JPH0150400B2 - - Google Patents
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Description
本発明は、ペルオキシダーゼが触媒し、或は関
与する新規な過酸化水素定量用試薬および過酸化
水素の定量法に関する。 近年、臨床検査に於ける酵素学的分析方法は、
その特異性が高く評価され、急速に普及しつつあ
る。それらのうち、尿および体液中のグルコー
ス、尿酸、コレステロール、トリグリセリド、乳
酸、クレアチニン、遊離脂肪酸、グルタミン酸ピ
ルビン酸トランスアミナーゼ、グルタミン酸オキ
ザロ酢酸トランスアミナーゼ、コリンエステラー
ゼ、クレアチンホスホキナーゼ、乳酸脱水素酵素
などを測定する方法としてそれぞれの系における
最終的に定量すべき物質の酸化酵素を作用させて
生成した過酸化水素を定量することにより、目的
物を定量する方法がしばしば用いられている。 従来からの過酸化水素の定量法としては、ペル
オキシダーゼの存在下に、ｏ−トリジン、２，７
−ジアミノフルオレン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−
フエニレンジアミン、ｏ−ジアニシジン、ｏ−ア
ミノフエノール、トリアリールイミダゾール等の
色原体を酸化型の発色体に変化させて比色定量す
る方法、４−アミノアンチピリンとフエノール又
はＮ，Ｎ−ジアルキルアニリンあるいはＮ，Ｎ−
ジアルキルトルイジンとの組合せ、３−メチル−
２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンとｏ−トリジ
ン又はＮ，Ｎ−ジメチルアニリンあるいはＮ，Ｎ
−ジエチルアニリンとの組合せ、あるいは二量体
を形成する４−メトキシ−１−ナフトール及びそ
の誘導体等の色原体を酸化縮合させて発色体とし
て比色定量する方法等が知られているが、このよ
うな比色による定量法には、自ずからその定量感
度に限界があり、微量の過酸化水素を定量するこ
とは不可能であつた。 また螢光法による定量法としては、ホモバニリ
ン酸を用いる方法が知られているが、この方法に
よつても微量の過酸化水素を定量することは極め
て困難であつた。このため、感度の高い方法とし
て特開昭54−43791号に見られるようにフルオレ
スシンを用いる方法が発明されているが、このフ
ルオレスシンはハイドロキノンの構造を有してい
るので酸化されやすく安定性に問題がある。この
改良法として特開昭55−48656号にはジアセチル
フルオレンスシンを用いる方法が記載されてい
る。しかし、この化合物を用いる場合の好ましい
PH域は7.5〜9.5であり、グルコースオキシダーゼ
やコレステロールオキシダーゼの至適PHとは離れ
ている。このため、安定かつより広いPH域で定量
可能な試薬が望まれている。 したがつて、本発明の目的は、微量の過酸化水
素を定量しえる過酸化水素定量用試薬及び定量方
法を提供することである。 本発明の他の目的は、広いPH域で定量可能で安
定な過酸化水素定量用試薬及び定量方法を提供す
ることである。 本発明者は、以上の諸点を考慮し、ペルオキシ
ダーゼが触媒し、あるいは関与する微量の過酸化
水素の定量用発螢光試薬につき、鋭意研究を重ね
た結果、活性メチレンまたは活性メチンから水素
原子一個が除去された残基と発螢光部分とからな
ることを特徴とする過酸化水素定量用試薬によつ
て、また、過酸化水素を含有した試料に前記過酸
化水素定量用試薬、水素供与体およびペルオキシ
ダーゼを作用させその結果生じた発螢光物質の螢
光強度を測定することを特徴とする方法によつ
て、前記の目的が効果的に達成しうることを見い
出した。 本発明にて用いられる過酸化水素定量用試薬と
しては、好ましくは下記の一般式（）によつて
示される化合物である。 一般式（） Ｑ−Fl 式中、Ｑは活性メチレン基または活性メチン基
から水素原子を一個除去した残基を有する化合物
部分である。そして、Ｑは、その活性メチレン残
基または活性メチン残基によつてFlと結合してい
る。Flは、Ｑと分離して螢光を発しうる化合物部
分である。 ここで、活性メチレン基または活性メチン基と
は、塩基によつてプロトンを放出しうるメチレン
基またはメチン基のことであり、具体的には、例
えば、メチレン基またはメチン基に直接又は間接
に（例えば共役二重結合を介して）カルボニル
基、シアノ基、ハロゲン原子、スルホン基、スル
ホキシド基、ニトロ基、イミノ基などのような電
子吸引性基を有したものである。 酸化酵素の作用により過酸化水素を生成する物
質を測定する場合には、前記の３種の有効成分に
更に酸化酵素を組合わせて用いることにより、生
成した過酸化水素を定量することができ、さらに
過酸化水素に関して作製した目的物質の検量線又
は計算式を利用して、これを直接に定量すること
ができる。 例えば、体液および尿に含まれる化学物質の定
量の際に、酸化酵素としてウリカーゼ、グルコー
スオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ等
を用いて尿酸、グルコース、コレステロール等の
定量を行なうことができる。 このような化学物質の定量は臨床診断上特に重
要なことである。 次に、本発明の一般式（）の化合物について
詳細に説明する。 一般式（）のＱは、活性メチレン残基または
活性メチン残基を有した化合物部分であるが、好
ましくは水素供与体の酸化体と酸化カツプリング
反応する化合物部分（すなわち、カプラー部分）
である。より好ましくは、写真化学の分野にて用
いられているいわゆる二当量カプラー部分（例え
ば、四当量カプラーの活性メチレン又は活性メチ
ン基から水素原子が脱離したもの）が用いられ
る。 具体的には、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ｐ−フエニ
レンジアミンなどの水素供与体の酸化体とカツプ
リング反応して、イエロー、マゼンタまたはシア
ン色素を形成するカプラー部分（すなわち、イエ
ローカプラー、マゼンタカプラー、シアンカプラ
ー）、いわゆる“直鎖状”の無呈色カプラー部分、
シクロケトンもしくはシクロイミン骨格を有する
無呈色カプラー部分などである。 本発明のカプラー部分Ｑとして用いられるカプ
ラーとしては、次の文献に記載されたものを用い
ることができる。すなわち、“The Theory of
the Photographic Process”4thed.、P.354〜
P.362、Edited by T.H.James（1977年、
Macmillan Publishing Co.、Inc.刊）、英国特許
第1038331号明細書、西独特許第1124356号明細
書、米国特許第3227550号明細書など。 例えば、マゼンタカプラー部分として、とく
に、次の一般式（Ｍ）によつて表わされるものが
有用である。 ただし、式中、R11は第１、第２および第３級
の中から選ばれたアルキル基（例えばメチル基、
エチル基、プロピル基、ｎ−ブチル基、tert−ブ
チル基、ヘキシル基、２−ヒドロキシエチル基、
２−フエニルエチル基など）、アリール基（例え
ば、ナフチル基、フエニル基、２，４，６−トリ
クロロフエニル基、２−クロロ−４，６−ジメチ
ルフエニル基、２，６−ジクロロ−４−メトキシ
フエニル基、４−アルキルアミノフエニル基、４
−トリフルオロメチルフエニル基、３，５−ジブ
ロモフエニル基、４−カルボキシフエニル基、２
−メチルフエニル基、４−スルフアモイルフエニ
ル基、３，５−ジカルボキシフエニル基、４−ス
ルホフエニル基など）、複素環残基（例えば、複
素原子として窒素または酸素などを含む５およ
び／または６員環残基、更に具体的にはキノリニ
ル基、ピリジン基、ベンゾフラニル基、オキサゾ
リル基など）、アミノ基（例えば、メチルアミノ
基、ジエチルアミノ基、ジブチルアミノ基、フエ
ニルアミノ基、トリルアミノ基、４−（３−スル
フオベンザミノ）アニリノ基、２−クロロ−５−
アシル基、アミノアニリノ基、２−クロロ−５−
アルコキシカルボニルアニリノ基、２−トリフル
オロメチルフエニルアミノ基、３，５−ジカルボ
キシフエニルアミノ基、５−カルボキシ−２−メ
トキシフエニルアミノ基、２−メトキシ−５−
（Ｎ−メチル）スルフアモイルフエニルアミノ基、
４−スルフアモイルフエニルアミノ基、３−スル
フアモイルフエニルアミノ基、５−カルボキシ−
２−クロロフエニルアミノ基など）、カルボンア
ミド基（例えば、エチルカルボンアミド基、アル
キルカルボンアミド基、アリールカルボンアミド
基、ベンゾチアゾリルカルボンアミド基など）、
スルホンアミド基（たとえば、スルホンアミド
基、ヘテロ環スルホンアミド基など）、ウレイド
基（例えば、アルキルウレイド基、アリールウレ
イド基、ヘテロ環ウレイド基など）、アルコキシ
基（例えば、メトキシ基、エトキシ基など）、カ
ルボキシル基、スルホ基など、R12は水素原子、
アリール基（例えば、ナフチル基、フエニル基、
２，４，６−トリクロロフエニル基、−クロロ−
４，６−ジメチルフエニル基、２，６−ジクロロ
−４−メトキシフエニル基、４−アルキルアミノ
フエニル基、４−トリフルオロメチルフエニル
基、３，５−ジブロモフエニル基、４−カルボキ
シフエニル基、２−メチルフエニル基、４−スル
フアモイルフエニル基、３，５−ジカルボキシフ
エニル基、４−スルホフエニル基など）、ヘテロ
環基（例えば、ヘテロ原子として窒素原子または
酸素原子を含む５および／または６員環、更に具
体的にはベンゾフラニル基、ナフトオキサゾリル
基、キノリニル基など）、アルキル基（例えばエ
チル基、ベンジル基、２−シアノプロピル基、２
−カルボキシプロピル基など）などを表わす。 一般式（Ｍ）にて表わされるカプラー部分の代
表的なものとしては次のようなものを挙げること
ができる。 イエローカプラー部分としてはつぎの一般式
（Ｙ）によつて表わされるものが有用である。 ただし、式中、R13は、炭酸原子数１〜18の第
