CN101250405B - 一种新型巯基荧光探针及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种可用于活细胞中活性巯基成像测定的荧光探针及其应用。该荧光探针是以马来酰亚胺或马来酰亚胺酸修饰的2-(2-羟基苯基)苯并咪唑类化合物，化合物的结构是N-{3-(2-苯并咪唑基)-4-羟基苯基}马来酰亚胺和N-{3-(2-苯并咪唑基)-4-羟基苯基}马来酰亚胺酸。该化合物可简单迅速地进入活细胞，与细胞内游离的活性巯基基团发生反应，导致化合物的荧光强度显著增强，进而可以用于活细胞中活性巯基(如谷胱甘肽等)的荧光测定和荧光成像。
Description
一技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及活细胞或生物活体中巯基含量的测定技术，是一种可用于活细胞中巯基成像测定的荧光探针及其应用。
二背景技术
巯基(-SH)是细胞中化学活性最高的基团。在蛋白质中，巯基部分是与酶活性有关的最具有反应性的官能团。细胞中的巯基，尤其是谷胱甘肽(GSH)作为细胞内的亲核和还原试剂，能保护细胞不受缺氧、毒素、诱变、放射线及许多致癌物的侵害。随着巯基官能团在生物体系中的重要作用逐渐被认识，鉴别和定量测定生物巯基化合物的方法日益受到关注。传统的检测方法有硝普盐法、碘量法、电流分析法、分光光度法、比色法等，但这些方法灵敏度低(毫摩尔级以上才能检测)，不能适应有些生物样品中巯基化合物的测定，因此需要合成一些高灵敏度的分析检测试剂。
荧光测定法由于其成本低，可重复性好，测定灵敏，选择性高，并且能够实现可视化观测，是一种非常好的测定手段。因此，新型的巯基荧光检测试剂成为研究的焦点。巯基荧光探针灵敏度高，可作为生物结构研究指示系统，因而被广泛应用到研究蛋白质结构和微环境性质、微量检测胆碱酶或谷胱甘肽S-转移酶、组织化学染色、抗原-抗体反应的检测和定位、疾病的诊断、HPLC分析巯基化合物等领域。
已报导的巯基荧光探针有芳基卤化物、丹磺酰氮丙啶类等，它们具有好的选择性和灵敏度，对巯基的检测限一般在纳摩尔(nmol)左右，但这些探针自身都有较强的荧光，用于活细胞成像时会造成较低的信噪比；还有一类如苯并呋喃磺酰卤，虽然其自身荧光较弱，但需要在碱性条件及高于室温下与巯基衍生，也无法应用于活细胞成像。最常用来衍生巯基的试剂是乙酰卤衍生物，主要是碘乙酰胺衍生物，它和巯基反应快，在室温和生理pH下即可进行，但产物容易失去荧光团，并且自身对光不稳定。这些现存的巯基荧光探针均不能很好地满足生物荧光检测和荧光成像的要求。
马来酰亚胺类荧光化合物与巯基可发生稳定的加成，且自身荧光较弱，在与巯基加成后荧光增强，这种仅在反应后得到荧光增强的特点使其表现出独有的优越性，但一般的荧光团和马来酰亚胺结合后，量子产率较低，荧光寿命短，并且Stokes位移较小，较难进行高质量的细胞内荧光成像。2-(2-羟基苯基)苯并咪唑类化合物属于激发态质子转移型高性能荧光团，其量子产率高，荧光寿命长，并有着较大的Stokes位移，可以减少系统中背景荧光的干扰，并且细胞毒性小，非常适用于作为活细胞应用的荧光团(Jie Ouyang et al.Journal of Heterocyclicchemistry，41，359-365(2004))，因此，以马来酰亚胺类基团修饰的2-(2-羟基苯基)苯并咪唑类化合物，有希望作为一种新型的活细胞巯基荧光探针得到应用。
三发明内容
本发明需要解决的问题是：
1.提供一种基于马来酰亚胺/马来酰亚胺酸和2-(2-羟基苯基)苯并咪唑类化合物的，可用于活细胞检测的高性能活性巯基荧光探针。这种荧光探针可以为研究活细胞中一些重要的蛋白酶类和酶学过程中的机制，阐明生物系统中某些重要信号通路，某些重大疾病(如癌症、免疫失调等)的早期诊断与预防，提供良好的辅助手段；
2.提供该荧光探针的应用途径。
本发明的技术方案为：
1.活性巯基荧光探针的结构及其合成方法
本发明的荧光探针结构式为：
该荧光探针的合成方法可参照如下步骤：
a.芳胺重氮盐的制备：苯胺溶于水中，加入浓盐酸，使苯胺变成盐酸盐完全溶解，冰浴冷却。亚硝酸钠溶于少量水，冰冷却，搅拌下慢慢加入到上述溶液中；
b.5-偶氮苯基水杨醛的制备：NaOH溶于水中，加入到水杨醛中，变成水杨醛钠盐溶解于水中，搅拌，保持在0℃。搅拌下将重氮盐溶液缓慢加入，同时滴加Na2CO3溶液保持pH为8左右。生成的沉淀用乙酸乙酯和正己烷(1∶1)重结晶即可得；
c.偶氮苯基苯并咪唑的制备：将等摩尔5-偶氮苯基水杨醛，亚硫酸氢钠与无水乙醇混合后常温搅拌，然后将等摩尔邻苯二胺溶解在DMF中，滴加到前面的溶液中加热回流。反应完毕将反应物倒入冷水，析出沉淀，抽滤，干燥，丙酮重结晶两次；
d.2-(2-羟基-5-氨基苯基)苯并咪唑的制备：将偶氮苯基苯并咪唑，80％水合肼，5％Pd/C催化剂，无水乙醇混合，迅速升温至回流反应，热过滤，滤液浓缩至有晶体析出，抽滤，冷乙醇洗涤，乙醇重结晶；
e.探针2(N-{3-(2-苯并咪唑基)-4-羟基苯基}马来酰亚胺酸)的合成：马来酸酐溶于丙酮，室温下分批搅拌加入2-(2-羟基-5-氨基苯基)苯并咪唑固体，室温搅拌反应。抽滤，丙酮洗涤，干燥，得到探针2粗品，用稀盐酸处理；
f.探针1(N-{3-(2-苯并咪唑基)-4-羟基苯基}马来酰亚胺)的合成：探针2加入甲苯，DMF以及对甲苯磺酸混合溶液，加热回流反应，然后加入适量DMF至固体完全溶解，继续加热回流反应一天。反应完毕蒸出甲苯，倒入冷水中，析出沉淀，经抽滤，水洗，干燥，得到探针1粗品，用柱层析硅胶分离，乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1作展开剂，得到探针1纯品，合成路线如下：
2.活性巯基荧光探针的应用
将本发明的巯基荧光探针用于化学体系中含巯基化合物的检测、生物活细胞和活组织内的巯基的分析检测和荧光成像检测。
本发明的荧光探针与现有技术相比，其有益效果是：
(1)稳定性好，能够长期保存使用，适用于活细胞生长的多种环境。
(2)具有较高的巯基测定灵敏度。
(3)有很好的选择性，与其他常见生物干扰分子作用荧光信号几乎无变化。
(4)和巯基反应前后荧光变化迅速，荧光稳定，适合于体系内巯基的即时荧光测定。
(5)可简单进入活细胞和活组织，特异性与细胞或组织中的巯基反应，导致探针的荧光强度显著增强，进而用于活细胞中巯基的时间分辨荧光测定。
(6)Stokes位移大，荧光背景弱，信噪比好。
本发明的荧光探针为研究巯基相关的生物信号通路，以及巯基在一些疾病或生物体内过程中的意义及诊断提供了较好的研究方法。
本发明的化合物作为巯基测定荧光探针可以用于细胞内巯基浓度变化的直接荧光检测，是一种活细胞荧光成像试剂，在生物工程工业中具有很好的实用性。
四附图说明
图1：探针1与L-半胱氨酸(L-Cys)反应前后的荧光光谱变化图，虚线代表单独探针1的荧光光谱，灰线代表探针1与L-Cys反应1分钟后的荧光光谱，黑线代表探针1与L-Cys反应1分钟后的荧光光谱。探针1的浓度为100μM，L-Cys的浓度为1mM；
图2：探针2与L-Cys反应前后的荧光光谱变化图，虚线代表单独探针2的荧光光谱，灰线代表探针2与L-Cys反应1分钟后的荧光光谱，黑线代表探针2与L-Cys反应1分钟后的荧光光谱。探针2的浓度为100μM，L-Cys的浓度为1mM；
图3：探针1跟巯基反应的选择性；
图4：探针2跟巯基反应的选择性；
图5：探针1检测巯基化合物L-Cys的荧光强度-剂量曲线；
图6：探针2检测巯基化合物L-Cys的荧光强度-剂量曲线；
图7：探针1对于HepG2细胞中活性巯基(主要为GSH)的荧光成像照片，1是普通的HepG2细胞，2是加入GSH合成酶抑制剂BSO处理12小时后的HepG2细胞，3是以过氧化氢处理1小时后的HepG2细胞，4是以过氧化氢处理2小时后的HepG2细胞。探针1加入细胞的终浓度均为10μM；
图8：以GSH检测试剂盒对不同处理条件下HepG2细胞中的活性巯基(GSH)含量进行定量。control是普通的HepG2细胞，BSO是加入1mM BSO处理12小时后的HepG2细胞，H2O2(1h)是以过氧化氢处理1小时后的HepG2细胞，H2O2(2h)是以过氧化氢处理2小时后的HepG2细胞。
五具体实施方式：
下面通过实施例具体地说明本发明，但本发明不受下述实施例的限定。
实施例1：探针1和探针2的合成路线：
(1)芳胺重氮盐的制备：称取3～6g苯胺加入到40mL水中，再加入15mL浓盐酸，使苯胺变成盐酸盐完全溶解，冰浴冷却至0℃。称取2.3～5g亚硝酸钠溶解在少量水中配成溶液，冰冷却，搅拌下慢慢加入到上述溶液中，即可制得氯化重氮苯溶液。用碘化钾试纸测试是否变蓝色，如变蓝色说明溶液中含有过量的亚硝酸，可用尿素中和，直到碘化钾试纸不变色；
(2)5-偶氮苯基水杨醛的制备：称取2～4g NaOH溶解于300mL水中，加入到盛有5～10g水杨醛的三口瓶中，变成水杨醛钠盐溶解于水中，将此溶液在搅拌条件下保持在0℃。搅拌下将重氮盐溶液缓慢滴加到已制备好的水杨醛钠盐溶液中，同时滴加Na2CO3溶液使反应液在pH＝8附近。反应过程有大量金黄色沉淀析出。滴加完毕，静置，抽滤，真空干燥，得粗品，用乙酸乙酯和正己烷(1∶1)重结晶，产物m.p.126～129℃；
(3)偶氮苯基苯并咪唑的制备：将等摩尔(2～10mmol)5-偶氮苯基水杨醛，亚硫酸氢钠与25mL无水乙醇混合后常温搅拌，然后将等摩尔邻苯二胺溶解在25mL DMF中，滴加到前面的溶液中加热回流1.5～3h。反应完毕将反应物倒入10倍冷水中，析出沉淀，抽滤，干燥，丙酮重结晶两次；
(4)2-(2-羟基-5-氨基苯基)苯并咪唑的制备：将3～8g偶氮苯基苯并咪唑，9～20mL 80％水合肼，适量5％Pd/C催化剂，131mL无水乙醇混合，迅速升温至回流反应50min，热过滤，滤液浓缩至有晶体析出，抽滤，冷乙醇洗涤，乙醇重结晶；
(5)探针2的合成：在三口瓶内加入0.1～0.4g马来酸酐，用5mL丙酮溶解，室温下分批搅拌加入0.2～1g 2-(2-羟基-5-氨基苯基)苯并咪唑固体，出现黄色沉淀，加料完毕室温搅拌反应1.5h。抽滤，丙酮洗涤，干燥，得到探针2粗品，粗品用稀盐酸处理，得到黄色固体粉末；
(6)探针1的合成：在装有0.5～1.5g探针2的三口瓶内，加入10mL甲苯，0.5mL DMF以及适量对甲苯磺酸，加热回流反应6h，然后加入适量DMF至固体完全溶解，继续加热回流反应一天，反应过程用TLC监控(乙酸乙酯作展开剂)。反应完毕蒸出甲苯，剩余褐色液体倒入冷水中，析出褐色沉淀，经抽滤，水洗，干燥，得到探针1粗品，用柱层析硅胶分离，乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1作展开剂，得到探针1纯品。
探针1的基本数据：
淡黄色针状晶体，m.p.285℃(分解)。
IR(KBr，cm-1)：3446(-OH，-NH)，3088(Ar-H)，1760，1702，717(酰亚胺环)，1603(C＝C)，1522(苯环)
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：13.24(br s，2H，OH and NH)，8.00(s，1H，Ar H)，7.70(dd，2H，Ar H)，7.33(m，2H，Ar H)，7.22(dd，2H，Ar H)，7.14(d，1H，CH)。
探针2的基本数据：
黄色固体粉末，m.p.232℃(稀盐酸处理)。
IR(KBr，cm-1)：3447(-NH，-OH，COOH)，1626(酰胺)，1508(苯环)
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：10.57(s，2H，OH and NH)，8.50(d，1H，Ar H)，7.78(br s，2H，Ar H)，7.52(m，2H，Ar H)，7.46(dd，1H，Ar H)，7.18(m，2H，Ar H)，6.51(d，1H，CH)，6.39(d，1H，CH).
