CN109923124A - 用于人肝细胞异种移植的遗传修饰小鼠模型 - Google Patents
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Abstract
本发明的一个或多个实施方式包括免疫缺陷小鼠，其被遗传修饰以包含编码人α‑1抗胰蛋白酶(AAT)的PiZ变体(Glu342Lys)的基因，其中所述小鼠表达所述人α‑1抗胰蛋白酶的PiZ变体(Z‑AAT)，并且具有与不表达Z‑AAT的相同类型的免疫缺陷小鼠相比数量减少的小鼠肝细胞。被遗传修饰以包含编码人AAT的PiZ变体的基因的免疫缺陷小鼠可以是遗传修饰的NSG、NRG或NOG小鼠。所述免疫缺陷小鼠可以进一步包含异种肝细胞，例如人肝细胞。可以在根据本公开的方面提供的小鼠中评估人肝脏疾病的推定治疗。
Description
相关申请的引用
本申请要求均于2016年10月27日提交的美国临时专利申请序列号62/413,736和62/413,743的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
政府支持
本发明是在国立卫生研究院授予的拨款号1R24OD018259-01、1R01DK098252-01、1P01HL131471-01、1P01HL131471-01和CA034196的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
技术领域
本公开一般涉及小鼠模型。更具体地，本公开涉及可接受人肝细胞异种移植的转基因小鼠模型。
背景技术
动物模型通常用于实验室研究以模拟、模仿或告知研究人员人类生物活动和疾病。一直需要人肝功能和疾病的小鼠模型。
发明内容
根据本公开的方面，提供了一种免疫缺陷小鼠，其被遗传修饰以包含编码人α-1抗胰蛋白酶(AAT)的PiZ变体(Glu342Lys)的基因，其中所述小鼠表达人α-1抗胰蛋白酶的PiZ变体(Z-AAT)，其中所述小鼠具有与不表达Z-AAT的相同类型的免疫缺陷小鼠相比数量减少的小鼠肝细胞。
根据本公开的方面，提供了一种免疫缺陷的NSG、NRG或NOG小鼠，其被遗传修饰以包含编码人α-1抗胰蛋白酶(AAT)的PiZ变体(Glu342Lys)的基因，其中所述小鼠表达人α-1抗胰蛋白酶的PiZ变体(Z-AAT)，并且其中所述小鼠具有与不表达Z-AAT的相同类型的免疫缺陷小鼠相比数量减少的小鼠肝细胞。
根据本公开的方面，提供了一种免疫缺陷小鼠，其被遗传修饰以包含编码人α-1抗胰蛋白酶(AAT)的PiZ变体(Glu342Lys)的基因，其中所述小鼠在肝细胞中表达人α-1抗胰蛋白酶的PiZ变体(Z-AAT)，并且其中所述小鼠具有与不表达Z-AAT的相同类型的免疫缺陷小鼠相比数量减少的小鼠肝细胞。
根据本公开的方面，提供了一种免疫缺陷的NSG、NRG或NOG小鼠，其被遗传修饰以包含编码人α-1抗胰蛋白酶(AAT)的PiZ变体(Glu342Lys)的基因，其中所述小鼠在肝细胞中表达人α-1抗胰蛋白酶的PiZ变体(Z-AAT)，并且其中所述小鼠具有与不表达Z-AAT的相同类型的免疫缺陷小鼠相比数量减少的小鼠肝细胞。
根据本公开的方面，提供了一种免疫缺陷小鼠，其被遗传修饰以包含编码人α-1抗胰蛋白酶(AAT)的PiZ变体(Glu342Lys)的基因，其中所述小鼠表达人α-1抗胰蛋白酶的PiZ变体(Z-AAT)，其中所述小鼠具有与不表达Z-AAT的相同类型的免疫缺陷小鼠相比数量减少的小鼠肝细胞，并且其中所述小鼠包含含有肝细胞的异种移植物或同种异体移植物。任选地，所述肝细胞是人肝细胞，并且在另一个选项中，所述人肝细胞表达人血清白蛋白。根据本公开的方面，所述人血清白蛋白在所述小鼠的血液中是可检测的，并且根据特定的方面，至少约0.01mg/mL的人血清白蛋白存在于所述小鼠的血清中。根据方面，本公开的免疫缺陷小鼠的至少约25％的肝细胞是移植的人肝细胞。根据本公开的方面，包含的人肝细胞表达野生型人AAT，和任选地，存在于所述小鼠的血清中的至少约100μg/mL野生型人AAT。在另一种选项中，所述异种移植物或同种异体移植物的肝细胞是基因组编辑的肝细胞。
根据本公开的方面，提供了一种免疫缺陷的NSG、NRG或NOG小鼠，其被遗传修饰以包含编码人α-1抗胰蛋白酶(AAT)的PiZ变体(Glu342Lys)的基因，其中所述小鼠表达人α-1抗胰蛋白酶的PiZ变体(Z-AAT)，其中所述小鼠具有与不表达Z-AAT的相同类型的免疫缺陷小鼠相比数量减少的小鼠肝细胞，并且其中所述小鼠包含含有肝细胞的异种移植物或同种异体移植物。任选地，所述肝细胞是人肝细胞，并且在另一种选项中，所述人肝细胞表达人血清白蛋白。根据本公开的方面，所述人血清白蛋白在所述小鼠的血液中是可检测的，并且根据特定的方面，至少约0.01mg/mL的人血清白蛋白存在于所述小鼠的血清中。根据方面，本公开的免疫缺陷小鼠的至少约25％的肝细胞是移植的人肝细胞。根据本公开的方面，包含的人肝细胞表达野生型人AAT，和任选地，存在于所述小鼠的血清中的至少约100μg/mL野生型人AAT。在另一种选项中，所述异种移植物或同种异体移植物的肝细胞是基因组编辑的肝细胞。
根据本公开的方面，提供了一种免疫缺陷小鼠，其被遗传修饰以包含编码人α-1抗胰蛋白酶(AAT)的PiZ变体(Glu342Lys)的基因，其中所述小鼠在肝细胞中表达人α-1抗胰蛋白酶的PiZ变体(Z-AAT)，其中所述小鼠具有与不表达Z-AAT的相同类型的免疫缺陷小鼠相比数量减少的小鼠肝细胞，并且其中所述小鼠包含含有肝细胞的异种移植物或同种异体移植物。任选地，所述肝细胞是人肝细胞，并且在另一种选项中，所述人肝细胞表达人血清白蛋白。根据本公开的方面，所述人血清白蛋白在所述小鼠的血液中是可检测的，并且根据特定的方面，至少约0.01mg/mL的人血清白蛋白存在于所述小鼠的血清中。根据方面，本公开的免疫缺陷小鼠的至少约25％的肝细胞是移植的人肝细胞。根据本公开的方面，包含的人肝细胞表达野生型人AAT，和任选地，存在于所述小鼠的血清中的至少约100μg/mL野生型人AAT。在另一种选项中，所述异种移植物或同种异体移植物的肝细胞是基因组编辑的肝细胞。
