CN102483407A - 预测化学物质毒性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及预测化学物质对发育途径的影响的方法和试剂盒。具体地讲，本发明涉及预测化学物质对人发育途径的毒性的方法和试剂盒。本发明的方法和试剂盒可用于预测人胎儿发育期间细胞生物图或发育途径的变化。

Description

预测化学物质毒性的方法

发明领域

本发明涉及细胞生物学、毒理学和药物筛选领域。具体地讲，本发明涉及预测化学物质(chemical)对发育途径的毒性的方法。

发明背景

本发明描述设计用于在化学伤害后提供人细胞/组织或胎儿发育信息的方法。它利用人干细胞系响应已知刺激的体外分化，作为模拟体内细胞/组织发育的手段。其它实施方案包括i)使用宽范围细胞/组织标记，ii)使用早期和晚期细胞/组织标记。这些可组合指示哪个发育途径被干扰和处于什么阶段。

在祖细胞分化期间，使细胞暴露于化学、药物、化妆品或致畸原，并通过监测分化程度评价对发育过程的影响。实际上，Suter(CurrentOpinion in Chemical Biology(化学生物学的当前意见)，2006，10，362-366)描述药物安全评价的标准(非干细胞)体外试验的预测值和限制。很多目前试验有显著缺陷，因为缺乏现有方法的特异性。实际上，很多现有方法耗时、没有丰富信息、昂贵且通常需要使用大量实验动物。因此，得到大量数据/信息的人发育毒性方法的使用是传统方法的有吸引力的替代，这潜在减少试验动物数和费用，而不损害消费者和患者的安全性。

最近的公开文献已强调化学物质对发育中的胎儿的影响。据估计，全部活婴的～5％有发育和行为缺陷，很多可归因于化学伤害。另外，欧盟已制定(2007)一项新的化学法规，称为REACH(化学物质注册、评估和授权)，这项法规有希望成为已建立的最复杂和全面的监管努力。在此法规内，对生殖和发育毒理学的要求很重要，因为它们导致对资助和试验动物需求的最高要求。另外，生殖和发育考虑因素可导致现在普遍使用的很多物质的限制。虽然REACH对试验动物研究有严格要求，但法规不赞成在试验中使用脊椎动物，需要实验室考虑替代方法。很多已建立的替代动物方法经常出现问题，因此，非常需要能够精确预测化学伤害对人胎儿和/或生殖发育的后果的更好和改善的实验方法。因此，需要引入和验证评价化学物质对人发育的潜在毒性影响的新的基于细胞的方法。

干细胞

在人发育期间，对毒性损伤最敏感的组织包括神经系统、肝、肾、肺、皮肤等，因此，用祖细胞系与细胞/组织特异标记组合的试验将不仅帮助确定是否特定化学物质为毒性，而且确定是否细胞/组织受影响。另外，在本专利说明书中描述的方法有另外的许可(enabling)特征，即它具有在早期和晚期细胞分化标记(例如，Nkx2.5和αMHC各自为早期和晚期心脏标记)之间区分的能力。

例如，胚胎干(ES)细胞可分化成神经元细胞。在分化时，胚胎干细胞标记的表达水平和经分化细胞标记的表达水平可以量化。在此，胚胎干细胞分化用作反映胎儿/细胞发育的手段(参见，例如图1)。

在化学损伤时，识别其中已干扰表达水平的标记可帮助识别哪种细胞发育途径受影响。另外，早期和晚期细胞标记两者的定量允许更深入地探询任何特定细胞类型(例如，各自利用早期和晚期标记olig2和MOG的少突神经胶质细胞)的发育。因此，所有具体细胞标记的定量帮助探询整个细胞发育/分化途径。因此，本文所述发明可用于构建例如用于胎儿发育的毒性分布或毒性生物图。

干细胞为在大多数(若非全部)多细胞生物体中发现的细胞。它们的特征在于通过有丝细胞分裂和分化成不同范围的专化细胞类型而自身更新的能力。两个宽类型哺乳动物干细胞为：从胚泡的内细胞团分离的胚胎干细胞，和在成体组织中发现的成体干细胞。在发育中的胚胎中，干细胞可分化成所有专化胚胎组织。在成年生物体中，干细胞和祖细胞充当身体的修复系统，补充专化细胞，而且保持再生器官(如血、皮肤或肠组织)的正常更替。现在，可使干细胞生长并转变成具有与不同组织细胞一致特征的专化细胞，如通过细胞培养转变成肌肉或神经。成体干细胞可分化成发育不相关的细胞类型，如神经细胞成为血细胞。内在和外在信号均控制干细胞命运，这些信号中的一些已经识别(Watt&Hogan，Science 2000，287，1427-1430)。

来自多种来源(包括脐带血和骨髓)的成体干细胞常规用于医学治疗。胚胎干细胞(ES细胞)为从早期阶段胚胎(称为胚泡)的内细胞团得到的干细胞。人胚胎在受精后4-5天达到胚泡阶段，此时它们由50-150个细胞组成。胚胎干(ES)细胞是多能的。这意味着它们能够分化成三个初级胚层(外胚层、内胚层和中胚层)的所有衍生物。这些包括成年体中各自多于220个细胞类型。多能性使ES细胞区分于在成体中发现的多能祖细胞，这些只形成有限的一些细胞类型。在不对分化给予刺激时(即，在体外生长时)，ES细胞在整个多细胞分裂中保持多能性。多能成体干细胞的存在仍然是科学争论的主题，然而，研究证明，可直接从成体成纤维细胞培养物产生多能干细胞。由于它们对自我更新的可塑性和潜在无限能力，已提出将ES细胞疗法用于再生医学和损伤或疾病后的组织更新。然而，至今未从胚胎干细胞研究得到经认可的医学治疗。因此，成体干细胞和脐带血干细胞远不是成功治疗任何疾病使用的唯一干细胞。

由这些非胚胎干细胞治疗的疾病包括一些血液和免疫系统相关的遗传疾病、癌症和病症；青少年糖尿病；帕金森病；失明和脊髓损伤。涉及干细胞治疗的一个技术问题是与异基因干细胞移植相关的移植物抗宿主疾病问题。然而，可用自身供体成体干细胞或通过治疗性克隆解决与组织相容性相关的问题。干细胞的实际定义为功能定义-有潜力终生使组织再生的细胞。例如，对骨髓或造血干细胞(HSC)的黄金标准试验是移植一个细胞并解救没有HSC的个体的能力。在此情况下，干细胞必须能够长期产生新的血细胞和免疫细胞，而证明其效力。也应能够使干细胞从移植的个体分离，这些细胞可自身移植到没有HSC的另一个个体，而证明干细胞能够自我更新。干细胞的性质可用诸如产克隆(clonogenic)试验的方法体外说明，其中单细胞特征为分化和自我更新的能力。另外，可根据不同的细胞表面标记组分离干细胞。

现有技术

有涉及干细胞的很多公开专利和专利申请，在允许时，以下所列专利的内容也在此全文通过引用结合到本申请中。

US5843780和US6200806(Wisconsin Alumni Research Foundation)描述分离灵长类胚胎干细胞的方法。

WO2007/120699(Wisconsin Alumni Res Foundation)描述能够预测发育毒性的低分子量细胞代谢物(10-1500道尔顿)的生物标记分布，和用人胚胎干细胞筛选化合物的方法，所述化合物包括药剂、先导和候选药物化合物和其它化学物质。

Stumman等(2009)Toxicology 257(3)117-126描述利用胚胎干细胞的甲基汞对神经元细胞的胚胎毒性危害评估。该文章描述胚胎干细胞试验作为发育毒性化合物的工具，尤其是针对改善甲基汞胚胎毒性的体外预测。Stummann等描述基于三个终点的预测模型，即，细胞毒性试验、RT-PCR和免疫组织化学。

WO2007/063316(Plasticell)公开识别细胞信号传导途径的潜在调节剂的方法，所述方法包含以下步骤：(a)提供第一细胞类型的细胞，其中通过使第一细胞类型依次暴露于两个或更多个反应条件，可使第一细胞类型经祖细胞分化成第二细胞类型；(b)利用暴露于包含潜在调节剂的一个或多个不同反应条件，加入或代替祖细胞已暴露的两个或更多个反应条件的至少一个条件；并且(c)监测第一细胞类型的分化，以测定第二细胞类型的形成。

Buesen等(2009，Toxicological Sciences，108，(2)389-400)描述从单一样品只测量一种生物标记(细胞毒性)。

WO 2004/013316(University of Durham)公开制备从细胞群体分离的个体哺乳动物多能干细胞得到的克隆多能干细胞的一种或多种组合物的方法，包含异质细胞群体至标记量，其识别和结合表达哺乳动物多能干细胞的标志的个体细胞，其中标记包含检索手段。

WO2007/002568(Geron Corporation)描述快速测定对体外培养的细胞群体中靶组织类型的药理作用的系统。细胞含有反映由正被筛选的作用剂(agent)导致的毒理或代谢变化的启动基因-报道基因结构。

US7041438(Geron Corporation)公开在没有饲养细胞存在下培养灵长类多能干细胞的改进系统。

US2006/0275816(Henderson&Cheatham)描述能够用生物标记识别药理学和毒理学机制的微阵列和基于细胞的筛选策略。

US2004/0254736(Michelson&Bangs)公开用计算机建模和生物方法识别生物系统中潜在毒性的方法和装置。

US2002/0192671(Castle&Elashoff)描述一种评价物质毒性的方法，所述方法包含：使至少两种基因暴露于物质；用对比分析来分析各基团对物质响应的差异；建立基因组中各基因的概括分数；对概括分数进行逻辑回归分析；并用逻辑回归分析结果提供关于物质毒性的预测模型。

US7354730(HemoGenix，Inc)公开造血干细胞和祖细胞增殖的高通量试验。

US7202081(Hoffmann La Roche)描述用增殖中的哺乳动物细胞样品作为试验系统同时测定物质的细胞增殖抑制活性和细胞毒性(诱导细胞死亡)的方法。

US6998249(Pharmacia&Upjohn)公开预测指定化合物的体内毒性的方法。该方法包括平行进行至少三个不同试验，以提供关于指定靶细胞中化学物质的细胞毒性的三个不同参数的信息，该信息可用于预测体内细胞毒性。该方法未描述涉及干细胞或多重化(multiplexing)的技术。

US6007993A(Insitut fur Pflanzengenetik undKulturpflanzenforschung)描述一种体外试验程序，用于检测对胚胎发育的化学诱导作用和用于分化，其目的在于使用从原始生殖细胞得到的胚胎干(EG)细胞，基于来自小鼠和大鼠的分化的多能胚胎干(ES)细胞的胚胎毒性/致畸性筛选。所提出的试验程序的特征在于，选择含有组织特异性启动基因和报道基因的稳定的转基因ES或EG细胞克隆，在特定时间起作用的胚胎毒性物质存在下ES细胞分化成不同的萌发途径衍生物后进行组织特异性基因的分化依赖性表达；随后检测调节胚胎发育的组织特异性基因的化学诱导激活、阻抑或调节。

US2008/0280300(Plasticell)公开识别细胞信号传导途径的潜在调节剂的方法，所述方法包含以下步骤：(a)提供第一细胞类型的细胞，其中通过使第一细胞类型依次暴露于两个或更多个反应条件，可使第一细胞类型经祖细胞分化成第二细胞类型；(b)利用暴露于包含潜在调节剂的一个或多个不同反应条件，加入或代替祖细胞已暴露的两个或更多个反应条件的至少一个条件；并且(c)监测第一细胞类型的分化，以测定第二细胞类型的形成。

US2008/0248503描述筛选化合物以预测毒性和淋巴-造血系统的残余增殖及分化能力的方法。

US2008/0132424公开利用增殖所用的ATP测量的基于人胚泡衍生干细胞和祖细胞的毒性试验。

US2007/0248947(Wisconsin Alumni Research Foundation)描述低分子量细胞代谢物的生物标记分布，和用人胚胎干细胞或由其产生的谱系特异性细胞筛选化合物的方法，所述化合物包括药剂、先导和候选药物化合物和其它化学物质。所述方法用于试验毒性，特别是发育毒性，并检测这些化合物的致畸作用。US2007/0248947未描述本文所述的多重方法或细胞生物标记。

US 7541185(Cythera，Inc.)公开用于识别一种或多种分化因子的方法，所述分化因子可用于使内胚层细胞群体中的细胞分化成能够形成由肠管得到的组织和/或器官的细胞。US 7510876(Cythera，Inc)描述制备人内胚层细胞的体外方法。

Cezar(Int.J.Pharm.Med，2006，20，107-114)回顾在产生疾病和毒性反应的体外模型中干细胞技术的关键机遇。

O’Brien&Haskins(Methods in Molecular Biology(分子生物学中的方法)，2007，356，415-425)描述用于评价化合物导致人毒性的可能性的多参数、活细胞、致死前细胞毒性高含量筛选试验。

Bremer&Hartung(Current Pharmaceutical Design(当前药物设计)，2004，10，2733-2747)回顾在国际失明合作研究中与体内结果比较的胚胎干细胞试验的验证。

Stumman等(Toxicology 2007 242，130-43)描述利用胚胎干细胞的甲基汞和铬的胚胎毒性危害评估。该文章描述胚胎干细胞试验作为发育毒性化合物的工具，尤其是针对改善甲基汞胚胎毒性的体外预测。Stummann等描述基于三个终点的预测模型，即，除了胚胎干细胞心脏分化试验外，还描述利用小鼠胚胎干细胞和3T3成纤维细胞的细胞毒性试验。然而，该文章未描述毒素或致畸原对早期或晚期分化生物标记对于特定细胞发育途径的作用作为反映胎儿或细胞发育的手段。