１級アルキル基、第２級アルキル基、第３級アル
キル基（例えば、tert−ブチル基、１，１−ジメ
チルプロピル基、１，１−ジメチル−１−エチル
チオメチル基、１，１−ジメチル−１−（４−メ
トキシフエノキシ）メチル基など）、アリール基
（例えば、フエニル基、アルキルフエニル基、３
−メチルフエニル基、２−メトキシフエニル基、
４−メトキシフエニル基、ハロフエニル基（ハロ
ゲン置換としては、塩素原子、臭素原子、フツ素
原子など）、２−ハロ−５−アルカミドフエニル
基（ハロゲン置換としては、塩素原子、臭素原
子、フツ素原子など）、２−クロロ−５−〔α−
（２，４−ジ−tert−アミルフエノキシ）ブチル
アミド〕フエニル基、２−メトキシ−５−アルカ
ミドフエニル基、２−クロロ−５−スルホンアミ
ドフエニル基、３−カルボキシフエニル基など）、
アミノ基（例えば、アニリノ基、ｐ−メトキシア
ニリノ基、３，５−ジカルボキシアニリノ基、ブ
チルアミノ基など）、R14はアリール基（例えば、
２−クロロフエニル基、２−ハロ−５−アルキル
アミドフエニル基、２−クロロ−５−〔α−（２，
４−ジ−ｔ−アミルフエノキシ）アセタミド〕フ
エニル基、２−クロロ−５−（４−メチルフエニ
ルスルホンアミド）フエニル基、２−クロロ−５
−ヘキサデカンスルホンアミドフエニル基、２−
メトキシ−５−（２，４−ジ−ｔ−アミルフエノ
キシ）アセタミドフエニル基、２−メトキシフエ
ニル基、２−エトキシフエニル基、３，５−ジメ
トキシカルボニルフエニル基、３，５−ジカルボ
キシフエニル基、５−エトキシカルボニル−２−
メトキシフエニル基、５−カルボキシ−２−メト
キシフエニル基、５−メトキシカルボニル−２−
クロロフエニル基、５−カルボキシ−２−クロロ
フエニル基、４−スルホフエニル基、３−カルボ
キシ−４−ヒドロキシフエニル基、３−（Ｎ−カ
ルボキシメチル）スルフアモイルフエニル基、３
−カルボキシ−５−メタンスルホニルアミノフエ
ニル基、４−｛Ｎ−（３，５−ジカルボキシフエニ
ル）｝スルフアモイルフエニル基、５−カルボキ
シ−２−ヒドロキシフエニル基、３−｛Ｎ−（２−
カルボキシエチル）｝スルフアモイルフエニル基、
３，５−ジスルホフエニル基など）を表わす。 R13は、第３級アルキル基（前記R11で示され
た第３級アルキル基を表わし、置換された第３級
アルキル基を包含する）またはアリール基（前記
R11で示されたアリール基であり、置換されてよ
く、炭素数40までのアルキル基で置換されたフエ
ニル基が望ましい。）を表わすのが好ましい。 一般式（Ｙ）にて表わされるカプラー部分の代
表的なものとしては、次のようなものを挙げるこ
とができる。 シアンカプラー部分としては、下記一般式（Ｃ
−１）、（Ｃ−２）または（Ｃ−３）で表わされる
カプラー部分残基が有用である。 式中、R15は、例えば、カルバモイル基（例え
ば、Ｎ−アルキルカルバモイル基、Ｎ，Ｎ−ジア
ルキルカルバモイル基、Ｎ−フエニルカルバモイ
ル基、Ｎ−アリールカルバモイル基、Ｎ−アルキ
ル−Ｎ−アリールカルバモイル基、Ｎ−ベンゾチ
アゾリルカルバモイル基のような複素環式カルバ
モイル基など）、スルフアモイル基（例えば、Ｎ
−アルキルスルフアモイル基、Ｎ，Ｎ−ジアルキ
ルスルフアモイル基、Ｎ−フエニルスルフアモイ
ル基、Ｎ−アリールスルフアモイル基、Ｎ−アル
キル−Ｎ−アリールスルフアモイル基、複素環式
スルフアモイル基など）、アルコキシカルボニル
基、アリールオキシカルボニル基などを表わす。 R16はアルキル基（例えば、メチル基、エチル
基、プロピル基、ｎ−ブチル基、tert−ブチル
基、ヘキシル基、２−ヒドロキシエチル基、２−
フエニルエチル基など）、アリール基（例えば、
ナフチル基、フエニル基、２，４，６−トリクロ
ロフエニル基、２−クロロ−４，６−ジメチルフ
エニル基、２，６−ジクロロ−４−メトキシフエ
ニル基、４−アルキルアミノフエニル基、４−ト
リフルオロメチルフエニル基、３，５−ジブロモ
フエニル基、４−カルボキシフエニル基、２−メ
チルフエニル基、４−スルフアモイルフエニル
基、３，５−ジカルボキシフエニル基、４−スル
ホフエニル基など）、複素環残基（例えば、複素
原子として窒素または酸素などを含む５および／
または６員環残基、更に具体的にはキノリニル
基、ピリジル基、ベンゾフラニル基、オキサゾリ
ル基など）、アミノ基（アミノ基、アルキルアミ
ノ基、アリールアミノ基など）、カルボンアミド
基（例えば、アルキルカルボンアミド基、アリー
ルカルボンアミド基など）、スルホンアミド基、
スルフアモイル基（アルキルスルフアモイル基、
アリールスルフアモイル基など）、カルバモイル
基などを表わす。R17、R18およびR19はR16で定
義した基または前に述べたようなハロゲン原子
（例えば、臭素原子、塩素原子など）、またはアル
コキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基、ブ
トキシ基など）などを表わす。また、R18とR19
とでピリジン環、ピロール環、ピリドン環、オキ
サジン環のような複素環を形成してもよい。 R20、R21は低級アルキル基（例えば、メチル
基、エチル基、ブチル基など）、炭素数１〜５の
ヒドロキシアルキル基（例えば、メトキシ基、エ
トキシ基、ブトキシ基など）、炭素数１〜５のシ
アノアルキル基、炭素数１〜５のアシルアミノア
ルキル基などを表わし、R22、R23、R24、R25は
水素原子またはアルキル基（好ましくは低級アル
キル基であり、具体的には、メチル基、エチル
基、プロピル基、ｎ−ブチル基、tert−ブチル基
など）などを表わす。 一般式（Ｃ−１）にて表わされるカプラー部分
の代表的なものとしては、次のようなものを挙げ
ることができる。 一般式（Ｃ−２）にて表わされるカプラー部分
の代表的なものとしては、次のようなものを挙げ
ることができる。 一般式（Ｃ−３）にて表わされるカプラー部分
の代表的なものとしては、次のようなものを挙げ
ることができる。 無呈色カプラーのうち、いわゆる“直鎖状”の
ものとしては、例えば特公昭46−22514号（また
はDAS1547640）の記載のものを挙げることがで
きるし、他方、シクロケトンまたはシクロイミン
骨格を有するものとしては、例えば特開昭51−
105819号に記載のものを挙げることができる。 その他、米国特許第3369897号明細書および特
開昭51−26541号に見られるピラゾロ〔２，３−
ａ〕ベンゾイミダゾール系二当量カプラー部分、
特開昭52−82423号および特開昭51−104825号に
見られる複素環置換酢酸誘導体系二当量カプラー
部分、さらにナフトールスルホン酸系二当量カプ
ラー部分も有用である。 更に、アセチルアセトンのような１，３−ジケ
トンやアシル酢酸エステル類などでもよい。 このようなカプラー部分Ｑすなわち、一般式
（Ｍ）、（Ｙ）、（Ｃ−１）（Ｃ−２）及び（Ｃ−３）
以外のカプラー部分Ｑとしては、具体的には次の
ようなものを挙げることができる。 一般式（）に記されているFlは、化合物部分
Ｑと結合している時は、強い螢光ないし螢光を発
しない化合物であるが、解離後は、その吸収光で
励起することにより螢光を発する化合物部分であ
ればどのようなものであつても用いることができ
る。 また、本発明の一般式（）に記されているFl
は、その化合物部分の中の下記のような化学物構
造部分ＬによつてＱと結合している。 （R′は、メチル基、エチル基、プロピル基、ブ
チル基などの低級アルキル基を表わす。） など、 上記のような化学構造部分を有したFlは、水素
供与体の酸化物（例えば、キノンジイミノ）が攻
撃した後、色素を形成する際にＱより離脱し上記
化学構造部分はOHまたは−NH2となり、螢光を
発する化合物となる。 このとき、用いるFlによつて、二酸化炭素、サ
ツカリン型化合物、チアゾリノン誘導体を遊離す
ることもある。 Flとして好ましい化学構造の代表的なものとし
ては、次の一般式によつて表わされる。 などが挙げられる。 上記の各式中、R26は水素原子、アルキル基
（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ｎ
−ブチル基、tert−ブチル基、ヘキシル基、２−
ヒドロキシエチル基、２−フエニルエチル基な
ど）、アリール基（例えば、ナフチル基、フエニ
ル基、２，４，６−トリクロロフエニル基、２−
クロロ−４，６−ジメチルフエニル基、２，６−
ジクロロ−４−メトキシフエニル基、４−アルキ
ルアミノフエニル基、４−トリフルオロメチルフ
エニル基、３，５−ジブロモフエニル基、４−カ
ルボキシフエニル基、２−メチルフエニル基、４
−スルフアモイルフエニル基、３，５−ジカルボ
キシフエニル基、４−スルホフエニル基など）を
表わす。また、R27、R28、R29及びR30は同一で
も異なつてもよく、それぞれ水素原子、ハロゲン
原子、好ましくは塩素原子または臭素原子を意味
する。 上記のFlのうつ（Fl−１）で表わされる化合物
は、吸収極大波長と螢光極大波長との差が大きく
本発明にとつてより好ましいものである。 以下に一般式（）Ｑ−Flで示される本発明に
用いる発螢光物質の代表例を以下に示すが、本発
明の範囲はこれらの化合物のみに限定されるもの
ではない。 一般式（）Ｑ−Flで示される化合物は、螢光
化合物部分（Fl）に当る化合物が市販されている
ので、それを原料とし、２当量カプラーの従来か
ら公知の合成法を応用して容易に合成できる。前
述の公知の合成法については、特開昭50−123342
号公報、同50−159336号公報、同51−117032号公
報、同51−146828号公報、米国特許第3737316号
明細書、同第3253924号明細書などに記載されて
いる。 次に、一般式（）で示される化合物のうち代
表的なものについて合成法を例示する。以下に具
体的に示されていない化合物も合成例１〜合成例
４に順じて容易に行なうことができる。 合成例 １ （化合物例−１の合成） ドイツ国特許1124356号に記載されている方法
により合成したα−ピバロイル−３，５−ジカル
ボメトキシアセトアニリド3.35ｇ（10ミリモル）
を塩化メチレン35mlに溶解し、氷冷下５℃以下で
臭素1.8ｇ（11.3ミリモル）を滴下し、α−ブロ
モ誘導体に導びいた。このα−ブロモ体の溶液を
飽和食塩水および水で洗浄した後、４−メチルウ
ンベリフエロン4.14ｇ（23.5ミリモル）、トリエ
チルアミン3.1ml、塩化メチレン10mlおよびＮ，
Ｎ−ジメチルホルムアミド（DMF）５mlから成
る溶液に水冷下18℃以下で滴下した。反応混合物
を1N水酸化ナトリウム水溶液、1N塩酸および１
％炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した後、無水
硫酸ナトリウムで乾燥した。塩化メチレンを留去
し、残渣をアセトニトリル／メタノールの混合溶
媒より再結晶することにより、α−ピバロイル−
α−4′−メチルウンベリフエリル−３，５−ジカ
ルボメトキシアセトアニリド4.55ｇ（収率89.5
％）が得られた。融点254〜256℃このジメチルエ
ステル2.55ｇ（５ミリモル）を30mlのメタノール
に懸濁し、これに水酸化ナトリウム0.6ｇ（15ミ
リモル）および水15mlから成る溶液を加えた。０
℃で1.5時間反応させた後、4.5mlの濃塩酸を加
え、生じた沈澱を取した。水洗、風乾を行なつ
た後、酢酸より再結晶し、目的化合物（−１）
2.05ｇ（収率85.3％）が得られた。融点267℃分
解 合成例 ２ （化合物−19の合成） ４−メチルウンベリフエロン17.6ｇ（0.1モル）
を塩化メチレン40mlおよびDMF17mlに懸濁し、
さらにトリエチルアミン14mlを加えて均一な溶液
にした。これを流水で18℃以下に冷却し、撹拌し
ながら、α−クロロアセト酢酸エチル16.5ｇ
（0.1モル）と塩化メチレン10mlとから成る溶液を
約30分間で滴下した。この後30℃で更に24時間撹
拌を続けた。次いで反応混合物を水３回洗浄した
後、塩化メチレン溶液を無水硫酸ナトリウムで乾
燥した。乾燥後、塩化メチレンを減圧下で留去
し、残渣にエタノール50mlを加え、室温で撹拌す
ると目的物である化合物−19が析出してくる。
この結晶を取し、エタノールで洗浄し、風乾し
た。 収量21.5ｇ（70.7％）、融点105〜106℃ 合成例 ３ （化合物−20の合成） 化合物−19 15.2ｇ（0.05モル）、フエニルヒ
ドラジン5.4ｇ（0.05モル）にエタノール250mlを
加え、３時間還流撹拌を行なつた。室温に冷却し
た後、エタノールを減圧留去した。残渣を酢酸エ
チル：ヘキサン＝１：１で再結晶し、目的化合物
−20を得た。 収量10.6ｇ（60.9％）、融点163〜165℃ 合成例 ４ （化合物−14の合成） Ｎ，Ｎ−ビス−（２−ヒドロキシエチル）−
N′−メチル−３−メチル−ｐ−フエニレンジア
ミン11.2ｇ（0.05モル）および２−（４−メチル
クマリン−７−オキシカルボニル）ベンゼンスル
ホニルクロリド16.9ｇ（0.05モル）を窒素気流下
で、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド150mlに溶解
し、これにピリジン５mlを氷冷下５℃で滴下し
た。滴下終了後室温で２時間撹拌を続けた。反応
混合物を稀塩酸に注ぎ、生じた結晶を取し、水
洗乾燥を行なつた。この粗結晶をエタノールから
再結晶し、目的の化合物−14を得た。 収量22.3ｇ（78.8％）、融点187〜190℃ 本発明にて用いられる水素供与体としては、一
般式（）のＱとFlとの結合位置を攻撃しえる水
素供与体であり、好ましくは下記の一般式（）
にて示される化合物である。 ここで、ａは、ヒドロキシ基、アミノ基、−
NHR、−NRR′（ここでＲおよびR′は炭素数１〜
５のアルキル基、炭素数３〜６のシクロアルキル
基、炭素数１〜５のヒドロキシアルキル基、アシ
ルアミノアルキル基（例えばメタンスルフオニル
アミノアルキル基、アセチルアミノアルキル基な
どＲとR′とで環を形成してもよい。）を表わす。 Z1、Z2は水素原子、炭素数１〜５のアルキル基
（例えばメチル基、エチル基など）、炭素数１〜５
のアルコキシ基、ハロゲン原子（例えば塩素原
子、臭素原子、フツ素原子など）、カルボキシル
基、メタンスルフオニル基、フエニル基などを表
わし、Z1とZ2とでシクロアルケン、芳香族環、複
素環を形成していてもよい。具体的には、ベンゼ
ン環、ピラゾール環、ナフタレン環などを表わ
す。 ｎは正の整数であり、一般式には１〜５、好ま
しくは１または２である。 本発明に用いられる水素供与体の代表的なもの
としては、４−アミノアンチピリン、ｐ−アミン
フエノール誘導体、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ｐ−フ
エニルレンジアミン誘導体などがある。 この他、L.F.A.Mason著Photographic
Processing Chemistry（Focal Press刊、1966年）
の226〜229頁、T.H.James編 The theory of
the Photographic Process（4th ed.、
Macmillan Publishing Co.、Inc.刊）の311〜
320頁、米国特許2193015号、同2592364号、特開
昭48−64933号などに記載のものを用いることが
できる。 以下にそれらの具体例を示すが、本発明の範囲
はこれらの化合物のみに限定されるものではな
い。 および、これらの鉄酸塩あるいは有機酸塩、 本発明の定量試薬の他の有効成分であるペルオ
キシダーゼは過酸化水素による水素供与体の酸化
反応の触媒であり、如何なる起源のペルオキシダ
ーゼでも使用可能である。 本発明の定量用試薬は各有効成分をそれぞれ別
個に粉末状固体として、又は水もしくは緩衝液中
の溶液として調製し、使用時すなわち定量する際
にこれらの形の各成分を任意に組合わせるか、あ
るいは粉末状成分の混合物又は各成分を含有する
水もしくは緩衝液中の溶液として調整することが
できる。最後の場合には各成分を同時に又は任意
の順序で溶解してもよい。 本発明の定量用試薬の過酸化水素との反応（発
螢光反応）は次式により示される。 この反応により式（）の螢光物質（この場合
は４−メチルウンベリフエロン）が生成する。そ
して生成した螢光物質の螢光の測定より過酸化
水素の定量を行なうことができる。 本発明の定量用試薬を用いて、任意のH2O2濃
度を有する試料からH2O2を高精度で定量するこ
とができるようになつた。本発明の定量法は、例
えば次のように実施することができる。試料に発
螢光物質（）および水素供与体、反応触媒とし
てのペルオキシダーゼを前記の形で同時にあるい
は任意の順序で添加し、混合物を５〜40℃の温度
及び3.0〜9.0のPHにおいて、好ましくは１〜60分
間反応させ、生成した螢光物質（Fl−OHタイプ
のものとしては例えばウンベリフエロン誘導体あ
るいはフルオレセイン誘導体など、Fl−NH2タ
イプのものとしては例えば７−アミノクマリン誘
導体など）を含有する反応混合物をPH8.0〜10.5
で280〜500nｍの波長の光を用いて励起し、400
〜650nｍにおける光の螢光強度を測定する。 本方法は過酸化水素の微量定量に特に有利であ
る。 試料中のH2O2濃度は一般に0.02〜200nｇ／ml
（総反応容量系）であることが好ましい。この
H2O2濃度において発螢光物質は0.50〜10μmol／
ml、水素供与体は１〜10nmol／ml、ペルオキシ
ダーゼは0.1〜1.0単位／ml（いずれも総反応容量
系）の量で用いられる。 本発明の定量試薬の有効成分（）、水素供与
体およびペルオキシダーゼのほかに、さらに酸化
酵素を組合わせることによつてより広範囲の測定
が可能となる。すなわち、酸化酵素を最終的に定
量すべき物質が酸化酵素の作用により過酸化水素
を生成する場合に併用することによつて、過酸化
水素の定量によつて目的とする種々の物質の定量
が可能になる。具体的には、尿および体液成分に
は、グルコース、尿酸、コレステロール、トリグ
リセリド、乳酸、クレアチニン、遊離脂肪酸、グ
ルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ、グル
タミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ、コリ
ンエステラーゼ、クレアチンホスホキナーゼ、乳
酸脱水素酵素などを測定することができる。 これらの測定に用いる酸化酵素としては、グル
コースオキシダーゼ、ウリカーゼコレステロール
オキシダーゼ、Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダ
ーゼ、ピルビン酸オキシダーゼなどが挙げられ
る。これらの酸化酵素はいかなる起源のものでも
よく固体粉末の形で用いでもよいが、好ましくは
水もしくは特に緩衝液中の溶液として用いられ
る。 酸化酵素を併用する場合には、酸化酵素の作用
により、H2O2をあらかじ生成させてもよいが、
H2O2生成反応と発螢光反応を同時に進行させる
ことが好ましい。この場合も酸化酵素を試料に添
加する時期は任意であつてよく、一般式（）、
水素供与体又はペルオキシダーゼと同時に又は四
者を同時に添加してもよい。酸化酵素の使用量は
その種類、目的とする基質または混在物質などに
応じて適宜決められる。 本発明は、通常の化学実験における過酸化水素
の定量に好適であるばかりでなく、近年急速に普
及しつつある酵素学的分析方法を用いた臨床検査
のうち、尿および体液中のグルコース、尿酸、コ
レステロール、トリグリセリド、乳酸、クレアチ
ニン、遊離脂肪酸、グルタミン酸ピルビン酸トラ
ンスアミナーゼ、グルタミン酸オキザロ酢酸トラ
ンスアミナーゼ、コリンエステラーゼ、クレアチ
ンホスホキナーゼ、乳酸脱水素酵素などを測定す
る方法として、それぞれの系における最終的に定
量すべき物質の酸化酵素を作用させて生成した過
酸化水素を定量することにより、目的物を定量す
る方法にも利用できる。また、試薬として有効成
分（）、水素供与体およびH2O2を組合わせれ
ば、ペルオキシダーゼの定量法にも使用でき、例
えばペルオキシダーゼを用いた酵素免疫測定法に
利用できる。 さらに本発明は、人ばかりでなく種々の動物、
例えば、家蓄、愛玩動物その他の尿、体液などの
測定にも利用できる。 以下、実施例を挙げ、本発明を更に詳細に説明
する。 実施例 １ （過酸化水素の定量） 化合物−１ 60mgを特級DMF5mlに溶解し
た。。この溶液0.5mlにPH５の0.1M酢酸緩衝液50
mlを加えた。更に、化合物−19 1.2mgとペルオ
キシダーゼ（シグマ社製54単位／mg）5.5mgを加
え、前述の緩衝液を加え、全量を正確に100mlと
した。………Ａ液 種々の濃度（0.25〜1nmole／ml）の過酸化水
素0.1mlにＡ液１mlを加え、37℃で10分間インキ
ユベーシヨンした。 この反応は次式により示される。 インキユベーシヨン後、PH10の0.1Mグリシン
−NaOH緩衝液2.5mlを加え、生成した４−メチ
ルウンベリフエロンを螢光光度計を用いて、励起
波長358nｍ、螢光波長448nｍで測定した。 測定により得られた螢光強度と過酸化水素量と
の関係は第１図に示したように直線となつた。 このように、本発明の方法によればPH５という
低PH域においても満足いく値が得られた。 実施例 ２ （過酸化水素の定量） 実施例１の化合物−１の代りの化合物−19
と化合物−19とを用いて実施例１と同様に種々
の濃度（0.25〜1nmole／ml）の過酸化水素水の
測定を行なつた。生成した４−メチルウンベリフ
エロンを螢光光度計を用いて励起波長358nｍ、
螢光波長448nｍで測定した。 測定により得られた螢光強度と過酸化水素との
関係は第２図に示したようになつた。 実施例 ３ （過酸化水素の定量） 実施例２において、PH５の0.1M酢酸緩衝液50
mlを、第１表に示したPH６、PH７、PH８及びPH９
の緩衝液と代えて同様にPHの異なる４種のＡ液を
調製した。更に、0.5nmole／mlの過酸化水素水
0.1mlにＡ液１mlを加えて、37℃で10分間インキ
ユベーシヨンした。インキユベーシヨン後、PH10
の0.1Mグリシン−NaOH緩衝液2.5mlを加え、同
様に螢光強度を各々測定し、結果を第１表に示し
た。 次に、化合物−19及び−19の代りに、化合
物−６及び−１を用いて、上記の方法と同様
にして螢光強度を各々測定した。また、化合物
−19及び−19の代りに、化合物−７及び−
４を用いて、上記の方法と同様にして螢光強度を
各々測定し、これらの結果を第１表に示した。 一方、本発明の化合物の代りに、ジアセチルフ
ルオレスシンを用いた従来法にて、同様に各PHの
緩衡液を用いて螢光強度を測定し第１表に示し
た。
与する新規な過酸化水素定量用試薬および過酸化
水素の定量法に関する。 近年、臨床検査に於ける酵素学的分析方法は、
その特異性が高く評価され、急速に普及しつつあ
る。それらのうち、尿および体液中のグルコー
ス、尿酸、コレステロール、トリグリセリド、乳
酸、クレアチニン、遊離脂肪酸、グルタミン酸ピ
ルビン酸トランスアミナーゼ、グルタミン酸オキ
ザロ酢酸トランスアミナーゼ、コリンエステラー
ゼ、クレアチンホスホキナーゼ、乳酸脱水素酵素
などを測定する方法としてそれぞれの系における
最終的に定量すべき物質の酸化酵素を作用させて
生成した過酸化水素を定量することにより、目的
物を定量する方法がしばしば用いられている。 従来からの過酸化水素の定量法としては、ペル
オキシダーゼの存在下に、ｏ−トリジン、２，７
−ジアミノフルオレン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−
フエニレンジアミン、ｏ−ジアニシジン、ｏ−ア
ミノフエノール、トリアリールイミダゾール等の
色原体を酸化型の発色体に変化させて比色定量す
る方法、４−アミノアンチピリンとフエノール又
はＮ，Ｎ−ジアルキルアニリンあるいはＮ，Ｎ−
ジアルキルトルイジンとの組合せ、３−メチル−
２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンとｏ−トリジ
ン又はＮ，Ｎ−ジメチルアニリンあるいはＮ，Ｎ
−ジエチルアニリンとの組合せ、あるいは二量体
を形成する４−メトキシ−１−ナフトール及びそ
の誘導体等の色原体を酸化縮合させて発色体とし
て比色定量する方法等が知られているが、このよ
うな比色による定量法には、自ずからその定量感
度に限界があり、微量の過酸化水素を定量するこ
とは不可能であつた。 また螢光法による定量法としては、ホモバニリ
ン酸を用いる方法が知られているが、この方法に
よつても微量の過酸化水素を定量することは極め
て困難であつた。このため、感度の高い方法とし
て特開昭54−43791号に見られるようにフルオレ
スシンを用いる方法が発明されているが、このフ
ルオレスシンはハイドロキノンの構造を有してい
るので酸化されやすく安定性に問題がある。この
改良法として特開昭55−48656号にはジアセチル
フルオレンスシンを用いる方法が記載されてい
る。しかし、この化合物を用いる場合の好ましい
PH域は7.5〜9.5であり、グルコースオキシダーゼ
やコレステロールオキシダーゼの至適PHとは離れ
ている。このため、安定かつより広いPH域で定量
可能な試薬が望まれている。 したがつて、本発明の目的は、微量の過酸化水
素を定量しえる過酸化水素定量用試薬及び定量方
法を提供することである。 本発明の他の目的は、広いPH域で定量可能で安
定な過酸化水素定量用試薬及び定量方法を提供す
ることである。 本発明者は、以上の諸点を考慮し、ペルオキシ
ダーゼが触媒し、あるいは関与する微量の過酸化
水素の定量用発螢光試薬につき、鋭意研究を重ね
た結果、活性メチレンまたは活性メチンから水素
原子一個が除去された残基と発螢光部分とからな
ることを特徴とする過酸化水素定量用試薬によつ
て、また、過酸化水素を含有した試料に前記過酸
化水素定量用試薬、水素供与体およびペルオキシ
ダーゼを作用させその結果生じた発螢光物質の螢
光強度を測定することを特徴とする方法によつ
て、前記の目的が効果的に達成しうることを見い
出した。 本発明にて用いられる過酸化水素定量用試薬と
しては、好ましくは下記の一般式（）によつて
示される化合物である。 一般式（） Ｑ−Fl 式中、Ｑは活性メチレン基または活性メチン基
から水素原子を一個除去した残基を有する化合物
部分である。そして、Ｑは、その活性メチレン残
基または活性メチン残基によつてFlと結合してい
る。Flは、Ｑと分離して螢光を発しうる化合物部
分である。 ここで、活性メチレン基または活性メチン基と
は、塩基によつてプロトンを放出しうるメチレン
基またはメチン基のことであり、具体的には、例
えば、メチレン基またはメチン基に直接又は間接
に（例えば共役二重結合を介して）カルボニル
基、シアノ基、ハロゲン原子、スルホン基、スル
ホキシド基、ニトロ基、イミノ基などのような電
子吸引性基を有したものである。 酸化酵素の作用により過酸化水素を生成する物
質を測定する場合には、前記の３種の有効成分に
更に酸化酵素を組合わせて用いることにより、生
成した過酸化水素を定量することができ、さらに
過酸化水素に関して作製した目的物質の検量線又
は計算式を利用して、これを直接に定量すること
ができる。 例えば、体液および尿に含まれる化学物質の定
量の際に、酸化酵素としてウリカーゼ、グルコー
スオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ等
を用いて尿酸、グルコース、コレステロール等の
定量を行なうことができる。 このような化学物質の定量は臨床診断上特に重
要なことである。 次に、本発明の一般式（）の化合物について
詳細に説明する。 一般式（）のＱは、活性メチレン残基または
活性メチン残基を有した化合物部分であるが、好
ましくは水素供与体の酸化体と酸化カツプリング
反応する化合物部分（すなわち、カプラー部分）
である。より好ましくは、写真化学の分野にて用
いられているいわゆる二当量カプラー部分（例え
ば、四当量カプラーの活性メチレン又は活性メチ
ン基から水素原子が脱離したもの）が用いられ
る。 具体的には、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ｐ−フエニ
レンジアミンなどの水素供与体の酸化体とカツプ
リング反応して、イエロー、マゼンタまたはシア
ン色素を形成するカプラー部分（すなわち、イエ
ローカプラー、マゼンタカプラー、シアンカプラ
ー）、いわゆる“直鎖状”の無呈色カプラー部分、
シクロケトンもしくはシクロイミン骨格を有する
無呈色カプラー部分などである。 本発明のカプラー部分Ｑとして用いられるカプ
ラーとしては、次の文献に記載されたものを用い
ることができる。すなわち、“The Theory of
the Photographic Process”4thed.、P.354〜
P.362、Edited by T.H.James（1977年、
Macmillan Publishing Co.、Inc.刊）、英国特許
第1038331号明細書、西独特許第1124356号明細
書、米国特許第3227550号明細書など。 例えば、マゼンタカプラー部分として、とく
に、次の一般式（Ｍ）によつて表わされるものが
有用である。 ただし、式中、R11は第１、第２および第３級
の中から選ばれたアルキル基（例えばメチル基、
エチル基、プロピル基、ｎ−ブチル基、tert−ブ
チル基、ヘキシル基、２−ヒドロキシエチル基、
２−フエニルエチル基など）、アリール基（例え
ば、ナフチル基、フエニル基、２，４，６−トリ
クロロフエニル基、２−クロロ−４，６−ジメチ
ルフエニル基、２，６−ジクロロ−４−メトキシ