根据本公开的方面，提供了一种免疫缺陷的NSG、NRG或NOG小鼠，其被遗传修饰以包含编码人α-1抗胰蛋白酶(AAT)的PiZ变体(Glu342Lys)的基因，其中所述小鼠在肝细胞中表达人α-1抗胰蛋白酶的PiZ变体(Z-AAT)，其中所述小鼠具有与不表达Z-AAT的相同类型的免疫缺陷小鼠相比数量减少的小鼠肝细胞，并且其中所述小鼠包含含有肝细胞的异种移植物或同种异体移植物。任选地，所述肝细胞是人肝细胞，并且在另一种选项中，所述人肝细胞表达人血清白蛋白。根据本公开的方面，所述人血清白蛋白在所述小鼠的血液中是可检测的，并且根据特定的方面，至少约0.01mg/mL的人血清白蛋白存在于所述小鼠的血清中。根据方面，本公开的免疫缺陷小鼠的至少约25％的肝细胞是移植的人肝细胞。根据本公开的方面，包含的人肝细胞表达野生型人AAT，和任选地，存在于所述小鼠的血清中的至少约100μg/mL野生型人AAT。在另一种选项中，所述异种移植物或同种异体移植物的肝细胞是基因组编辑的肝细胞。
根据本公开的方面提供了一种制备包含移植的外源性肝细胞的遗传修饰的免疫缺陷小鼠的方法，其包括提供免疫缺陷小鼠，所述免疫缺陷小鼠被遗传修饰以包含编码人α-1抗胰蛋白酶(AAT)的PiZ变体(Glu342Lys)的基因，其中所述小鼠表达人α-1抗胰蛋白酶的PiZ变体(Z-AAT)，其中所述小鼠具有与不表达Z-AAT的相同类型的免疫缺陷小鼠相比数量减少的小鼠肝细胞；和施用人或同种异体肝细胞至所述小鼠。任选地，所述人或同种异体肝细胞是原代肝细胞。施用人或同种异体肝细胞至本公开的遗传修饰的免疫缺陷小鼠任选地包括注射所述肝细胞。施用人或同种异体肝细胞至本公开的遗传修饰的免疫缺陷小鼠包括脾内施用所述肝细胞。所述施用的肝细胞任选地表达标志蛋白，例如绿色荧光蛋白或其荧光类似物。
根据本公开的方面提供了一种制备包含移植的外源性肝细胞的遗传修饰的免疫缺陷小鼠的方法，其包括提供免疫缺陷的NSG、NRG或NOG小鼠，所述免疫缺陷小鼠被遗传修饰以包含编码人α-1抗胰蛋白酶(AAT)的PiZ变体(Glu342Lys)的基因，其中所述小鼠表达人α-1抗胰蛋白酶的PiZ变体(Z-AAT)，其中所述小鼠具有与不表达Z-AAT的相同类型的免疫缺陷小鼠相比数量减少的小鼠肝细胞；和施用人或同种异体肝细胞至所述小鼠。任选地，所述人或同种异体肝细胞是原代肝细胞。施用人或同种异体肝细胞至本公开的遗传修饰的免疫缺陷小鼠任选地包括注射所述肝细胞。施用人或同种异体肝细胞至本公开的遗传修饰的免疫缺陷小鼠包括脾内施用所述肝细胞。所述施用的肝细胞任选地表达标志蛋白，例如绿色荧光蛋白或其荧光类似物。
根据本公开的方面提供了一种制备包含移植的外源性肝细胞的遗传修饰的免疫缺陷小鼠的方法，其包括提供免疫缺陷小鼠，所述免疫缺陷小鼠被遗传修饰以包含编码人α-1抗胰蛋白酶(AAT)的PiZ变体(Glu342Lys)的基因，其中所述小鼠在肝细胞中表达人α-1抗胰蛋白酶的PiZ变体(Z-AAT)，其中所述小鼠具有与不表达Z-AAT的相同类型的免疫缺陷小鼠相比数量减少的小鼠肝细胞；和施用人或同种异体肝细胞至所述小鼠。任选地，所述人或同种异体肝细胞是原代肝细胞。施用人或同种异体肝细胞至本公开的遗传修饰的免疫缺陷小鼠任选地包括注射所述肝细胞。施用人或同种异体肝细胞至本公开的遗传修饰的免疫缺陷小鼠包括脾内施用所述肝细胞。所述施用的肝细胞任选地表达标志蛋白，例如绿色荧光蛋白或其荧光类似物。