Clarke等(Regen.Med.2007，2，947-956)公开用来自不同造血组织的初级细胞提供高内容信息。

Paquette等(Reprod.Toxicol.2008，83，104-111)描述胚胎干细胞试验作为制药工业中发育毒性化合物的工具的应用和用途。

Li等(Biol.Chem.2008，389，169-177)描述抑制成体干细胞系的生脂分化的毒剂(二氧芑)的作用。

Miranda等(Methods Mol.Biol.2008447，151-156)描述用啮齿动物胎脑皮层衍生的神经干细胞作为试验模型，并测定预先乙醇暴露对随后神经元成熟的作用。

Adler等(Altern Lab Anim.2008 36，129-40)公开基于人细胞类型的细胞生存能力试验，代表发育成熟的不同程度，即，包皮成纤维细胞、人胚胎干细胞衍生的祖细胞和人胚胎干细胞。

Adler等(Toxicology in vitro，2008 22，200-211)描述基于人胚胎干细胞和一些标记基因的发育毒性试验方法。

Ahuja等(Toxicology，2007 231，1-10)描述用化学或物理剂治疗特异细胞类型，测量其响应提供试验成体生物体不同器官系统中毒性的捷径。

技术问题

如上讨论，需要可用于预测化学物质对人发育的毒性，而不回到漫长和昂贵的动物试验，并且比依赖模型动物系统更近地反映人发育的新试验。具体地讲，对于预测哪种发育途径和哪种组织受化学物质影响的试验存在未满足的需求。

发明概述

本发明的第一方面提供一种预测化学物质对样品中发育途径的毒性的方法，所述方法包含以下步骤：

(i)用一种作用剂处理样品中的未分化干细胞的对照群体，以在第一发育途径中产生分化细胞的第一对照群体；

(ii)测量在所述未分化干细胞的对照群体和/或所述分化细胞的第一对照群体中表达的至少两种生物标记的水平，以测定表达的对照水平，其中至少一种所述生物标记在发育途径和/或分化的早期阶段表达，并且至少一种生物标记在发育途径和/或分化的晚期阶段表达；

(iii)在用所述作用剂处理之前或之后，使所述样品中的未分化干细胞的试验群体暴露于化学物质，以在第一发育途径中产生分化细胞的第一试验群体；

(iv)测量所述未分化干细胞的试验群体和/或所述分化细胞的第一试验群体中的所述至少两种生物标记的水平，以测定表达的试验水平；

(v)将所述表达的对照水平与所述表达的试验水平比较，

其中在暴露于所述化学物质后表达水平的差异指示化学物质对所述发育途径的毒性。

本领域的技术人员应了解，为避免疑虑，用于本发明的未分化干细胞不包括全能干细胞。

在优选的方面，方法的步骤(i)包含用一种作用剂处理未分化干细胞的群体的步骤，以在第n发育途径中产生分化细胞的第n群体；并且重复步骤(ii)至(v)，以测定所述第n群体中表达的对照水平与表达的试验水平的差异，其中在暴露于化学物质后表达水平的差异指示化学物质对所述第n发育途径的毒性。

一方面，第一和第n发育途径为网络化发育途径。

一方面，方法的步骤(i)包含用一种作用剂处理未分化干细胞的群体的步骤，以在多个发育途径中产生分化细胞的多个群体；然后，方法包含重复步骤(ii)至(v)，以测定所述多个群体中表达的对照水平与表达的试验水平的差异，其中在暴露于化学物质后表达水平的差异指示化学物质对所述多个发育途径的毒性。

多个发育途径适合为网络化发育途径。

一方面，干细胞为多能干细胞。多能干细胞可以为胚胎干细胞、诱导多能干细胞或原始生殖细胞。

另一方面，干细胞为成体干细胞。

优选干细胞为人干细胞。

一方面，至少一种生物标记为胚胎干细胞生物标记。

另一方面，至少一种生物标记为原始生殖细胞生物标记。

另一方面，至少一种生物标记为成体干细胞生物标记。

胚胎干细胞生物标记适合选自Nanog、SOX2、SSEA4、Oct4、TRA-1-60、TRA-1-81、Cripto、CD133、A2B5、PAX6、Integran β1、CEA、Tnk1、ERAS和STELLAR。

原始生殖细胞生物标记适合选自DDX4、Fragillis、Stella和NANOS2。

一方面，至少一种生物标记为中胚层生物标记。优选中胚层生物标记选自Brachyury、Tbx6、TBR2、EOMES、PHOX2A、PHOX2B、PRRX1、PRRX2、MESDC2、Mesp1、Mesp2、MIER1、MIER3和SNAIL。

另一方面，至少一种生物标记为外胚层生物标记。优选外胚层生物标记选自EED、TIF1γ、KLH25、EDA、GJB6、ENC1、EDAR、SOSTDC1、NCAM和CD99。

另一方面，至少一种生物标记为内胚层生物标记。优选内胚层生物标记选自Ki67、Rb、Cullin1、Cullin 2、Cullin 3、Cyclin E和CyclinE2。

一方面，至少一种生物标记为心脏干细胞生物标记。优选心脏干细胞生物标记选自透明质烷合酶1、OSR1和Sca1。

另一方面，至少一种生物标记为心肌细胞前体细胞生物标记。优选心肌细胞前体细胞选自ALPK3、Periostin和Mesp 1。

一方面，早期生物标记为在发育途径和/或分化的早期阶段期间表达的心肌细胞生物标记。优选早期心肌细胞生物标记选自Nkx2.5、心肌素、GATA4、MEF2C、HAND1、IRX4、TBX5、TBX20和转录因子25。

另一方面，晚期生物标记为在发育途径和/或分化的晚期阶段期间表达的心肌细胞生物标记。优选晚期心肌细胞生物标记选自心肌钙蛋白T抗体、心肌钙蛋白I抗体、重链心肌球蛋白抗体、肌球蛋白轻链抗体、心FABP抗体和α肌节肌动蛋白抗体。

另一方面，晚期生物标记为心室生物标记。优选心室生物标记选自BMP10、HAND2和血清应答因子。

一方面，早期生物标记为在发育途径和/或分化的早期阶段期间表达的神经干细胞生物标记。优选早期神经干细胞生物标记选自聚集蛋白聚糖ARGxxx、CD133、EMX2、巢蛋白(Nestin)和NeuroD1。

另一方面，晚期生物标记为在发育途径和/或分化的晚期阶段期间表达的神经干细胞生物标记。优选晚期神经干细胞生物标记选自BRN3A、BRN3B、Musashi 1、Msi1、NR2E1、Tailless、核干细胞因子、Oct6、Pax2、SOX2、SOX4、SOX10、SOX11、SOX22、波形蛋白和CDw33。

另一方面，至少一种生物标记为神经嵴细胞生物标记。优选神经嵴细胞生物标记选自神经发生素(Neurogenin)1、神经发生素2、神经发生素3和MASH1。

一方面，至少一种生物标记为星形胶质细胞生物标记。

另一方面，至少一种生物标记为神经胶质细胞或小神经胶质细胞生物标记。

另一方面，至少一种生物标记为浦肯野(purkinja)细胞生物标记。

一方面，至少一种生物标记为神经元或神经细胞生物标记。优选神经细胞生物标记选自海马神经元、端脑神经元、多巴胺能神经元、胆碱能神经元、感觉神经元、伤害性神经元、运动神经元、锥体神经元、少突神经胶质细胞、神经内分泌、轴突、施万(Schwann)细胞、树突、生长锥、体细胞和突触细胞。

另一方面，至少一种生物标记为脂肪细胞生物标记。

一方面，通过与标记的抗体反应，并测量结合的标记，将两种或更多种生物标记的水平定量。两种或更多种生物标记的水平优选用定量免疫细胞化学定量。

另一方面，未分化干细胞包含可操作连接到至少两种或更多种生物标记的不同报道基因，两种或更多种生物标记的水平通过测量不同基因产物定量。优选报道基因选自硝基还原酶、β-半乳糖苷酶、β-内酰胺酶、荧光素酶和荧光蛋白报道基因。

另一方面，通过选自定量RT-PCR、定量免疫细胞化学、表面等离子共振和微阵列分析的方法将两种或更多种生物标记的水平定量。

一方面，所述方法另外包含在步骤(iii)后测定细胞增殖。

在一个优选的方面，方法为多重方法。

本发明的第二方面提供一种用上述方法预测人胎儿发育期间细胞生物图或发育途径变化的方法。

本发明第三方面提供一种进行上述方法的试剂盒，所述试剂盒包含用于将至少两种生物标记定量的装置和用于进行方法的说明书。在优选的方面，用于将生物标记定量的装置选自抗体、酶底物和寡核苷酸引物。

定义

本文所用“干细胞”定义为特征在于分化成不同范围专化细胞类型的能力的细胞。两个宽类型哺乳动物干细胞为：从胚泡的内细胞团分离的胚胎干细胞，和在成体组织中发现的成体干细胞。在发育中的胚胎中，干细胞可分化成所有专化胚胎组织。在成年生物体中，干细胞和祖细胞充当身体的修复系统，补充专化细胞，而且保持再生器官(如血、皮肤或肠组织)的正常更替。

本文所用“胚泡”定义为在形成囊胚腔后但在植入前在早期胚胎发生中形成的结构。

本文所用“祖细胞”定义为具有分化成特定细胞类型的能力的细胞。大多数祖细胞描述为单能或多能。

本文所用“发育途径”定义为用于细胞分化的途径(或细胞分化途径)，且为祖细胞藉以变成更专用细胞类型的过程。在生物体从单一受精卵变为复杂的组织系统和细胞类型时，在多细胞生物体发育期间发生很多次分化。分化也是成体中的一般过程：在组织修复期间和在正常细胞更替期间成体干细胞分化并产生完全分化的子细胞。

在本文所用“发育途径”环境中的“网络化”定义为包含能够分化成两种或更多种不同细胞类型的祖细胞的网络，并且这些细胞类型自身可具有进一步分化的能力。该过程继续直到产生最终分化细胞类型。

本文所用“发育生物学”定义为生物体藉以生长和发育的过程的研究。发育生物学家研究细胞生长、分化和形态发生的基因控制，产生组织、器官和机体结构的过程。

本文所用“形态发生”定义为引起生物体发育其形状的生物过程。它随同细胞生长、细胞分化和细胞发育控制是发育生物学的三个基本方面之一。形态发生过程控制生物体的胚胎发育和胎儿发育期间细胞的组织化空间分布。通过激素，通过由其它生物体产生的物质到毒性化学物质或放射性核素、污染物和其它毒剂范围的环境化学物质，或者通过细胞空间图形化诱导的机械应力，可在生物体中诱导形态发生响应。形态发生可在胚胎、成熟生物体、细胞培养物中或肿瘤细胞团内进行。

本文所用“多能性”定义为具有分化成任何以下三种胚层的潜能的干细胞：内胚层(例如，产生胃内粘膜、胃肠道、肺、肝、胸腺、甲状旁腺和甲状腺)、中胚层(例如，产生肌肉、骨、血液、泌尿生殖细胞)或外胚层(例如，产生表皮组织和神经系统)。

本文所用“诱导多能干细胞”定义为通过诱导某些基因的遍布(ubiquitous)表达从非多能细胞(一般为成体体细胞)人工诱导的多能干细胞类型。

本文所用“生物标记”定义为用作生物学状态标记的细胞分子，如蛋白，但与低分子量代谢物不同。它是客观测量并评价为正常生物过程、致病过程或对治疗干预或毒剂的药理学反应的标记的特征或分子。在细胞生物学中，生物标记为由特定细胞类型表达的分子(例如，用蛋白Oct-4作为识别胚胎干细胞的生物标记)。生物标记可通过技术人员公知的多种技术测量，如微阵列分析、报道基因试验、定量RT-PCR或使用定量免疫细胞化学。

本文所用“早期”或“晚期”生物标记定义为分别在细胞培养或生长的早期或晚期阶段期间表达的细胞生物标记。在培养或生长的这些不同阶段，这些生物标记可上调或下调。

本文所用“多重试验”或“多重化”定义为测量来自单一样品的多重分析物、分子或生物标记的实验室程序类型。因此，该技术允许多重探询活细胞，从而允许产生高含量信息。多重试验不同于测量单一分析物或单一生物标记的程序。

本文所用“第n”表示2至1000的正整数(例如，第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十...第一千)。

本文所用“作用剂(agent)”为诱导未分化干细胞分化的物理刺激(例如，光、热、辐射)或化学处理。化学处理可包含化学物质(例如激素、生长因子等)的混合物。该作用剂一般不同于作为潜在毒物评价的“化学物质”，在该作用剂和化学物质为一种并且相同时，它们在本发明的方法中以不同浓度使用。

附图简述

图1为显示干细胞分化成发育途径网络的示意性表示(生物标记在括号内指示)。

图2为本发明方法的一个实施方案的示意性说明，其中评价了化学物质(20)对用刺激物或作用剂(30)处理后对未分化干细胞(10)分化成分化细胞(40)的作用。

发明详述

干细胞和胚胎生殖细胞标记

干细胞为具有i)不明确体外分化和ii)分化成不同成熟细胞类型的能力的特征的未分化细胞。可将它们归类为可产生所有三种胚胎生殖细胞层(即，外胚层、中胚层和内胚层)细胞类型的多能干细胞。这些包括胚胎原始生殖细胞(从生殖腺嵴得到)和重编程诱导多能干细胞。成体干细胞为多能，并沿着特定发育途径分化。

多个新兴技术有希望提供识别干细胞分化不同阶段的标记的手段。包括干细胞的各细胞类型具有独特信号传导网络，该网络由引起细胞特异性基因表达的细胞特异性转录调整体系保持。因此，身体中的274种不同的细胞类型由人体中存在的～25,000种基因的组合表达限定(Ahn，S.M.等，2008 Proteomics 8，4946-4957)。

