JPH06324040A - パーオキシダーゼ免疫染色法及び芳香族第一級アミン化合物溶液の安定化方法 - Google Patents
パーオキシダーゼ免疫染色法及び芳香族第一級アミン化合物溶液の安定化方法Info
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- JPH06324040A JPH06324040A JP11068693A JP11068693A JPH06324040A JP H06324040 A JPH06324040 A JP H06324040A JP 11068693 A JP11068693 A JP 11068693A JP 11068693 A JP11068693 A JP 11068693A JP H06324040 A JPH06324040 A JP H06324040A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 簡易に且つ高感度、高分解能でありしかも迅
速な特定成分の測定方法を提供することであり、パーオ
キシダーゼ免疫染色法で使用される芳香族第一級アミン
化合物溶液の長期安定化方法の提供。 【構成】 パーオキシダーゼ免疫染色法において、色原
体として使用されるフェノール化合物もしくは活性メチ
レン化合物とカップリングして色素を形成する芳香族第
一級アミン化合物の溶液に亜硫酸塩を存在させることを
特徴とするパーオキシダーゼ免疫染色法。
速な特定成分の測定方法を提供することであり、パーオ
キシダーゼ免疫染色法で使用される芳香族第一級アミン
化合物溶液の長期安定化方法の提供。 【構成】 パーオキシダーゼ免疫染色法において、色原
体として使用されるフェノール化合物もしくは活性メチ
レン化合物とカップリングして色素を形成する芳香族第
一級アミン化合物の溶液に亜硫酸塩を存在させることを
特徴とするパーオキシダーゼ免疫染色法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はパーオキシダーゼ免疫染
色法に関し、特に色素形成反応に用いる芳香族第一級ア
ミン化合物溶液の安定化方法に関する。
色法に関し、特に色素形成反応に用いる芳香族第一級ア
ミン化合物溶液の安定化方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】生体成分などの特定成分を検出する各種
の分析法が開発されて来ているが、それらの方法の中最
も精度の高い方法として、該特定成分とこれに対して特
異的に結合しうる物質(以後特異結合物質と称する)、例
えば抗原と抗体、ある種の糖鎖とレクチン、ビオチンと
アビジン、プロテインＡとＩｇＧ、ホルモンとレセプ
タ、酵素と基質等の間の特異的結合反応を用いる方法が
知られている。
の分析法が開発されて来ているが、それらの方法の中最
も精度の高い方法として、該特定成分とこれに対して特
異的に結合しうる物質(以後特異結合物質と称する)、例
えば抗原と抗体、ある種の糖鎖とレクチン、ビオチンと
アビジン、プロテインＡとＩｇＧ、ホルモンとレセプ
タ、酵素と基質等の間の特異的結合反応を用いる方法が
知られている。
【０００３】一般的には何らかの標識(ラベル)を付した
特異結合物質(以後標識体と称する)を用い特定成分に応
じて変化した該標識のシグナルを検出することにより特
定成分の測定が行われる。
特異結合物質(以後標識体と称する)を用い特定成分に応
じて変化した該標識のシグナルを検出することにより特
定成分の測定が行われる。
【０００４】特に支持体に直接的にまたは間接的に担持
させた特定成分を標識体と反応させ、両者の複合体とし
て標識体を固定し、実質的に特定成分に応じた標識から
のシグナルを検出する方法が適宜用いられる。
させた特定成分を標識体と反応させ、両者の複合体とし
て標識体を固定し、実質的に特定成分に応じた標識から
のシグナルを検出する方法が適宜用いられる。
【０００５】例えば電気泳動した蛋白質生体成分(特定
成分)をゲルからニトロセルローズ膜上に転写担持し、
標識体たとえば抗体標識体と反応させシグナルを検出す
る方法、ＴＬＣプレート上に展開した脂質等の特定成分
に標識体を反応させシグナルを検出する方法、膜上でＤ
ＮＡと該ＤＮＡに対する標識した相補的ＤＮＡとを反応
させシグナルを検出する方法或は免疫組織化学染色法な
どである。
成分)をゲルからニトロセルローズ膜上に転写担持し、
標識体たとえば抗体標識体と反応させシグナルを検出す
る方法、ＴＬＣプレート上に展開した脂質等の特定成分
に標識体を反応させシグナルを検出する方法、膜上でＤ
ＮＡと該ＤＮＡに対する標識した相補的ＤＮＡとを反応
させシグナルを検出する方法或は免疫組織化学染色法な
どである。
【０００６】これらの方法により、特定成分の定量や特
定成分の特異結合物質との反応性だけでなく、特定成分