根据本公开的方面提供了一种制备包含移植的外源性肝细胞的遗传修饰的免疫缺陷的NSG、NRG或NOG小鼠的方法，其包括提供免疫缺陷小鼠，所述免疫缺陷小鼠被遗传修饰以包含编码人α-1抗胰蛋白酶(AAT)的PiZ变体(Glu342Lys)的基因，其中所述小鼠在肝细胞中表达人α-1抗胰蛋白酶的PiZ变体(Z-AAT)，其中所述小鼠具有与不表达Z-AAT的相同类型的免疫缺陷小鼠相比数量减少的小鼠肝细胞；和施用人或同种异体肝细胞至所述小鼠。任选地，所述人或同种异体肝细胞是原代肝细胞。施用人或同种异体肝细胞至本公开的遗传修饰的免疫缺陷小鼠任选地包括注射所述肝细胞。施用人或同种异体肝细胞至本公开的遗传修饰的免疫缺陷小鼠包括脾内施用所述肝细胞。所述施用的肝细胞任选地表达标志蛋白，例如绿色荧光蛋白或其荧光类似物。
根据本文所述的本公开的方面，提供了一种制备包含移植的外源性肝细胞的遗传修饰的免疫缺陷小鼠的方法，并且其还包括处理所述遗传修饰的免疫缺陷小鼠以减少内源性小鼠肝细胞。处理所述遗传修饰的免疫缺陷小鼠以减少内源性小鼠肝细胞是在施用所述人或同种异体肝细胞之前进行，并且包括选自施用肝毒素至所述遗传修饰的免疫缺陷小鼠、在所述遗传修饰的免疫缺陷小鼠中进行至少部分肝切除术和施用肝毒素并且进行至少部分肝切除术两者的处理。
根据特定的实施方式，施用的肝毒素是野百合碱。根据本公开的方面，制备包含移植的外源性肝细胞的遗传修饰的免疫缺陷小鼠的方法包括在施用所述人或同种异体肝细胞之前，施用约10-100mg/kg野百合碱至所述遗传修饰的免疫缺陷小鼠。
根据本公开的方面，处理所述遗传修饰的免疫缺陷小鼠以减少内源性小鼠肝细胞是在施用所述人或同种异体肝细胞之前、期间或之后进行，并且包括施用抗小鼠CD95抗体至所述遗传修饰的免疫缺陷小鼠。根据本公开的特定方面，处理所述遗传修饰的免疫缺陷小鼠以减少内源性小鼠肝细胞是在施用所述人或同种异体肝细胞之前、期间或之后进行，并且包括施用约0.1-10μg的所述抗小鼠CD95抗体至所述遗传修饰的免疫缺陷小鼠。
根据本公开的方面，提供了一种免疫缺陷小鼠，其被遗传修饰以包含编码人α-1抗胰蛋白酶(AAT)的PiZ变体(Glu342Lys)的基因，其中所述小鼠表达人α-1抗胰蛋白酶的PiZ变体(Z-AAT)。
根据本公开的方面，提供了一种免疫缺陷的NSG、NRG或NOG小鼠，其被遗传修饰以包含编码人α-1抗胰蛋白酶(AAT)的PiZ变体(Glu342Lys)的基因，其中所述小鼠表达人α-1抗胰蛋白酶的PiZ变体(Z-AAT)。
根据本公开的方面，提供了一种免疫缺陷小鼠，其被遗传修饰以包含编码人α-1抗胰蛋白酶(AAT)的PiZ变体(Glu342Lys)的基因，其中所述小鼠在肝细胞中表达人α-1抗胰蛋白酶的PiZ变体(Z-AAT)。
根据本公开的方面，提供了一种免疫缺陷的NSG、NRG或NOG小鼠，其被遗传修饰以包含编码人α-1抗胰蛋白酶(AAT)的PiZ变体(Glu342Lys)的基因，其中所述小鼠在肝细胞中表达人α-1抗胰蛋白酶的PiZ变体(Z-AAT)。
根据本公开的方面，提供了一种免疫缺陷小鼠，其被遗传修饰以包含编码人α-1抗胰蛋白酶(AAT)的PiZ变体(Glu342Lys)的基因，其中所述小鼠表达人α-1抗胰蛋白酶的PiZ变体(Z-AAT)，其中所述小鼠包含含有肝细胞的异种移植物或同种异体移植物。任选地，所述肝细胞是人肝细胞，并且在另一种选项中，所述人肝细胞表达人血清白蛋白。根据本公开的方面，所述人血清白蛋白在所述小鼠的血液中是可检测的，并且根据特定的方面，至少约0.01mg/mL的人血清白蛋白存在于所述小鼠的血清中。根据方面，本公开的免疫缺陷小鼠的至少约25％的肝细胞是移植的人肝细胞。根据本公开的方面，包含的人肝细胞表达野生型人AAT，和任选地，存在于所述小鼠的血清中的至少约100μg/mL野生型人AAT。在另一种选项中，所述异种移植物或同种异体移植物的肝细胞是基因组编辑的肝细胞。
根据本公开的方面，提供了一种免疫缺陷的NSG、NRG或NOG小鼠，其被遗传修饰以包含编码人α-1抗胰蛋白酶(AAT)的PiZ变体(Glu342Lys)的基因，其中所述小鼠表达人α-1抗胰蛋白酶的PiZ变体(Z-AAT)，其中所述小鼠包含含有肝细胞的异种移植物或同种异体移植物。任选地，所述肝细胞是人肝细胞，并且在另一种选项中，所述人肝细胞表达人血清白蛋白。根据本公开的方面，所述人血清白蛋白在所述小鼠的血液中是可检测的，并且根据特定的方面，至少约0.01mg/mL的人血清白蛋白存在于所述小鼠的血清中。根据方面，本公开的免疫缺陷小鼠的至少约25％的肝细胞是移植的人肝细胞。根据本公开的方面，包含的人肝细胞表达野生型人AAT，和任选地，存在于所述小鼠的血清中的至少约100μg/mL野生型人AAT。在另一种选项中，所述异种移植物或同种异体移植物的肝细胞是基因组编辑的肝细胞。
根据本公开的方面，提供了一种免疫缺陷小鼠，其被遗传修饰以包含编码人α-1抗胰蛋白酶(AAT)的PiZ变体(Glu342Lys)的基因，其中所述小鼠在肝细胞中表达人α-1抗胰蛋白酶的PiZ变体(Z-AAT)，其中所述小鼠包含含有肝细胞的异种移植物或同种异体移植物。任选地，所述肝细胞是人肝细胞，并且在另一种选项中，所述人肝细胞表达人血清白蛋白。根据本公开的方面，所述人血清白蛋白在所述小鼠的血液中是可检测的，并且根据特定的方面，至少约0.01mg/mL的人血清白蛋白存在于所述小鼠的血清中。根据方面，本公开的免疫缺陷小鼠的至少约25％的肝细胞是移植的人肝细胞。根据本公开的方面，包含的人肝细胞表达野生型人AAT，和任选地，存在于所述小鼠的血清中的至少约100μg/mL野生型人AAT。在另一种选项中，所述异种移植物或同种异体移植物的肝细胞是基因组编辑的肝细胞。
根据本公开的方面，提供了一种免疫缺陷的NSG、NRG或NOG小鼠，其被遗传修饰以包含编码人α-1抗胰蛋白酶(AAT)的PiZ变体(Glu342Lys)的基因，其中所述小鼠在肝细胞中表达人α-1抗胰蛋白酶的PiZ变体(Z-AAT)，其中所述小鼠包含含有肝细胞的异种移植物或同种异体移植物。任选地，所述肝细胞是人肝细胞，并且在另一种选项中，所述人肝细胞表达人血清白蛋白。根据本公开的方面，所述人血清白蛋白在所述小鼠的血液中是可检测的，并且根据特定的方面，至少约0.01mg/mL的人血清白蛋白存在于所述小鼠的血清中。根据方面，本公开的免疫缺陷小鼠的至少约25％的肝细胞是移植的人肝细胞。根据本公开的方面，包含的人肝细胞表达野生型人AAT，和任选地，存在于所述小鼠的血清中的至少约100μg/mL野生型人AAT。在另一种选项中，所述异种移植物或同种异体移植物的肝细胞是基因组编辑的肝细胞。
