JPH0972908A - パーオキシダーゼ免疫染色法及び試薬溶液の安定化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 簡易に且つ高感度、高分解能でありしかも迅
速な特定成分の測定方法を提供することであり、パーオ
キシダーゼ免疫染色法で使用される芳香族第一級アミン
化合物溶液の長期安定化方法の提供。 【構成】 パーオキシダーゼ免疫染色法において、色原
体として使用されるフェノール化合物若しくは活性メチ
レン化合物と芳香族第一級アミン化合物の溶液にアスコ
ルビン酸又はその塩を存在させることを特徴とするパー
オキシダーゼ免疫染色法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はパーオキシダーゼ免疫染
色法に関し、特に色素形成反応に用いる芳香族第一級ア
ミン化合物溶液の安定化方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】生体成分などの特定成分を検出する各種
の分析法が開発されて来ているが、それらの方法の中最
も精度の高い方法として、該特定成分とこれに対して特
異的に結合しうる物質（以後特異結合物質と称する）、
例えば抗原と抗体、ある種の糖鎖とレクチン、ビオチン
とアビジン、プロテインＡとＩｇＧ、ホルモンとレセプ
タ、酵素と基質等の間の特異的結合反応を用いる方法が
知られている。

【０００３】一般的には何らかの標識（ラベル）を付し
た特異結合物質（以後標識体と称する）を用い特定成分
に応じて変化した該標識のシグナルを検出することによ
り特定成分の測定が行われる。

【０００４】特に支持体に直接的にまたは間接的に担持
させた特定成分を標識体と反応させ、両者の複合体とし
て標識体を固定し、実質的に特定成分に応じた標識から
のシグナルを検出する方法が適宜用いられる。

【０００５】例えば電気泳動した蛋白質生体成分（特定
成分）をゲルからニトロセルロース膜上に転写担持し、
標識体例えば抗体標識体と反応させシグナルを検出する
方法、ＴＬＣプレート上に展開した脂質等の特定成分に
標識体を反応させシグナルを検出する方法、膜上でＤＮ
Ａと該ＤＮＡに対する標識した相補的ＤＮＡとを反応さ
せシグナルを検出する方法或は免疫組織化学染色法など
である。

【０００６】これらの方法により、特定成分の定量や特
定成分の特異結合物質との反応性だけでなく、特定成分
若しくは特異結合物質の性質、存在状態などに対する多
大な情報をうることができる。例えば電気泳動後膜上に
転写、担持された蛋白質や核酸、またはＴＬＣ上に展開
した脂質成分等の生体の特定成分と該特定成分に対する
標識体とを結合させた複合体上にシグナルを検出する方
法に於ては特定成分のシグナルの位置、移動度から該特
定成分の分子量、等電点或は極性等の情報がえられる。

【０００７】また免疫組織化学染色法に於ては、組織上
の目的とする特定成分の存在場所、状態等の情報がえら
れる。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】前記した、支持体上に
直接または間接的に担持させた複合結合体上に実質的に
特定成分量に応じてシグナルを検出する特定成分の測定
では対象とする特定成分が微量であるため標識が高感度
に検出されること、また特定成分に対するより多くの情
報をうるため標識の検出法が高い分解能をもったもので
あることが必須である。

【０００９】特異結合物質の標識としては、放射性同位
元素、蛍光物質、発光物質、酵素等が用いられている。
放射性同位元素は放射活性の減衰や廃棄、被曝或は設備
に巨費を要する等の問題があり、更に支持体に担持させ
た標識体上にシグナルを検出する際には写真感光材料の
感光、現像など時間と煩雑な操作を要する欠点がある。
蛍光物質若しくは発光物質は特殊な装置、設備が必要で
ある。

【００１０】一方、酵素を用いた場合、操作も比較的簡
単で生成色素はたやすく可視化でき、定量も可能であ
る。従来、標識酵素としてパーオキシダーゼ、アルカリ
フォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ等が用いられ
てきた。支持体上に担持せしめた複合結合体上に酵素反
応により色素を生成、沈着させる方法において、標識酵
素としてパーオキシダーゼが主として用いられ、過酸化
水素と色原体の存在下でパーオキシターゼによって生ず
る色素によって定量する方法が知られている。そして、
色素生成反応として、フェノール化合物若しくは活性メ
チレン化合物と芳香族第一級アミン化合物をカップリン
グする方法がよく知られている。しかし、前記カップリ
ング反応を行う際、従来芳香族第一級アミン化合物の溶
液は、不安定であるので使用直前に調製していた。