フエニル基、４−アルキルアミノフエニル基、４
−トリフルオロメチルフエニル基、３，５−ジブ
ロモフエニル基、４−カルボキシフエニル基、２
−メチルフエニル基、４−スルフアモイルフエニ
ル基、３，５−ジカルボキシフエニル基、４−ス
ルホフエニル基など）、複素環残基（例えば、複
素原子として窒素または酸素などを含む５およ
び／または６員環残基、更に具体的にはキノリニ
ル基、ピリジン基、ベンゾフラニル基、オキサゾ
リル基など）、アミノ基（例えば、メチルアミノ
基、ジエチルアミノ基、ジブチルアミノ基、フエ
ニルアミノ基、トリルアミノ基、４−（３−スル
フオベンザミノ）アニリノ基、２−クロロ−５−
アシル基、アミノアニリノ基、２−クロロ−５−
アルコキシカルボニルアニリノ基、２−トリフル
オロメチルフエニルアミノ基、３，５−ジカルボ
キシフエニルアミノ基、５−カルボキシ−２−メ
トキシフエニルアミノ基、２−メトキシ−５−
（Ｎ−メチル）スルフアモイルフエニルアミノ基、
４−スルフアモイルフエニルアミノ基、３−スル
フアモイルフエニルアミノ基、５−カルボキシ−
２−クロロフエニルアミノ基など）、カルボンア
ミド基（例えば、エチルカルボンアミド基、アル
キルカルボンアミド基、アリールカルボンアミド
基、ベンゾチアゾリルカルボンアミド基など）、
スルホンアミド基（たとえば、スルホンアミド
基、ヘテロ環スルホンアミド基など）、ウレイド
基（例えば、アルキルウレイド基、アリールウレ
イド基、ヘテロ環ウレイド基など）、アルコキシ
基（例えば、メトキシ基、エトキシ基など）、カ
ルボキシル基、スルホ基など、R12は水素原子、
アリール基（例えば、ナフチル基、フエニル基、
２，４，６−トリクロロフエニル基、−クロロ−
４，６−ジメチルフエニル基、２，６−ジクロロ
−４−メトキシフエニル基、４−アルキルアミノ
フエニル基、４−トリフルオロメチルフエニル
基、３，５−ジブロモフエニル基、４−カルボキ
シフエニル基、２−メチルフエニル基、４−スル
フアモイルフエニル基、３，５−ジカルボキシフ
エニル基、４−スルホフエニル基など）、ヘテロ
環基（例えば、ヘテロ原子として窒素原子または
酸素原子を含む５および／または６員環、更に具
体的にはベンゾフラニル基、ナフトオキサゾリル
基、キノリニル基など）、アルキル基（例えばエ
チル基、ベンジル基、２−シアノプロピル基、２
−カルボキシプロピル基など）などを表わす。 一般式（Ｍ）にて表わされるカプラー部分の代
表的なものとしては次のようなものを挙げること
ができる。 イエローカプラー部分としてはつぎの一般式
（Ｙ）によつて表わされるものが有用である。 ただし、式中、R13は、炭酸原子数１〜18の第
１級アルキル基、第２級アルキル基、第３級アル
キル基（例えば、tert−ブチル基、１，１−ジメ
チルプロピル基、１，１−ジメチル−１−エチル
チオメチル基、１，１−ジメチル−１−（４−メ
トキシフエノキシ）メチル基など）、アリール基
（例えば、フエニル基、アルキルフエニル基、３
−メチルフエニル基、２−メトキシフエニル基、
４−メトキシフエニル基、ハロフエニル基（ハロ
ゲン置換としては、塩素原子、臭素原子、フツ素
原子など）、２−ハロ−５−アルカミドフエニル
基（ハロゲン置換としては、塩素原子、臭素原
子、フツ素原子など）、２−クロロ−５−〔α−
（２，４−ジ−tert−アミルフエノキシ）ブチル
アミド〕フエニル基、２−メトキシ−５−アルカ
ミドフエニル基、２−クロロ−５−スルホンアミ
ドフエニル基、３−カルボキシフエニル基など）、
アミノ基（例えば、アニリノ基、ｐ−メトキシア
ニリノ基、３，５−ジカルボキシアニリノ基、ブ
チルアミノ基など）、R14はアリール基（例えば、
２−クロロフエニル基、２−ハロ−５−アルキル
アミドフエニル基、２−クロロ−５−〔α−（２，
４−ジ−ｔ−アミルフエノキシ）アセタミド〕フ
エニル基、２−クロロ−５−（４−メチルフエニ
ルスルホンアミド）フエニル基、２−クロロ−５
−ヘキサデカンスルホンアミドフエニル基、２−
メトキシ−５−（２，４−ジ−ｔ−アミルフエノ
キシ）アセタミドフエニル基、２−メトキシフエ
ニル基、２−エトキシフエニル基、３，５−ジメ
トキシカルボニルフエニル基、３，５−ジカルボ
キシフエニル基、５−エトキシカルボニル−２−
メトキシフエニル基、５−カルボキシ−２−メト
キシフエニル基、５−メトキシカルボニル−２−
クロロフエニル基、５−カルボキシ−２−クロロ
フエニル基、４−スルホフエニル基、３−カルボ
キシ−４−ヒドロキシフエニル基、３−（Ｎ−カ
ルボキシメチル）スルフアモイルフエニル基、３
−カルボキシ−５−メタンスルホニルアミノフエ
ニル基、４−｛Ｎ−（３，５−ジカルボキシフエニ
ル）｝スルフアモイルフエニル基、５−カルボキ
シ−２−ヒドロキシフエニル基、３−｛Ｎ−（２−
カルボキシエチル）｝スルフアモイルフエニル基、
３，５−ジスルホフエニル基など）を表わす。 R13は、第３級アルキル基（前記R11で示され
た第３級アルキル基を表わし、置換された第３級
アルキル基を包含する）またはアリール基（前記
R11で示されたアリール基であり、置換されてよ
く、炭素数40までのアルキル基で置換されたフエ
ニル基が望ましい。）を表わすのが好ましい。 一般式（Ｙ）にて表わされるカプラー部分の代
表的なものとしては、次のようなものを挙げるこ
とができる。 シアンカプラー部分としては、下記一般式（Ｃ
−１）、（Ｃ−２）または（Ｃ−３）で表わされる
カプラー部分残基が有用である。 式中、R15は、例えば、カルバモイル基（例え
ば、Ｎ−アルキルカルバモイル基、Ｎ，Ｎ−ジア
ルキルカルバモイル基、Ｎ−フエニルカルバモイ
ル基、Ｎ−アリールカルバモイル基、Ｎ−アルキ
ル−Ｎ−アリールカルバモイル基、Ｎ−ベンゾチ
アゾリルカルバモイル基のような複素環式カルバ
モイル基など）、スルフアモイル基（例えば、Ｎ
−アルキルスルフアモイル基、Ｎ，Ｎ−ジアルキ
ルスルフアモイル基、Ｎ−フエニルスルフアモイ
ル基、Ｎ−アリールスルフアモイル基、Ｎ−アル
キル−Ｎ−アリールスルフアモイル基、複素環式
スルフアモイル基など）、アルコキシカルボニル
基、アリールオキシカルボニル基などを表わす。 R16はアルキル基（例えば、メチル基、エチル
基、プロピル基、ｎ−ブチル基、tert−ブチル
基、ヘキシル基、２−ヒドロキシエチル基、２−
フエニルエチル基など）、アリール基（例えば、
ナフチル基、フエニル基、２，４，６−トリクロ
ロフエニル基、２−クロロ−４，６−ジメチルフ
エニル基、２，６−ジクロロ−４−メトキシフエ
ニル基、４−アルキルアミノフエニル基、４−ト
リフルオロメチルフエニル基、３，５−ジブロモ
フエニル基、４−カルボキシフエニル基、２−メ
チルフエニル基、４−スルフアモイルフエニル
基、３，５−ジカルボキシフエニル基、４−スル
ホフエニル基など）、複素環残基（例えば、複素
原子として窒素または酸素などを含む５および／
または６員環残基、更に具体的にはキノリニル
基、ピリジル基、ベンゾフラニル基、オキサゾリ
ル基など）、アミノ基（アミノ基、アルキルアミ
ノ基、アリールアミノ基など）、カルボンアミド
基（例えば、アルキルカルボンアミド基、アリー
ルカルボンアミド基など）、スルホンアミド基、
スルフアモイル基（アルキルスルフアモイル基、
アリールスルフアモイル基など）、カルバモイル
基などを表わす。R17、R18およびR19はR16で定
義した基または前に述べたようなハロゲン原子
（例えば、臭素原子、塩素原子など）、またはアル
コキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基、ブ
トキシ基など）などを表わす。また、R18とR19
とでピリジン環、ピロール環、ピリドン環、オキ
サジン環のような複素環を形成してもよい。 R20、R21は低級アルキル基（例えば、メチル
基、エチル基、ブチル基など）、炭素数１〜５の
ヒドロキシアルキル基（例えば、メトキシ基、エ
トキシ基、ブトキシ基など）、炭素数１〜５のシ
アノアルキル基、炭素数１〜５のアシルアミノア
ルキル基などを表わし、R22、R23、R24、R25は
水素原子またはアルキル基（好ましくは低級アル
キル基であり、具体的には、メチル基、エチル
基、プロピル基、ｎ−ブチル基、tert−ブチル基
など）などを表わす。 一般式（Ｃ−１）にて表わされるカプラー部分
の代表的なものとしては、次のようなものを挙げ
ることができる。 一般式（Ｃ−２）にて表わされるカプラー部分
の代表的なものとしては、次のようなものを挙げ
ることができる。 一般式（Ｃ−３）にて表わされるカプラー部分
の代表的なものとしては、次のようなものを挙げ
ることができる。 無呈色カプラーのうち、いわゆる“直鎖状”の
ものとしては、例えば特公昭46−22514号（また
はDAS1547640）の記載のものを挙げることがで
きるし、他方、シクロケトンまたはシクロイミン
骨格を有するものとしては、例えば特開昭51−
105819号に記載のものを挙げることができる。 その他、米国特許第3369897号明細書および特
開昭51−26541号に見られるピラゾロ〔２，３−
ａ〕ベンゾイミダゾール系二当量カプラー部分、
特開昭52−82423号および特開昭51−104825号に
見られる複素環置換酢酸誘導体系二当量カプラー
部分、さらにナフトールスルホン酸系二当量カプ
ラー部分も有用である。 更に、アセチルアセトンのような１，３−ジケ
トンやアシル酢酸エステル類などでもよい。 このようなカプラー部分Ｑすなわち、一般式
（Ｍ）、（Ｙ）、（Ｃ−１）（Ｃ−２）及び（Ｃ−３）
以外のカプラー部分Ｑとしては、具体的には次の
ようなものを挙げることができる。 一般式（）に記されているFlは、化合物部分
Ｑと結合している時は、強い螢光ないし螢光を発
しない化合物であるが、解離後は、その吸収光で
励起することにより螢光を発する化合物部分であ
ればどのようなものであつても用いることができ
る。 また、本発明の一般式（）に記されているFl