胚胎干细胞分化的初始阶段包括产生三种胚胎生殖细胞层(即，外胚层、中胚层和内胚层细胞)，所有最终分化细胞衍生自这三种细胞类型。图1显示干细胞分化成发育途径网络。生物标记在图中的括号中指示，因此，Oct4为用于胚胎干细胞的生物标记，而Naggin为用于神经干细胞的生物标记。也说明了早期和晚期生物标记，因此DSS3为在神经元发育的早期阶段表达的生物标记，而NeuN在神经元发育的晚期阶段表达。

为了评价干细胞群体展示的分化的初始程度，可使用以下胚层生物标记。

在分化的晚期阶段期间，使用更多细胞/组织特异性标记。

胚胎干细胞标记

[1]Nanog(抗体ab21603)-对早期胚和多能干细胞(包括小鼠和人胚胎干(ES)细胞和胚胎生殖(EG)细胞特异。

[2]SOX2(抗体ab12830)-胚胎干细胞标记

[3]SSEA4(抗体ab16287)-阶段-特异性胚胎抗原4早期在胚胎发育和在多能干细胞中表达。

[4]Oct4(抗体ab27985)-由未分化胚胎干细胞和胚胎生殖细胞表达的转录因子。

[5]TRA-1-60(抗体ab16288)-与在人丁癌(tetracarcinoma)和胚胎基因和干细胞的表面表达的抗原反应。

[6]TRA-1-81(抗体ab16289)-人胚胎干细胞、生殖细胞和癌细胞的标记。

[7]Cripto(抗体ab19917)-在ES细胞中和在胚胎发育早期阶段期间两者中表达。

[8]CD133(抗体ab19898)-用于干细胞和祖细胞(包括神经和胚胎干细胞)的标记。

[9]A2B5(抗体ab53521)-A2B5为在发育中的上皮细胞、少突神经胶质细胞祖细胞和神经内分泌细胞中表达的细胞表面神经节苷脂表位。

[10]PAX6(抗体ab5790)-转录因子，在眼、鼻、中枢神经系统和胰腺的发育中重要。

[11]Integran β1(抗体ab5185)-干细胞标记

[12]CEA癌胚胎抗原(抗体ab46538)-在胎肠发育期间表达

[13]Tnk1(抗体ab70402)-胚胎干细胞的激酶。

[14]ERAS(抗体ab67696)-在胚胎干(ES)细胞中表达，并促进其体外增殖和致瘤性。

[15]STELLAR(抗体ab78559)-生殖细胞和胚胎干细胞富集的蛋白。

原始生殖细胞标记

[1]DDX4(抗体ab13840)-在卵巢和睾丸中表达的原始生殖细胞标记。

[2]Fragillis(抗体ab15592)-在生殖系细胞命运中涉及。

[3]Stella(抗体ab19878)-原始生殖细胞标记，在原始生殖细胞、卵母细胞、植入前胚胎和多能细胞中特异表达。

[4]NANOS2(抗体ab15731)-在无脊椎动物和脊椎动物两者的生殖细胞发育中涉及的原始生殖细胞标记。

中胚层标记

[1]Brachyury(抗体ab20680)中胚层标记-中胚层形成的最早指示物。用作中胚层分化的标记。

[2]Tbx6(抗体ab30946)-在原条和体节前期中胚层中表达。

[3]TBR2/Eomes(抗体ab23345)-T box brain 2为由发育期间的中间祖细胞表达的转录因子。

[4]PHOX2A和2B(分别为抗体ab54847和ab12047)-同源框样转录因子，在数种主要神经元群体的发育中涉及。

[5]PRRX1和2(抗体ab67631和ab77655)-同源框蛋白配对族的成员

[6]MESDC2(抗体ab68809)-对小鼠胚胎极性的规格是必要的。

[7]Mesp1和2(各自为抗体ab77013和ab23733)-中胚层1/2为在前部体节前期中胚层的分节/图案化中具有作用的转录因子。

[8]MIER1和3(各自为抗体ab26254和ab69877)-中胚层诱导早期应答基因族的成员。

[9]SNAIL(抗体ab17732)-对中胚层形成必不可少的转录因子

外胚层标记

EED(抗体ab4469)-涉及保持基因的转录阻抑态的多梳蛋白组族。在ES细胞分化期间表达。

TIF1γ(抗体ab333475)-在细胞分化和发育中起作用，在造血细胞分化中起作用。

KLH25(抗体ab55953)-外胚层神经皮质蛋白。

EDA(ab54386)-属于肿瘤坏死因子族，涉及外胚层器官发育期间的细胞-细胞信号传导。

GJB6(抗体ab59927)-外胚层发育不良(其构成影响外胚层起源的组织的一组发育病症)的缺陷原因。

ENC1(抗体ab56348)-外胚层神经皮质蛋白1

EDAR(抗体ab56803)-外胚层发育异常蛋白A受体

SOSTDC1(抗体ab56079)-涉及子宫内膜对于蜕膜细胞反应的植入/敏化的感受性的开始。

NCAM(抗体ab6123)-在神经外胚层衍生细胞系、组织和瘤(如成视网膜细胞瘤、成神经管细胞瘤、星细胞瘤和成神经细胞瘤)中表达。

CD99(抗体ab8855)-CD99的表达是来自原始外周神经外胚层肿瘤的细胞的特征。

内胚层标记

[1]Ki67(抗体ab833)-Ki67抗原为原型细胞周期相关的核蛋白，由活性细胞周期所有阶段中的增殖细胞表达。

[2]Rb(抗体2G5，ab1116)-肿瘤阻抑基因，作为细胞周期的负调节剂。

[3]Cullin 1、2和3(各自为抗体ab1868、ab1870和ab1871)-中胚层标记。

[4]Cyclin E和E2(各自为抗体ab1108和ab1110)Cyclin E为Cdk2的调节子单元，并在哺乳动物细胞周期期间控制G1/S转变。

心肌细胞分化

i)完成分化，ii)抑制剂细节，和iii)心肌细胞标记的方案。

可用良好表征和公开的方案使祖细胞分化成心肌细胞，如McBurney，M.W.等，(1982)，Nature 299，165-167，Smith，S.C等，(1987)，J.Cell Physiol.131，74-84和Puceat，M.2008，Methods，45，168-171所述。使用这些方案，可从多能(pluri-potent)和多能(multi-potent)祖细胞(如胚胎癌和干细胞)产生心肌细胞。

心肌细胞分化-小鼠P19衍生心肌细胞

P19细胞为小鼠多能胚胎癌细胞，在DMSO存在下生长时，体外分化成收缩心肌细胞[McBumey，M.W.(1993)Int.J.Dev.Biol.37，135-140]。可通过使用McBurney，M.W.等，(1982)，Nature 299，165-167和Smith，S.C等，(1987)，J.Cell Physiol.131，74-84所述的方法完成该分化。P19细胞购自ATCC(cat.no.CRP-1825)。

McBurney，M.W.等(1982)所述的“大批培养”方法简要包括在含有15％(v/v)热失活胎牛血清、50μg/ml链霉素、50单位/ml青霉素、β-巯基乙醇(100nM)和丙酮酸盐(1mM)的RPMI培养基中，使P19细胞在37℃在水饱和气氛，5.0-7.5％CO₂中生长。在100mm超低结合细胞培养皿(Corning Cat.no.3282)中，使对数生长的细胞以2×10⁴个细胞/ml传代培养于分化培养基(含有20％热失活胎牛血清的生长培养基，并补加1％DMSO)中。4天后，将细胞集合体转移到含有无DMSO的新鲜分化培养基的100mm Falcon组织培养皿(Cat no.353003)。在暴露于分化培养基和DMSO后～6天，跳动的心肌细胞出现在集合体中。

Smith，S.C.等(1987)所述的P19细胞分化成心肌细胞的“悬滴”方法类似于McBurney，M.W.等(1982)的大批培养方法。然而，在暴露于分化培养基和DMSO后，将少量细胞转移到100mm Corning超低结合细胞培养皿的顶部。为了使细胞保持在潮湿气氛中，将它们倒置于PBS溶液上。在第4天，交换分化培养基，大约在第6天出现跳动的心肌细胞。

心肌细胞分化-胚胎干细胞衍生的心肌细胞

小鼠胚胎干细胞系CGR8、R1和BS1分化的方案以前已描述于Puceat，M.2008，Methods，45，168-171。CGR8和R1分别购自ECACC(Cat.no.07032901)和ATCC(Cat.no.SCRC-1011)。BS1细胞系描述并表征于Zeineddine，D.等，2006，Dev.Cell 11，535-546。

该方案包括产生细胞集合体(也称为胚状体)，以引发分化，并用生长因子改善对心谱系的分化效率。该方案适用于小鼠和人胚胎干细胞两者的分化。小鼠和人胚胎干细胞繁殖之间的主要差异是，小鼠细胞可在白血病抑制因子存在下不用成纤维细胞饲养细胞繁殖，而人细胞传统上需要饲养细胞和FGF2以保持多能性。

在开始分化过程之前24小时，使对数生长小鼠胚胎干细胞暴露于繁殖培养基中的2.5ng/ml重组体人BMP2(Invitrogen)。繁殖培养基由BHK21培养基(Invitrogen)、链霉素(50μg/ml)、青霉素(50单位/ml)、非必需氨基酸(1mM)、丙酮酸钠(1mM)、谷氨酰胺(1mM)、巯基乙醇(100nM)、胎牛血清(7.5％v/v)和重组体白血病抑制因子(1单位/ml)组成。在传代培养细胞时，分散(以促进产生胚状体)，通过低速离心收获，并以25,000个细胞/ml重新悬浮于分化培养基，所述分化培养基由缺少重组体白血病抑制因子的繁殖培养基组成，并补加20％(v/v)胎牛血清。所有细胞操作在37℃和5-7.5％CO₂中进行。

使细胞(500)以20μl等分试样分配到100mm Corning超低结合细胞培养皿的下侧。使PBS分配到底部，以防止蒸发。使胚状体形成进行48小时。在此时间后，使所有胚状体缓和地重新悬浮于10ml分化培养基，并培养另外72小时。在第5天，将胚状体平板接种到用0.1％明胶涂覆的Falcon 100mm组织培养皿上。跳动的小鼠心肌细胞应在～7天后出现。

人胚胎干细胞衍生的心肌细胞的产生包括以下：在E14小鼠胚胎成纤维细胞上，使用以下繁殖培养基培养对数生长的I-6人胚胎干细胞(Technion-Israel Institute of Technology)：补加巯基乙醇(100nM)、谷氨酰胺(1mM)、非必需氨基酸(1mM)、15％(v/v)KOSR血清替代品(Invitrogen)和10ng/ml重组体人FGF2(invitrogen)的KO-DMEM(Invitrogen)。I-6人胚胎干细胞系由NIH批准。

为了使I-6细胞分化成心肌细胞，使细胞暴露于繁殖培养基48小时，所述繁殖培养基具有减小浓度的KOSR血清替代品(5％v/v)，并缺少FGF2，但补加10ng/ml BMP2和FGF2受体抑制剂SU5402(1μM，Calbiochem Cat.no.572630)。

如上所述使用类似于为分化小鼠细胞设计的那些方案产生人胚状体。在用胶原酶CLS2(Invitrogen)进行I-6细胞酶促解离后，使细胞重新悬浮于补加5％KOSR血清替代品巯基乙醇(100nM)、谷氨酰胺(1mM)和非必需氨基酸(1mM)的KO-DMEM培养基，并转移到Corning超低结合细胞培养皿，以促进细胞集合。在～2星期后观察到跳动的人心肌细胞。

最近，Mummery C.L.等，2007 Curr Protoc Stem Cell Biol第1章第1F.2单元和Mummery C.L.(2007)Cardiomyocyte differentiation inhuman ES cells(人ES细胞中的心肌细胞分化)描述了基于人胚胎干细胞(hES2和hES3)与小鼠内胚层样END2细胞共培养的无血清悬浮培养方法。在Culture of Human Stem Cells(人干细胞培养)，第4章，93-106页(Eds.Freshney R.I.，Stacey，G.N.和Auerbach，J.M.)中，此方案进一步由Graichen等2008 Differentiation(分化)76 357-370修改，用于使用END2细胞调节的培养基。两种方法包括如前所述胚状体的产生。

心肌细胞分化的抑制剂

小鼠HSP25的表达对P19细胞的心肌细胞分化是重要的。已知HSP25通过p38途径的磷酸化对其某些功能是重要的。已显示由特异性抑制剂SB203580(10μM)抑制p38途径阻止小鼠P19细胞分化成心肌细胞[Davidson，S.M.&Norange，M.(2000)Dev.Biol，218，146-160]。在此研究中，通过免疫组织化学监测单一心脏标记心肌动蛋白的存在，并通过RT-PCR监测心肌动蛋白和心房钠尿肽的表达，来评价分化。

SB 203580[4-(4′-氟苯基)-2-(4′-甲基亚磺酰基苯基)-5-(4′-吡啶基)咪唑]购自Promega(Cat.no.V1161)。它是MAP激酶同系物p38α、p38β和p38β2的特异性细胞可渗透抑制剂。SB 203580对ERK、JNK、p38γ或p38δ的活性没有显著作用。

Graichen，R.等，(2008)Differentiation(分化)，76，357-370已证明SB 203580在1-10μM实际促进来自人胚胎干细胞的心肌细胞的产生。然而，浓度增加到15μM显著减少心肌细胞数，并在25μM完全阻止分化。因此，SB 203580的功能似乎依赖于物种(specy)和剂量两者。这些作者也证明对另一种p38MAP激酶抑制剂SB202190的类似浓度作用。他们也报告人胚胎干细胞心肌细胞分化的以下抑制剂-SB216763(10-25μM，GSK-3抑制剂)、PD098059(5-25μM，MAPKK抑制剂)、茴香霉素(0.01-100μM，JNK/SAPK和p38激活剂)、ATA(0.01-100μM，JAK2/STAT5激活剂)、FTT(0.01-100μM，PKC激活剂)和OAG(0.01-100μM，Ca2+依赖性PKC)。

心肌细胞分化的其它抑制剂包括下列。Lei，L.等，(2008)Shen WuGong Xue Bao，24.(10)，1790-1795证明，钠/质子交换剂1(NHE1)抑制剂EMD87580抑制DMSO诱导期间小鼠P19胚胎癌细胞的心肌细胞分化。Li，X.等，(2009)Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.，196，1，159-170证明在小鼠胚胎干细胞系CGR8中的类似结果。PI-3-激酶抑制剂LY294002(50μM)阻止小鼠胚胎干细胞分化成心肌细胞[Klinz，F.，等，(1999)，Exp.Cell Res.，247，(1)，79-83]。

这些抑制剂的大部分可以购得，例如SB202190(Millipore Cat.no.19-134)、LY294002(Promega V1201)、SB216763和茴香霉素(各自为Tocris Bioscience Cat.no.1616和1290)。

在祖干细胞分化期间，可监测抑制剂(和化学物质、药物或化妆品)(如，SB 203580等)对心脏发育的作用。使祖细胞暴露于抑制剂，并通过本领域技术人员公知的技术，如定量免疫细胞化学，通过测量与经分化的细胞类型相关的细胞/组织特异性标记的表达，来监测分化程度，而评价对细胞发育过程的作用。

图2说明本发明的方法的一个实施方案，其中在用刺激物或作用剂(30)处理后，通过测量至少两种生物标记(15、45和47)的水平，评价化学物质(20)对未分化干细胞(10)分化成分化细胞(40)的作用。在暴露于诱导分化的刺激物或作用剂(30)之前或之后，可使干细胞(10)暴露于化学物质(20)。因此，例如，在心肌细胞发育环境下，通过测量干细胞(15)或心肌细胞(45，47)中存在的至少两种生物标记的水平，可评价药物或化学物质(20)对干细胞(10)分化成心肌细胞(40)的潜在作用。

指示心脏发育的标记包括下列(也描述购自Abcam Inc.的抗体的来源)：

心脏干细胞标记

[1]透明质烷合酶1(抗体ab75329)-在心脏发育中涉及。

[2]OSR1(抗体ab76689)-转录因子，在中内胚层并且随后在内胚层和间介中胚层中表达。

[3]Sca1(抗体D7，ab25031)-在多能造血干细胞中表达。

心肌细胞前体细胞的标记

[1]ALPK3(抗体ab57526)-在心肌细胞分化中起作用。

[2]Periostin(抗体ab14041)-在胚胎和胎心中表达，定位到最终使原始心脏管分成四个室的心内膜垫。

[3]Mesp1(抗体ab77013)-Mesp1在心血管系统的很多前体中表达，已知在心形态发生过程中起作用。

心肌细胞-早期标记

[1]Nkx2.5抗体(Abacm-ab35842)-在心肌和心内膜两者中表达。

[2]心肌素抗体(Abcam Inc.-ab22621)-心肌素调节一组心脏和平滑肌特异性基因的表达。它在心脏发生和平滑肌细胞谱系的分化中起关键性作用。

[3]GATA4抗体(Abcam Inc.-ab61170)-涉及心脏发育的转录因子，在心脏和平滑肌细胞类型中调节基部、激动剂或应激诱导的基因表达中起作用。

[4]MEF2C(抗体ab43796)-转录激活剂，控制心形态发生和肌发生，也涉及血管发育。它也可涉及神经发生和皮层结构发育。

[5]HAND1(抗体ab52767)-转录调节剂，在早期心脏形态发生中起重要作用。在成体中，为心特异性基因表达所需。

[6]IRX4(抗体ab56032)-在发育期间在心脏中表达。

[7]TBX5(抗体(ab18531)-TBX5可在心脏发育中起作用。

[8]Tbx20(抗体ab42468)-在发育中的心脏中表达。

[9]转录因子25(抗体ab67762)-在体外作为SRF的转录阻抑物，并因此可在心脏发育中起作用。

心肌细胞-晚期标记

[1]心肌钙蛋白T抗体(Abcam Inc.-1C11，ab8295)-只在心肌中表达，心肌钙蛋白T是肌钙蛋白复合物的原肌球蛋白结合亚基。

[2]心肌钙蛋白I抗体(Abcam Inc.-28419C7，ab19615)-肌钙蛋白I是在调节骨胳肌和心肌收缩中起重要作用的异侧(heteromeric)复合体的部分。

[3]重链心肌球蛋白抗体(Abcam Inc.-3-48，ab15)-心MHC作为两个同种型存在，α-心MHC和β-心MHC。两者均在人心脏中表达，β-心MHC为主导形式。

[4]肌球蛋白轻链抗体(&1LC-14，ab50080)-肌球蛋白由两个重链和四个轻链组成。心室肌球蛋白轻链I(Abcam Inc.-MLM527，ab680)和心肌球蛋白轻链11LC-14，ab50080

[5]肌球蛋白轻链2抗体(Abcam Inc.-ab48003)-肌球蛋白轻链2与心肌球蛋白β-重链相关。

[6]心FABP抗体(Abcam Inc.-67D3，ab16916)-在心肌组织中表达，且在骨胳肌中以显著较低浓度表达。

[7]α-肌节肌动蛋白抗体(5C5，ab7799)-α-肌动蛋白为肌动蛋白的同种型之一。在脊椎动物中有三组肌动蛋白同种型：α、β和γ。α-肌动蛋白发现于肌肉组织，并且为收缩器官的主要成分。该抗体与a-心肌肌动蛋白反应。

心室标记

[1]BMP10(抗体ab34962)-在心脏心室发育期间调节心肌细胞增殖和成熟的必需成分。

[2]HAND2(抗体ab56590)-在发育中的心室腔中表达，并在心形态发生中起重要作用。

肌节标记

[1]肌节α-辅肌动蛋白抗体(Abcam Inc.-EA-53，ab9465)-ACTN2编码在骨胳肌和心肌两者中表达的肌肉-特异性α-辅肌动蛋白同种型。定位于心肌和骨胳肌中肌管的应力纤维中的Z线和点。

[2]血清应答因子(抗体ab36747)-心脏中出现跳动的肌节所需的心脏富集的转录因子。

其它心脏标记

[1]HEY2(抗体ab70133)-转录因子，哺乳动物心脏发育的重要决定子。

[2]KLF13(抗体ab15701)-心脏发育所需的转录因子。

[3]MEF2转录因子族

MEF2A(抗体ab55547)-在心肌和骨胳肌发育中具有关键作用。

MEF2B(抗体ab55565)-在发育期间调节很多肌肉相关基因的表达。涉及某些神经原性细胞分化。

MEF2D(抗体ab43797)-在未分化成肌细胞中存在表明可在生肌发育的很早阶段起作用。涉及生肌细胞和一些神经原性细胞的分化。

[4]受磷蛋白抗体(Abcam Inc.-2D12，ab2865)-调节心脏肌质网(SR)的钙泵。

上述方法及其变体常用于使祖细胞(如胚胎干细胞)和癌细胞分化成心肌细胞。该分化过程可受化学物质(如SB 293580)抑制。不同分化方法、特征化抑制剂和抗体的组合形成评价化学损伤后对哺乳动物细胞/组织发育的作用的多重定量免疫细胞化学方法的基础。

神经分化

i)完成分化，ii)抑制剂细节，和iii)神经标记的方案。

可用良好表征和公开的方案使祖细胞分化成神经谱系的细胞，如下面所述的那些方案。使用这些方案，可从多能和多能祖细胞(如胚胎癌和干细胞)产生神经元细胞。

胚胎干(ES)和癌(EC)细胞满足研究神经元分化的很多标准，它们快速分裂并能够分化成包括神经元的多种细胞类型。ES细胞多能，然而，它们需要要求高的培养条件，通常需要饲养细胞或昂贵的生长因子。然而，EC细胞较容易培养，不需要饲养细胞，并且可保持在相对简单的培养基中。EC细胞的缺点是它们是肿瘤细胞，基因异常，并且显示有限的分化能力。然而，它们确实代表用于分化研究的简单且稳健的系统。

EC细胞系NTERA2已用于研究神经元分化，并且暴露于视黄酸可靠产生神经元，所述神经元类似于通过培养物中初级神经元产生的那些。视黄酸暴露导致干细胞标记(如Oct4、SSE3、TRA-1-60和TRA-1-81)的损失和神经标记(如NeuroD1、β-III微管蛋白和神经丝)的上调。此分化过程非常可预见和一致。暴露于视黄酸和在有丝分裂抑制剂存在下细胞的重新接种促进产生基本纯的神经元群体(LeypoldtF.等，2001，Neurochem.76，806-814)。这些是基本功能成熟的表达突触和神经递质表现型，如胆碱能、GABA能和血清素能(sertonergic)受体(Hartley等，1999，J.Comp.Neurol.，407，1-10)。

祖细胞的神经分化

由Leypoldt F.等，2001(Neurochem.76，806-814)进行的NTERA2细胞的神经分化简要包括下列。细胞常规于37℃在5％CO₂中保持在补加5％胎牛血清的OptiMEM(Invitrogen)培养基中。在具有10％胎牛血清的高葡萄糖DMEM(Invitrogen)中在细菌学培养皿中进行细胞集合(1×10⁶个细胞/ml)。在过夜后，培养基补加1μM反式视黄酸。每3天更换培养基和培养皿。使视黄酸存在保持21天，随后，将细胞集合体转移到集合培养基[补加有丝分裂抑制剂胞嘧啶-D-阿拉伯呋喃糖苷(10μg/ml)和尿苷(1μg/ml)]中的聚-D-赖氨酸和层粘连蛋白(两者均为10μg/ml)细胞培养物处理的皿。这些条件继续～7天，培养基每2-3天更换。该延长方案(持续～4星期)促进高百分数NTERA2细胞有效分化成神经元。

表达功能突触的神经元细胞也已从NTERA2细胞产生。Hartley等，1999(J.Comp.Neurol.，407，1-10)共培养NTERA2细胞与初级星形胶质细胞，所得神经元产生谷氨酸盐能和GABA能突触(另外，它们的体外生存能力延长到＞1年)。根据Cadelli，D.S.和Schwab，M.E.，1991(Ann.N.Y.Acad.，Sci.，633，234-240)的方法，使初级星形胶质细胞从18-21天大鼠胚胎的脑半球分离。将NTERA2神经元(1×10⁵)接种到聚-D-赖氨酸和Matrigel^TM(BDbiosciences)涂覆的盖片上，并与(但不接触)汇合星形胶质细胞一起在35mm细胞培养物处理的皿中共培养。使共培养物保持在具有以星形胶质细胞调节的培养基1∶1补加的高葡萄糖的DMEM中。在6星期后，电子显微图表明，免疫组织化学证明突触和突触蛋白I表达的存在。谷氨酸盐能、GABA能和NMDA传输各自用选择性拮抗剂CNQX(10μM)、荷苞牡丹碱(20μM)和APV(100μM)通过电生理学证明。

未分化的人ES细胞(如NTERA2细胞)表达标记Oct4、SSE3、TRA-1-60和TRA-1-81，所有这些标记均在分化时下调。在利用视黄酸、二甲亚砜(DMSO)或六亚甲基双乙酰胺的神经元分化时，衍生的ES细胞显示ES标记的下调和神经神经节苷脂糖脂GD2、GD3和A2B5的增加表达(Draper J.等，2002，J.Anat.，200，249-258)。通常用这些细胞表面标记从早期分化中的细胞分离有前景的神经前体。用于从神经谱系分离细胞的其它有用标记包括N-CAM、neuroD1、NSE、巢蛋白β-微管蛋白和musashi-1。少突神经胶质细胞可用标记Olig-1、-2-3和-4识别(Jackson J.P.等，2007，Culture of human stem cells(人干细胞培养)中的Techniques for neural differentiation of human EC and ES cells.(人EC和ES细胞的神经分化技术)eds.Freshney R.I.，Stacey，G.D.&Auerbach J.M.J.Wiley&Sons，Inc.)。

促进祖细胞神经分化的方法包括细胞集合。该方法常规用于诱导ES和EC细胞(包括NTERA2、P19和PC12)的分化。细胞集合增加细胞接触，促进细胞间信号传导，这是体内发育和体外分化的重要方面。早期神经分化技术在含有血清的培养基中利用视黄酸，但这些现在被更好限定的无血清方法代替。

神经分化-无血清确定成分培养基

用无血清确定成分培养基通过细胞集合技术从EC和人ES细胞产生神经球已显示从NTERA2细胞产生放射状神经胶质细胞(Marchal-Vitorion S.等，2003，Cell Neurosci.，24，198-213)。这是多级过程，如果培养基补加FGF-2，神经球可无限保持。利用人ES细胞，在FGF-2退出时，神经球分化成星形胶质细胞、神经元和少突神经胶质细胞(Zhang，S.C.等，2001，Nat.Biotechnol.19，1129-1130)。

为了产生神经球，Marchal-Vitorion S.等，2003，Cell Neurosci.，24，198-213使用在25cm²烧瓶中生长的NTERA2细胞(1×10⁵个细胞/ml)，所述烧瓶含有无血清的确定成分培养基DMEM/F12(Invitrogen)，培养基补加N2(Life Technologies)、谷氨酰胺(2mM)、葡萄糖(0.6％w/v)、胰岛素(20μg/ml)、肝素(2μg/ml)、EGF(20ng/ml)和FGF(10ng/ml)。为了诱导神经分化，使所得细胞集合体或神经球离解，并以5×10⁵个细胞/cm²接种在聚-D-赖氨酸涂覆的皿上，在减去生长因子的血清确定成分培养基中培养另外10天。这些NTERA2神经球随后显示产生高百分数未成熟神经元(～50％)与少突神经胶质细胞谱系的细胞。

Zhang，S.C.等，2001(Nat.Biotechnol.19，1129-1130)用在失活小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上生长的人ES细胞系H1和H9产生神经前体细胞，所述神经前体细胞在无血清存在但在有FGF-2存在下显示神经样结构。在去除FGF-2时，它们分化成神经元、星形胶质细胞和少突神经胶质细胞。ES/成纤维细胞共培养物的常规保持在由补加20％v/v血清替代培养基(Invitrogen)、β-巯基乙醇(0.1mM)、肝素(2μg/ml)和FGF-2(4ng/ml)]的DMEM/F12培养基组成的ES细胞培养基中进行。为了诱导分化，用Dispase^TM(0.1mg/ml Invitrogen)去除ES细胞群体，并重新悬浮于减去FGF-2的确定成分的ES细胞培养基。利用每日培养基变化，将细胞作为飘浮胚状体在25cm²细胞培养瓶中培养。4天后，使胚状体重新悬浮于补加胰岛素25(μg/ml)、转铁蛋白(100μg/ml)、黄体酮(20nM)、腐胺(60uM)、亚硒酸钠(30nM)、肝素(2μg/ml)和FGF-2(20ng/ml)的DMEM/F12中。将分化中的胚状体培养～10天，然后转移到用聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)涂覆的新烧瓶中，以阻止附着。

为了产生少突神经胶质细胞(oligodentrocyte)，将ES-细胞衍生的神经前体细胞在没有FGF-2存在下在补加N1(Invitrogen)和PDGF-1(2ng/ml)的DMEM中培养。在～2星期后，观察olig4-阳性细胞，具有一般少突神经胶质细胞形态。

在FGF-2(20ng/ml)存在下，通过在由DMEM/F12、N2(Invitrogen)、cAMP(100ng/ml)和BDNF(10ng/ml)组成的培养基中在鸟氨酸/层粘连蛋白上培养细胞，而进行神经元分化。～10天后，观察到纤维过程从附着球散发。大部分细胞表达神经元标记MAP2ab和β-微管蛋白。

神经分化-共培养

增加ES和EC神经分化效率的另外的努力利用与其它细胞系(例如PA6基质细胞)的共培养(Scwartz等，2005，Stem Cell Dev.，14，517-534)。作者在PA6细胞的汇合单层上共培养NTERA2细胞(2000个细胞/ml)。用10μg/ml丝裂霉素-C使PA6细胞失活。使共培养物保持在类似于前述的分化培养基中(Leypoldt F.等，2001，Neurochem.76，806-814)。22天后，在86％NTERA2神经元中检测到酪氨酸水解酶，指示存在成熟的多巴胺能表现型。使用PA6基质细胞调节的培养基显示产生多巴胺能表现型效率较低，因为促进分化过程的因素仍未完全表征。

神经分化-单层

其它神经分化方法基于单层中人ES细胞的分化(Gerrard，L.等，2005，Stem Cell，23，1234-1241)。这些研究已显示，加入BMP抑制剂量(noggin)到ES细胞培养物导致产生神经祖细胞。该方法利用在补加FGF-2(20ng/ml)的小鼠胚胎成纤维细胞调节的培养基中在Matrigel^TM(BD Biosciences)上生长ES细胞。对于神经分化，在补加100ng/ml量的N2B27神经分化培养基(Invitrogen)中培养汇合ES细胞。在第3次通过(passage)，使细胞离解成单个细胞，并在补加FGF-2的N2B27中培养。该方案导致产生神经祖细胞，并且～97％细胞表达神经标记musashi。通过将N2B27-处理的细胞接种到聚-L-赖氨酸/层粘连蛋白涂覆的皿上，并在补加音猬因子(sonic hedgehog)(300ng/ml)、FGF-8(100ng/ml)和抗坏血酸(160μM)的N2B27培养基中培养2星期，产生表达神经元和神经祖细胞的酪氨酸水解酶。2星期后，抽出音猬因子，并由BDNF(20ng/ml)、GDNF(20ng/ml)、抗坏血酸(160μM)和层粘连蛋白(500ng/ml)代替。

在此文献中描述的很多神经分化方法的数个方法的详细说明提供在Jackson J.P.等，2007，Culture of human stem cells(人干细胞培养)中的Techniques for neural differentiation of human EC and ES cells.(人EC和ES细胞的神经分化技术)eds.，Freshney R.I.，Stacey，G.D.&Auerbach J.M.J.Wiley&Sons，Inc.)。所述实例方案包括通过视黄酸诱导人EC细胞神经分化，在胚状体中的人ES细胞神经分化，和神经球从人ES细胞的衍生和分化。

实施例1-通过视黄酸诱导人EC细胞神经分化

于37℃在10％CO₂空气中使NTERA2细胞保持在生长培养基(DMEM，4.5g/l葡萄糖和10％v/v胎牛血清)中。将NTERA2细胞以1×10⁶个细胞/75cm²烧瓶接种在分化培养基(补加10μM视黄酸的生长培养基)中。NTERA2细胞在2-3天内投入到神经分化，在～10天后出现神经元。

实施例2-胚状体中人ES细胞神经分化(细胞集合)

使对数生长的ES细胞重新悬浮于胚状体(EB)培养基(DMEMknockout，20％knockout血清替代品、1％非必需氨基酸、1mM β-巯基乙醇和1mM谷氨酰胺)，并在37℃在5％CO₂空气中在100mm Corning超低结合细胞培养皿或细菌培养皿中培养，以防止细胞附着。培养基每隔一天更换。在悬浮体中～21天后，存在分化的EB。将这些平板接种到EB培养基中明胶涂覆的表面上，密度为50个胚状体/25cm²。在重新接种后～24小时，可作为附着的胚状体向外生长(outgrowth)看到神经分化。

实施例3-神经球从人ES细胞的衍生和分化

使汇合ES细胞重新悬浮于EB培养基，并于37℃在5％CO₂空气中放入25cm²细胞培养瓶中4天。培养基每天更换。～4天后，将EB放入由DMEM/F12、N2补充物、FGF-2(20ng/ml)、胰岛素(20μg/ml)和动物淀粉硫酸钠盐(2μg/ml)组成的神经球培养基中，并接种到明胶涂覆的25cm²瓶中。培养基每隔一天更换。在～10天后可见神经瓣状体。用杆菌衍生的中性金属蛋白酶分散酶^TM(100μg/ml-Invitrogen)分离经解聚的神经瓣状体，使这些重新悬浮于神经球培养基，并分配到DMEM/F12涂覆瓶的1％琼脂糖上。神经球每5天用新鲜的神经球培养基处理，并且每2-3星期传代培养。为了分化研究，将神经球接种到神经球培养基中的明胶涂覆瓶上，在数次通过后，神经球衍生细胞为培养物中最主导的细胞类型。这些细胞一般对早期神经标记(如musashi-1和巢蛋白)为阳性，。然后，可用例如上述那些方法使神经球有效分化，即Marchal-Vitorion S.等，2003(Cell Neurosci.，24，198-213)和Zhang，S.C.等，2001(Nat.Biotechnol.19，1129-1130)。

神经分化的抑制剂

[1]腺苷二醛

S-腺苷甲硫氨酸(AdoMet)是宽范围生物甲基化反应(包括DNA甲基化)的通用甲基给体。基因可通过CpG部位的甲基化而转录失活，这有时与细胞分化过程相关，例如，神经分化需要控制阶段特异性基因活性的一系列基因程序。这些活性不仅在转录水平控制，而且通过外遗传修饰控制，包括DNA甲基化。

通过Adomet依赖性甲基转移酶进行的甲基化反应导致产生两种产物，甲基化底物和自身为Adomet依赖性甲基转移酶的潜在抑制剂的副产物Ado-高半胱氨酸(AdoHcy)。AdoHcy进一步通过酶S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)分解成腺苷和高半胱氨酸。因此，SAHH的抑制导致甲基转移酶抑制剂AdoHcy的积累。腺苷二醛(AdOx)为SAHH的潜在抑制剂，因此间接为Adomet依赖性甲基转移酶并由此为神经分化的潜在抑制剂。

P19为胚胎癌性细胞，它们可如前所述在视黄酸存在下通过细胞集合方法分化成神经元。然而，在分化过程第一天使细胞暴露于AdOx(1μM)减少i)观察到的轴突数和ii)神经元标记β-微管蛋白、NeuroD1和mash1的表达水平。因此，AdOx通过其间接抑制Adomet依赖性甲基转移酶而中断P19细胞中的神经元分化(Hong，S.等，2008，Biochem.Biophys.Res.Commum.，377，935-940)。

[2]D-theo-1-苯基-2-癸酰基氨基-3-吗啉代-1-丙醇(D-PDMP)

神经节苷脂已在神经发育中涉及。利用包括P19EC细胞的体外神经元分化模型，Liour S.S.&Yu R.K.，2002，(Neurochemical Res.27，1507-1512)证明，神经节苷脂生物合成抑制剂D-theo-1-苯基-2-癸酰基氨基-3-吗啉代-1-丙醇(D-PDMP)抑制轴突向外生长，最终导致P19-衍生神经元死亡。

在补加2.5％胎牛血清和5％小牛血清的α-MEM(Invitrogen)中培养P19EC细胞(1×10⁶个细胞/皿)。在细菌级皿中在5μM视黄酸存在下诱导它们分化4天，随后使它们分散于减去视黄酸的生长培养基，并接种到聚-赖氨酸涂覆的细胞培养皿上。培养基每～3天更换。神经节苷脂抑制剂D-PDMP(50μM)在用视黄酸处理之前3天加入，并在整个分化过程保持。结果表明，D-PDMP减少i)未分化P19EC细胞的增殖，没有任何细胞死亡迹象，和减少ii)废除的轴突伸长，应注意-轴突存在，但它们不能正确发育。通过使用其它神经节苷脂抑制剂，作者能够证明，D-PDMP对神经元分化的作用不只与神经节苷脂生物合成抑制相关。

[3]吲哚咔唑抑制素

吲哚咔唑抑制素A、D、C和D由链霉菌物种产生，并全部证明为大鼠PC12细胞的NGF诱导神经元分化的抑制剂(Matsuura N等2002，J.Antibiotics 55，355-362和Feng，Y.等，J.Antibiotics 57.627-633)。简单地讲，PC12细胞生长于补加0.35％葡萄糖、10％胎牛血清和10％马血清的DMEM中。将PC12细胞平板接种到96孔胶原型1涂覆板的孔中。12小时后，加入吲哚咔唑抑制素，12小时后加入NGF。通过观察轴突过程的发生来监测神经元分化。

[4]吲哚并咔唑

在以上关于大鼠PC12细胞的NGF-诱导神经元分化的吲哚咔唑抑制素介导的抑制的所述类似试验中，也证明吲哚并咔唑K-252a和b为神经分化的有效抑制剂(Matsuura N等，2002，J.Antibiotics 55，355-362)。通过抑制p140trk酪氨酸激酶NGF-受体，这些化合物明显介导其轴突伸长的抑制。

[5]2′-氨基-3′-甲氧基黄酮(PD98059)

PD 98059为MAPK/ERK激酶1(MAP激酶激酶1或MEK1)的潜在细胞可渗透和选择性抑制剂。它阻止MEK1活化，因此，抑制MAP激酶的随后磷酸化和活化。Pang，L.等，1995(J.Biol.Chem.270，13585-13588)证明，PD98059完全阻止PC12细胞中NGF诱导的轴突形成，而不影响细胞生存能力。这表明，MAP激酶途径似乎对PC-12细胞中NGF诱导的神经元分化重要。

[6][7-(苯甲酰基氨基)-4，9-二氢-4-甲基-9-氧代-吡唑并[5，1-b]喹唑啉-2-甲酸]PD90780

取代的吡唑并喹唑啉酮PD90780与NGF相互作用，由此防止它结合到p140trk酪氨酸激酶NGF-受体和共同的神经营养因子受体p75NTR。抑制NGF的结合废止PC12细胞的NGF-介导神经元分化，Spiegel K等1995 Biochem.Biophys Res Commun.217，488-494。

[7]AG870

AG-879为酪氨酸激酶抑制剂的酪氨酸磷酸化抑制剂族的成员。它选择性抑制p140trk酪氨酸激酶NGF-受体自动磷酸化，而不抑制EGF或PDGF受体磷酸化(IC50＝10μM)。象以上化学物质一样，AG-879也抑制PC12细胞中的NGF-诱导轴突向外生长，Ohmichi M等1993，Biochemistry 4，32 4650-4658。

在祖细胞分化期间，可监测抑制剂(和化学物质、药物或化妆品)(如上所述)对神经发育的作用。使祖细胞暴露于抑制剂，并通过监测分化的程度评价对细胞发育过程的作用。这可通过比如定量免疫细胞化学的技术测量与经分化的细胞类型相关的细胞/组织特异性标记的表达来完成。

指示神经发育的特异性神经细胞标记包括下列(也描述购自Abcam Inc.的抗体的细节)。

神经干细胞标记-早期标记

[1]聚集蛋白聚糖ARGxx(抗体BC-3，ab3773)-在神经前体细胞中检测

[2]CD133(抗体32AT1672，ab5558)-神经和胚胎干细胞的标记。

[3]Dlx5(抗体ab54729)-在神经发育期间的转录调节剂。

[4]EMX2(抗体ab11849)-Emx2为牵涉Otx1/2以确定CNS的发育中的大脑皮层中细胞命运的同源框蛋白。

[5]巢蛋白(抗体10C2，ab22035)-在早期胚胎神经上皮干细胞中表达。巢蛋白广泛用作干/祖细胞、神经胶质瘤细胞的标记。

[6]NeuroD1抗体(ab60704)-神经发生中的重要分化因子。

神经干细胞标记-晚期标记

[1]BRN3A(抗体ab30880)-转录因子，涉及调节神经元基因。

[2]BRN3B(抗体ab32264)-发现于视网膜中神经节细胞的亚群内，在此它决定视觉系统神经元的亚组的特性。

[3]Musashi 1/Msi1(抗体ab60600)-在神经干细胞中表达。

[4]NR2E1/Tailless(抗体ab66125)-在脑中表达。

[5]核干细胞因子(抗体ab52784)-发现于胚胎和成体CNS干细胞。

[6]Oct6(抗体ab72681)-涉及在胚胎干细胞和发育中的脑中表达的早期胚胎发生和神经发生的转录因子。

[7]Pax2(抗体ab55490)-在神经系统(包括中脑、后脑、脊髓、眼、耳)发育期间需要的转录因子。

[8]SOX2(抗体57CT23.3.4，ab75485)-在发育中的神经系统中表达的转录激活剂。

[9]SOX4(抗体154C4a，ab70598)-在CNS中表达的转录因子。表达在发育中的CNS中增加。

[10]SOX10(抗体ab27655)-转录激活剂，作为核质穿梭蛋白，对神经嵴和外周神经系统发育重要。

[11]SOX11(抗体ab50194)-SOX11在发育中的神经系统中重要。

[12]SOX22(抗体86C2a，ab54371)-在胎脑和肾和成体心中表达的转录激活剂。

[13]波形蛋白(抗体RV202.ab8978)-神经干细胞标记

[14]CDw338(抗体BXP-21，ab3380)-造血/神经干细胞标记。

神经嵴细胞-标记

[1]神经发生素1(抗体ab66498)-在不同的祖群体中表达的转录因子。它调节神经元发育和分化。

[2]神经发生素2(抗体ab57560)-调节新皮质发育的转录因子。从细胞增殖转变到神经发生涉及神经发生素2。

[3]神经发生素3(抗体ab54743)-在从游走神经嵴细胞的神经发生中起重要作用的转录因子。

[4]MASH1(抗体ab76987)-在神经细胞早期发育中表达。发现于脊髓、中侧-和前侧前脑的神经上皮。后发现于脑。

星形胶质细胞-标记

[1]星形胶质细胞(抗体10E4/R5，(ab3268)-星形胶质细胞标记

[2]CaMKII(ab63377)-CNS的激酶，在长期增强和神经递质释放中起作用。

[3]EAAT1(抗体ab416)-在额皮质、海马和基底神经节中表达。

[4]早期CD15抗体(28，ab20137)-在星形胶质细胞和某些上皮细胞中表达。

[5]神经节苷脂GD3(抗体MB3.6，ab78361)-所有星细胞瘤表达GD3抗原。

[6]GFAP(抗体GF5，ab10062)星形胶质细胞标记-表达于星形胶质细胞、星形胶质、外周神经节中的卫星细胞、施万细胞和神经干细胞中。

[7]S100(抗体4C4.9，ab4066)星形胶质细胞标记-位于星形胶质细胞、施万氏细胞、室管膜细胞瘤和星形胶质细胞瘤。

[8]存活素(抗体32.1，ab9178)-在星形胶质细胞和一些神经元中表达。

[9]其它星形胶质细胞标记包括

ABCA1抗体(HJ1，ab66217)&ABCA7抗体(7A1-144，ab48265)

ALDH1L1抗体(ab56777)

血小板反应素抗体(A4.1，ab3131)。

神经胶质细胞和小神经胶质细胞-早期标记

[1]CNTF(抗体4-68，ab78269)-在CNS和PNS内的神经胶质细胞中表达。CNTF刺激多种神经元细胞类型的分化。

[2]Twist(抗体2C1a，ab50887)-Twist为在神经胶质瘤中表达的转录因子。它可在CNS发育和血管生成中起作用。

神经胶质细胞和小神经胶质细胞-晚期标记

[1]cCD11b(抗体ab8879)-一般在神经组织中用作小神经胶质标记。

[2]Iba1/AIF1(抗体ab54749)-由小神经胶质细胞表达的Ca2+结合肽。

[3]MRP8(抗体2C5/4，ab19860)-由小神经胶质细胞表达。

[4]Nfasc155抗体(ab77951)-Nfasc155，在神经胶质中的无髓鞘轴突中。

[5]PAX6(抗体AD2.38，ab78545)-转录因子，涉及眼、鼻、中枢神经系统和胰腺的发育。

[6]BLBP(抗体ab27171)

BLBP可用作放射状神经胶质(主要的神经祖细胞类型和支持神经元迁移的支架)的分子标记

浦肯野细胞-早期标记

[1]L1CAM(抗体2C2，ab24345)-在神经外胚层组织中表达。涉及轴突生长、神经迁移和介导神经元分化。

浦肯野细胞-晚期标记

[1]PTPζ(抗体ab78019)-在脑中发育调节，并在CNS中表达，在此它位于小脑的浦肯野细胞层、齿状回和侧脑室的前角的室管膜下层。

[2]NSMase2(抗体ab68735)-限于神经元、浦肯野细胞、锥体细胞、齿状回颗粒层的神经元和脑桥核中的神经元。也存在于下丘脑核、梨状皮质中的神经元和脑干的核。

[3]醛缩酶(抗体1F8，ab67204)-醛缩酶C在脑和神经中表达。

[4]前小脑肽(Precerebellin)(抗体ab36909)-脑特异性小脑肽的前体。活性形式富集于小脑浦肯野细胞的突触后结构和蜗背侧核的车轮神经元(cartwheel neuron)。

[5]钙结合蛋白(抗体CL-300，ab9481)-小脑浦肯野细胞的标记

神经元-早期标记

[1]PROX1(抗体ab57746)-在CNS早期发育中起重要作用。它调节有丝分裂期后未分化幼神经元的基因表达和发育。

[2]CD90(抗体1.BB.730，ab62009)-在神经细胞、T细胞、早期造血祖细胞、成纤维细胞、神经元和枯否(Kupffer)氏细胞上表达。

[3]UCHL1/3(抗体ab75275)-在调节神经元发育中作用。

[4]PLAGL1(抗体ab55659)-在早期脑发育期间在神经元-上皮中表达。

[5]HLXB9(抗体EPR3342，ab79541)-在发育中的脊椎动物CNS中由运动神经元选择性表达的同源框基因发育性调节神经元命运。

[6]NeuroD2抗体(ab66607)-诱导神经元分化和生存。

[7]NEUROD4抗体(ab67168)-介导神经元分化。

[8]NEUROD6抗体(ab77998)-涉及神经元分化和成熟。

神经元-中间标记

[1]NNPTX2(抗体ab69858)-在兴奋性突触发生中起作用的神经元中间早期基因。

[2]神经多糖C(抗体ab56941)-涉及CNS中的神经元回路形成。

[3]TBR2(抗体ab58225)-由发育期间中间祖细胞表达的转录因子。IPC在心室区域(VZ)或亚心室区域(SVZ)内分裂，并产生严格神经元群体。

神经元-晚期标记

[1]SIRP(抗体OX-41，ab9295)-由髓样细胞和神经元表达。

[2]共济失调蛋白7(抗体ab11434)-位于正常脑神经元的细胞质中和核膜上。

[3]GIRK2(抗体ab30738)-神经元GIRK2通道涉及调节神经元兴奋性，并可有助于静息电位。

[4]肌动蛋白2(抗体ab55611)-肌动蛋白2为神经元特异性。

[5]AP180(抗体AP180-I，ab11329)-表达限于神经元来源的细胞。

[6]PGP9.5(抗体ab27053)神经元标记-PGP9.5的表达对神经元高度特异性，并且对发散神经内分泌系统及其肿瘤的细胞高度特异性。

[7]SorCS1(抗体ab16641)神经元标记-SorCS1免疫反应性在整个脑的神经群体中分布广。

[8]Nova1(抗体ab77926)-Nova 1为神经元特异性RNA结合蛋白。

[9]NSE(抗体ab944)神经元标记-神经元特异性烯醇化酶主要在神经元中表达，在正常和肿瘤神经内分泌细胞中表达。

[10]HB Hu蛋白(抗体16A11，ab14370)-特异性结合到脊椎动物神经元蛋白的Hu族成员中存在的保守肽表位。

[11]ELAVL4(抗体16C12，ab14369)-可在神经元-特异性RNA处理中起作用。它位于脑组织。

[12]SAPAP3(抗体ab67224)-位于神经元细胞中的突触后区域。

[13]早期Ki67抗体[PP-67,526)-Ki67常规用作神经元标记。

[14]MAP2(抗体HM-2，ab11267)神经元标记-MAP2为脑组织的主要微管相关蛋白。

[15]髓鞘碱性蛋白(抗体MBP101，ab62631)-髓鞘膜的丰富蛋白组分。可在早期脑发育中起作用。

[16]驱动蛋白(抗体ab25715)、驱动蛋白2(抗体K2.4，ab24626)和驱动蛋白5A(抗体ab5628)-涉及神经元细胞中的小泡运输。5A为神经元-特异性。

[17]NeuN(抗体A60，ab77315)-神经元特异性核内蛋白为神经元的标记。NeuN发现于整个神经系统、小脑、大脑皮层、海马、丘脑和脊髓。

[18]Nfasc186(抗体ab31719)-在朗飞节的神经元中表达。

[19]Pin1(抗体ab12107)-在阿尔茨海默病下的tau病理中涉及。Pin1可对保持正常神经元功能关键。

[20]神经配蛋白3(抗体ab57375)-神经配蛋白3为神经元细胞表面蛋白。

[21]PDGFβ受体(抗体Y92，ab32570)-在神经元上表达。

[22]肌动蛋白(抗体ab54532)-肌动蛋白普遍存在，但尤其在神经元中表达。

海马神经元

[1]SynGAP(抗体EPR2883Y，ab77235)-只在海马神经元中的突触表达。

端脑神经元

[1]突触孔蛋白(抗体ab50485)-对形成端脑神经元的棘器是必要的。涉及突触可塑性。

多巴胺能神经元-早期标记

[1]PITX3(抗体ab30734)-该转录因子调节多巴胺能神经元分化。

[2]Nurr1(抗体ab12261)-在胚胎前侧中脑表达的转录因子。对多巴胺神经元的发育和保持关键。

[3]AMSX1(抗体4F11，ab73883)-与Wnt1平行作用，以建立中脑多巴胺能祖域，产生神经元群体。

多巴胺能神经元-晚期标记

[1]酪氨酸羟化酶(抗体185，ab10372)神经元标记-TH在肾上腺素能神经元的生理中起作用，并且经常用作多巴胺能神经元的标记。

[2]多巴胺D2受体(抗体ab30743)-在垂体和脑中表达。

ALDH1A1(抗体ab23375)-在视网膜背侧、前侧中脑(多巴胺能神经元)和造血干细胞中表达。

[3]DOPA脱羧酶(抗体ab3905)-涉及神经递质多巴胺和血清素合成的酶。

胆碱能神经元

[1]胆碱乙酰转移酶(抗体ab54599)-作为外周和中枢神经系统两者中胆碱能神经元的特异性标记。

感觉神经元

[1]突触融合蛋白和2(分别为抗体4H256，ab18010和ab12369)-神经元突触融合蛋白，定位于到达小血管的感觉神经元和神经的末端。

伤害性神经元

[1]外周蛋白(抗体2Q135ab17999)伤害性(疼痛)神经元标记-发现于外周神经节及其过程的神经元。

运动神经元

[1]Islet 1(抗体ab20670)神经干细胞标记-在神经管运动神经元分化和胰岛细胞的胚胎发生中起作用。

[2]Islet 2(抗体ab26117)神经干细胞标记-限定运动神经元亚类的转录因子。

锥体神经元-早期标记

[1]Emx1(抗体ab32925)-特异性表达锥体神经元的同源框基因。Emx1是锥体神经元和锥体细胞谱系的可靠标记。

[2]TBR1(抗体(ab56994)-在大脑皮层中表达。在早期胚胎发生期间，它区分旧皮质、边缘和新皮质域。

锥体神经元-晚期标记

[1]海马钙结合蛋白(抗体ab24560)-限于CNS，在海马CA1区域的锥体细胞中最丰富。

少突神经胶质细胞-早期标记

[1]A2B5(抗体2Q162，ab68385)-在发育中的少突神经胶质细胞祖细胞和神经内分泌细胞中表达的细胞表面神经节苷脂表位。

[2]PDGFα受体(抗体Y92，ab32570)-在少突神经胶质细胞祖细胞中表达的α亚基。

[3]Olig1(抗体ab21943)-Olig1促进少突神经胶质细胞形成。

[4]Olig2(抗体ab56643)-少突神经胶质细胞、脊髓运动神经元所需和后脑中的体运动神经元发育所需的转录因子。

[5]OSP(抗体ab7474)，少突神经胶质细胞标记-表达在发育期间高度调节，它可在少突神经胶质细胞的生长和分化中起作用。

[6]Olig3抗体(ab78006)-Olig3在胚胎中枢神经系统的不同类型祖细胞中短暂表达。

少突神经胶质细胞-中间标记

[1]选蛋白(sortilin)(抗体ab16640)-在脑、脊髓和肌肉中表达。选蛋白作为神经降压素的受体。选蛋白在胚胎发生期间表达。

少突神经胶质细胞-晚期标记

[1]髓鞘少突神经胶质细胞糖蛋白(抗体F3-87-8，ab24022)-MOG发现于正在髓鞘化的少突神经胶质细胞的表面上。

[2]CNPase(抗体11-5B，ab6319)少突神经胶质细胞标记-由少突神经胶质细胞和施万细胞表达。

[3]髓鞘PLP(抗体plpc 1，ab9311)，少突神经胶质细胞标记-CNS中最主导的髓鞘蛋白。涉及少突神经胶质细胞发育和轴突存活。

[4]CaMKII(抗体ab63377)-在脑中丰富的作为突触后密集区主要成分的遍在激酶。

神经内分泌细胞

嗜铬粒蛋白A(抗体23A1，ab36997)-在神经内分泌细胞中表达。

轴突

[1]神经丝组成神经元轴突、交感神经节细胞和树突的主要结构元素。

200kD重神经丝(抗体ab8135)

