対照血清に加え、抗ＰＧＰ９．５抗体（ウサギポリクローナル抗体、アブカム社）を５００倍希釈して反応させた点以外は実験例２と同様の蛍光間接抗体法を行った。また、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で核を染色した。スケールバーは５０μｍを示す。また、左下の枠内に矢印部分の拡大写真を示す。その結果、対照血清はマウス皮膚と反応性を示さなかった。
図１２（ｃ）は、患者由来の自己抗体の免疫染色の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。１次抗体反応において、６０倍希釈した患者血清に加え、抗ＰＧＰ９．５抗体（ウサギポリクローナル抗体、アブカム社）を５００倍希釈して反応させた点以外は実験例２と同様の蛍光間接抗体法を行った。また、ＤＡＰＩで核を染色した。スケールバーは５０μｍを示す。また、左下の枠内に矢印部分の拡大写真を示す。その結果、患者由来の自己抗体は、表皮及びＰＧＰ９．５陽性の皮膚神経線維に結合したことが明らかとなった。
《抗ＴＨ抗体との二重染色》
続いて、マウスの後足足底の皮膚の組織切片に対し、患者由来の自己抗体が結合する自律神経線維を同定するために、交感神経のマーカーであるチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）に対する抗体との二重染色を行った。
続いて、マウスの後足足底の皮膚の組織切片に対し、患者由来の自己抗体が結合する自律神経線維を同定するために、交感神経のマーカーであるチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）に対する抗体との二重染色を行った。
１次抗体反応において、６０倍希釈した患者血清に加え、抗ＴＨ抗体（ウサギポリクローナル抗体、アブカム社）を５００倍希釈して反応させた点以外は実験例２と同様の蛍光間接抗体法を行った。また、ＤＡＰＩで核を染色した。
図１３（ａ）は、神経障害性疼痛を有する患者由来の血清を反応させたマウスの後足足底の皮膚の組織切片の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。図１３（ｂ）は、図１３（ａ）と同一の視野において、抗ＴＨ抗体の結合を検出した結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。図１３（ｃ）は、図１３（ａ）及び図１３（ｂ）の写真をマージしたものである。スケールバーは５０μｍを示す。その結果、患者由来の自己抗体は、ＴＨ陽性の神経線維を染色しないことが明らかとなった。
《抗ＶＩＰ抗体との二重染色》
続いて、マウスの後足足底の皮膚の組織切片に対し、副交感神経のマーカーであるｖａｓｏａｃｔｉｖｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ（ＶＩＰ）に対する抗体との二重染色を行った。
続いて、マウスの後足足底の皮膚の組織切片に対し、副交感神経のマーカーであるｖａｓｏａｃｔｉｖｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ（ＶＩＰ）に対する抗体との二重染色を行った。
１次抗体反応において、６０倍希釈した患者血清に加え、抗ＶＩＰ抗体（ウサギポリクローナル抗体、イムノスター社）を５００倍希釈して反応させた点以外は実験例２と同様の蛍光間接抗体法を行った。また、ＤＡＰＩで核を染色した。
図１４（ａ）は、神経障害性疼痛を有する患者由来の血清を反応させたマウスの後足足底の皮膚の組織切片の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。図１４（ｂ）は、図１４（ａ）と同一の視野において、抗ＶＩＰ抗体の結合を検出した結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。図１４（ｃ）は、図１４（ａ）及び図１４（ｂ）の写真をマージしたものである。スケールバーは５０μｍを示す。その結果、患者由来の自己抗体は、ＶＩＰ陽性の神経線維と共局在したことが明らかとなった。
以上の結果から、神経障害性疼痛を有する患者由来の自己抗体が、節後自律神経である副交感神経Ｃ線維にも反応することが明らかとなった。
［実験例７］
（自己抗体が反応するタンパク質の同定）
１０～１２週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６マウスの腰椎後根神経節を採取し、直ちに液体窒素中で凍結した。続いて、凍結した組織を、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を終濃度１％となるように添加したＲＩＰＡバッファー（ナカライテスク社）中でホモジナイズした。続いて、４℃で１０，０００×ｇ、３０分間遠心して上清を回収し、マウス後根神経節由来タンパク質抽出液とした。
（自己抗体が反応するタンパク質の同定）
１０～１２週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６マウスの腰椎後根神経節を採取し、直ちに液体窒素中で凍結した。続いて、凍結した組織を、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を終濃度１％となるように添加したＲＩＰＡバッファー（ナカライテスク社）中でホモジナイズした。続いて、４℃で１０，０００×ｇ、３０分間遠心して上清を回収し、マウス後根神経節由来タンパク質抽出液とした。
