PT594047E - Cromoionoforos arilazo - Google Patents

Description

1 DESCRIÇÃO "CROMOIONÓFOROS ARILAZO"

Antecedentes do invento O cálcio é um dos mais importantes elementos encontrados no corpo. E necessário não só para o esqueleto mas também para a células. Existe, em média, cerca de um quilograma de cálcio no corpo humano do qual 99% está localizado nos ossos com o restante 1% distribuído pelo plasma, fluidos extracelulares e compartimentos inter-celulares. Esta pequena fracção, no entanto, joga um papel vital em muitas funções bioquímicas e fisiológicas tais como um regulador e mensageiro de célula. Estas funções incluem a formação do osso e hemostasia, manutenção da integridade e permeabilidade da membrana da célula, excitação do nervo, contracção muscular e coagulação do sangue em conjunto com a regulação de muitas reacções de enzima e hormona. A concentração de cálcio nos fluidos do corpo, particularmente no plasma, precisa de se manter dentro de uma gama muito apertada. O seu nível é controlado por um determinado número de hormonas, principalmente por hormona paratiróide (PTH), e calcitonina. A PTH é libertada a partir da glândula paratiróide em resposta a uma diminuição da concentração de cálcio no plasma e indirectamente promove a absorção de cálcio no intestino e túbulos renais e aumenta a mobilização de cálcio a partir dos ossos. Calcitonina, que inibe a actividade PTH no tecido ósseo, é segredada pela glândula da tiróide em resposta a um aumento em ião de cálcio.

Desvios dos níveis normais de cálcio ocorrem em determinadas - 2 -

doenças. Níveis de cálcio significativamente abaixo do normal podem ser indicativos de hipoparatiroidismo, deficiência de vitamina D ou nefritis. Níveis de cálcio aiores que o normal podem indicar hiperparatiroidismo, intoxicação com vitamina D e mieloma. O valor normal do total de cálcio no plasma é de cerca de 2,4 mM/1. Geralmente, as crianças têm a maior concentração de cálcio que declina levemente com a idade. A determinação do cálcio no soro começa com o método gravimétrico no qual o cálcio é precipitado com oxalato de amónio depois do que o precipitado é seco e pesado. Este método foi melhorado depois em 1921 quando havia referência a uma técnica na qual o oxalato de cálcio é dissolvido em ácido sendo o oxalato determinado por titulação com permanganato de potássio. Uma modificação deste método, no qual o processo de lavagem e temperatura foram normalizados durante a titulação, foi utilizado como processo primário para determinação de cálcio. Enquanto razoavelmente exactos, estes processos requerem grandes quantidades de soro e tempo. Uma titulação complexométrica mais sensível e rápida foi introduzida em 1940 a qual utilizou murexida como indicador. Vários outros indicadores, por exemplo calcon, calceína, azul de metiltimol, preto T de ericromio, glioxal cis-(2-hidroxianil) e arsenazo III, foram subsequentemente introduzidos. Independentemente do que foi utilizado como indicador, estes métodos complexométricos de titulação requerem um grande volume de amostra de soro, são demorados e apresentam um ponto de viragem mal definido assim como interferências de iões de metal diferentes de cálcio.

Mais recentemente, o método de titulação foi substituído por um método espectrofotométrico utilizando vários indicadores metalocrómicos, o mais popular dos quais é o método de complexo orto-cresolftaleina (CPC). Neste método, o cálcio combina com CPC numa solução alcalina (pH 10,5 até 12) para formar num complexo calcium-corante. A absorção do corante aumenta para 575 nm e é proporcional à concentração do cálcio na amostra. A desvantagem deste método é a exigência de ser efectuado com um pH numa gama de 10 até 12. Neste nível de pH, o reagente pode absorver dióxido de carbono resultando na flutuação da linha de base.

Complexos coloridos de formas de Arsenazo III com muitos catiões bivalentes e trivalentes podem ser utilizados para determinar quantidades micromolares de ião de cálcio a pH 5,5 sem interferência significativa do ião de magnésio. Este reagente tem uma alta afinidade com ião de cálcio no pH fisiológico, um alto coeficiente de extinção do complexo de cálcio-corante a 650 nm e mostra alta estabilidade química em soluções aquosas. Portanto tomou-se uma ferramenta útil para determinar as concentrações micromolares de cálcio em células singulares. Enquanto arsenazo III é largamente utilizado por pesquisadores em estudos de transporte de cálcio em células e fracções de células, a sua utilidade em química clínica tem sido limitada devido à presença de porções tóxicas de arsénico e sua concomitante segurança e aspectos ambientais.

Em Biochemistrv 19 (1980) Tsien refere a preparação de 2-[[2-bis(carboxilmetil)amino]-5-metilfenoxi]metil]-8-[bis(carboxilmetil)amino]-qui-nolina (QUIN1) e seu análogo 6-metoxi (QUIN2). Estes compostos são descritos como tendo utilidade como ionóforos de cálcio fluorescente. Numa publicação posterior (J. Biol. Chem., 260, 3440 (1985), Tsien et al. descreve a monitorização da fluorescência de QUIN2 como sendo o método mais popular para a medição de [Ca++]. Eles destacam que, enquanto QUIN2 tem revelado informação biológica muito importante, a sua utilização tem algumas limitações inerentes uma vez que o seu comprimento de onda de excitação preferido de 339 nm é demasiado baixo. Também é destacado que o seu coeficiente de extinção (<5000) e rendimento quantum de fluorescência (0,03 até 0,14) são também demasiado baixos. Adicionalmente, a autofluorescência das células requer carregamentos QUIN2 de vários décimos de milimolar ou mais para se obter um resultado satisfatório. Também é destacado que QUIN2 sinaliza Ca++ por aumento da sua intensidade de fluorescência sem alterar muito quer o comprimento de onda de excitação quer em comprimento de ondas de emissão e que existe a necessidade de um indicador que responda ao cálcio por alteração dos comprimentos de onda enquanto se mantém forte fluorescência. Outra deficiência referida para QUIN2 é que a sua selectividade para o cálcio em relação ao magnésio e catiões bivalentes de metal pesado poderia ser melhorada. Este artigo destaca que compostos que têm um fluoróforo de estilbeno e um padrão tetracarboxilato octocoordenado de grupos ligantes característicos de EGTA, [(éter bis(P-aminoetil) de etileno glicol] e BAPTA, [ácido l,2-bis(o-aminofenoxi)etano-N,N,N’,N’-tetra-acético] são preferíveis ao QUIN2. Esta preferência é baseada em vários factores tais como a selectividade melhorada para Ca++ e a capacidade e BAPTA e EGTA para mostrar fluorescência muito mais forte em conjunto com alterações de comprimento de ondas na ligação Ca+T. A preparação e utilidade destes compostos também é revelada na Patente U.S. 4.603.209 para Tsien et al.

