CN101784895A - 预测肝细胞中生物学系统响应的方法 - Google Patents

Abstract

本发明的方法使用“系统生物学”方法来预测由暴露于测试物质而导致的肝细胞毒性和其它的生物学肝细胞响应。在一个实施方式中，本发明提供了一种预测测试物质的肝细胞生物学系统作用的自动化方法。在另一个实施方式中，本发明提供了一种构建具有已知的生物学系统作用的参比物质的细胞系统生物学响应谱的知识库(或数据库)的方法。在另一个实施方式中，本发明提供了用于进行建谱的一组方法和软件工具。本发明的另外实施方式是一套试剂。在另一个实施方式中，本发明提供了用于进行建谱的一组方法和软件工具。本发明的另外实施方式是用于产生细胞系统生物学响应谱所需的一套试剂和方法，以产生知识库、或用现存的知识库和信息学软件建立物质生理学作用的谱。本发明的另外实施方式为生理学谱的数据库。

Description

预测肝细胞中生物学系统响应的方法

相关申请

本申请要求申请日为2007年6月26日的美国临时申请No.60/946,186的优先权。

上述申请在此处以其整体引用作为参考。

背景技术

基本上，多种候选药物的失败都是因为在动物药物安全试验中或者在人类晚期临床试验中发现了肝细胞毒性(hepatocellular toxicity)。然而，甚至在药物经过批准之后，在市售的药物中仍然存在肝中毒(hepatotoxicity)的实质性风险。尽管偶尔有并非由于肝毒性的药物撤回(withdrawal)，但是肝毒性(liver toxicity)是最常见的撤回原因，显著地限制了已获批准的药物的应用。总之，肝毒性可导致无效并产生不必要的费用，通过使用具有高效预测值的早期检测来鉴定体内的肝毒性可以降低所述费用。

考虑到人的肝脏对各种环境毒物具有高度的敏感性，因此环境毒物学的挑战是开发高效预测和快速筛选的方法，以评估物质对人类健康的影响，包括对肝脏的可能的毒性。

几种因素使上述问题复杂化，例如要测试的物质的数量日益增大；环境暴露的复杂性需要在广范围的暴露机制、浓度和时间进行测定；以及年龄和遗传变异性对结果的影响不确定。

美国国家健康学院和其他政府与私营实体的国家毒物学项目正在积极寻找能够改进环境毒物学测试的效率和减少所需的动物测试数量的可靠方法。

在这些领域，以及主要为细胞检测的其它领域，由于可用于分析复杂的、多组分系统的响应的工具的限制，典型的集中于单细胞过程的测试限制了发展。最近对一组细胞毒素测试(包括DNA合成、蛋白质合成、谷胱甘肽消耗、过氧化物诱导、半胱天冬酶(Caspase)-3的诱导、膜完整性和细胞存活)的性能比较中发现，这些测试平均仅具有动物研究的一半的预测能力(Xuet al.，Chem Biol Interact，2004.150(1)：p.115-28.)。这些测试独立地进行，并且不试图以任何定量的方式来结合读出的数据。另外，其它研究显示，来自基于细胞的测试的多维细胞响应可以使用标准方法来聚类(clustered)，以鉴定具有相似活性的化合物(Taylor et al.，Drug Discov Today，2005，2(2)：p.149-154；Mitchison，Chembiochem，2005.6(1)：p.33-9；Perlman，Science，2004.306(5699)：p.1194-8)。总之，这些研究证明了将化合物响应聚类的原则，但是并未尝试将这些鉴定的群(clusters)与特异性的响应谱相关联，以及随后使用所述响应来预测未知物质的生理学影响。

已经开发了简单的自动化分类器，用于某些商业上可获得的测试。此类分类器允许使用布尔数学体系(Boolean)的运算(operations)，以使来自几个测试部分的输出结合成一个结果(Abraham et al.，Preclinica，2004.2(5)：p.349-355)。这些布尔数学体系的运算允许测试开发者对结合多个特征检测的输出进行定义。在扩大某些高容量筛选(HCS)测试中此类分类器特别有用，但是具有受限的特征，并且不能被确定地设计和不易以多维特征来使用。因此，最近的研究描述了使用与临床肝中毒具有80％的相关性的人Hep G2细胞，进行多维细胞毒素测试(P.J.O′Brien et al，Arch Toxicol，2006，80(9)，p.580-604)。然而，HepG2细胞缺失了已分化的肝细胞的多种功能。与在肝中毒的早期检测中的重要性相一致，需要在原代肝细胞中发展多维细胞系统生物学筛选方法，来预测机理性肝中毒(mechanism-based hepatotoxicity)。

发明内容

本发明提供了用于细胞系统生物学建谱(profiling)和分析的方法和系统，包括具有多色荧光的5种或更多(例如多元的)生物标记以及可筛选的数据库。本发明提供了肝细胞响应的分析方法和细胞系统生物学(CSB)(有时也称为“系统细胞生物学”)建谱的方法。所述细胞系统生物学是对负责细胞正常功能和异常细胞功能的基因、蛋白质和代谢的完整的和相互作用的网络的研究。

本发明的一个实施方式提供了用于预测测试物质对肝细胞(例如原代肝细胞、干细胞衍生的肝细胞、肝脏切片中的肝细胞、外植培养的肝细胞或肝细胞衍生的细胞系)的生物学系统作用的方法。该方法包括提供覆盖培养的、封装的或在柔性3D支撑基质上生长的肝细胞(例如在高密度平板中的肝细胞)。所述肝细胞含有代谢活性的细胞色素P450(所述肝细胞有时也称为“代谢活性的”)，从而所述肝细胞能够使化合物(例如药物)代谢。将所述肝细胞与测试物质接触，并检测至少两种细胞功能类别中的6种或更多的细胞特征，其中，至少一种细胞功能类别为磷脂质化(phospholipidosis)或脂肪变性(steatosis)，由此产生与所述测试物质接触的所述肝细胞的响应谱。可以使用标准技术来检测细胞特征，例如，通过使用至少一种光学模式获得与测试物质接触的肝细胞的至少一个图像，并分析该图像以检测所述6种或更多种的细胞特征。将所述6种或更多种的细胞特征相结合，产生测试物质对所述肝细胞的生物学系统作用谱。该响应谱可以与例如存在于数据库中的其它响应谱相比较，所述其它响应谱为对细胞(例如肝细胞)已知的生物学系统作用的一种或多种物质的响应谱，如果所述与测试物质接触的肝细胞的响应谱与数据库中的响应谱相同或相似，则预测该测试物质与数据库中对细胞(例如肝细胞)产生已知的生物学系统作用的物质具有相同或相似的生物学系统作用。

本发明的一个实施方式提供了肝细胞响应状态的建谱方法。该方法包括获得一种或多种以一套荧光标记试剂标记的肝细胞，从而产生一种或多种荧光标记的细胞。各荧光标记试剂对生物标记是特异性的，所述一套荧光标记试剂能检测至少约5种或更多种不同的生物标记。所述生物标记的检测提供了一种或多种细胞的一种或多种特征的读出。在一个实施方式中，本发明提供使用高密度平板(例如384孔的微量滴定平板)的自动化方法，来预测测试物质对肝细胞的系统作用。一方面，肝细胞可以从任意物种中分离到(例如大鼠、小鼠、人、狗、猪和/或兔)，本发明提供了将要以所述测试物质进行处理的肝细胞，并且要处理的肝细胞含有独特组合的荧光或发冷光的报告子或处理(manipulations)。所述报告子响应并指示功能性响应，而所述处理在所述肝细胞中产生功能性响应。在添加所述报告子或进行所述处理之前或之后，将所述肝细胞与所述测试物质相接触(共同培育)。在添加所述报告子或进行所述处理和将所述肝细胞与所述测试物质相接触以后，将肝细胞成像或扫描以获得报告子的荧光图像。然后，分析所述肝细胞的图像以测量或检测生物标记。然后，将获自所述生物标记的检测的这些特征结合，以产生所述测试物质的细胞系统生物学响应谱。在另一方面，提供要处理的肝细胞组，该肝细胞组同样与测试物质共同培育。

然后，获得并分析所述组中的肝细胞的图像，以测量或检测指示细胞功能类别的生物标记。在下一个步骤中，将这些来自所述肝细胞的特征结合，以产生所述测试物质的细胞系统生物学响应谱。在任一方面，该方法涉及将所述测试物质的细胞系统生物学响应谱与参比物质的细胞系统生物学响应谱的数据库(或知识库)进行比较，所述参比物质对肝脏具有已知的生物学系统作用。作为此类比较的结果，所述测试物质的响应谱与具有已知肝细胞系统作用的物质的细胞系统生物学响应谱之间的相关性的程度，表示了所述测试物质在活的肝细胞或肝脏中展现作用的可能性。

本发明的另一个实施方式提供了构建参比物质的细胞系统生物学响应谱的知识库(或数据库)的方法。此类物质可以具有已知的肝细胞生物学系统作用。在一个实施方式中，提供了构建与一种或多种参比物质相接触的肝细胞的细胞系统生物学响应谱的数据库的方法。该方法包括将含有代谢活性的细胞色素P450的肝细胞与第一参比物质相接触。所述肝细胞以一套荧光标记试剂进行标记，以产生一种或多种荧光标记的肝细胞。各荧光标记试剂对生物标记是特异性的，所述一套荧光标记试剂能检测至少5种不同的生物标记。所述生物标记的检测提供了一种或多种细胞的一种或多种特征的读出。在特定实施方式中，至少一种特征与选自由磷脂质化和脂肪变性所组成的组中的至少一种细胞功能类别相关。通过使用至少一种光学模式使一种或多种荧光标记的肝细胞成像，以产生一系列数据，这些数据可以用来分析所述5种或更多种的生物标记中的每种生物标记的一种或多种特征。将所述5种或更多种的生物标记的特征相结合，产生所述第一参比物质对所述肝细胞的细胞系统生物学谱。该细胞系统生物学谱可以加入到参比物质的细胞系统生物学谱的数据库中。可以同样地分析另外的参比物质(例如第二参比物质、第三参比物质、第四参比物质等等)，并加入到数据库中，由此构建与一种或多种参比物质相接触的肝细胞的细胞系统生物学响应谱。

在另一方面，提供了要以测试物质进行处理的肝细胞组，要处理的肝细胞含有独特组合的荧光或发冷光的报告子或处理。在添加所述报告子或进行所述处理之前或之后，将所述肝细胞与参比物质相接触(共同培育)。在添加所述报告子或进行所述处理并将所述肝细胞与所述参比物质相接触以后，将肝细胞成像或扫描以获得报告子的荧光图像。然后，分析所述肝细胞的图像以测量或检测生物标记。下一步，将获自所述肝细胞的这些特征结合，以产生所述参比物质的细胞系统生物学响应谱。在另一方面，提供了要处理的肝细胞组，该肝细胞组同样与所述参比物质共同培育。然后，获得和分析该组中的肝细胞的图像，以测量或检测指示细胞功能类别的生物标记。在下一步中，将这些获自所述肝细胞的特征相结合，以产生所述测试物质的细胞系统生物学响应谱。在任一方面，该方法涉及将所述测试物质的细胞系统生物学响应谱与参比物质的细胞系统生物学响应谱的数据库(或知识库)进行比较，所述参比物质具有已知的肝细胞生物学系统作用。然后将所述参比物质的细胞系统生物学响应谱加入到所述数据库中。使用不同的参比物质(例如第一参比物质、第二参比物质等等)重复所述步骤，以增加所述数据库。本发明还提供细胞系统生物学响应谱的知识库(或数据库)。

所述方法能够对在肝细胞、肝脏中预测的体内肝细胞作用进行鉴定和分类，并能影响整个器官，并导致用于药物开发、环境毒物学、生物医学研究和其它领域(例如环境健康和工业安全性)的其它功能性响应。

在另一个实施方式中，本发明提供了用于进行所述建谱的一组方法和软件工具。本发明的另一个实施方式包括一套试剂和方法，该试剂和方法用于产生细胞系统生物学响应谱、或以产生知识库、或使用现有知识库和信息学软件来建立物质生理效应谱的应用。本发明的另一个实施方式提供了生理学谱的数据库。还提供了包括用于实践此处所述方法的试剂和说明书的试剂盒。

