JPS59126245A - 過酸化水素の定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ペルオキシダーゼが触媒し、あるいは関与す
る新規な過酸化水素定量用試薬および過酸化水素の定量
法に関する。

近年、臨床検査における酵素学的分析方法は、その特異
性が高く評価され、急速に普及しつつある。それらのう
ち、尿および体液中のグルコース、尿酸、コレステロー
ル、トリグリセリド、乳酸、クレアチニン、遊離脂肪酸
、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ、グルタ
ミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ、コリンエステ
ラーゼ、クレアチンホスホキナーゼ、乳酸脱水素酵素な
どを測定する方法としてそれぞれの系における最終的に
定量すべき物質の酸化酵素を作用させて生成した過酸化
水素を定量することにより、目的物を定量する方法がし
ばしば用いられている。

従来からの過酸化水素の定量法としては、ペルオキシダ
ーゼの存在下に、ｏ−トリジン、コ、７−ジアミツフル
オレン、Ｎ、Ｎ−ジメチル−ｐ−フ二二レンジアミン、
０−ジアニシジン、Ｏ−”ｙミノフェノール、トリアリ
ールイミダゾール等の色原体を酸化型の発色体に変化さ
せて比色定量する方法、≠−アミノアンチピリンとフェ
ノール又ジアルキルトルイジンとの組合せ、３−メチル
ーーーペンゾチアゾリノンヒドラゾンとＯ−）リジン又
はＮ、Ｎ−ジメチルアニリンあるいはＮ、Ｎ−ジエチル
アニリンとの組合せ、あるいは二量体を形成する≠−メ
トキシー／−ナフトール及びその誘導体等の色原体を酸
化縮合させて発色体として比色定量する方法等が知られ
ている。

これらの化合物では、１モルの発色体（色素）を形成す
るためにコモルの過酸化水素を必要とするため、微量成
分の定量にとって、非常に不利な方法である。このため
、１モルの色素を形成するために、１モルだけの過酸化
水素で十分な過酸化水素定量用試薬が望まれている。

したがって、本発明の目的は、１モルの過酸化水素で１
モルの色素を形成しうる、高感化された過酸化水素定量
用試薬及び定量方法と提供することである。

本発明者は、以上の点を考慮し、ペルオキシダーゼが触
媒し、あるいは関与する微量の過酸化水素の定量用発色
試薬につき鋭意研究を重ねだ結果下記の一般式（Ｉ）で
表わされる化合物と一般式（■）で表わされる化合物と
を組合せて用いることによって、前記の目的が効果的に
達成しうろことを猪い出した。

一般式（１） （式中、Ｒはハロゲン原子、Ｏ−Ｒ（Ｒはアルキル基ま
たはフェニル基を表わす。）、Ｓ−Ｒ’（Ｒ’はアルキ
ル基、ベンジル基またはフェニル基を表わす）または けメチン鎖を表わす）を表わす。Ｒ２はアルキル基、ア
シル基、アルコキシカルボ゛ニル基寸たはアリール基を
表わす。Ａｒは、フェニル基を表わす。） ７ （式中、Ｒ５及びＲ６はアルキル基を表わし、Ｒ５とＲ
６は同じでも異なってもよく、またＲ５とＲ６は互いに
連なって環を形成してもよい。Ｒ７及Ｒ８は、水素原子
、アルキル基、ハロゲン原子、カルボ゛キシル基、カル
／（モイル基、スルホ基またはスルホンアミド基を表わ
す。） 一般式（Ｉ）のＲ１のノ・ロゲン原子としては、例えば
塩素原子、臭素原子などがある。

一般式（■）のＲ３のアルキル基またはフェニル基は、
アルコキシ基、ヒドロキシル基、ノ飄ロゲン原子によっ
て置換されていてもよい。また、アルキル基としては、
炭素数≠以下の直鎖又は分枝のものが好ましく、フェニ
ル基としては、炭素数ｇ以下のものが好ましい。具体的
には、メチル基、エチル基、メトキシエチル基、アニシ
ル基、フェニル基、クロロフェニル基、β−ヒト９０キ
シエチル基などを猛げることができる。

一般式（Ｉ）のＲ４のアルキル またはフェニル基は、アルコキシ基、カルボキシ基など
によって置換されていてもよい。

捷た、アルキル基としては、炭素数≠以下の直鎖又は分
枝のものが好ましく、ベンジル基またはフェニル基とし
ては炭素数ざ以下のものが好ましい。具体的には、メチ
ル基、エチル基、β−ヒドロキシエチル基、ベンジル基
、オルトカルボキシフェニル基、メタカルボキシフェニ
ル７Ｓ’、７′！ラカルボキシフエニル基などを拳げる
ことができる。

一般式（Ｉ）の （炭素ａ６以下の置換基を有してもよい）としては、具
体的には／−イミダゾリル基、／−ビラン。

ジル基々どを挙げることができる。

一般式（１）のＲ　のアルキル基、アシル基、アリール
基は、アルコキシ基、スルホン酸基、カルボン酸基、ノ
・ロゲン原子によって置換されていてもよい。アルキル
基としては、炭素数ｇ以下のものが好ましく、炭素数≠
以下のものがより好ましい。アルコキシカルボ゛ニル基
としては、炭素数≠以下のものが好ましい。アリール基
としては、炭素数ｒ以下のものが好ましく、また、アシ
ル基としては、炭素数り以下のものが好ましく、炭素数
≠以下のものがより好ましい。アルキル基、アシル基、
アリール基の炭素数が５以上のときは、スルホン酸基ま
だはカルボン酸基を７個またはコ個有することが好せし
い。

Ｒ２の具体例としては、メチル基、エチル基、メトキシ
メチル基、スルホメチル基、エトキシエチル基、アセチ
ル基、プロピオニル基、メタカルボキシフェニル基、３
，！ージカルボ゛キシフェニル基、フェニル基、トリル
基などを挙げることができる。

ｆｔ’Ｚ式（　Ｉ　）のＡｒのフェニル基は、・・ロゲ
ン原子（例えば塩素原子など）、カルボ゛キシル基、ス
ルホン酸基、アルキル基（好ましくは、炭素数ｊ以下）
、などによって、７個ないし３個置換されていてもよい
。このアルキル基は更にアルコキシ、９ｅ　、ヒドロキ
シル基などによって置換されていてもよい。

Ａｒの具体例としては、！，４ｔ，Ｊートリクロロフェ
ニル基、パラカルボキシフェニル基、’　７スルホフエ
ニル基などを挙げることができる。

本発明の過酸化水素定量法は、ペルオキシダーゼを用い
るため、発色反応を均一な水溶液中才たは水溶液を含む
親水性高分子媒質中で行なうことが好ましい。したがっ
て本発明において用いられる一般式（Ｉ）の化合物は水
溶性であることが望凍しい。すなわち、水溶性の点で好
ましい化合物は一般式（１）においてＲ１　、　Ｒ２，
またはＡｒで表わされる置換基の少なくとも７個がスル
ホン酸基またはカルボ゛キシル基を有するものである。

本発明において用いられる一般式（ＩＴ）で表わされる
フェニレンジアミン誘導体とは、ペルオキシダーゼの存
在下に過酸化水素を作用させることによって酸化され得
る性質を有している。

一般式（■）のＲ　５及びＲ６のアルキル基は、アルコ
キシ基、ノ１０ゲン原子、シアノ基、ヒドロキシル基、
スルホンアミド基、スルファモイル基などによって置換
されていてもよい。また、アルキル基としては、炭素数
ｊ以下の直鎖状捷たは分枝状のものが好ましい。ここで
、スルホ基あるいはカルボ゛キシル基は、ナトリウム塩
、カリウム塩またはアンモニウム塩を形成してもよい。

Ｒ５及びＲ６によって形成される環としては、ピロリジ
ン環、ピはリジン環、モルホリン環などを挙げることが
できる。これらの環は、アルキル基、アルコキシ基、ス
ルホンアミド基、ヒドロキシル基、スルファモイル基、
カルボンアミド基、カルバモイル基、スルホ基、カルボ
キシル基などによって置換されていてもよい。これらの
置換基は炭岩数ｊ以下であることが好ましく、これらの
置換基は、更にアルコキシ基、ハロゲン原子、シアツノ
、（ベスルホ基、カルボキシル基などによって置換され
てもよい。

Ｒ５またはＲ６の具体例としては、メチル基、エチル−
７メ２、プロピル基、ヒドロキシエチル基、カルボキシ
プロピル基、スルホエチル基、メトキシメチル基、など
を挙げることができる。

Ｒ５とＲによって形成される環上に置換される基として
は、メチル基、エチル基、プロピル基、ヒドロキシエチ
ル基、カルボキシプロピル基、スルホプロピル基、メト
キシエチル基、などを挙げることができる。

一般式（Ｉｎ）のＲ７とＲ８で示されるアルキル基、カ
ルバモイル基、スルホンアミド基は１．アルコキシ基、
ヒドロキシ基、ハロゲン原子、シアノ基などによって置
換されてもよい。Ｒ又はＲ８によって表わされる置換基
は、炭素数ｊ以下のものであることが好ましい。

Ｒ７またはＲの具体例としては、水素原子、−ブチル基
、メトキシエチル基、ヒドロキシエチル基、クロルエチ
ル基、Ｎ、Ｎ−ジメチルカルバモイル基、Ｎ、Ｎ−ジメ
チルスルホンアミド基すどを挙げることができる。

一般式（ＩＩ　’）で表わされるフェニレンジアミン誘
導体は、はルオキシダーゼの存在下に過酸化水素を作用
させることによって酸化され、一般式（Ｉ）で表わされ
る化合物とカップリングして色素を形成する性質を有す
るが、これらの化合物のうち空気中あるいは溶液中の酸
素の作用によっては酸化されにくいものが低いブランク
値を示すので好ましい。このような化合物としては、ｐ
Ｈ３ないしりの範囲内の少なくとも７点で飽和カロメル
電極に対して十〇、、２Ｖ以上の酸化電位を示すものが
好ましい。

酸化還元電位は、ｐＨ７のＢｒ１ｔｔｏｎ−Ｒｏｂｂｉ
ｎｓｏｎ緩衝液中で、飽和カロメル電極を対照電極とし
て、回転白金電極（７ｔＯｒｐｍ）を用いて容易に測定
することができる。試料の濃度としては例えば約ｔＸ／
　ｏ’ｍｏｔ／ｌ　　で行なう。

なお酸化還元電位の測定法についてはたとえば日本化学
会編、実験化学講座　第１！巻「分析化学・上」、３２
り頁、同第１巻「基礎技術、１下」、３夕ｌＩ−頁、昭
和３．２年　丸竹発行に記載された方法を用いることが
できる。また白金電極についてはたとえげ上記実験化学
講序、第１ｊ巻、「分析化学・上」１．２ｒ！頁に、回
転電極については、たとえばコルトフ著　藤原鎮男監駅
　分析化学■「容量分析および電気分析」／／り７頁、
昭和５０年　床用書店発行に記載された方法を用いるこ
とができる。

一般式（ＩＩ）にて表わされる化合物は構造的には、以
下の（’（）ないしくニ）の条件の少なくとも７つを満
たすものであることが好−ましい。

（イ）　Ｒ”Ｊ？よびＲ６がピロリジン環、ピはリジン
環、モルホリン環、またはこれらの環上に置換基を有す
る環を形成していること。

（ロ）Ｒ７またはＲ８の少なくとも一方が電子吸引基（
ハメットのシグマ定数が正）であること。

（ハ）Ｒ５４たはＲ６の少々くとも一方７５ヨ、２級ま
たは３級の炭素原子を介してフェニレンジアミンの窒素
原子に結合していること。

に）水素原子でないＲ７お工びＲ８７５ｔともに、無置
換のアミン基に関してメタ位にあること。

一般式（ＩＩ）で表わされる化合？吻は必要に広；じて
塩酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩、あるいはシュウ酸塩ガど
の有機酸塩として用いてもさしつめ・えない。

次に一般式（Ｉ）で表わされるイし金物のうち好ましい
ものの具体例を示すが、本発明の範囲はこれらの化合物
のみに限定されるものではない。

化合物５゜ 化合物７゜ 化合物８ 化合物１０ 化合物１１、 化合物１７− 化合物１＆ 化合物１４゜ ＳＯ３Ｎａ 化合物１７゜ 化合物１９゜ 化合物２０゜ 化合物２１゜ 一般式（Ｉ）で表わされる化合物は、写真化学における
２当量カプラーとして公知の化合物の合成法に準じて容
易に合成できる。この写真化学における。２尚量カプラ
ーの合成法としては、米国特許Ｊ、　、２２７．ｊｊｌ
ｔ号、３，７０／、７１３号、３、り３３．ｊ００号、
特開昭ｔｏ−ｉ３ｏ４ｔｉ号、同ｊ／−２０１，２を号
、同！／−３０２２１号、同Ｊ−／−、１ｔＷｊＩｒ号
、同！２−ｊｌり、２２号、同６３−／２３／、２り号
、同５ｔｉ−−ｇ０７≠≠号、同！ｊ−２ＪＯ！に号、
同夕ｊ−λりｔｒ。

！号、同ｊｊ−Ｌ日！≠号、同ｊＡ−／２ぶｒ３３号、
同ｊ７−≠０４ｔ≠号、同ｊ７−／７り５０号、特公昭
！／−１０１００号、同！３−３≠０≠弘号、Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ　Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ　／７り３１（／り７
り年３月）などに記載されている。

次に一般式（Ｉ）で示される化合物のうち代表的なもの
について合成法を例示する。なお以下に具体的に示され
ていない化合物も以下の合成例に準じて容易に行なうこ
とかできる。

合成例１：化合物！の合成 ３−（Ｊ、タージカルボ゛キシフェニルアミノ）−／−
（，２，≠、６−ドリクロロンエニル）−λ−ピラゾリ
ンー！−オン／２、炭酸カリウムｔ≠Ｏｍ９、エタノー
ル、２（’　ｔｒ＋ｂ−、および水！罰よりなろ１８、
オヵ、ヤニ流ケイっっ、。￥８−￥７ａｌ　　Ｋ工゛・
・１．２３　ｊ　’ｌ”ｊ〜ハ―頁（／り７０年発行）
に記載されているフ５７−１にｑｊｆ５つて合成しまた
５−（−２−ヒ１０千ンエｆ−ルチ：、り一イソチオ尿
素６００ｍ９と／、Ｏｍｌのエタノールとからなる。′
８液を３分間にわたって滴下した。（’、１．きつづき
、２０分間加熱還流を続けた後、氷令しコへ４塩酸を加
えて中オロした。この反応液を酢酸エチルで抽出し、抽
出液を水でλ回洗浄シフ／コ後無水硫酸マグネシウムで
乾燥した。

酢酸エチルを留去した後−＼キｙ−ンを加えて結晶化さ
せた。この結晶をエタノールに溶解した後、水を加えて
結晶を析出させた。

収＠−、０．Ｉｙ、礪点　／り／　Ｏｃ（分Ｍ）合成例
２：化合物２の合成 ３−（３，Ｓ−ジカルボキシフェニルアミノ）−／−（
２，！Ｌｔ、乙−トソートリクロロフェニルーピラゾリ
ンーｊ−オンコ１、炭酸カリウム八３巻、２３！頁〜２
≠λ頁（／７７０年発行）に記載されている方法に従っ
て合成したＳ−ベンジルチオイソチオ尿素／、／？と２
０属のエタノールとからなる溶液を７分Ｆ→１にわたっ
て滴下した。ひきつづき７５分間加熱還流を続けた後、
氷令し、２Ｍ塩酸を加えて中和し７た。この反応液を酢
酸エチルで抽出し、抽出液を水で２回洗浄した後、無水
硫酸マグネシウムで乾燥した。酢酸エチルを留去した後
、残渣をエタノール／ｊｍｌと水−２０ｍｌとの混和物
に加熱溶解した後、攪拌しつつ室温まで徐々に冷却した
。生じた結晶にエタノール１５ｍ１！と水／ｊｍｌとを
加えて加熱溶解した後、攪拌しつつ室温まで徐々に冷却
し、生じた結晶をｆ取し乾燥した。

収量　２．０？、融点　、ｚ４Ｌ＋ｒ０Ｃ（分解）次に
一般式（、ＩＩ）で表わされる化合物の好ましい例を挙
げるが、本発明の範囲はこれのみに限定されるものでは
ない。

化合物例Ｊｒ−１ １［−２ ［−３ ■−４ １１’−５ ］Ｉ−６ α ［−６ α １［−７ α Ｔｌ−８ ■−９ α ■−１０ ■−１１ ■−１２ α ■−１８ α ■−１４ ■−１５ ■−１６ α ■−１７ α ■−１８ ＣＯＮＴ（２ ■−１９ Ｈ３ ］１．−２０ Ｈ３ ■−２０ Ｈ３ ■−２１ ■−２２ α 一般式′（■）で示される化合物の合成は、一般式（Ｔ
ＪＩ）で表わされる化合物と二級アミンとを反応させた
後、ニトロ基を還元するという通常の方法（方法工）に
よって合成できる。あるいは一般式（］Ｖ）で表わされ
る化合物のアミノ基を常法によりアルキル化した後、ニ
トロ化、ニトロソ化、ジアゾカップリングにひきつづき
還元するという通常の方法（方法■）によりアミン基を
導入することによっても合成することができる。

方法■ 一般式（ＩＩＩ） 同義。

７７ − ］ ７ 一般式（ＩＩ） 次に一般式（ＩＩ）で示される化合物の合成例を示すが
、以下に具体的に示されていない化合物も以下の合成例
に準じて容易に行なうことができる。

合成例３：化合物■−／の合成 （１）Ｎ−（≠−二トロフェニル）モルホリンの合成 ｐ−クロロニトロベンゼン１０１にモルホリン２！ゴを
加え油浴上で７時間加熱還流した。室温まで冷却した後
、生じた同体をＪ′ｏｍｌの水に分散させて洗いＰ取し
た。得られた黄色針状結晶をメタノール１０ｏｍｌとエ
タノール３ｏｏｒｎｌとの混合液から再結晶した。

収量　ｉｉ、　９ｙ、融点　１ｒｏ−ｉｓｉ、　ｊ’ｃ
（２）化合物■−／の合成 ＜１１ｆｉ＆Ｎ−（＋−二トロフェニル）モルホリン／
　Ｏｒ、鉄粉／３？、塩化アンモニウム３？、イソプロ
パツール７ｏｒｒｒｌ、および水／ｌＡｍ１よりなる混
合物を７時間にわたシ加熱還流した。反応液が熱いうち
に不溶物をｒ去し、Ｆ液を氷水で冷却した。生じた結晶
をＦ取し、減圧下に乾燥した。

収量　、ｔ、ｏｙ、融点　／λ７−／、２り０Ｃ本発明
の方法に用いられるはルオキシダーゼは過酸化水素によ
る水素供与体の酸化反応の触媒であり、如何なる起源の
はルオキシダーゼでも使用可能である。

本発明の方法において、定量用試薬の各有効成分をそれ
ぞれ別個に粉末状固体として、又は水もしくは緩衝液中
の溶液として調製し、使用時すなわち定量する際にこれ
らの形の各成分を任意に組合わせるか、あるいは粉末状
成分の混合物又は各成分を含有する水もしくは綾瀬液中
の溶液として調整することができる。最後の場合には各
成分を同時に又は任意の順序で溶解してもよい。

本発明の方法において、定量用試薬と過酸化水素との反
応（発色反応）は例えば次式により示される。

この反応により色素（ｄｙｅＡ）が生成する。そして／
４Ｔ：ｈｊ、シ／こ色素の吸光度の測定よりあらかじめ
作成した検量線に基づいて追酸化水素の定量を行なうこ
とができる。

本発明の方法にて用いられる定量用試薬−では、１モル
のＨ２０２７１・ら１モルの色素が生成するので任意の
Ｈ２Ｏ２濃度を有する試料からＨ２Ｏ２を高感度で定量
することができるようになった。

本発明の定量法は、例えば次のように実施することがで
きる。試料に一般式に■）で示される化合物、一般式（
ｎ）で示される化合物および反応触媒としてのペルオキ
シダーゼを前記の形で同時にあるいは任意の順序で添加
し、混合物を５〜弘ＯｏＣの温度及び３．０−タ、０の
ｐＨにおいて、好ましくは／〜１０分間反応させ、生成
した色素を含有する反応混合物の吸光度を測定する。

本方法は過酸化水素の微量定量に特に有利である。

試料中のＨ２０２濃罠は一般に０．０２〜７００μ９／
−（総反応容量系）であることが好ましい。このＨ２Ｏ
２濃度において一般式（Ｉ）で表わされる化合物は０　
、ｊ　Ｏ〜／　０　μｍ　ｏ　ｌ　／ｍｌ、一般式（ｎ
）で表わされる化合物は０．０／〜／μｍｏｌ／７、ペ
ルオキシダーゼはｏ、ｉ〜１０単位／単位−ずれも総反
応８量系）の量で用いられることが好ましい。

本発明の方法においては、定量試薬として一般式（Ｉ）
で示される化合物、一般式（ＩＩ）で示される化合物お
よびペルオキシダーゼのほかに、さらに酸化酵素を組合
わせることによってよシ広範囲の測定が可能となる。す
なわち、酸化酵素を最終的に定量丁べき物質が酸化酵素
の作用により過酸化水素を生成する場合に併用すること
によって、過酸化水素の定量によって目的とする種々の
物質の定量が可能になる。具体的には、尿および体液成
分ニハ、クルコース、尿酸、コレステロール、トリグリ
セリド、乳酸、クレアチニン、遊離脂肪酸、グルタミン
酸ピルビン酸トランスアミナーゼ、グルタミン酸オキザ
ロ酢酸トランスアミナーゼ、コリンエステラーゼ、クレ
アチンホスホキナーゼ、乳酸脱水素酵素などを測定する
ことができる。

こり、らの測定に用いる酸化面光としては、グルコース
オキンダーセ、ウリカーゼコレ２チロールオキシダーゼ
、Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ、ピルビン酸オ
キシダーゼなどが挙げられる。

これらの酸化酵素はい力）なる起源のものでもよく固体
粉末の形で用いてもよいが、好ましくは水もしくは！ｔ
ゲに緩衝液中の溶液として用いらλ′しる。

酸化酵素を併用する場合には、酸化酵素の作用により、
Ｈ２Ｃンをあらかじめ生成させてもよいが、ｉ（２０２
生成反応と発色反応を同時に４１させることが好ましい
。この場合も酸化酵素を試料に添加する時期は任意であ
ってよく、一般式（Ｉ３の化合物、一般式（ｎ）の化合
物又はペルオキシダーゼと同時に又は囲者を同時に雄刃
ＩＪしてもよい。

酸化酵素の使用量はその種類、目的とする基質または混
在物質などに応じて適亘足められる。

本発明は、通常の化学実験における過酸化水素の定量に
好適でろるば〃）シでなく、近年急速に普及しつつある
酵素学的分析方法を用いた臨床検査のうち、尿および体
液中のグルコース、尿酸、コレステロール、トリグリセ
リド、乳酸、クレアチニン、遊離脂肪酸、グルタミン酸
ピルビン酸トランスアミナーゼ、グルタミン酸オキザロ
酢酸トランスアミナーゼ、コリンエステラーゼ、クレア
チンホスホキナーゼ、乳酸脱水素酵素などを測定する方
法として、それぞれの系における最終的に足丘すべき物
質の酸化酵素を作用させて生成した過酸化水素を定量す
ることにょシ、目的物を定量する方法にも利用できる。

また、試薬として有効成分（１）、水素供与体およびＨ
２Ｏ２を組合わせれば、ペルオキシダーゼの定量法にも
使用でき、例えばペルオキシダーゼを用いた酵素免疫測
定法に利用できることは明らかである。

さらに本発明は、人はカリでなく種々の動物、例えば、
家格、愛玩動物その他の尿、体液などの測定にも利用で
きることｒよ明らかである。

以下、実施例を挙げ、本発明を更に詳細に説明する。

実施例１．：過酸化水素の定量 発色液の調製：化合物ｌｌ−４／、１ｍ９およびはルオ
キシダーゼ２００単位にｐＨ♂の／／／　Ｊ−モルリン
酸緩衝液！Ｏｍｌを加えて溶解し、これに１４１１ｍ９
の化合物６を含む７Ｍのジメチルホルムアミド溶液を加
えた後、ｐＨの１７７５モル　リン酸緩衝液を加えて全
容をｔｏｏｍｉとした。これを発色液／とする。

比較の目的で以下のようにして発色液λと３とを調製し
た。発色液コは、発色液／の調製において化合物ｌｌ−
４／、１■のかわりに弘−アミノアンチピリン２■、化
合物ｔ　／≠／　ｍ９のかわシＫＮ、Ｎ−ビス（β−ジ
ヒドロキシエチル）メタトルイジン≠り■とじたほかは
全く同様にして調製した。発色液３は発色液ｌの調製に
おいて化合物ｔを／　弘／　ｍ９用いるかわりに化合物
乙のインジルチオ基を水素原子で置換した化合物を／　
／　０ｍ９用いるとしたほかは全く同様にして調製した
。

過酸化水素の定量二発色液！ｍｌを試験管に入れ１分間
３７°Ｃにインキュベートした。次いで濃ず。

度既知の過酸化水素水溶液ｊＯμｔを加えて３７０Ｃに
て７０分間インキュベートした後、ブランク（過酸化水
素水溶液のかわりに蒸留水を加えたもの）を対照として
吸光度を測定した。ただし測定波長は発色液／および３
を用いた場合にはタタコｎｒｎ、発色液コを用いた場合
にはｊ夕ｏｎｒｎであった。

吸光度と過酸化水素濃度との関係は第１図に示すとおり
であった。すなわち本発明の方法すなわち発色液／を用
いた場合の定量感度は、公知の方法すなわち発色液λを
用いた場合の約３倍にも達しており、本発明の方法に従
えば高感度で過酸化水素の定量が可能であることを示し
ている。まだ本発明の方法は発色液３を用いた場合に比
べて約２倍の感度を示しており、一般式（Ｉ）における
Ｒ１の存在が定量感度の倍増に寄与していることを示し
ている。

【図面の簡単な説明】

横軸は過酸化水素水溶液の濃度（ミリモル／１）を示し
、縦軸はブランクを対照とした吸光度を示特許出願人　
富士写真フィルム株式会社手続補正書（ガ（！ ＼ １、事件の表示　　　　昭和！７年特願第１３０り２０
号２、発明の名称　　過酸化水素の定量方法３、補正を
する者 事件どの関係　　　　　　特許出願人 件　所　　神奈川県南足柄市中沼２１０番地４、補正命
令の日付 昭和３７年７月３／日（発送日） ５、補正の対象 明細書の「図面の簡単な説明」の欄 ６、補正の内容 （１）明細書第≠３頁第１り行から第弘≠頁第１行の記
載を次の通り補正する。 「第１図は実施例１に記載の本発明の方法および公知の
方法における過酸化水素水溶液の過酸化水素濃度と発色
濃度（吸光度）との関係を示すグラフである。第１図の
グラフにおいて横＠は過酸化水素水溶液の濃度（ミリモ
ル／ｌ）を、縦軸はブランクを対照とした吸光度（１１
１１足された吸光度値からブランクの吸光度値を差引い
た値）をそれぞれ示す。発色液１は本発明の方法、発色
液２．３は公知の方法によるものである。」以上

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １．４ルオキシダーゼの存在下に、一般式（■）で表わ
   される化合物と一般式（Ｕ）で表わされる化合物とを組
   合せて用いることを特徴とする過酸化水素の定量方法。 一般式（Ｉ） （式中、Ｒ”　ｉｄハロケンｌＪｊ’、子、０−Ｒ３（
   Ｒ”はアルキル基またはフェニル基を表わす。）、Ｓ−
   Ｒ（Ｒはアルキル基、ベンジル基まだはフェニル基を表
   わす）または たはメチン鎖を表わす）を表わす。Ｒ２はアルキル基、
   アシル基、アルコキシカルボ゛ニル基またはアリール基
   を表わす。Ａｒは、フェニル基を表わす。） ７ （式中、Ｒ５及びＲ６はアルキル基を表わし、ＲとＲは
   同じでも異なってもより、マだＲとＲは互いに連なって
   環を形成してもよい。Ｒ及Ｒは、水素原子、アルキル基
   、ハロゲン原子、カルボキシル基、カルバモイル基、ス
   ルホ基まだはスルホンアミド基を表わす。）