Mais recentemente Toner et al., revelou derivados cromáticos de BAPTA e compostos semelhantes a BAPTA na Patente U.S. 4.795.712. Eles referem que os compostos fluorogénicos de Tsien sofrem de várias desvantagens de absorção na região ultravioleta do espectro, de maneira a que constituintes normais dos fluidos do corpo que também absorvem nos UV e comprimentos de onda visíveis curtos tendem a produzir interferência de fundo com equipamento e procedimentos colorimétricos normalizados. Eles continuam a dizer que seria desejável ter compostos de complexo de cálcio altamente selectivos que seriam detectáveis com comprimentos de onda superiores (acima de 400 nm) e se desviariam para outros comprimentos de onda quando complexados com cálcio para permitir análises quantitativas de cálcio sem interferência de espécies que absorvem a luz visível de comprimento de ondas curto e radiação UV. O presente invento baseia-se na descoberta de derivados arilazo de QUIN1 e QUIN2 podem ser efectivamente utilizados para determinação colorimétrica de Ca** desde que sejam altamente selectivos para cálcio num meio que também contém ião de magnésio. Adicionalmente, estes compostos absorvem luz de maior comprimentos de onda do que fazem os BAPTA sujeitos a derivatização de modo semelhante e mostram uma significativamente maior alteração na absorvência máxima dos compostos complexados versus compostos não complexados do que fazem os correspondentes compostos BAPTA cromogénicos.

Sumário do Invento O presente invento envolve cromoionóforos de arilazo cálcio caracterizados pela fórmula A:

R

Na fórmula anterior, X é hidrogénio ou um catião monovalente, Y é H ou metoxi e R é um anel aromático ou heteroaromático, substituído ou insubstituído, de cinco ou seis membros ou um sistema de anel condensado feito de anéis heteroaromáticos ou aromáticos, substituídos ou insubstituídos, de cinco - 6 -

ou seis membros.

Também incluídos no âmbito do presente invento está a utilização destes cromóforos na determinação quantitativa de ião de cálcio.

Descrição do invento A síntese dos cromoionóforos do presente invento é ilustrada pelo seguinte esquema I no qual o substituinte Y previamente mencionado é hidrogénio.

ESQUEMA I

Com referência ao Esquema I, os indicadores de cálcio 14 - 41 (Quadro 2) são preparados utilizando quer o método 1 ou 2 como aqui mencionado. O Método 1 envolve o acoplamento aromático de um sal diazónio R-N2+ com I para se conseguir intermediários tetra-éster arilazo 2 - ϋ (Quadro 1) seguido da hidrólise básica para se conseguir os indicadores de cálcio 14 até 23 (Quadro 2). No caso de QUIN2, o material de partida l terá um grupo 6-metoxi. QUADRO 1

cocei cocei =**» Ç006* ν' i

Composto R Y 2 NOt H 3 NO, H 4 NO, H

5 NO, H 6 NO, H 7 -<§>-NO> H 8 -0 H 9 f ^NO, H ΙΟ C! -^Ç)}-no* H U H 12 -<§>-no· och3 51 NO, 52 -©>-N0' O Método 2 primeiro hidrolisa os ésteres de I para dar JJ3 depois faz o acoplamento entre estes com o sal diazónio aromático para conseguir indicadores 24 - 4L O método 1 tem uma vantagem desde que os intermediários arilazo-tetraéster sejam altamente cristalinos e facilmente purificados por cristalização simples. A sua hidrólise básica sob condições preferidas, isto é, com uma quantidade estequiométrico ou ligeiro excesso de 4,0 Μ KOH ou LiOH em álcool n-butílico, produz os compostos indicadores de cálcio directamente numa forma pura, facilmente colectável e altamente solúvel na água a qual não requer purificação adicional. O método 2 tem uma vantagem em relação à síntese de certos análogos lábeis com as condições de hidrólise básica. Alguns análogos podem ser feitos por aqueles métodos e a seguir são dados métodos sintéticos representativos. Todos os materiais de partida estão prontamente disponíveis para os peritos em síntese orgânica.

Compostos indicadores de cálcio 43 - 49 (Quadro 2) incorporam um substituinte 6-metoxi no anel quinolona e são conhecidos na técnica como compostos QUIN2 em contraste com aqueles que são insubstituídos na posição 6 referida como compostos QUIN1. Estes podem ser preparados a partir de ácido livre QUIN2 disponível comercialmente, composto 42, X = H, (a partir de MTM Research Chemicals, Windham, New Hampshire, USA) pela reacção com um sal diazónio aromático apropriado (R - N2+) utilizando o método 1. Altemativamente, tetra-etiléster de QUIN2, também disponível a partir de MTM pode ser acoplado primeiro com um sal diazónio aromático para dar um tetraéster arilazo QUIN2 (por exemplo 12) o qual é hidrolizado sob condições básicas para dar o composto indicador de cálcio (por exemplo 48) pelo método 2 de acordo com o Esquema Γ:

ESQUEMA Γ A estrutura e comprimentos de onda de absorção máxima para compostos 14 - 41 e 43 - 49 são estabelecidos no Quadro 2. 11 QUADRO 2 11

Xmax (nm) pH=9

Composto R Y X Método -Ca++ +Ca++ 14 NO, H K I 508 363 15 -©-f H K I 510 370 16 NO, H K I 520 373 12 NO, H K I 532 365 J_8 NO, H K I 538 370 12 H^-NO, H K I 544 383 20 -0 H K I 548 404 21 -^>-NOt H K I 560 387 22 Cl H K I 560 389 23 ê® H K I 580 414 24 NO, H^-SO,OH H H 11 524 370 25 Cl ~@K50*\_J0,OM ^ei H H II 546 380 26 SO,CH, -^-NO* H H II 594 396 27 NO, -©>-NO< H H II 584 378 43 NO, och3 H II 508 404 44 Cl NO, och3 H II 510 410 45 NO, och3 H II 516 410 46 _-HO, 'uo, och3 H II 518 410 47 och3 H II 528 — 48 och3 K I 536 408 49 C1 -^-NOt och3 H II 560 422 28 H H II 460,560 450 29 TXT H H II 575 432 30 αχ CH, H H II 576 420 31 χν\ H-^<Ϊ^ΑθΗ, CH^ H H II 577 422 32 iDO H H II 580 414 33 αχ H H II 580 430 34 COT0" H H II 580 420 35 «x H H II 585 430 36 H H II 588 486 37 tXf H H II 590 426 38 -CÇk· α H H II 592 422 39 txf H H II 595 428 40 tXT" H H II 607 41 σ H H II 600 "

Compostos indicadores de cálcio tais como 54 - 58 (Quadro 3) são derivados arilazo de BAPTA como revelado na Patente U.S. 4.795.712 anteriormente mencionada. Estes compostos podem ser preparados a partir de compostos tetraéster BAPTA 50_ (Y = 5-CH3) pelo método revelado em J. Biol. Chem. 260, 3440 (1985) ou (Y = 4-terc-C4H()) pelo método revelado na referida Patente U.S. 4.795.712 como ilustrado no Esquema II.

