JPH01163659A - 膵島膜抗体検出法 - Google Patents
膵島膜抗体検出法Info
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Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
Ａ 産業上の利用分野
この発明は免疫染色法を利用した膵島膜抗体検出法、特
にその非特異的染色の抑制に関するものである。
にその非特異的染色の抑制に関するものである。
Ｂ 発明の概要
この発明は膵島膜抗体（ｌ５ｌｅｔ Ｃｅ１ｌ ５ｕｒ
ｆａｃｅＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ 以下ｒｌ Ｃ３ＡＪ
という。）検出の精度を高めた膵島膜抗体検出法に関す
るものであり、この方法は蛍光色素標識抗体との反応の
終了まで膵島細胞の固定を行なわないこと、固定前の反
応の条件を最適条件とすることを特徴とするものである
。
ｆａｃｅＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ 以下ｒｌ Ｃ３ＡＪ
という。）検出の精度を高めた膵島膜抗体検出法に関す
るものであり、この方法は蛍光色素標識抗体との反応の
終了まで膵島細胞の固定を行なわないこと、固定前の反
応の条件を最適条件とすることを特徴とするものである
。
Ｃ従来の技術
近年、インスリン依存性糖尿病と自己免疫との関連を示
す血清学的マーカーとしてＩ Ｃ３Ａか注目されてきて
いる。
す血清学的マーカーとしてＩ Ｃ３Ａか注目されてきて
いる。
従来の膵島膜抗体（ＩＣ３Ａ）検出法では、カバーグラ
ス等の表面に生着させた単層化膵島細胞を用いるのて、
取り扱いを容易とし、血清等との反応を十分に行なわせ
るため、ます、この単層化膵島細胞の固定を行ない、そ
の後、被検血清及び対照血清との反応、そして標識第２
抗体との反応を行なわせるようにしている。
ス等の表面に生着させた単層化膵島細胞を用いるのて、
取り扱いを容易とし、血清等との反応を十分に行なわせ
るため、ます、この単層化膵島細胞の固定を行ない、そ
の後、被検血清及び対照血清との反応、そして標識第２
抗体との反応を行なわせるようにしている。
０１発明か解決しようとする問題点
上記のような従来の膵島膜抗体検出法では、単層化膵島
細胞と被検血清又は対照血清との反応、及び標識第２抗
体との反応は単層化膵島細胞の固定後に行なわれている
ため、固定による抗原性の変化等から非特異的な染色か
起こり、Ｉ Ｃ３Ａ検出の精度が低下するという問題点
かあった。
細胞と被検血清又は対照血清との反応、及び標識第２抗
体との反応は単層化膵島細胞の固定後に行なわれている
ため、固定による抗原性の変化等から非特異的な染色か
起こり、Ｉ Ｃ３Ａ検出の精度が低下するという問題点
かあった。
この発明は、かかる問題点を解決するためになされたも
ので、Ｉ Ｃ３Ａ検出の精度を向上させることができる
膵島膜抗体検出法を得ることを目的とするものである。
ので、Ｉ Ｃ３Ａ検出の精度を向上させることができる
膵島膜抗体検出法を得ることを目的とするものである。
Ｅ 問題点を解決するための手段
この発明に係る膵島膜抗体検出法は、膵島細胞に、該膵
島細胞か生きている所定条件下で、ＩＣ３Ａ（＋）の抗
血清と該抗血清の抗体と結合する蛍光色素標識抗体を作
用させ、次に該膵島細胞に固定液を作用させ、吹に該膵
島細胞を蛍光顕微鏡で観察することにより上記問題点を
解決したものである。
島細胞か生きている所定条件下で、ＩＣ３Ａ（＋）の抗
血清と該抗血清の抗体と結合する蛍光色素標識抗体を作
用させ、次に該膵島細胞に固定液を作用させ、吹に該膵
島細胞を蛍光顕微鏡で観察することにより上記問題点を
解決したものである。
Ｆ 作用
この発明においては、単層化膵島細胞の抗原性の変化か
生しる前に抗血清及び蛍光色素標識抗体か作用するから
、蛍光色素標識抗体の非特異的染色が抑制される。
生しる前に抗血清及び蛍光色素標識抗体か作用するから
、蛍光色素標識抗体の非特異的染色が抑制される。
Ｇ 実施例
実施例１
単層膵島細胞の作成
７〜８週令のラットよりレージ−とコスチャノフスキー
（Ｌａｃｙ ＆ Ｋｃｓｔｉａｎｏｖｃｋｉ ）等の方
法、すなわちコラゲナーゼ法によって膵島を遊離し、更
に、それら遊離膵島を集め、５分間キレート剤（０，０
２零ＥＤ’ｒＡ／リン酸緩衝液）中に装置した後、膵島
を１０ｍＪＺ三角フラスコにわし、約４ｍ℃のデイスバ
ーセ含有組織培養液（１０００，ＱＬ位／ｍｆ１組織培
養液、 ＲＰＭＩ １６４０ ＴＣＭ １９９等）にて
１５分間低速攪拌することにより単離膵島細胞を得た。
（Ｌａｃｙ ＆ Ｋｃｓｔｉａｎｏｖｃｋｉ ）等の方
法、すなわちコラゲナーゼ法によって膵島を遊離し、更
に、それら遊離膵島を集め、５分間キレート剤（０，０
２零ＥＤ’ｒＡ／リン酸緩衝液）中に装置した後、膵島
を１０ｍＪＺ三角フラスコにわし、約４ｍ℃のデイスバ
ーセ含有組織培養液（１０００，ＱＬ位／ｍｆ１組織培
養液、 ＲＰＭＩ １６４０ ＴＣＭ １９９等）にて
１５分間低速攪拌することにより単離膵島細胞を得た。
単離しない細胞塊はピペッティングにより機械的にｆ＃
離した。これら単離膵島細胞は２０〜２５μｍのメツシ
ュを通し、僅かに共存する夾雑物や細胞塊を除去して純
化した。
離した。これら単離膵島細胞は２０〜２５μｍのメツシ
ュを通し、僅かに共存する夾雑物や細胞塊を除去して純
化した。
このようにして得た単離細胞を組織培養液中［ＴＣＭ１
９９．１６．７ｍＭＤ−グルコース、２０％牛脂児血清
（以下ｒＦＢＳＪという。） ０．１ｍＭ ３−インブ
チル−１−メチルキサンチン（以下ｒＩＢＭＸＪという
。］に１０６〜１０７細胞／ ｍ ｊ２程度になるよう
懸濁させ、この懸澗液を顕微鏡観察用のガラス製カバー
グラスに約０．１ｍρ採り、静置して単層培養した 培養条件は、温度３７℃、湿度１００％、５％ＣＯ２＋
９５％空気インキュヘータを用いた。初めの２〜３日間
は０．１ｍＭ；ＩＢＭＸ、２０％；ＦＢＳ、１６．７ｍ
ＭＨＤ−グルコースを含むＴＣＭ１９９で培養した。
９９．１６．７ｍＭＤ−グルコース、２０％牛脂児血清
（以下ｒＦＢＳＪという。） ０．１ｍＭ ３−インブ
チル−１−メチルキサンチン（以下ｒＩＢＭＸＪという
。］に１０６〜１０７細胞／ ｍ ｊ２程度になるよう
懸濁させ、この懸澗液を顕微鏡観察用のガラス製カバー
グラスに約０．１ｍρ採り、静置して単層培養した 培養条件は、温度３７℃、湿度１００％、５％ＣＯ２＋
９５％空気インキュヘータを用いた。初めの２〜３日間
は０．１ｍＭ；ＩＢＭＸ、２０％；ＦＢＳ、１６．７ｍ
ＭＨＤ−グルコースを含むＴＣＭ１９９で培養した。
この２〜３日間の培養で細胞は前述のカバーグラスの表
面に接着し、シート状に伸展（単層化）し始める。ここ
で培養液を１１ｍＭ；Ｄ−グルコース、１０％、ＦＢＳ
を含むＲＰＭ１１６４０に変え、更に３〜４日間培養を
続け、完全な単層化細胞を得た。
面に接着し、シート状に伸展（単層化）し始める。ここ
で培養液を１１ｍＭ；Ｄ−グルコース、１０％、ＦＢＳ
を含むＲＰＭ１１６４０に変え、更に３〜４日間培養を
続け、完全な単層化細胞を得た。
Ｉ Ｃ３Ａの検出
以下の反応は特に記述がないかきり、気温と液温はとも
に２３℃、湿度１００％の炭酸ガス５％＋空気９５％の
霊囲気条件て行なった。
に２３℃、湿度１００％の炭酸ガス５％＋空気９５％の
霊囲気条件て行なった。
カラス製カバーグラス上に単層培養した上記膵島細胞を
ＰＨ７，３に調整した洗浄液で洗浄した後、希釈した対
照血清又は被検血清をかけ、１時間反応させ、その後、
この洗浄液で３回洗浄した。
ＰＨ７，３に調整した洗浄液で洗浄した後、希釈した対
照血清又は被検血清をかけ、１時間反応させ、その後、
この洗浄液で３回洗浄した。
ここで、洗浄液としては、Ｏ，０２ｍｏｌ／ｕリン酸緩
衝生理食塩水（以下、ｒＰＢｓＪという。）＋０５％ウ
シ血清アルブミン（以下、ｒＢＳＡＪという。）７夜（
以下「Ａイ夜」という。）を用いた。
衝生理食塩水（以下、ｒＰＢｓＪという。）＋０５％ウ
シ血清アルブミン（以下、ｒＢＳＡＪという。）７夜（
以下「Ａイ夜」という。）を用いた。
対照血清及び被検血清は、予め、５６℃で３０分間熱処
理した後、ラット牌臓細胞で吸収処理し、ＰＢＳ＋４％
Ｂ Ｓ Ａｆｐｉ （Ｐ Ｈ７，３）で４倍に希釈した
ものを用いた。
理した後、ラット牌臓細胞で吸収処理し、ＰＢＳ＋４％
Ｂ Ｓ Ａｆｐｉ （Ｐ Ｈ７，３）で４倍に希釈した
ものを用いた。
対照血清は浮遊細胞法等の他のＩ ＣＳＡ測定法により
ｒｃｓＡ（−）と判定されたものを用いた。被検血清は
対照血清と同し方法によりＩＣ３Ａ（＋）と判定された
ものを用いた。
ｒｃｓＡ（−）と判定されたものを用いた。被検血清は
対照血清と同し方法によりＩＣ３Ａ（＋）と判定された
ものを用いた。
次に、上記の反応・洗浄をした膵島細胞に蛍光色素標識
抗体液をかりて１時間反応させ、その後、上記Ａ液で３
回洗浄し、ｐＨ７，３のＰＢＳ中て洗浄した。
抗体液をかりて１時間反応させ、その後、上記Ａ液で３
回洗浄し、ｐＨ７，３のＰＢＳ中て洗浄した。
ここで、蛍光色素標識抗体液は、フルオレッセンイ、ソ
ヂアネート（ＦＩＴＣ）標識Ｆ （ａｂ’）２成分ヤギ
抗ヒトＴ ｇ Ｇ （ｃａｐｐｅｌ、カッペル社製 カ
タログ番号０３０１−００８１）をＰＢＳ＋４％ＢＳＡ
７夜（ｐＨ７，３）で１０倍に希釈したものを用いた。
ヂアネート（ＦＩＴＣ）標識Ｆ （ａｂ’）２成分ヤギ
抗ヒトＴ ｇ Ｇ （ｃａｐｐｅｌ、カッペル社製 カ
タログ番号０３０１−００８１）をＰＢＳ＋４％ＢＳＡ
７夜（ｐＨ７，３）で１０倍に希釈したものを用いた。
次に、上記膵島細胞に５％酢酸アルコール溶液（−２０
℃）を暗所で１０分間作用させて固定し、ＰＢＳ （ｐ
Ｈ７，３）で３回洗浄した。
℃）を暗所で１０分間作用させて固定し、ＰＢＳ （ｐ
Ｈ７，３）で３回洗浄した。
次に、上記膵島細胞を約５分間暗所で風乾し、グリセリ
ンでスライドカラスに封入し、蛍光顕微鏡で観察した。
ンでスライドカラスに封入し、蛍光顕微鏡で観察した。
顕微鏡での観察結果
対照血清の試料の場合はＦＩＴＣに由来する蛍光か全く
観察されなかったが、被検血清の試料の場合は、大部分
の細胞、特にその周縁部に明瞭なＦＩＴＣの蛍光か観察
された。
観察されなかったが、被検血清の試料の場合は、大部分
の細胞、特にその周縁部に明瞭なＦＩＴＣの蛍光か観察
された。
実施例２
温度：１０〜４２℃、反応時間、１０〜１２０分、反応
中の気体の炭酸ガス濃度、θ〜１５％、洗浄液のＢ Ｓ
Ａ ｆｌＡ度；０３〜誌の条件て実施例１に準して実
験を行なったところ、次の範囲で実施例１と同し結果を
得ることかできた。
中の気体の炭酸ガス濃度、θ〜１５％、洗浄液のＢ Ｓ
Ａ ｆｌＡ度；０３〜誌の条件て実施例１に準して実
験を行なったところ、次の範囲で実施例１と同し結果を
得ることかできた。
■ンｆｉ度、１５℃〜３８℃
■反応時間；１５分〜９０分
■反応中の気体の炭酸カス濃度、０＊〜１０＊■洗浄液
のＢＳＡ濃度； Ｑ、５９６〜５９６実施例１．２のい
ずれにおいても、反応の条件を正確に調節することによ
り、単層化した膵島細胞を生きている状態で血清（及び
そのＩｇＧ分画）との反応、そして、標識抗体との反応
を行なわせることにより、固定による抗原性の変化なと
の理由による非特異的な染色か起こらない。そのため、
Ｉ Ｃ３Ａ検出の精度を高めることかできた。
のＢＳＡ濃度； Ｑ、５９６〜５９６実施例１．２のい
ずれにおいても、反応の条件を正確に調節することによ
り、単層化した膵島細胞を生きている状態で血清（及び
そのＩｇＧ分画）との反応、そして、標識抗体との反応
を行なわせることにより、固定による抗原性の変化なと
の理由による非特異的な染色か起こらない。そのため、
Ｉ Ｃ３Ａ検出の精度を高めることかできた。
Ｈ発明の効果
この発明は以上説明したとおり、膵島細胞の固定を蛍光
色素標識抗体との反応の終了まで行なわず、固定前の反
応の条件を最適条件とすることにより、膵島細胞の非特
異的染色を抑制し、Ｉ ＣＳＡ検出の精度を高めるとい
う効果がある。
色素標識抗体との反応の終了まで行なわず、固定前の反
応の条件を最適条件とすることにより、膵島細胞の非特
異的染色を抑制し、Ｉ ＣＳＡ検出の精度を高めるとい
う効果がある。
第１図はこの発明の一実施例を示す工程図である。
代理人 弁理士 佐 藤 正 年
ノ
１１′
と
（。
窮１図
クラス上に
層膵島細胞
争
ご交換
り解島細削に蛍光色素槽±
！かり、 所で１時間反
竹
ご交換
◎ＰＢＳ （ｐ Ｈ７，３）１
↓
↓
◎約５分間暗所で風乾
↓
◎スライドガラスにグ
↓
◎蛍光顕微鏡で観察
中で洗浄
リセリンで封入
Claims (5)
- （１）膵島細胞に、該膵島細胞が生きている所定条件下
で、ＩＣＳＡ（＋）の抗血清と該抗血清の抗体と結合す
る蛍光色素標識抗体を順次作用させ、次に該膵島細胞に
固定液を作用させ、次に該膵島細胞を蛍光顕微鏡で観察
することを特徴とする膵島膜抗体検出法。 - （２）前記所定条件が、温度：１５〜３８℃、反応時間
、１５〜９０分、雰囲気中のＣＯ＿２濃度；０〜１０％
、洗浄液中のＢＳＡ濃度；０．５〜５％であることを特
徴とする特許請求の範囲第１項に記載の膵島膜抗体検出
法。 - （３）前記抗血清が、熱処理後にラット脾臓細胞で吸収
処理し、ＰＢＳ＋ＢＳＡ液で希釈したものであることを
特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の膵島膜抗体検
出法。 - （４）前記蛍光色素標識抗体がフルオレッセインイソチ
アネート（ＦＩＴＣ）標識Ｆ（ａｂ’）＾２成分ヤギ抗
ヒトＩｇＧ（ｃａｐｐｅｌ、カッペル社製カタログ番号
３３００−００８１）をＰＢＳ＋ＢＳＡ液で希釈したも
のであることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載
の膵島膜抗体検出法。 - （５）前記固定液が酢酸アルコール溶液であることを特
徴とする特許請求の範囲第１項に記載の膵島膜抗体検出
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4034787A JPH01163659A (ja) | 1987-02-25 | 1987-02-25 | 膵島膜抗体検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4034787A JPH01163659A (ja) | 1987-02-25 | 1987-02-25 | 膵島膜抗体検出法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01163659A true JPH01163659A (ja) | 1989-06-27 |
Family
ID=12578100
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4034787A Pending JPH01163659A (ja) | 1987-02-25 | 1987-02-25 | 膵島膜抗体検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01163659A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013147081A1 (ja) * | 2012-03-30 | 2013-10-03 | コニカミノルタ株式会社 | 生体物質検出方法 |
-
1987
- 1987-02-25 JP JP4034787A patent/JPH01163659A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013147081A1 (ja) * | 2012-03-30 | 2013-10-03 | コニカミノルタ株式会社 | 生体物質検出方法 |
| JPWO2013147081A1 (ja) * | 2012-03-30 | 2015-12-14 | コニカミノルタ株式会社 | 生体物質検出方法 |
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