CN110850070A - 一种基于荧光标记转基因动物模型评价化学物质生殖发育毒性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于荧光标记转基因动物模型评价化学物质生殖发育毒性的方法，包括以下步骤：首先对受试动物进行荧光蛋白标记；然后将标记的受试动物用待测化学物质进行染毒；最后利用荧光成像技术评价化学物质对受试动物的组织发育和/或早期胚胎着床和/或体外培养胚胎发育毒性。该方法具有实时动态跟踪、结果直观可靠、实验周期短、操作简单、灵敏度高等优势。

Description

一种基于荧光标记转基因动物模型评价化学物质生殖发育毒 性的方法
技术领域
本发明涉及化学物质毒性评价技术领域，特别是涉及一种基于荧光标记转基因动物模型评价化学物质生殖发育毒性的方法。
背景技术
近年来，随着越来越多化合物的人工合成和使用量的增加，其在环境中的归宿及对生态系统和人类健康可能产生的危害都开始受到人们广泛的关注。其中许多化合物，如农药、商业化学品和环境污染物等，能够干扰内分泌系统的正常功能，具有内分泌干扰作用，称为内分泌干扰物(Endocrine Disruptor Chemicals，EDCs)。它们能够模拟或拮抗机体内源激素作用，改变天然激素的合成和代谢模式，破坏机体内环境稳态，造成内分泌失调。研究表明，长期职业性或环境性接触这些外源物质会危害机体生长发育，影响生殖功能，导致不良妊娠结局、不孕不育、后代畸形及肿瘤等的发生。因此，研究这些外源性化合物暴露对生物体所产生的潜在毒性效应及其作用机理，并对公众健康或生态安全建立有效的风险评价成为重中之重。
鉴于内分泌干扰物存在的广泛性和作用的危害性，建立有效的评价方法是当务之急。根据美国EPA的内分泌干扰物筛选程序(Endocrine Disruptor Screening Program，EDSP)，这些化合物的内分泌干扰活性主要影响机体雌激素、雄激素和甲状腺系统。目前已有一些成熟的评价方法，传统的体内(In Vivo)动物筛选实验通过整体动物实验来评估物质的内分泌干扰效应，目前已建立了鱼类、两栖类、鸟类和哺乳类等动物模型。啮齿类实验动物包括小鼠、大鼠、豚鼠等品种，其体型较小，便于操作，遗传背景清晰，且饲养繁殖方便，现已广泛应用于化学物质内分泌干扰作用研究。如测定环境污染物雌激素效应的小鼠子宫增重实验(Uterotrophic Assay)、测定环境污染物雄激素效应的大鼠Hershberger试验、幼龄/环青春期雌性大鼠青春期发育及甲状腺功能试验、以及小鼠致畸试验等。这些体内实验方法需要在不同的时间点处死实验动物以获得特定时间点的数据，从而整合得到多个时间点的实验结果。
活体动物成像技术是指应用影像学方法，对活体状态下的生物过程进行组织、细胞和分子水平的定性和定量研究的技术。活体动物荧光成像技术则是采用荧光报告基因(如GFP、EGFP、RFP)或Cyt及dyes等荧光染料进行标记，通过外界激发光源的激发捕捉荧光蛋白或染料产生的荧光信号。活体动物荧光成像技术可追踪并检测标记细胞及标记基因在体内的活动及表达，与超声、计算机断层摄影、核磁共振等传统活体成像技术相比，具有操作简便、结果直观、灵敏度高、检测快速等优点。增强型绿色荧光蛋白(Enhanced GreenFluorescent Protein，EGFP)等荧光标记转基因鼠具备荧光的示踪特性，是肿瘤等研究中重要的工具鼠。利用光学标记的转基因动物模型可针对同一组实验对象跟踪记录标记细胞或组织不同时间内在活体动物体内的变化，直观地显示测试物质对生物体的毒理学作用信息。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种基于荧光标记转基因动物模型评价化学物质生殖发育毒性的方法。
本发明所采用的技术方案是：
一种基于荧光标记转基因动物模型评价化学物质生殖发育毒性的方法，包括以下步骤：
(1)对受试动物进行荧光蛋白标记；
(2)将标记的受试动物用待测化学物质进行染毒；
(3)利用荧光成像技术评价化学物质对受试动物的组织发育和/或早期胚胎着床和/或体外培养胚胎发育毒性。
进一步地，步骤(1)中荧光蛋白标记包括绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白标记。
进一步地，步骤(1)中受试动物优选转基因小鼠和大鼠。
进一步地，步骤(2)中标记的受试动物优选绿色荧光转基因小鼠品系：C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)C14-Y01-FM131Osb、C57BL/6J-TgN(CAG-EGFP-1)ZLFILAS、C57BL/6J-TgN(CAG-EGFP-2)ZLFILAS、C57BL/6J-TgN(CAG-EGFP-3)ZLFILAS、C57BL 6-Tg(ACTB-EGFP)1OsbJ、C57BL/6J-TgN(Chicken-β-actin-LUC)ZLFILAS、Stock-Tg(CAG-EGFP)/nju；红色荧光转基因小鼠品系：C57BL/6J-TgN(CAG-DsRed-1)ZLFILAS、C57BL/6J-TgN(CAG-DsRed-2)ZLFILAS；以及绿色荧光转基因大鼠品系：SD-Tg(CAG-EGFP)。
进一步地，步骤(2)中待测化学物质包括双酚类、烷基苯酚类、对烷氧基酚类、尼泊金酯类、联苯类、联苯醚类、有机磷类、卤素类化合物。
进一步地，步骤(3)中对受试动物的组织发育毒性评价方法包括：将标记的青春期雌性动物模型分组进行染毒，利用荧光成像技术观察不同处理组离体器官冰冻切片的单位荧光强度差异。
进一步地，步骤(3)中对受试动物的组织发育毒性评价方法还包括：利用实时荧光定量PCR检测标记基因的表达水平，同时体外培养受试动物的组织细胞进行毒性测试。
更进一步地，上述毒性测试包括细胞增殖测试和细胞活力测定，计数染毒前后细胞的数量和活力，采用统计学方法分析染毒前后细胞的增殖和活力差异。
需要说明的是，所述荧光定量PCR检测标记基因的表达水平时以GAPDH、β-Actin为内参，计算处理组中标记基因的表达量。以对照组中标记基因的表达量为参照，计算处理组中标记基因的相对表达量，采用统计学方法分析染毒前后标记基因的表达差异。
进一步地，步骤(3)中对受试动物的早期胚胎着床毒性评价方法包括：将标记的雄性纯合子性成熟动物模型与正常的雌性性成熟动物模型分组进行染毒，染毒过程中进行合笼处理，于雌性受试动物妊娠期间利用活体荧光成像技术观察待测物质对胚胎着床的影响。
需要说明的是，上述观察结果包括胚胎着床率。
进一步地，步骤(3)中对受试动物的体外培养胚胎发育毒性评价方法包括：将标记的雄性纯合子性成熟动物模型与正常的雌性性成熟动物先进行合笼交配繁殖，于孕中安乐死受试动物，在荧光体视显微镜下收集发育至中晚期的囊胚，体外培养获得带荧光标记的胚胎；将胚胎分组进行染毒，利用荧光成像技术观察待测物质对体外培养胚胎发育的影响。
更进一步地，上述合笼处理时受试动物雌：雄＝1:1或2:1，优选雌：雄＝2:1。
需要说明的是，上述观察结果包括胚胎发育情况，如胚胎生长状况、致畸率和致死率。