«I - 15

ESQUEMA II QUADRO 3

Composto R Y X Método -Ca++ +Ca++ 54 NO, 5-CH3 LI I 468 366 55 5-CH3 LI I 506 382 56 5-CH3 H II 518 404 57 NO, 5-CH3 H II 540 388 SOtCH, 58 -^>-NO, 4-T-Bu H II 576 424

Os análogos 5 arilazo-BAPTA (54 - 58) foram preparados de maneira a demonstrar as características indicadoras de cálcio superiores dos compostos arilazo-QUIN por comparação directa de BAPTA e análogos QUIN com as mesmas porções arilazo substituídas. O Quadro 4 resume os dados de espectro visíveis para os indicadores (-Ca++) não complexados e os indicadores (+Ca++) complexados de metal em tampão de borato a pH = 9,0 como descrito seguidamente sob avaliação de desempenho . QUADRO 4

ο Ό ΓΛ ιη <Ν <Ν ι-Η ιη ίΟ 1-^ οο Ο οο (Ν 't m ^- 00 ο Ο ι— Γ" ίη ίη ίΓ> ι> οο ιη ΙΟ Ο ο ΟΟ 't ο σ\ (Ν 00 νο ο Γ- ro ΓΟ οο οο σ·\ ΙΟ ΙΟ Ο Γ"- ο CN CN <Ν F=\ Ο ζ 1 Ο Ζ _τ 1 V §φ *φ

Com referência ao Quadro 4, é importante notar que os compostos arilazo-QUIN mostram um maior desvio na sua absorção máxima (AÀmax) depois de complexação com Ca++ do que os correspondentes compostos arilazo BAPTA da técnica anterior. Para os cinco pares de compostos estabelecidos no Quadro 4, o aumento do desvio espectral atingiu cerca de 30 a 54 nm.

Um técnico da química de corantes pode antecipar a ληΐ3Χ de um composto arilazo-QUIN não complexado para estar num comprimento de onda maior do que o do correspondente análogo arilazo-BAPTA devido a uma conjugação extendida conseguida pelo sistema de anel quinolina. No entanto, não se pode anticipar ο λ,η3Χ do composto arilazo-QUIN complexedo com metal para ter o mesmo ou mais curto comprimento de onda do que o análogo arilazo-BAPTA. Esta em parte explica o aumento do desvio espectral dos indicadores arilazo-QUIN, que aumentam a oferta de vantagens significativas quando estes compostos são utilizados como indicadores em ensaios de diagnóstico para cálcio em fluidos biológicos. Não é esperado que os compostos arilazo-QUIN sejam de todo adequados para a determinação do cálcio em fluidos biológicos, tais como o sangue humano ou plasma, em que o cálcio está presente a altos níveis numa mistura que contém outros iões de metal tais como magnésio. Deste modo, em J. Biological Chem. 260, 3440 (1985) Giynkiewicz et al. atestam que “a alta afinidade efectiva de QUIN2 para Ca^ é ideal para níveis de medição ... perto 7 10' M, mas também significa que nos níveis micromolares ou superiores, o corante aproxima-se da saturação perde a resolução.”

No sangue humano, os níveis de Ca++ podem atingir 1-20 mg/dl (2,5 x 10'4 até 5 x 10'3 M), e mesmo com uma diluição de 1:100 da amostra num analisador clínico típico a concentração final CaT+ continuará a ser 2,5x10'6 até 5 20 - χ 10° M, a qual está bem dentro da gama micromolar. Inesperadamente, os compostos arilazo-QUIN do presente invento mostram uma resposta linear ao cálcio no soro numa gama de 0-20 mg /dl sem perda de resolução quando a amostra é diluída 1:100 numa solução reagente analítica contendo o indicador.

Referindo-se de novo à referência Grynkiewicz et al., realçam que “a selectividade para QUIN2 para cálcio em relação ao magnésio pode ser melhorada.” Isto é uma importante consideração desde que níveis Mg^ no soro humano sejam tipicamente mais altos do que são os níveis de cálcio e podem ser tão altos como 2,93 mg(dl (1,2 x 10'3M). A interferência por Mg** deverá limitar a utilidade dos indicadores arilazo-QUIN em diagnósticos médicos no entanto não descobrimos interferência significativa a níveis maiores do que 3 vezes mais altas utilizando reagentes que incorporam compostos tais como 14.

Grynkiewicz et al. também referem que “Grande selectividade para a ligação Ca2T em vez de Mg2+ é observada em quelatos tetracarboxilato relacionados nos quais os anéis estão ligados por ligações de éter sem qualquer azoto de anel quinolina.” Contrariamente à duvidas levantadas pela referência, descobrimos que compostos arilazo-QUIN são indicadores muito úteis os quais oferecem vantagens substanciais sobre compostos da técnica anterior para a medição de cálcio em amostras biológicas.

