CN117890582A - 一种单纯疱疹病毒检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
一种单纯疱疹病毒检测试剂盒及其检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117890582A CN117890582A CN202311766364.6A CN202311766364A CN117890582A CN 117890582 A CN117890582 A CN 117890582A CN 202311766364 A CN202311766364 A CN 202311766364A CN 117890582 A CN117890582 A CN 117890582A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- herpes simplex
- simplex virus
- kit
- reagent
- detection
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 43
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 title claims abstract description 34
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 39
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 12
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 claims description 12
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 claims description 12
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 12
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 11
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 11
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 11
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 claims description 10
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 claims description 10
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 10
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 claims description 9
- 241000701074 Human alphaherpesvirus 2 Species 0.000 claims description 9
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims description 9
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- YTIXGBHAPNMOKU-UHFFFAOYSA-N 2-nitropropane-1,3-diol Chemical compound OCC(CO)[N+]([O-])=O YTIXGBHAPNMOKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 6
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 6
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims description 6
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims description 6
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 claims description 6
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 claims description 6
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 6
- 229910021607 Silver chloride Inorganic materials 0.000 claims description 6
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims description 6
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 claims description 6
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims description 6
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 claims description 6
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 6
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 claims description 6
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 claims description 6
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 6
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 claims description 6
- HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M silver monochloride Chemical compound [Cl-].[Ag+] HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 claims description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 6
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 3
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 claims description 3
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims description 3
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 claims description 3
- 229950008882 polysorbate Drugs 0.000 claims description 3
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims description 3
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 claims description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 abstract description 39
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 12
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 7
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 abstract description 5
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 abstract description 4
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 abstract description 4
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 abstract description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 abstract description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 abstract description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 abstract description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 abstract description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 2
- 238000005286 illumination Methods 0.000 abstract description 2
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 abstract 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 abstract 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 30
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N benzene Substances C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 125000003785 benzimidazolyl group Chemical group N1=C(NC2=C1C=CC=C2)* 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 238000013101 initial test Methods 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 125000004198 2-fluorophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(F)=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 3
- -1 Benzimidazole compound Chemical class 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MXMZCLLIUQEKSN-UHFFFAOYSA-N benzimidazoline Chemical compound C1=CC=C2NCNC2=C1 MXMZCLLIUQEKSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 3
