JPS6371654A - パ−オキシダ−ゼ酵素反応を用いた特定成分の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【産業上の利用分野】

本発明は特定成分の測定方法に関し、特にパーオキシダ
ーゼの酵素反応を用いる特定成分の測定方法に閃する。

【従来技術】

生体成分などの特定成分を検出する各種の分析法が開発
されて米でいるが、それらの方法の中段も精度の高い方
法として、該特定成分とこれに対して特異的に結合しう
る物質（以後特異結合物質と称する）、例えば抗原と抗
体、ある種の糖鎖とレクチン、ビオチンとアビジン、プ
ロティンＡとＩｇＧ、ホルモンとレセプタ、酵素と基質
等の間の特異的結合反応を用いる方法が知られている。 一般的には何らかの標ｎ（ラベル）を付した特異結合物
質（以ｆ！　？Ｗ識体と称する）を用い特定成分に応じ
て変化した該標識のシグナルを検出することにより特定
成分の測定が行われる。 特に支持体に直接的にまたは間接的に担持させた特定成
分を標識体と反応させ、両者の複合体として標識体を固
定し、実質的に特定成分に応じた標識からのシグナルを
検出する方法が適宜用いられる。 例えば電気泳動した蛋白質生体成分（特定成分）をゲル
からニトロセルローズ膜上に転写担持し、環１体たとえ
ば抗体標識体と反応させシグナルを検出する方法、ＴＬ
Ｃプレート上に展開した脂質等の特定成分に標識体を反
応させシグナルを検出する方法、膜上でＤＮＡと該Ｄ　
Ｎ　Ａ　ｌ：　Ｎする１２識した相補的ＤＮＡとを反応
させシグナルを検出する方法或は免疫組織化学染色法な
どである。 これらの方法により、特定成分の定量や特定成分の特異
結合物質との反応性だけでな（、特定成分もしくは特異
結合物質の性質、存在状態などに対する多大な情報をう
ろことができる。例えば電気泳ｆ３′Ｊ後腺上に転写、
担持された蛋白質や核酸、またはＴＬＣ上に展開した脂
質成分等の生体の特定成分と該特定成分に対する標識体
とを結合させた複合体上にシグナルを検出する方法に於
ては特定成分のシグナルの位置、移動度から誼特定成分
の分子１、等電点或は極性等の情報がえられる。 また免疫組織化学染色法に於ては、組織上の目的とする
特定成分の存在場所、状態等の情報かえられる。

【発明が解決しようとする問題、α］ 前記した、支持体上に直接または間接的に担持させた複
合結合体上に実質的に特定成分量に応じてシグナルを検
出する特定成分の測定では対象とする特定成分が微量で
あるため標識が高感度に検出されること、また特定成分
に対するより多くの情報をうるため標識の検出法が高い
分Ｍ、ｆｆ！をもったものであることが必須である。 ｖＰ異結合物質の標識としては、放射性同位元素、蛍光
物質、発光物質、酵素等が用いられている。 放射性同位元素は放射活性の減衰や廃棄、被曝或は設費
に巨費を要する等の問題があり、更に支持体に担持させ
た標識体上にシグナルを検出する際には写真感光材料の
感光、現像など良い時間と煩雑な操作を要する欠点があ
る。 蛍光物質もしくは発光物質は特殊な装置、設備が必要で
ある。 一方、酵素を用いた場合、操作も比較的簡単で生成色素
はたやすく可視化でき、定量も可詣である。従来、標識
酵素としてバーオキシグーゼ、アルカリ７オス７アター
ゼ、β−〃ラクトシグーゼ等が用いられてきた。支持体
上に担持せしめた複合結合体上に酵素反応により色素を
生成、沈着させる方法において、標ａ＃素としてバーオ
・キシグーゼが主として用いられ、その際、基質として
、従来ジアミノベンジノン、０−ノアニシジン、４−ク
ロロ−１−ナフトール等が使用されてきた。 ノアミノベンツジンや０−ノアニシジンは毒性が強くバ
ックグランドカイ出やすい欠点がある。４−クロロ−１
−カブトールは池に比べやや感度が高いが、より微量の
特定成分を測定するため、もしくは、特定成分に対する
より多くの情報を明確に得るには、感度は充分とは言え
ない。 従って本発明の目的は、簡易に且つ高感度、高ｔ％　　
４１Ｆ　　／１０４％　門　　１　　ｌ　　上、　１　
　コ１　ゴガ　φ、　べｔ　ウ　＋ｈ　　Ｌ−Δヘ　エ
ｄｒラ　−争俸　コ棒・　−提供することである。 【問題点を解決ｒるための手段】 前記目的に沿って種々検討した結果、測定対象の特定成
分とバーオキシグーゼをＪＩＩとして有する標識体とか
らなる複合結合体を支持体上に担持せしめ、該複合結合
体上にバーオキシグーゼの酵素反応によって色素を形成
、沈着せしめる特定成分の到定方法に於て、該酵素反応
の基質として過酸化水素、芳香族第一級アミン化合物及
び活性メチレン化合物の三者を用いる測定方法によって
問題点が解消され、重工本発明のゴ的が達成される。 犬に本発明の詳細な説明する。 本発明に於て特定成分は支持体に物理的吸着、化学的結
合等により直接的に担持されてもよく、１つ以上の特異
結合物質を介して間接的に担持されてもよい、又、特定
成分を支持体上に直接もくくは間接的に担持せしめた後
、前記標識体を反応させ前記複合結合体を形成させても
よいし、或は複合結合体を形成せしめた後に譲曳合結合
体を支持体上に直接もしくはｎｒＩ接的に担持せしめで
（、上い。更に標識体は該特定成分と複合結合体を形成
し、支持体に担持されるが、特定成分と標識体は直接結
合してもよく、１つ以上の池の特異結合物質を介して結
合してもよい。 また本発明に於て標識体はパーオキシダーゼと抗バーオ
キシグーゼ抗体とで特異結合物質を重複して標識したも
のであってもよい。 複合結合体中のパーオキシダーゼの酵素反応の基質とし
では、過酸化水素、芳香族第一級アミン化合物及び活性
メチレン化合物を用いる。パーオキシダーゼと過酸化水
素の作用により芳香族第一級アミン化合物は酸化され、
次いで活性メチレン化合物とカップリングして色素が生
成、沈着する。 従来の過酸化水素及び４−クロロ−１−す７トールを基
質として用いるアナリティ力ルバイオケミ　ス　ト　リ
　−　（＾ｎａｌｙＬｉｃａｌ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ）１１９　、１４２−１４７（１９８２）に記載
の方法と比べ本発明の方法は発色時間が短縮され、スポ
ットは鮮明で感度は１０倍以上上昇した。また、その結
果、パーオキシグーゼ標識体の量を低減する事ができコ
スト的にも有利である。 本発明において、対象とする特定成分は、その特定成分
に特異的に結合する特異結合物質が得られる物質又は物
質群である。 たとえば蛋白質、核酸、ホルモン、脂質、複合糖質、糖
脂質、多糖類、酵素、ビタミン、抗原、抗体等が挙げら
れる。 また本発明に使用し得る特異結合物質は、特定成分又は
池の特異結合物質と特異的に結合できる物質であり、特
定成分に応じて適当に選ぶ事ができる。たとえば、蛋白
質、核酸、ホルモン、脂質、複合糖質、糖脂質、多糖類