Como referido anteriormente, os compostos arilazo-QUIN do presente invento podem ser ilustrados pela fórmula geral A na qual Y é hidrogénio ou metoxi, e X representa hidrogénio ou um catião monovalente, por exemplo lítio, sódio ou potássio, com o potássio sendo a espécie preferida. A porção R pode ser qualquer de uma grande variedade de estruturas insubstituídas ou substituídas orgânicas aromáticas em anel com porções tais como, por exemplo, alquilo, alcoxi, halo, ciano, nitro, arilo, heteroarilo, ceto ou mesilo as quais completam a estrutura do corante azo e afectam as propriedades de absorção ópticas dos compostos do presente invento. Típicos de R são: 1- Um anel carboxílico aromático substituído ou insubstituído de seis membros. Exemplos de tais anéis de seis membros incluem 2-nitrofenilo; 2-nitro-4-fluorofenilo; 2-nitro-4-clorofenilo; 2-nitro-4-trifluorometilfenilo; 2-nitro-4-cianofenilo; 4-nitrofenilo; 2-fluoro-4-nitrofenilo; 2-cloro-4-nitrofenilo; 3-nitro-4-sulfofenilo; 2,5-dicloro-4-(2’-sulfoetilsulfonamido)fenilo; 2-metano-sulfonil-4-nitrofenilo; 2,4-dinitro-fenilo; 2-cloro-5-nitro-fenilo; ou 3,5-dinitrofenilo. 2 - Um anel de cinco ou seis membros heteroaromático, substituído ou insubstituído, por exemplo, 2-tiazolilo; 4-metil-2-tiazolilo; 4-fenil-2-tiazolilo; 4,5-dimetil-2-tiazolilo; 5-nitro-2-tiazolilo; 5-bromo-2-tiazolilo; 4-carboximetil-2-tiazolilo; 5-nitrofenilsulfonil-2-tiazolilo; 2-piridilo; 4,6-dimetil-2-piridilo; 5-cloro-2-piridilo: 5-bromo-2-piridilo; 3-metil-2-piridilo; 5-bromo-3-nitro-2-piridilo; 3-cloro-5-trifluorometil-2-piridilo; 3,5-dicloro-2-piridilo; 3-nitro-2-piridilo; 4-piridilo; 2,5,6-trifluoro-3-cloro-4-piridilo; 2-metoxi-5-piridilo; 2,6-dimetoxi-3-piridilo; 5-nitro-2-pirimidinilo; 4-metil-2-pirimidinilo; 4,6-dimetil-2-pirimidinilo; 4,6-dimetoxi-2-pirimidinilo; 4-cloro-6-metil-2-pirimidinilo; 5-metil-3-isoxazolilo; 3-metil-5-isoxazolilo; 3-metil-5-isotiazolilo; l-etil-5-pirazolilo; 2-(1,3,4-tiadiazolilo); 5-etil-2-(l,3,4-tiadiazolilo) ou 3-fenil-5-(l,2,4-tiadiazolilo). 3 - Um sistema de anel condensado feito de anéis aromáticos ou heteroaromáticos de cinco ou seis membros, substituídos ou insubstituídos, por exemplo, 4-trifluorometil-6-cloro-2-benzotiazolilo; 1-naftilo; 6-(2’-hidroxietiloxi)-2-benzotiazolilo; 6-terc-butil-2-benzotiazolilo: 4-metil-5-cloro-2-benzotiazolilo; 4,5-dimetil-2-benzotiazolilo; 2-benzotiazolilo; 5-fluoro-2-benzotiazolilo; 6-sulfo-2-benzotiazolilo; 5,6-dicloro-2-benzotiazolilo; 2-β-naftotiazolilo; 4-bromo-6-cloro-2-benzotiazolilo; 4,5-dicloro-2-benzotiazolilo; 6-nitro-2-benzotiazolilo; 4,5,6,7-tetracloro-2-benzotiazolilo; 1-isoquinolilo; 5-isoquinolilo; 6-nitro-5-quinolilo; 5-cloro-2-benzoxazolilo; 5,6-dimetil-2- 22 - benzotiazolilo; 6-etoxi-2-benzotiazolilo; 6-fluoro-2-benzotiazolilo; 4-metoxi-2-benzotiazolilo; 6-metoxi-2-benzotiazolilo; 4-metil-2-benzotiazolilo; ou 6-metil-2-benzotiazolilo. O presente invento é ilustrado adicionalmente pelos seguintes

Exemplos. EXEMPLO 1 A síntese de sal tetrapotássio 2-nitrofenilazo-QUINl (14) e tiazolazo-QUINl (20) são típicas da via do método 1 utilizada para preparar análogos arilazo-QUIN 14 - 23 e 48.

Fase I (Síntese de Tetraéster Intermediário 2): 300 mg (2,18 mmol) 2-nitroanilina e 1,2 ml de HC1 aquoso concentrado foram aquecidos a 50°C durante 1 hora com agitação. A pasta resultante foi diluída com 3,0 ml de água e arrefeceu num banho de gelo durante 5 minutos. Uma solução de 160 mg (2,2 mmol) NaN02 e, 1,0 ml de água foi adicionado rapidamente à solução agitada e mantida num banho de gelo durante 1 hora. A solução transparente, quase incolor foi adicionada gota a gota durante cerca de 2 minutos a uma solução agitada de 1,25 g (2,0 mmol) QUIN1 éster tetraetilo QUIN1 (!) (preparada de acordo com o método Tsien, Biochemistry 19. 2396, 1980) em 40 ml CH3OH mantido a -10°C. A massa de reacção foi agitada a -10°C durante 30 minutos e deixada aquecer até à temperatura ambiente e foi agitada durante a noite. O sólido que se separou da mistura de reacção foi filtrado, lavado com 250 ml de CH3OH/H20 (1:1), agitado em 60 ml CH3OH durante 1 hora à temperatura ambiente e filtrado de novo. O produto bruto foi dissolvido em 50 ml de acetato de etilo (EtOAc) e diluído com 100 ml de hexano 23 - depois do que um sólido rapidamente precipitou da solução. A mistura foi arrefecida durante a noite a cerca de 0°C; o sólido foi recolhido por filtração, lavado com hexano e seco no vácuo a 65°C para se conseguir o composto intermediário éster tetraetilo 2-nitrofenilazo-QUIN 1 (1,18 g 76,6%) como agulhas fins cor de tijolo vermelho com pf = 120-121,5°C.

Rf= 0,4 em placaa de tlc de gel de silica desenvolvidas em EtOAc/hexano (4:6). IV (KBr) cm'1 3443, 2983, 1748, 1559, 1531, 1514, 1487, 1402, 1302, 1364, 1306, 1262, 1185, 1027; lH RMN (CDC13) δ 9,30 (d, J=8,8Hz, 1H), 8,02 (d, J= 8,8Hz, 1H), 7,82-7,92 (m, 3H), 7,68 (t de d, Jt=7,7hz e Jd= 1,4Hz, 1H), 7,52 (t de d, Jt=7,7Hz, e Jd= 1,3Hz, 1H), 6,95 (d, J= 8,8 Hz, 1H), 6,88 (d, J= 8,0Hz, 1H), 6,75 (d, J= l,3hz, 1H), 6,70 (br d, J= 8,0 Hz, 1H), 5,33 (s, 2H), 4,56 (s, 4H), 4,31 (q, J= 7,1Hz, 4H), 4,22 (s, 4H), 3,56 (q, J= 7,1Hz, 4H), 2,24 (s, 3H), 1,32 (t, J= 7,1 Hz, 6H), 1,20 (t, J= 7,1 Hz, 6H); l3C RMN (CDCI3) ppm 171,5, 170,9, 155,0, 150,0, 150,3, 147,4, 145,8, 140,0, 139,0, 136,7, 133,0, 132,6, 129,4, 128,5, 123,9, 122,0, 120,6, 120,1, 119,1, 115,7, 114,4, 112,4, 71,4, 61,2, 60,6, 59,3, 54,0, 20,9, 14,3, 14,2.

Análise Cale. Para C39H44N60ii: C, 60,61; H, 5,74; N, 10,88 Encontrado: C, 61,00; H, 5,80; O , 11,02.