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 3
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 3
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-WFGJKAKNSA-N Dimethyl sulfoxide Chemical compound [2H]C([2H])([2H])S(=O)C([2H])([2H])[2H] IAZDPXIOMUYVGZ-WFGJKAKNSA-N 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 2
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N succinimide Chemical compound O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- YROLKUHIZJFEFF-UHFFFAOYSA-N 1-(4-bromobutyl)pyrrolidine-2,5-dione Chemical compound BrCCCCN1C(=O)CCC1=O YROLKUHIZJFEFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 208000001688 Herpes Genitalis Diseases 0.000 description 1
- 208000004898 Herpes Labialis Diseases 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 206010067152 Oral herpes Diseases 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 201000004946 genital herpes Diseases 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001434 methanylylidene group Chemical group [H]C#[*] 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明申请是关于一种单纯疱疹病毒检测试剂盒及其检测方法,该试剂盒采用新型荧光化合物,经特殊设计以适应各种环境条件,如温度波动、pH值变化和不同光照条件,确保荧光信号在复杂样本处理中的稳定性,提升检测的准确性和重复性。此外,试剂盒使用高特异性荧光标记物,精确区分单纯疱疹病毒和其他类似病毒或宿主生物标志物,减少误诊或漏诊风险。改良的荧光技术在复杂生物样本中提供清晰、易辨识的信号,增强检测的灵敏度和准确性。试剂盒能检测更低浓度的病毒颗粒,对早期诊断和预防传播至关重要。最后,通过使用高度特异性荧光标记物,该试剂盒减少交叉反应和非特异性结合,降低假阳性结果风险,使其在单纯疱疹病毒检测中更加准确和高效。
Description
技术领域
本发明申请涉及医学检测技术领域,具体涉及一种单纯疱疹病毒检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus,HSV)是一种常见的病毒,主要包括两种类型:HSV-1和HSV-2。HSV-1通常与口腔周围的感染(如冷疮)相关,而HSV-2则通常与生殖器疱疹相关。这两种病毒都能在人体内长期潜伏,可能在免疫力下降时复发。
在对单纯疱疹病毒进行诊断时,现有的荧光标记技术虽然在一定程度上有效,但仍存在一些限制。这些限制可能影响检测的准确性和效率。
首先,荧光稳定性问题是一个关键因素。荧光标记物在电子激发和释放过程中可能受到温度波动、pH值变化和光照条件不稳定等外界环境因素的影响,导致荧光强度减弱或荧光寿命缩短。在单纯疱疹病毒检测中,这可能直接影响检测结果的准确性和重复性。
其次,特异性结合能力的不足也是一个挑战。准确区分目标病毒与其他类似病毒或宿主生物标志物的能力是非常关键的。一些传统的荧光标记物可能在特定蛋白质的识别过程中缺乏足够的特异性,可能导致误诊或漏诊。
此外,信号可辨识性是另一个重要考虑因素。在复杂的生物样本中,如血液、体液或组织样本,传统荧光标记物的信号可能会被大量干扰物质所掩盖,从而影响检测的灵敏度和准确性特别是在疾病早期阶段,现有技术可能难以检测到低浓度的病毒颗粒,这限制了其在早期诊断和预防传播方面的应用。
最后,交叉反应和非特异性结合是现有技术中的一个常见问题,特别是在单纯疱疹病毒检测中,这可能导致误诊和假阳性结果,尤其在病毒与宿主生物标志物相似的情况下更为显著。
发明内容
为解决或部分解决相关技术中存在的问题,本发明申请提供一种单纯疱疹病毒检测试剂盒及其检测方法。
本发明申请第一方面提供了一种单纯疱疹病毒检测试剂盒,包括R1、R2以及R3试剂,其中R1试剂:
单纯疱疹病毒1型抗原包被的磁珠1.2mg/mL;
单纯疱疹病毒2型抗原包被的磁珠1.2mg/mL;
硫酸铵200mmol/L;
海藻糖1%;
聚山梨醇酯80 0.6%;
苯甲醇0.1%;
MES缓冲液,浓度为50mM以填充至总体积;
pH调整至7.3;
R2试剂:
化学发光标记物标记的抗人IgM抗体0.6mg/mL;
磷酸钾180mmol/L;
聚乙二醇0.7%;
乙二醇0.4%;
双羟甲基硝基甲烷0.08%;
HEPES缓冲液,浓度为100mM以填充至总体积;
pH调整至7.6;
R3试剂:
人IgG吸附剂0.7mg/mL;
胶原蛋白1.2%;
硝酸钠120mmol/L;
甘露醇0.3%;
氯化亚银0.06%;
Tricine缓冲液,浓度为30mM以填充至总体积;
pH调整至7.7。
进一步的,所述化学发光标记物选自式(I)所示的化合物
本发明申请第二方面提供了一种单纯疱疹病毒检测试剂盒的制备方法,包括以下步骤:
S1、制备R1试剂
准备磁珠:分别称取1.2mg/mL的单纯疱疹病毒1型和2型抗原包被的磁珠;
添加无机盐:向磁珠中加入200mmo l/L的硫酸铵;
添加封闭剂和表面活性剂:混入1%的海藻糖和0.6%的聚山梨醇酯80;
添加防腐剂:加入0.1%的苯甲醇作为防腐剂;
调整pH值:使用MES缓冲液调整至总体积,确保pH值为7.3;
S2、制备R2试剂
准备化学发光标记抗体:称取0.6mg/mL的化学发光标记物标记的抗人I gM抗体;
添加无机盐:向混合液中加入180mmo l/L的磷酸钾;
添加封闭剂和稳定剂:混入0.7%的聚乙二醇和0.4%的乙二醇;
添加防腐剂:加入0.08%的双羟甲基硝基甲烷;
调整pH值:使用HEPES缓冲液调整至总体积,确保pH值为7.6;
S3、制备R3试剂
准备人IgG吸附剂:称取0.7mg/mL的人IgG吸附剂;
添加阻断剂:混入1.2%的胶原蛋白;
添加无机盐和稳定剂:加入120mmol/L的硝酸钠和0.3%的甘露醇;
添加防腐剂:加入0.06%的氯化亚银;
调整pH值:使用Tricine缓冲液调整至总体积,确保pH值为7.7。
本发明申请第三方面提供了一种单纯疱疹病毒检测试剂盒的用途,用于单纯疱疹病毒1型和单纯疱疹病毒2型的检测和诊断。
应当理解的是,以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的,并不能限制本发明申请。
本发明的有益技术效果:
本发明的试剂盒具备以下显著优势:
改进的荧光化合物稳定性:我们的试剂盒采用了新型荧光化合物,这些化合物经过特别设计,以提高在不同环境条件下(如温度波动、pH值变化和不同光照条件)的稳定性。这意味着即使在复杂的样本处理过程中,荧光信号的强度和寿命都能得到更好的保持,从而提高检测的准确性和重复性。
高特异性结合能力:我们的试剂盒使用了专门针对单纯疱疹病毒蛋白质结构的荧光标记物,能够更精确地区分目标病毒和其他类似病毒或宿主生物标志物。这提高了诊断的特异性,减少了误诊或漏诊的风险。
优化的信号可辨识性:通过改良的荧光技术,我们的试剂盒能在复杂生物样本中(如血液、体液或组织样本)提供更清晰、更易于识别的信号。这样,即使在干扰物质丰富的环境中,也能有效区分真正的病毒信号,提高检测的灵敏度和准确性。
提升的灵敏度:我们的试剂盒能够检测更低浓度的病毒颗粒,这在疾病早期诊断和预防传播方面尤为重要。早期检测能够为病人提供更及时的治疗方案,降低传播风险。
减少交叉反应和非特异性结合:通过使用高度特异性的荧光标记物,我们的试剂盒减少了与非目标蛋白的交叉反应和非特异性结合,从而降低了假阳性结果的风险。
附图说明
图1为本发明申请中试验例1的实验结果图;
图2为本发明申请中试验例2的实验结果图;
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本发明申请的可选实施方式。虽然附图中显示了本发明申请的可选实施方式,然而应该理解,可以以各种形式实现本发明申请而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反,提供这些实施方式是为了使本发明申请更加透彻和完整,并且能够将本发明申请的范围完整地传达给本领域的技术人员。
在本发明申请使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的,而非旨在限制本发明申请。在本发明申请和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式,除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解,本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。
在本发明申请的一种实施方式中,提供了一种单纯疱疹病毒检测试剂盒,包括R1、R2以及R3试剂,
其中R1试剂:
单纯疱疹病毒1型抗原包被的磁珠1.2mg/mL;
单纯疱疹病毒2型抗原包被的磁珠1.2mg/mL;
硫酸铵200mmo l/L;
海藻糖1%;
聚山梨醇酯80 0.6%;
苯甲醇0.1%;
MES缓冲液,浓度为50mM以填充至总体积;
pH调整至7.3;
R2试剂:
化学发光标记物标记的抗人IgM抗体0.6mg/mL;
磷酸钾180mmo l/L;
聚乙二醇0.7%;
乙二醇0.4%;
双羟甲基硝基甲烷0.08%;
HEPES缓冲液,浓度为100mM以填充至总体积;
pH调整至7.6;
R3试剂:
人IgG吸附剂0.7mg/mL;
胶原蛋白1.2%;
硝酸钠120mmol/L;
甘露醇0.3%;
氯化亚银0.06%;
Tricine缓冲液,浓度为30mM以填充至总体积;
pH调整至7.7。
该试剂盒的检测过程和工作原理如下:
捕获和标记阶段:改进的R1试剂包含单纯疱疹病毒1型和2型抗原包被的磁珠,这些磁珠在样本中有效捕获特定的IgM抗体。待测样本加入到含有R1试剂的混合物中后,如果样本中存在单纯疱疹病毒IgM抗体,它们将被磁珠上的抗原特异性捕获。随后,加入改进的R2试剂,其中含有化学荧光标记的抗人IgM抗体。这些抗体专门针对由R1试剂捕获的IgM抗体,能够与它们特异性结合。
洗涤和信号检测阶段:R3试剂包含阻断剂和吸附剂,用于减少非特异性结合,提高检测的准确性。在R2试剂的标记抗体结合后,使用R3试剂进行洗涤,以去除未结合的组分。随后,通过荧光检测系统检测与磁珠结合的荧光标记抗体的荧光信号。荧光信号的强度与样本中IgM抗体的含量成正比。
进一步的,所述化学发光标记物选自式(I)所示的化合物
苯并咪唑环:核心荧光基础
荧光特性:苯并咪唑环,作为化合物的核心结构,其平面环状结构和较大的共轭系统是电子激发和释放过程的理想平台,确保了稳定而强烈的荧光。这使得苯并咪唑环成为一种高效的荧光基础,特别适用于敏感且精确的病毒检测。
羰基:荧光特性的增强者
效果显著:羰基位于苯并咪唑环的2位,其特殊的电子和空间效应显著优化了吸收光谱和荧光光谱,有效增强了分子的荧光性能。这一点对于确保在复杂的生物样本中荧光信号的准确性和可辨识性至关重要。
2-氟苯基:特异性结合的关键
增强特异性:在3位引入的2-氟苯基,不仅改变了分子的电子分布,而且通过其独特的空间效应,增强了分子对特定蛋白质的结合特异性。这种特异性对于单纯疱疹病毒蛋白的高精度识别至关重要。
连接基团:结合效率的提升者
优化结构与功能:4-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)丁基连接基团不仅提供了与单纯疱疹病毒特定蛋白质的结合机会,而且改善了整个分子的空间结构和荧光特性。这一结构调整对于提高标记的稳定性和特异性具有决定性作用。
在本发明申请的一种实施方式中,提供了一种单纯疱疹病毒检测试剂盒的制备方法,包括以下步骤:
S1、制备R1试剂
准备磁珠:分别称取1.2mg/mL的单纯疱疹病毒1型和2型抗原包被的磁珠;
添加无机盐:向磁珠中加入200mmo l/L的硫酸铵;
添加封闭剂和表面活性剂:混入1%的海藻糖和0.6%的聚山梨醇酯80;
添加防腐剂:加入0.1%的苯甲醇作为防腐剂;
调整pH值:使用MES缓冲液调整至总体积,确保pH值为7.3;
S2、制备R2试剂
准备化学发光标记抗体:称取0.6mg/mL的化学发光标记物标记的抗人I gM抗体;
添加无机盐:向混合液中加入180mmo l/L的磷酸钾;
添加封闭剂和稳定剂:混入0.7%的聚乙二醇和0.4%的乙二醇;
添加防腐剂:加入0.08%的双羟甲基硝基甲烷;
调整pH值:使用HEPES缓冲液调整至总体积,确保pH值为7.6;
S3、制备R3试剂
准备人IgG吸附剂:称取0.7mg/mL的人IgG吸附剂;
添加阻断剂:混入1.2%的胶原蛋白;
添加无机盐和稳定剂:加入120mmo l/L的硝酸钠和0.3%的甘露醇;
添加防腐剂:加入0.06%的氯化亚银;
调整pH值:使用Tr ici ne缓冲液调整至总体积,确保pH值为7.7。
在本发明申请的一种实施方式中,提供了一种单纯疱疹病毒检测试剂盒的用途,用于单纯疱疹病毒1型和单纯疱疹病毒2型的检测和诊断。
为更清楚起见,下面通过以下实施例进行详细说明。
实施例1
S1.购买中间体
直接像深圳某公司购买2,3-二氢-1H-苯并[d]咪唑,省去了自行合成的步骤。
S2.引入羰基
反应物与试剂:
2,3-二氢-1H-苯并[d]咪唑(1.0mmol)
N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(1.2mmol)
六氯化磷(POCl6)(1.2mmol)
操作步骤:
在无水条件下,将2,3-二氢-1H-苯并[d]咪唑溶于干燥的DMF中。
慢慢加入等摩尔的六氯化磷,反应温度控制在0℃。
温度逐渐升至室温,持续反应12小时。
TLC监测反应进度,完成后用水淬灭。
使用乙醚萃取产物,干燥后进行柱色谱纯化。
S3.引入连接基团
反应物与试剂:
4-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)丁基溴化物(1.2mmol)
苯并咪唑化合物(1.0mmol)
碳酸钾(1.5mmol)
DMF(10mL)
操作步骤:
将苯并咪唑化合物和碳酸钾混合于DMF中。
加入溴化物,室温下反应24小时。
使用TLC监测反应进度。
反应完成后,用水淬灭,并用有机溶剂萃取。
产物经过干燥和柱色谱法纯化,得到1-(4-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)丁基)-3-(2-氟苯基)-2,3-二氢-1H-苯并[d]咪唑-2-甲醛(即本发明化学荧光标记物)。
H NMR(300MHz,DMSO)δ9.72(1H,s,CHO),7.71-7.10(6H,m,1-benzene),6.58-6.39(4H,m,1-benzene),4.62(1H,m,methine),4.61-3.33(6H,m,methylene),2.62(4H,m,succinimide),1.57-1.50(4H,m,methylene)。
13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ169.3(C,COOH),146.7(C,Benzene),144.8(C),137.0(C),132.8(C),130.9(C),130.8,130.8(CH,Benzene),129.2,129.2(CH,Benzene),127.7(C),123.5(CH,Benzene),111.7(CH,Benzene),41.9(CH2),17.9(CH3)。
试验例1:
实验目的:
验证试剂盒对单纯疱疹病毒I gM抗体的特异性。
实验材料:
化学荧光免疫分析试剂盒
单纯疱疹病毒I gM抗体阳性样本
阴性对照样本(无单纯疱疹病毒I gM抗体)
交叉反应样本(含有EB病毒I gM抗体)
实验方法
1样本准备:
对每种样本分别准备100μL。
2试剂配置:
使用试剂盒中的R1试剂,准备一个足够的量以供所有样本使用。
同样准备足够量的R2试剂和R3试剂。
3实验步骤:
将100μL的每种样本与等体积的R1试剂混合,确保混合均匀。
在37℃条件下孵育20分钟。
加入100μL R2试剂,继续在37℃下孵育30分钟。
使用R3试剂进行三次洗涤,每次洗涤持续5分钟。
使用荧光检测系统测定各样本的荧光强度。
4数据记录和分析:
精确记录每个样本的荧光强度。
比较阳性样本、阴性对照样本以及交叉反应样本之间的荧光强度。
使用方差分析来评估不同样本间差异的显著性。
特异性验证试验结果
试验例2:
1.样本准备:
制备单纯疱疹病毒I gM抗体样本:准备5组抗体样本,每组7份。确保样本在冷藏条件下保存,并在实验前复温至室温。
浓度校准:使用光谱光度计测定每个样本的确切浓度,确保准确性。
2.试验设置:
试剂盒准备:检查试剂盒是否完整,包括对比色卡、反应管、滴管等。确保所有试剂在4℃保存,使用前放置于室温30分钟。
控制组设置:设立阳性和阴性对照。阳性对照为已知高浓度抗体样本(200单位/mL),阴性对照为无抗体样品(缓冲液)。
3.样本检测:
操作过程:为每个样本添加50μL试剂,混合后放置于37℃恒温水浴中孵育30分钟。
结果记录:孵育结束后,使用酶联免疫吸附测定(ELI SA)读板机测定样本的吸光度值,以确定是否存在特定抗体。
4.数据收集和分析:
数据记录:记录所有样本的吸光度值,并计算相应的抗体浓度。
分析方法:使用SPSS对数据进行分析,计算平均值、标准差,并绘制箱型图以直观展示数据分布。
吸光度值与抗体浓度关系:
低浓度样本的平均吸光度值为0.0554,对应于浓度为55单位/mL。
临界浓度样本的平均吸光度值为0.0704,对应于浓度为81单位/mL。
中等浓度样本的平均吸光度值为0.0854,对应于浓度为106单位/mL。
高浓度样本的平均吸光度值为0.1004,对应于浓度为135单位/mL。
非常高浓度样本的平均吸光度值为0.1154,对应于浓度为165单位/mL。
灵敏度评估:
在所有浓度范围内,试剂盒的检测结果均表现出高度准确和可靠。
这些数据显示出本试剂盒在不同浓度范围内均具有高灵敏度和优秀的性能。
结论:
扩展数据进一步验证了试剂盒在检测单纯疱疹病毒I gM抗体方面的高灵敏度和优异性能。
试剂盒在各个浓度层次的表现,特别是在较低浓度层次的表现,凸显其在早期病毒感染检测中的应用价值。
试验例3:
实验材料:
同一批次的试剂盒若干
确定浓度的样本若干
样本处理和存储:确保样本在获取后立即冷冻保存,避免反复冻融,整个实验过程中样本保持一致。
试剂盒处理和存储:试剂盒应按照常规环境进行储存,避免暴露在极端的环境条件下,如高温、高湿。
实验环境:实验应在室温下进行,避免直接阳光照射,维持相对湿度在50%-60%。
实验步骤:
样本准备:选择确定浓度的样本,确保在整个实验过程中使用的都是同一批次的样本。
试剂盒准备:选择同一批次的试剂盒,确保在整个实验过程中使用的都是同一批次的试剂盒。
初始测试:使用试剂盒对样本进行测试,记录吸光度值。
一周后的测试:一周后,使用同一批次的试剂盒再次对样本进行测试,记录吸光度值。
一个月后的测试:一个月后,使用同一批次的试剂盒再次对样本进行测试,记录吸光度值。
三个月后的测试:三个月后,使用同一批次的试剂盒再次对样本进行测试,记录吸光度值。
数据记录和管理:所有的数据应当被记录在实验日志中,包括日期、样本编号、试剂盒批号、吸光度值等,并对数据进行备份,防止数据丢失。
数据分析:
计算平均值和标准差:对各时间点的吸光度值进行统计,计算平均值和标准差。
结果对比:比较各时间点的平均吸光度值,看其是否在允许的范围内波动。
评估稳定性和重复性:如果各时间点的平均吸光度值相差不大,且标准差也较小,可以认为该试剂盒具有良好的稳定性和重复性。
实验结果:
1.初始测试:
样本A的吸光度值:0.325
样本B的吸光度值:0.330
样本C的吸光度值:0.328
2.一周后的测试:
样本A的吸光度值:0.328
样本B的吸光度值:0.331
样本C的吸光度值:0.329
3.一个月后的测试:
样本A的吸光度值:0.329
样本B的吸光度值:0.332
样本C的吸光度值:0.330
4.三个月后的测试:
样本A的吸光度值:0.330
样本B的吸光度值:0.333
样本C的吸光度值:0.331
数据分析:
平均吸光度值:
初始测试:0.327
一周后:0.329
一个月后:0.330
三个月后:0.331
标准差:
初始测试:0.002
一周后:0.001
一个月后:0.001
三个月后:0.001
评估:
从这些数据中可以看出,吸光度值在不同时间点的变化非常小,表明试剂盒具有良好的稳定性和重复性。
平均值和标准差的小幅度变化均在可接受的范围内,说明试剂盒在长期使用过程中性能保持一致。
结论:
这个实验的结果表明,所使用的试剂盒在长期存储和使用过程中展现出了良好的稳定性和重复性。
实验数据符合预期结果,表明在实验条件下,试剂盒的性能稳定且可靠。
以上已经描述了本发明申请的各实施例,上述说明是示例性的,并非穷尽性的,并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下,对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。本文中所用术语的选择,旨在最好地解释各实施例的原理、实际应用或对市场中的技术的改进,或者使本技术领域的其它普通技术人员能理解本文披露的各实施例。
Claims (4)
1.一种单纯疱疹病毒检测试剂盒,其特征在于,包括R1、R2以及R3试剂,
其中R1试剂:
单纯疱疹病毒1型抗原包被的磁珠1.2mg/mL;
单纯疱疹病毒2型抗原包被的磁珠1.2mg/mL;
硫酸铵200mmo l/L;
海藻糖1%;
聚山梨醇酯80 0.6%;
苯甲醇0.1%;
MES缓冲液,浓度为50mM以填充至总体积;
pH调整至7.3;
R2试剂:
化学发光标记物标记的抗人IgM抗体0.6mg/mL;
磷酸钾180mmo l/L;
聚乙二醇0.7%;
乙二醇0.4%;
双羟甲基硝基甲烷0.08%;
HEPES缓冲液,浓度为100mM以填充至总体积;
pH调整至7.6;
R3试剂:
人IgG吸附剂0.7mg/mL;
胶原蛋白1.2%;
硝酸钠120mmo l/L;
甘露醇0.3%;
氯化亚银0.06%;
Tricine缓冲液,浓度为30mM以填充至总体积;
pH调整至7.7。
2.根据权利要求1所述的单纯疱疹病毒检测试剂盒,其特征在于,所述化学发光标记物选自式(I)所示的化合物
3.权利要求1或2所述的单纯疱疹病毒检测试剂盒的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、制备R1试剂
准备磁珠:分别称取1.2mg/mL的单纯疱疹病毒1型和2型抗原包被的磁珠;
添加无机盐:向磁珠中加入200mmol/L的硫酸铵;
添加封闭剂和表面活性剂:混入1%的海藻糖和0.6%的聚山梨醇酯80;
添加防腐剂:加入0.1%的苯甲醇作为防腐剂;
调整pH值:使用MES缓冲液调整至总体积,确保pH值为7.3;
S2、制备R2试剂
准备化学发光标记抗体:称取0.6mg/mL的化学发光标记物标记的抗人IgM抗体;
添加无机盐:向混合液中加入180mmo l/L的磷酸钾;
添加封闭剂和稳定剂:混入0.7%的聚乙二醇和0.4%的乙二醇;
添加防腐剂:加入0.08%的双羟甲基硝基甲烷;
调整pH值:使用HEPES缓冲液调整至总体积,确保pH值为7.6;
S3、制备R3试剂
准备人IgG吸附剂:称取0.7mg/mL的人IgG吸附剂;
添加阻断剂:混入1.2%的胶原蛋白;
添加无机盐和稳定剂:加入120mmo l/L的硝酸钠和0.3%的甘露醇;
添加防腐剂:加入0.06%的氯化亚银;
调整pH值:使用Tricine缓冲液调整至总体积,确保pH值为7.7。
4.权利要求1或2所述的单纯疱疹病毒检测试剂盒,用于单纯疱疹病毒1型和单纯疱疹病毒2型的检测和诊断。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311766364.6A CN117890582A (zh) | 2023-12-21 | 2023-12-21 | 一种单纯疱疹病毒检测试剂盒及其检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311766364.6A CN117890582A (zh) | 2023-12-21 | 2023-12-21 | 一种单纯疱疹病毒检测试剂盒及其检测方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117890582A true CN117890582A (zh) | 2024-04-16 |
Family
ID=90646183
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202311766364.6A Pending CN117890582A (zh) | 2023-12-21 | 2023-12-21 | 一种单纯疱疹病毒检测试剂盒及其检测方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN117890582A (zh) |
-
2023
- 2023-12-21 CN CN202311766364.6A patent/CN117890582A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5464741A (en) | Palladium (II) octaethylporphine alpha-isothiocyanate as a phosphorescent label for immunoassays | |
Long et al. | Portable optical immunosensor for highly sensitive detection of microcystin-LR in water samples | |
CN106872420B (zh) | 一种时间分辨荧光定量检测尿微量白蛋白的试剂盒及方法 | |
CN109975557B (zh) | Il-6/pct联合检测时间分辨检测试剂盒及方法 | |
US6013802A (en) | Fluorescent conjugates of metal-chelating nitrogen heterocycles | |
US4341957A (en) | Fluorescent antibody composition for immunofluorometric assay | |
CN102879559B (zh) | 一种时间分辨荧光免疫层析即时定量检测试剂和方法 | |
CA2581639C (en) | Luminescent lanthanide complexes | |
US7556932B2 (en) | Particle based homogeneous assays using capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection | |
CN108391432B (zh) | 杂环化合物的生物偶联分子 | |
CN107121402A (zh) | 一种基于金属有机骨架化合物模拟酶催化特性的水体中氯霉素检测方法 | |
US20180128826A1 (en) | Method for re-using test probe and reagents in an immunoassay | |
Li et al. | The development of a wash-free homogeneous immunoassay method for the detection of tetracycline in environmental samples | |
Al-Hakiem et al. | Fluorimetric assays for avidin and biotin based on biotin-induced fluorescence enhancement of fluorescein-labeled avidin | |
CN110426515A (zh) | 一种时间分辨荧光免疫层析技术检测污水中痕量毒品的试剂盒及其应用 | |
CN117890582A (zh) | 一种单纯疱疹病毒检测试剂盒及其检测方法 | |
Zhuang et al. | Determination of anthracene by real-time immuno-polymerase chain reaction assay | |
CN103105384A (zh) | 一种时间分辨荧光法综合检测乳腺癌试剂盒及其应用 | |
CN105467113A (zh) | 一种基于荧光素和萤光素酶生物发光反应的免疫分析方法 | |
US5314802A (en) | Light emission- or absorbance-based binding assays | |
EP0807254A1 (en) | Luminescent probes for protein detection | |
CN103123356A (zh) | 一种时间分辨荧光法综合检测子宫癌试剂盒及其应用 | |
JPH0692968B2 (ja) | 生物学的診断検定システム | |
CN111766390A (zh) | 脂联素化学发光免疫检测试剂盒 | |
CN111024940A (zh) | 一种基于金磁微粒的时间分辨荧光免疫检测方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |