JP2546991B2 - パ−オキシダ−ゼ酵素反応を用いた特定成分の測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は特定成分の測定方法に関し、特にパーオキシ
ダーゼの酵素反応を用いる特定成分の測定方法に関す
る。

〔従来技術〕

生体成分などの特定成分を検出する各種の分析法が開
発されて来ているが、それらの方法の中最も精度の高い
方法として、該特定成分とこれに対して特異的に結合し
うる物質（以後特異結合物質と称する）、例えば抗原と
抗体、ある種の糖鎖とレクチン、ビオチンとアビジン、
プロテインＡとIgG、ホルモンとレセプタ、酵素と基質
等の間の特異的結合反応を用いる方法が知られている。

一般的には何らかの標識（ラベル）を付した特異結合
物質（以後標識体と称する）を用い特定成分に応じて変
化した該標識のシグナルを検出することにより特定成分
の測定が行われる。

特に支持体上に直接的にまたは間接的に担持させた特
定成分を標識体と反応させ、両者の複合体として標識体
を固定し、実質的に特定成分に応じた標識からのシグナ
ルを検出する方法が適宜用いられる。

例えば電気泳動した蛋白質生体成分（特定成分）をゲ
ルからニトロセルロース膜上に転写担持し、標識体たと
えば抗体標識体と反応させシグナルを検出する方法、TL
Cプレート上に展開した脂質等の特定成分に標識体を反
応させシグナルを検出する方法、膜上でDNAと該DNAに対
する標識した相補的DNAとを反応させシグナルを検出す
る方法或は免疫組織化学染色法などである。

これらの方法により、特定成分の定量や特定成分の特
異結合物質との反応性だけでなく、特定成分もしくは特
異結合物質の性質、存在状態などに対する多大な情報を
うることができる。例えば電気泳動膜上に転写、担持さ
れた蛋白質や核酸、またはTLC上に展開した脂質成分等
の生体の特定成分と該特定成分に対する標識体とを結合
させた複合体上にシグナルを検出する方法に於ては特定
成分のシグナルの位置、移動度から該特定成分の分子
量、等電点或は極性等の情報がえられる。

また免疫組織化学染色法に於ては、組織上の目的とす
る特定成分の存在場所、状態等の情報がえられる。

〔発明が解決しようとする問題点〕

前記した、支持体上に直接または間接的に担持させた
複合結合体上に実質的に特定成分量に応じてシグナルを
検出する特定成分の測定では、対象とする特定成分が微
量であるため標識が高感度に検出されること、また特定
成分に対するより多くの情報をうるため標識の検出法が
高い分解能をもったものであることが必須である。

特異結合物質の標識としては、放射性同位元素、蛍光
物質、発光物質、酵素等が用いられている。

放射性同位元素は放射活性の減衰や廃棄、被曝或いは
設備に巨費を要する等の問題があり、更に支持体に担持
させた標識体上にシグナルを検出する際には写真感光材
料の感光、現像など長い時間と煩雑な操作を要する欠点
がある。

蛍光物質もしくは発光物質は特殊な装置、設備が必要
である。

一方、酵素を用いた場合、操作も比較的簡単で生成色
素はたやすく可視化でき、定量も可能である。従来、標
識酵素としては、パーオキシデーゼ、アルカリフォスフ
ァターゼ、β−ガラクトシダーゼ等が用いられてきた。
支持体上に担持せしめた複合結合体上に酵素反応により
色素を形成、沈着させる方法において、標識酵素として
パーオキシターゼが主として用いられ、その際、基質と
して、従来ジアミノベンジジン、ｏ−ジアニジジン、４
−クロル−１−ナフトール等が使用されてきた。

ジアミノベンジジンやｏ−ジアニジジンは毒性が強く
バックグランドが出やすい欠点がある。４−クロル−１
−ナフトールは他に比べやや感度が高いが、より微量の
特定成分を測定するため、もしくは、特定成分に対する
より多くの情報を明確に得るには、感度は充分とは言え
ない。

従って本発明の目的は、簡易に且つ高感度、高分解能
であり、しかも迅速な特定成分の測定方法を提供するこ
とである。

〔問題点を解決するための手段〕

前記目的に沿って種々検討した結果、測定対象の特定
成分と、パーオキシダーゼを標識として有する標識体と
から成る複合結合体を支持体上に担持せしめ、該複合結
合体上にパーオキシダーゼの酵素反応によって色素を形
成、沈着せしめる特定成分の測定方法に於いて、該酵素
反応の基質として過酸化水素、芳香族第一級アミン化合
物及び後述の一般式〔II〕で表されるフェノール化合物
の三者を用いる測定方法によって問題点が解消され、前
記本発明の目的が達成される。

尚、本発明において支持体上に担持せしめるとは、支
持体の表面又は内部に固定化し支持体から脱離できない
状態におく事を意味する。

次に本発明を詳細に説明する。

本発明に於いて特定成分は支持体に物理的吸着、イオ
ン結合や共有結合等の化学的結合により直接的に担持さ
れてもよく、１つ以上の特異結合物質を介して間接的に
担持されてもよく、また、支持体内部に包括され担持さ
れていてもよい。又、特定成分を支持体上に直接もしく
は間接的に担持せしめた後、前記標識体を反応させ前記
複合結合体を形成させてもよいし、或いは複合結合体を
形成せしめた後に該複合結合体を支持体上に直接もしく
は間接的に担持せしめてもよい。更に標識体は該特定成
分と複合結合体を形成し、支持体に担持されるが、特定
成分と標識体は直接結合してもよく、１つ以上の他の特
異結合物質を介して結合してもよい。

また本発明に於いて標識体はパーオキシダーゼと抗パ
ーオキシダーゼ抗体とで特異結合物質を重複して標識し
たものであってもよい。

複合結合体中のパーオキシダーゼの酵素反応のパーオ
キシダーゼの基質としては、過酸化水素、芳香族第一級
アミン化合物及びフェノール化合物を用いる。パーオキ
シダーゼと過酸化水素の作用により芳香族第一級アミン
化合物は酸化され、次いでフェノール化合物とカップリ
ングして鮮やかな青色色素が生成、沈着する。

従来の過酸化水素及び４−クロル−１−ナフトールを
基質として用いるアナリティカルバイオケミストリ（An
alytical Biochemistry）119、142−147（1982）に記
載の方法と比べ本発明の方法は発色時間が短縮され、ス
ポットは鮮明で感度は10倍以上上昇した。また、その結
果、パーオキシダーゼ標識体の量を低減する事ができコ
スト的にも有利である。

本発明において、対象とする特定成分は、その特定成
分に特異的に結合する特異結合物質が得られる物質又は
物質群である。

たとえば蛋白質、核酸、ホルモン、脂質、複合糖質、
糖脂質、多糖類、酵素、ビタミン、抗原、抗体等が挙げ
られる。

また本発明に使用し得る特異結合物質は、特定成分又
は他の特異結合物質と特異的に結合できる物質であり、
特定成分に応じて適当に選ぶ事ができる。たとえば、蛋
白質、核酸、ホルモン、脂質、複合糖質、糖脂質、多糖
類、酵素、ビタミン、抗原、抗体、レクチン、プロテイ
ンＡ、アビジン、ビオチン、レセプタ、補酵素、酵素の
基質、毒素、補体及びこれらの複合体等が挙げられる。

本発明に使用し得る支持体としては、セルロースアセ
テート、ニトロセルロース等の膜；ポリアクリルアミド
等のゲル状支持体;TLCプレート等のシリカゲル担体；デ
キストラン、アガロース等の多糖類及びその誘導体；プ
レート状、ビーズ状のプラスチック、ガラス、金属、繊
維、活性炭、ヒドロキシアパタイト等が挙げられる。ま
た組織化学染色においては、組織そのものも支持体とし
て使用できる。

本発明において使用し得る芳香族第一級アミン化合物
としては、ｏ−又はｐ−アミノフェノール系化合物及び
ｏ−又はｐ−フェニレンジアミン系化合物及びそれらの
塩が挙げられる。

好ましくはｐ−フェニレンジアミン系化合物であり下
記一般式〔Ｉ〕で示されるものである。

一般式〔Ｉ〕 式中、Ａ及びＢは水素原子またはアルキル基を表し、
ＡとＢは窒素原子と共に複素環を形成してもよく、D,E,
G及びＪは水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ア
ミノ基、アルコキシ基、アシルアミド基、アリールスル
ホンアミド基、アルキルスルホンアミド基またはアルキ
ル基を表す。