続いて、マウス後根神経節由来タンパク質抽出液をウエスタンブロッティングに供し、マウス後根神経節の組織切片に反応する患者由来自己抗体で検出した結果、１１名の患者のうち１０名の患者由来自己抗体で共通の免疫反応性を有するバンドが検出された。当該バンドの分子量は約２２０ｋＤａであった。一方、神経障害性疼痛を有しない患者由来血清及び健常人由来血清で検出した結果、免疫反応性を有するバンドは検出されなかった。
図１５（ａ）はウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図１５（ａ）中、「ＩＦＡ ｐｏｓｉｔｉｖｅ」は蛍光間接抗体法の結果陽性であったことを表し、「ＩＦＡ ｎｅｇａｔｉｖｅ」は蛍光間接抗体法の結果陰性であったことを表し、「ＮｅＰ Ｐｔ．１、２、５、６、９、１１」は、それぞれ、神経障害性疼痛を有する患者１、２、５、６、９、１１を表し、「ＨＣ」は健常人を表す。また、線で囲んだバンドは１１名の患者のうち１０名の患者由来自己抗体で共通に検出されたバンドである。
《免疫沈降、ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び銀染色》
患者血清から、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＨＰ ＳｐｉｎＴｒａｐ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いてＩｇＧサブクラス全４種類の血清ＩｇＧを精製した。
患者血清から、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＨＰ ＳｐｉｎＴｒａｐ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いてＩｇＧサブクラス全４種類の血清ＩｇＧを精製した。
また、１ｍｇ／ｍＬに希釈したマウス後根神経節由来タンパク質抽出液３００μＬと、０．１ｍｇのＦＧ ｂｅａｄｓ－Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ｂｅａｄｓ（多摩川精機）を４℃で１５分間インキュベーションした。続いて、磁気分離を行い、タンパク質抽出液中の非特異的なＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ吸着物を除去し、粗精製した。
続いて、粗精製したタンパク質抽出液３００μＬに血清ＩｇＧ ３μｇを加え、４℃で１時間インキュベーションし抗原抗体反応を起こさせた。
続いて、０．１ｍｇのＦＧ ｂｅａｄｓ－Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ｂｅａｄｓ（多摩川精機）に上記のタンパク質－血清ＩｇＧ反応液２４０μＬを添加し、分散させた。続いて、ローテーターで攪拌しながら４℃で２時間インキュベーションし、ビーズとＩｇＧとの結合反応を行った。
続いて、磁気分離を行い、上清を除去した後に、２００μＬの１５０ｍＭ ＫＣｌバッファー（１５０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ＣａＣｌ２、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．１％ＮＰ－４０、０．２ｍＭ ＰＭＳＦ）で計３回ビーズを洗浄した。
続いて、４０μＬの１×Ｄｙｅ（４×Ｄｙｅ：０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、８％ＳＤＳ、４０％グリセロール、２０％２－メルカプトエタノール、０．００２％ＢＰＢ）を加えて分散させた後に、９８℃で５分間インキュベーションした。
続いて、室温で磁気分離を行い、上清を回収し目的タンパク質を含む試料とした。続いて、免疫沈降で得られた自己抗原タンパク質試料をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）に供し、銀染色を行って自己抗原タンパク質を含むバンドを確認して切り出し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる解析を行った。
図１５（ｂ）はＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び銀染色の結果を示す写真である。図１５（ｂ）中、レーン１は分子量マーカーであり、レーン２はマウス後根神経節由来タンパク質抽出液であり、レーン３は陰性対照の免疫沈降試料であり、レーン４は自己抗原タンパク質を含む免疫沈降試料である。矢印は、２２０ｋＤａより少し大きな自己抗原タンパク質のバンドを示す。
図１５（ｃ）は図１５（ｂ）と同様の試料をウエスタンブロッティングに供し、患者由来自己抗体で検出した結果を示す写真である。図１５（ｃ）中、レーン１は分子量マーカーであり、レーン２はマウス後根神経節由来タンパク質抽出液であり、レーン３は陰性対照の免疫沈降試料であり、レーン４は自己抗原タンパク質を含む免疫沈降試料である。矢印は、２２０ｋＤａより少し大きな自己抗原タンパク質のバンドを示す。
