CN104698190A - 用于中枢神经系统脱髓鞘疾病的生物诊断标记物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于中枢神经系统脱髓鞘疾病的生物诊断标记物，所述生物诊断标记物是脑脊液中血小板衍生因子、趋化因子12和趋化因子14。中枢神经系统脱髓鞘疾病包括视神经炎ON和视神经脊髓炎NMO，且在视神经炎ON的不同阶段，还能通过监测脑脊液中血小板衍生因子和趋化因子12评估其病情变化，判断预后情况。本发明通过检测ON和NMO患者脑脊液中血小板衍生因子、趋化因子12和趋化因子14的水平和变化，发现了ON和NMO新的生物学标记物，评估其髓鞘再生能力，为ON和NMO的预后及转归提供实验依据，并为其治疗提供新的思路。

Description

用于中枢神经系统脱髓鞘疾病的生物诊断标记物

技术领域

本发明涉及医疗领域，具体是用于中枢神经系统脱髓鞘疾病的生物诊断标记物。

背景技术

视神经属于中枢神经系统，其神经纤维由少突胶质细胞组成的髓鞘所包裹。少突胶质细胞凋亡常引起ON(Optic neuritis，视神经炎)，是一种累及视神经进而导致轴突损伤的炎性脱髓鞘疾病。

ON是CIS(Clinically isolated syndrome，临床孤立综合征)的一种类型，在临床上，CIS病人可以进展为MS(Multiple sclerosis，多发性硬化)或NMO(Neuromyelitisoptica，视神经脊髓炎)等CNS(Central nervous system，中枢神经系统)脱髓鞘疾病。在脱髓鞘疾病中，CNS不但存在髓鞘的脱失，也存在轴索的损伤，就MS和NMO而言，NMO的病理学损伤在轴索上更为明显，特别是AQP4蛋白密集区域。在疾病早期，特别是ON初次发作的时候，AQP4-Ab，CSF-OCB等免疫指标为疾病的进展提供了一个很好的参考标准。但是由于随访时间、个体差异等因素，在ON首次发作后，疾病的预后和转归尚不能有较为合适的生物学指标作为参照。

西方国家报道以IDON(Idiopathic demyelinating optic neuritis，特发性脱髓鞘性视神经炎)最为常见，该种类型的ON与中枢神经系统疾病MS关系密切，ONTT研究小组经过长达15年的研究发现，成人患者中有近50％的孤立视神经炎患者(72％发病时颅脑MRI阳性，25％发病时颅脑MRI阴性)最终转化为MS。而在亚洲国家，关于NMO的报道较多。很长一段时间，对NMO是独立的疾病或MS亚型一直是有争议的，近些年的研究发现血清中AQP4(Aquaporin-4，水通道蛋白4)抗体是NMO较为特异的一项指标，在NMO诊断中有较高的敏感性(68-91％)和特异性(85-99％)。NMO除了部分原发进展型(10％)之外，多由反复发作的IDON发展而来(90％)。这部分最终发展为NMO的ON患者，在视神经脊髓炎首次发病的过程中，其临床表现和普通的ON极为相似。同时由于这部分ON患者血清中AQP4抗体的阳性率很低，仅约3-5％，因此并不能依靠AQP4抗体检测预判其疾病的转归。鉴于此，寻找新特异有效的生物学标记物及阻碍疾病髓鞘再生机制显得尤为重要。

髓鞘再生是中枢神经系统脱髓鞘性疾病发生后的重要修复方式，主要由OPCs(Oligodendrocyte precursor cells，少突胶质前体细胞)增殖分化形成具有功能性的少突胶质细胞，包绕轴突，重新执行神经纤维的传导和神经元的保护、营养等功能。但是在部分ON和NMO等脱髓鞘疾病中，髓鞘的再生明显被抑制，这可能是因为促进髓鞘修复的因子的缺乏和/或抑制髓鞘修复的因子的增加，而导致OPCs在病变部位成熟化(maturation)失败，使髓鞘再生受阻。

从上世纪末至今，有关MS和NMO生物标记的研究，为两种疾病的临床诊断、鉴别及治疗提供了重大支持。然而作为这两种CNS脱髓鞘疾病的一部分，在临床上首次发作的ON，其疾病走势仍是临床及科研工作中的一大难题。目前NMO的重要诊断指标AQP4-Ab往往在患者还处在ON阶段时无法检出。但是其他一些因子，尤其是与神经髓鞘再生相关的细胞因子，在近年来的研究中越来越受到重视。这些因子包括血小板衍生因子、趋化因子12和趋化因子14。

CXCL12(C-X-C motif ligand 12，趋化因子12)又名基质细胞衍生因子1(SDF-1)，属于CXC类趋化因子家族。CXCL12与CXCR4具有高度亲和力，二者形成的CXCL12/CXCR4轴在免疫介导及炎症反应、HIV感染、恶性肿瘤的侵润转移等过程中起到重要作用。近年来，Patel等人研究发现在脱髓鞘实验动物模型中阻断CXCL12/CXCR4信号通路减弱受损的中枢神经系统的髓鞘再生，这提示CXCL12可能参与调节OPCs迁移、增殖或分化形成少突胶质细胞的过程。另有研究显示，基因敲除CXCR4的动物在脱髓鞘模型中出现髓鞘修复障碍，并发展成为慢性脱髓鞘。可见，CXCL12在对抗中枢神经系统脱髓鞘疾病，并参与髓鞘修复的过程中起着至关重要的作用。另外，Tanegashima等人发现，另一个CXC类趋化因子家族成员CXCL14(C-X-C motif ligand 14，趋化因子14)可以竞争性结合CXCR4，从而阻断CXCL12/CXCR4信号通路。在动物实验中，PDGF(Platelet derived growth factor，血小板衍生因子)可以调节OPCs向脱髓鞘部位迁移，促进慢性脱髓性疾病的髓鞘再生。

但是截止到目前，PDGF、CXCL12、CXCL14在ON中的变化尚不清楚，因此检测PDGF、CXCL12和CXCL14在ON患者脑脊液中的变化，有可能找到新的诊断和转归判断的生物学标记，并有可能进一步揭示视神经炎发病和恢复的生理机制。

发明内容

本发明的目的在于提供用于中枢神经系统脱髓鞘疾病的生物诊断标记物，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

用于中枢神经系统脱髓鞘疾病的生物诊断标记物，所述生物诊断标记物是脑脊液中血小板衍生因子、趋化因子12和趋化因子14。

作为本发明进一步的方案：中枢神经系统脱髓鞘疾病包括视神经炎ON和视神经脊髓炎NMO，且在视神经炎ON的不同阶段，还能通过监测脑脊液中血小板衍生因子和趋化因子12评估其病情变化，判断预后情况。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过检测ON和NMO患者脑脊液中CXCL12、PDGF及CXCL14的水平和变化，发现了ON和NMO新的生物学标记物，评估其髓鞘再生能力，为ON和NMO的预后及转归提供实验依据，并为其治疗提供新的思路。

附图说明

图1是各组患者脑脊液CXCL12、PDGF及CXCL14水平(x±s，ng/ml)比较图，其中*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；

图2是ON不同发病时期CXCL12、PDGF水平(x±s，ng/ml)比较图，其中*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；

图3是MRI分组CXCL12、PDGF水平(x±s，ng/ml)的比较图，其中**P＜0.01，***P＜0.001；

图4是脑脊液CXCL12与PDGF的关系图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1实验

1.1研究对象

选取2012年9月至2013年9月期间就诊于解放军总医院神经眼科的55名患者。其中ON患者35人(以本次发病后4周为节点，分为急性期组18人及平稳期组17人)，NMO患者10人作为实验组。ON符合美国ONTT研究小组提出的视神经炎诊断标准。NMO则符合Wingerchuk等人提出的诊断标准。选取CVST(Cerebral venous sinus thrombosis，颅内静脉窦血栓形成)患者10人作为对照组，并且在性别、年龄上与ON、NMO组相匹配。所有受试者年龄均≥16岁，至少有3个月没有激素、免疫抑制剂或免疫调节剂治疗史，排除感染性视神经炎及其他眼部疾病和全身性疾病。

1.2临床资料及标本的收集

受试者均接受系统的眼科检查，包括最佳矫正视力、裂隙灯检查、直接及间接检眼镜检查、Goldmann眼压检测等。入院后行血清学检查和腰椎穿刺术检查，脑脊液除行常规(白细胞计数)、生化(蛋白质、葡萄糖)及免疫(IgG、IgA、IgM)检测外，留取第3管脑脊液3ml，500μl/EP管分装后立即置于-80℃冰箱中保存。对于CVST的患者还需结合颅脑MRV或者DSA检查除外其他疾病。视神经炎及NMO的患者还需进行系统的神经内科查体，必要时行眼眶、颅脑及颈胸椎MRI检查、视觉诱发电位(VEP)、OCT(Opticai coherencetomography，光学相干断层扫描)、ERG(Electroretinogram，视网膜电流图)等以明确诊断。

1.3 CXCL12、PDGF及CXCL14检测

三种细胞因子均采用ELISA方法检测，最后以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的回归方程(R²＞0.98)，再根据样品的OD值计算出对应的样品浓度。

1.4统计学方法

采用SPSS 19.0及GraphPad Prism5.0统计学软件进行统计分析，正态性检验采用Kolmogorov-Smirnov检验，患者年龄及脑脊液白细胞计数、蛋白质含量、葡萄糖、IgG、IgA、IgM、CXCL12、PDGF、CXCL14水平均为正态分布计量资料，用均数±标准差(x±s)表示。用单因素方差分析(ANOVA)比较不同疾病和不同时期患者CSF中CXCL12、PDGF及CXCL14水平，组间的两两比较采用LSD法。ON不同发病时期MRI阳性率的比较采用Pearson卡方检验。同时分别对CXCL12、PDGF水平与白细胞数、IgG含量及蛋白质含量进行Pearson相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2数据分析

2.1受试者的基本情况

ON组共有35例，其中男10例(28.57％)，女25例(71.43％)，男女之比1∶2.5，年龄16-58岁，平均年龄33.97±11.65岁。NMO组共有10例，其中女性8例(80.00％)，平均年龄38.90±13.69岁，较ON组年龄大，但差异无统计学意义。CSF检查中白细胞计数NMO组高于ON组和CVST组(P＝0.005及P＝0.009)。9名NMO患者中，有4名IgG含量高于正常值，平均含量为3.46±1.83mg/dl，高于其他各组(P＝0.020及P＝0.039)。其它检测结果详见表1。

表1 患者的基本情况表

2.2 ELISA法检测患者脑脊液CXCL12、PDGF及CXCL14的水平

所有患者的CSF标本均检测到CXCL12、PDGF及CXCL14的存在。

CXCL12：ON组和CVST组脑脊液CXCL12的水平均显著高于NMO组患者，且差异有统计学意义(P＜0.001及P＜0.001)。CVST组患者脑脊液CXCL12水平高于ON组(P＝0.012)，见表2与图1A。

PDGF：ON组和CVST组脑脊液PDGF的水平均明显高于NMO组患者，且差异有统计学意义(P＝0.001及P＜0.001)。CVST组患者脑脊液PDGF水平高于ON组(P＝0.043)，见表2与图1B。

CXCL14：ON组和CVST组脑脊液CXCL14的水平均高于NMO组患者，且CVST组高于ON组，见表2与图1C。

表2 各组患者脑脊液CXCL12、PDGF及CXCL14水平(x±s，ng/ml)比较表

组别	CXCL12(35/10/10)	PDGF(35/10/10)	CXCL14(19/8/5)
				ON组	4.39±0.51	2.51±0.39	8.65±1.55
NMO组	3.69±0.35	2.04±0.24	7.05±0.94
				CVST组	4.84±0.49	2.79±0.47	10.53±1.11
F	14.593	10.060	10.003
				P	＜0.001	＜0.001	＜0.001

2.3 ON不同发病时期CXCL12、PDGF及CXCL14水平比较

ON组中，以本次发病后4周为节点，将ON组分为急性期组18人和平稳期组17人。

CXCL12：急性期组和CVST组脑脊液中CXCL12水平比平稳期组高(P＝0.003，P＜0.001)，而急性期组与CVST组无差异，见表3与图2A。

PDGF：急性期组和CVST组脑脊液中PDGF水平高于平稳期组(P＝0.023，P＝0.006)，急性期组与CVST组无差异，见表3与图2B。

表3 ON不同发病时期CXCL12、PDGF水平(x±s，ng/ml)比较表

组别

CXCL12(18/17/10)

PDGF(18/17/10)

CXCL14(8/11/5)

急性期组	4.63±0.50	2.65±0.40	8.76±1.86
				平稳期组	4.13±0.39	2.34±0.32	8.58±1.30
CVST组	4.84±0.49	2.79±0.47	10.53±1.11
				F	8.823	4.906	3.196
P	0.001	0.012	0.061

2.4 MRI检查

35例ON患者中有28例行颅脑或眼眶MRI检查，其中16例出现视神经或视交叉的异常信号、强化或增粗。MRI检查阳性组的患者脑脊液CXCL12及PDGF水平高于阴性组的患者，差异有统计学意义(P＜0.001，P＝0.006)，见表4与图3。

ON急性期MRI阳性率高于平稳期阳性率(χ²＝3.877，P＝0.049)。

表4 MRI分组CXCL12、PDGF水平(x±s，ng/ml)的比较表

组别	CXCL12(12/16)	PDGF(12/16)	CXCL14(7/8)
				MRI阴性	3.96±0.30	2.23±0.16	9.27±1.20
MRI阳性	4.64±0.42	2.62±0.42	8.99±1.32
				t	-4.754	-2.977	0.418
P	＜0.001	0.006	0.683

2.5 ON复发与否分组间CXCL12、PDGF及CXCL14水平的比较

ON组患者中，有9名患者既往有单眼或双眼视神经炎发作病史，26名患者首次发病，两组比较脑脊液中CXCL12、PDGF及CXCL14水平变化无差异，如表5所示。

表5 ON复发与否分组CXCL12、PDGF水平(x±s，ng/ml)的比较表

组别	CXCL12(26/9)	PDGF(26/9)	CXCL14(14/5)
				首发	4.40±0.53	2.45±0.31	8.78±1.63
复发	4.36±0.46	2.66±0.56	8.29±1.19
				t	0.162	-1.431	0.549
P	0.872	0.162	0.406

2.6脑脊液中CXCL12、PDGF、CXCL14水平与脑脊液各项参数相关性分析

脑脊液中CXCL12与PDGF水平变化有显著相关性(P＜0.001)。

此外，患者脑脊液中CXCL12、PDGF、CXCL14水平与脑脊液其他各项参数间无相关关系，如表6所示。

表6脑脊液中CXCL12、PDGF、CXCL14与脑脊液各项指标的关系表

本发明的实验结果显示，NMO组脑脊液白细胞计数和免疫球蛋白IgG的含量高于ON组和CVST组，蛋白质含量也有升高的趋势，这可能是由于NMO病情重，血-脑脊液屏障受损，导致白细胞、IgG和其他蛋白质通透性增加来调节炎性反应。而这也印证了Lucchinetti CF等人在A role for humoral mechanisms in the pathogenesis of Devic’s neuromyelitisoptica中指出的NMO是一种以体液免疫为主，细胞免疫为辅的中枢神经系统脱髓鞘疾病。

NMO组患者脑脊液中CXCL12和PDGF水平明显低于ON组和CVST组。而NMO患者往往伴有严重的视力下降，并且预后差。从生理功能的角度来看，这说明NMO患者的脱髓鞘更为严重或者说是髓鞘的自我修复功能较差。可以合理推测这是由于脑脊液中髓鞘再生的促进因子含量太少导致髓鞘再生失败，进而使病情反复迁延。ON组脑脊液中CXCL12和PDGF水平也明显低于CVST组。这两种炎症相关因子在炎症性疾病中的水平反而低于在非炎症疾病，这似乎与一般的认知相违背。但是，根据Ashenkov等人的研究，非炎症性神经系统疾病组脑脊液CXCL12水平与MS合并ON组相比没有差异，因此我们的发现可能是由于在CVST患者中，机体能主动提高CXCL12和PDGF的水平，以对抗疾病的发生，而在ON患者体内这种对抗机制不存在或者很弱，这导致了它们的水平在ON患者中相对较低。限于工作条件目前无法收集正常人的脑脊液，因此也无法排除该可能性。CXCL14在3组中也出现了相似的变化，但由于目前CXCL14在不同疾病中的变化研究刚刚起步，因此尚不能对结果进行过度解释，仅能提供初步的研究结果。更多的机制问题还有待于进一步的研究来揭示。

关于CXCL12在NMO患者中的低表达还可以这样解释：在动物模型的研究中已经证实，CXCL12是由星型胶质细胞所分泌的。而在NMO患者体内，AQP4抗体的升高可能导致星型胶质细胞的凋亡。缺少了分泌CXCL12的供体细胞，它在脑脊液中的含量自然会降低。从这个角度来说，CXCL12在诊断上的价值和AQP4自身抗体即有重叠的地方又不完全重叠。CXCL12的降低是AQP4自身抗体升高的结果。如果AQP4自身抗体的浓度升高了，达到了病理水平而CXCL12的浓度未见到显著的降低，这可能意味着这时候星型胶质细胞还未大量凋亡，正处在最有利的治疗时期。而如果AQP4自身抗体浓度升高伴随着CXCL12的浓度出现极低值，则可能意味着，星型胶质细胞已经凋亡殆尽，此时的治疗效果也就非常有限。此假说是建立在我们的观察和他人的基础研究之上，尚需要更多的动物实验来证实。

在急性实验模型中，急性脱髓鞘疾病可引起脑脊液中CXCL12升高，从而促进髓鞘再生，而在慢性脱髓鞘模型中，CXCL12的表达和分泌受到抑制。同样，在慢性脱髓鞘病变部位中，PDGF-α受体数量较正常脑白质和急性脱髓鞘病变减少。Harirchian等人在Serumand CSF PDGF-AA and FGF-2 in relapsing-remitting multiple sclerosis：acase-control study中发现，脑脊液PDGF-AA水平与多发性硬化病程相关。在我们的研究中，ON组在发病4周内脑脊液CXCL12和PDGF水平高于发病4周后的水平，但与CVST组无差异。在动物实验中，Patel等曾发现，在脱髓鞘部位周围的星形胶质细胞能通过增加CXCL12的分泌来促进髓鞘的修复。而这一过程需要其他炎症因子的刺激才能引发。典型ON在发病后4周左右视力开始恢复，且恢复很快，这很可能就是由于在这个过程中CXCL12和PDGF的分泌促进了神经的修复。但是随着疾病进入平台期，这两种因子的分泌减少，导致修复过程停止，因此视功能的进一步的恢复可持续到发病后1年。本发明的实验提示，在ON的不同阶段，监测脑脊液CXCL12和PDGF可以评估其病情变化，判断预后情况。同时如果能在急性期之后适当补充CXCL12或促进机体自身合成CXCL12，可能促使视功能更快地恢复。

颅脑和眼眶MRI检查是诊断中枢神经系统脱髓鞘疾病的重要方法之一，Natalia等人通过MS患者尸检发现，在MRI阳性病灶周围，CXCR4+细胞数量增加。在本发明实验中，ON患者MRI阳性组脑脊液中CXCL12和PDGF水平明显高于阴性组，并且急性期组MRI的阳性率高于平稳期组，可能是MRI阳性病变部位尚处于疾病的急性活动阶段，两者分泌增高促进神经髓鞘的修复。

其他学科研究中发现，CXCL12可以诱导PDGF-B的表达，从而促使骨髓细胞分化为成熟周细胞。在本发明实验中，同样发现脑脊液中CXCL12和PDGF有明显的相关性，二者相互协同、相互促进，共同完成神经修复。

另外，本研究还存在很多不足，比如没有正常人的脑脊液做正常对照、样本量小、未对患者进行脑脊液随访观察等，在下一步的研究中我们将针对上述不足进行改进。

总之，脑脊液CXCL12、PDGF及CXCL14水平较低的患者中枢神经系统脱髓鞘更为严重，三者成为ON和NMO等中枢神经系统脱髓鞘疾病的新的生物诊断标记物。在ON的不同阶段，监测脑脊液CXCL12和PDGF可以评估其病情变化，判断预后情况。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (2)

1.用于中枢神经系统脱髓鞘疾病的生物诊断标记物，其特征在于，所述生物诊断标记物是脑脊液中血小板衍生因子、趋化因子12和趋化因子14。

2.根据权利要求1所述的用于中枢神经系统脱髓鞘疾病的生物诊断标记物，其特征在于，所述中枢神经系统脱髓鞘疾病包括视神经炎ON和视神经脊髓炎NMO，且在视神经炎ON的不同阶段，还能通过监测脑脊液中血小板衍生因子和趋化因子12评估其病情变化，判断预后情况。