Fase 2 (Síntese de 14, X=K): 1,000 g (1,294 mmol) éster tetraetilo 2-nitrofenilazo-QUINl (2) e 35 ml de álcool n-butílico (n-BuOH) foram agitados num frasco de recuperação de 100 ml à temperatura ambiente sob árgon durante 10 minutos. A suspensão foi então tratada com 1,54 ml (6,16 mmol, 4,75 equivalentes) de KOH aquoso a 4,00 M (qualidade de semicondutor de alta pureza) e 7 ml adicionais de n-BuOH e 24 - foram deixados agitar à temperatura ambiente sob árgon durante a noite. Depois de 23 horas de tlc (gel de silica; n-BuOH/ácido acético (H0Ac)/H20 (4:1:1) produto Rf = 0,16, material de partida Rf = 0,95) indicou que a reacção está completa. A massa da reacção foi transferida para um tubo de centrifugação utilizando cerca de 2 ml de n-BuOH para enxaguar o frasco e depois centrifugar a 20,000 x G durante 10 minutos depois do que o supematante foi pipetado da pelete resultante e descartado. A pelete foi ressuspensa duas vezes com sujeita a ultra-sons em 20 ml de n-BuOH e centrifugação como anteriormente. A pelete final foi seca no vácuo durante a noite à temperatura ambiente no tubo de centrifugação, pulverizada e transferida para um frasco em que foi seca no vácuo durante 2 dias adicionais à temperatura ambiente para dar 1,03 g (90%) do composto em título (14) como um pó cor de tijolo vermelho o qual reteve traços do solvente utilizado na processamento. IV (KBr) cm'1 3442 (largo), 2928, 1597, 1507, 1397, 1286, 1241, 1182; 'H RMN (D20) δ 9,20 (d, J= 8,9Hz, 1H), 8,04 (d, J= 8,1 Hz, 1H), 7,96 (d, J= 8,9Hz, 1H), 7,79-7,90 (m, 3H), 7,62 (t de d, Jt= 7,7Hz e Jd = 1,5Hz, 1H), 6,83-6,90 (m, 2H), 6,70-6,79 (m, 2H), 5,41 (s, 2H), 4,42 (s, 4H9, 3,95 (s, 4H), 2,16 (s, 3H); 13C RMN (D20) ppm 182,3, 181,3, 157,7, 154,8, 152,1, 148,7, 148,0, 141,2, 140,9, 140,2, 136,8, 135,2, 134,5, 132,2, 131,2, 127,2, 124,4, 123,4, 122,7, 121,1, 119,6, 117,2, 114,4, 73,7, 62,0, 59,8, 22,7.

Análise Cale. Para CsiH^NôOhIm . l/4n-BuOH . 3H20 Teoria: C, 43,40; H, 3,70; N, 9,49

Encontrado: C, 43,27; H, 3,92; N, 9,28.

EXEMPLO II Síntese de Tiazolilazo-OUINl (20. X = K)

Fase 1 (Síntese do Intermediário Tetraéster 8: 25 -

Uma mistura de 1,0 ml de H2SO4/H2O (7:3, v/v) foi arrefecida num banho de gelo e foi adicionado NaN02 (44,8 mg, 0,65 mmol). Uma solução de 2-aminotiazole (66mg, 0,65 mmol) em 0,5 ml HOAc foi adicionado gota a gota, a mistura foi agitada a 0-5°C durante 1,5 horas e depois foi diluída com 1,0 ml de H20. Depois de se agitar 40 minutos adicionais a solução resultante do sal diazónio foi adicionada gota a gota, durante 15 minutos, a uma solução de ! (250 mg, 0,4 mmol) em 5,0 ml de CH3OH arrefecido com gelo. A mistura foi deixada a agitar a 0-5°C durante 1 hora e depois foi diluída com 75 ml de H20. O sólido laranja-vermelho que se separou foi recolhido por filtração, lavado com 100 ml de H20 e foi seco para dar 8 (220 mg, 75%). A recristalização a partir de EtOAc/hexano (1.3, v/v) produziu a amostra analítica como um pó cor de laranja-vermelho tendo um pf de 100-102°C IV (CHCI3) cm1 3001, 2933, 1744, 1559, 1506, 1487, 1412, 1373, 1309, 1258, 1192, 1139, 1109, 1024; 'H RMN (CDCI3) δ 9,19 (d, J= 9,2Hz, 1H), 8,39 (d, J= 9,2Hz, 1H), 7,99 (d, J= 3,5Hz, 1H), 7,92 (d, J= 8,8Hz, 1H), 7,35 (d, J= 3,8Hz, 1H), 6,86-6,91 (m, 2H), 6,68-6,73 (m, 2H), 5,26 (s, 2H), 4,66 (s, 4H), 4,33 (q, J= 7,1 Hz, 4H), 4,21 (s, 4H), 4,12 (q, J= 7,1 Hz, 4H), 2,23 (s, 3H), 1,34 (t, J= 7,1 Hz, 6H), 1,21 (t, 7,1 Hz, 6H); 13C RMN (CDCI3) ppm 171,4, 170,6, 155,2, 151,2, 150,3, 143,4, 138,95, 138,89, 136,7, 133,0, 133,0, 132,4, 128,7, 122,0, 120,8, 120,1, 119,9, 116,4, 114,4, 112,5, 71,3, 61,3, 60,6, 56,4, 54,0, 20,9, 14,24, 14,20.

Análise Cale. Para C36H42N6O9S C, 58,84; H, 5,76; N, 11,44 Encontrado: C, 58,85; H, 5,70; N, 11,63. 26 -

Fase 2:

Uma suspensão de 8 (0,144 g, 0,196 mmol) em n-BuOH (8,8 ml) à temperatura ambiente foi tratada com KOH a 4,0 M (0,245 ml, 0,98 mmol, 5 eq) e deixada agitar durante 7 horas. A mistura de reacção foi então arrefecida a 5°C durante 17 horas, transferida para um tubo de centrifugação com alguns ml de n-BuOH e centrifugou a 7500 x G durante 20 minutos. O supemadante foi descartado, depois do que a plaqueta resultante foi ressuspensa com sujeita a ultra-sons em cerca de 3 ml de n-BuOH fresco e centrifugada de novo. O produto foi lavado com EtOAc e hexano por ressuspensão/centrifugação e foi seco no vácuo (0,1 torr) a 60°C durante 2 horas para conseguir 20 (0,133, 87%) como o sal tetrapotássio púrpura escuro. IV (KBr) cm'1 3418 (largo), 1587, 1505, 1396, 1287, 1247, 1202, 1179, 1136, 1022; ‘H RMN (D20) δ 9,15 (d, J=8,9Hz, 1H), 8,07 (d, J= 9,3Hz, 1H), 7,81 (d, J= 3,5Hz, 1H), 7,72 (d, J= 8,9Hz, 1H), 7,43 (d, J= 3,5 Hz, 1H), 6,82 (d, J= 9,3Hz, 1H), 6,76 (d, J= 0,7Hz, 1H), 6,62-6,70 (m, 2H), 5,31 (s, 2H), 4,40 (s, 4H), 3,87 (s, 4H), 2,10(s, 3H), 13C RMN (D20) ppm 182,5, 180,6, 157,8, 156,0, 152,1, 145,0, 141,1, 140,3, 139,6, 135,3, 134,2, 132,0, 124,3, 123,7, 123,0, 121,0, 120,6, 117,2, 114,8, 73,6, 62,4, 59,7, 22,7.

Análise Cale. Para C28H22N609SK4 . Vi n-BuOH . 3H20: Teoria: C, 41,60; H, 3,84; N, 9,70

Encontrado: C, 41,77; H, 3,81; N, 9,89. A síntese de tetra-ácido benzotiazolil-QUINl (32) e tetra-ácido (4-trifluorometil-6-clorobenzotiazoil)-QUINl (39) como descrito em seguida são típicos da via do método 2 utilizado para preparar análogos arilazo-QUINl 24 - 41. 27 -

EXEMPLO III (Síntese de Tetra-ácido Benzotiazolilazo-OUIN 1 321

Fase 1 (Síntese de Tetra-ácido OUIN1 (13. X = Hl: 6,24 g (10 mmol) de éster tetra-etilo QUIN1 (1) foi dissolvido em 100 ml de EtOH e tratado com um excesso de 5 molar de KOH aquoso a 4M. A mistura de reacção foi agitada durante 16 horas a 40°C depois do que a reacção foi julgada completa por tlc (gel de silica; Et0H:H0Ac:H20 (4:1:1). Depois da adição de 100 ml de H20 o EtOH foi evaporado sob pressão reduzida e o pH da solução foi ajustado para 2,5 pela adição de HC1 a 1M. O tetra-ácido começou a precipitação meia cristalina/meia gomosa. Um produto totalmente cristalino foi isolado depois da agitação durante 24 horas. *H RMN (CD3OD) δ 8,22 (d, 1H), 7,67 (d, 1H), 7,40 (d, 2H), 7,07 (t, 1H), 6,85 (d, 1H), 6,84 (s, 1H), 6,66 (d de d, 1H), 5,35 (s, 2H), 4,30 (s, 4H), 4,07 (s, 4H), 2,18 (s, 3H).

Análise Cale. Para: C25H25N309: C, 58,71; H, 4,93; N, 8,22 Encontrado. C, 58,75, H, 4,89; N, 8,34.

Fase 2 (Diazotizacão) 220 mg (1,46 mmol) 2-aminobenzotiazole foi dissolvido numa mistura de 15 ml H3PO4 e 5 ml HO Ac com sujeita a ultra-sons, arrefecido para 0°C e tratado com 0,25 ml de ácido nitrosilsulfúrico a 40% . A reacção foi agitada durante 2 horas a 0°C seguida da adição de uma pequena quantidade de ureia. 28 -

Depois da agitação durante 1 hora adicional, a solução estava pronta para se utilizar na Fase 3.

Fase 3 (Acoplamento) 0,747 g (1,46 mmol) tetra-ácido QUIN1 (13, X = H) foi dissolvido numa mistura de 100 ml CH3OH e 50 ml H20 arrefecido para -20°C e tratado com a solução de diazónio da Fase 2. A mistura de reacção foi mantida a pH 4 pela adição de NaOH concentrado. A solução foi aquecida à temperatura ambiente e o pH foi ajustado para 2,5. O CH3OH foi removido por evaporação sob pressão reduzida e o produto (32) foi recolhido por filtração.

Rendimento: 0,9g (91%).

Fase 4 (Purificação) 32 Impuro foi purificado por cromatografia flash numa coluna de gel de silica RP-2 (Gel de Silica 60 Silanizada, tamanho da partícula 0,063 -0,200 nm; de E. Merck) embalada e desenvolvida com uma mistura solvente de CH30H/H20 (2:3) ajustado para pH 9 com KOH. Antes da aplicação da coluna o tetra-ácido foi suspenso num volume mínimo do solvente em desenvolvimento e tratado com um excesso molar 4 de KOH a 4M para se obter uma solução homogénea. Fracções de coluna contendo o produto puro são recolhidas e acidificadas para pH 2,5; o CH3OH foi removido sob pressão reduzida e 32 puro foi isolado por filtração. *H RMN (CD3OD + DMSO-d6) δ 9,20 (d, 1H), 8,21 (d, 1H), 8,03 (d, 1H), 8,00 (d, 1H), 7,96 (d, 1H), 7,54 (t, 1H), 7,46 (t, 1H), 7,04 (d, 1H), 6,89 (d, 1H), 6,81 (d, 1H), 6,69 (d, de d, 1H), 5,33 (s, 2H), 4,67 (s, 4H), 4,13 (s, 4H), 2,23 (s, 3H). Análise Cale. Para: C32H28N609S: 29 - C, 57,14; Η, 4,20; N, 12,50 Encontrado. C, 57,32, H, 4,26; N, 12,71.

EXEMPLO IV Síntese de Tetra-ácido (4-trifluorometil-6-c1orobenzotiazolil-azo)-OUINl 1391 Fase 1: 2-amino-4-trifluorometil-6-clorobenzotiazole foi diazotizado como descrito anteriormente para a preparação de 32.

Fase 2:

Tetra-ácido QUIN1 (13) foi acoplado com solução de diazónio preparada na Fase 1 de acordo com o processo utilizado para a preparação de 32, excepto que o acoplamento foi feito a -60°C e não houve controlo do pH da reacção.

Rendimento: 84%.

Fase 3:

Coluna de purificação RP-2 de 39 foi a mesma descrita anteriormente para a preparação de 32. ’H RMN (CD3OD + DMSO-d6) δ 9,15 (d, 1H), 8,45 (d, 1H), 8,29 (d, 1H), 8,07(d, 1H), 7,84 (d, 1H), 7,08 (d, 1H), 6,86 (d, 1H), 6,73 (d, 1H), 6,62 (d de d, 1H), 5,32 (s, 2H), 4,73 (s, 4H), 4,04 (s, 4H), 2,19 (s, 3H).

Análise Cale. Para: C33H26CLF3N609S: - 30

C, 51,13; Η, 3,38; N, 10,84 Encontrado. C, 51,38, H, 3,47; N, 10,63.

EXEMPLO V A síntese do análogo 2-nitrofenilazo BAPTA 54 e análogo tiazolil-BAPTA 56 são típicos de duas vias utilizadas para preparar compostos análogos arilazo BAPTA 54 - 58. Síntese de 51: 0,110 g (0,19 mmol) 50 (Y = 5-CH3) [preparado como descrito por Grynkiewicz em J. Biol. Chem. 260. 3440 (1985)] foi dissolvido em 75 ml de CH3OH, filtrado e arrefecido para -40°C depois do que foi adicionado de uma só vez 2-nitrobenzeno-diazónio tetrafluoroborato (0,048 g, 0,2 mmol) [preparado como descrito por Doyle and Bryker em J. Org. Chem.. 44, 1572 (1979)] seguido de 5 ml de acetona. A reacção foi aquecida para -20°C, seguida de agitação a esta temperatura durante 2 horas e depois foi aquecida até à temperatura ambiente. A mistura de reacção evaporou até secar sob pressão reduzida e purificou por coluna cromatográfica (gel de silica); o desenvolvimento com hexano/EtOAc (7.3, v/v) para conseguir 5f (23 mg, 16%) como um sólido cor de laranja com pf. = 105-6°C. 'H RMN (CDCI3) δ 7,89 (br d, J= 8,1Hz, 1H), 7,44-7,69 (m, 5H), 6,75-6,84 (m, 2H), 6,66-6,70 (m, 2H), 4,35-4,2 (m, 2H), 4,28-4,35 (m, 2H), 4,25 (m, 4H), 4,13 (s, 4H), 4,08 (q, J= 7,1 Hz, 4H), 4,06 (q, J= 7,1 Hz, 4H), 2,26 (s, 3H), 1,16 (t, J= 7,1 Hz, 6H), 1,15 (t, J= 7,1 Hz, 6H); 13C RMN (CDCI3) ppm 171,5, 170,9, 150,3, 150,0, 147,2, 143,8, 137,1, 132,9, 132,1,129,5, 124,0, 122,2, 122,0, 121,5, 119,5, 118,7, 117,1, 117,0, 114,7, 105,1, 31 -

77,8, 77,7, 67,5, 61,3, 61,1, 60,9, 60,7, 53,9, 53,7, 20,9, 14,1, 14,0. MS [EI, inlet directo] m/z (intensidade relativa) 751 (11,7%, M'4), 678 (100%) Síntese de 54: 7,52 mg (0,01 mmol) 5! em 0,5 ml de n-BuOH foi tratado com 17,5 μΐ (7 eq) de LiOH a 4M e foi agitado à temperatura ambiente durante 17,3 horas. A mistura de reacção foi transferida para um tubo micro centrifugador e girou a 7.000 x G durante 5 minutos. O supemadante foi descartado e a plaqueta resultante foi lavada com 0,5 ml de nBuOH seguida de 0,1 ml de EtOAc utilizando a ressupenção e centrifugação depois do que foi seca no vácuo para dar 54 (5,1 mg, 77%) como um pó vermelho tijolo. ‘H RMN (CDC13) δ 8,09 (d de d, J,= 8,2Hz e J2=1,1Hz, 1H), 7,82 (t de d, Jt= 7,7Hz e Jd=l,2Hz, 1H), 7,62 (t de d, Jt= 7,8Hz e Jd=l,3Hz, 1H), 7,48-7,57 (m, 2H), 7,46 (d, J= 2,2Hz, 1H), 6,97 (s, 1H), 6,7-6,80 (m, 3H), 4,40 (s, 4H), 4,05 (s, 4H), 3,73 (s, 4H), 2,25 (s, 3H) 13C RMN (D20) ppm 182,6, 181,5, 152,5, 151,6, 148,0, 147,3, 140,6, 137,5, 135,1, 132,4, 128,8, 127,7, 125,1, 125,0, 122,9, 121,7, 118,1, 109,5, 70,5, 69,9, 60,2, 60,0, 22,7. Síntese de 53 (Y = 5-OL. X = Li) 0,6026 g (1,0 mmol) 50 (Y = 5-CH3) foi suspenso em 50 ml de m-BuOH, tratado com LiOH a 4M (1,75 ml, 7 eq.) e foi deixado agitar à temperatura ambiente durante 16 horas. Um produto sólido branco foi isolado por centrifugação a 7,000 x G, lavado com 10 ml de n-BuOH seguido de 15 ml de EtOAc e foi seco no vácuo para se conseguir 53 (Y = 5-CH3, X = Li) em rendimento quantitativo. 32 - IV (KBr) cm·' 3440 (largo), 2928, 1599, 1500, 1412, 1325, 1250, 1158, 1130, 1041,985,925; 'H RMN (D20) δ 7,10-7,14 (m, 1H), 6,90-7,00 (m, 3H), 6,75-6,85 (m, 3H), 4,37 (s, 4H), 3,87 (s, 4H), 3,82 (s, 4H), 2,27 (s, 3H); ,3C RMN (D20) ppm 182,6, 152,6, 152,4, 143,3, 140,6, 135,1, 124,9, 124,3, 121,4, 121,0, 118,0, 117,8, 70,4, 70,1, 60,1, 59,8, 22,7.

Análise Cale. Para: C23H22N2OiolÍ4 · LiOH . 3H20:

Teoria: C, 46,65; H, 4,94; N, 4,73

Encontrado: C, 46,32, H, 4,82; N, 4,52. Síntes de 56: 2-aminotiazole (20 mg, 0,2 mmol) foi dissolvido em 200 μΐ de HOAc e foi adicionado gota a gota a uma mistura agitada de ácido nitrosilsulfurico (32 mg, 0,25 mmol) e HOAc (200 μΐ) mantida num banho de gelo. A mistura foi agitada durante 45 minutos depois dos quais uma pequena quantidade de ureia foi adicionada. Depois de uns 5 minutos iniciais a mistura foi adicionada gota a gota a uma solução agitada de 53 (60 mg, 0,1 mmol) em 1,0 ml H20 e 0,25 ml CH3OH, mantida a 0-5°C e deixada reagir durante 3 horas. A mistura de reacção foi extraída 4 vezes com 1 ml de porções de EtOAc e os extractos combinados foram secos sobre MgS04 e evaporados at+e secar sob pressão reduzida para dar 56 (42 mg, 70%). RP-2 coluna cromatográfica (como para a Fase 4 na síntese de 32) conseguiu o produto puro. *H RMN (CD3OD) δ 7,95 (d, J=3,3Hz, 1H), 7,57-7,65 (m, 3H), 6,77-6,90 (m, 3H), 6,68 (d, J=7,8Hz, 1H), 4,84 (s, 4H; COOH), 4,25-4,50 (m, 4H), 4,30 (s, 4H), 4,07 (s, 4H), 2,27 (s, 3H). » »

- 33 -

Determinação da Absorção Máxima A absorção óptica máxima das formas não complexadas e complexadas dos compostos indicadores de cálcio 14 - 4! e 43 - 49 foram determinadas em tampão de borato pH 9. Indicador suficiente foi dissolvido no tampão para produzir a absorção desde cerca de 1,0 até 2,0 quando medido com espectómetro UV/VIS. Para “curvettes” (pequenos tubos de teste) normalizados com 1 cm de passo e 4,0 ml de volume havia tipicamente 0,15 mg até 0,35 mg do indicador em 4,0 ml de tampão. A máxima absorção não complexada foi determinada, depois cerca de 2,0 mg de CaC^ (50 até 100 vezes de excesso molar) foi adicionado e a máxima absorção complexada foi determinada.