160kD中神经丝(抗体3H11，ab7256)

145kD神经丝(抗体2E30，ab35953)

68kDa神经丝(抗体DA2ab4572)

[2]14-3-3(抗体2Q248，ab14121)-位于神经元，轴突输送到神经末梢。

[3]Fez1(抗体ab53562)-涉及轴突向外生长，作为调节细胞形态和轴突引导机构的分子网络的组分。

[4]动力蛋白重链(抗体440.4，ab6305)&中链1(抗体70.1，ab6304)在微管中表达，动力蛋白已涉及轴突输送。

[5]巨轴突蛋白(Gigaxonin)(抗体ab27041)-普遍表达，对神经元功能和存活是必要的。

[6]Lingo1(抗体ab23631)-在小鼠和人脑中表达。

[7]MAP1a+MAP1b(抗体HM-1，ab66021)MAP2(抗体ab32454)MAP1B(抗体3G5ab3095)，MAP2a+MAP2b抗体(AP20，ab3096)-微管由微管蛋白和微管相关蛋白组成。MAP1为神经元特异性。

[8]神经生长因子G1配体(抗体ab31983)-在纹状体中的丘脑轴突和大脑皮层中高度表达。NGL1涉及促进轴突生长。

[9]丛蛋白(plexin)B2(抗体ab41098)-该受体在轴突引导中具有关键作用。

[10]Robo2(抗体ab72972)-Slit2和Slit1的受体，其在神经元发育期间引导神经管的轴突导航。

[11]Tau(抗体ab8763)神经元标记-Tau是主要在轴突上发现的神经元微管相关蛋白。

[12]微管蛋白(抗体YOL1/34，ab6161)微管标记-微管蛋白族涉及微管组织。

施万细胞

[1]NGF受体(抗体MLR2，ab61425)-在施万细胞和神经元中表达。在发育期间，NGFR调节神经元生长、迁移、分化和细胞死亡。

[2]髓鞘(抗体pm432B5，ab58513)-髓鞘在CNS中通过少突神经胶质细胞产生，在外周神经系统中通过施万细胞产生。

[3]神经胶质蛋白(抗体ab24483)-通过正在髓鞘化的施万细胞表达，在发育期间在各髓鞘片断边缘积累。

[4]Lgi4(抗体KT18，ab63289)-在施万细胞中表达。

[5]髓鞘蛋白零(抗体ab31851)-MPZ的表达限于施万细胞。它是外周髓鞘和神经的主要结构蛋白。

[6]Lgi4(抗体KT18.ab63289)-Lgi4在施万细胞中表达，控制轴突分离和髓鞘生成。

树突-早期标记

Arg 3.1(抗体ab23382)-即时早期基因，在脑表达中富集，通过神经元活性而诱导。在海马、扁桃体、下丘脑、纹状体和皮层中表达。

树突-晚期标记

[1]RRIMS3(抗体ab50198)-位于神经元树突和突触后密集区。

[2]脑发育调节蛋白(drebrin)(抗体M2F6，ab12350)-脑发育调节蛋为涉及控制肌动蛋白动力学和神经元形态发生的主要神经元F-肌动蛋白结合蛋白。

[3]神经元特异性βIII微管蛋白(抗体ab18207)-在胎发育和出生后发育期间在CNS和PNS中在其表达处丰富。

[4]SAP102(抗体7D3mAb 119，ab69738)-突触相关蛋白102在不对称型1突触的树突轴和脊柱中检测到。

[5]其它-滤泡树突细胞标记(抗体ab8138)

树突细胞抗体(抗体ab8171)

生长锥-早期标记

[1]CRMP1(抗体ab76995)-CRMP2(抗体ab54546)CRMP5(抗体ab77158)

脑衰蛋白反应介导蛋白(mediator protein)涉及神经发育期间神经元分化、轴突和生长锥引导。

[2]NRP2(抗体96009，ab50205)-NRP2为受体蛋白的神经毡蛋白族成员，可在心血管发育和轴突引导中起作用。

生长锥-晚期标记

[1]聚集蛋白(agrin)(抗体AGR 131，ab12362)-促进发育期间在神经肌肉接点烟碱性乙酰胆碱受体(和其它)的群集。

[2]BAI1相关蛋白2同种型3(抗体ab791)-脑特异性血管生成抑制剂。

[3]BAIAP2(抗体ab56588)-脑特异性血管生成抑制剂，在神经元生长锥引导中涉及。

[4]BASP1(抗体ab79349)-在脑中丰富表达的蛋白。

[5]双皮层蛋白(抗体ab28941)-微管结合蛋白，发现于细胞体，并导致分化中的神经元的神经元和轴突迁移的过程。

[6]Eph受体A1蛋白(抗体ab55900)、A2(抗体RM-0051-8F21ab73254)、A3(抗体6C1B6、ab76361)、A4(抗体7D3D4ab70403)、A5(抗体ab54633)、A6(抗体ab58022)、A7(抗体ab54640)、A8(抗体ab10615)、B1(抗体5F10A4、ab66326)、B2(抗体ab54650)、B3(抗体ab54717)、B4(抗体4A12G8，5G2F8，ab66336)和B6(抗体2A6B9，ab66325)-EPH相关受体已涉及介导神经组织发育事件。发育中的神经组织和成体神经组织表达所有的Eph受体和肝配蛋白配体。Eph受体的作用是介导轴突引导和神经嵴细胞迁移。

[7]肝配蛋白A1(抗体ab7040)、A2(抗体ab65041)、A3(抗体ab66150)、A4(抗体ab53062)、B2(抗体ab75868)和B3(抗体ab53063)-肝配蛋白是涉及介导神经系统中的发育事件的Eph受体的配体。

[8]GAP43(抗体GAP-7B10，ab50608)-神经元生长锥蛋白。

[9]GPRIN1(抗体ab74577)-GPRIN1涉及轴突向外生长。

[10]LIM激酶1(抗体ab51200)-在脑和脊髓中有活性，相信在那里涉及神经细胞发育。

[11]NCAM(抗体123C3，ab28377)-在大多数神经外胚层衍生细胞中表达。

[12]神经丝抑蛋白(抗体ab55587)-由发育中的脑和成体脑的神经元主导表达。该丝抑蛋白由CNS和PNS的轴突生长锥分泌。

体细胞

[1]ALK(抗体ALKc ab650)-ALK发现于在前脑神经元中表达的神经系统中。

[2]Membralin(抗体ab21818)-在中枢神经系统中表达。

[3]抑蛋白(抗体ab55501)-脑特异性生长抑制剂。

[4]STEP(抗体23E5，ab16967)-为神经特异性蛋白-酪氨酸磷酸酶。

突触-早期标记

内居蛋白(抗体ab19903)-调节神经元中的发育分布，在强烈生长和突触形成阶段中最丰富。

突触-晚期标记

[1]EAAT2(抗体ab77039)-对终止谷氨酸盐的突触后作用是必要的。

[2]神经元表面蛋白IIα(抗体ab34245)、神经元表面蛋白Iβ(抗体ab77596)和NRXN3(抗体ab18523)-在突触发生期间作为细胞粘着分子的神经元蛋白。

[3]双载蛋白(抗体C14-23，ab16770)-与突触小泡的细胞质表面相关。

[4]Bassoon(抗体SAP7F407，ab13249)-定位到突触前神经末梢。

[5]SAP102(抗体ab12086)-在不对称型1突触的树突轴和脊柱中检测的突触蛋白。

[6]CASK(抗体ab11343)-定位到神经元突触。

[7]CPLX1(抗体ab15855)和CPLX2(抗体ab77978)-在突触小泡胞吐中起作用的胞质蛋白。

[8]CRIPT(抗体ab16422)-在整个脑中在兴奋性突触的突触后密集区与PSD95共区域化(colocalise)，但在抑制突触中检测不到。

[9]CSP(抗体ab79346)-定位到突触小泡的细胞质表面。

[10]CTBP2(抗体ab67161)-作为用于专化突触的支架。

[11]小肌营养蛋白α(抗体ab72793)-定位到肌膜可涉及突触的形成和稳定性。

[12]HOMER2(抗体ab75037)-在谷氨酸盐能突触保持可塑性中起重要作用。

[13]HOMER3(抗体ab75038)-突触后密集区支架蛋白。

[14]ICA1(抗体ab55253)-可在神经递质分泌中起作用，在胰、心和脑中丰富表达。

[15]Munc 13(抗体ab27077)-涉及引起突触小泡。

[16]Munc18(抗体ab3451)-调节突触小泡对接和融合。对神经传递必要，并且结合突触融合蛋白。

[17]神经多糖C(抗体ab31946)-在中枢神经系统中表达。

[18]神经配蛋白1(抗体ab56882)、神经配蛋白2(抗体ab36602)-神经配蛋白为突触细胞粘着分子。

[19]PSD93(抗体ab12097)突触标记-使N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)在突触群集。

[20]PSD95(抗体6G6-1C9，ab2723)-位于突触后部位，以形成使受体、离子通道和相关信号传导蛋白群集的支架。

[21]Piccolo(抗体ab20664)突触标记-在突触接点的突触前侧聚集的突触前细胞基质蛋白。

[22]RIC8(抗体ab24383)-阳性调节突触传递。

[23]SAP97(抗体RPI 197.4，ab69737)-膜相关突触蛋白促进离子通道在突触末端群集。

[24]SAPAP3(抗体ab67224)-位于神经元细胞中的突触后密集区(PSD)。

[25]SNAP23(抗体ab57961)-突触小体相关蛋白在胞内小泡运输中的膜融合过程中起关键作用。

[26]SNAP25(抗体ab66066)-在突触小泡融合和胞吐中起重要作用的突触前神经末梢蛋白。

[27]SNAP29(抗体ab56566)-涉及膜运输步骤，结合到突触融合蛋白。

[28]SNAPIN(抗体ab37496)-突触小泡对接和融合所需的SNARE复合体的组分。

[29]SV2A(抗体15E11，ab49572)、SV2B(抗体ab68025)和SV2C(抗体ab33892)-在所有突触小泡中存在的整合膜糖蛋白。

[30]SYNPR(抗体ab75053)-突触小泡膜的组分，据认为在突触小泡运输中起重要作用。

[31]突触蛋白I、II和III分别为(抗体ab57468)、(抗体EPR3277，ab76494)和抗体ab68849)。突触蛋白为与突触小泡的细胞质表面相关的神经元磷蛋白。

[32]突触小泡蛋白(synaptobrevin)(抗体4E240，ab18013)-涉及突触小泡与突触前膜的对接和/或融合。

[33]突触小泡磷酸酶(抗体ab19904)突触标记-在神经系统中表达。

[34]突触小泡蛋白(synaptophysin)(抗体4E206，ab18008)-存在于脑、脊髓、视网膜、肾上腺髓质的小泡、神经肌肉接点中神经元突触前小泡的膜。

[35]突触结合蛋白(抗体ASV30，ab13259)-突触小泡的整合膜蛋白。

[36]肌营养不良蛋白相关蛋白(Utrophin)(抗体DRP3/20C5，ab49174-位于神经肌肉突触和肌腱接点，参与突触后膜保持和受体群集。

[37]VAMP2(抗体克隆3E5，ab53407)-在神经元中的突触小泡中特定发现的小整合膜蛋白。

[38]突触结合蛋白XII(抗体ab76261)-涉及神经系统中递质释放的调节，作为囊泡运输和胞吐中的Ca(2+)传感器。

其它神经标记

[1]MEF2A(抗体ab55547)-在整个突触发生中在小脑皮质的颗粒神经元中丰富。在心肌和骨胳肌发育中也具有关键作用。

[2]MEF2B(抗体ab55565)-在发育期间调节肌肉相关基因的表达。它们也涉及某些神经原性细胞的分化。

[3]MEF2C(抗体ab43796)-控制心形态发生和肌发生。它也可涉及神经发生和皮层结构发育。

[4]MEF2D(抗体ab43797)-涉及肌原性细胞和一些神经原性细胞的分化。

脂肪细胞分化

完成i)分化，ii)抑制剂细节，和iii)脂肪细胞标记的方案。

可用良好表征和公开的方案使祖细胞分化成脂肪细胞，如Dani C等，(1997)J.Cell Sci 110，1279-128所述。使用这种方案和相关方案，可从多能和多能祖干细胞产生脂肪细胞。

胚胎干细胞是多能细胞，并且可在白血病抑制因子(LIF)存在下保持在未分化状态。去除LIF并加入适合的分化剂导致ES细胞投入多种细胞类型，包括脂肪细胞、心脏细胞、骨胳肌细胞和神经元。脂肪细胞从中胚层干细胞(肌细胞、软骨细胞和骨细胞的共同前体)产生。一旦投入到脂肪细胞谱系，前脂肪细胞就在分化过程的晚期阶段成熟为脂肪细胞。

因此，两个不同相存在于脂肪生成，i)在胚状体形成后2-5天之间，此阶段需要视黄酸，并且为ES细胞衍生的脂肪生成的投入(committal)阶段，和ii)相当于最终分化阶段。此后一阶段需要生脂因子PPARγ。已用前脂肪细胞系(如，3T3L1和3T3F442A)研究与脂肪生成的晚期阶段相关的机制，从而识别和分离数个脂肪细胞特异性基因。