もしくは特異結合物質の性質、存在状態などに対する多
大な情報をうることができる。例えば電気泳動後膜上に
転写、担持された蛋白質や核酸、またはＴＬＣ上に展開
した脂質成分等の生体の特定成分と該特定成分に対する
標識体とを結合させた複合体上にシグナルを検出する方
法に於ては特定成分のシグナルの位置、移動度から該特
定成分の分子量、等電点或は極性等の情報がえられる。
定成分の特異結合物質との反応性だけでなく、特定成分
もしくは特異結合物質の性質、存在状態などに対する多
大な情報をうることができる。例えば電気泳動後膜上に
転写、担持された蛋白質や核酸、またはＴＬＣ上に展開
した脂質成分等の生体の特定成分と該特定成分に対する
標識体とを結合させた複合体上にシグナルを検出する方
法に於ては特定成分のシグナルの位置、移動度から該特
定成分の分子量、等電点或は極性等の情報がえられる。
【０００７】また免疫組織化学染色法に於ては、組織上
の目的とする特定成分の存在場所、状態等の情報がえら
れる。
の目的とする特定成分の存在場所、状態等の情報がえら
れる。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】前記した、支持体上に
直接または間接的に担持させた複合結合体上に実質的に
特定成分量に応じてシグナルを検出する特定成分の測定
では対象とする特定成分が微量であるため標識が高感度
に検出されること、また特定成分に対するより多くの情
報をうるため標識の検出法が高い分解能をもったもので
あることが必須である。
直接または間接的に担持させた複合結合体上に実質的に
特定成分量に応じてシグナルを検出する特定成分の測定
では対象とする特定成分が微量であるため標識が高感度
に検出されること、また特定成分に対するより多くの情
報をうるため標識の検出法が高い分解能をもったもので
あることが必須である。
【０００９】特異結合物質の標識としては、放射性同位
元素、蛍光物質、発光物質、酵素等が用いられている。
放射性同位元素は放射活性の減衰や廃棄、被曝或は設費
に巨費を要する等の問題があり、更に支持体に担持させ
た標識体上にシグナルを検出する際には写真感光材料の
感光、現像など長い時間と煩雑な操作を要する欠点があ
る。蛍光物質もしくは発光物質は特殊な装置、設備が必
要である。
元素、蛍光物質、発光物質、酵素等が用いられている。
放射性同位元素は放射活性の減衰や廃棄、被曝或は設費
に巨費を要する等の問題があり、更に支持体に担持させ
た標識体上にシグナルを検出する際には写真感光材料の
感光、現像など長い時間と煩雑な操作を要する欠点があ
る。蛍光物質もしくは発光物質は特殊な装置、設備が必
要である。
【００１０】一方、酵素を用いた場合、操作も比較的簡
単で生成色素はたやすく可視化でき、定量も可能であ
る。従来、標識酵素としてパーオキシダーゼ、アルカリ
フォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ等が用いられ
てきた。支持体上に担持せしめた複合結合体上に酵素反
応により色素を生成、沈着させる方法において、標識酵
素としてパーオキシダーゼが主として用いられ、その
際、定量的に発生する過酸化水素に応じて、色素を生成
せしめて定量する方法が知られている。そして、色素生
成反応として、フェノール化合物もしくは活性メチレン
化合物と芳香族第一級アミン化合物をカップリングする
方法がよく知られている。しかし、前記カップリング反
応を行う際、従来芳香族第一級アミン化合物の溶液は、
不安定であるので使用直前に調製していた。
単で生成色素はたやすく可視化でき、定量も可能であ
る。従来、標識酵素としてパーオキシダーゼ、アルカリ
フォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ等が用いられ
てきた。支持体上に担持せしめた複合結合体上に酵素反
応により色素を生成、沈着させる方法において、標識酵
素としてパーオキシダーゼが主として用いられ、その
際、定量的に発生する過酸化水素に応じて、色素を生成
せしめて定量する方法が知られている。そして、色素生
成反応として、フェノール化合物もしくは活性メチレン
化合物と芳香族第一級アミン化合物をカップリングする
方法がよく知られている。しかし、前記カップリング反
応を行う際、従来芳香族第一級アミン化合物の溶液は、
不安定であるので使用直前に調製していた。
【００１１】従って本発明の目的は、簡易に且つ高感
度、高分解能でありしかも迅速な特定成分の測定方法を
提供することであり、パーオキシダーゼ免疫染色法で使
用される芳香族第一級アミン化合物溶液の長期安定化方
法の提供にある。
度、高分解能でありしかも迅速な特定成分の測定方法を
提供することであり、パーオキシダーゼ免疫染色法で使
用される芳香族第一級アミン化合物溶液の長期安定化方