本发明的又一实施方式提供了一种商业方法，其中，将一种或多种候选药物化合物从第一药物开发公司送到第二毒性筛选公司，所述第二毒性筛选公司利用上述本发明的一个或多个方面对所述一种或多种化合物进行毒性筛选，并将细胞系统生物学毒性报告返回第一药物开发公司。这些方面，以及本发明的其它特征将通过附图和下面的具体实施方式而明显地体现。

附图说明

本专利或申请文件含有至少一幅彩色的附图。如专利局需要，可以在本专利或专利申请公布的副本中提供彩色附图，申请人将支付所需的费用。

图1A和1B表示本发明方法的一个实施方式的流程图。图1A涉及数据库或知识库的构建，图1B涉及使用所述数据库或知识库评价测试化合物。

图2描述了来自大鼠肝细胞的多元HCS分析的范例性图像。

图3表示当处理平板以产生本发明的方法的谱时的样本流程图。

图4A、图4B和图4C表示肝细胞图谱，揭示了核大小不同的两种细胞群体的DNA含量的变化。

图5A、图5B和图5C表示一些绘图显示方法，以显示能够产生细胞系统生物学响应谱的细胞响应。

图6表示将与毒性评估相结合的10种毒性相关的功能类别与相应的肝细胞生物标记相结合。

图7表示实施例2所描述的肝细胞毒性谱多元平板1和2的标准平板设置。

图8A和图8B表示由基于实施例2所描述的剂量响应的肝细胞毒性分析产生的数据。

图9表示证明在HepG2细胞中评价的30个化合物测试组的细胞密码(CellCipher)谱聚类分析的数据。

图10表明在HepG2细胞中评价的30个化合物测试组的细胞密码谱主要组分的分析。

图11A至图11C为证明在分离的大鼠肝细胞中代谢依赖的毒性的图。图11A表明在肝细胞中代谢能力随时间降低。在细胞色素P450代谢后3小时，约有70％水平的新分离的细胞，而在16小时或24小时后，分别降低到30％和20％。图11B表明需要双氯芬酸代谢的有毒产物来产生明显的细胞毒性，并证明了在24小时和48小时处依赖于剂量和时间的细胞的损失。然而，在暴露于缺乏代谢能力的细胞系(HepG2细胞)72小时以后，没有明显的毒性。图11C表示在肝细胞中将化合物定时暴露于代谢活动的重要性。当以双氯芬酸处理肝细胞16小时后，与处理3小时相比毒性降低。

图12A至图12C表明在覆盖培养4天后肝细胞恢复极性胆小管运输功能。图12A为证明在对照细胞中的正常运输的图像，在邻近的肝细胞之间形成的胆小管空间中显示出增强的荧光。图12B为显示化合物(例如曲格列酮)抑制正常运输功能的图像，胆小管空间中的荧光减少。图12C为用图像分析处理定量荧光染料的运输的图，通过将邻近的肝细胞之间的荧光的强度和面积分别用总的肝细胞强度或面积进行均一化(normalizing)。

具体实施方式

本发明涉及定向地在分离的肝细胞中扩展细胞系统生物学方法。细胞是最简单的生命系统。组织是特定细胞类型的集合而形成的相互作用的细胞群体。尽管细胞和组织都没有完整的生物体复杂，但是它们具有显著的功能复杂性，可以使作用于整体生物体的多种方面(例如疾病的细胞基础、治疗效能和治疗的可能毒性)得到详细地理解。

本发明的方法使用“系统生物学”方法，以高密度的形式来预测暴露于测试化合物所导致的肝细胞毒性响应。该方法基于对多组分的肝细胞系统的细胞分析的整合，以产生细胞系统生物学的响应谱，该谱可以预测更高水平的细胞和细胞系统以及肝功能和响应。本发明的方法的实施方式如图1A和图1B中的流程图所示。为了建立此类数据库或知识库，确定参比物质的细胞系统生物学的响应谱，并将其添加到所述数据库中(图1A)。

为了评估测试物质，将所述测试物质的细胞系统生物学的响应谱与具有已知的生物学系统作用的参比物质的细胞系统生物学的响应谱的数据库(或知识库)相比较(图1B)。

本发明的方法可以使用适当的、肝衍生的细胞来进行，所述细胞包括以所述测试物质或参比物质处理的肝细胞。在一个特定实施方式中，所述肝细胞含有代谢活性的细胞色素P450。所述要处理的组中的所述肝细胞可以来自单个细胞类型或多种细胞类型。然而，使用多种细胞类型可以更广泛地显示出组织相关的响应。所述细胞类型可以包括任意哺乳动物或非哺乳动物的原始材料，该原始材料含有能够行使全部或部分的已分化的肝细胞功能的完整的、活的肝细胞。所述原始材料可以包括但不限于：特定的原代肝细胞(例如以标准酶分散方法、离体或其它长出(outgrowth)方法分离的)，完整的、离体功能性肝切片(例如肝组织)，或者含有肝细胞的宿主器官(即脾)(例如通过机械切除收集的)；衍生自肝细胞源或祖细胞源(即肝细胞的干细胞)的传代和生长的肝细胞，以及经基因工程化而表达一种或多种肝细胞功能的任意细胞。此外，所述肝细胞或肝细胞的原始材料可以在固体或特异性包被的柔性物质(例如基质胶、多层胶原)上二维(2D)培养和三维(3D)培养，或可以用合成的或天然的蛋白质、纤维或其它物质封装，以支持肝细胞的功能或提供机械支撑。最后，组内的所述肝细胞可以含有通常与肝相关的非肝细胞，例如Kupffer细胞和其它的炎症细胞、内皮细胞、星状细胞、胆管内皮细胞、成纤维细胞和肝神经细胞。

此类细胞材料按需要可以是原代培养的或已建立的肝细胞系(例如HepG2)，并且此类细胞材料是可以从多种来源(例如Cambrex、CellzDirect、In Vitro Technologies、Xenotech、Zivic Laboratories)商购的。组内所述肝细胞或肝细胞衍生的细胞可以按需要选择为一种类型或细胞类型的混合。

所述肝细胞可以任选地含有一种或多种肝细胞特异性报告子和/或处理。在某些实施方式中，每种肝细胞可以含有独特的报告子和/或处理的组合。在另一些实施方式中，肝细胞群可以含有独特的报告子和/或处理的组合。所述肝细胞应当含有适合于接近生物学系统的多种报告子和/或处理。通常，所述肝细胞含有独特的至少5种或更多(例如至少约6种或更多、或至少7种或更多、至少8种或更多、至少9种或更多、至少10种或更多、至少11种或更多、至少12种或更多、至少13种或更多、至少14种或更多、或至少15种或更多)报告子和/或处理的独特组合。

“细胞系统生物学”(此处也称为“CSB”)是对负责正常细胞功能和异常细胞功能的基因、蛋白质和代谢的完整的和相互作用的网络的研究。因此，“细胞系统生物学谱”是细胞成分的相互作用、关系和/或状态的系统性特征，由至少约5种或更多的生物标记来表示，所述生物标记产生构建所述谱的细胞系统生物学特征。定义了细胞系统生物学谱中的相互关系，例如在算数上(例如细胞系统生物学特征值的比例、总合或差)或统计学上(例如细胞系统生物学特征值的组合的分级聚类方法或主要组分分析法)。

细胞系统生物学利用的技术(例如较高处理能力的自动化显微镜技术)可以避免与传统的基于生物体的系统生物学相关的花费和可能的种属混杂的问题(例如蠕虫、果蝇、鱼、啮齿类等等)。细胞系统生物学谱是细胞的系统性特征，在本发明中定义为对活的细胞(基本的“生命单位”)的研究，对基因、蛋白质的完整的和相互作用的网络的研究，以及对产生功能的无数代谢反应的研究。因此，“细胞系统生物学谱”是细胞成分的相互作用、关系和/或状态的系统性特征，由至少约5种或更多的生物标记来表示，所述生物标记产生构建所述谱的细胞系统生物学特征。定义了细胞系统生物学谱中的相互关系，例如在算数上(例如细胞系统生物学特征值的比例、总合或差)或统计学上(例如细胞系统生物学特征值的组合的分级聚类方法或主要组分分析法)。

如此处详细描述的，“细胞系统生物学响应谱”(此处也称为“响应谱”)为一种或多种细胞经试剂、物质、环境条件等的处理所产生的结果(例如响应)的细胞系统生物学谱。所述响应谱可以鉴定受所述处理影响的任意下述特定的细胞功能(例如下面详细描述的，1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多)：毒性响应、凋亡、细胞增殖、胁迫途径激活、细胞器功能、形态学改变、药物代谢活性等等。

例如，此处所用的“生物标记”为使用报告子或基于荧光的试剂(荧光标记的抗体、荧光标记的肽、荧光标记的多肽、荧光蛋白生物传感器、荧光标记的适体(aptamers)、荧光标记的核酸探针、荧光标记的化学试剂和荧光化学试剂)被特异性“标记”的细胞成分和/或细胞活性(例如蛋白质或其它大分子、细胞器、离子、代谢产物等等)。在本发明的一个实施方式中，使用可以检测至少约5种不同生物标记的一套荧光标记试剂。在另一个实施方式中，所述的一套荧光标记试剂检测至少约6种、至少约7种、至少约8种、至少约9种、至少约10种、至少约11种、至少约12种、至少约13种、至少约14种、或至少约15种或更多不同的生物标记。每种荧光标记可以通过其特定的荧光特性(例如激发和/或发射波长、强度、荧光各向异性、荧光寿命等等)来鉴定。因此，可以清楚地标记两个或多个荧光标记试剂或生物标记，由此将它们相互区分。在一种或多种细胞中的生物标记的检测是所述细胞或组织的一种或多种特征的读出。此处所用“特征”(此处也称为“细胞特征”)是对特定生物标记的检测(例如基于图像的检测)或一系列检测，可以包括对生物标记的形态计量(morphometry)、强度、定位、以及比值或差异的检测和其它(inter alia)，可以表示所述肝细胞的生物学功能或活性。由生物标记表示的生物学功能或活性包括但不限于：蛋白质的翻译后修饰，例如磷酸化、蛋白水解切割、甲基化、十四烷酰化(myristoylation)、以及糖类的联结；细胞内部或细胞之间的区室之间的离子、代谢产物和大分子的易位；细胞器的结构和活性的改变；以及大分子(例如编码或非编码的RNAs和蛋白质)的表达水平、形态学、分化的状态等的改变。单个生物标记可以提供多于一个特征的读出数据。例如，可以使用烟酸己可碱(Hoechst)染料检测DNA(例如一种生物标记)，以及细胞的多种特征(例如核的大小、细胞周期阶段、核的数量、凋亡核的存在等等)。

在本发明的方法中，“报告子”为荧光或发冷光的分子，例如生理指示剂、标记、蛋白质、生物传感器等等。所述报告子可以是蛋白质或非蛋白质性质的。然而，在报告子是非蛋白质性质的情况下，所述肝细胞可以表达一种或多种所述报告子分子。可选择地或另外地，可以将一种或多种所述报告子分子递送到所述细胞中，例如通过附加上有利于穿过原生质膜输入的蛋白质序列标签。在所述肝细胞在成像之前被固定的实施方式中，可以通过标准标记技术来提供报告子。