は、その化合物部分の中の下記のような化学物構
造部分ＬによつてＱと結合している。 （R′は、メチル基、エチル基、プロピル基、ブ
チル基などの低級アルキル基を表わす。） など、 上記のような化学構造部分を有したFlは、水素
供与体の酸化物（例えば、キノンジイミノ）が攻
撃した後、色素を形成する際にＱより離脱し上記
化学構造部分はOHまたは−NH2となり、螢光を
発する化合物となる。 このとき、用いるFlによつて、二酸化炭素、サ
ツカリン型化合物、チアゾリノン誘導体を遊離す
ることもある。 Flとして好ましい化学構造の代表的なものとし
ては、次の一般式によつて表わされる。 などが挙げられる。 上記の各式中、R26は水素原子、アルキル基
（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ｎ
−ブチル基、tert−ブチル基、ヘキシル基、２−
ヒドロキシエチル基、２−フエニルエチル基な
ど）、アリール基（例えば、ナフチル基、フエニ
ル基、２，４，６−トリクロロフエニル基、２−
クロロ−４，６−ジメチルフエニル基、２，６−
ジクロロ−４−メトキシフエニル基、４−アルキ
ルアミノフエニル基、４−トリフルオロメチルフ
エニル基、３，５−ジブロモフエニル基、４−カ
ルボキシフエニル基、２−メチルフエニル基、４
−スルフアモイルフエニル基、３，５−ジカルボ
キシフエニル基、４−スルホフエニル基など）を
表わす。また、R27、R28、R29及びR30は同一で
も異なつてもよく、それぞれ水素原子、ハロゲン
原子、好ましくは塩素原子または臭素原子を意味
する。 上記のFlのうつ（Fl−１）で表わされる化合物
は、吸収極大波長と螢光極大波長との差が大きく
本発明にとつてより好ましいものである。 以下に一般式（）Ｑ−Flで示される本発明に
用いる発螢光物質の代表例を以下に示すが、本発
明の範囲はこれらの化合物のみに限定されるもの
ではない。 一般式（）Ｑ−Flで示される化合物は、螢光
化合物部分（Fl）に当る化合物が市販されている
ので、それを原料とし、２当量カプラーの従来か
ら公知の合成法を応用して容易に合成できる。前
述の公知の合成法については、特開昭50−123342
号公報、同50−159336号公報、同51−117032号公
報、同51−146828号公報、米国特許第3737316号
明細書、同第3253924号明細書などに記載されて
いる。 次に、一般式（）で示される化合物のうち代
表的なものについて合成法を例示する。以下に具
体的に示されていない化合物も合成例１〜合成例
４に順じて容易に行なうことができる。 合成例 １ （化合物例−１の合成） ドイツ国特許1124356号に記載されている方法
により合成したα−ピバロイル−３，５−ジカル
ボメトキシアセトアニリド3.35ｇ（10ミリモル）
を塩化メチレン35mlに溶解し、氷冷下５℃以下で
臭素1.8ｇ（11.3ミリモル）を滴下し、α−ブロ
モ誘導体に導びいた。このα−ブロモ体の溶液を
飽和食塩水および水で洗浄した後、４−メチルウ
ンベリフエロン4.14ｇ（23.5ミリモル）、トリエ
チルアミン3.1ml、塩化メチレン10mlおよびＮ，
Ｎ−ジメチルホルムアミド（DMF）５mlから成
る溶液に水冷下18℃以下で滴下した。反応混合物
を1N水酸化ナトリウム水溶液、1N塩酸および１
％炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した後、無水
硫酸ナトリウムで乾燥した。塩化メチレンを留去
し、残渣をアセトニトリル／メタノールの混合溶
媒より再結晶することにより、α−ピバロイル−
α−4′−メチルウンベリフエリル−３，５−ジカ
ルボメトキシアセトアニリド4.55ｇ（収率89.5
％）が得られた。融点254〜256℃このジメチルエ
ステル2.55ｇ（５ミリモル）を30mlのメタノール
に懸濁し、これに水酸化ナトリウム0.6ｇ（15ミ
リモル）および水15mlから成る溶液を加えた。０
℃で1.5時間反応させた後、4.5mlの濃塩酸を加
え、生じた沈澱を取した。水洗、風乾を行なつ
た後、酢酸より再結晶し、目的化合物（−１）
2.05ｇ（収率85.3％）が得られた。融点267℃分
解 合成例 ２ （化合物−19の合成） ４−メチルウンベリフエロン17.6ｇ（0.1モル）
を塩化メチレン40mlおよびDMF17mlに懸濁し、
さらにトリエチルアミン14mlを加えて均一な溶液
にした。これを流水で18℃以下に冷却し、撹拌し
ながら、α−クロロアセト酢酸エチル16.5ｇ
（0.1モル）と塩化メチレン10mlとから成る溶液を
約30分間で滴下した。この後30℃で更に24時間撹
拌を続けた。次いで反応混合物を水３回洗浄した
後、塩化メチレン溶液を無水硫酸ナトリウムで乾
燥した。乾燥後、塩化メチレンを減圧下で留去
し、残渣にエタノール50mlを加え、室温で撹拌す
ると目的物である化合物−19が析出してくる。
この結晶を取し、エタノールで洗浄し、風乾し
た。 収量21.5ｇ（70.7％）、融点105〜106℃ 合成例 ３ （化合物−20の合成） 化合物−19 15.2ｇ（0.05モル）、フエニルヒ
ドラジン5.4ｇ（0.05モル）にエタノール250mlを
加え、３時間還流撹拌を行なつた。室温に冷却し
た後、エタノールを減圧留去した。残渣を酢酸エ
チル：ヘキサン＝１：１で再結晶し、目的化合物
−20を得た。 収量10.6ｇ（60.9％）、融点163〜165℃ 合成例 ４ （化合物−14の合成） Ｎ，Ｎ−ビス−（２−ヒドロキシエチル）−
N′−メチル−３−メチル−ｐ−フエニレンジア
ミン11.2ｇ（0.05モル）および２−（４−メチル
クマリン−７−オキシカルボニル）ベンゼンスル
ホニルクロリド16.9ｇ（0.05モル）を窒素気流下
で、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド150mlに溶解
し、これにピリジン５mlを氷冷下５℃で滴下し
た。滴下終了後室温で２時間撹拌を続けた。反応
混合物を稀塩酸に注ぎ、生じた結晶を取し、水
洗乾燥を行なつた。この粗結晶をエタノールから
再結晶し、目的の化合物−14を得た。 収量22.3ｇ（78.8％）、融点187〜190℃ 本発明にて用いられる水素供与体としては、一
般式（）のＱとFlとの結合位置を攻撃しえる水
素供与体であり、好ましくは下記の一般式（）
にて示される化合物である。 ここで、ａは、ヒドロキシ基、アミノ基、−
NHR、−NRR′（ここでＲおよびR′は炭素数１〜
５のアルキル基、炭素数３〜６のシクロアルキル
基、炭素数１〜５のヒドロキシアルキル基、アシ
ルアミノアルキル基（例えばメタンスルフオニル
アミノアルキル基、アセチルアミノアルキル基な
どＲとR′とで環を形成してもよい。）を表わす。 Z1、Z2は水素原子、炭素数１〜５のアルキル基
（例えばメチル基、エチル基など）、炭素数１〜５
のアルコキシ基、ハロゲン原子（例えば塩素原
子、臭素原子、フツ素原子など）、カルボキシル
基、メタンスルフオニル基、フエニル基などを表
わし、Z1とZ2とでシクロアルケン、芳香族環、複
素環を形成していてもよい。具体的には、ベンゼ
ン環、ピラゾール環、ナフタレン環などを表わ
す。 ｎは正の整数であり、一般式には１〜５、好ま
しくは１または２である。 本発明に用いられる水素供与体の代表的なもの
としては、４−アミノアンチピリン、ｐ−アミン
フエノール誘導体、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ｐ−フ
エニルレンジアミン誘導体などがある。 この他、L.F.A.Mason著Photographic
Processing Chemistry（Focal Press刊、1966年）
の226〜229頁、T.H.James編 The theory of
the Photographic Process（4th ed.、
Macmillan Publishing Co.、Inc.刊）の311〜
320頁、米国特許2193015号、同2592364号、特開
昭48−64933号などに記載のものを用いることが
できる。 以下にそれらの具体例を示すが、本発明の範囲
はこれらの化合物のみに限定されるものではな
い。 および、これらの鉄酸塩あるいは有機酸塩、 本発明の定量試薬の他の有効成分であるペルオ
キシダーゼは過酸化水素による水素供与体の酸化
反応の触媒であり、如何なる起源のペルオキシダ
ーゼでも使用可能である。 本発明の定量用試薬は各有効成分をそれぞれ別
個に粉末状固体として、又は水もしくは緩衝液中
の溶液として調製し、使用時すなわち定量する際
にこれらの形の各成分を任意に組合わせるか、あ
るいは粉末状成分の混合物又は各成分を含有する
水もしくは緩衝液中の溶液として調整することが
できる。最後の場合には各成分を同時に又は任意
の順序で溶解してもよい。 本発明の定量用試薬の過酸化水素との反応（発
螢光反応）は次式により示される。 この反応により式（）の螢光物質（この場合
は４−メチルウンベリフエロン）が生成する。そ
して生成した螢光物質の螢光の測定より過酸化
水素の定量を行なうことができる。 本発明の定量用試薬を用いて、任意のH2O2濃
度を有する試料からH2O2を高精度で定量するこ
とができるようになつた。本発明の定量法は、例
えば次のように実施することができる。試料に発
螢光物質（）および水素供与体、反応触媒とし
てのペルオキシダーゼを前記の形で同時にあるい
は任意の順序で添加し、混合物を５〜40℃の温度
及び3.0〜9.0のPHにおいて、好ましくは１〜60分
間反応させ、生成した螢光物質（Fl−OHタイプ
のものとしては例えばウンベリフエロン誘導体あ
るいはフルオレセイン誘導体など、Fl−NH2タ
イプのものとしては例えば７−アミノクマリン誘
導体など）を含有する反応混合物をPH8.0〜10.5
で280〜500nｍの波長の光を用いて励起し、400