实施例2：探针1和探针2与巯基化合物反应的荧光光谱变化：
将探针1和探针2溶于DMSO中，至终浓度为100μM，取200μl与1mM的含巯基化合物L-半胱氨酸(L-Cys)反应1，5min后，测定荧光强度变化，激发波长均为336nm。结果可参见图1和图2，所有的荧光强度均进行了归一化(normalized)。
从图1和图2中可以看出这两个探针的本底荧光强度很低，而跟巯基化合物L-Cys反应后，荧光强度在1分钟内即有很显著的增强(探针1：11.4倍，探针2：8.9倍)，荧光最大发射波长均在505nm处。在反应五分钟后荧光趋于稳定，探针1的荧光强度增强19.5倍，而探针2的荧光强度增强18.3倍。这种荧光增强的快速性和明显性说明这两种探针完全可以用于巯基的即时测定。
实施例3：探针对巯基的选择性
取探针1和探针2，溶于DMSO至浓度为1mM。向96孔板中加入两种探针，分别加入过氧化氢，硫化钠，硝酸盐，亚硝酸盐，铵盐，胱氨酸，和L-Cys，而后向全部样品中补加去离子水，使每个孔得到探针终浓度是100μM，过氧化氢，硫化钠，硝酸盐，亚硝酸盐，铵盐，胱氨酸，和L-Cys的摩尔量分别为相应探针的100倍，总体积为150μl。反应1小时后在酶标仪上测定505nm处的荧光强度，反应后的荧光强度除以原本探针的荧光强度，即可得到反应后荧光增强的倍数，进而确定探针1和探针2对巯基反应的专一性。结果如图3和图4所示。
从图3和图4中可以看出，探针1和探针2对活性巯基均具有很高的选择性，能够专一的和巯基反应，在反应前后荧光强度有明显的区别，而生物系统中存在的常见巯基检测干扰分子却不能对它们的荧光造成明显的改变，因此，它们能够被应用于生物系统中进行巯基的荧光检测和成像。
实施例4：探针对L-半胱氨酸的荧光-浓度曲线
取探针1和探针2，溶于DMSO至浓度为1mM。向96孔板中加入两种探针，分别加入不同浓度的L-Cys(终浓度为5μM～2mM)，探针终浓度为100μM。反应半小时后，测定505nm处荧光强度相对于原探针的变化倍数，做出荧光增强倍数对浓度的变化曲线。结果如图5和图6所示。
从图5和图6中可以得出，探针1对巯基化合物(以L-Cys为例)的最低检测下限为18.5μM，探针2对L-Cys的最低检测下限为13.9μM。而在活细胞中，巯基化合物(主要是谷胱甘肽等)的浓度在一般在μM到mM之间波动，这两种探针的灵敏度足够满足细胞水平中巯基化合物浓度变化的检测要求。
实施例5：探针1检测HepG2细胞中的活性巯基变化：
HepG2细胞以含有10％小牛血清的DMEM培养液进行培养。细胞分为三组：普通细胞；加入1mM的过氧化氢刺激后细胞；预先以1mM的谷胱甘肽合成抑制剂BSO(buthioninesulfoximine，丁硫氨酸亚砜胺)处理12小时后细胞。取探针1溶于DMSO中，浓度为1mM，分别加入各组细胞，终浓度为10μM。以奥林巴斯IX-71荧光显微镜在200倍放大下进行观测。荧光激发滤片为BP330-385带通型滤片，荧光检测滤片为BA420长通型滤片。细胞中活性巯基荧光成像的结果如图7所示。同时，以总谷胱甘肽检测试剂盒(碧云天生物技术有限公司)平行检测细胞中的谷胱甘肽(活性巯基的代表)含量的变化。试剂盒的检测结果如图8所示。
从图7中观察，探针1的对HepG2细胞中活性巯基的荧光成像结果非常明显，在普通的HepG2细胞中，荧光强度是中等的，因为一定的活性巯基含量是维持细胞(尤其是肿瘤细胞)活性的必要条件之一；在BSO处理12小时后的细胞中，由于谷胱甘肽的合成受到了干扰，细胞中的总活性巯基量大大下降，因此，荧光强度较低；而在以1mM过氧化氢刺激的HepG2细胞中，过氧化氢这种活性氧化分子的加入，刺激细胞在1小时之内开始增加表达活性巯基(主要是谷胱甘肽)，以维持细胞的氧化还原平衡。图8中谷胱甘肽检测试剂盒的检测结果，与细胞内荧光强度变化非常一致。这证明，探针1确实能够作为活细胞的巯基荧光探针，即时反应活细胞中活性巯基的浓度变化情况，所获得的结果是可靠的。
Claims (5)
1.一种测定活性巯基的荧光探针，其特征在于该荧光探针是马来酰亚胺或马来酰亚胺酸修饰的2-(2-羟基苯基)苯并咪唑类衍生物，其结构式为：
2.根据权利要求1所述测定活性巯基荧光探针的合成方法，其特征是：(1)芳胺重氮盐的制备：称取3～6g苯胺加入到40mL水中，再加入15mL浓盐酸，使苯胺变成盐酸盐完全溶解，冰浴冷却至0℃，称取2.3～5g亚硝酸钠溶解在少量水中配成溶液，冰冷后，搅拌下慢慢加入到上述溶液中，即可制得氯化重氮苯溶液；用碘化钾试纸测试是否变蓝色，如变蓝色说明溶液中含有过量的亚硝酸，用尿素中和，直到碘化钾试纸不变色；
(2)5-偶氮苯基水杨醛的制备：称取2～4g NaOH溶解于300mL水中，加入到盛有5～10g水杨醛的三颈瓶中，变成水杨醛钠盐溶解于水中，将此溶液在搅拌条件下保持在0℃，搅拌下将重氮盐溶液缓慢滴加到已制备好的水杨醛钠盐溶液中，同时滴加Na2CO3溶液使反应液在pH＝8附近，反应过程有大量金黄色沉淀析出，滴加完毕，静置，抽滤，真空干燥，得粗品，用乙酸乙酯和正己烷1∶1重结晶，产物m.p.126～129℃；
(3)偶氮苯基苯并咪唑的制备：将2～10mmol等摩尔5-偶氮苯基水杨醛，亚硫酸氢钠与25mL无水乙醇混合后常温搅拌，然后将等摩尔邻苯二胺溶解在25mL DMF中，滴加到前面的溶液中加热回流1.5～3h；反应完毕将反应物倒入10倍冷水中，析出沉淀，抽滤，干燥，丙酮重结晶两次；
(4)2-(2-羟基-5-氨基苯基)苯并咪唑的制备：将3～8g偶氮苯基苯并咪唑，9～20mL 80％水合肼，适量5％Pd/C催化剂，131mL无水乙醇混合，迅速升温至回流后反应50min，热过滤，滤液浓缩至有晶体析出，抽滤，冷乙醇洗涤，乙醇重结晶；
(5)探针2的合成：在三颈瓶内加入0.1～0.4g马来酸酐，用5mL丙酮溶解，室温下分批搅拌加入0.2～1g 2-(2-羟基-5-氨基苯基)苯并咪唑固体，出现黄色沉淀，加料完毕室温搅拌反应1.5h；抽滤，丙酮洗涤，干燥，得到探针2粗品，粗品用稀盐酸处理，得到黄色固体粉术；
(6)探针1的合成：在装有0.5～1.5g探针2的三颈瓶内，加入10mL甲苯，0.5mLDMF以及适量对甲苯磺酸，加热回流后反应6h，然后加入适量DMF至固体完全溶解，继续加热回流反应一天，反应过程用TLC监控，乙酸乙酯作展开剂；反应完毕蒸出甲苯，剩余褐色液体倒入冷水中，析出褐色沉淀，经抽滤，水洗，干燥，得到探针1粗品，用柱层析硅胶分离，乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1作展开剂，得到探针1纯品。
3.根据权利要求1所述测定活性巯基的荧光探针在生物工程工业中的应用。
4.根据权利要求1所述测定活性巯基的荧光探针在人体外非疾病诊断治疗目的的化学体系巯基检测中的应用。
5.根据权利要求1所述测定活性巯基的荧光探针在人体外非疾病诊断治疗目的的细胞内巯基生物分子的分析检测和荧光成像检测中的应用。
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| CN101250405A (zh) | 2008-08-27 |
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