用作本发明的方法中的合适的报告子的标记的实例包括：例如探针，该探针可用于标记亚细胞区室、定位蛋白质、标记膜、对膜电位的响应、对局部化学环境的感应、分子运动的读出、对肝细胞的代谢和结合(conjugation)能力的响应，并提供多种其它的检测(例如见Waggoner，A.，″Fluorescenceprobes for analysis of cell structure，function and health by flow and imagingcytometry.，″in Applications of Fluorescence in the Biomedical Sciences，D.Taylor，et al.，Editors.1986，Alan R.Liss，Inc.：New York.p.3-28，此处以其整体引入作为参考)。结合了抗体的免疫荧光标记法提供了一种用于检测和定位蛋白质、肝细胞特异性蛋白质(例如白蛋白)和蛋白质变体(例如磷酸化的蛋白质或磷脂)的简易方法。肝细胞或肝脏来源的细胞可以被工程化，而表达以荧光蛋白质的任意有色变体为标签的蛋白质(Chalfieet al.，Science，1994.263(5148)：p.802-5；Chudakov，et al.Trends Biotechnol，2005.23(12)：p.605-13)，并且这些荧光蛋白质可以进一步被工程化，以产生特异细胞功能的生物传感器、指示剂(例如见Conway et al.，Receptors Channels，2002.8(5-6)：p.331-41；Umezawa，et al.，Biosens Bioelectron，2005.20(12)：p.2504-11；Giuliano et al.，Trends Biotechnol，1998.16(3)：p.135-40；Giuliano et al.，CurrOpin Cell Biol，1995.7(1)：p.4-12)。

生物传感器可以检测肝细胞中的一种或多种蛋白质-蛋白质的相互作用(例如见PCT/US2005/027919，公开号为WO2006/017751)。毒物学上显著的单一的蛋白质-蛋白质的相互作用的实例为细胞质蛋白质keap-1和核转录调节子nfr2。在正常条件下，在细胞质中由于keap-1与nrf2之间的结合而不表达负责抗氧化活性的基因。当在适当的胁迫下，所述转录调节子nfr2从keap-1中释放出，并易位到细胞核中，在细胞核内nfr2诱导抗氧化胁迫蛋白质和相位2-解毒酶(phase 2-detoxifying enzymes)的表达。由此，可以使用适当的标记的生物传感器来检测蛋白质-蛋白质(例如keap-1和nfr2之间)相互作用的变化。

可以在单一样品的制备中结合多种标记，以提供在群体中的各单个肝细胞中以及在整个群体中的多种特征的检测(Zhang et al.，Cell，2004.119(1)：p.137-44；Taylor et al.，Drug Discov.Today，2005.2(2)：p.149-154)。具有单一刺激波长和狭窄发射带的量点(quantum dots)提供了在测试中实现更高程度的多元性的可能性(Michalet，et al.，Science，2005.307(5709)：p.538-44)。除多种色彩的荧光探针以外，多种生物发光试剂和化学发光试剂也可以有效地用于基于细胞的测试中(Hemmila et al.，J Fluoresc，2005，15(4)：p.529-42；Roda et al.，Trends Biotechnol，2004.22(6)：p.295-303)。

可以将所述肝细胞铺种于基质上，例如微量培养平板、显微镜载玻片或其它典型地用于基于细胞测试的实验室器皿上。另外，可以将肝细胞维持在柔性支撑基质上，例如多聚泡沫或凝胶以及用于3D细胞培养的水凝胶。通常，此类实验室器皿和柔性支撑为透明的，以利于随后的成像分析。优选多孔微量培养平板，因为它们有利于同时进行多重反复测试，并且可以使用自动化设备容易地操作。多孔平板可以是商购的，可以是8孔、12孔、96孔、384孔、1536孔等等。所述肝细胞可以以任意需要的密度铺种，以利于随后的成像分析。对于更高密度的多孔微量培养平板，可以向各孔中引入几百到几千个肝细胞(例如每40μl孔200-30000个细胞)。

在本发明的方法中，“处理”为对一种或多种肝细胞的处理，以在所述细胞中影响功能性响应(或改变)。可以通过暴露于或接触化学试剂、生物试剂、环境或遗传处理来处理肝细胞。可以使用这些处理来改变细胞的离子、代谢、大分子和细胞器的活性，随之影响表型的改变，该表型的改变可以通过以添加的物质进行处理来进一步地改变。使用标准技术的处理的实例是技术人员所公知的，包括：蛋白质的表达或增强表达；蛋白质表达的降低；增加对已知响应的刺激；或添加能够诱导或抑制肝细胞或肝细胞祖细胞的代谢能力、共轭反应、运输功能、白蛋白的合成或释放、氨解毒、糖类和脂类调节和分化的物质。

在特定实施方式中，所述肝细胞的处理是将肝细胞与测试或参比物质相接触。例如一旦铺种，通过以测试物质或参比物质接触给定时间来处理所述肝细胞。在本发明中，所述“测试物质”或“参比物质”为能够用于获得细胞系统生物学响应谱的任意物质。例如，处理可以是与感染性生物颗粒体(寄生虫、细菌、支原体、病毒、蛋白感染素(prion))、小分子(例如“药物”或候选的药物)、生物分子(例如蛋白质、多肽、核酸(例如DNA、RNA或杂合的多核苷酸))相接触，或者暴露于某种条件下，例如环境条件(例如重量克分子渗透压浓度(osmolality)、pH、温度或它们的组合)、电磁辐射(例如一定频率、强度或持续时间的光)、或其它类型的辐射(例如α、β、γ射线等等)、或任意工程化而大小和形状均一的物质(例如纳米颗粒)。当一种物质对目标生物学系统的作用需要探测时，该物质作为测试物质处理。当一种物质对所述生物学系统的作用已知时，该物质为参比物质，并且需要将该物质对肝细胞组的作用加入到所述数据库或知识库中。

在进行本发明的方法时，以适合于测试物质或参比物质的方式，将所述肝细胞暴露于所述测试物质或参比物质，以使所述测试物质或参比物质与所述肝细胞相接触并与所述肝细胞相互作用。典型地，当所述测试物质或参比物质是分子或感染性生物颗粒体时，可以将所述测试物质或参比物质引入到所述肝细胞的位置(例如铺种了所述肝细胞的培养平板的孔中)。然后，所述分子或生物颗粒体可以在细胞的外表面与所述细胞相互作用，或渗透至细胞内与细胞内在的活动相互作用。其它类型的测试物质或参比物质(例如温度、辐射等等)以适合此类物质的方式向所述肝细胞暴露。将所述肝细胞与所述测试物质或参比物质共同培育合适的时间，该时间可以从1分钟到少数几分钟，到几分钟、几小时、到几天。例如，时间的长度可以基于是否需要立即的活性或长期的活性来选择。在一个实施方式中，所述肝细胞与所述测试物质或参比物质共同培育1分钟、3分钟、5分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、10小时、12小时、16小时、20小时、24小时、28小时、32小时、36小时、48小时和/或72小时。

在可选实施方式中，重复的肝细胞组(即相似的组)可以平行施用不同的测试物质或参比物质浓度来处理，以构建各浓度的细胞系统生物学响应谱。例如，可以使用6-10个点的log浓度系列，化合物的浓度范围从约1nM或更低到约1mM或更高。同样地，可以将不同的肝细胞组(例如具有不同的报告子或处理)暴露于所述测试物质。可以平行使用不同细胞类型和/或浓度的重复组(例如在同样多孔平板的不同孔中、或不同多孔平板的不同孔中)，并同时或平行地分析。同样，可以与所述测试物质或参比物质一同来测试阴性和阳性对照肝细胞。

将所述肝细胞暴露于所述测试物质或参比物质以后，检测细胞的特征。例如，在一个实施方式中，获得所述肝细胞的图像。当所述肝细胞含有一种或多种报告子时，使用适合于要成像的各种荧光或发冷光的报告子的频率(通道)。此类多重成像的实例在图2中显示。另外或可选择地，可以将所述肝细胞用结合于所需蛋白质或细胞结构的染料、荧光或发冷光标记(例如抗体、配体等)进行染色，然后在适合于要成像的各种染料、荧光或发冷光标记的频率(通道)成像。由此，在一个实施方式中，所述肝细胞以至少一种光学模式成像，以产生第一组数据。可以使用任意合适的方法成像，例如广视野显微镜或共聚焦显微镜。在一个实施方式中，至少一种光学模式是荧光显微镜。从成像产生的数据可以是可视的或数字的。在一个实施方式中，所述数据组为数字的数据。

分析所述肝细胞的图像，以测量或检测生物标记，所述生物标记是选择为指示适合于要测试的特性(例如毒性、临床病理学、组织病理学等)的功能类别。因此，可以选择所述报告子(标记、染料等等)以使其靶向(例如结合于)适合于测试细胞功能类别的生物标记或特征。在每个这些细胞功能类别中，使用一种或多种测试以检测一种或多种所述生物标记或特征，该生物标记或特征作为在测试功能类别的响应中的指示剂。在某些实施方式中，单个的生物标记或报告子对应于单个的特征。在其它实施方式中，使用一种生物标记或报告子来评估多于一种的特征(多种特征)。

如此处所述，检测在至少两种细胞功能类别中的细胞特征，以产生响应谱。在特定实施方式中，至少一种细胞功能类别为磷脂质化或脂肪变性。依赖于测试的目的，可以选择任意合适的细胞功能类别。为测试所选择的细胞功能类别的数量可以是1种、2种或更多种，该选择依赖于需要产生的响应谱的数目，熟练的技术人员应当理解此点。适合于评估肝细胞毒性的生物标记、特征和功能类别的实例在实施例1中显示。特征包括指示细胞周期或细胞健康状态的核的大小、形状和定位；代谢能力(I阶段和II阶段代谢反应)、解毒能力(尿素生物合成)、糖类调节(糖原生物合成)的检测；指示脂肪变性的脂肪(例如甘油三酯)储存的检测；指示磷脂质化或其它溶酶体功能异常的溶酶体的数目、大小、形状、定位的检测；指示线粒体失调或肝细胞健康的线粒体的数目、大小、形状和定位的检测；以及指示过氧化物酶体增殖和其它过氧化物酶体功能失调的过氧化物酶体的数目、大小、形状、位置的检测。在优选实施方式中，所述肝细胞生物标记的检测选自以下功能响应类别中的两种或更多种特征：细胞增殖、代谢能力、解毒能力、脂类和糖类调节、胁迫途径、细胞器功能(包括但不限于指示磷脂质化和过氧化物酶体增殖)、细胞周期状态、形态、凋亡、DNA损伤、代谢、线粒体功能、细胞分化和细胞-细胞相互作用或细胞-非细胞组分的相互作用。在另一个优选实施方式中，所述肝细胞的生物标记的检测选自以下功能响应类别中的两种或更多种特征：细胞增殖、细胞周期、凋亡、形态、细胞骨架扰动(perturbations)、线粒体功能、胁迫激酶活性、DNA损伤、以及细胞-细胞或细胞-非细胞组分的相互作用。在一个优选实施方式中，至少一种功能响应类别是脂肪变性或磷脂质化、或它们的组合。所述生物标记(例如甘油三酯、DGAT、MGAT、和它们的组合)可以检测如下的特征：例如指示脂肪变性的脂肪(如甘油三酯)储存的增加和脂类调节的酶促加工的调节。生物标记(例如LAMP1)可以检测指示磷脂质化的溶酶体大小的增加或溶酶体特异性蛋白质的增加。

指示所述肝细胞增殖的特征包括：核计数、细胞计数、总细胞量、总DNA、细胞周期蛋白的磷酸化状态、或涉及细胞生长和分裂的任意的蛋白质翻译后修饰状态。指示所述胁迫途径激活的特征包括：转录因子激活(例如c-jun、NRF2、NF-B、P1、ATF2、MSK1、CREB或NFAT)、或激酶激活(例如p38、INK、ERK、RSK90或MEK)。指示所述细胞器功能的特征包括：细胞骨架组建、线粒体量或膜电位、过氧化物酶体量、高尔基体组建、溶酶体量或质膜渗透性。指示所述细胞周期状态的特征包括：DNA含量、Rb磷酸化、细胞周期蛋白(cyclin)B1(CDK1)的生物合成、细胞周期蛋白D1(CDK4)的生物合成、细胞周期蛋白E(CDK2)的生物合成和组蛋白H3的磷酸化状态。指示所述形态的特征包括：运动、细胞伸展、附着、边缘波动(ruffling)、起泡(blebbing)或集落形成。指示所述凋亡的特征包括：核的大小和形状、DNA含量、谷胱甘肽含量、反应性氧的检测、半胱天冬酶(caspase)的激活、细胞色素C的释放、PARP切割、Bax易位和降解。指示所述DNA损伤的特征包括：修复蛋白(APE)的表达、GADD153的诱导、肿瘤抑制因子p53激活、Rb表达、氧化活性(8-氧鸟嘌呤)、或转录活性(Oct1)。指示所述代谢和代谢活性的特征包括：谷胱甘肽含量、反应性氧、cAMP浓度、P-糖蛋白活性、CYP450的诱导/抑制、或添加物质的时间依赖的清除或浓度。指示信号转导的特征包括：Ca++离子浓度(例如细胞内的Ca++离子浓度)、pH、蛋白质的表达、蛋白质的激活、蛋白质的修饰、蛋白质的易位、或已知的与特异性途径相关的蛋白质之间的相互作用。指示所述细胞分化的特征包括：组织特异性蛋白质或展现组织特异性形态，例如胰高血糖素受体或细胞角蛋白8、18的表达。指示所述细胞-细胞相互作用的特征包括：在细胞-细胞界面紧密连接的浓度、或材料从一个细胞向另一个细胞或向非细胞组分的转移(例如重新形成的胆小管空隙的转移)。

另外，指示所述代谢能力的特征包括：氧化和结合代谢、尿素生成、脂类储存、糖原生成、糖原分解和白蛋白合成。优选特征包括：微管稳定性、微丝稳定性、c-jun磷酸化状态、线粒体的量、过氧化物酶体的量、核的大小、细胞周期阻滞、DNA降解、和细胞缺失。

用于测试所需的肝细胞的生物标记的所述图像可以使用固定的(例如化学固定)或活细胞获得。对于活细胞测试，任选地在扫描或读取平板(或其它物质)之前添加标记试剂(报告子)。固定和以报告子(例如抗体、染料等)标记(或染色)是常规的，并可以自动地进行，从而使测试可以有效进行。对于固定的细胞测试，需要空间信息，但是仅在一个时间点。然而，在平行进行重复的测试的情况下，可能在分别的孔中在所需时间间隔固定肝细胞(例如每秒、每分钟等等)，以利于随时间分析相似的肝细胞群体。相反，或细胞测试允许测试含有需要随时间以及空间成像的活的肝细胞。然而，在检测过程中需要所述肝细胞的环境控制(例如温度、湿度和二氧化碳)，因为对于随时间的多种发冷光或荧光检测应当维持所述肝细胞的生理健康。对于活的或固定的肝细胞测试，所述肝细胞(或所述肝细胞的分离的亚群)的扫描可以重复多次，以利于在各时间点分析来捕获对所述测试物质或参比物质的动力学响应。

获得所述肝细胞的图像，并可以通过标准方法和设备进行分析(例如Schroeder et al.，J.Biomol.Screen，1(2)，75-80(1996)；Taylor et al.，Toxicol.Pathol，22(2)，145-59(1994))，例如高容量筛选(HCS)(例如Giuliano et al.，JBiomol Screen，1997.2(4)：p.249-259)和高通量细胞分析、自动显微镜、或其它检测器。例如，使用设备以在各样品或微量培养平板的孔中扫描一个或多个光学视野，由此将各光学视野的一个或多个荧光通道聚集。该多波长图像可以使单个制品的一套测试成为多重的，但是测试也可以以多个制品进行，并且所述特征测试与单个活性谱相结合。可以在获得图像的过程中提取生物标记，或在之后获得和处理图像。合适的设备包括：用于一次分析整个平板的细胞群体相应的设备，例如FLIPR(Molecular Devices，Sunnyvale，CA))或FDSS6000(Hamamatsu City，Japan)，以及用于逐孔或逐个细胞分析的设备，例如ArrayScan

HCS读出器(Cellomics，Pittsburgh，PA)；固定终点和基于细胞的动力学测试；产生原始肝细胞响应数据的图像分析算法；以及用于提取衍生的特征(例如动力学参数、EC50、IC50、和检测的群体响应分布)的数据分析工具。所述测试可以包括检测单个肝细胞的HCS测试与整体分析孔中的肝细胞群体的较高通量测试相结合，在单个时间点或多个时间点检测动力学响应。对于动力学测试，可以从动力学曲线提取多个特征以产生附加的衍生特征。例如，可以从动力学曲线衍生峰延迟、峰强度、半衰期、斜率和其它等特征。可以使用一种算法从所述图像提取信息，以产生不同感细胞生物标记的输出。典型地，此类算法将原始图像数据转换为测试数据点。那些图像和细胞分析领域的技术人员应当了解多种此类算法可以容易地获得，并且有多种适于肝细胞的基于图像的分析的肝细胞加工以检测肝细胞功能。在BioApplication软件中习惯设计或包装的算法由HCS售主提供，产生多种数字的特征值，例如在光学视野中的各细胞的亚细胞物强度、形状和定位。例如，可用使用vHCS^TM Discovery Toolbox(Cellomics，Inc)、Metamorph^TM(Molecular Devices)、来自GE Healthcare的软件和其它HCS和图像分析包来批量分析所获得的图像。在此种系统中，依赖于肝细胞响应的不均一性和测试的敏感性，每孔中检测的肝细胞总数典型地在100-1500个范围内。完整平板的读出器典型地提供鉴定所述图像中的孔面积和在这些区域中在一个或多个时间点检测总荧光的软件。

按需要，使用一种算法将不同生物标记的输出、以及来自一个或多个测试平板或孔的测试相结合，以产生适合于预测较高水平的整合功能的化合物的细胞系统生物学响应谱。在不同时间点的细胞或平板的特征可以结合起来(例如当生理响应在一段时期发生的情况)。可选择地，可以将不同孔或平板中使用不同细胞类型进行的重复实验类似地结合起来。优选地，所述细胞系统生物学响应谱代表至少约5种或更多、至少约6种或更多、至少7种或更多、至少约8种或更多、或至少约9种或更多、至少约10种或更多、至少约11种或更多、至少约12种或更多、至少约13种或更多、至少约14种或更多、至少约15种或更多的特征或功能类别。

在要分析的各个波长和时间点，各平板组中的各个平板可以产生包含各孔的一个或多个视野的图像的图像组。对所述图像组的分析产生各平板的肝细胞数据组，代表所述平板上各成像视野的随时间和浓度系列的特征值。最终，处理所述肝细胞数据组并聚类，以产生一组细胞系统生物学响应谱，从而加入到数据库或知识库中，或者用于搜索所述数据库或知识库，以鉴定生理响应的可能模式。图3表示处理平板以产生谱的样本全流程图。

可以使用几种方法从所述特征检测中产生所述谱。例如对于各特征检测，对各化合物在各化合物浓度下对单个细胞肝细胞或肝细胞群计算检测细胞群体转变的参数(例如Kolmogorov-Smirnov(KS)值或平均值)，结果产生参数稀释系列(parameters dilution series)。然后，可以拟合(fit)此类稀释系列参数，使用4-参数对数拟合，并分析拟合的数据以计算所述响应的AC50(达到50％最大活性的浓度)。然后，将所计算的AC50值转换为对数等级，作为测试物质或参比物质活性的检测值。然后可以使用聚类分析来鉴定谱中的相似性，以及细胞系统响应的相互关系。

图2描述了用于产生所述参比响应曲线以构建所述数据库或知识库的一个实施方式。根据该方法，可以分析通过所述算法产生的某些测试数据点，以鉴定2个或更多个细胞亚群。例如，核标记的强度与核中的DNA的量相关。可以分析来自一个孔的细胞群体的核强度数据，以鉴定具有2N、4N和亚2N量的DNA的细胞，后者为DNA分解的指示。由此可以将细胞群体基于1个或多个测试值而聚类成亚群，各亚群具有那些测试值的特征谱，并且因此代表一类肝细胞响应。在此种简单情况下，有3个亚群，并且因此有3个特征，包括具有2N DNA的细胞的百分比、具有4N DNA的细胞的百分比、以及具有亚2N DNA的细胞的百分比。这些特征中的每个可以用于作为化合物谱的组分。还可以使用任意数量的其它测试特征将肝细胞分类成亚群。某些测试特征(例如部分细胞缺失)是整个群体的特征，因此可以直接用作所述化合物谱中的组分。在所有情况下，将处理的肝细胞的测试值与单独以赋形剂(vehicle)(例如0.4％DMSO)处理的肝细胞相比较。

可以将化合物谱进行聚类分析、主要组分和其它模式的分析，以鉴定化合物集的普通细胞系统生物学响应谱。这些化合物的聚类代表普通类别的响应，并且可以使用该响应谱构建分类器。所有的参比化合物的谱与化合物类别的谱都储存于谱的数据库中，用于另外方式的分析。

图3通过实例描述了用于产生所述细胞系统生物学响应谱的一个实施方式，涉及在Hela细胞和A549细胞中评估测试化合物，以及将所述化合物响应分类。简单的细胞系统生物学响应谱可以应用于肝细胞。当对所述参比化合物进行分析时，进一步分析所述测试特征，以鉴定细胞亚群谱，该细胞亚群谱与直接测试特征一起形成储存在所述数据库中的化合物谱。细胞系统生物学谱的比较允许鉴定所比较的细胞系统生物学谱之间的相似性、差异或其组合。可以使用多种方法来比较2个或更多个细胞系统生物学谱，例如通过绘图展示、聚类分析、或相关性的统计检测以及其组合。因此，测试化合物的细胞系统生物学响应谱与数据库或知识库中的细胞系统生物学响应谱之间的相似性的检测，可以用于计算测试化合物在体外或体内产生相关联谱的可能性。用于比较化合物谱的度量(metric)可以是多种标准度量中的任意一种，例如欧几里德距离(Euclidean distance)、皮尔森相关系数(Pearson′scorrelation coefficient)、曼哈顿距离(Manhatten distance)、或任意其它用于比较多参数谱的度量。测试化合物谱与参比化合物共同分析，以鉴定所述测试化合物与特定聚类的联系。多种联系模型以及其它分类方法可以用于相对于数据库中的参比化合物谱来将测试化合物分类。

如前所述，在一个实施方式中，所述肝细胞含有代谢活性的细胞色素P450(此处也称为“有活性的肝细胞”或“代谢活性的肝细胞”)。目前，已经发现了约55个人类细胞色素P450亚型。然而，几乎所有这些亚型都涉及内源物质代谢。仅有约5-9个细胞色素P450亚型与药物的代谢相关。已知与临床相关的涉及毒性的细胞色素为CYP3A4、CYP2D6、CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19和CYP2E1。除CYP1A2在体外比在体内能诱导到更高水平以外，所有其它的细胞色素在原代肝细胞中随时间被下调。熟练的技术人员应当理解，原代肝细胞会随时间和/或依赖于体外细胞培养条件而丢失细胞色素P450代谢活性。例如，如图11A所示，原代肝细胞的代谢活性依赖于时间而降低。在铺种肝细胞3小时后，细胞色素P450的代谢约为新鲜分离的细胞的水平的70％，且在16小时和24小时后分别降低到30％和20％。此外，某些物质的肝细胞毒性作用由它们的代谢形式决定。例如，如图11B-C所示，仅在当肝细胞将原始双氯芬酸化合物生物激活(例如代谢)为4’-OH-和5-OH-双氯芬酸衍生物时，化合物双氯芬酸才具有毒性。因此，为了某些应用，各肝细胞的肝细胞特征值依赖于所述肝细胞对于所述测试物质或化合物的处理(例如代谢)。因此，在本发明的一个实施方式中，当对测试物质或参比物质进行测试以分析它们对细胞系统生物学的毒性作用时，与缺少或具有有限的细胞色素P450代谢活性的细胞(例如HepG2细胞)相反，有利地使用具有所需的细胞机械完整性的有活性的肝细胞(例如具有细胞色素P450代谢活性的肝细胞，例如至少一种或更多的选自由CYP3A4、CYP2D6、CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19和CYP2E1所组成的组中的活性P450细胞色素)。在优选实施方式中，测试物质与一种或多种肝细胞相接触，所述肝细胞具有与新鲜分离的肝细胞相比至少约90-100％的细胞色素P450代谢活性。在另一个实施方式中，所述肝细胞具有与新鲜分离的肝细胞相比至少约80-100％、至少约70-100％、至少约60-100％、至少约50-100％、至少约40-100％、至少约30-100％、至少约20-100％、至少约10-100％、或其中的范围的细胞色素P450代谢活性。在一个实施方式中，在体外2-D铺种肝细胞后，将测试物质与原代肝细胞接触约1分钟到1小时、约1-12小时、约1-10小时、或约3、4、5、6、7、8、9、10、11或12小时。在另一个实施方式中，在体外3-D铺种(例如使用胶原凝胶覆盖技术)肝细胞后，将测试物质与原代肝细胞接触约0-120小时、约5分钟到约1小时、约1、2、3、4、5、6、9、12、15、18、21、24、30、36、48、60、72、84、96、108、120小时。

在本发明的另一个实施方式中，可以将来自各肝细胞的所有肝细胞特征值结合在一起，以产生肝细胞谱。图4表明展示用于产生细胞系统生物学响应谱的细胞响应的一些绘图展示方法。这些绘图展示也用于描述多维细胞响应。HeLa和A549细胞的细胞特征图谱用于鉴定与特异细胞系统生物学响应谱相关的细胞功能。如此处所述，导致凋亡的细胞生理事件的知识可以增加分类器的输出的信息，但是对于应用本发明的方法并不是必需的。细胞分布图谱(4B)描述当物质浓度变化时的细胞响应分布的改变。这些图表明群体中的细胞如何占据分离的响应类别，以及当物质浓度变化时从一个类别变为另一类别。细胞系统生物学响应谱(4C)用于通过应用KS分析来定量群体响应分布中的变异。然后，这些类别的每一个的占有百分比变为群体细胞系统生物学响应谱。来自参比化合物的群体谱与参比化合物的谱相结合并储存于数据库或知识库中。所述测试化合物的群体谱与数据库中的参比化合物的群体谱相比较，并计算匹配的概率。

为了将肝细胞群体中由参比物质或测试物质处理而诱导的肝细胞响应的变化进行定量，可以有效地使用几种不同的方法。在肝细胞群体中，由于细胞响应的不均一性，可以有多种不同的个体细胞系统生物学响应谱(Elsasser，Proc Natl Acad Sci USA 1984；81(16)：5126-9；Rubin H，Proc NatlAcad Sci USA 1984；81(16)：5121-5)。在一个实施方式中，可以使用拟合分析的柯尔莫哥洛夫-斯米尔诺夫(Kolmogorov-Smirnov(KS))goodness(KS值)将孔或载玻片中对于各肝细胞参数的所述肝细胞响应的分布与对照物质的分布进行比较(Giuliano et al.，Assay Drug Dev Technol 2005；3(5)：501-14)。例如，为了在多元的HCS衍生细胞群体分布数据中进行物质依赖的变化的显著性检验，如Peacock所描述(Peacock，Monthly Notices of the RoyalAstronomical Society 1983；202：615-27)和由Fasano和Franceschini进一步精炼的(Fasano et al.，Monthly Notices of the Royal Astronomical Society 1987；225：155-70)，可以将一维KS检验适用于二维。将以一种物质处理后获得的二维细胞群体数据分布(代表来自多重HCS测试的两个生理参数)与获自多个孔的未处理肝细胞的二维细胞群体数据分布相比较。首先，可以通过由未处理细胞的数据分布计算的x轴和y轴的中位值将各分布分成4个象限(quadrants)。然后通过所有4个象限的搜索(ranging)来寻找所述二维KS值，以找到各处理象限中肝细胞部分与各相应未处理象限中肝细胞部分之间的最大差异。也可以用其它统计学方法来分析细胞群体响应的不均一性。可以使用几个其它可能的分析算法或方法，以基于参比物质测试组的已知特性来讲细胞系统生物学响应谱分类，所述方法包括例如神经网的方法。通过凝聚聚类法(agglomerative clustering)对KS细胞系统生物学响应谱进行聚类，以鉴定具有相似活性的化合物。可以使用除KS分析以外的其它方法在聚类之前处理数据，并且可以使用多种聚类算法。

还可以通过对用于产生细胞系统生物学响应谱的细胞响应进行绘图分析来辅助本发明的方法的实践。另外，图4A-4C表明展示用于产生细胞系统生物学响应谱的细胞响应的一些绘图展示方法。这些绘图展示也用于描述多维细胞响应。细胞特征图谱用于鉴定与特异细胞系统生物学响应谱相关的细胞功能。如此处所述，对于多种细胞类型，导致凋亡的细胞生理事件的知识可以增加分类器的输出的信息，但是对于应用本发明的方法并不是必需的。细胞分布图谱描述当物质浓度变化时的细胞响应分布的改变。这些图表明群体中的细胞如何占据分离的响应类别，以及当物质浓度变化时从一个类别变为另一类别。细胞系统生物学响应谱用于通过应用KS分析来定量群体响应分布中的变异。

图5A-5C描述用于从HCS分析获得细胞系统生物学响应谱的附加显像工具。例如利用3个显像工具来呈现数据组，该数据组显示11个浓度的Laulimalide(LML)对MDA-MB-231乳腺细胞的DNA含量的作用。图5A显示细胞响应数据的图组。各图显示在各浓度(nM)的LML下细胞DNA含量的群体分布。通过此种方法可以容易地观测所述群体分布的形式的精细改变，但是除非通过能够更灵敏地检测全部群体响应的KS分析，否则很难分辨跨过整个浓度范围的趋势。图5B描述了三维的表面图。当以合适的颜色编码在最佳角查看时，一系列叠加的细胞群体分布曲线提供了理想的环境，在其中可以同时查看和分析一系列复杂的曲线。然而，由于图的形状缺陷以及缺乏视觉校准信号，很难进行在二维平面(例如计算机屏幕或纸)上的多个三维表面图之间的比较。最后，图5C表示数据的二维轮廓图或“分布图谱”。在分布图谱中数据点密度的颜色编码可以产生在二维平面上基本突出的三维表面图的独特方法。例如，蓝色阴影可以编码最低群体密度，而黑色阴影和黄色阴影可以编码最高群体密度。当DNA含量数据绘制成分布图谱时，通过三维表面图提供的多种细节可以被复制。此外，多个分布图谱可以容易地排列以用于多重HCS数据组的同时显现。这些和其它显像工具可以容易地应用于肝细胞建谱。

在另一个实施方式中，本发明提供一组用于进行所述建谱的方法和软件工具。本发明的另一个实施方式是用于产生细胞系统生物学响应谱的一套试剂和方法，以产生知识库、或用使用现有知识库和信息学软件来产生物质生理学作用的谱。本发明的另一个实施方式是生理学谱的数据库。这些可以以面对最终使用者的产品(即试剂盒)来提供或用于以本发明的试剂组合软件或以用户自己的测试来为用户进行建谱服务。因此，本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒含有试剂和根据本发明的方法使用所述试剂的说明书。在一个实施方式中，所述试剂盒含有一种或多种试剂和使用所述试剂的说明书，以根据操作方法进行一组肝细胞的测试，所述方法包括以测试物质或参比物质培育一组肝细胞；获得所述组内的肝细胞的图像；分析所述图像以测量或检测只是细胞功能类别的生物标记；以及产生含有至少5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多的所述生物标记的细胞系统生物学响应谱。所述试剂盒还包括将测试物质的细胞系统生物学响应谱与具有已知的生物学系统作用的物质的细胞系统生物学响应谱的数据库进行比较的说明书。所述试剂可以包括肝细胞或经处理具有肝细胞功能的细胞(在液氮中保存)、一种或多种荧光或冷光标记、实验室器皿例如多孔平板、培养基等等。此外，所述试剂盒可以包括具有已知的生物学系统作用的物质的细胞系统生物学响应谱的数据库(例如在电子储存介质上)。作为试剂盒的实例，在表5、6和7中描述的所有的试剂可以以合适的量包装，用以制备标准数目的测试平板，例如实施例1所述的处理16个化合物所需的6个平板。所述试剂盒通常包括如实施例1所述的用于样品制备的方法，以及任选的具有已知细胞系统生物学响应谱的参比数据值。该数据可以以电子形式在内含的CD或DVD盘中或其它数据储存介质中提供，以及通过网络登录化合物谱的集中数据库。此类试剂组合和方法的选择、测试和验证需要有效的努力以避免干扰并确保可靠性，因此得到难于再工程化的独特的试剂和方法的组合，并且可以进行在细胞活性建谱中使用的多重数据的采集。

实施例1

该实施例证明本发明的一个实施方式，其中，使用一组测试功能类别以建立产生肝细胞毒性的物质的谱。

要进行毒性测试的所述功能类别包括胁迫途径、线粒体功能、细胞周期阶段、形态学改变、凋亡、核的改变、磷脂质化和过氧化物酶体增殖。在一个实施方式中，要进行毒性测试的所述功能类别选自由线粒体功能、凋亡、核的改变、磷脂质化、脂肪变性和DNA损伤所组成的组中。在一个优选实施方式中，至少一种要进行毒性测试的所述功能类别为磷脂质化或脂肪变性。在另一个优选实施方式中，至少两种功能类别要进行毒性测试，其中至少一种功能类别为磷脂质化或脂肪变性。在另一个优选实施方式中，至少三种功能类别要进行毒性测试，其中至少一种功能类别为磷脂质化或脂肪变性。在另一个优选实施方式中，至少四种、五种、六种或更多的功能类别要进行毒性测试，其中至少一种功能类别为磷脂质化或脂肪变性。

可以根据本发明的方法测试某些特征，以产生知识库或对存在于下述表1和图6中的测试化合物进行测试。

表1

细胞功能类别	特征
		DNA损伤	i.细胞周期调节(DNA含量和降解)ii.核形态iii.GADD153蛋白激活
凋亡指示剂	i.DNA含量和组成ii.核形态iii.线粒体功能(膜电位)iv.半胱天冬酶(Caspase)激活(多个亚型)v.Bax线粒体易位vi.细胞色素C释放vii.PARP激活
		细胞形态	i.细胞铺展和细胞过度生长ii.细胞粘附iii.细胞运动iv.集落形成和消散v.细胞角蛋白8、18、19、波形蛋白的表达vi.微管蛋白稳定性vii.激动蛋白稳定性
磷脂质化	i.溶酶体的量ii.耦合荧光探针的磷脂的摄入
		过氧化物酶体增殖	i.过氧化物酶体的量ii.过氧化物酶体特异性抗体，例如PMP70
线粒体功能	i.线粒体膜电位
		脂肪变性	i.脂肪泡数量ii.脂肪泡面积iii.脂肪泡亮度

在这些测试功能类别中，选择一种或多种测试，用以检测作为在该测试功能类别中响应的指示的一种或多种生物标记。可以使用本发明的方法来验证另外的测试和功能类别，这些测试和功能类别可以添加到谱中以改进本发明的特定实施方式的敏感性、特异性或应用范围。

一个实施方式使用来自这些功能类别中的一套测试。这些测试首先用于建立预测的毒物学知识库，然后用以产生测试化合物的谱，将该测试化合物的谱与所述知识库中的类别相比较，由此预测所述测试物质的毒性作用。本发明的另一个实施方式使用图6中列出的所有测试，以产生更广泛的谱，然后使用统计学方法(例如主要组分分析)以鉴定对于选定的毒物学参数谱具有最高预测能力的特征。

用于测试这些细胞功能类别和特征的试剂是本领域技术人员已知的，并且是可商购的。实例在表2中列出。

表2

细胞功能的指示	细胞参数(生物标记/特征)	试剂	试剂来源
				凋亡	细胞数目，DNA片段化，DNA含量和组成	Hoechst 33342	Sigma B2261
磷脂质化	溶酶体的量，耦合荧光基团的溶酶体物质的摄入，溶酶体特异性蛋白质	Lysotracker绿，Lysotracker红，BoDipy C12-HPC抗-LAMP1抗体	分子探针(Molecularprobes)
				过氧化物酶体的增殖	过氧化物酶体特异性蛋白质	抗-PMP70抗体，抗-ALDP抗体	Invitrogen 71835
微管蛋白细胞骨架；细胞角蛋白细胞骨架	微管细胞角蛋白	抗-MT，抗-CK8、18，抗CK19，抗-波形蛋白	Sigma
				DNA损伤	标记有特异性抗体的核	抗-p-53，抗-GADD153，抗-8鸟嘌呤	Chemicon UpStateSigma
线粒体膜电位线粒体损伤	线粒体亮度细胞色素C释放	Mitotracker红，TMRN抗细胞色素C抗体	分子探针UpStateSigma
				二级标记(secondary.GIF")		驴抗小鼠Cy3驴抗小鼠FITC驴抗小鼠Cy5驴抗兔Cy3	Chemicon AP 192CChemicon AP 192FChemicon AP 192SChemicon AP 182CChemicon AP 182F
		驴抗兔FITC驴抗兔Cy5驴抗羊Cy3驴抗羊FITC驴抗羊Cy5	Chemicon AP 182SChemicon AP 184CChemicon AP 184FChemicon AP 184S
				GSH	谷胱甘肽	Bio-Gee，抗-GSH抗体，Thioltracker	Invitrogen，Sigma

该实施例涉及多个细胞系统生物学毒性HCS谱。该实施例描述肝细胞毒性谱的性能，设计为使用表3和4A中显示的两种平板测试来检测8个细胞功能作为细胞毒性参数。新的另外肝细胞特征在表4B中显示。该实施例还证明了如何分析和解释获得的响应数据。

测试和试剂特异性

所述肝细胞毒性谱平板1含有如表5所示的标记和特征，所述肝细胞毒性谱平板2含有如表6所示的标记和特征。细胞毒性谱平板1的特异性细胞生理学试剂的抗体和荧光指示剂在表5中列出，而细胞毒性谱平板2的特异性细胞生理学试剂的抗体和荧光指示剂在表6中列出。最后，细胞毒性谱平板1和2的特异性测试缓冲液在表7中列出。

表3 CellCipher^TM肝细胞毒性谱：多孔平板1

细胞参数(特征)	检测	试剂
			(1)细胞缺失(2)核组成(3)核大小	细胞缺失％亮度变化核面积	Hoechst 33342
(4)磷脂质化	溶酶体的量	Lysotracker红
			(5)细胞色素C	凋亡	抗-细胞色素C，抗羊-FITC
(6)GADD153	DNA损伤	抗-GADD153，抗-兔Cy5

表4A CellCipher^TM肝细胞毒性谱：多孔平板2

细胞参数(特征)	检测	试剂
			(1)细胞缺失(2)核大小	细胞缺失％核面积	Hoechst 33342
(7)脂肪变性	脂肪面积	Lipidtox深红
			(8)线粒体功能I(电位)	线粒体膜电位	MitoTracker红，TMRN

表4B 可能的多个细胞特征

细胞参数(特征)	检测	试剂
			氧化代谢	Cyp P450	EROD，PROD，BZQ，荧光探针

细胞参数(特征)	检测	试剂
			氨去毒作用	尿素介导的释放	尿素
反应性氧	巯基修饰	还原Mitotracker红
			极性转运的抑制	胆小管流动	Tracker染料CMFDA
糖类代谢	葡萄糖介导的释放糖原生成	2-nbdg
			GSH	谷胱甘肽含量	抗-GSH，Thiol Tracker，MCL，BioGee

表5 多孔平板1所需的试剂

平板1细胞参数	试剂	目录号(lot)	原始试剂的初始稀释(储存温度)	原始试剂的最终稀释或最终试剂浓度	384孔微量平板所需的初始稀释试剂的精确体积
						(1-3)核	Hoechst33342	Sigma B2261(044K4096)	以水重溶到10mg/ml(4℃)	1∶10000	0.38μl
磷脂质化	Lysotracker红	InvitrogenD3792	以DMSO重溶到1mM	1∶1000	1.25μl
						细胞色素C释放	抗细胞色素C	UpState 05-479	无已含有30％甘油	1∶200	19.2μl
细胞色素C释放第2抗体	抗-羊FITC	MilliporeAP192S(0604027318)	以400μl 50％甘油重溶(-20℃)	1∶300	12.8μl
						GADD153	抗-GADD153	细胞信号传导(Cell Signaling)	无已含有30％甘油	1∶400	9.6μl
GADD153第二抗体	抗-兔cy5	Upstate	以400μl 50％甘油重溶(-20℃)	1∶300	12.8μl

表6 多孔平板2所需的试剂

平板2细胞参数	试剂	目录号(lot)	原始试剂的初始稀释(储存温度)	原始试剂的最终稀释或最终试剂浓度	384孔微量平板所需的初始稀释试剂的精确体积
						(1-2)核	Hoechst33342	Sigma B2261(044K4096)	以水重溶到10mg/ml(4℃)	1∶10000	0.38μl
脂肪变性	Lipidtox	Invitrogen(H34477)	无已制备	1∶1000	20μl
						线粒体电位	Mitotracker	InvitrogenM7512(42746A)	以DMSO重溶到1mM(-20℃)	1∶20000	0.19μl

表7 多孔平板1和2所需的测试缓冲液

测试步骤	试剂	目录号(lot)	一个384孔微量平板所需的缓冲液的精确体积
				甲醛的稀释	含酚红的Hanks平衡盐溶液-1×	Hyclone    SH30030.03(AQL25083)	15.4ml
透化作用试剂的稀释	含酚红的Hanks平衡盐溶液-1×	Hyclone    SH30030.03(AQL25083)	6.1ml
				固定后的清洗	含酚红的Hanks平衡盐溶液-1×	Hyclone    SH30030.03(AQL25083)	38.4ml
透化作用后的清洗	含酚红的Hanks平衡盐溶液-1×	Hyclone    SH30030.03(AQL25083)	38.4ml
				第一抗体标记后的清洗	含酚红的Hanks平衡盐溶液-1×	Hyclone    SH30030.03(AQL25083)	38.4ml
第二抗体标记后的首次清洗	含酚红的Hanks平衡盐溶液-1×	Hyclone    SH30030.03(AQL25083)	38.4ml
				第二抗体标记后的二次清洗	含酚红的Hanks平衡盐溶液-1×	Hyclone    SH30030.03(AQL25083)	38.4ml

肝细胞的细胞处理和铺种过程

为建立肝细胞毒性谱，使用可以在多数HCS读出器上使用的适合高数量孔的光学薄底384孔微量滴定平板。Falon#3962平板或Greiner#781091平板具有最大的表面积，适合用于HCS。这些微量滴定平板以胶原I包被，通过以溶于1∶1000冰醋酸(Sigma A6283)中的浓度为0.25mg/ml的胶原I(Sigma C9791)清洗所述微量滴定平板，并将这些平板在无菌操作台中空气干燥，产生最适附着物质并分散HepG235肝细胞。将溶解的胶原I加入到干燥的384孔微量滴定平板(16μl/孔)，将所述平板在室温下培育5分钟，然后振掉孔中的溶液，将所述微量滴定平板在无菌操作台中空气干燥。

根据标准分离方法，从合适大小的雄性大鼠分离肝细胞到铺种培养基中。在384微量滴定平板中，以10000个肝细胞/孔的密度铺种肝细胞。装满各微量滴定平板以后，将平板置于稳定工作台上静置30分钟。在室温下静置30分钟后，将所述微量滴定平板置于37℃、5％CO₂培养箱中。另外附着3-4小时以后，倾泻铺种培养基，换为无血清培养基。

化合物的制备和肝细胞的处理

标准化合物以如下浓度在DMSO(Sigma D8418)中制备：CCCP-SigmaC2759 20mM；衣霉素(Tunicaymcin)-Sigma T789，10mM；氯喹(Chloroquine)-Sigma C662633.3mM；和布比卡因(bupivacaine)-SigmaB5274，16mM。测试化合物在DMSO中制备成浓度高达50mM，并储存于-20℃。在进一步以含有酚红的HBSS稀释之前，所有化合物以DMSO稀释。所述标准化合物的最大终浓度如下：布比卡因(Bupivicaine)-160μM(每3个平板200μl的5×溶液[50μM])；氯喹(Chloroquine)-333μM(每3个平板200μl的5×溶液[50μM])；CCCP-200μM(每3个平板200μl的5×溶液[50μM])；以及衣霉素(tunicamycin)-150μM(每3个平板200μl的5×溶液[50μM])。各化合物进行10个点的稀释，每步轻微地稀释多于3倍(10的平方根)。通过转移10μl的5×化合物储存液来添加化合物。对于所有条件，在添加化合物后，各孔使用终浓度为1％的DMSO(总体积50μl)。

在固定前以MitoTracker红标记肝细胞毒性谱多孔平板2

首先，在温热培养基中制备400nM的MitoTracker红储存溶液。向微量平板的各孔中加入50μl的2×Mitotracker红溶液，使终浓度为200nM。在进行细胞固定步骤之前，将所述微量平板在37℃、CO₂培养箱中培育45分钟。

在固定前以红色标记肝细胞毒性谱多孔平板3

在温热培养基中制备42μM的Lysotracker红储存溶液。向微量平板的各孔中加入50μl的2×Lysotracker红溶液，使终浓度为1μM。在进行细胞固定步骤之前，将所述微量平板在37℃、CO₂培养箱中培育45分钟。

Mitotracker红平板细胞固定方法

制备含有溶于含酚红的HBSS中的浓度为7.2％的甲醛(Sigma 252549，36％储存液)的2×固定液。向微量平板的各孔中加入50μl的固定液。在以HBSS(100μl/孔)清洗之前，将所述微量平板在室温下培育30分钟，清洗后立即除去HBSS。

Lysotracker红平板细胞固定方法

制备含有溶于含酚红的HBSS中的浓度为3.6％的甲醛(Sigma 252549，36％储存液)的1×固定液。将Lysotracker红平板从培养箱中取出并倾泻。向微量平板的各孔中加入50μl的固定液。在以HBSS(100μl/孔)清洗之前，将所述微量平板在室温下培育30分钟，清洗后立即除去HBSS。

细胞透化和标记方法

通过以0.5％(v/v)Triton X-100(Sigma T9284)(16μl/孔)在室温下培育5分钟来透化肝细胞。以HBSS(100μl/孔)清洗所述微量平板，清洗后立即除去HBSS。将多孔平板1中的肝细胞以表3中所列的第一抗体试剂在室温下培育1小时(20μl/孔)。将多孔平板2中的肝细胞以表4中所列的lipidtox深红试剂在室温下培育1小时(30μl/孔)。以HBSS(100μl/孔)清洗所述微量平板，清洗后立即除去HBSS。将多孔平板1中的肝细胞以表3中所列的第二抗体试剂和Hoechst33342在室温下培育1小时(10μl/孔)。将多孔平板2中的肝细胞以HBSS(50μl/孔)清洗一次，并将清洗液留在孔中。然后将所述平板密封用于HCS分析。

CellCipher肝细胞毒性谱多孔平板的示例性标准平板设置

在图7中描述了多孔平板1和2的示例性标准平板设置。含有24个DMSO对照的各微量平板分布在角落。各微量平板含有以10个点浓度系列的2个双重复对照。各微量平板还含有以10个点浓度系列的16个双重复测试物。

平板读数

使用Cellomics

BioApplication软件结合Cellomics

储存数据库，以ArrayScan

HCS读出器来获得制备的微量平板或载玻片的细胞图像。也可以使用其它HCS读出器和应用程序以及其它显微镜成像系统结合相同或任选的图像分析包，来进行数据的获得和特征的提取。简言之，使用仪器扫描各样品或微量平板孔的一个或多个光学视野，对各平板上的各光学视野集中4个荧光通道。

算法

封装在Cellomics BioApplication软件中的算法可以产生各细胞核各平板的各孔的多数目的特征值。生物标记的实例包括亚细胞物的总强度和平均强度、空间特征，例如面积的周长和长宽比、以及光学视野中各细胞的定位。孔特征在孔中检测的肝细胞的整个群体上平均或累加，包括细胞计数、平均核大小、平均核强度、总核强度、平均细胞质/核比例以及这些平均值的标准偏差。由于添加的化学化合物对肝细胞与基质的附着的作用，每孔检测的肝细胞的总数典型地在100-1500个范围内，这依赖于细胞响应的不均一性和测试的敏感性。使用测试输出参数在2个时间点检测表1和2中显示的肝细胞毒性参数，所述时间点为急性(30分钟)和早期(24小时)。例如，为了计算核形态的改变，使用各细胞的平均核强度值。使用以c-jun特异性抗体标记的肝细胞的平均核强度来获得c-jun磷酸化的检测。用于提取生物学功能的信息的图像特征在表3、表4A和表4B中列出。图像和细胞分析领域的技术人员应当了解有多种容易获得的此类算法，以及有多种此类细胞处理适用于基于图像的肝细胞分析以检测细胞功能。

响应值的定量

为了定量在以参比或测试分子处理的肝细胞群体中诱导细胞响应的整体改变，使用匹配分析的非参数Kolmogorov-Smirnov(KS)goodness(KS值)，将孔中各细胞参数的细胞响应分布与仅含有DMSO的对照孔相比较(Giuliano et al.，Assay Drug Dev Technol 2005；3(5)：501-14)。所述KS分析对各孔产生单个值，因此对各浓度产生单个值。使用Xlfit(IDBS，Guildford，UK)将剂量响应数据拟合于4个参数对数模型。对于全部浓度系列的AC50值转换成对数(log[IC50)。图8A和图8B中显示了CCCP和紫杉醇的剂量响应曲线拟合的实例。

化合物响应的聚类和分类

图9为HepG2细胞中测试化合物的响应值的热学图谱，但是化合物响应的聚类和分类可以适用于肝细胞。水平轴为化合物的名称，垂直轴为检测的特征。所述检测的特征为2组。早期毒性评估在24小时进行，长期毒性为暴露48小时。灰色的水平表示AC50浓度，上方的白色为mM，中间灰色为μM，下方的黑色为nM。使用标准欧几里得距离度量进行化合物聚类。本领域技术人员应当了解也可以使用多种其它的度量。聚类图顶部的高度表示谱间的相似程度，而较短的分支表示所述谱更为相似。由矩形A-C表示化合物的3个聚类。矩形A中的3个化合物在任意测试中均没有活性，由此具有特别高的相似度。聚类B中的2个化合物米法斯丁(mevastatin)和洛伐他汀(lovastatin)在多种测试中具有中度活性(在μM范围)，在测试中具有非常相似的活性谱，且事实上具有非常形似的化学结构。聚类C中的5个化合物在多种测试中具有高度活性(在nM范围)，它们的谱具有不同程度的相似度。甚至在这样小的数据组中，也可以使用化合物细胞系统生物学响应谱的聚类，以鉴定化学上相似以及生物学上相似的化合物。

除了多种聚类分析的方法，数据挖掘(data-mining)领域的技术人员应当了解也可以应用其它统计学方法来发现多维数据组中的此类关系。图10表明相同数据组的主要组分(PC)图。主要组分分析(PCA)是本领域内公知的，得到一组正交组分中数据的线性图谱，以使方差(variance)最大。图中间的大的聚类为差异极小或没有差异的化合物。然而，有2个重要的化合物的聚类(图10中的A和B)，与测试物清楚地区分，但是对于开始的2个PCs彼此相似。还有2个化合物(图10中的C和D)对于开始的2个PCs在该组中是独特的。在该图中还有几个其它化合物是可清楚区分的。第一个PC的负荷(loadings)分析表明多种不同测试特征对PC中的方差的贡献几乎相等。10个最显著的测试是：长期氧化胁迫、染色质浓缩、胁迫激酶的激活、细胞缺失、DNA修复活性、核的大小、以及早期胁迫激酶的激活、氧化胁迫、核的大小和细胞缺失。这些特征的PC负荷范围在0.22-0.3，表明所有特征显著地贡献于通过该谱区分化合物。

其它PCs的负荷分析表明即使在这样小的库中，多数测试特征显著地贡献于区分这些化合物作用的细胞模式。结论是该谱的测试宽度为比较化合物活性和坚定作用的常规模式提供了重要的工具。这些急性分析也可以应用于肝细胞筛选。

覆盖培养的材料与方法

肝细胞覆盖3D细胞培养是本领域公知的(例如见Ng et al.，″ImprovedHepatocyte Excretory Function by Immediate Presentation of Polarity Cues″Tissue Engineering，2006，12(8)：2181-2191，和Richert et al.，″Evaluation of theeffect of culture configuration on morphology，survival time，antioxidant statusand metabolic capacities of cultured rat hepatocytes″Toxicol In Vitro，2002；16(1)：89-99)。简言之，根据标准分离方法，从合适大小的雄性大鼠分离肝细胞到铺种培养基中。在384孔微量滴定平板中以16000-18000个肝细胞/孔德密度铺种肝细胞。装满各微量滴定平板以后，将平板置于稳定工作台上静置30分钟。在室温下静置30分钟后，将所述微量滴定平板置于37℃、5％CO₂培养箱中。另外附着3-8小时后，将所述平板置于冰上10分钟而短暂冷却到10-15℃。倾泻掉铺种培养基，换为10μl的冷却到4℃的50％基质胶培养基。再将平板置于冰上5分钟，然后在冷却到10℃的离心机中以50g离心1分钟。离心后，将平板于37℃、5％CO2培养箱中放置1小时，以使凝胶覆盖(凝固)。凝固后，加入40μl肝细胞的细胞培养基。将平板培育48小时，然后在已存在的培养基顶部再另外添加40μl肝细胞培养基。将平板再培育48-72小时。

化合物制备和肝细胞的处理

曲格列酮(Troglitazone)、氯丙嗪(chlorpromazine)对照以如下浓度在DMSO(Sigma D8418)中制备：曲格列酮10mM，氯丙嗪10mM。在以含有酚红的HBSS进一步稀释之前，所有化合物以DMSO稀释。标准化合物的最大终浓度如下：曲格列酮100μM，氯丙嗪100μM。各化合进行10个点的稀释，每步轻微地稀释多于3倍(10的平方根)。通过转移10μl的5×化合物储存液来添加化合物。对于所有条件，在添加化合物之后，各孔使用终浓度为1％的DMSO(总体积50μl)。

图11A-11C的材料和方法

通过多种公开的和标准的方法确定细胞色素P4503A4的活性水平。例如见Promega P450-Glo 3A4发光完整细胞测试试剂盒。简言之，在胶原1包被的24孔平板中，以每250μl培养基100000个细胞的密度铺种肝细胞。在选定孔中加入连接荧光素的Cyp P4503A底物试剂，并培育3小时。3小时后去除一部分培养基，以发光测试释放到培养基中的荧光素。以相同的方式测试其它肝细胞的孔，不同的是在附着和培育3小时、16小时、24小时或48小时之后。

在一个实施方式中，在附着3小时或16小时后向所述肝细胞加入双氯芬酸，并使双氯芬酸保留在肝细胞溶液中24小时。经药物暴露阶段后，固定肝细胞病进行核染色和图11A-11C所示的VTI图像数据采集。在图11A-11C中证明了在分离的大鼠肝细胞中依赖于代谢的毒性。图11A为显示肝细胞代谢能力随时间降低的图。铺种后3小时，细胞色素P450代谢约为新鲜分离的细胞的水平的70％，而在16小时或24小时后分别降为30％和20％。图11B为表明产生明显的细胞毒性需要来自双氯芬酸代谢的毒性产物的图，并且证明了在24小时和48小时剂量依赖和时间依赖的细胞缺失。然而，暴露于缺乏代谢能力的细胞系(HepG2细胞)72小时后，没有明显的毒性。图11C为表明在肝细胞中将化合物定时暴露于代谢活动的重要性的图。当以双氯芬酸处理肝细胞16小时后，与处理3小时相比毒性降低。

铺盖培养的肝细胞毒性谱多孔平板3的标记

以Hoechst覆盖培养1.5小时，然后加入赋形剂或化合物进行30分钟的药物处理。以10×的浓度制备CMFDA，(40μM，在HBSS中)，并添加到终浓度为4μM。覆盖培养另外的20-30分钟，然后在不固定的情况下成像。

图12A-12C表明在覆盖培养4天后，肝细胞恢复极性胆小管运输功能。图12A为证明在对照细胞中的正常运输的图像，在邻近的肝细胞之间形成的胆小管空间中显示增强的荧光。图12B为显示化合物(例如曲格列酮)抑制正常运输功能的图像，胆小管空间中的荧光减少。图12C为用图像分析处理定量荧光染料的运输的图，通过将邻近的肝细胞之间的荧光的强度或面积分别用总的肝细胞强度或面积进行均一化(normalizing)。

除非此处特别指出或在文中清楚地反对，在本发明的说明书(尤其在权利要求)中使用的术语“一个”和“一种”和相似的术语，可以解释为覆盖单数和复数形式。除非另外说明，术语“包含”“具有”“包括”和“含有”应当理解为开放式术语(即指“包括，但不限于”)。除非另外说明，此处的数值范围的描述仅预期作为单独指该范围内的各分离值的快速方法，且正如此处单独引用的，在说明书中引入了各分离的值。除非此处特别指出或在文中清楚地反对，此处描述的所有方法可以以任意合适的规则进行。除非另外要求，此处提供的任意和所有实例、或示例性语言(如“例如”)仅预期更好的说明本发明，而不是限制本发明的范围。说明书中的语言不应解释为表明对本发明的实践很重要的任意的非权利要求元素。

此处描述了本发明的优选实施方式，包括本发明人已知的进行本发明的最佳方式。通过阅读前述说明书，那些优选实施方式的变更对于本领域普通技术人员是显而易见的。本发明人预期技术人员可以适当地使用此类变更，并且本发明人预计本发明可以以除此处特定描述的方式被实践。因此，本发明包括所有适用法律所允许的附加权利要求中所引用的主题的修饰和等同物。而且，除非此处特别指出或在文中清楚地反对，本发明包括上述元素以其所有可能变体的任意组合。

本申请引用了国际申请PCT/US2007/011865(公开号为WO2007/136724)；PCT/US2007/012406(公开号为WO2007/139895)；PCT/US2007/023678(公开号为WO2008/060483)；PCT/US2007/01217(公开号为WO2008/018905)；PCT/US2005/027919(公开号为WO2006/017751)；PCT/US2008/003401；以及美国临时专利申请No.60/759,476(申请日为2006年1月17日)和美国临时专利申请No.60/846,006(申请日为2006年9月20日)作为参考。

此处引用的所有参考文献，包括公开出版物、专利申请和专利，正如各参考文献单独地和特异地引用作为参考和以其整体引用一样，各参考文献在此以相同的范围引用作为参考。

本发明参考实例实施方式来特定地显示和描述，本领域技术人员应当理解在不背离本发明所附权利要求的范围的情况下，可以对本发明的形式和细节进行多种改变。

Claims (42)

1.一种预测测试物质对肝细胞的生物学系统作用的方法，其中，该方法包括：

a)将含有代谢活性的细胞色素P450的肝细胞与所述测试物质接触；

b)检测至少两种细胞功能类别中的6种或更多种细胞特征，其中，至少一种细胞功能类别为磷脂质化或脂肪变性，由此产生与所述测试物质接触的所述肝细胞的响应谱；以及

c)将与所述测试物质接触的所述肝细胞的响应谱与数据库进行比较，该数据库包括对肝细胞具有已知的生物学系统作用的一种或多种物质的响应谱，其中，当与所述测试物质接触的所述肝细胞的响应谱与所述数据库中的响应谱相同或相似时，则预测所述测试物质与所述数据库中对肝细胞产生已知的生物学系统作用的物质具有相同或相似的生物学系统作用。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述已知的生物学系统作用为毒性生物学系统作用。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述肝细胞为原代肝细胞、干细胞衍生的肝细胞、肝脏切片中的肝细胞、外植培养的肝细胞或肝细胞衍生的细胞系。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述肝细胞以一套荧光标记试剂所标记，其中各荧光标记试剂对生物标记是特异性的，所述一套荧光标记试剂检测至少5种不同的生物标记，并且所述生物标记的检测是读取一种或多种特征。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述肝细胞表达一种或多种荧光的或发冷光的报告子。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述一种或多种荧光的或发冷光的报告子被引入到所述肝细胞中。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述肝细胞是混合的细胞类型的群体。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，至少一种细胞特征指示至少一种细胞功能类别，该细胞功能类别选自由细胞增殖、胁迫途径、氧化胁迫、胁迫激酶激活、DNA损伤、脂类代谢、糖类调节、包括I阶段和II阶段反应在内的代谢激活、细胞色素P-450的诱导或抑制、氨去毒作用、线粒体功能、过氧化物酶体增殖、细胞器功能、细胞周期状态、形态、凋亡、DNA损伤、代谢、信号转导、细胞分化、细胞-细胞相互作用和细胞与非细胞区室的相互作用所组成的组中。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，指示所述细胞增殖的所述至少一种细胞特征选自由核计数、细胞计数、总细胞量、总DNA、细胞周期调控蛋白的磷酸化状态、以及涉及细胞生长或分裂的任意的蛋白质翻译后修饰状态所组成的组中。

10.根据权利要求8所述的方法，其中，指示所述胁迫途径激活的所述至少一种细胞特征为选自NRF2、NF-κB、P1、ATF2、MSK1、CREB和NFAT中的转录因子的转录因子激活，或者为p38、JNK、ERK、RSK90和MEK的激酶激活，或者为它们的组合。

11.根据权利要求8所述的方法，其中，指示所述细胞器功能的所述至少一种细胞特征选自由细胞骨架组建、线粒体的量、线粒体膜电位、过氧化物酶体的量、荧光的过氧化物酶体特异性底物的摄入、过氧化物酶体蛋白PMP70的增加、ALD的增加、溶酶体的量、荧光的溶酶体特异性底物的摄入、溶酶体蛋白LAMP1染色的增加、高尔基体的组建、以及原生质膜渗透性所组成的组中。

12.根据权利要求8所述的方法，其中，指示所述细胞周期状态的所述至少一种细胞特征选自由DNA含量、组蛋白H3的磷酸化状态、Rb的磷酸化状态、细胞周期蛋白B1(CDK1)的生物合成、细胞周期蛋白D1(CDK4、6)的生物合成、和细胞周期蛋白E(CDK2)的生物合成所组成的组中。

13.根据权利要求8所述的方法，其中，指示所述形态的所述至少一种细胞特征选自由运动、细胞伸展、粘着、起泡、空泡化、边缘波动和集落形成所组成的组中。

14.根据权利要求8所述的方法，其中，指示所述凋亡的所述至少一种细胞特征选自由核的大小和形状、DNA含量和降解、谷胱甘肽含量、反应性氧的检测、细胞色素C的释放、半胱天冬酶的激活、磷脂酰基的表达和Bax的易位所组成的组中。

15.根据权利要求8所述的方法，其中，指示所述代谢的所述至少一种细胞特征选自由cAMP浓度、P-糖蛋白、转运泵的活性和CYP450的诱导/抑制所组成的组中。

16.根据权利要求8所述的方法，其中，指示所述信号转导的所述至少一种细胞特征选自由Ca++离子浓度和pH所组成的组中。

17.根据权利要求8所述的方法，其中，指示所述细胞分化的所述至少一种细胞特征选自由组织特异性分化标记的表达和组织特异性分化的形态所组成的组中。

18.根据权利要求8所述的方法，其中，指示所述细胞-细胞相互作用或细胞与非细胞的相互作用的所述至少一种细胞特征选自由细胞-细胞界面的紧密连接蛋白的浓度、细胞-细胞通讯、细胞-非细胞通讯、以及从细胞向小管的细胞内空间的材料转移所组成的组中。

19.根据权利要求1所述的方法，其中，至少一种细胞特征为细胞缺失、DNA降解、细胞周期阻滞、核的大小、组蛋白H2A.X的磷酸化水平、c-jun的磷酸化水平、p53的激活、GADD153的诱导、甘油三酯累积的增加或减少、I阶段代谢、II阶段代谢、细胞色素P-450酶的活性、白蛋白的合成或白蛋白的释放。

20.根据权利要求1所述的方法，其中，所述6种或更多种细胞特征中的至少一种通过成像来检测。

21.一种构建与一种或多种参比物质接触的肝细胞的细胞系统生物学响应谱的数据库的方法，其中，该方法包括：

a)将含有代谢活性的细胞色素P450的肝细胞与第一参比物质接触；

b)以一套荧光标记试剂来标记所述肝细胞，由此产生一种或多种荧光标记的肝细胞，其中各荧光标记试剂对生物标记是特异性的，所述一套荧光标记试剂检测至少5种不同的生物标记，所述生物标记的检测提供一种或多种特征的读出，并且其中至少一种特征与选自由磷脂质化和脂肪变性所组成的组中的至少一种细胞功能类别相关；

c)使用至少一种光学模式使一种或多种荧光标记的肝细胞成像，其中所述成像产生数据组；

d)对所述的5种或更多种生物标记中的每一种生物标记的一种或多种特征的数据组进行分析，其中，所述5种或更多种生物标记的特征的组合产生所述第一参比物质对肝细胞的细胞系统生物学谱；以及

e)任选地重复步骤a-f，以第二参比物质或另外的参比物质代替所述第一参比物质，由此构建与一种或多种参比物质接触的肝细胞的细胞系统生物学响应谱的数据库。

22.根据权利要求21所述的方法，其中，该方法还包括将所述第一参比物质、第二参比物质和/或另外的参比物质的细胞系统生物学谱与所述数据库中对肝细胞具有已知的生物学系统作用的物质的细胞系统生物学谱相比较，其中，当与第一参比物质、第二参比物质和/或另外的参比物质接触的肝细胞的响应谱与所述数据库中的响应谱相同或相似时，则预测所述第一参比物质、第二参比物质和/或另外的参比物质与所述数据库中对肝细胞产生已知的生物学系统作用的物质具有相同或相似的生物学系统作用。

23.根据权利要求21所述的方法，其中，所述数据组的分析包括聚类分析。

24.根据权利要求21所述的方法，其中，所述肝细胞与一系列不同浓度的参比物质相接触，并构建各参比物质浓度的细胞系统生物学响应谱。

25.根据权利要求21所述的方法，其中，所述一种或多种荧光标记的肝细胞的成像在多于一个的时间点进行，其中所述成像产生各时间点的数据组。

26.根据权利要求22所述的方法，其中，由在各物质浓度下的特征检测结果构建谱，包括：

a)使用柯尔莫哥洛夫-斯米尔诺夫值或平均值作为在各物质浓度的各特征检测结果的细胞群转移的检测值，来计算参数，以产生浓度系列的参数；

b)使用4-参数对数拟合，对所述浓度系列的参数进行拟合，从而产生拟合的数据；

c)分析所述拟合的数据，以计算EC50值；

d)将所述EC50值转换为log值，作为化合物活性的检测值；以及

e)使用聚类分析，以鉴定谱之间的相似性以及细胞系统响应之间的相关性。

27.一种试剂盒，该试剂盒包括用于检测至少两个细胞功能类别中的6种或更多种细胞特征的一种或多种试剂，其中，至少一种细胞功能类别为磷脂质化或脂肪变性，并且所述试剂盒还包括使用所述试剂来预测测试物质对肝细胞的生物学系统作用的说明书。

28.根据权利要求27所述的试剂盒，该试剂盒还包括一套荧光标记试剂，其中，各荧光标记试剂对生物标记是特异性的，所述一套荧光标记试剂检测至少5种不同的生物标记，并且所述生物标记的检测为读取一种或多种特征。

29.根据权利要求27所述的试剂盒，其中，该试剂盒还包括肝细胞响应谱的数据库。

30.根据权利要求27所述的试剂盒，其中，至少一种细胞特征指示至少一种细胞功能类别，该细胞功能类别选自由细胞增殖、胁迫途径、氧化胁迫、胁迫激酶激活、DNA损伤、脂类代谢、糖类调节、包括I阶段和II阶段反应在内的代谢激活、细胞色素P-450的诱导或抑制、氨去毒作用、线粒体功能、过氧化物酶体增殖、细胞器功能、细胞周期状态、形态、凋亡、DNA损伤、代谢、信号转导、细胞分化、细胞-细胞相互作用和细胞与非细胞区室的相互作用所组成的组中。

31.根据权利要求30所述的试剂盒，其中，指示所述细胞增殖的所述至少一种细胞特征选自由核计数、细胞计数、总细胞量、总DNA、细胞周期调控蛋白的磷酸化状态、以及涉及细胞生长或分裂的任意蛋白质的翻译后修饰状态所组成的组中。

32.根据权利要求30所述的试剂盒，其中，指示所述胁迫途径激活的所述至少一种细胞特征为选自NRF2、NF-κB、P1、ATF2、MSK1、CREB和NFAT中的转录因子的转录因子激活，或者为p38、JNK、ERK、RSK90和MEK的激酶激活，或者为它们的组合。

33.根据权利要求30所述的试剂盒，其中，指示所述细胞器功能的所述至少一种细胞特征选自由细胞骨架组建、线粒体的量、线粒体膜电位、过氧化物酶体的量、荧光的过氧化物酶体特异性底物的摄入、过氧化物酶体蛋白PMP70的增加、ALD的增加、溶酶体的量、荧光的溶酶体特异性底物的摄入、溶酶体蛋白LAMP1染色的增加、高尔基体的组建、以及原生质膜渗透性所组成的组中。

34.根据权利要求30所述的试剂盒，其中，指示所述细胞周期状态的所述至少一种细胞特征选自由DNA含量、组蛋白H3的磷酸化状态、Rb的磷酸化状态、细胞周期蛋白B1(CDK1)的生物合成、细胞周期蛋白D1(CDK4、6)的生物合成、和细胞周期蛋白E(CDK2)的生物合成所组成的组中。

35.根据权利要求30所述的试剂盒，其中，指示所述形态的所述至少一种细胞特征选自由运动、细胞伸展、粘着、起泡、空泡化、边缘波动和集落形成所组成的组中。

36.根据权利要求30所述的试剂盒，其中，指示所述凋亡的至少一种细胞特征选自由核的大小和形状、DNA含量和降解、谷胱甘肽含量、反应性氧的检测、细胞色素C的释放、半胱天冬酶的激活、磷脂酰基的表达和Bax的易位所组成的组中。

37.根据权利要求30所述的试剂盒，其中，指示所述代谢的所述至少一种细胞特征选自由cAMP浓度、P-糖蛋白、转运泵的活性和CYP450的诱导/抑制所组成的组中。

38.根据权利要求30所述的试剂盒，其中，指示所述信号转导的所述至少一种细胞特征选自由Ca++离子浓度和pH所组成的组中。

39.根据权利要求30所述的试剂盒，其中，指示所述细胞分化的所述至少一种细胞特征选自由组织特异性分化标记的表达和组织特异性分化的形态所组成的组中。

40.根据权利要求30所述的试剂盒，其中，指示所述细胞-细胞相互作用或细胞与非细胞的相互作用的至少一种细胞特征选自由细胞-细胞界面的紧密连接蛋白的浓度、细胞-细胞通讯、细胞-非细胞通讯、以及从细胞向小管的细胞内空间的材料转移所组成的组中。

41.根据权利要求30所述的试剂盒，其中，至少一种细胞特征为细胞缺失、DNA降解、细胞周期阻滞、核的大小、组蛋白H2A.X的磷酸化水平、c-jun的磷酸化水平、p53的激活、GADD153的诱导、甘油三酯累积的增加或减少、I阶段代谢、II阶段代谢、细胞色素P450酶的活性、白蛋白的合成或白蛋白的释放。

42.一种试剂盒，该试剂盒包括一套荧光标记试剂和使用说明书，其中，各荧光标记试剂对生物标记是特异性的，其中所述一套荧光标记试剂检测至少5种不同的生物标记，并且所述生物标记的检测提供一种或多种特征的读取，其中至少一种特征指示选自由磷脂质化和脂肪变性所组成的组中的至少一种细胞功能类别。

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