続いて、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる解析結果を解析ソフトで解析し、自己抗原候補タンパク質を同定した。その結果、「ＲＴＩＴＶＡＧＥＲＦ」（配列番号１）のアミノ酸配列を有するペプチド断片が検出された。このペプチド断片は、ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質のアミノ酸配列の第１０８７～１０９６番目のアミノ酸と一致した。
Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１は約２１２ｋＤａの理論的分子量を有する。これは、ウエスタンブロッティングにより検出されたバンドの分子量とほぼ一致した。Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１は、神経組織における最も分子量の大きい糖タンパク質の１つである。しかしながら、ヒト後根神経節及び脊髄におけるＰｌｅｘｉｎ Ｄ１の発現は報告されていない。
［実験例８］
（ヒト後根神経節及び脊髄の組織切片におけるＰｌｅｘｉｎ Ｄ１の発現の検討）
死亡したドナー由来のヒト腰椎後根神経節及び脊髄の組織切片を調製した。続いて、各組織切片を免疫染色し、蛍光顕微鏡（型式「ＢＺ－Ｘ７００」、キーエンス社）で観察した。
（ヒト後根神経節及び脊髄の組織切片におけるＰｌｅｘｉｎ Ｄ１の発現の検討）
死亡したドナー由来のヒト腰椎後根神経節及び脊髄の組織切片を調製した。続いて、各組織切片を免疫染色し、蛍光顕微鏡（型式「ＢＺ－Ｘ７００」、キーエンス社）で観察した。
図１６（ａ）は、ヒト後根神経節の組織切片を抗ヒトＰｌｅｘｉｎ Ｄ１抗体（ヤギポリクローナル抗体、Ｒ＆Ｄシステムズ社）で染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
図１６（ｂ）は、図１６（ａ）と同一の視野において、有髄線維である、Ａβ線維型後根神経節ニューロン及びＡδ線維型後根神経節ニューロンのマーカーである、ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ（ＮＦＨ）に対する抗体（抗ヒトリン酸化ＮＦＨ抗体、型式「ＳＭＩ３１」、マウスモノクローナル抗体、Ｃｏｖａｎｃｅ社；及び、抗ヒト非リン酸化ＮＦＨ抗体、型式「ＳＭＩ３２」、マウスモノクローナル抗体、Ｃｏｖａｎｃｅ社）で染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。また、ＤＡＰＩで核を染色した。
図１６（ｃ）は、図１６（ａ）及び図１６（ｂ）の写真をマージしたものである。スケールバーは５０μｍを示す。
図１６（ｄ）は、ヒト脊髄の組織切片を抗ヒトＰｌｅｘｉｎ Ｄ１抗体（ヤギポリクローナル抗体、Ｒ＆Ｄシステムズ社）で染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
図１６（ｅ）は、図１６（ｄ）と同一の視野において、抗ヒトＮＦＨ抗体（抗ヒトリン酸化ＮＦＨ抗体、型式「ＳＭＩ３１」、マウスモノクローナル抗体、Ｃｏｖａｎｃｅ社；及び、抗ヒト非リン酸化ＮＦＨ抗体、型式「ＳＭＩ３２」、マウスモノクローナル抗体、Ｃｏｖａｎｃｅ社）で染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。また、ＤＡＰＩで核を染色した。
図１６（ｆ）は、図１６（ｄ）及び図１６（ｅ）の写真をマージしたものである。スケールバーは１００μｍを示す。
その結果、Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１は、ＮＦＨ陽性の有髄後根神経節ニューロンとは全く共局在しないことが明らかとなった。また、脊髄の背側において、ＮＦＨは後柱（ＰＣ）及び後角深層（ＤＤＨ；脊髄後角第ＩＩＩ層～第Ｖ層）に主に存在しており、後角浅層（ＳＤＨ）ではより少なく存在していた。
以上の結果は、Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１が無髄後根神経節ニューロン及び後角浅層に位置するその軸索末端に存在していることを示し、この局在パターンは患者由来の自己抗体の結合パターンに類似していた。
［実験例９］
（患者由来の自己抗体のＰｌｅｘｉｎ Ｄ１に対する反応性の検討１）
《ｓｉＲＮＡによるＰＬＸＮＤ１遺伝子発現の抑制》
Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１を発現するＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌由来細胞株）に、Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質をコードする遺伝子である、ＰＬＸＮＤ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（型式「ｓ２３０９４」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）及び対照ｓｉＲＮＡ（型式「＃４３９０８４３」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を導入し、定量的リアルタイムＰＣＲによりＰＬＸＮＤ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を定量した。また、ウエスタンブロッティングによりタンパク質レベルでＰｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質の発現量を検討した。
（患者由来の自己抗体のＰｌｅｘｉｎ Ｄ１に対する反応性の検討１）
《ｓｉＲＮＡによるＰＬＸＮＤ１遺伝子発現の抑制》
Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１を発現するＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌由来細胞株）に、Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質をコードする遺伝子である、ＰＬＸＮＤ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（型式「ｓ２３０９４」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）及び対照ｓｉＲＮＡ（型式「＃４３９０８４３」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を導入し、定量的リアルタイムＰＣＲによりＰＬＸＮＤ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を定量した。また、ウエスタンブロッティングによりタンパク質レベルでＰｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質の発現量を検討した。
定量的リアルタイムＰＣＲにおいては、陽性コントロールとしてＫＩＦ１１遺伝子のｍＲＮＡを増幅した。また、リファレンス遺伝子としてＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡを増幅した。定量的リアルタイムＰＣＲにはＦａｓｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用い、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ リアルタイムＰＣＲシステム（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）でＰＣＲを実施した。
ＰＬＸＮＤ１特異的プライマーとして、ＰＬＸＮＤ１ Ｆｗｄ（5'-AATGGGCGGAACATCGTCAAG-3'、配列番号２）及びＰＬＸＮＤ１ Ｒｅｖ（5'-CGAGACTGGTTGGAAACACAG-3'、配列番号３）を用いた。また、ＫＩＦ１１特異的プライマーとして、ＫＩＦ１１ Ｆｗｄ（5'-TGTTTGATGATCCCCGTAACAAG-3'、配列番号４）及びＫＩＦ１１ Ｒｅｖ（5'-CTGAGTGGGAACGACTAGAGT-3'、配列番号５）を用いた。また、ＧＡＰＤＨ特異的プライマーとして、ＧＡＰＤＨ Ｆｗｄ（5'-ACCCACTCCTCCACCTTTGAC-3'、配列番号６）及びＧＡＰＤＨ Ｒｅｖ（5'-TGTTGCTGTAGCCAAATTCGTT-3'、配列番号７）を用いた。
図１７（ａ）は定量的リアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。図１７（ａ）中、「Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ ｓｉＲＮＡ」は対照ｓｉＲＮＡを導入した結果であることを示し、「ＰＬＸＮＤ１ ｓｉＲＮＡ」はＰＬＸＮＤ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡを導入した結果であることを示す。その結果、ＰＬＸＮＤ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡの導入により、ＰＬＸＮＤ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を平均８７％低下させることができたことが確認された。
また、図１７（ｂ）はウエスタンブロッティングによりＰｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質の発現を検討した結果を示す写真である。ローディングコントロールとしてβアクチンタンパク質を検出した。
図１７（ｂ）中、「Ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｉＲＮＡ」は対照ｓｉＲＮＡを導入した結果であることを示し、「ＰＬＸＮＤ１ ｓｉＲＮＡ」はＰＬＸＮＤ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡを導入した結果であることを示す。その結果、ＰＬＸＮＤ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡの導入により、Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質の発現量を８２％低下させることができたことが確認された。
《自己抗体の反応性の検討》
ＨｅＬａ細胞にＰＬＸＮＤ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡを導入し、神経障害性疼痛を有する患者由来の自己抗体を反応させた。また、比較のために、ｓｉＲＮＡを導入しなかったＨｅＬａ細胞も用意した。
ＨｅＬａ細胞にＰＬＸＮＤ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡを導入し、神経障害性疼痛を有する患者由来の自己抗体を反応させた。また、比較のために、ｓｉＲＮＡを導入しなかったＨｅＬａ細胞も用意した。
まず、ＢｉｏＣｏａｔコラーゲンＩ カルチャースライド８ウェル（コーニング社）に、１ウェル当たり終濃度７．５ｎＭのｓｉＲＮＡと０．４５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（インビトロジェン社）を含む調製液を加えてウェル表面全体を覆い、１５分間室温で静置した。
続いて、ＨｅＬａ細胞を８×１０３個／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養し、リバーストランスフェクションを行った。続いて、４８時間後に培地交換を行った。続いて、リバーストランスフェクションから９６時間後に培地を除去し、４％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液（和光純薬）を加えて室温で１０分間静置した後、氷冷ＰＢＳ（－）で細胞を３回洗浄した。
続いて、各ウェルに０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（シグマ－アルドリッチ社）を含むＰＢＳ（－）を加え、１０分間室温静置して膜透過処理を行った後、ＰＢＳ（－）で２回洗浄した。続いて、各ウェルに１％ゼラチンを含むＰＢＳ（－）を加え室温で１時間静置してブロッキングした。
続いて、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ（－）中に１，０００倍希釈した患者由来の血清ＩｇＧ、及び、２００倍希釈した抗Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１抗体（ヤギポリクローナル抗体、Ｒ＆Ｄシステムズ社）を含む、１次抗体反応液を加えて室温で１時間静置し１次抗体反応を行った後、ＰＢＳ（－）で３回洗浄した。また、比較のために、患者由来の血清ＩｇＧの代わりに対照の血清ＩｇＧを反応させた試料も用意した。
続いて、１，０００倍希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、１，０００倍希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４標識ウサギ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、及び０．１μｇ／ｍＬのＤＡＰＩを含む、２次抗体反応液を加えて室温で１時間、遮光下で静置し２次抗体反応を行った後、ＰＢＳ（－）で３回洗浄した。続いて、蛍光顕微鏡（型式「ＢＺ－Ｘ７１０」、キーエンス社）で観察した。
図１８（ａ）はｓｉＲＮＡを導入していないＨｅＬａ細胞に結合した対照ＩｇＧを検出した結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。図１８（ｂ）は、図１８（ａ）と同一の視野において、抗Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１抗体の結合を検出した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図１８（ｃ）は、図１８（ａ）及び図１８（ｂ）の写真をマージしたものである。スケールバーは１００μｍを示す。
また、図１８（ｄ）はｓｉＲＮＡを導入していないＨｅＬａ細胞に結合した患者由来自己抗体を検出した結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。図１８（ｅ）は、図１８（ｄ）と同一の視野において、抗Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１抗体の結合を検出した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図１８（ｆ）は、図１８（ｄ）及び図１８（ｅ）の写真をマージしたものである。スケールバーは１００μｍを示す。
その結果、患者由来自己抗体はＨｅＬａ細胞に結合したのに対し、対照ＩｇＧはＨｅＬａ細胞に結合しないことが明らかとなった。また、患者由来自己抗体は、抗Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１抗体と共局在したことが明らかとなった。
図１９（ａ）は対照ｓｉＲＮＡを導入したＨｅＬａ細胞を明視野観察した顕微鏡写真である。図１９（ｂ）は、図１９（ａ）と同一の視野において、患者由来自己抗体（症例５）の結合を検出した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図１９（ｃ）は、図１９（ａ）と同一の視野において、抗Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１抗体の結合を検出した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図１９（ｄ）は、図１９（ａ）、図１９（ｂ）及び図１９（ｃ）の写真をマージしたものである。スケールバーは２５μｍを示す。
図１９（ｅ）はＰＬＸＮＤ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡを導入したＨｅＬａ細胞を明視野観察した顕微鏡写真である。図１９（ｆ）は、図１９（ｅ）と同一の視野において、患者由来自己抗体（症例５）の結合を検出した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図１９（ｇ）は、図１９（ｅ）と同一の視野において、抗Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１抗体の結合を検出した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図１９（ｈ）は、図１９（ｅ）、図１９（ｆ）及び図１９（ｇ）の写真をマージしたものである。スケールバーは２５μｍを示す。
その結果、ＰＬＸＮＤ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡを導入することにより、患者由来自己抗体のＨｅＬａ細胞に対する結合が顕著に減少したことが明らかとなった。この結果は、神経障害性疼痛を有する患者由来自己抗体が認識する自己抗原がＰｌｅｘｉｎ Ｄ１であることを示す。
［実験例１０］
（患者由来の自己抗体のＰｌｅｘｉｎ Ｄ１に対する反応性の検討２）
マウス後根神経節の組織切片に反応する自己抗体を含んでいた１１名の患者由来の血清を用いて、実験例９と同様の検討を行った。
（患者由来の自己抗体のＰｌｅｘｉｎ Ｄ１に対する反応性の検討２）
マウス後根神経節の組織切片に反応する自己抗体を含んでいた１１名の患者由来の血清を用いて、実験例９と同様の検討を行った。
図２０（ａ）は、対照ｓｉＲＮＡを導入したＨｅＬａ細胞に結合した患者由来自己抗体（症例５）を検出した結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。図２０（ａ）では、ＤＡＰＩで核が染色されている。スケールバーは５０μｍを示す。図２０（ｂ）は、ＰＬＸＮＤ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡを導入したＨｅＬａ細胞に結合した患者由来自己抗体（症例５）を検出した結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。図２０（ｂ）においても、ＤＡＰＩで核が染色されている。スケールバーは５０μｍを示す。
図２０（ｃ）は、図２０（ａ）及び（ｂ）の結果を数値化したグラフである。その結果、ＰＬＸＮＤ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡを導入したＨｅＬａ細胞では、症例５の患者由来自己抗体の結合が有意に減少したことが明らかとなった。
同様の検討を、症例５以外の患者由来自己抗体についても行った。その結果、１１名の患者由来自己抗体のうち９名の患者由来自己抗体について同様の結果が得られた。この結果は、神経障害性疼痛を有する患者由来自己抗体が認識する自己抗原がＰｌｅｘｉｎ Ｄ１であることを更に支持するものである。
［実験例１１］
（患者由来の自己抗体のＰｌｅｘｉｎ Ｄ１に対する反応性の検討３）
免疫吸収実験を行い、患者由来の自己抗体のＰｌｅｘｉｎ Ｄ１に対する反応性を検討した。具体的には、患者由来自己抗体に、ＰＬＸＮＤ１遺伝子の細胞外ドメイン部分を発現させた組換えヒトＰｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質（型式「４１６０－ＰＤ」、Ｒ＆Ｄシステムズ社、アミノ酸配列を配列番号８に示す。）を混合し、プレインキュベートした。続いて、マウス後根神経節の組織切片及びマウス脊髄の組織切片を用いた蛍光間接抗体法を行った。
（患者由来の自己抗体のＰｌｅｘｉｎ Ｄ１に対する反応性の検討３）
免疫吸収実験を行い、患者由来の自己抗体のＰｌｅｘｉｎ Ｄ１に対する反応性を検討した。具体的には、患者由来自己抗体に、ＰＬＸＮＤ１遺伝子の細胞外ドメイン部分を発現させた組換えヒトＰｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質（型式「４１６０－ＰＤ」、Ｒ＆Ｄシステムズ社、アミノ酸配列を配列番号８に示す。）を混合し、プレインキュベートした。続いて、マウス後根神経節の組織切片及びマウス脊髄の組織切片を用いた蛍光間接抗体法を行った。
図２１（ａ）は、患者由来自己抗体（症例５）を、マウス後根神経節の組織切片に反応させた結果を示す蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは５０μｍを示す。
図２１（ｂ）は、０．５μｇ／ｍＬのＰｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質とプレインキュベートした患者由来自己抗体（症例５）をマウス後根神経節の組織切片に反応させた結果を示す蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは５０μｍを示す。
図２１（ｃ）は、２μｇ／ｍＬのＰｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質とプレインキュベートした患者由来自己抗体（症例５）をマウス後根神経節の組織切片に反応させた結果を示す蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは５０μｍを示す。
図２１（ｄ）は、患者由来自己抗体（症例５）を、マウス脊髄の組織切片に反応させた結果を示す蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは５０μｍを示す。矢印の部分に患者由来自己抗体の結合が認められた。
図２１（ｅ）は、０．５μｇ／ｍＬのＰｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質とプレインキュベートした患者由来自己抗体（症例５）をマウス脊髄の組織切片に反応させた結果を示す蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは５０μｍを示す。また、図２１（ｄ）と同じ位置に矢印を示す。
図２１（ｆ）は、２μｇ／ｍＬのＰｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質とプレインキュベートした患者由来自己抗体（症例５）をマウス脊髄の組織切片に反応させた結果を示す蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは５０μｍを示す。また、図２１（ｄ）と同じ位置に矢印を示す。
その結果、Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質とプレインキュベートすることにより、Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質の容量依存的に患者由来自己抗体（症例５）の後根神経節ニューロンに対する染色性が低下したことが確認された。同様の結果が１１名の患者由来自己抗体の全てで認められた。
この結果は、神経障害性疼痛を有する患者由来の自己抗体が、Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質に対する特異性を有すること、及び病原性を有することを更に支持するものである。
［実験例１２］
（患者由来の自己抗体のＰｌｅｘｉｎ Ｄ１に対する反応性の検討４）
免疫吸収実験を行い、患者由来の自己抗体のＰｌｅｘｉｎ Ｄ１に対する反応性を検討した。具体的には、患者由来自己抗体に、ＰＬＸＮＤ１遺伝子の細胞外ドメイン部分を発現させた組換えヒトＰｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質（型式「４１６０－ＰＤ」、Ｒ＆Ｄシステムズ社、アミノ酸配列を配列番号８に示す。）を混合し、プレインキュベートした。続いて、実験例７と同様にして調製したマウス後根神経節由来タンパク質抽出液をウエスタンブロッティングに供し、患者由来自己抗体で検出した。
（患者由来の自己抗体のＰｌｅｘｉｎ Ｄ１に対する反応性の検討４）
免疫吸収実験を行い、患者由来の自己抗体のＰｌｅｘｉｎ Ｄ１に対する反応性を検討した。具体的には、患者由来自己抗体に、ＰＬＸＮＤ１遺伝子の細胞外ドメイン部分を発現させた組換えヒトＰｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質（型式「４１６０－ＰＤ」、Ｒ＆Ｄシステムズ社、アミノ酸配列を配列番号８に示す。）を混合し、プレインキュベートした。続いて、実験例７と同様にして調製したマウス後根神経節由来タンパク質抽出液をウエスタンブロッティングに供し、患者由来自己抗体で検出した。
図２２（ａ）は、患者由来自己抗体（症例１）を反応させて自己抗原を検出した結果を示す写真である。図２２（ｂ）は、０．５μｇ／ｍＬのＰｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質とプレインキュベートした患者由来自己抗体（症例１）を反応させて自己抗原を検出した結果を示す写真である。
図２２（ｃ）は、患者由来自己抗体（症例２）を反応させて自己抗原を検出した結果を示す写真である。図２２（ｄ）は、０．５μｇ／ｍＬのＰｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質とプレインキュベートした患者由来自己抗体（症例２）を反応させて自己抗原を検出した結果を示す写真である。
その結果、Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質とプレインキュベートすることにより、２２０ｋＤａ付近のバンドが消失したことが確認された。同様の結果が１１名の患者由来自己抗体の全てで認められた。
この結果は、神経障害性疼痛を有する患者由来の自己抗体が、Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質に対する特異性を有すること、及び病原性を有することを更に支持するものである。
［実験例１３］
（患者由来の自己抗体のＰｌｅｘｉｎ Ｄ１に対する反応性の検討５）
組換えヒトＰｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質をウエスタンブロッティングに供し、患者由来自己抗体で検出することにより、患者由来の自己抗体のＰｌｅｘｉｎ Ｄ１に対する反応性を検討した。
（患者由来の自己抗体のＰｌｅｘｉｎ Ｄ１に対する反応性の検討５）
組換えヒトＰｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質をウエスタンブロッティングに供し、患者由来自己抗体で検出することにより、患者由来の自己抗体のＰｌｅｘｉｎ Ｄ１に対する反応性を検討した。
組換えヒトＰｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質として、ＰＬＸＮＤ１遺伝子の細胞外ドメイン部分を発現させたタンパク質（型式「４１６０－ＰＤ」、Ｒ＆Ｄシステムズ社、アミノ酸配列を配列番号８に示す。）を用いた。このタンパク質のバンドサイズは１６５ｋＤａ～１７５ｋＤａと予測された。
図２３は、蛍光間接抗体法による結果が陽性であった神経障害性疼痛患者由来自己抗体（症例１、２、５）、蛍光間接抗体法による結果が陰性であった神経障害性疼痛患者由来血清、健常人由来血清、及び、市販の抗ヒトＰｌｅｘｉｎ Ｄ１抗体を用いて、組換えヒトＰｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質を検出した結果を示す写真である。
その結果、蛍光間接抗体法による結果が陽性であった神経障害性疼痛患者由来自己抗体、及び、市販の抗ヒトＰｌｅｘｉｎ Ｄ１抗体により、１５０ｋＤａと２５０ｋＤａの間のサイズである単一のバンドが検出されたことが明らかとなった。
一方、蛍光間接抗体法による結果が陰性であった神経障害性疼痛患者由来血清、及び、健常人由来血清では、バンドが検出されなかった。
以上の結果は、蛍光間接抗体法による結果が陽性であった神経障害性疼痛患者由来自己抗体が結合したタンパク質がＰｌｅｘｉｎ Ｄ１であることを更に支持するものである。
本発明により、神経障害性疼痛を検出する技術を提供することができる。
Claims (15)
- 神経障害性疼痛マーカーとしての小型無髄後根神経節ニューロンに対する自己抗体の使用。
- 前記自己抗体が抗Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１抗体である、請求項１に記載の使用。
- 神経障害性疼痛の検出方法であって、患者由来の血液試料中の、小型無髄後根神経節ニューロンに対する自己抗体を検出することを備え、前記自己抗体が検出されることが、前記患者が神経障害性疼痛に罹患していることを示す、方法。
- 小型無髄後根神経節ニューロンに対する自己抗体を検出することが、
ヒト又は非ヒト動物由来の後根神経節組織又は脊髄後角組織に患者由来の血液試料を接触させ、前記後根神経節組織又は前記脊髄後角組織に結合したヒトＩｇＧ抗体を検出することと、
前記後根神経節組織又は前記脊髄後角組織における有髄後根神経節ニューロン又はその神経線維を検出することと、
を含み、前記ヒトＩｇＧ抗体が前記有髄後根神経節ニューロン以外のニューロンに結合したことが、小型無髄後根神経節ニューロンに対する自己抗体が検出されたことを示す、請求項３に記載の方法。 - 有髄後根神経節ニューロンを検出することが、
前記後根神経節組織を抗Ｓ１００β抗体で免疫染色することを含み、
前記抗Ｓ１００β抗体で免疫染色されたニューロンが有髄後根神経節ニューロンである、請求項４に記載の方法。 - 小型無髄後根神経節ニューロンに対する自己抗体を検出することが、
ヒト又は非ヒト動物由来の後根神経節組織又は脊髄後角組織に患者由来の血液試料を接触させ、前記後根神経節組織又は前記脊髄後角組織に結合したヒトＩｇＧ抗体を検出することと、
前記後根神経節組織又は前記脊髄後角組織における無髄後根神経節ニューロン又はその神経線維を検出することと、
を含み、前記ヒトＩｇＧ抗体が前記無髄後根神経節ニューロンに結合したことが、小型無髄後根神経節ニューロンに対する自己抗体が検出されたことを示す、請求項３に記載の方法。 - 無髄後根神経節ニューロンを検出することが、
前記後根神経節組織にイソレクチンＢ４を接触させることを含み、
前記イソレクチンＢ４が結合したニューロンが無髄後根神経節ニューロンである、請求項６に記載の方法。 - 前記ヒトＩｇＧ抗体がＩｇＧ２抗体である、請求項４～７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記自己抗体が抗Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１抗体である、請求項３～８のいずれか一項に記載の方法。
- 神経障害性疼痛の検出方法であって、Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１を発現するヒト細胞又は非ヒト動物細胞に患者由来の血液試料を接触させ、前記細胞に結合したヒトＩｇＧ抗体を検出することを含み、
検出された前記ヒトＩｇＧ抗体の量が、Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１を発現しない細胞に前記血液試料を接触させた場合に、当該細胞に結合するヒトＩｇＧ抗体の量と比較して多いことが、前記患者が神経障害性疼痛に罹患していることを示す、方法。 - 抗ヒトＩｇＧ抗体と、
無髄後根神経節ニューロンの検出薬と、
を備える、神経障害性疼痛の診断キット。 - 前記抗ヒトＩｇＧ抗体が、抗ヒトＩｇＧ２抗体である、請求項１１に記載の診断キット。
- 前記無髄後根神経節ニューロンの検出薬が、イソレクチンＢ４である、請求項１１又は１２に記載の診断キット。
- 抗ヒトＩｇＧ抗体と、Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１タンパク質と、を備える、神経障害性疼痛の診断キット。
- 前記抗ヒトＩｇＧ抗体が、抗ヒトＩｇＧ２抗体である、請求項１４に記載の診断キット。
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