法の提供にある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明の上記目的は、パ
ーオキシダーゼ免疫染色法において、色原体として使用
されるフェノール化合物もしくは活性メチレン化合物と
カップリングして色素を形成する芳香族第一級アミン化
合物の溶液に亜硫酸塩を存在させることを特徴とするパ
ーオキシダーゼ免疫染色法により達成される。
ーオキシダーゼ免疫染色法において、色原体として使用
されるフェノール化合物もしくは活性メチレン化合物と
カップリングして色素を形成する芳香族第一級アミン化
合物の溶液に亜硫酸塩を存在させることを特徴とするパ
ーオキシダーゼ免疫染色法により達成される。
【００１３】次に本発明を詳細に説明する。
【００１４】本発明において使用し得る芳香族第一級ア
ミン化合物としては、o−又はp−アミノフェノール系化
合物及びo−又はp−フェニレンジアミン系化合物及びそ
れらの塩が挙げられる。
ミン化合物としては、o−又はp−アミノフェノール系化
合物及びo−又はp−フェニレンジアミン系化合物及びそ
れらの塩が挙げられる。
【００１５】好ましくはp−フェニレンジアミン系化合
物であり下記化１で示されるものである。
物であり下記化１で示されるものである。
【００１６】
【化１】
【００１７】式中、Ａ及びＢは水素原子またはアルキル
基を表し、ＡとＢは窒素原子と共に複素環を形成しても
よく、Ｄ,Ｅ,Ｇ及びＪは水素原子、ハロゲン原子、ヒド
ロキシ基、アミノ基、アルコキシ基、アシルアミド基、
アリールスルホンアミド基、アルキルスルホンアミド基
またはアルキル基を表わす。
基を表し、ＡとＢは窒素原子と共に複素環を形成しても
よく、Ｄ,Ｅ,Ｇ及びＪは水素原子、ハロゲン原子、ヒド
ロキシ基、アミノ基、アルコキシ基、アシルアミド基、
アリールスルホンアミド基、アルキルスルホンアミド基
またはアルキル基を表わす。
【００１８】Ａ及びＢで表されるアルキル基としては、
炭素原子数１乃至６のものが好ましく、特に１乃至４の
ものが好ましい。例えばメチル基、エチル基、ブチル基
を挙げることができる。これらのアルキル基は置換基を
有していてもよく置換基としては、例えばウレイド基、
テトラヒドロフリル基、カルボキシル基、メタンスルホ
ンアミド基、スルホ基、メトキシ基、エトキシ基、メト
キシエトキシ基、メトキシエトキシエトキシ基、メトキ
シテトラエトキシ基が挙げられる。
炭素原子数１乃至６のものが好ましく、特に１乃至４の
ものが好ましい。例えばメチル基、エチル基、ブチル基
を挙げることができる。これらのアルキル基は置換基を
有していてもよく置換基としては、例えばウレイド基、
テトラヒドロフリル基、カルボキシル基、メタンスルホ
ンアミド基、スルホ基、メトキシ基、エトキシ基、メト
キシエトキシ基、メトキシエトキシエトキシ基、メトキ
シテトラエトキシ基が挙げられる。
【００１９】Ｄ,Ｇ及びＪとしては水素原子、アルコキ
シ基及びアルキルスルホンアミド基、アリールスルホン
アミド基が好ましく、さらに好ましくは水素原子であ
る。Ｅとしては水素原子、アルキル基、アシルアミド基
が好ましく、より好ましくは炭素原子数１〜３のアルキ
ル基特にメチル基である。また、化１で示される化合物
の塩としてはp−トルエンスルホン酸、スルホン酸、ス
ルフイン酸、硫酸エステル、スルファミン酸、チオ硫酸
Ｓ−エステル、カルボン酸、燐酸エステル、アミド燐
酸、燐酸、亜燐酸エステル、有機硼素化合物、塩酸及び
硫酸等の有機酸又は無機酸の塩を挙げることができ、特
にp−トルエンスルホン酸塩、塩酸塩及び硫酸塩が好ま
しい。
シ基及びアルキルスルホンアミド基、アリールスルホン
アミド基が好ましく、さらに好ましくは水素原子であ
る。Ｅとしては水素原子、アルキル基、アシルアミド基
が好ましく、より好ましくは炭素原子数１〜３のアルキ
ル基特にメチル基である。また、化１で示される化合物
の塩としてはp−トルエンスルホン酸、スルホン酸、ス
ルフイン酸、硫酸エステル、スルファミン酸、チオ硫酸
Ｓ−エステル、カルボン酸、燐酸エステル、アミド燐
酸、燐酸、亜燐酸エステル、有機硼素化合物、塩酸及び
硫酸等の有機酸又は無機酸の塩を挙げることができ、特
にp−トルエンスルホン酸塩、塩酸塩及び硫酸塩が好ま
しい。
【００２０】以下に本発明に係る芳香族第１級アミン化
合物の代表的具体例を示すが、本発明はこれに限定され
るものではない。
合物の代表的具体例を示すが、本発明はこれに限定され
るものではない。
【００２１】例示化合物 (１−１)Ｎ,Ｎ−ジエチル−３−メチル−４−アミノア
ニリン (１−２)Ｎ,Ｎ−ジエチル−４−アミノアニリン (１−３)Ｎ−カルバミドメチル−Ｎ−メチル−４−アミ
ノアニリン (１−４)Ｎ−カルバミドメチル−Ｎ−テトラヒドロフル
フリル−３−メチル−４−アミノアニリン(１−５)Ｎ−
エチル−Ｎ−カルボキシメチル−３−メチル−４−アミ
ノアニリン (１−６)Ｎ−カルバミドメチル−Ｎ−エチル−３−メチ
ル−４−アミノアニリン (１−７)Ｎ−エチル−Ｎ−テトラヒドロフルフリル−３
−メチル−４−アミノフエノール (１−８)３−アセチルアミノ−４−アミノジメチルアニ
リン (１−９)Ｎ−エチル−Ｎ−βメタンスルホンアミドエチ
ル−４−アミノアニリン (１−10)Ｎ−エチル−Ｎ−β−メタンスルホンアミドエ
チル−３−メチル−４−アミノアニリン (１−11)Ｎ−メチル−Ｎ−βスルホエチル−p−フェニ
レンジアミン (１−12)Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチル−３−メチ
ル−４−アミノアニリン (１−13)Ｎ−エチル−Ｎ−〔２−(２−メトキシエトキ
シ)エチル〕−３−メチル−４−アミノアニリン (１−14)Ｎ−エチル−Ｎ−{２−〔２−(２−メトキシエ
トキシ)エトキシ〕エチル}−３−メチル−４−アミノア
ニリン (１−15)Ｎ−エチル−Ｎ−〔２−{２−〔２−〔２−(２
−メトキシエトキシエトキシ)エトキシ〕エトキシ〕エ
トキシ}エチル〕−３−メチル−４−アミノアニリン (１−16)Ｎ,Ｎ−ジエチル−３−メタンスルホンアミド
エチル−４−アミノアニリン。
ニリン (１−２)Ｎ,Ｎ−ジエチル−４−アミノアニリン (１−３)Ｎ−カルバミドメチル−Ｎ−メチル−４−アミ
ノアニリン (１−４)Ｎ−カルバミドメチル−Ｎ−テトラヒドロフル
フリル−３−メチル−４−アミノアニリン(１−５)Ｎ−
エチル−Ｎ−カルボキシメチル−３−メチル−４−アミ
ノアニリン (１−６)Ｎ−カルバミドメチル−Ｎ−エチル−３−メチ
ル−４−アミノアニリン (１−７)Ｎ−エチル−Ｎ−テトラヒドロフルフリル−３
−メチル−４−アミノフエノール (１−８)３−アセチルアミノ−４−アミノジメチルアニ
リン (１−９)Ｎ−エチル−Ｎ−βメタンスルホンアミドエチ
ル−４−アミノアニリン (１−10)Ｎ−エチル−Ｎ−β−メタンスルホンアミドエ
チル−３−メチル−４−アミノアニリン (１−11)Ｎ−メチル−Ｎ−βスルホエチル−p−フェニ
レンジアミン (１−12)Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチル−３−メチ
ル−４−アミノアニリン (１−13)Ｎ−エチル−Ｎ−〔２−(２−メトキシエトキ
シ)エチル〕−３−メチル−４−アミノアニリン (１−14)Ｎ−エチル−Ｎ−{２−〔２−(２−メトキシエ
トキシ)エトキシ〕エチル}−３−メチル−４−アミノア
ニリン (１−15)Ｎ−エチル−Ｎ−〔２−{２−〔２−〔２−(２
−メトキシエトキシエトキシ)エトキシ〕エトキシ〕エ
トキシ}エチル〕−３−メチル−４−アミノアニリン (１−16)Ｎ,Ｎ−ジエチル−３−メタンスルホンアミド
エチル−４−アミノアニリン。
【００２２】化１で示される化合物の塩は、一般的に水
溶性であり、水もしくは緩衝液中に容易に溶解する事が
できる。
溶性であり、水もしくは緩衝液中に容易に溶解する事が
できる。
【００２３】本発明で化１で示される化合物の溶液の安
定化のために使用される亜硫酸塩は、アルカリ金属塩或
いはアンモニウム塩が好ましく使用されるが、特に好ま
しくはカリウム塩又はナトリウム塩である。好ましい濃
度としては0.01〜1000mg／mlであり、特に好ましい濃度
は0.1〜100mg／mlである。
定化のために使用される亜硫酸塩は、アルカリ金属塩或
いはアンモニウム塩が好ましく使用されるが、特に好ま
しくはカリウム塩又はナトリウム塩である。好ましい濃
度としては0.01〜1000mg／mlであり、特に好ましい濃度
は0.1〜100mg／mlである。
【００２４】本発明において使用し得るフェノール化合
物もしくは活性メチレン化合物は、芳香族第一級アミン
化合物の酸化体とカップリングして色素を生成する化合
物であり、該生成色素の水に対する溶解性を減ずるた
め、適当な置換基を置換した化合物群である。
物もしくは活性メチレン化合物は、芳香族第一級アミン
化合物の酸化体とカップリングして色素を生成する化合
物であり、該生成色素の水に対する溶解性を減ずるた
め、適当な置換基を置換した化合物群である。
【００２５】このようなフェノール化合物もしくは活性
メチレン化合物については、ハロゲン化銀カラー写真に
おいて、シアンカプラーもしくはイエローカプラー、マ
ゼンタカプラーとしてよく知られている。またフェノー
ル化合物の活性点の水素原子又は活性メチレンの２つの
水素原子のうち１つが、芳香族第一級アミン化合物の酸
化体とのカップリング反応によって脱離する基によって
置換されている場合も含まれる。これらの化合物につい
ては、T.H.ジェムス(T.H.James)著「ザ・セオリ・オブ・
ザ・フォトグラフィック・プロセス」(The Theory of th
e PhotographicProcess)(第３版)第17章及び(第４版)第
12章に記載されている。
メチレン化合物については、ハロゲン化銀カラー写真に
おいて、シアンカプラーもしくはイエローカプラー、マ
ゼンタカプラーとしてよく知られている。またフェノー
ル化合物の活性点の水素原子又は活性メチレンの２つの
水素原子のうち１つが、芳香族第一級アミン化合物の酸
化体とのカップリング反応によって脱離する基によって
置換されている場合も含まれる。これらの化合物につい
ては、T.H.ジェムス(T.H.James)著「ザ・セオリ・オブ・
ザ・フォトグラフィック・プロセス」(The Theory of th
e PhotographicProcess)(第３版)第17章及び(第４版)第
12章に記載されている。
【００２６】シアンカプラーとしては、フェノール誘導
体、１−ナフトール誘導体が挙げられ、その例について
は特開昭63-6462号に記載されている。マゼンタカプラ
ーとしては、５‐ピラゾロン誘導体、ピラゾロ[2,3‐a]
ベンツイミダゾール誘導体、ピラゾロ‐(3,2‐c)‐５‐
トリアゾール誘導体、シアノアセチル置換複素環式化合
物(シアノアセチル、クロマン、‐チオフェン、‐キノ
リン誘導体)、インダゾロン誘導体が好ましい例として
挙げられ、イエローカプラーとしては、アシルアセトニ
トリル誘導体、アシルアセトアミド誘導体、1,3ジケト
ン誘導体が挙げられる。これらの例については特開昭63
-71654に記載されている。
体、１−ナフトール誘導体が挙げられ、その例について
は特開昭63-6462号に記載されている。マゼンタカプラ
ーとしては、５‐ピラゾロン誘導体、ピラゾロ[2,3‐a]
ベンツイミダゾール誘導体、ピラゾロ‐(3,2‐c)‐５‐
トリアゾール誘導体、シアノアセチル置換複素環式化合
物(シアノアセチル、クロマン、‐チオフェン、‐キノ
リン誘導体)、インダゾロン誘導体が好ましい例として
挙げられ、イエローカプラーとしては、アシルアセトニ
トリル誘導体、アシルアセトアミド誘導体、1,3ジケト
ン誘導体が挙げられる。これらの例については特開昭63
-71654に記載されている。
【００２７】以下に本発明のフェノール化合物及び活性
メチレン化合物の代表的具体例を示すが、本発明に用い
られる化合物はこれに限定されるものではない。
メチレン化合物の代表的具体例を示すが、本発明に用い
られる化合物はこれに限定されるものではない。
【００２８】例示化合物 Ｃ−１ 2-ベンジル-4-クロロフェノール Ｃ−２ N-ベンゾイル-4,6-ジクロロ-5-メチル-2-
アミノフェノール Ｃ−３ 2-ベンゾイルアミノ-5-アセトアミノ-4-ク
ロロフェノール Ｃ−４ 4-クロロ-1-ナフトール Ｃ−５ 4-メトキシ-1-ナフトール Ｃ−６ 2,4-ジクロロ-1-ナフトール Ｃ−７ 1-ヒドロキシ-4-ブロモ-N-エチル-2-ナフ
トアミド Ｃ−８ 1-ヒドロキシ-4-メトキシ-N-プロピル-2-
ナフトアミド Ｃ−９ 2,6-ジブロモ-1,5-ジヒドロキシ-ナフタレ
ン Ｃ−10 1-ヒドロキシ-5-フェニルスルホンアミド
ナフトール Ｃ−11 1-ヒドロキシ-2,4-ジクロロ-5-ニトロ-ナ
フトール
アミノフェノール Ｃ−３ 2-ベンゾイルアミノ-5-アセトアミノ-4-ク
ロロフェノール Ｃ−４ 4-クロロ-1-ナフトール Ｃ−５ 4-メトキシ-1-ナフトール Ｃ−６ 2,4-ジクロロ-1-ナフトール Ｃ−７ 1-ヒドロキシ-4-ブロモ-N-エチル-2-ナフ
トアミド Ｃ−８ 1-ヒドロキシ-4-メトキシ-N-プロピル-2-
ナフトアミド Ｃ−９ 2,6-ジブロモ-1,5-ジヒドロキシ-ナフタレ
ン Ｃ−10 1-ヒドロキシ-5-フェニルスルホンアミド
ナフトール Ｃ−11 1-ヒドロキシ-2,4-ジクロロ-5-ニトロ-ナ
フトール
【００２９】
【化２】
【００３０】
【化３】
【００３１】
【化４】
【００３２】
【化５】
【００３３】
【化６】
【００３４】本発明に於て特定成分は支持体に物理的吸
着、化学的結合等により直接的に担持されてもよく、１
つ以上の特異結合物質を介して間接的に担持されてもよ
い。又、特定成分を支持体上に直接もしくは間接的に担
持せしめた後、前記標識体を反応させ前記複合結合体を
形成させてもよいし、或は複合結合体を形成せしめた後
に該複合結合体を支持体上に直接もしくは間接的に担持
せしめてもよい。更に標識体は該特定成分と複合結合体
を形成し、支持体に担持されるが、特定成分と標識体は
直接結合してもよく、１つ以上の他の特異結合物質を介
して結合してもよい。
着、化学的結合等により直接的に担持されてもよく、１
つ以上の特異結合物質を介して間接的に担持されてもよ
い。又、特定成分を支持体上に直接もしくは間接的に担