〜650nｍにおける光の螢光強度を測定する。 本方法は過酸化水素の微量定量に特に有利であ
る。 試料中のH2O2濃度は一般に0.02〜200nｇ／ml
（総反応容量系）であることが好ましい。この
H2O2濃度において発螢光物質は0.50〜10μmol／
ml、水素供与体は１〜10nmol／ml、ペルオキシ
ダーゼは0.1〜1.0単位／ml（いずれも総反応容量
系）の量で用いられる。 本発明の定量試薬の有効成分（）、水素供与
体およびペルオキシダーゼのほかに、さらに酸化
酵素を組合わせることによつてより広範囲の測定
が可能となる。すなわち、酸化酵素を最終的に定
量すべき物質が酸化酵素の作用により過酸化水素
を生成する場合に併用することによつて、過酸化
水素の定量によつて目的とする種々の物質の定量
が可能になる。具体的には、尿および体液成分に
は、グルコース、尿酸、コレステロール、トリグ
リセリド、乳酸、クレアチニン、遊離脂肪酸、グ
ルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ、グル
タミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ、コリ
ンエステラーゼ、クレアチンホスホキナーゼ、乳
酸脱水素酵素などを測定することができる。 これらの測定に用いる酸化酵素としては、グル
コースオキシダーゼ、ウリカーゼコレステロール
オキシダーゼ、Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダ
ーゼ、ピルビン酸オキシダーゼなどが挙げられ
る。これらの酸化酵素はいかなる起源のものでも
よく固体粉末の形で用いでもよいが、好ましくは
水もしくは特に緩衝液中の溶液として用いられ
る。 酸化酵素を併用する場合には、酸化酵素の作用
により、H2O2をあらかじ生成させてもよいが、
H2O2生成反応と発螢光反応を同時に進行させる
ことが好ましい。この場合も酸化酵素を試料に添
加する時期は任意であつてよく、一般式（）、
水素供与体又はペルオキシダーゼと同時に又は四
者を同時に添加してもよい。酸化酵素の使用量は
その種類、目的とする基質または混在物質などに
応じて適宜決められる。 本発明は、通常の化学実験における過酸化水素
の定量に好適であるばかりでなく、近年急速に普
及しつつある酵素学的分析方法を用いた臨床検査
のうち、尿および体液中のグルコース、尿酸、コ
レステロール、トリグリセリド、乳酸、クレアチ
ニン、遊離脂肪酸、グルタミン酸ピルビン酸トラ
ンスアミナーゼ、グルタミン酸オキザロ酢酸トラ
ンスアミナーゼ、コリンエステラーゼ、クレアチ
ンホスホキナーゼ、乳酸脱水素酵素などを測定す
る方法として、それぞれの系における最終的に定
量すべき物質の酸化酵素を作用させて生成した過
酸化水素を定量することにより、目的物を定量す
る方法にも利用できる。また、試薬として有効成
分（）、水素供与体およびH2O2を組合わせれ
ば、ペルオキシダーゼの定量法にも使用でき、例
えばペルオキシダーゼを用いた酵素免疫測定法に
利用できる。 さらに本発明は、人ばかりでなく種々の動物、
例えば、家蓄、愛玩動物その他の尿、体液などの
測定にも利用できる。 以下、実施例を挙げ、本発明を更に詳細に説明
する。 実施例 １ （過酸化水素の定量） 化合物−１ 60mgを特級DMF5mlに溶解し
た。。この溶液0.5mlにPH５の0.1M酢酸緩衝液50
mlを加えた。更に、化合物−19 1.2mgとペルオ
キシダーゼ（シグマ社製54単位／mg）5.5mgを加
え、前述の緩衝液を加え、全量を正確に100mlと
した。………Ａ液 種々の濃度（0.25〜1nmole／ml）の過酸化水
素0.1mlにＡ液１mlを加え、37℃で10分間インキ
ユベーシヨンした。 この反応は次式により示される。 インキユベーシヨン後、PH10の0.1Mグリシン
−NaOH緩衝液2.5mlを加え、生成した４−メチ
ルウンベリフエロンを螢光光度計を用いて、励起
波長358nｍ、螢光波長448nｍで測定した。 測定により得られた螢光強度と過酸化水素量と
の関係は第１図に示したように直線となつた。 このように、本発明の方法によればPH５という
低PH域においても満足いく値が得られた。 実施例 ２ （過酸化水素の定量） 実施例１の化合物−１の代りの化合物−19
と化合物−19とを用いて実施例１と同様に種々
の濃度（0.25〜1nmole／ml）の過酸化水素水の
測定を行なつた。生成した４−メチルウンベリフ
エロンを螢光光度計を用いて励起波長358nｍ、
螢光波長448nｍで測定した。 測定により得られた螢光強度と過酸化水素との
関係は第２図に示したようになつた。 実施例 ３ （過酸化水素の定量） 実施例２において、PH５の0.1M酢酸緩衝液50
mlを、第１表に示したPH６、PH７、PH８及びPH９
の緩衝液と代えて同様にPHの異なる４種のＡ液を
調製した。更に、0.5nmole／mlの過酸化水素水
0.1mlにＡ液１mlを加えて、37℃で10分間インキ
ユベーシヨンした。インキユベーシヨン後、PH10
の0.1Mグリシン−NaOH緩衝液2.5mlを加え、同
様に螢光強度を各々測定し、結果を第１表に示し
た。 次に、化合物−19及び−19の代りに、化合
物−６及び−１を用いて、上記の方法と同様
にして螢光強度を各々測定した。また、化合物
−19及び−19の代りに、化合物−７及び−
４を用いて、上記の方法と同様にして螢光強度を
各々測定し、これらの結果を第１表に示した。 一方、本発明の化合物の代りに、ジアセチルフ
ルオレスシンを用いた従来法にて、同様に各PHの
緩衡液を用いて螢光強度を測定し第１表に示し
た。
【表】
第１表よりわかるように、本発明の方法によれ
ば、従来法に比べて、PH５〜９といつた広い領域
において著しく高感度の測定を行なうことができ
るため、酸化酵素の至適PHに合わせた測定も可能
となり、測定精度、操作の簡易性及び迅速性、経
済性を向上させることができる。 実施例 ４ （コレステロールの測定） 化合物−６、60mgを特級DMF5mlに溶解し
た。この溶液0.5mlにPH６の0.1Mリン酸緩衝液50
mlを加えた。更に化合物−１、1.2mg、コレス
テロールオキシダーゼ（シグマ社製20単位／mg）
１mgとペルオキシダーゼ（シグマ社製54単位／
mg）5.5mgを加え、前述の緩衝液を加え、全量を
正確に100mlとした。……Ａ液 コレステロール200mgに前述の緩衝液を加え、
全量を正確に100mlとし、これを更に100倍に希釈
した。……Ｂ液 Ｂ液10μを試験管にとり、Ａ液１mlを加えて
37℃で10分間インキユベーシヨンした。インキユ
ベーシヨン後、PH10の0.1Mグリシン−NaOH緩
衝液2.5mlを加え、生成したフルオレセインを螢
光光度計を用いて、励起波長494nｍ、螢光波長
520nｍで測定し、55の螢光強度を得た。 このように、本発明の方法によればPH６という
低PH域においても満足いく値が得られた。 実施例 ５ （グルコースの測定） 化合物−７、60mgを特級DMF5mlＣに溶解し
た。この溶液0.5mlにPH５の0.1M酢酸緩衝液50ml
を加えた。更に化合物−４ 1.2mg、グルコー
スオキシダーゼ（シグマ社製125単位／mg）3.3mg
とペルオキシダーゼ（シグマ社製54単位／mg）
5.5mgを加え、前述の緩衝液を加え、全量を正確
に100mlとした。……Ａ液 グルコース200mgに前述の緩衝液を加え、全量
を正確に100mlとし、これを更に100倍に希釈し
た。……Ｂ液 Ｂ液10μを試験管にとり、Ａ液１mlを加えて
37℃で10分間インキユベーシヨンした。インキユ
ベーシヨン後、PH10の0.1Mグリシン−NaOH緩
衝液2.5mlを加え、生成した４−メチルウンベリ
フエロンを螢光光度計を用いて、励起波長358n
ｍ、螢光波長448nｍで測定した。螢光強度は85
であつた。 このように、本発明の方法によればPH５という
低PH域においても満足しえる測定が行なうことが
できた。 実施例 ６ （尿酸の測定） 化合物−９、60mgを特級DMF5mlに溶解し
た。この溶液0.5mlにトリトンＸ−100 100mgとPH
８の0.1Mホウ酸緩衝液50mlを加えた。更に化合
物−３ 1.2mg、ウリカーゼ（シグマ社製17.1
単位／mg）1.0とペルオキシダーゼ（シグマ社製
54単位／mg）5.5mgを加え、前述の緩衝液を加え、
全量を正確に100mlとした。……Ａ液 尿酸10mgに前述の緩衝液を加え、全量を正確に
100mlとし、これを更に10倍に希釈した。……Ｂ
液 Ｂ液10μを試験管にとり、Ａ液１mlを加えて
37℃で10分間インキユベーシヨンした。インキユ
ベーシヨン後PH10の0.1Mグリシン−NaOH緩衝
液2.5mlを加えて生成したウンベリフエロンを螢
光光度計を用いて励起波長366nｍ、螢光波長
455nｍで測定した。螢光強度は38であつた。 このように、本発明の方法によれば、PH８とい
う比較的高PH域においても十分な測定を行なうこ
ことができた。 実施例 ７ （コレステロールの測定） 実施例３の化合物−６に替えて化合物−18
を用い、化合物−１に替えて化合物−19を用
いて、実施例３と同様の測定を行なつたところ、
36の螢光強度を得た。 このように本発明の方法によれば、低PH域にお
いても実施例３と同様に好ましい測定を行なうこ
とができた。
ば、従来法に比べて、PH５〜９といつた広い領域
において著しく高感度の測定を行なうことができ
るため、酸化酵素の至適PHに合わせた測定も可能
となり、測定精度、操作の簡易性及び迅速性、経
済性を向上させることができる。 実施例 ４ （コレステロールの測定） 化合物−６、60mgを特級DMF5mlに溶解し
た。この溶液0.5mlにPH６の0.1Mリン酸緩衝液50
mlを加えた。更に化合物−１、1.2mg、コレス
テロールオキシダーゼ（シグマ社製20単位／mg）
１mgとペルオキシダーゼ（シグマ社製54単位／
mg）5.5mgを加え、前述の緩衝液を加え、全量を
正確に100mlとした。……Ａ液 コレステロール200mgに前述の緩衝液を加え、
全量を正確に100mlとし、これを更に100倍に希釈
した。……Ｂ液 Ｂ液10μを試験管にとり、Ａ液１mlを加えて
37℃で10分間インキユベーシヨンした。インキユ
ベーシヨン後、PH10の0.1Mグリシン−NaOH緩
衝液2.5mlを加え、生成したフルオレセインを螢
光光度計を用いて、励起波長494nｍ、螢光波長
520nｍで測定し、55の螢光強度を得た。 このように、本発明の方法によればPH６という
低PH域においても満足いく値が得られた。 実施例 ５ （グルコースの測定） 化合物−７、60mgを特級DMF5mlＣに溶解し
た。この溶液0.5mlにPH５の0.1M酢酸緩衝液50ml
を加えた。更に化合物−４ 1.2mg、グルコー
スオキシダーゼ（シグマ社製125単位／mg）3.3mg
とペルオキシダーゼ（シグマ社製54単位／mg）
5.5mgを加え、前述の緩衝液を加え、全量を正確
に100mlとした。……Ａ液 グルコース200mgに前述の緩衝液を加え、全量
を正確に100mlとし、これを更に100倍に希釈し
た。……Ｂ液 Ｂ液10μを試験管にとり、Ａ液１mlを加えて
37℃で10分間インキユベーシヨンした。インキユ
ベーシヨン後、PH10の0.1Mグリシン−NaOH緩
衝液2.5mlを加え、生成した４−メチルウンベリ
フエロンを螢光光度計を用いて、励起波長358n
ｍ、螢光波長448nｍで測定した。螢光強度は85
であつた。 このように、本発明の方法によればPH５という
低PH域においても満足しえる測定が行なうことが
できた。 実施例 ６ （尿酸の測定） 化合物−９、60mgを特級DMF5mlに溶解し
た。この溶液0.5mlにトリトンＸ−100 100mgとPH
８の0.1Mホウ酸緩衝液50mlを加えた。更に化合
物−３ 1.2mg、ウリカーゼ（シグマ社製17.1
単位／mg）1.0とペルオキシダーゼ（シグマ社製
54単位／mg）5.5mgを加え、前述の緩衝液を加え、
全量を正確に100mlとした。……Ａ液 尿酸10mgに前述の緩衝液を加え、全量を正確に
100mlとし、これを更に10倍に希釈した。……Ｂ
液 Ｂ液10μを試験管にとり、Ａ液１mlを加えて
37℃で10分間インキユベーシヨンした。インキユ
ベーシヨン後PH10の0.1Mグリシン−NaOH緩衝
液2.5mlを加えて生成したウンベリフエロンを螢
光光度計を用いて励起波長366nｍ、螢光波長
455nｍで測定した。螢光強度は38であつた。 このように、本発明の方法によれば、PH８とい
う比較的高PH域においても十分な測定を行なうこ
ことができた。 実施例 ７ （コレステロールの測定） 実施例３の化合物−６に替えて化合物−18
を用い、化合物−１に替えて化合物−19を用
いて、実施例３と同様の測定を行なつたところ、
36の螢光強度を得た。 このように本発明の方法によれば、低PH域にお
いても実施例３と同様に好ましい測定を行なうこ
とができた。
第１図は、実施例１にて得られた過酸化水素の
検量線である。横軸は、過酸化水素の濃度であ
り、縦軸は、相対螢光強度（螢光波長448nｍ）
である。第２図は、実施例２にて得られた過酸化
水素の検量線である。横軸は、過酸化水素の濃度
であり、縦軸は、相対螢光強度である。
検量線である。横軸は、過酸化水素の濃度であ
り、縦軸は、相対螢光強度（螢光波長448nｍ）
である。第２図は、実施例２にて得られた過酸化
水素の検量線である。横軸は、過酸化水素の濃度
であり、縦軸は、相対螢光強度である。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56036050A JPS57150399A (en) | 1981-03-13 | 1981-03-13 | Reagent for determining hydrogen peroxide and its determination method |
| EP82101947A EP0060518B2 (en) | 1981-03-13 | 1982-03-11 | Reagent for assaying hydrogen peroxide and method of quantitative assay for hydrogen peroxide |
| DE8282101947T DE3264721D1 (en) | 1981-03-13 | 1982-03-11 | Reagent for assaying hydrogen peroxide and method of quantitative assay for hydrogen peroxide |
| US06/862,195 US4853328A (en) | 1981-03-13 | 1986-05-09 | Reagent for assaying hydrogen peroxide and method of quantitative assay for hydrogen peroxide |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56036050A JPS57150399A (en) | 1981-03-13 | 1981-03-13 | Reagent for determining hydrogen peroxide and its determination method |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| JP (1) | JPS57150399A (ja) |
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| US5851785A (en) * | 1992-02-04 | 1998-12-22 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Method of quantitative determination of substances using coumarin derivatives |
| US5332662A (en) * | 1992-07-31 | 1994-07-26 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Methods for determining peroxidatively active substances |
| RU94044169A (ru) * | 1994-12-16 | 1996-10-20 | И.А. Кочетов | Многослойный аналитический элемент |
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| JP2001026506A (ja) * | 1999-04-28 | 2001-01-30 | Takeda Chem Ind Ltd | スルホンアミド誘導体 |
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|---|---|---|---|---|
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| US3351482A (en) * | 1961-02-21 | 1967-11-07 | Bayer Ag | Synthetic textiles brightened with 3-phenyl-7-hydroxy-coumarin |
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| DE2034306A1 (de) * | 1970-07-10 | 1972-01-20 | Boehnnger Mannheim GmbH, 6800 Mann heim Waldhof | 2 (3,4 Dimethyl-cumarin 7 yl) oxy alkylcarbonsaure Derivate und Verfahren zu ihrer Herstellung |
| JPS51105819A (ja) * | 1975-03-14 | 1976-09-20 | Fuji Photo Film Co Ltd | Shashinyokatsupuringukagobutsu |
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1981
- 1981-03-13 JP JP56036050A patent/JPS57150399A/ja active Granted
-
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- 1982-03-11 DE DE8282101947T patent/DE3264721D1/de not_active Expired
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- 1986-05-09 US US06/862,195 patent/US4853328A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0060518B1 (en) | 1985-07-17 |
| DE3264721D1 (en) | 1985-08-22 |
| JPS57150399A (en) | 1982-09-17 |
| EP0060518B2 (en) | 1988-09-21 |
| US4853328A (en) | 1989-08-01 |
| EP0060518A1 (en) | 1982-09-22 |
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