【００１１】従って本発明の目的は、簡易に且つ高感
度、高分解能でありしかも迅速な特定成分の測定方法を
提供することであり、パーオキシダーゼ免疫染色法で使
用される芳香族第一級アミン化合物溶液の長期安定化方
法の提供にある。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明の上記目的は、下
記構成により達成される。

【００１３】１） パーオキシダーゼ免疫染色法におい
て、色原体として使用されるフェノール化合物若しくは
活性メチレン化合物とカップリングして色素を形成する
芳香族第一級アミン化合物の溶液にアスコルビン酸又は
その塩を存在させることを特徴とするパーオキシダーゼ
免疫染色法。

【００１４】２） 色原体として使用されるフェノール
化合物若しくは活性メチレン化合物とカップリングして
色素を形成する芳香族第一級アミン化合物の溶液にアス
コルビン酸又はその塩を存在させることを特徴とする該
溶液の安定化方法。

【００１５】３） 少なくともフェノール化合物若しく
は活性メチレン化合物を含む溶液とアスコルビン酸又は
その塩を含有する芳香族第一級アミン化合物の溶液から
なることを特徴とするパーオキシダーゼ免疫染色キッ
ト。

【００１６】次に本発明を詳細に説明する。本発明にお
いて使用し得る芳香族第一級アミン化合物としては、ｏ
−又はｐ−アミノフェノール系化合物及びｏ−又はｐ−
フェニレンジアミン系化合物及びそれらの塩が挙げられ
る。

【００１７】好ましくはｐ−フェニレンジアミン系化合
物であり下記化１で示されるものである。

【００１８】

【化１】

【００１９】式中、Ａ及びＢは水素原子またはアルキル
基を表し、ＡとＢは窒素原子と共に複素環を形成しても
よく、Ｄ，Ｅ，Ｇ及びＪは水素原子、ハロゲン原子、ヒ
ドロキシ基、アミノ基、アルコキシ基、アシルアミド
基、アリールスルホンアミド基、アルキルスルホンアミ
ド基またはアルキル基を表わす。

【００２０】Ａ及びＢで表されるアルキル基としては、
炭素原子数１乃至６のものが好ましく、特に１乃至４の
ものが好ましい。例えばメチル基、エチル基、ブチル基
を挙げることができる。これらのアルキル基は置換基を
有していてもよく置換基としては、例えばウレイド基、
テトラヒドロフリル基、カルボキシル基、メタンスルホ
ンアミド基、スルホ基、メトキシ基、エトキシ基、メト
キシエトキシ基、メトキシエトキシエトキシ基、メトキ
シテトラエトキシ基が挙げられる。

【００２１】Ｄ,Ｇ及びＪとしては水素原子、アルコキ
シ基及びアルキルスルホンアミド基、アリールスルホン
アミド基が好ましく、更に好ましくは水素原子である。
Ｅとしては水素原子、アルキル基、アシルアミド基が好
ましく、より好ましくは炭素原子数１〜３のアルキル基
特にメチル基である。また、化１で示される化合物の塩
としてはｐ−トルエンスルホン酸、スルホン酸、スルフ
ィン酸、硫酸エステル、スルファミン酸、チオ硫酸Ｓ−
エステル、カルボン酸、燐酸エステル、アミド燐酸、燐
酸、亜燐酸エステル、有機硼素化合物、塩酸及び硫酸等
の有機酸又は無機酸の塩を挙げることができ、特にｐ−
トルエンスルホン酸塩、塩酸塩及び硫酸塩が好ましい。