所述步骤(3)检测物质的拟雌激素活性对受试动物的组织发育和/或早期胚胎着床和/或体外培养胚胎发育毒性时，阳性对照组为雌二醇，所述浓度为400μg/Kg BW/d；检测物质的抗雌激素活性对受试动物的组织发育和/或早期胚胎着床和/或体外培养胚胎发育毒性时，阳性对照组为雌二醇联合氟维司群，所述雌二醇浓度为400μg/Kg BW/d，所述氟维司群浓度为10mg/Kg BW/d；检测物质的拟雄激素活性对受试动物的组织发育和/或早期胚胎着床和/或体外培养胚胎发育毒性时，阳性对照组为R1881，所述R1881浓度为400μg/KgBW/d；检测物质的抗雄激素活性对受试动物的组织发育和/或早期胚胎着床和/或体外培养胚胎发育毒性时，阳性对照组为R1881联合氟他胺，所述R1881浓度为400μg/Kg BW/d，所述氟他胺浓度为10mg/Kg BW/d。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)实时动态跟踪：荧光报告蛋白在荧光显微镜不同波长的激发下，可发出相应的荧光，发挥其在活细胞内的示踪作用。利用荧光蛋白嵌合体动物模型，可直接在荧光显微镜下透过皮肤见到高强度荧光，达到在活体水平上对动物组织或胚胎进行直接观察和定量分析的目的，避免了传统实验需处死动物以获得组织或胚胎的缺点。
(2)结果直观可靠：传统的体内动物实验方法需要在不同的时间点处死实验动物以获得数据，从而整合得到多个时间点的实验结果。相比之下，利用荧光成像技术可在不同时间点对同一组实验对象进行实时记录，记录同一观察目标的生理变化，所得数据也更加真实可信。
(3)操作简单，灵敏度高。传统的体内动物实验方法需首先引进或建立可以表征化学物质生殖和发育毒性的动物品系，然后通过动物繁殖发育实验，结合相关标记蛋白的表达测定、mRNA定量表达验证等，最终形成整套的物质毒性评价体系，其实验周期长，过程繁琐。而利用荧光标记转基因动物模型的组织细胞可实时直观地显示测试物质对生物体的毒理学作用信息，实验周期短，实验操作简单，所得结果可靠、灵敏度更高。
附图说明
图1为荧光体视显微镜下孕12d的雌性小鼠，可见绿色荧光蛋白标记的小鼠胚胎；
具体实施方式
下面结合附图对本发明进一步说明。
实施例1：利用转基因EGFP小鼠检测双酚A的组织发育毒性
将利用荧光蛋白标记的青春期雌性Stock-Tg(CAG-EGFP)/nju小鼠分组进行染毒，利用荧光成像技术观察离体子宫冰冻切片的荧光强度，利用实时荧光定量PCR检测标记基因的表达水平，同时体外培养子宫内膜细胞进行毒性测试。结果表明，双酚A染毒后小鼠子宫膨大，并有严重的充血和水肿，ER受体表达量增高。可见双酚A暴露可引发子宫系数发生变化，影响小鼠生殖发育。
实施例2：利用转基因EGFP小鼠检测双酚芴对早期胚胎着床的影响
采用腹腔注射法，根据前期预实验，将25只利用绿色荧光蛋白标记的雄性性成熟Stock-Tg(CAG-EGFP)/nju小鼠与50只正常的雌性性成熟C57BL/6小鼠分组进行染毒，染毒过程中按雌：雄＝2:1进行合笼处理。于母鼠妊娠期间利用活体荧光成像技术观察双酚芴对胚胎着床的影响，附图1为荧光体视显微镜下孕12d的雌性小鼠，可见绿色荧光蛋白标记的小鼠胚胎。结果表明，双酚芴染毒后小鼠胚胎着床数量减少，且中、高剂量组减少明显，具有统计学意义。双酚芴表现出抗雌激素样作用，扰乱了子宫内环境，从而干扰了胚胎着床，下降胚胎着床数。
实施例3：利用转基因EGFP小鼠检测他莫昔芬对体外培养胚胎的发育毒性
根据前期预实验，将25只利用绿色荧光蛋白标记的雄性性成熟Stock-Tg(CAG-EGFP)/nju小鼠与50只正常的雌性性成熟C57BL/6小鼠按雌：雄＝2:1进行合笼处理，于孕5d用CO2安乐死小鼠，75％酒精常规消毒，剪取双侧子宫。用1mL注射器吸取DMEM/F12培养基冲洗子宫腔，在荧光体视显微镜下收集发育至中晚期的囊胚。将其置于37℃，5％CO2培养箱内培养，每隔24h换液，获得带荧光标记的胚胎。将胚胎分组进行染毒，利用荧光成像技术观察他莫昔芬对体外培养胚胎发育的影响。结果表明，他莫昔芬染毒后小鼠胚胎发育迟滞，且中、高剂量组发育减缓明显，具有统计学意义。

Claims (10)

1.一种基于荧光标记转基因动物模型评价化学物质生殖发育毒性的方法，包括以下步骤：
(1)对受试动物进行荧光蛋白标记；
(2)将标记的受试动物用待测化学物质进行染毒；
(3)利用荧光成像技术评价化学物质对受试动物的组织发育和/或早期胚胎着床和/或体外培养胚胎发育毒性。
2.如权利要求1所述一种基于荧光标记转基因动物模型评价化学物质生殖发育毒性的方法，其特征在于，步骤(1)中荧光蛋白标记选自绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白标记。
3.如权利要求1所述一种基于荧光标记转基因动物模型评价化学物质生殖发育毒性的方法，其特征在于，受试动物选自转基因小鼠或大鼠。
4.如权利要求3所述一种基于荧光标记转基因动物模型评价化学物质生殖发育毒性的方法，其特征在于，标记的受试动物选自绿色荧光转基因小鼠品系：C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)C14-Y01-FM131Osb、
C57BL/6J-TgN(CAG-EGFP-1)ZLFILAS、C57BL/6J-TgN(CAG-EGFP-2)ZLFILAS、C57BL/6J-TgN(CAG-EGFP-3)ZLFILAS、C57BL 6-Tg(ACTB-EGFP)1OsbJ、C57BL/6J-TgN(Chicken-β-actin-LUC)ZLFILAS、Stock-Tg(CAG-EGFP)/nju；或者红色荧光转基因小鼠品系：C57BL/6J-TgN(CAG-DsRed-1)ZLFILAS、C57BL/6J-TgN(CAG-DsRed-2)ZLFILAS；或者绿色荧光转基因大鼠品系：
SD-Tg(CAG-EGFP)。
5.如权利要求1所述一种基于荧光标记转基因动物模型评价化学物质生殖发育毒性的方法，其特征在于，待测化学物质包括双酚类、烷基苯酚类、对烷氧基酚类、尼泊金酯类、联苯类、联苯醚类、有机磷类或卤素类化合物。
6.如权利要求1所述一种基于荧光标记转基因动物模型评价化学物质生殖发育毒性的方法，其特征在于，步骤(3)中对受试动物的组织发育毒性评价方法包括：将标记的青春期雌性动物模型分组进行染毒，利用荧光成像技术观察不同处理组离体器官冰冻切片的单位荧光强度差异。
7.如权利要求6所述一种基于荧光标记转基因动物模型评价化学物质生殖发育毒性的方法，其特征在于，步骤(3)对受试动物的组织发育毒性评价方法还包括：利用实时荧光定量PCR检测标记基因的表达水平，同时体外培养受试动物的组织细胞进行毒性测试。
8.如权利要求1所述一种基于荧光标记转基因动物模型评价化学物质生殖发育毒性的方法，其特征在于，步骤(3)中对受试动物的早期胚胎着床毒性评价方法包括：将标记的雄性纯合子性成熟动物模型与正常的雌性性成熟动物模型分组进行染毒，染毒过程中进行合笼处理，于雌性受试动物妊娠期间利用活体荧光成像技术观察待测物质对胚胎着床的影响。
9.如权利要求1所述一种基于荧光标记转基因动物模型评价化学物质生殖发育毒性的方法，其特征在于，步骤(3)中对受试动物的体外培养胚胎发育毒性评价方法包括：将标记的雄性纯合子性成熟动物模型与正常的雌性性成熟动物先进行合笼交配繁殖，于孕中安乐死受试动物，在荧光体视显微镜下收集发育至中晚期的囊胚，体外培养获得带荧光标记的胚胎；将胚胎分组进行染毒，利用荧光成像技术观察待测物质对体外培养胚胎发育的影响。
10.如权利要求8或9所述一种基于荧光标记转基因动物模型评价化学物质生殖发育毒性的方法，其特征在于，合笼处理时受试动物雌：雄＝1:1或2:1。
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