Avaliação do desempenho O desempenho de 14 foi avaliado numa formulação de reagente líquido num analisador Technicon ΑΧΟΝ®. O reagente era composto por 100 mM tampão de borato contendo 100 mg/1 do composto 14. Os parâmetros de instrumento foram como se segue: 350μ1 4μ1 50μ1 3 minutos 505/750 rnn Ponto-terminal/Uma diminuição RI Volume Volume de amostra Volume de enxaguamento Demora Filtro Tipo

Foi conseguida linearidade utilizando soluções aquosas de cálcio em gamas de concentração desde 0-20 mg/dl. A figura que traça a concentração de cálcio versus a mudança na absorção a 505 nm, ilustra a linearidade da 34 - resposta. A análise de regressão linear múltipla dos dados na Figura 1 produz a equação: Y = 0,0625X- 0,001

Em que Y é a absorção Δ a 505 nm dividido pela absorção a 750 nm e X é a concentração de cálcio em mg/dl. A correlação de coeficiente ( R) é 0,9997.

Lisboa, 29 de Março de 2000

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Claims (10)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Cromoionofores arilazo caracterizados pela fórmula COO- x-t- COO- X-*- COO- X+· COO- X+-

   R em que X é hidrogénio ou um catião monovalente, Y é H ou metoxi e R é uma estrutura orgânica aromática em anel a qual completa a estrutura de corante azo.
2. 2. Os cromoionóforos arilazo da Reivindicação 1 em que R é um anel carboxílico de cinco ou seis membros, substituído ou insubstituído, aromático ou heteroaromático ou um sistema de anel condensado com cinco ou seis membros, substituído ou insubstituído, aromáticos ou heteroaromáticos.
3. 3. Os cromoionóforos arilazo de qualquer das reivindicações 1 e 2 em que o anel carboxílico aromático ou heteroaromático é substituído por porções alquilo, alcoxi, halo, ciano, nitro, arilo, heteroarilo, ceto ou mesilo.
4. 4. Os cromoionóforos arilazo de qualquer das reivindicações 1 a 3 em que R é um anel carboxílico aromático substituído de seis membros seleccionado a partir do grupo que consiste em 2-nitrofenilo; 2-nitro-4- -2- fluorofenilo; 2-nitro-4-clorofenilo;2-nitro-4-trifluorometilfenilo; 2-nitro-4-cianofenilo; 4-nitrofenilo; 2-fluoro-4-nitrofenilo; 2-cloro-4-nitrofenilo; 3-nitro-4-sulfofenilo; 2,5-dicloro-4-(2,-sulfoetilsulfonamido)feni1; 2-metanossulfonilo-4-nitro-fenilo; 2,4-dinitrifenilo; 2-cloro-5-nitrofenilo e 3,5-dinitrofenilo.
5. 5. Os cromoionóforos arilazo de qualquer das reivindicações 1 a 4 em que Y é H.
6. 6. Os cromoionóforos arilazo de qualquer uma das reivindicações 1 a 4 em que X é potássio.
7. 7. Os cromoionóforos arilazo de qualquer das reivindicações 1 a 6 em que R é um anel heteroaromático de seis membros seleccionado a partir do grupo que consiste em 2-tiazolilo; 4-metil-2-tiazolilo; 4-fenil-2-tiazolilo; 4,5-dimetil-2-tiazolilo, 5-nitro-2-tiazolilo; 5-bromo-2-tiazolilo; 4-carbometilo-2-tiazolilo; 5-nitro-fenilsulfonilo-2-tiazolilo; 2-piridilo; 4,6-dimetil-2-piridilo; 5-cloro-2-piridilo; 5-bromo-2-piridilo; 3-metil-2-piridilo; 5-bromo-3-nitro-2-piridilo; 3-cloro-5-trifluorometil-2-piridilo; 3,5-dicloro-2-piridilo; 3-nitro-2-piridilo; 4-piridilo; 2,5,6-trifluoro-3-cloro-4-piridilo; 2-metoxi-5-piridilo; 2,6-dimetoxi-3-piridilo; 5-nitro-2-pirimidilo; 4-metil-2-pirimidilo; 4,6-dimetil-2-pirimidilo; 4,6-dimetoxi-2-pirimidilo; 4-cloro-6-metil-2-pirimidilo; 5-metil-3-isoxazolilo; 3-metil-5-isoxazolilo; 3-metil-5-isotiazolilo; l-etil-5-pirazolilo; 2-(1,3,4-tiadiazolilo); 5-etil-2-(l,3,4-tiadiazolilo) e 3-fenil-5-(l,2,4-tiadiazolilo).
8. 8. Os cromoionóforos arilazo de qualquer uma das reivindicações 1 a 6 em que R é um sistema de anel condensado feito a partir de anéis de cinco ou seis membros, substituídos ou insubstituídos, carboxílicos aromáticos ou heteroaromáticos seleccionados a partir do grupo que consiste em 4-trifluorometil-6-cloro-2-benzotiazolilo; 1-naftilo; 6-(2’-hidroxietiloxi)-2-benzo- -3 - tiazolilo; 6-terc-butil-2-benzotiazo1ilo; 4-metil-5-cloro-2-benzotiazolilo; 4,5-dimetil-2-benzotiazolilo; 2-benzotiazolilo; 5-fluoro-2-benzotiazolilo; 6-sulfo-2-benzotiazolilo; 5,6-dicloro-2-benzotiazolilo; 2-P-naftotiazolilo; 4-bromo-6-cloro-2-benzotiazolilo; 4,5-dicloro-2-benzotiazolilo; 6-nitro-2-benzotiazolilo; 4,5,6,7-tetracloro-2-benzotiazolilo.
9. 9. Método para a detecção de ião de cálcio em líquido aquoso suspeito de conter tal ião, cujo método compreende o contacto do líquido com um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 e determinação da mudança da densidade óptica no líquido resultante da complexação do ião de cálcio com o referido composto.
10. 10. Sistema reagente para a detecção de ião de cálcio em amostras aquosas que compreende um composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 8. Lisboa, 29 de Março de 2000

    JORGE CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrie RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA