JPWO2013147081A1 - 生体物質検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
蛍光標識体としては、蛍光色素や無機ナノ粒子(半導体ナノ粒子、量子ドット等と称されることもある)、それらの集積体の利用が知られている(非特許文献2〜3、特許文献4)。蛍光色素や無機ナノ粒子と、それらの集積体では、集積体の方が耐光性能が向上することが報告されている(特許文献5)。従って、耐光性の観点から集積体の方がより好ましいが、蛍光顕微鏡観察において要求される耐光性能には、集積化だけでは十分ではない。なお、色素1個と集積体1個では1個あたりの輝度が集積体の方が高くなるので、シグナルの観点から、集積体の方がより好ましい。
[2] 前記封入剤が退色防止剤を含む、項[1]に記載の生体物質検出方法。
[3] 項[1]に記載の生体物質検出方法に用いるキットであって、
水と自由混和しない有機溶媒を含む封入剤と、
前記生体物質検出方法を記載した使用説明書と
を有する生体物質検出用キット。
[4] 項[2]に記載の生体物質検出方法に用いるキットであって、
水と自由混和しない有機溶媒および退色防止剤を含む封入剤と、
前記生体物質検出方法を記載した使用説明書と
を有する生体物質検出用キット。
[5] 項[1]に記載の生体物質検出方法に用いる病理切片であって、生体物質を特異的に検出するための蛍光標識体を用いた免疫染色処理、固定処理、および水と自由混和しない有機溶媒を含む封入剤を用いた封入処理がなされた病理切片。
項[3]の生体物質検出用キットを用いれば、項[1]の方法で作製できる標本を得ることができる。
本発明の典型的な実施形態にかかる生体物質検出方法は、病理切片から生体物質を特異的に検出する方法であり、基本的には、(1)蛍光標識体を用いて病理切片を免疫染色する工程と、(2)染色後の病理切片に励起光を照射して蛍光発光させ、その病理切片から生体物質を検出する工程と、を有している。本発明では、(1)の工程において、切片の固定処理工程および封入工程を含む。
さらに、(1)の工程の前後どちらかに、形態観察用の染色剤を用いて病理切片を形態観察染色する工程を含んでもいてもよい。こうすることで、蛍光標識体を用いた免疫染色と形態観察用の染色剤を用いた形態観察染色の同時染色を行なうことも可能とできる。
免疫染色用の蛍光標識体、免疫染色工程、形態観察用の染色剤、形態観察染工程の詳細は次のとおりである。
本発明における免疫染色用の蛍光標識体は、免疫染色に用いる事ができるものであれば既存の如何なるものでも構わない。(A)蛍光色素、(B)蛍光ナノ粒子、(C)蛍光色素内包ナノ粒子、(D)蛍光ナノ粒子内包粒子、のいずれであっても良い。
本発明で用いる蛍光色素は既存の如何なるものを用いても構わない。公知の方法により入手または作製することができる。
カルボピロニン系色素分子の具体例としては、CARBOPYRONIN 149などが挙げられる。
Alexa Fluor系色素分子の具体例としては、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 635、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750など(以上インビトロジェン社製)が挙げられる。
DY系色素分子の具体例としては、DY−590、DY−610、DY−615、DY−630、DY−631、DY−632、DY−633、DY−634(以上DYOMICS社製)、などが挙げられる。
DyLight系色素分子の具体例としては、DyLight 594、DyLight633(以上サーモサイエンティフィック社製)などが挙げられる。
その他色素としては、C−Phycocyanin、Phycocyanin、APC(Allophycocyanin)、APC−XL、NorthernLights637(R&D Systems社製)、等が挙げられる。
また、これらの誘導体(蛍光色素として機能しうるもの、例えば、公知の誘導体)を挙げることができる。
本発明で用いられる蛍光ナノ粒子とは、粒子サイズが1〜500nmのものであり、好ましくは10〜200nmである。
半導体は例えばII−VI族半導体であるZnSe、ZnTe、CdSe、CdTe、PbS、PbSe、PbTe等やII−VI族半導体であるAlAs、AlSb、GaP、GaAs、GaSb、InP、InAs、InSb等を用いることができ、毒性の観点から、GaPやInPを好適に用いることができる。
蛍光ナノ粒子の粒子サイズ、母体組成、不純物量を調整することで観察に適した励起波長とする。
ノイズであるエオジンの蛍光や細胞自家蛍光に対する信号値の比の観点から、蛍光標識体の輝度は高い方が好ましい。従って、本発明における蛍光標識体としては、蛍光色素と比して輝度が高い、蛍光色素内包ナノ粒子がより好適に用いられる。
たとえば、芳香環系色素分子、ローダミン系色素分子などの蛍光色素は比較的耐光性が高いため好ましく、なかでも芳香環系色素分子に属するペリレン(perylene)、特にペリレンジイミド(perylene diimide)が好ましい。一方、比較的耐光性の低い蛍光色素であっても、適切な母体を選択することにより、本発明による所定の輝度保持率の条件を満たす蛍光色素内包ナノ粒子を作製できる可能性がある。
本発明で用いられる蛍光ナノ粒子内包粒子とは、有機物または無機物でできた粒子に対し、上記(B)で説明した蛍光ナノ粒子が内包されてなるものである。蛍光ナノ粒子は、蛍光色素内包ナノ粒子中に、いずれか一種を単独で内包させるようにしても、複数種を混合して内包させるようにしてもよい。
蛍光ナノ粒子内包粒子のサイズは10〜500nmのものであり、好ましくは50〜200nmである。
本発明においては、形態観察染色を行うことができる。形態観察染色工程では、特に組織標本の形態を観察する場合、前述したようなヘマトキシリンおよびエオジンの2つの色素を用いるヘマトキシリン・エオジン染色(HE染色)が標準的に用いられるが、本発明における形態観察染色はこれに限定されるものではない。他の形態観察染色としては、例えば細胞診に用いられるパパニコロウ染色(Pap染色)等がある。
本発明における免疫染色の方法としては、前述したような免疫染色用の蛍光標識体で検出の対象とする生体物質を染色する、蛍光染色法が用いられる。
本発明の染色方法において行われる固定処理工程は、上記免疫染色工程により導入された蛍光標識体を、生体物質もしくは生体物質に結合した抗体等に固定化する工程である。固定化処理液で処理する事で、タンパク質の架橋や変性を行ない、蛍光標識体と生体物質もしくは生体物質に結合した抗体等とを、化学的、物理的により強固に結合し、安定した状態とできる。本発明において固定処理は、固定処理溶液に組織化学染色工程により得られた染色組織切片を浸漬することにより行うことができる。例えば、希パラホルムアルデヒド水溶液中に、組織化学染色工程により得られた染色組織切片を数分から数時間程度浸漬することにより行うことができる。
封入工程は、組織切片の有機溶媒による脱水・透徹工程と、油系封入剤による封入工程とからなる。脱水・透徹工程は、染色した組織切片をPBS等の水系洗浄液で洗浄後、EtOH(ethanol)による脱水およびキシレン置換により行なわれる。EtOHによる脱水は、EtOHの水含有率を、例えば、50%、30%、10%、0%というように水含有率を下げたEtOHに、組織切片を順次漬けていき、EtOHに置換することで行なわれる。EtOH置換した切片をキシレンに漬ける事で、キシレン置換が行なわれ、切片が透徹される。キシレン置換した切片に油系封入剤を載せ、カバーガラス等を載せる事で封入が行なわれる。
封入剤は、溶媒(封入溶媒)と樹脂とから構成される。本発明の封入剤には、油系封入剤(一般的に非水溶性封入剤と呼ばれることもある。)を用いる。油系封入剤とは、水と自由混和しない溶媒を含む封入剤をいう。
また、本発明の封入剤は、退色防止剤を含むことができる。これを退色防止剤含有封入剤という。
本発明では、封入溶媒として、水と自由混和しない有機溶媒を含む溶媒を用いる。上記市販の油系封入剤に含まれている溶媒、市販の油系封入剤を希釈するための所定の溶媒、自家で油系封入剤を調製するために用いた溶媒などが上記封入溶媒に相当する。
また、封入溶媒は、水と自由混和しない有機溶媒のみからなるものであってもよいし、必要に応じて、本発明の作用効果を阻害しない範囲で、水と自由混和しない有機溶媒とともに、水および/または水と自由混和する有機溶媒を含むものであってもよい。水と自由混和しない封入剤における、封入溶媒中の、水と自由混和しない溶媒の割合(体積%)は、通常50〜100%であり、好ましくは70〜100%であり、より好ましくは90〜100%である。この範囲で規定された、水と自由混和しない溶媒を含む封入剤は、標本との屈折率差が小さく標本を透明とできる、形態染色の色味や発色が良い、永久標本を作成やすい、より脱水した条件とできるため、標本作製時の水の混入を防止しやすい、標本作製時の乾燥が均一にできる、という観点から好ましい。
封入剤に含まれる樹脂は、封入剤の溶媒分が蒸発した後、固形分として残るので、観察に影響を与えないようなものが適切である。従って、ガラスに近い屈折率で透明性が高いものが適切である。また、着色や蛍光は蛍光顕微鏡観察に悪影響を与えるので無い方が良い。本発明に用いる樹脂としては、上記条件を満たすものであれば、特に限定されるものではないが、例えば、カナダバルサムなどのような天然樹脂や、ポリスチレンやポリメタクリル酸メチルなどのような合成樹脂が挙げられる。
退色防止剤としては、フェノール系、アミン系、リン系、硫黄系および不飽和炭化水素系の退色防止剤の中から、水と自由混和しない溶媒を含む封入溶媒への溶解性に問題がないものを選択して用いることができる。
これら退色防止剤は、蛍光顕微鏡観察に悪影響が無いよう、吸収波長450〜600nmで吸収が無いことが好ましく、発光波長500〜700nmで発光が無いことが好ましい。吸収があると蛍光標識の輝度低下につながる。また、発光があると蛍光顕微鏡観察時にノイズが増加する。なお、退色防止剤吸収の吸収が無いとは、退色防止剤の1mg/mL濃度のキシレン溶液を調整し、10mmセルに入れて吸光度測定を行なった際に、450nmおよび600nmにおける吸光度がともに0.5以下であることをいう。
上記工程により免疫染色および形態観察染色が施された病理切片に、用いられている蛍光標識体に応じた適切な波長を有する励起光を照射することにより、その蛍光標識体が発する蛍光を観察する。このような工程により、その病理切片内に存在する所定の生体分子を検出することができ、例えば、抗体医薬(例えば、HER2を標的とするハーセプチン等)の適用の適否を判定するための情報として利用することができる。
本発明の生体物質検出用キットは、上記工程を含む本発明の生体物質検出方法に使用されるものである。本発明の生体物質検出用キットは、上記水と自由混和しない溶媒を含む封入剤、または、上記水と自由混和しない溶媒ならびに退色防止剤を含む封入剤を有するものであり、さらに、本発明に係る生体物質検出方法が指示として記載された使用説明書、免疫染色用の蛍光標識体および蛍光標識化試薬を有することができる。
キットに含まれる使用説明書は、本発明の方法を実施するために、本発明に係る生体物質検出方法のいずれかが、指示として記載された使用説明書である。使用説明書の具体的態様は上記情報を適切に伝達できるものであればよい。例えば、紙片、キットの包装、キットの構成物のラベル等に印刷されているものでよく、ディスケット、CD等コンピューターで読み取り可能な媒体中に記録されているものでもよい。
<蛍光標識の作製>
蛍光標識は、すべてストレプトアビジン結合体として作製した。
蛍光色素としてSulforhodamine 101 acid chloride(同仁化学社製、Texas Red色素)を用いた。蛍光色素へのストレプトアビジン結合は、以下のようにおこなった。
蛍光色素として用いたペリレンジイミドは次の方法で準備した。N,N'−Bis(2,6−diisopropylphenyl)−1,6,7,12−tetraphenoxyperylene−3,4:9,10−tetracarboxdiimideを濃硫酸で処理し、ペリレンジイミドスルホン酸誘導体を作製した。これを酸クロリドに変換してペリレンジイミドスルホン酸クロリド誘導体とした。これを用いた以外は蛍光色素1の方法と同様にして、ストレプトアビジン結合色素を得た。
SulfoRhodamine101(シグマアルドリッチ社製)2.5mgを水22.5mLに加えた後、ホットスターラ―上で70℃20分間加熱し、メラミン樹脂ニカラックMX−035(日本カーバイド工業社製)1.5gを加え、さらに5分間加熱撹拌した。ギ酸100μLを加え、60℃20分間で加熱攪拌した後、室温放冷した。冷却後、反応混合物を遠心用チューブに入れて遠心分離機に12,000rpmで20分間かけ、上澄み除去した。この洗浄をエタノールと水で行なった。
蛍光色素として上記色素2に記載のペリレンジイミドスルホン酸誘導体を用いた。
それ以外は上記蛍光色素3の方法と同様にして、ストレプトアビジン結合ペリレン色素内包メラミンナノ粒子を得た。
蛍光色素としてフルオレセインイソチオシアネート(同仁化学社製、FITC)を用いた。それ以外は上記蛍光色素3の方法と同様にして、ストレプトアビジン結合FITC色素内包メラミンナノ粒子を得た。
蛍光標識1で用いたTexas Red色素3.4mgと3−アミノプロピルトリメトキシシラン(3−aminopropyltrimetoxysilane、信越シリコーン社製、KBM903)3μLとをDMF中で混合し、オルガノアルコキシシラン化合物を得た。得られたオルガノアルコキシシラン化合物0.6mLを、48mLのエタノール、0.6mLのTEOS(テトラエトキシシラン)、2mLの水、2mLの28%アンモニア水と3時間混合した。上記工程で作製した混合液を10000Gで20分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を2回ずつ行なった。Texas Red色素内包シリカナノ粒子を得た。
蛍光色素として蛍光標識2で用いたペリレンジイミドを用いた。それ以外は上記蛍光色素6の方法と同様にして、ストレプトアビジン結合ペリレン色素内包シリカナノ粒子を得た。
蛍光色素として蛍光色素3で用いたFITCを用いた。それ以外は上記蛍光色素6の方法と同様にして、ストレプトアビジン結合ペリレン色素内包シリカナノ粒子を得た。
Texas Red色素内包ポリスチレン粒子はソープフリー乳化重合法により作製した。蛍光色素Sulforhodamine 101 acid chloride(同仁社製、Texas Red色素)を4−アミノスチレン(東京化成工業社製)と室温条件で1時間混合し、色素結合スチレンを作製した。アルゴンバブリングした純水中5mLにグリシジルメタクリレート(東京化成工業社製)0.18gとスチレン(和光純薬社製)0.05g、ジビニルベンゼン0.05g、上記色素結合スチレン0.005gを加えた。撹拌しながら70℃に昇温し、水溶性アゾ重合開始剤であるV−50(和光純薬社性)を0.012g加え、12時間反応した。反応液を10000Gで20分遠心分離し、粒子を回収した。回収した粒子を純水に分散し再度遠心分離で回収する事で精製を行なった。得られた粒子を過剰のアンモニア水に加え、粒子末端のエポキシ基をアミノ基へと変換し、末端にアミノ基を持つ色素内包ポリスチレンナノ粒子を得た。
蛍光色素として蛍光標識2で用いたペリレンジイミドを用いた。それ以外は上記蛍光色素9の方法と同様にして、ストレプトアビジン結合ペリレン色素内包シリカナノ粒子を得た。
蛍光色素として蛍光色素3で用いたFITCを用いた。それ以外は上記蛍光色素9の方法と同様にして、ストレプトアビジン結合ペリレン色素内包シリカナノ粒子を得た。
蛍光ナノ粒子として、カルボン酸末端のCdSe/ZnS(インビトロジェン社:Qdot605)を用いた。これをEDTA(サーモサイエンス社製)で活性化させた後、蛍光標識1の方法と同様にしてストレプトアビジンと結合させ、ストレプトアビジン結合蛍光ナノ粒子を得た。
CdSe/ZnSデカン分散液(インビトロジェン社:Qdot605)10μLにTEOS0.1mg、エタノール0.01mL、濃アンモニア水0.03mLを加え3時間攪拌して加水分解を行った。得られた混合液を10,000Gで20分間遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を2回ずつ行い、CdSe内包ナノ粒子60mgを得た。
得られたCdSe内包ナノ粒子は、蛍光色素3との方法と同様に、表面アミノ化、PEG化、ストレプトアビジン修飾を行ない、ストレプトアビジン結合CdSe内包ナノ粒子を得た。
使用した蛍光標識の一覧を表1に示す。
封入剤として、以下に示す封入剤1−1〜1−10、2−1〜2−5および3−1を準備した。
(封入剤1−1:ルチン含有封入剤)
封入剤として、エンテランニュー(メルク社製。主成分:アクリル樹脂、キシレン約60%)またはパラマウントN(ファルマ社。主成分:アクリル樹脂、脂肪族炭化水素)を用いた。エンテランニュー、パラマウントNは、購入したものをそのまま希釈せずに用いた。
封入剤に対して退色防止剤として、ルチンを1重量%(以下「wt%」と略記する。)添加して撹拌し、退色防止剤含有封入剤を得た。
封入剤として、エンテランニュー(メルク社製)またはパラマウントN(ファルマ社)を用いた。封入剤に対して退色防止剤として、2,6-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシメチルフェノールを1wt%添加して撹拌し、退色防止剤含有封入剤を得た。
封入剤として、エンテランニュー(メルク社製)またはパラマウントN(ファルマ社)を用いた。封入剤に対して退色防止剤として、セバシン酸ビス(2,2,6,6-テトラメチル-4-ピペリジル)を1wt%添加して撹拌し、退色防止剤含有封入剤を得た。
封入剤として、エンテランニュー(メルク社製)またはパラマウントN(ファルマ社)を用いた。封入剤に対して退色防止剤として、フェノチアジンを1wt%添加して撹拌し、退色防止剤含有封入剤を得た。
封入剤として、エンテランニュー(メルク社製)またはパラマウントN(ファルマ社)を用いた。封入剤に対して退色防止剤として、2-メルカプトベンゾイミダゾールを1wt%添加して撹拌し、退色防止剤含有封入剤を得た。
封入剤として、エンテランニュー(メルク社製)またはパラマウントN(ファルマ社)を用いた。封入剤に対して退色防止剤として、亜りん酸トリフェニルを1wt%添加して撹拌し、退色防止剤含有封入剤を得た。
封入剤として、エンテランニュー(メルク社製)またはパラマウントN(ファルマ社)を用いた。封入剤に対して退色防止剤としてジベンジルジスルフィドを1wt%添加して撹拌し、退色防止剤含有封入剤を得た。
封入剤として、エンテランニュー(メルク社製)またはパラマウントN(ファルマ社)を用いた。封入剤に対して退色防止剤として、3,3'-チオジプロピオン酸ジドデシルを1wt%添加して撹拌し、退色防止剤含有封入剤を得た。
封入剤として、エンテランニュー(メルク社製)またはパラマウントN(ファルマ社)を用いた。封入剤に対して退色防止剤として、DL-α-リポ酸を1wt%添加して撹拌し、退色防止剤含有封入剤を得た。
封入剤として、エンテランニュー(メルク社製)またはパラマウントN(ファルマ社)を用いた。封入剤に対して退色防止剤として、レチノイン酸を1wt%添加して撹拌し、退色防止剤含有封入剤を得た。