因此，脂肪生成的早期阶段为视黄酸依赖性，而晚期阶段为PPARγ依赖性。

在早期暴露于视黄酸，随后施加经典的脂肪形成诱导剂后，可产生从ES细胞衍生的脂肪细胞。在这些条件下，在70-80％胚状体中存在成熟脂肪细胞大群集。视黄酸以时间和浓度依赖性方式影响ES细胞分化的模式。在脂肪细胞分化期间，视黄酸处理刺激ES细胞早期投入到脂肪细胞，但在前脂肪细胞成熟的晚期阶段作为抑制剂。此晚期抑制作用是由于视黄酸对重要脂肪细胞转录调节剂基因PPARδ和C/EBP的表达的阻抑物作用(Shao，D.和Lazar，M.A.，1997，J.Biol.Chem.，272，21473-21478)。

ERK信号传导似乎对脂肪生成重要，因为ES细胞与视黄酸和PD980599(ERK途径的特异性抑制剂)的共处理阻止脂肪细胞生成。施加PD98059对ES细胞分化成神经元或心肌细胞没有作用(Bost F.等，2002Biochem J.，361，621-627)。

胚胎干细胞体外分化成脂肪细胞

小鼠胚胎干细胞系ZIN40、E14TG2a和CGR8由Dani C等，(1997)J.Cell Sci 110，1279-1285用于产生脂肪细胞。简要地讲，此过程包括在无喂养剂条件下在明胶涂覆的板上在培养基(含有0.25％碳酸氢钠、x1MEM必需氨基酸、2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸盐、100μM巯基乙醇和10％v/v胎牛血清的MEM/BHK21培养基)中培养未分化细胞系。加入白血病抑制因子(100单位/ml)，以抑制分化。为了使ES细胞分化成脂肪细胞，作为在胚状体中的集合体培养细胞。各悬挂滴在20μl培养基中含有1,000个细胞。将这些在用PBS填充的细菌学板的盖上保持2天。使形成的胚状体重新悬浮于补加视黄酸(0.1％v/v)的培养基，并保持在细菌板盖上。将胚状体保持数天，然后使之沉降到重新悬浮于分化培养基的明胶涂覆板上，所述分化培养基由补加85nM胰岛素、2nM三碘甲腺原氨酸和10％胎牛血清的培养基组成。

在10-15天后，出现充满脂质滴的细胞群集。这些可用油红O(oilred O)(甘油三酯的特异性染色剂)染色。结果表明，通过脂肪形成标记降脂蛋白(adipsin)和PPARγ表达测定，60％胚状体形成脂肪细胞阳性集落。

Dani，C.等，(1997)，J.Cell Sci.，110，1279-1285方法的修改由Rosen，E.D.等，(1999)，Molecular Cell，4，611-617在从对照和PPARγ缺陷大鼠衍生的ES细胞(2天年龄)的分化期间利用。实际的修改方案简要包括从在含有视黄酸的培养基中培养的胚胎干细胞产生胚状体。然后，将胚状体转移到明胶涂覆的六孔板，并暴露于5μg/ml胰岛素。在第17天，使胚状体暴露于地塞米松(400ng/ml)和PDE抑制剂甲基异丁基黄嘌呤(500nM)经历2天。随后，使胚状体重新悬浮于含有胰岛素的培养基另外经历10天。通过中性脂质的油红O染色测定，此方案导致胚状体中70-90％的细胞表达脂肪细胞表现型。在分化过程引发后4天，野生型ES细胞表达早期标记降脂蛋白和PPARγ。

小鼠胚胎干细胞和人成体干细胞分化成脂肪细胞的全面指导描述于Wdziekonski B，Villageois P和Dani(2007)Curr.Protoc.Cell Biol.第23章：第23.4单元。这包括小鼠、人多能脂肪衍生和人间质干细胞分化所需的方案。

脂肪生成的抑制剂

[1]抑制ERK信号传导

胞外信号调节激酶(ERK)涉及调节一些细胞功能(如细胞增殖和分化)的信号级联。PPARγ的Erk介导磷酸化明显抑制脂肪生成。PD98059为MEK1(负责ERK激活的酶)的特异性抑制剂。用视黄酸和PD68059分化ES细胞的共处理防止ES细胞中脂肪细胞形成和脂肪形成标记的表达两者(Bost F.等，2002，Biochme J.，361，621-627)。

[2]HIV蛋白酶抑制剂

利用HIV蛋白酶抑制剂的疗法与脂肪代谢变化相关。Lenhard，J.M.等，(2000)，Antiviral Res.，47，121-129研究这些抑制剂对使用C3H10T1/2间质干细胞的脂肪细胞分化的影响。在这些细胞中，脂肪生成分别通过加入200nM胰岛素和1μM PPARγ和RXR激动剂BRL49653和LGD1069诱导。

在这些条件下，通过脂肪生成减少、油红O染色和脂肪细胞标记AP2和LPL表达测定，HIV蛋白酶抑制剂奈非那韦、沙奎那韦和利托那韦，减小间质干细胞的脂肪细胞分化。

Vernochet，C.等(2003)，AIDS，17，2177-2180扩展此研究，并评价相似范围HIV蛋白酶抑制剂对四个小鼠前脂肪细胞细胞系(3T3-F442A，3T3-L1，Ob1771和胚胎干细胞)的脂肪细胞分化的作用。分化的方法类似于Dani，C.等(1997)，J.Cell Sci.，110，1279-1285所述。

蛋白酶抑制剂奈非那韦、洛匹那韦，抑制试验的所有细胞中的脂肪细胞分化，而茚地那韦、沙奎那韦和利托那韦只抑制3T3-L1和3T3-F442A细胞的分化。作者得出结论，HIV蛋白酶抑制剂根据使用的细胞模型系统抑制脂肪细胞分化。

[3]糖原合成酶激酶3抑制剂

还没有完全表征涉及干细胞投入到脂肪形成途径的信号传导事件。最近，Mointeiro，M.C.等，(2009)，Stem Cells Dev.，18，457-463使用小鼠胚胎干细胞和视黄酸的早期处理而展示，视黄酸受体的激活对ES细胞投入到脂肪细胞分化是充分和必要的。作者也证明，在ES细胞中视黄酸受体β诱导的脂肪生成可通过GSK3抑制剂废止。

在祖干细胞分化期间，可监测抑制剂(和化学物质、药物或化妆品)(如上所述的HIV蛋白酶抑制剂等)对脂肪细胞发育的作用。使祖细胞暴露于抑制剂，并通过监测分化的程度评价对细胞发育过程的作用。这可通过比如定量免疫细胞化学的技术来测量与分化的细胞类型相关的细胞/组织特异性标记的表达而完成。

指示脂肪细胞发育的标记包括下列(也描述购自Abcam Inc.的抗体的来源)。

脂肪细胞-早期标记

C20orf3(抗体ab69162)-涉及脂肪细胞分化。

FNDC3B(抗体ab69854)-脂肪生成的阳性调节剂

脂连素(抗体19F1，ab22554)-脂肪细胞在脂肪细胞分化期间产生和分泌脂连素。

NOC3L(抗体ab74151)-作为脂肪细胞分化加速因子。

AE结合蛋白1(抗体ab54820)-脂肪细胞增强子结合蛋白1，结合到脂肪细胞增强子1调节序列的转录阻抑物。

PPARα(抗体ab8934)、γ(抗体ab12409)和δ(抗体ab23673)-相信均涉及脂肪细胞分化。

CEBPα(抗体EP708Y，ab40761)和β(抗体A16ab18336-重要的脂肪细胞转录调节基因。

降脂蛋白/因子D(抗体ab8841)-脂肪细胞特异性

脂肪细胞-晚期标记

瘦素(抗体ab3583)-脂肪细胞产生并分泌瘦素。

脂蛋白脂肪酶(抗体LPL.A4，ab21356)-由脂肪细胞产生并分泌。

AEBP2(抗体2012C4a，ab74517)-AE(脂肪细胞增强子)结合蛋白2。

FABP4(抗体ab37458)-发现于脂肪细胞的主要脂肪酸结合蛋白。

FABP5(抗体ab37267)-脂肪酸结合蛋白FABP-4FABP5密切相关和在脂肪细胞中表达。

PDE3B(抗体ab42091)-在脂肪细胞组织中表达。

KIAA1881(抗体ab78602)-涉及三酰基甘油包入脂肪细胞。

抵抗素(抗体ab3423)-脂肪细胞分泌的因子，为脂肪细胞特异性分泌的细胞因子。

围脂滴蛋白A(抗体ab61682)-只发现于脂肪细胞和类固醇生成细胞中脂质滴的表面。

围脂滴蛋白B(抗体ab3527)-表达限于脂肪细胞和类固醇生成细胞。

葡萄糖转运蛋白GLUT4(抗体ab654)-在脂肪组织中由胰岛素刺激葡萄糖摄取需要GLUT4胞内部位易位到细胞表面。

TUG(抗体4A11A6G11，ab32007)-调节GLUT4分布的假定系链(tether)。

甘油3磷酸酯脱氢酶抗体(ab34492)-通过最终分化脂肪细胞表达。

检测和定量

细胞成像

使用细胞成像仪(例如，IN细胞分析仪，GE Healthcare)以多重模式，可检测系链到不同特异性抗体的不同荧光素(例如，菁染料，GEHealthcare)。由于ES沿着特定途径经历分化，这些荧光素用于检测和测量数种目标分子。因此，可使用定量免疫细胞化学用仪器检测毒性化学物质对来自相同样品的最多三种不同标记的作用，因此能够建立化学物质的毒性分布。另外，在此文献中所述的方法具有用本领域技术人员公知的技术(例如，定量免疫细胞化学、报道基因测定或RT-PCT和微阵列分析)在早期和晚期胚胎干细胞选择性生物标记之间区分的另外的特征。

由于祖细胞经历分化，这些报道基因可同时检测和测量不仅在分化的细胞类型而且在初始祖细胞中存在的数种细胞/组织特异性分子。另外，产生定量数据(无论衍生自免疫细胞化学还是基因报道测定等)的能力可允许测定亚致死剂量水平。这可对药物开发或化妆品工业有重要价值。

虽然已根据不同方面和优选实施方案描述了本发明，但应了解，本发明的范围不应认为只限于此，并且申请人的意向是其所有变体及等价也落在附加权利要求的范围内。

Claims (19)

1.一种预测化学物质对样品中发育途径的毒性的方法，所述方法包含以下步骤：

(i)用一种作用剂处理样品中的未分化干细胞的对照群体，以在第一发育途径中产生分化细胞的第一对照群体；

(ii)测量在所述未分化干细胞的对照群体和/或所述分化细胞的第一对照群体中表达的至少两种生物标记的水平，以测定表达的对照水平，其中至少一种所述生物标记在发育途径和/或分化的早期阶段表达，并且至少一种生物标记在发育途径和/或分化的晚期阶段表达；

(iii)在用所述作用剂处理之前或之后，使所述样品中的未分化干细胞的试验群体暴露于化学物质，以在第一发育途径中产生分化细胞的第一试验群体；

(iv)测量所述未分化干细胞的试验群体和/或所述分化细胞的第一试验群体中的所述至少两种生物标记的水平，以测定表达的试验水平；并且

(v)将所述表达的对照水平与所述表达的试验水平比较，

其中在暴露于所述化学物质后表达水平的差异指示化学物质对所述发育途径的毒性。

2.权利要求1的方法，其中步骤(i)包含以下步骤：

用一种作用剂处理未分化干细胞的群体，以在第n发育途径中产生分化细胞的第n群体；

并且

重复步骤(ii)至(v)，以测定所述第n群体中表达的对照水平与表达的试验水平的差异，

其中在暴露于化学物质后表达水平的差异指示化学物质对所述第n发育途径的毒性。

3.权利要求2的方法，其中所述第一和所述第n发育途径为网络化发育途径。

4.权利要求1的方法，其中步骤(i)包含以下步骤：

用一种作用剂处理未分化干细胞的群体，以在多个发育途径中产生多个分化细胞的群体；

并且

重复步骤(ii)至(v)，以测定所述多个群体中表达的对照水平与表达的试验水平的差异，

其中在暴露于化学物质后表达水平的差异指示化学物质对所述多个发育途径的毒性。

5.权利要求4的方法，其中所述多个发育途径为网络化发育途径。

6.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述干细胞为多能干细胞。

7.权利要求6的方法，其中所述多能干细胞为胚胎干细胞。

8.权利要求7的方法，其中多能干细胞为经诱导的多能干细胞。

9.权利要求7的方法，其中多能干细胞为原始生殖细胞。

10.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述干细胞为成体干细胞。

11.权利要求1至10中任一项的方法，其中干细胞为人干细胞。

12.权利要求1至11的方法，其中未分化干细胞包含可操作连接到至少两种或更多种生物标记的不同报道基因，两种或更多种生物标记的水平通过测量不同基因产物定量。

13.权利要求12的方法，其中所述报道基因选自硝基还原酶、β-半乳糖苷酶、β-内酰胺酶、荧光素酶和荧光蛋白报道基因。

14.权利要求1到13的方法，其中通过选自定量RT-PCR、定量免疫细胞化学、表面等离子共振和微阵列分析的方法将两种或更多种生物标记的水平定量。

15.前述权利要求中任一项的方法，所述方法另外包含在步骤(iii)后测定细胞增殖。

16.前述权利要求中任一项的方法，其中方法为多重方法。

17.一种用任何前述权利要求的方法预测人胎儿发育期间细胞生物图或发育途径变化的方法。

18.一种进行任何前述权利要求的方法的试剂盒，所述试剂盒包含用于将至少两种生物标记定量的装置和用于进行所述方法的说明书。

19.权利要求18的试剂盒，其中所述装置选自抗体、酶底物和寡核苷酸引物。

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