持せしめた後、前記標識体を反応させ前記複合結合体を
形成させてもよいし、或は複合結合体を形成せしめた後
に該複合結合体を支持体上に直接もしくは間接的に担持
せしめてもよい。更に標識体は該特定成分と複合結合体
を形成し、支持体に担持されるが、特定成分と標識体は
直接結合してもよく、１つ以上の他の特異結合物質を介
して結合してもよい。
【００３５】また本発明に於て標識体はパーオキシダー
ゼと抗パーオキシダーゼ抗体とで特異結合物質を重複し
て標識したものであってもよい。
ゼと抗パーオキシダーゼ抗体とで特異結合物質を重複し
て標識したものであってもよい。
【００３６】複合結合体中のパーオキシダーゼの酵素反
応の基質としては、過酸化水素、芳香族第一級アミン化
合物及びフェノール化合物もしくは活性メチレン化合物
を用いる。パーオキシダーゼと過酸化水素の作用により
芳香族第一級アミン化合物は酸化され、次いでフェノー
ル化合物もしくは活性メチレン化合物とカップリングし
て色素が生成、沈着する。 従来の過酸化水素及び４−
クロロ−１−ナフトールを基質として用いるアナリティ
カルバイオケミストリー(Analytical Biochemistry)11
9、142−147(1982)に記載の方法と比べ本発明の方法は
発色時間が短縮され、スポットは鮮明で感度は10倍以上
上昇した。また、その結果、パーオキシダーゼ標識体の
量を低減する事ができコスト的にも有利である。
応の基質としては、過酸化水素、芳香族第一級アミン化
合物及びフェノール化合物もしくは活性メチレン化合物
を用いる。パーオキシダーゼと過酸化水素の作用により
芳香族第一級アミン化合物は酸化され、次いでフェノー
ル化合物もしくは活性メチレン化合物とカップリングし
て色素が生成、沈着する。 従来の過酸化水素及び４−
クロロ−１−ナフトールを基質として用いるアナリティ
カルバイオケミストリー(Analytical Biochemistry)11
9、142−147(1982)に記載の方法と比べ本発明の方法は
発色時間が短縮され、スポットは鮮明で感度は10倍以上
上昇した。また、その結果、パーオキシダーゼ標識体の
量を低減する事ができコスト的にも有利である。
【００３７】本発明において、対象とする特定成分は、
その特定成分に特異的に結合する特異結合物質が得られ
る物質又は物質群である。
その特定成分に特異的に結合する特異結合物質が得られ
る物質又は物質群である。
【００３８】たとえば蛋白質、核酸、ホルモン、脂質、
複合糖質、糖脂質、多糖類、酵素、ビタミン、抗原、抗
体等が挙げられる。
複合糖質、糖脂質、多糖類、酵素、ビタミン、抗原、抗
体等が挙げられる。
【００３９】また本発明に使用し得る特異結合物質は、
特定成分又は他の特異結合物質と特異的に結合できる物
質であり、特定成分に応じて適当に選ぶ事ができる。た
とえば、蛋白質、核酸、ホルモン、脂質、複合糖質、糖
脂質、多糖類、酵素、ビタミン、抗原、抗体、レクチ
ン、プロテインＡ、アビジン、ビオチン、レセプター、
補酵素、酵素の基質、毒素、補体及びこれらの複合体等
が挙げられる。本発明に使用し得る支持体としては、セ
ルロースアセテート、ニトロセルロース等の膜、ポリア
クリルアミド等のゲル状支持体、ＴＬＣプレート等のシ
リカゲル担体、プレート状、ビーズ状のプラスチック、
ガラス、金属、繊維等が挙げられる。また組織化学染色
においては、組織そのものも支持体として使用できる。
特定成分又は他の特異結合物質と特異的に結合できる物
質であり、特定成分に応じて適当に選ぶ事ができる。た
とえば、蛋白質、核酸、ホルモン、脂質、複合糖質、糖
脂質、多糖類、酵素、ビタミン、抗原、抗体、レクチ
ン、プロテインＡ、アビジン、ビオチン、レセプター、
補酵素、酵素の基質、毒素、補体及びこれらの複合体等
が挙げられる。本発明に使用し得る支持体としては、セ
ルロースアセテート、ニトロセルロース等の膜、ポリア
クリルアミド等のゲル状支持体、ＴＬＣプレート等のシ
リカゲル担体、プレート状、ビーズ状のプラスチック、
ガラス、金属、繊維等が挙げられる。また組織化学染色
においては、組織そのものも支持体として使用できる。
【００４０】支持体に担持された特定成分とパーオキシ
ダーゼ標識体との複合結合体上に色素を生成沈着せしめ
るには発色用基質試液中に支持体を浸漬させれば良い。
発色用基質試験液は、適当なpHの緩衝液中に過酸化水
素、芳香族第一級アミン化合物及び活性メチレン化合物
を溶解し、調製される。活性メチレン化合物は、少量の親
水性の有機溶剤たとえばメタノール、エタノール、DMF等
に溶解して加えても良い。芳香族第一級アミン化合物と
活性メチレン化合物とのモル比は1対100から100対1が適
当であり、1対10から10対1が好ましい。
ダーゼ標識体との複合結合体上に色素を生成沈着せしめ
るには発色用基質試液中に支持体を浸漬させれば良い。
発色用基質試験液は、適当なpHの緩衝液中に過酸化水
素、芳香族第一級アミン化合物及び活性メチレン化合物
を溶解し、調製される。活性メチレン化合物は、少量の親
水性の有機溶剤たとえばメタノール、エタノール、DMF等
に溶解して加えても良い。芳香族第一級アミン化合物と
活性メチレン化合物とのモル比は1対100から100対1が適
当であり、1対10から10対1が好ましい。
【００４１】酵素反応により支持体上に色素が充分生成
沈着した後、未反応物質を洗い流し、反応を停止する。
沈着した後、未反応物質を洗い流し、反応を停止する。
【００４２】生成色素についての情報は、目視にて、もし
くは技術的に公知な方法たとえば分光光度計を用いて読
み取る事ができる。
くは技術的に公知な方法たとえば分光光度計を用いて読
み取る事ができる。
【００４３】
【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明はその実施例によりその範囲を限定される
ものではない。
るが、本発明はその実施例によりその範囲を限定される
ものではない。
【００４４】実施例１ （１）芳香族第１級アミン化合物の保存溶液の調製 Ｎ−エチル−Ｎ−β−メタンスルホンアミドエチル−３
−メチル−４−アミノアニリン３／２硫酸１水塩２５０
ｍｇ及び表１に示す量の亜硫酸カリウムを純水１０ｍｌ
に溶解した。比較対象として、亜硫酸カリウムを溶解し
ないものも同様に調製した。
−メチル−４−アミノアニリン３／２硫酸１水塩２５０
ｍｇ及び表１に示す量の亜硫酸カリウムを純水１０ｍｌ
に溶解した。比較対象として、亜硫酸カリウムを溶解し
ないものも同様に調製した。
【００４５】この溶液を３７℃にて保存し、その経時的
変化を目視上及び性能上で評価した。
変化を目視上及び性能上で評価した。
【００４６】（２）性能の評価 ａ）発色液の調製 ４−クロロ−１−ナフトールの３０ｍｇを１０ｍｌのメ
タノールに溶解し、これに５０ｍｌの５０ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ７．４、２００ｍＭ ＮａＣｌ含有；以
下ＴＢＳと称す）を加える。さらに（１）で調製した溶
液４００μｌを加え、さらに３％過酸化水素４００μｌ
を加え発色液を調製した。
タノールに溶解し、これに５０ｍｌの５０ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ７．４、２００ｍＭ ＮａＣｌ含有；以
下ＴＢＳと称す）を加える。さらに（１）で調製した溶
液４００μｌを加え、さらに３％過酸化水素４００μｌ
を加え発色液を調製した。
【００４７】ｂ）発色能の評価 メタノールに１０分間浸漬した後に純水に１時間以上浸
漬したＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）に燐酸緩衝食塩水
（ｐＨ７．４；以下ＰＢＳと称す）にて段階希釈したヤ
ギＩｇＧをブロッティング装置（バイオラッド社製）を
用いてドットブロットした。このＰＶＤＦ膜に対し、１
％牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと称す）−ＰＢＳ溶液
にて４℃にて一晩ブロッキングを行い、次いでパーオキ
シダーゼ標識ウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体（カッペル社製：
１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液にて１５００倍希釈したもの）
と４゜Ｃにて２時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ
−２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレー
ト；和光純薬社製）−ＰＢＳ溶液にて５回洗浄し、発色
液中に浸漬し発色させた。１０分後に取り出し、水洗後
に乾燥させ、目視にて検出限界を確認した。
漬したＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）に燐酸緩衝食塩水
（ｐＨ７．４；以下ＰＢＳと称す）にて段階希釈したヤ
ギＩｇＧをブロッティング装置（バイオラッド社製）を
用いてドットブロットした。このＰＶＤＦ膜に対し、１
％牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと称す）−ＰＢＳ溶液
にて４℃にて一晩ブロッキングを行い、次いでパーオキ
シダーゼ標識ウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体（カッペル社製：
１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液にて１５００倍希釈したもの）
と４゜Ｃにて２時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ
−２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレー
ト；和光純薬社製）−ＰＢＳ溶液にて５回洗浄し、発色
液中に浸漬し発色させた。１０分後に取り出し、水洗後
に乾燥させ、目視にて検出限界を確認した。
【００４８】（３）結果 性能を評価した結果を表１に示す。
【００４９】
【表１】
【００５０】表１から、本発明の試薬溶液が、保存性も
良好で、検出能力も優れていることが解る。
良好で、検出能力も優れていることが解る。
【００５１】実施例２ 実施例１の（１）においてＮ−エチル−Ｎ−β−メタン
スルホンアミドエチル−３−メチル−４−アミノアニリ
ン３／２硫酸１水塩の代わりにＮ，Ｎ−ジエチル−３−
メチル−４−アミノアニリン塩酸塩を用いた場合も同様
の結果を得た。また、（１）において亜硫酸カリウムの
代わりに亜硫酸ナトリウムを用いた場合も同様の結果を
得た。
スルホンアミドエチル−３−メチル−４−アミノアニリ
ン３／２硫酸１水塩の代わりにＮ，Ｎ−ジエチル−３−
メチル−４−アミノアニリン塩酸塩を用いた場合も同様
の結果を得た。また、（１）において亜硫酸カリウムの
代わりに亜硫酸ナトリウムを用いた場合も同様の結果を
得た。
【００５２】
【発明の効果】簡易に且つ高感度、高分解能でありしか
も迅速な特定成分の測定方法が得られ、パーオキシダー
ゼ免疫染色法で使用される芳香族第一級アミン化合物溶
液の長期安定化方法が得られた。
も迅速な特定成分の測定方法が得られ、パーオキシダー
ゼ免疫染色法で使用される芳香族第一級アミン化合物溶
液の長期安定化方法が得られた。
Claims (2)
- 【請求項１】 パーオキシダーゼ免疫染色法において、
色原体として使用されるフェノール化合物もしくは活性
メチレン化合物とカップリングして色素を形成する芳香
族第一級アミン化合物の溶液に亜硫酸塩を存在させるこ
とを特徴とするパーオキシダーゼ免疫染色法。 - 【請求項２】 パーオキシダーゼ免疫染色法において、
色原体として使用されるフェノール化合物もしくは活性
メチレン化合物とカップリングして色素を形成する芳香
族第一級アミン化合物の溶液に亜硫酸塩を存在させるこ
とを特徴とする該溶液の安定化方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11068693A JPH06324040A (ja) | 1993-05-12 | 1993-05-12 | パーオキシダーゼ免疫染色法及び芳香族第一級アミン化合物溶液の安定化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11068693A JPH06324040A (ja) | 1993-05-12 | 1993-05-12 | パーオキシダーゼ免疫染色法及び芳香族第一級アミン化合物溶液の安定化方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06324040A true JPH06324040A (ja) | 1994-11-25 |
Family
ID=14541882
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11068693A Pending JPH06324040A (ja) | 1993-05-12 | 1993-05-12 | パーオキシダーゼ免疫染色法及び芳香族第一級アミン化合物溶液の安定化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06324040A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002010744A1 (fr) * | 2000-08-01 | 2002-02-07 | International Reagents Corporation | Procede pour pretraiter un echantillon |
-
1993
- 1993-05-12 JP JP11068693A patent/JPH06324040A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002010744A1 (fr) * | 2000-08-01 | 2002-02-07 | International Reagents Corporation | Procede pour pretraiter un echantillon |
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