、酵素、ビタミン、抗原、抗体、レクチン、プロティン
Ａ１アビジン、ビオチン、レセプター、補酵素、酵素の
基質、毒素、補体及びこれらの複合体等が挙げられる。 本発明に使用し得る支持体としては、セルロースアセテ
ート、ニトロセルロース等の膜、ポリアクリルアミド等
のデル状支持体、ＴＬＣプレート等のシリカゾル担体、
プレート状、ビーズ状のプラスチック、ガラス、金属、
繊維等が挙げられる。 また組織化学染色においては、ｍ織そのものも支持体と
して使用できる。 本発明において使用し得る芳香族第一級アミン化合物と
しては、〇−又はｐ−７ミノフ工ノール系化合物及び〇
−又はｌ）−フェニレンジアミン系化合物及びそれらの
塩が挙げられる。 好ましくは９−フェニレンジアミン系化合物であり下記
一般式ＣＩ）で示されるものである。 一般式（１） 式中、Ａ及びＢは水素原子またはアルキル基を表し、Ａ
とＢは窒素原子と共に複素環を形成してもよく、Ｄ、Ｅ
ｌ：、Ｇ及びＪは水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ
基、アミ７基、アルコキシ基、アシルアミド基、アリー
ルスルホンアミド基、アルキルスルホンアミド基または
フルキル基を表わす。 原子数１乃至６のものが好ましく、特に】乃至４のもの
が好ましい。例えばメチル基、エチル基、ブチル基を挙
げることができる。これらのアルキル基は置換基を有し
ていてもよく置換基としては、例えばウレイド基、テト
ラヒドロ７リル基、カルボキシル基、メタンスルホン７
ミド基、スルホ基、メトキシ基、工Ｆキシ基、メトキン
エトキシ基、メトキシエトキシエトキシ基、メトキシテ
トラエトキシ基が挙げられる。 Ｄ、Ｇ及びＪとしては水素原子、アルコキシ基及びアル
キルスルホンアミド基、アリールスルホンアミド基が好
ましく、さらに好ましくは水素原子である。Ｅとしては
水素原子、アルキル基、アシルアミド基が好ましく、よ
り好ましくは炭７＋原子数１〜３のアルキル基特にメチ
ル基である。また、一般式（１）で示される化合物の塩
としてはｐ　−）　／レニンスルホン酸、スルホン酸、
スルフィン酸、硫酸エステル、スルファミン酸、千オ硫
酸Ｓ−エステル、カルボンＩ’１２、ｔＪ１２エステル
、アミを一ンガ噂１Ｉ４５べ続−剪Ｘ祷ｉもず・チー１
噌−Ｉマεや１１７厚ｌしΔ序−塩酸及び硫酸等の有機
酸又は！！俺酸の塩を挙げることができ、特にｐ−）ル
エンスルホン酸塩、塩酸塩及び硫酸塩が好ましい。 以下に本発明に係る芳香族第１級アミン化合物の代表的
具体例を示すが、本発明はこれに限定されるものではな
い。 例示化合物 （１−１）Ｎ、Ｎ−ジエチル−３−メチル−４−アミ／
アニリン （１−２）Ｎ、Ｎ−ジエチル−４−アミフアニリン（１
−３）Ｎ−カルバミドメチル−Ｎ−メチル−４−アミノ
アニリン （１−４）Ｎ−カルバミドメチル−Ｎ−テトラヒドロフ
ルフリル−３−メチル−４−アミノアニリン（１−５）
Ｎ−エチル−Ｎ−力ルボキシメチル−３−メチル−４−
アミ７アニリン （１−６）Ｎ−カルバミドメチル−Ｎ−エチル−３−メ
チル−４−アミノアニリン （１−７）Ｎ−エチル−Ｎ−テトラヒドロフルフリル−
３−メチル−４−７ミノフエノール（１−８）３−７セ
チルアミ／−４−アミ７ノメチルアニリン （１−９）Ｎ−エチル−Ｎ−βメタンスルホンアミドエ
チル−４−７ミノアニリン （１−１０）Ｎ−エチル−Ｎ−β−メタンスルホンアミ
ドエチル−３−メチル−４−７ミノアニリン（１−１１
）Ｎ−メチル−Ｎ−βスルホエチル−ｐ−７二二レンジ
アミン （１−１２）Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチル−３−
メチル−４−アミ／アニリン （１−１３）Ｎ−エチル−Ｎ−（２−（２−メトキシエ
トキシ）エチルツー３−メチル−４−アミノアニリン （１−１４）Ｎ−エチル−Ｎ−（２−（２−（２−メト
キシエトキシ）工）４シ〕エチル）−３−メチル−４−
アミノアニリン （１−１５）Ｎ−エチル−Ｎ−（２−（２−Ｃ２−［２
−（２−メトキシエトキシエトキシ）エトキシ〕エトキ
シ〕エトキシ）エチルクー３−メチル−４−アミ／アニ
リン （１−１６）Ｎ、Ｎ−ジエチル−３−メタンスルホンア
ミドエチル−４−アミノ７ニリン。 一般式（１）で示される化合物の塩は、一般的に水溶性
であり、水もしくは緩衝液中に容易に溶解する事ができ
る。 本発明において使用し得る活性メチレン化合物は、芳香
族第１級アミン化合物の酸化体と力・ノブリングして色
素を生成する化合物であり、該生成色素の水に対する溶
解性を減するため、適当な置換基を置換した活性メチレ
ン化合物である。 このような活性メチレン化合物については、７〜ロデン
化銀カラー写真ｉこおいて、イエローカブラ、マゼンタ
カブラとしてよく知られている。また活性メチレンの２
つの水素原子のうち、１つが、芳香族第一級アミン化合
物の酸化体との力・／プリ２フ反応ｌ二よって脱離する
基によって置換されている場合も含まれる。これらの化
合物については、Ｔ、１１．ノエムス（Ｔ、ｔｌ、Ｊａ
＋ｎｅｓ）若「ザ・セオリ・オブ・ザ・７オトグラフイ
ツク・プロセスＪ　（Ｔ　Ｉ＋　ｅ　Ｔ　ｈ　ｅ　ｏ　
ｒ　ｙ及び（第４版）第１２章に記載されている。 マゼンタカブラとしては、５−ピラゾロン誘導体、ピラ
ゾロ［２，３−ａｌｌベンライミグゾール導体、ピラゾ
ロ−（３，Ｌｃ）−５−）リアゾール誘導体、シアノア
セチル置換複素環式化合物（シアノアセチル、クロマン
、−チオフェン、−キ７リン誘導体）、イングゾロン誘
導体が好ましい例としてあげられる。 イエローカブラとしては、アシルアセトニトリル誘導体
、アシルアセトアミド透導体、１．３ジケトン誘導体が
あげられる。 以下に本発明の活性メチレン化合物の代表的具体例を示
すが、本発明に用いられる化合物はこれに限定されるも
のではない。 例示化合物 Ｍ−３ 〜１−５ ｔ） Ｖσ Ｙ−８ ｒρ 支持体に担持された特定成分とバーオキシグーゼ標識体
との複合結合体上に色素を生成沈着せＩ７めるには発色
用基質試液中に支持体を浸漬させれば良い０発色用基質
試験液は、適当なｐＨの緩衝液中に過酸化水素、芳香族
第一級アミン化合物及び活性メチレン化合物を溶解し、
調製される。活性メチレン化合物は、少量の親水性の有
機溶剤たとえばメタノール、エタノール、ＤＭＦ等に溶
解して加えても良い。芳香族第一級アミン化合物と活性
メチレン化合物とのモル比は１対１００がら１００対１
が適当であり、１討１０から１ＯＮ１が好ましい。 酵素反応により支持体上に色素が充分生、戎沈着した後
、未反応物質を洗い流し、反応を停止する。 生成色素についての情報は、目視にて、もしくは技術的
に公知な方法たとえば分光光度計を用いて読み取る事が
できる。

【実施例】

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発
明はその実施例によりその範囲を限定されるものではな
い。 実施例１ ：ニトロセルロース膜上での抗原の測定：純水にて洗浄
後、風乾したニトロセルロース膜（バイオラッド社製；
厚み０．４５μｌ）に、燐酸級ＩＨｔ（以下ＰＢＳと称
す）にて段階希釈したヤギ１８Ｇの１μｌをスポットし
た。 風乾後１９６牛血清アルブミン（ＢＳ＾）−ＰＢＳ溶液
により４°Ｃにて一晩ブロッキングを行い、次いでバー
オキシグーゼ標識つサギ抗ヤギＩｇＣ抗体（カッペル社
製；１タロＢＳ八−ｐｅｓｓ液によＩ）　１５００倍希
釈したもの）と４°Ｃ２時間反応させた。０，０５％Ｔ
ｖｇｅｅｎ−２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノ
ラウレート；和光純薬社製）−ＰＢＳ溶液にて５回洗浄
し発色用基質試液中に浸漬した。　発色用基質試液は次
の３１１を用い、比較した。 （１）　　：　３ｘｇの１−４−クロロ−１−す７トー
ルを１ｘｌのメタノールに溶解し、５１１の０．０５８
）　Ｕス塩酸緩衝ｇ（ｐＨ７，４，２００ｚＭ　ＮａＣ
Ｎ含有；以下ＴＢＳと称す）を加乏る。 （２）：　３ｉＩ？の例示化合物Ｍ−１をＩＲｌのメタ
ノールに溶解し、５ｘｌのＴＢＳを加え、ｌｚｇのトエ
チルートβ−メタンスルホンアミドエチル−３−メチル
・４−７ミノアニリン３／２硫酸１水塩を加え、さらに
３％過酸化水素水２０μ！を加える。 （３）：　（２）のｘｉ中、トエチルーＮ−β−メタン
スルホンアミドエチル−３−メチル−４−アミ７アニリ
ン３／２硫酸１水塩の代わりにＮ、Ｎ−ジエチル−３−
メチル−４−７ミノアニリン塩酸塩を加えた９１５分間
反応後、充分水洗し、風乾した。発色用基質試液（１）
を用いた場合、スポットは仄紫色であり１０１１ｇのヤ
ギＩｇＧＬか検出できなかったが発色用基質試液（２）
及び（３）を用いた場合ｉｎ３のヤギＩｇＧのスポット
が検出可能であった。 実施例（２） ：　ＴＬＣプレート上での糖脂質抗原の測定：ＴＬＣプ
レート（ポリグラム、マチエリ−・ナーデル社製）上に
牛脳より分離精製したＣＭ、、７７ングリオシドを１を
変化させクロロホルム、メタノール）ｄへ循ｌ＋遼侮１
２＋９キー、［ｉン◆李負　ｈ閂−↓）１−糾ノタノー
ル対０．５％塩化カルシウム水溶液（５５対４５討１０
　Ｖ／Ｖ）の展開液にて展開した。風乾後１％ポリビニ
ルピロリドン、１％オパルプミンーＰＢＳ溶液にて４℃
、−晩ブロッキングし、ワサギにて作製した抗ＧＭ、、
ｙングリオシド抗血ｔｉ（１％ポリビニルピロリドン、
１％オバルブミンーＰ［ｌＳ溶液にて５００倍希釈）と
３７で２１Ｌｊ間反応させた。 ０．０５％Ｔｍｅｅｎ　−２０−ＰＢＳ溶液にて３回洗
浄後パーオキシグーゼ＋２識ヤギ抗マウスイムノグロブ
リン抗体（カッペル社製：３％ポリビニルピロリドン−
ＰＢＳ溶液にて１５００倍希釈）と３７℃、２Ｂ３間反
応させた。 ０．０５％Ｔｗｅｅｎ　−２０−ＰＢＳ溶液にて３回洗
浄後発色用基質試液中に浸漬した。発色用基質試液は次
の３！１を用い、比較した。 （１）：実施例１の（１）と同様 （２）：　３Ｂの例示化合物Ｍ−２を１ｘｌのメタノー
ルに溶解し、５ｉｌのＴＢＳを加え、１ｉｇのＮ−エチ
ル−Ｎ−ヒドロキシエチル−３−メチル−４−アミノア
ニリン硫酸１水塩を加え、さらに３％過酸化水素水２０
μｌを加える。 （３）　：　（２）の試液中、例示化合物ト１の代わり
に例示化合物Ｙ−２を用いた。１５分間反応後充分水洗
し、風乾した。 （１）の発色用基質試液を用いた場合、スポットは灰紫
色であり、４ｎ９のＣＬｗングリオシドしか検出できな
かったが、本発明の（２）及び（３）の試液を用いた場
合、０．２ｎｇまでのスポットが検出可能であった。 実施例３ ：抗体及びハイブリドーマのスクリーニング：αビアフ
チトリプシン５０μ９を７０インドの完全アジュバント
と共にＢａｆｂ／Ｃマウス（＃ｉ、６週齢）の腹腔内に
注射した。３週間後、さらにａ、−アンチトリプシン５
０μｓを７０インドの不完全アジュバントと共に腹腔内
に注射し、さらに２週間後Ｑビアンチトリブトン３０μ
ｓをＰＢＳＩ：ｉ−８解し、Ｄ　ｂｉ注射した。 最終免疫の３日後胛ｇｉ１１ＩＪ胞を取り出し、宗法に
Ｃｔい、マフスミエローマ細胞Ｘ　６３．６．５．３と
融合した。９６穴プレ一ト５枚に分配し１１＾Ｔ選択培
地にて培養した。 融合の３週間後ハイブリドーマのフロニが生成したウェ
ルについて、抗体の測定を以下の方法にて行りた。 ニトロセルロースを４ｚｚ角の正方形に切断し、おのお
のにαビアンチトリブシン５００μｇ／ｘｌｌＰＢｓ溶
液１μｌをスポットした。９６穴マイクロタイタープレ
ート１穴当り１枚ずつ加え、１％ＢＳ＾−ＰＢＳ溶液に
て４℃、１晩ブロツキングした。ＰＢＳにて洗浄後、ハ
イブリドーマの培養上清４０μ２を加え、室温にて２時
間反応させた。Ｏ，ＯＳ％ＴＩＩＩｅｅｎ　−２０−Ｐ
ＢＳ溶液にて３回洗浄した後、パーオキシダーゼ標識ヤ
ギ抗マウスイム／グロブリン抗体（カッペル社製；１％
ＢＳ八−ＰへＳ溶液にて１５００倍希釈したもの）を４
０μ！加え、室温にて２時間反応させた。０，０５％Ｔ
ｗｅｅｍ　−２０−Ｐｕｓ溶液にて３回洗浄後、発色用
基質試液１５０μｒを加え、ニトロセルロース上に色素
が生成したものを抗体活性陽性とした。 発色用基質試液として （１）：　実施例１の（１）と同様 （２）　：　３ｍｇの例示化合物Ｙ−２を１１１のメタ
ノールに溶解し、５１１のＴＢＳを加乏５１１ｇのＮ、
Ｎ−ンエチ３％過酸化水素水２０μｌを加えた。 １５穴しか抗体活性陽性ハイブリドーマが検出できなか
ったが本発明の（２）の試液を用いた場合２３穴に抗体
活性陽性ハイブリドーマが検出できた。 出願人　　　小西六写真工業株式会社

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）測定対象の特定成分と、パーオキシダーゼを標識
   として有している標識体とから成る複合結合体を支持体
   上に担持せしめ、該複合結合体上にパーオキシダーゼの
   酵素反応によって色素を形成、沈着せしめる特定成分の
   測定方法において、該酵素反応の基質として過酸化水素
   、芳香族第一級アミン化合物及び活性メチレン化合物の
   三者を用いることを特徴とする特定成分の測定方法。
2. （２）前記特定成分を支持体上に直接もしくは間接的に
   担持せしめた後、前記標識体を反応させ、複合結合体を
   形成せしめることを特徴とする特許請求の範囲第１項記
   載の特定成分の測定方法。
3. （３）前記複合結合体を形成せしめた後に、該複合結合
   体を支持体上に直接もしくは間接的に担持せしめること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の特定成分の測
   定方法。