封入剤として、エンテランニュー(メルク社製)またはパラマウントN(ファルマ社)をそのまま用いた。退色防止剤は加えなかった。
封入剤に対して退色防止剤として、シアニジンを1wt%添加して撹拌し、退色防止剤含有封入剤を得た。
封入剤に対して退色防止剤として、p-フェニルアゾフェノールを1wt%添加して撹拌し、退色防止剤含有封入剤を得た。
封入剤として、エンテランニュー(メルク社製)またはパラマウントN(ファルマ社)を用いた。封入剤に対して退色防止剤として、4−ニトロアニリンを1wt%添加して撹拌し、退色防止剤含有封入剤を得た。
封入剤として、エンテランニュー(メルク社製)またはパラマウントN(ファルマ社)を用いた。封入剤に対して退色防止剤として、リコピンを1wt%添加して撹拌し、退色防止剤含有封入剤を得た。
封入剤として、フルオロマウント(コスモ・バイオ社製;水性封入剤)を用いた。封入剤に対して退色防止剤として、1,4−ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン(DABCO)を1wt%添加して撹拌し、退色防止剤含有封入剤を得た。
使用した封入剤の一覧を表2に示す。
[免疫組織染色]
蛍光標識1〜13を用いて、ヒト乳房組織の免疫染色を行なった。染色切片はコスモ・バイオ社製の組織アレイスライド(CB−A712)を用いた。組織アレイスライドを脱パラフィン処理後、水に置換洗浄し、10mMクエン酸緩衝液(pH6.0)中で15分間オートクレーブ処理することで、抗原の賦活化処理を行った。抗原の賦活化処理後の組織アレイスライドをPBS緩衝液を用いて洗浄後、1%BSA含有PBS緩衝液を用いて湿潤箱中で1時間ブロッキング処理を行った。ブロッキング処理後、1%BSA含有PBS緩衝液で0.05nMに希釈したビオチン化トラスツズマブを組織切片と2時間反応させ、その後洗浄した。さらに、蛍光標識1〜13と0.5時間反応させ、その後洗浄を行うことにより、免疫組織化学染色切片が得られた。得られた免疫組織化学染色切片を4%中性パラホルムアルデヒド水系バッファ溶液中に10分間浸漬することにより、固定処理を行った。
上記で固定処理した免疫組織化学染色切片に対してHE染色を行い、染色後の切片をエタノールに浸漬することにより脱水し、脱水切片をさらにキシレンに浸漬し風乾させることにより透徹を行ったところ、二重染色切片が得られた。なお、形態染色としてHE染色を行なっても、後述の耐光性評価に影響は無い。
上記形態染色を行なったものについて、封入を行なった。蛍光標識1〜13を用い、封入剤として、1−1〜1−10、2−1〜2−5および3−1をそれぞれ用いた。
[評価1:退色防止剤吸収]
退色防止剤吸収は、退色防止剤の1mg/mL濃度のキシレン溶液を調整し、10mmセルに入れて吸光度測定を行なった際に、450nmおよび600nmにおける吸光度がともに0.5以下であることを退色防止剤吸収無しと、いずれかまたは両方が0.5を超えるものを退色防止剤吸収有りとした。吸光度測定には日立社製分光光度計U−4100を用いた。なお、退色防止剤のキシレン溶解性が悪い場合には、0.5wt%キシレン溶液として、10mmセルに入れて測定を行なった。さらにキシレン溶解性が悪い場合は、溶媒をキシレンとEtOH等との混合溶媒に替えて測定を行なった。
蛍光標識1〜13で免疫染色し、その後に封入剤1−1〜1−10または封入剤2−1〜2−5で封入した組織切片に対し、励起光を照射して蛍光発光させ、その組織切片から、正立型蛍光顕微鏡(カールツァイス社製Axio Imager 2、モノクロカメラAxioCam MRm装備)を用いて画像を取得した。
封入し作製した切片スライドについて、3ヵ月保存後の輝度を評価した。輝度の評価は評価2と同様におこなった。元の輝度に対し、70%以上の輝度を保持している場合は保存性あり(○)、70%未満に低下している場合は保存性なし(×)、とした。
