JP2007518068A - 視神経脊髄炎用マーカー - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 本発明は、視神経脊髄炎(NMO)および関連疾患の診断用および治療用の、方法および材料を提供する。
【選択図】 なし
Description
本発明は、NMO抗原性ポリペプチドを用いて、個体におけるNMO特異的自己抗体の検出方法を提供する。本発明の方法を用いる可能性がある個体は、典型的には、視力障害および/または刺痛、麻痺、脱力、四肢痙攣、膀胱および/または腸制御の喪失、あるいは原因未知の他の神経学的症状を示す。本発明の方法は、異常な神経学的症状と、個体中のNMO特異的自己抗体の存在との間の関連性に基づく。
本発明はさらに、NMOを患っている個体の治療方法を提供する。NMOの治療はNMO特異的免疫機構の結果生じる個体における神経学的症状を変更することを要する。NMOを患っている患者の治療方法としては、限定するものではないが、アフェレーシス、およびT細胞受容体に基づく免疫療法が挙げられる。
本明細書に開示した実験的証拠は、NMO抗原性ポリペプチドがアクアポリン-4であると示唆している。「アクアポリン-4」という用語は、アクアポリンファミリーのあるメンバーのことを指す。アクアポリンファミリーには10種類の既知のメンバーが存在する。アクアポリン-4は、中枢神経系における毛細管に接触するアストロサイト足突起膜で、ならびに腎臓末端集合管および胃上皮細胞の側底膜で発現される。ヒトアクアポリン-4ポリペプチドをコードする核酸配列の例は、GenBank登録番号U63622およびU63623に示されている。代表的なヒトアクアポリン-4ポリペプチドの推定アミノ酸配列は、GenBank登録番号AAG17964、AAB26957、AAB26958およびI39178に示されている。他の生物(例えばマウス(Mus musculus)、ウシ(Bos Taurus)、ラット(Rattus norvegicus)、およびヒツジ(Ovis aries))由来のアクアポリン-4をコードする核酸配列およびアミノ酸配列は、「aquaporin-4」を検索単語として用いてGenBankデータベース(ワールドワイドウェブ上のncbi.nlm.nih.gov)を検索することにより見つけることができる。
非特異的染色を最小化するために、各患者の血清を肝臓抗原で予備吸着したが、予備吸着は、1%ウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝生理食塩水(PBS)590μL中に希釈した前記患者血清10μLと市販モルモット組織粉末(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)40mgとを混合することにより行った。室温で1時間穏やかに撹拌した後、不溶残渣を遠心分離(20800×gで10分間)で除去した。その後新鮮な肝臓粉末(40mg)を直ちに血清上清に加え、本処理をさらに2回繰り返すことで、合計3回連続の吸着を行った。
3箇所の正常哺乳動物組織(例えばマウス脳(小脳および中脳の両方)、胃および腎臓)の冷凍混成塊を、8-ウェル顕微鏡用スライドの個々のウェル上へと低温切開(厚さ4ミクロン)した。これらのスライドは、カスタム製品として購入(MeDiCa, Encinitas, CAより)されたものであり、乾燥剤を含有する個々の密封パケットに−70℃で貯蔵した。使用するために開封する前に、各パケットを室温で平衡化した。各切片標本に冷却界面活性剤(PBS中の1%CHAPS)を加え、4分後に吸引した。冷却PBSで3回洗浄(各洗浄は振とう器で5分間行った)した後、冷却10%リン酸緩衝ホルマリンを加え、4分後に吸引した。冷却PBS中でさらに3回、5分間の洗浄を行った後、10%標準ヤギ血清を含有するPBSを(室温で)加え、60分後に吸引した。
吸着済みの希釈された患者血清およびコントロール血清(容量40μL)を、上述の処理を施した組織切片標本を含有するウェルに個別に加えた。室温で40分後、各ウェルを冷却PBSで十分に洗浄した。ヒトIgGに特異的な、市販の蛍光色素コンジュゲートIgG(例えば、Southern Biotechnology Assoc., Inc., Birmingham, ALの蛍光色素化されたヤギ抗ヒトIgG)を、その後適当な希釈率で加える。室温で35分後、ウェルを冷却PBSで十分に洗浄し、カバーガラス(♯1厚み)を、退色防止試薬を含む封入剤を用いて各スライドに被せた。スライドを、組織に結合したIgGの特徴的NMOパターンについて、蛍光顕微鏡検査(20×対物レンズ)により評価した。
陰性:−または±/−
かすかな陽性、両義の可能性あり:±
明らかな陽性、強い強度:±/+、+または2+
臨床、造影および脊髄液診断基準によって、「明らかな」NMO、アジアの視神経脊髄型のMS、または古典的MSと分類された患者、およびコントロール患者からの血清を、CNS組織に選択的に結合する可能性のある自己抗体について分析した。本明細書に記載する実験は、NMOと多発性硬化症(MS)の古典的形態を区別する血清陽性反応の値を実証する。血清(番号は試験時に割り当てた)は、種々の等級のストリンジェンシーの診断基準を用いて明らかなNMOを罹患している患者(n=45)、古典的MSを罹患している患者(n=19)、MNO(両側性視神経炎または単発性もしくは再発性の縦方向伸長性脊髄炎の発病、それぞれ陰性脳MRIと関連する、すなわち「明らかな」NMO分類用のストリンジェントな診断基準を満たさない)の高いリスクを有すると見なされる患者(n=35)、および最終的にはMSと診断されるものの当初は視神経炎もしくは脊髄炎を示した患者(n=22)からのものであった。間接的免疫蛍光測定を、マウス脳、胃および腎臓の標準的混成基質について行ったが、血清は実施例1に上述した通り肝臓抽出物で予備吸着した。
組換えラットアクアポリン-4(C末端残基249〜323位、Alamone Labs, Jerusalem, Israel)を含有するGST融合タンパク質を、β-メルカプトエタノールを含有する標準ラエムリSDSバッファー中の10%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、NMO患者血清およびポジティブコントロールとしての免疫化ウサギ血清を用いてウェスタンブロットを行ったが、これは患者のIgGが38kDaのGST-アクアポリン-4融合タンパク質に結合するか否かを判別するためであった。ブロットをヒト血清(1:50希釈)と接触させたが、ヒト血清は、NMO患者4人、正常なヒト3人、コントロール脊髄炎患者1人、古典的MSを罹患している患者2人、および他の神経精神病学的疾患を罹患している患者3人の血清などであった。NMO患者4人および免疫化ウサギからの血清は38kDaアクアポリン-4融合タンパク質と結合したが、コントロール患者もしくは他の疾患を示している患者からの血清はいずれも38kDaアクアポリン-4融合タンパク質に結合しなかった。
本発明は、本明細書の発明の詳細な説明に関連して記載されたが、上述の記載は本発明を例証することを意図したものであって、特許請求の範囲により定義される本発明の範囲を限定することを意図したものではない、と理解されたい。他の態様、効果および変法は、特許請求の範囲内に入る。
Claims (17)
- 個体からの生物学的サンプル中のNMO特異的自己抗体の存在または不在を検知する方法であって、
生物学的サンプルをNMO抗原性ポリペプチドアクアポリン-4もしくはその断片と接触させ、
生物学的サンプル中のNMO抗原性ポリペプチドによるNMO特異的自己抗体への結合の存在または不在を検知する、
工程を含む前記方法。 - 生物学的サンプル中のNMO特異的自己抗体の存在が、個体における、視力障害、脱力、麻痺、痙攣または異常もしくは疼痛性感覚、ならびに/あるいは膀胱および/または腸制御の喪失と関連している、請求項1に記載の方法。
- NMO特異的自己抗体の存在が、個体のNMOと関連している、請求項1に記載の方法。
- NMO抗原性ポリペプチドが、組換え発現されたNMO抗原性ポリペプチドである、請求項1に記載の方法。
- NMO特異的ポリペプチドが、脳、脊髄、視神経、腎臓および胃からなる群より選択される固形組織中に存在する、請求項1に記載の方法。
- 生物学的サンプルが、血液、血清、血漿および脳脊髄液からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 個体からの生物学的サンプル中のNMO抗原性ポリペプチドの存在または不在を検知する方法であって、
生物学的サンプルをNMO抗原アクアポリン-4に対する抗NMO抗原抗体と接触させ、
抗NMO抗原抗体の生物学的サンプルへの結合を検知する工程を含んでなり、
結合が生物学的サンプル中のNMO抗原性ポリペプチドの存在を示すものである、前記方法。 - 生物学的サンプル中のNMO抗原性ポリペプチドの存在が、個体のNMOを示す、請求項7に記載の方法。
- 個体が部分的にまたは完全に盲目である、請求項7に記載の方法。
- 生物学的サンプルが、血液、血清、血漿、脳脊髄液、脳生検、および脊髄生検からなる群より選択される、請求項7に記載の方法。
- NMO抗原性ポリペプチド、および、個体中の抗NMO抗原自己抗体を検出するために該NMO抗原性ポリペプチドを使用するための説明書、を含む製品であって、該NMO抗原性ポリペプチドがアクアポリン-4である前記製品。
- 製品が個体のNMOを診断するために使用される、請求項11に記載の製品。
- NMO抗原性ポリペプチドに対する特異的結合親和性を有するモノクローナル抗体をさらに含む、請求項11に記載の製品。
- NMOを患っている個体を治療する方法であって、
個体から体液を取り出し、体液はアクアポリン-4に結合する1種以上の自己抗体を含むものであり、
体液から前記自己抗体の大部分を除去し、
被験者に体液を戻す
工程を含む前記方法。 - NMOを患っている個体を治療する方法であって、
個体にNMO抗原性ポリペプチドを投与し、NMO抗原性ポリペプチドがアクアポリン-4である、
工程を含む前記方法。 - 投与が、経口、静脈内、および非経口からなる群より選択される方法によるものである、請求項15に記載の方法。
- NMOを患っている個体を治療する方法であって、
個体に、NMO抗原性ポリペプチドをコードする核酸を投与し、NMO抗原性ポリペプチドがアクアポリン-4である、
工程を含む前記方法。
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