【００２２】以下に本発明に係る芳香族第１級アミン化
合物の代表的具体例を示すが、本発明はこれに限定され
るものではない。

【００２３】例示化合物 （１−１）Ｎ，Ｎ−ジエチル−３−メチル−４−アミノ
アニリン （１−２）Ｎ，Ｎ−ジエチル−４−アミノアニリン （１−３）Ｎ−カルバミドメチル−Ｎ−メチル−４−ア
ミノアニリン （１−４）Ｎ−カルバミドメチル−Ｎ−テトラヒドロフ
ルフリル−３−メチル−４−アミノアニリン （１−５）Ｎ−エチル−Ｎ−カルボキシメチル−３−メ
チル−４−アミノアニリン （１−６）Ｎ−カルバミドメチル−Ｎ−エチル−３−メ
チル−４−アミノアニリン （１−７）Ｎ−エチル−Ｎ−テトラヒドロフルフリル−
３−メチル−４−アミノフエノール （１−８）３−アセチルアミノ−４−アミノジメチルア
ニリン （１−９）Ｎ−エチル−Ｎ−βメタンスルホンアミドエ
チル−４−アミノアニリン （１−１０）Ｎ−エチル−Ｎ−β−メタンスルホンアミ
ドエチル−３−メチル−４−アミノアニリン （１−１１）Ｎ−メチル−Ｎ−βスルホエチル−ｐ−フ
ェニレンジアミン （１−１２）Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチル−３−
メチル−４−アミノアニリン （１−１３）Ｎ−エチル−Ｎ−〔２−（２−メトキシエ
トキシ）エチル〕−３−メチル−４−アミノアニリン （１−１４）Ｎ−エチル−Ｎ−〔２−〔２−（２−メト
キシエトキシ）エトキシ〕エチル〕−３−メチル−４−
アミノアニリン （１−１５）Ｎ−エチル−Ｎ−〔２−〔２−〔２−〔２
−（２−メトキシエトキシエトキシ）エトキシ〕エトキ
シ〕エトキシ〕エチル〕−３−メチル−４−アミノアニ
リン （１−１６）Ｎ，Ｎ−ジエチル−３−メタンスルホンア
ミドエチル−４−アミノアニリン。

【００２４】化１で示される化合物の塩は、一般的に水
溶性であり、水若しくは緩衝液中に容易に溶解する事が
できる。

【００２５】本発明で化１で示される化合物の溶液の安
定化のために、アスコルビン酸又はその塩が使用され
る。アスコルビン酸の塩は、アルカリ金属塩が好ましく
使用されるが、特に好ましくはカリウム塩又はナトリウ
ム塩である。好ましい濃度としては０．１〜５００ｍｇ
／ｍｌであり、特に好ましい濃度は１〜１００ｍｇ／ｍ
ｌである。

【００２６】本発明において使用し得るフェノール化合
物若しくは活性メチレン化合物は、芳香族第一級アミン
化合物の酸化体とカップリングして色素を生成する化合
物であり、該生成色素の水に対する溶解性を減ずるた
め、適当な置換基を置換した化合物群である。

【００２７】このようなフェノール化合物若しくは活性
メチレン化合物については、ハロゲン化銀カラー写真に
おいて、シアンカプラー若しくはイエローカプラー、マ
ゼンタカプラーとしてよく知られている。またフェノー
ル化合物の活性点の水素原子又は活性メチレンの２つの
水素原子のうち１つが、芳香族第一級アミン化合物の酸
化体とのカップリング反応によって脱離する基によって
置換されている場合も含まれる。これらの化合物につい
ては、Ｔ．Ｈ．ジェムス（Ｔ．Ｈ．Ｊａｍｅｓ）著「ザ
・セオリ・オブ・ザ・フォトグラフィック・プロセス」
（Ｔｈｅ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｈｏｔｏｇ
ｒａｐｈｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓ）（第３版）第１７章及
び（第４版）第１２章に記載されている。

【００２８】シアンカプラーとしては、フェノール誘導
体、１−ナフトール誘導体が挙げられ、その例について
は特開昭６３−６４６２号に記載されている。マゼンタ
カプラーとしては、５−ピラゾロン誘導体、ピラゾロ
〔２，３−ａ〕ベンツイミダゾール誘導体、ピラゾロ−
（３，２−ｃ）−５−トリアゾール誘導体、シアノアセ
チル置換複素環式化合物（シアノアセチル、クロマン、
−チオフェン、−キノリン誘導体）、インダゾロン誘導
体が好ましい例として挙げられ、イエローカプラーとし
ては、アシルアセトニトリル誘導体、アシルアセトアミ
ド誘導体、１，３ジケトン誘導体が挙げられる。これら
の例については特開昭６３−７１６５４号に記載されて
いる。

【００２９】以下に本発明のフェノール化合物及び活性
メチレン化合物の代表的具体例を示すが、本発明に用い
られる化合物はこれに限定されるものではない。

【００３０】例示化合物 Ｃ−１ ２−ベンジル−４−クロロフェノール Ｃ−２ Ｎ−ベンゾイル−４，６−ジクロロ−５−メチ
ル−２−アミノフェノール Ｃ−３ ２−ベンゾイルアミノ−５−アセトアミノ−４
−クロロフェノール Ｃ−４ ４−クロロ−１−ナフトール Ｃ−５ ４−メトキシ−１−ナフトール Ｃ−６ ２，４−ジクロロ−１−ナフトール Ｃ−７ １−ヒドロキシ−４−ブロモ−Ｎ−エチル−２
−ナフトアミド Ｃ−８ １−ヒドロキシ−４−メトキシ−Ｎ−プロピル
−２−ナフトアミド Ｃ−９ ２，６−ジブロモ−１，５−ジヒドロキシ−ナ
フタレン Ｃ−１０ １−ヒドロキシ−５−フェニルスルホンアミ
ドナフトール Ｃ−１１ １−ヒドロキシ−２，４−ジクロロ−５−ニ
トロ−ナフトール

【００３１】

【化２】

【００３２】

【化３】

【００３３】

【化４】

【００３４】

【化５】

【００３５】

【化６】

【００３６】本発明に於て特定成分は支持体に物理的吸
着、化学的結合等により直接的に担持されてもよく、１
つ以上の特異結合物質を介して間接的に担持されてもよ
い。又、特定成分を支持体上に直接若しくは間接的に担
持せしめた後、前記標識体を反応させ前記複合結合体を
形成させてもよいし、或は複合結合体を形成せしめた後
に該複合結合体を支持体上に直接若しくは間接的に担持
せしめてもよい。更に標識体は該特定成分と複合結合体
を形成し、支持体に担持されるが、特定成分と標識体は
直接結合してもよく、１つ以上の他の特異結合物質を介
して結合してもよい。

【００３７】また本発明に於て標識体はパーオキシダー
ゼと抗パーオキシダーゼ抗体とで特異結合物質を重複し
て標識したものであってもよい。

【００３８】複合結合体中のパーオキシダーゼの酵素反
応の基質としては、過酸化水素、芳香族第一級アミン化
合物及びフェノール化合物若しくは活性メチレン化合物
を用いる。パーオキシダーゼと過酸化水素の作用により
芳香族第一級アミン化合物は酸化され、次いでフェノー
ル化合物若しくは活性メチレン化合物とカップリングし
て色素が生成、沈着する。従来の過酸化水素及び４−ク
ロロ−１−ナフトールを基質として用いるアナリティカ
ルバイオケミストリー（ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ）１１９、１４２−１４７（１９８
２）に記載の方法と比べ本発明の方法は発色時間が短縮
され、スポットは鮮明で感度は１０倍以上上昇した。ま
た、その結果、パーオキシダーゼ標識体の量を低減する
事ができコスト的にも有利である。

【００３９】本発明において、対象とする特定成分は、
その特定成分に特異的に結合する特異結合物質が得られ
る物質又は物質群である。

【００４０】例えば蛋白質、核酸、ホルモン、脂質、複
合糖質、糖脂質、多糖類、酵素、ビタミン、抗原、抗体
等が挙げられる。

【００４１】また本発明に使用し得る特異結合物質は、
特定成分又は他の特異結合物質と特異的に結合できる物
質であり、特定成分に応じて適当に選ぶ事ができる。例
えば、蛋白質、核酸、ホルモン、脂質、複合糖質、糖脂
質、多糖類、酵素、ビタミン、抗原、抗体、レクチン、
プロテインＡ、アビジン、ビオチン、レセプター、補酵
素、酵素の基質、毒素、補体及びこれらの複合体等が挙
げられる。本発明に使用し得る支持体としては、セルロ
ースアセテート、ニトロセルロース等の膜、ポリアクリ
ルアミド等のゲル状支持体、ＴＬＣプレート等のシリカ
ゲル担体、プレート状、ビーズ状のプラスチック、ガラ
ス、金属、繊維等が挙げられる。また組織化学染色にお
いては、組織そのものも支持体として使用できる。

【００４２】支持体に担持された特定成分とパーオキシ
ダーゼ標識体との複合結合体上に色素を生成沈着せしめ
るには発色用基質試液中に支持体を浸漬させれば良い。
発色用基質試験液は、適当なｐＨの緩衝液中に過酸化水
素、芳香族第一級アミン化合物及び活性メチレン化合物
を溶解し、調製される。活性メチレン化合物は、少量の
親水性の有機溶剤例えばメタノール、エタノール、ＤＭ
Ｆ等に溶解して加えても良い。芳香族第一級アミン化合
物と活性メチレン化合物とのモル比は１対１００から１
００対１が適当であり、１対１０から１０対１が好まし
い。

【００４３】酵素反応により支持体上に色素が充分生成
沈着した後、未反応物質を洗い流し、反応を停止する。

【００４４】生成色素についての情報は、目視にて、若
しくは技術的に公知な方法例えば分光光度計を用いて読
み取る事ができる。

【００４５】また、本発明のパーオキシダーゼ免疫染色
キットとして、例えば、下記の構成により芳香族第一級
アミン化合物を液状試薬として供給できる。下記の試薬
は発色反応を行わせる直前に調製する。また、試薬Ａと
Ｂは点滴ビンに入れてキット化することが好ましい。

【００４６】試薬Ａ：芳香族第一級アミン化合物とアス
コルビン酸又はその塩を含有する水溶液 試薬Ｂ：フェノール化合物若しくは活性メチレン化合物
を含有するアルコール溶液 試薬Ｃ：３％過酸化水素水 試薬Ｄ：緩衝液（トリスバッファーなど）。

【００４７】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明はその実施例によりその範囲を限定される
ものではない。

【００４８】実施例１ （１）芳香族第１級アミン化合物の保存溶液の調製 Ｎ−エチル−Ｎ−β−メタンスルホンアミドエチル−３
−メチル−４−アミノアニリン３／２硫酸１水塩２４０
ｍｇ及び表１に示す量のＬ−アスコルビン酸を純水１０
ｍｌに溶解した。比較対象として、Ｌ−アスコルビン酸
を溶解しないものも同様に調製した。

【００４９】この溶液を４０℃にて保存し、その経時的
変化を目視上及び性能上で評価した。

【００５０】（２）性能の評価 ａ）発色液の調製 ４−クロロ−１−ナフトールの３０ｍｇを１０ｍｌのメ
タノールに溶解し、これに５０ｍｌの０．１Ｍトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ７．４、２００ｍＭ ＮａＣｌ含有；以
下ＴＢＳと称す）を加える。更に（１）で調製した溶液
４００μｌを加え、更に３％過酸化水素４００μｌを加
え発色液を調製した。

【００５１】ｂ）発色能の評価 メタノールに２０分間浸漬した後に純水に１時間以上浸
漬したＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）に燐酸緩衝食塩水
（ｐＨ７．４；以下ＰＢＳと称す）にて段階希釈したマ
ウスＩｇＧをブロッティング装置（バイオラッド社製）
を用いてドットブロットした。このＰＶＤＦ膜に対し、
０．５％カゼインナトリウム−ＰＢＳ溶液にて４℃にて
一晩ブロッキングを行い、次いでパーオキシダーゼ標識
ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（カッペル社製：０．５％カ
ゼイン−ＰＢＳ溶液にて１５００倍希釈したもの）と４
℃にて２時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０
（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート；和光
純薬社製）−ＰＢＳ溶液にて５回洗浄し、発色液中に浸
漬し発色させた。１０分後に取り出し、水洗後に乾燥さ
せ、目視にて検出限界を確認した。

【００５２】（３）結果 性能を評価した結果を表１に示す。

【００５３】

【表１】

【００５４】表１から、本発明の試薬溶液が、保存性も
良好で、検出能力も優れていることが解る。

【００５５】実施例２ 実施例１の（１）においてＮ−エチル−Ｎ−β−メタン
スルホンアミドエチル−３−メチル−４−アミノアニリ
ン３／２硫酸１水塩の代わりにＮ，Ｎ−ジエチル−３−
メチル−４−アミノアニリン塩酸塩を用いた場合も同様
の結果を得た。

【００５６】また、（１）においてＬ−アスコルビン酸
の代わりにＬ−アスコルビン酸ナトリウムを用いた場合
も同様の結果を得た。

【００５７】

【発明の効果】簡易に且つ高感度、高分解能でありしか
も迅速な特定成分の測定方法が得られ、パーオキシダー
ゼ免疫染色法で使用される芳香族第一級アミン化合物溶
液の長期安定化方法が得られた。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 パーオキシダーゼ免疫染色法において、
   色原体として使用されるフェノール化合物若しくは活性
   メチレン化合物とカップリングして色素を形成する芳香
   族第一級アミン化合物の溶液にアスコルビン酸又はその
   塩を存在させることを特徴とするパーオキシダーゼ免疫
   染色法。
2. 【請求項２】 色原体として使用されるフェノール化合
   物若しくは活性メチレン化合物とカップリングして色素
   を形成する芳香族第一級アミン化合物の溶液にアスコル
   ビン酸又はその塩を存在させることを特徴とする該溶液
   の安定化方法。
3. 【請求項３】 少なくともフェノール化合物若しくは活
   性メチレン化合物を含む溶液とアスコルビン酸又はその
   塩を含有する芳香族第一級アミン化合物の溶液からなる
   ことを特徴とするパーオキシダーゼ免疫染色キット。