Ａ及びＢで表されるアルキル基としては、炭素原子数
１乃至６のものが好ましく、特に１乃至４のものが好ま
しい。例えばメチル基、エチル基、ブチル基を挙げるこ
とができる。これらのアルキル基は置換基を有していて
もよく置換基としては、例えばヒドロキシル基、ウレイ
ド基、テトラヒドロフリル基、カルボキシル基、メタン
スルホンアミド基、スルホ基、メトキシ基、エトキシ
基、メトキシエトキシ基、メトキシエトキシエトキシ
基、メトキシテトラエトキシ基が挙げられる。更に好ま
しくはヒドロキシル基、メタンスルホンアミド基であ
る。

D,G及びＪとしては水素原子、アルコキシ基、及びア
ルキルスルホンアミド基、アリールスルホンアミド基が
好ましく、さらに好ましくは水素原子である。Ｅとして
は水素原子、アルキル基、アシルアミド基が好ましく、
より好ましくは炭素原子数１〜３のアルキル基特にメチ
ル基である。

また、一般式〔Ｉ〕で示される化合物の塩としてはｐ
−トルエンスルホン酸、スルホン酸、スルフイン酸、硫
酸エステル、スルフアミン酸、チオ硫酸ｓ−エステル、
カルボン酸、燐酸エステル、アミド燐酸、燐酸、亜燐酸
エステル、有機硼素化合物、塩酸及び硫酸等の有機酸又
は無機酸の塩を挙げることができ、特にｐ−トルエンス
ルホン酸塩、塩酸塩及び硫酸塩が好ましい。

以下に本発明に係る芳香族第一級アミン化合物の代表
的具体例を示すが、本発明はこれに限定されるものでは
ない。

例示化合物 （１−１）N,N−ジエチル−３−メチル−４−アミノア
ニリン （１−２）N,N−ジエチル−４−アミノアニリン （１−３）Ｎ−カルバミドメチル−Ｎ−メチル−４−ア
ミノアニリン （１−４）Ｎ−カルバミドメチル−Ｎ−テトラヒドロフ
ルフリル−３−メチル−４−アミノアニリン （１−５）Ｎ−エチル−Ｎ−カルボキシメチル−３−メ
チル−４−アミノアニリン （１−６）Ｎ−カルバミドメチル−Ｎ−エチル−３−メ
チル−４−アミノアニリン （１−７）Ｎ−エチル−Ｎ−テトラヒドロフルフリル−
３−メチル−４−アミノフェノール （１−８）３−アセチルアミノ−４−アミノジメチルア
ニリン （１−９）Ｎ−エチル−Ｎ−βメタンスルホンアミドエ
チル−４−アミノアニリン （１−10）Ｎ−エチル−Ｎ−β−メタンスルホンアミド
エチル−３−メチル−４−アミノアニリン （１−11）Ｎ−メチル−Ｎ−β−スルホエチル−ｐ−フ
ェニレンジアミン （１−12）Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチル−３−メ
チル−４−アミノアニリン （１−13）Ｎ−エチル−Ｎ−〔２−（２−メトキシエト
キシ）エチル〕−３−メチル−４−アミノアニリン （１−14）Ｎ−エチル−Ｎ−｛２−〔２−（２−メトキ
シエトキシ）エトキシ〕エチル｝−３−メチル−４−ア
ミノアニリン （１−15）Ｎ−エチル−Ｎ−〔２−｛２−〔２−〔２−
（２−メトキシエトキシエトキシ）エトキシ〕エトキ
シ〕エトキシ｝エチル〕−３−メチル−４−アミノアニ
リン （１−16）N,N−ジエチル−３、メタンスルホンアミド
エチル−４−アミノアニリン。

一般式〔Ｉ〕で示される化合物の塩は、一般的に水溶
性であり、水もしくは緩衝液中に容易に溶解する事がで
きる。

本発明において使用し得るフェノール化合物は、芳香
族第一級アミン化合物の酸化体とカップリングして色素
を生成する化合物であり、該生成色素の水に対する溶解
性を減ずるため、ベンゼン環上に適当な置換基を置換し
たフェノール化合物である。このため、このフェノール
化合物は、カップリングによって離脱するＺで表される
基以外の部分で、水溶性に寄与するスルホ基（−SO₃H）
またはカルボキシル基（−COOH）を有さない。

該フェノール化合物の中でも好ましいのは、４位が置
換されていない又は芳香族第一級アミン化合物の酸化体
とカップリング反応する際に離脱しうる基（以下、離脱
基と称する）もしくは原子（以下離脱原子と称する）で
置換されているフェノール化合物である。

本発明のフェノール化合物は次の一般式〔II〕で示さ
れる。

一般式〔II〕 式中、R₁はハロゲン原子、脂肪族炭化水素基、脂環式
化合物残基、ヘテロ環残基、アリール基、−SCN、−O
R₄、−OCOR₄、−OSO₂R₄、−SR₄、−CONHR₄、−OS₂NH
R₄、 を表すか、あるいは、２つのR₁が結合して非芳香族環、
または芳香族環を形成してもよい。R₄及びR₅は水素原
子、脂肪族炭化水素残基、脂環式化合物残基、アリール
基又はヘテロ環残基を表し、Ｚは水素原子、離脱基又は
離脱原子を表し、ｋは１乃至４の整数を表す。ｋが２以
上のときR₁は互いに同じでも異なってもよい。ただし、
一般式〔II〕で表される化合物のうち、Ｚ以外の部分で
スルホ基またはカルボキシル基を有する化合物を除く。

Ｚで表される離脱原子としては、ハロゲン原子例えば
塩素原子、臭素原子が挙げられる。好ましくは塩素であ
る。

Ｚで表される離脱基としては、例えば−OR₂,−OCOR₂,
−OSO₂R₂,−SR₂,−OCONHR₂,−OS₂NHR₂, −SCNが挙げられる。

ここにR₂及びR₃は水素原子、脂肪族炭化水素残基、脂
環式化合物残基、アリール基又はヘテロ環残基を表す。

R₁,R₂,R₃,R₄及びR₅で表される脂肪族炭化水素残基と
しては飽和のもの不飽和のもののいずれでもよく、また
直鎖のもの、分岐のもののいずれでもよい。そして好ま
しくはアルキル基（例えばメチル基、エチル基、プロピ
ル基、イソプロピル基、ブチル基、ｔ−ブチル基、イソ
ブチル基、ドデシル基、オクタデシル基の各基）、アル
ケニル基（例えばアリル基、オクテニル基等の各基）で
ある。

R₁,R₂,R₃,R₄及びR₅で表される脂環式化合物残基とし
ては５乃至６員のもの、例えばシクロペンチル基、シク
ロヘキシル基が挙げられる。

R₁,R₂,R₃,R₄及びR₅で表されるヘテロ環残基としては
ピリジルニル基、ピラジニル基、ピリダジニル基、キノ
リル基、ピロリジル基、フラリル基、チエニル基、ピペ
リジル基、ピロリル基、ピロリニルヒ基、テトラゾリル
基、チアゾニル基、イミダゾリル基、モルホリル基、フ
リル基、オキサゾリル基、チアゾリル基、ベンツイミダ
ゾリル基、ベンツオキサゾリル基、ベンツチアゾリル基
等の各基が代表的である。

R₁,R₂,R₃,R₄及びR₅で表されるアリール基としてはフ
ェニル基、ナフチル基が代表的である。

前述の２つのR₁が結合して形成するベンゼン環に融合
する非芳香族環としては５乃至６員のもの例えばシクロ
ペンタン環、シクロヘキサン環、シクロヘキセン環が挙
げられる。

前述の２つのR₁、特に５位と６位のR₁が結合して形成
するベンゼン環と融合する芳香族環としては、５乃６員
のものたとえば、フェニル基、ピリジルニル基、ピラジ
ニル基、ピリタジニル基、ピロリジル基、フラリル基、
チェニル基、ピペリジル基、ピロリル基、ピロリニル
基、チアジニル基、イミダゾリル基、フリル基、オキサ
ゾリル基、チアゾリル基等が挙げられる。好ましくはフ
ェニル基である。

以上のR₁,R₂,R₃,R₄及びR₅で表される脂肪族炭化水素
残基、脂環式化合物残基、アリール基、ヘテロ環残基、
並びに前途の２つのR₁が結合して形成する非芳香族環、
芳香族環は置換基を有していてもよい。

かかる置換基としては、例えばハロゲン原子（例えば
塩素原子、フッ素原子）、ニトロ基、シアノ基、ヒドロ
キシ基、ケト基、アミノ基（例えば、アミノ、アルキル
アミノ、ジアルキルアミノ、アニリノ、Ｎ−アルキルア
ニリノ）、アルキル基（例えば、メチル、プロピル、イ
ソプロピル、ｔ−ブチル、オタクデシル、シアノアルキ
ル、ハロアルキル、アルアルキル）、アルケニル基、ア
リール基（例えば、フェニル、トリル、アセチルアミノ
フェニル、４−ラウロイルアミノフェニル、エトキシフ
ェニル）ヘテロ環残基、アルコキシ基（例えば、エトキ
シ、フェノキシ、メトキシ、テトラデシルオキシ）、ア
リールオキシ基（例えば、フェノキシ、2,4−ジ−ｔ−
アミルフェノキシ、ｐ−ｔ−ブチルフェノキシ、４−ｎ
−ドデシルオキシフェノキシ、４−ヒドロキシ−３−ｔ
−ブチルフェノキシ、４−ヒドロキシ−３−ｎ−ブチル
フェノキシ）、アリールチオ基、アミド基（例えば、ア
セトアミド、メタンスルホンアミド、ｐ−ドデシルベン
ゼンスルホンアミド）、カルバモイル基（例えば、Ｎ−
ｐ−カルボキシナトキシフェニルカルバモイル、N,N−
ジヘキシルカルバモイル、Ｎ−ベンジルカルバモイル、
Ｎ−エチルカルバモイル、Ｎ−メトキシエチルカルバモ
イル）、スルファモイル基（例えば、N,N−ジエチルス
ルファモイル）、アルキルスルホニル基、アリールスル
ホニル基（例えば、ベンゼンスルホニル、ｍ−クロルベ
ンゼンスルホニル）、アシル基（例えば、アセチル、ｐ
−クロルベンゾイル、ベンゾイル）、アシルオキシ基
（例えば、アセチルオキシ、ｍ−クロルベンゾイルオキ
シ）、アシルオキシカルボニル基及びアルコキシカルボ
ニル基（例えば、Ｎ−メトキシエチルカルバモイルメト
キシカルボニル、エトキシカルボニル、メトキシカルボ
ニル、トリエトキシカルボニル）、アリールオキシカル
ボニル基（例えばフェノキシカルボニル、ｐ−ニトロフ
ェノキシカルボニル）、アリールチオカルボニル基（例
えば、フェニルチオカルボニル）、イミド基（例えば、
サクシンイミド、オクタデシルサクシンイミド）が挙げ
られる。

以下に本発明のフェノール化合物の代表的具体例を示
すが、本発明に用いられる化合物はこれに限定されるも
のではない。

例示化合物 （２−１）２−ベンジル−４−クロルフェノール （２−２）Ｎ−ベンゾイル−4,6−ジクロル−５−メチ
ル−２−アミノフェノール （２−３）２−ベンゾイルアミノ−５−アセトアミノ−
４−クロルフェノール （２−４）４−クロル−１−ナフトール （２−５）４−メトキシ−１−ナフトール （２−６）2,4−ジクロル−１−１ナフトール （２−７）１−ヒドロキシ−４−ブロム−Ｎ−エチル−
２−ナフトアミド （２−８）１−ヒドロキシ−４−メトキシ−Ｎ−プロピ
ル−２−ナフトアミド （２−９）2,6−ジブロム−1,5−ジヒドロキシ−ナフタ
レン （２−10）１−ヒドロキシ−５−フェニルスルホンアミ
ドナフタレン （２−11）１−ヒドロキシ−2,4−ジクロル−５−ニト
ロ−ナフタレン （２−12）４−ブロム−１−ナフトール （２−13）４−エトキシ−１−ナフトール （２−14）４−（ｎ−ブトキシ）−１−ナフトール （２−15）４−スルホ−１−ナフトール （２−16）４−（２−メトキシエトキシ）−１−ナフト
ール （２−17）４−メチルチオ−１−ナフトール （２−18）４−フェニルチオ−１−ナフトール （２−19）４−フェニルアゾ−１−ナフトール （２−20）4,5−ジメトキシ−１−ナフトール （２−21）４−エタンスルホンアミド−１−ナフトール （２−22）４−（２−アミノフェニルアゾ）−２−プロ
ピル−１−ナフトール （２−23）4,7−ジメトキシ−２−メトキシメチル−１
−ナフトール （２−24）４−クロル−２−ジメチルカルバモイル−１
−ナフトール （２−25）４−（１−カルボキシブトキシ）−１−ナフ
トール （２−26）４−クロル−２−アセチルアミノ−１−ナフ
トール 支持体に担持された特定成分とパーオキシダーゼ標識
体との複合結合体上に色素を生成沈着せしめるには発色
用基質試液中に支持体を浸漬させれば良い。発色用基質
試験液は、適当なpHの緩衝液中に過酸化水素、芳香族第
一級アミン化合物及びフェノール化合物を溶解し、調製
される。フェノール化合物は、少量の親水性の有機溶剤
たとえばメタノール、エタノール、DMF等に溶解して加
えても良い。芳香族第一級アミン化合物フェノール化合
物とのモル比は１対100から100対１が適当であり、１対
10からの10対１が好ましい。

酵素反応により支持体上に色素が充分生成沈着した
後、未反応物質を洗い流し、反応を停止する。

生成色素についての情報は、目視にて、もしくは技術
的に公知な方法たとえば分光度計を用いて読み取る事が
できる。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本
発明はその実施例によりその範囲を限定されるものでは
ない。

実施例１ ：ニトロセルロース膜上での抗原の測定： 純水にて洗浄後、風乾したニトロセルロース膜（バイ
オラッド社製；厚み0.45μｍ）に、燐酸緩衝液（以下PB
Sと称す）にて段階希釈したヤギIgGの１μｌをスポット
した。

風乾後１％牛血清アルブミン（BSA）−PBS溶液により
４℃にて一晩ブロッキングを行い、次いでパーオキシダ
ーゼ標識ウサギ抗ヤギIgG抗体（カッペル社製;1％BSA−
PBS溶液により1500倍希釈したもの）と４℃２時間反応
させた。0.05％Tween20（ポリオキシエチレンソルビタ
ンモノラウレート；和光純薬社製）−PBS溶液にて５回
洗浄し発色用基質試液中に浸漬した。

発色用基質試液は次の３種を用い、比較した。

（１）:3mgの１−４−クロル−１−ナフトールを1mlの
メタノールに溶解し、5mlの0.02Mトリス塩酸緩衝液（pH
7.4,200mM NaCl含有；以下TBSと称す）を加える さらに３％過酸化水素20μｌを加える。

（２）：（１）の試液にＮ−エチル−Ｎ−β−メタンス
ルホンアミドエチル−３−メチル−４−アミノアニリン
3/2硫酸１水塩1mgを加えた。

（３）：（１）の試液にN,N−ジエチル−３−メチル−
４−アミノアニリン塩酸塩1mgを加えた。

15分間反応後、充分水洗し、風乾した。

発色用基質試液（１）を用いた場合、スポットは灰紫
色であり10ngのヤギIgGしか検出できなかったが発色用
基質試液（２）及び（３）を用いた場合スポットは鮮や
かな青色で1ngのヤギIgGが検出可能であった。

実施例２ :TLCプレート上での糖脂質抗原の測定： TLCプレート（ポリグラム、マチェリー・ナーゲル社
製）上に牛脳より分離精製したGM₁がガングリオシドの
量を変化させクロロホルム、メタノール混合液に溶解し
スポットした後、クロロホルム対メタノール対0.5％塩
化カルシウム水溶液（55対45対10V/V）の展開液にて展
開した。風乾後１％ポリビニルピロリドン、１％オバル
ブミン−PBS溶液にて４℃、一晩ブロッキングし、ウサ
ギにて作製した、抗GM₁ガングリオシド抗血清（１％ポ
リビニルピロリドン、１％オバルブミン−PBS溶液にて5
00倍希釈）と37℃２時間反応させた。

0.05％Tween−20−PBS溶液にて３回洗浄後パーオキシ
ダーゼ標識ヤギ抗マウスイムノグロブリン抗体（カッペ
ル社製:3％ポリビニルピロリドン−PBS溶液にて1500倍
希釈）と37℃,2時間反応させた。

0.05％Tween−20−PBS溶液にて３回洗浄後発色用基質
試液中に浸漬した。発色用基質試液は、次の３種を用い
比較した。

（１）：実施例１の（１）と同様 （２）：（１）にＮ−エチル−Ｎ−ヒドロキシルエチル
−３−メチル−４−アミノアニリン硫酸１水塩1mgを加
えた。

（３）：（２）の試液中、４−クロル−１−ナフトール
の代わりに４−メトキシ−１−ナフトールを用いた。

15分間反応後充分水洗し、風乾した。

（１）の発色用基質試液を用いた場合、スポットは灰
紫色であり、4ngのGM₁ガングリオシドしか検出できなか
ったが、（２）及び（３）の試液を用いた場合、スポッ
トは鮮かな青色で0.2ngまで検出可能であった。

実施例３ ：抗体及びハイブリドーマのスクリーニング： α_１−アンチトリプシン50μｇをフロイントの完全ア
ジュバントと共にBalb/Cマウス（雌、６週齢）の腹腔内
に注射した。３週間後、さらにα_１−アンチトリプシン
50μｇをフロイントの不完全なアジュバンドと共に腹腔
内に注射し、さらに２週間後α_１−アンチトリプトン30
μｇをPBSに溶解し、静脈注射した。

最終免疫の３日後脾臓細胞を取り出し、常法に従い、
マウスミエローマ細胞×63.6.5.3と融合した。96穴プレ
ート５枚に分配しHAT選択培地にて培養した。融合の３
週間後ハイブリドーマのコロニーが生成したウェルにつ
いて、抗体の測定を以下の方法にて行った。

ニトロセルロースを4mm角の正方形に切断し、おのお
のにα_１−アンチトリプシン500μg/mlPBS溶液１μｌを
スポットした。96穴マイクロタイタープレート１穴当た
り１枚ずつ加え、１％BSA−PBS溶液にて４℃、１晩ブロ
ッキングした。PBSにて洗浄後、ハイブリドーマの培養
上清40μｌを加え、温室にて２時間反応させた。

0.05％Tween−20−PBS溶液にて３回洗浄した後、パー
オキシターゼ標識ヤギ抗マウスイムノグロブリン抗体
（カッペル社製;1％BSA−PBS溶液にて1500倍希釈したも
の）を40μｌ加え、室温にて２時間反応させた。0.05％
Tween−20−PBS溶液にて３回洗浄後、発色用基質試液を
加え、ニトロセルロース上に色素が生成したものを抗体
活性陽性とした。

発色用基質試液として （１）：実施例１の（１）と同様 （２）：（１）にN,N−ジエチル−４−アミノアニリン
硫酸塩1mgを加えた、２種類を用い比較した。

測定した350穴のうち（１）の試液を用いた場合は15
穴しか抗体活性陽性ハイブリドーマが検出できなかった
が本発明の（２）の試液を用いた場合23穴に抗体活性陽
性ハイブリドーマが検出できた。

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】測定対象の特定成分と、パーオキシダーゼ
   を標識として有している標識体とから成る複合結合体を
   支持体上に担持せしめ、該複合結合体上にパーオキシダ
   ーゼの酵素反応によって沈着する色素を形成せしめるに
   あたって、該色素を形成せしめるために、過酸化水素、
   芳香族第１級アミン化合物及び下記一般式〔II〕で表さ
   れる化合物の三者を用いることを特徴とする特定成分の
   測定方法。 一般式〔II〕 〔式中、R₁はハロゲン原子、脂肪族炭化水素基、脂環式
   化合物残基、ヘテロ環残基、アリール基、−SCN、−O
   R₄、−OCOR₄、−OSO₂R₄、−SR₄、−CONHR₄、−OS₂NH
   R₄、 を表すか、あるいは、２つのR₁が結合して非芳香族環、
   または芳香族環を形成してもよい。R₄及びR₅は水素原
   子、脂肪族炭化水素残基、脂環式化合物残基、アリール
   基又はヘテロ環残基を表し、Ｚは水素原子、離脱基又は
   離脱原子を表し、ｋは１乃至４の整数を表す。ｋが２以
   上のときはR₁は互いに同じでも異なってもよい。ただ
   し、一般式〔II〕で表される化合物のうち、Ｚ以外の部
   分でスルホ基またはカルボキシル基を有する化合物を除
   く。〕
2. 【請求項２】前記特定成分を支持体上に直接もしくは間
   接的に担持せしめた後、前記標識体を反応させ、複合結
   合体を形成せしめることを特徴とする特許請求の範囲第
   １項記載の特定成分の測定方法。
3. 【請求項３】前記複合結合体を形成せしめた後に、該複
   合結合体を支持体上に直接もしくは間接的に担持せしめ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の特定成
   分の測定方法。