封入し作製した切片スライドについて、分光光度計U−4100(日立社製)で、450〜600nmの吸光度測定を行ない評価した。450nmおよび600nmにおける吸光度がともに0.1以下を透明(○)と、いずれかまたは両方が0.1を超えるものを不透明(×)とした。封入剤に着色がある場合、透明性が低下する。また、切片が白濁した場合も透明性は低下する。蛍光標識の輝度を維持する観点から、切片スライドは透明であることが好ましい。
油系封入剤で染色ができている事の確認のため、染色時に切片の固定処理工程を行わないサンプルを準備し、固定処理工程を行なったものと比較を行なった。固定処理工程を行なわないサンプルに対して、初期輝度が1.1倍以上となっているものを、蛍光染色性を維持している(○)、1.1倍未満となっているものを、蛍光染色性を維持していない(×)とした。
以上の評価結果を表3−1〜3−7、表4、表5−1〜5−3および表6に示す。
Claims (13)
- 病理切片から生体物質を特異的に検出する生体物質検出方法であって、蛍光標識体を用いた免疫染色工程と、切片の固定処理工程と、水と自由混和しない有機溶媒を含む封入剤を用いて切片を封入する封入処理工程とを有する生体物質検出方法。
- 前記蛍光標識体が、蛍光色素内包ナノ粒子および蛍光ナノ粒子内包粒子からなる群より選ばれる少なくとも1種を含む、請求項1に記載の生体物質検出方法。
- 前記水と自由混和しない有機溶媒が、芳香族炭化水素、不飽和炭化水素、ケトン、エステル、エーテルおよびアルコールからなる群より選ばれる少なくとも1種を含む、請求項1または2に記載の生体物質検出方法。
- 前記水と自由混和しない有機溶媒が、キシレン、トルエンおよびリモネンからなる群より選ばれる少なくとも1種を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の生体物質検出方法。
- 前記封入剤が退色防止剤を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の生体物質検出方法。
- 前記退色防止剤が、吸収波長450〜600nmの波長域で吸光をしない、請求項5に記載の生体物質検出方法。
- 前記退色防止剤を含む封入剤を用いて作製した切片スライドが透明である、請求項5または6に記載の生体物質検出方法。
- 前記退色防止剤が、フェノール、アミン、チオール、スルフィド、ジスルフィドおよび不飽和炭化水素からなる群より選ばれる少なくとも1種を含む、請求項5〜7のいずれか一項に記載の生体物質検出方法。
- 前記退色防止剤が、フェノールおよびアミンからなる群より選ばれる少なくとも1種を含む、請求項5〜8のいずれか一項に記載の生体物質検出方法。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の生体物質検出方法に用いるキットであって、
水と自由混和しない有機溶媒を含む封入剤と、
前記生体物質検出方法を記載した使用説明書と
を有する生体物質検出用キット。 - 請求項5〜9のいずれか一項に記載の生体物質検出方法に用いるキットであって、
水と自由混和しない有機溶媒および退色防止剤を含む封入剤と、
前記生体物質検出方法を記載した使用説明書と
を有する生体物質検出用キット。 - さらに、免疫染色用の蛍光標識体および蛍光標識化試薬を含む、請求項10または11に記載の生体物質検出用キット。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の生体物質検出方法に用いる病理切片であって、生体物質を特異的に検出するための蛍光標識体を用いた免疫染色処理、固定処理、および水と自由混和しない有機溶媒を含む封入剤を用いた封入処理がなされた病理切片。
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