根据本公开的方面提供了一种制备包含移植的外源性肝细胞的遗传修饰的免疫缺陷小鼠的方法，其包括提供免疫缺陷小鼠，所述免疫缺陷小鼠被遗传修饰以包含编码人α-1抗胰蛋白酶(AAT)的PiZ变体(Glu342Lys)的基因，其中所述小鼠表达人α-1抗胰蛋白酶的PiZ变体(Z-AAT)；和施用人或同种异体肝细胞至所述小鼠。任选地，所述人或同种异体肝细胞是原代肝细胞。施用人或同种异体肝细胞至本公开的遗传修饰的免疫缺陷小鼠任选地包括注射所述肝细胞。施用人或同种异体肝细胞至本公开的遗传修饰的免疫缺陷小鼠包括脾内施用所述肝细胞。所述施用的肝细胞任选地表达标志蛋白，例如绿色荧光蛋白或其荧光类似物。
根据本公开的方面提供了一种制备包含移植的外源性肝细胞的遗传修饰的免疫缺陷小鼠的方法，其包括提供免疫缺陷的NSG、NRG或NOG小鼠，所述免疫缺陷小鼠被遗传修饰以包含编码人α-1抗胰蛋白酶(AAT)的PiZ变体(Glu342Lys)的基因，其中所述小鼠表达人α-1抗胰蛋白酶的PiZ变体(Z-AAT)；和施用人或同种异体肝细胞至所述小鼠。任选地，所述人或同种异体肝细胞是原代肝细胞。施用人或同种异体肝细胞至本公开的遗传修饰的免疫缺陷小鼠任选地包括注射所述肝细胞。施用人或同种异体肝细胞至本公开的遗传修饰的免疫缺陷小鼠包括脾内施用所述肝细胞。所述施用的肝细胞任选地表达标志蛋白，例如绿色荧光蛋白或其荧光类似物。
根据本公开的方面提供了一种制备包含移植的外源性肝细胞的遗传修饰的免疫缺陷小鼠的方法，其包括提供免疫缺陷小鼠，所述免疫缺陷小鼠被遗传修饰以包含编码人α-1抗胰蛋白酶(AAT)的PiZ变体(Glu342Lys)的基因，其中所述小鼠在肝细胞中表达人α-1抗胰蛋白酶的PiZ变体(Z-AAT)；和施用人或同种异体肝细胞至所述小鼠。任选地，所述人或同种异体肝细胞是原代肝细胞。施用人或同种异体肝细胞至本公开的遗传修饰的免疫缺陷小鼠任选地包括注射所述肝细胞。施用人或同种异体肝细胞至本公开的遗传修饰的免疫缺陷小鼠包括脾内施用所述肝细胞。所述施用的肝细胞任选地表达标志蛋白，例如绿色荧光蛋白或其荧光类似物。
根据本公开的方面提供了一种制备包含移植的外源性肝细胞的遗传修饰的免疫缺陷小鼠的方法，其包括提供免疫缺陷的NSG、NRG或NOG小鼠，所述免疫缺陷小鼠被遗传修饰以包含编码人α-1抗胰蛋白酶(AAT)的PiZ变体(Glu342Lys)的基因，其中所述小鼠在肝细胞中表达人α-1抗胰蛋白酶的PiZ变体(Z-AAT)；和施用人或同种异体肝细胞至所述小鼠。任选地，所述人或同种异体肝细胞是原代肝细胞。施用人或同种异体肝细胞至本公开的遗传修饰的免疫缺陷小鼠任选地包括注射所述肝细胞。施用人或同种异体肝细胞至本公开的遗传修饰的免疫缺陷小鼠包括脾内施用所述肝细胞。所述施用的肝细胞任选地表达标志蛋白，例如绿色荧光蛋白或其荧光类似物。
根据本公开的方面提供了一种评估人肝脏疾病的推定治疗的安全性和/或功效的方法，其包括提供免疫缺陷小鼠，所述免疫缺陷小鼠被遗传修饰以包含编码人α-1抗胰蛋白酶(AAT)的PiZ变体(Glu342Lys)的基因，其中所述小鼠表达人α-1抗胰蛋白酶的PiZ变体(Z-AAT)，其中所述小鼠具有与不表达Z-AAT的相同类型的免疫缺陷小鼠相比数量减少的小鼠肝细胞，并且其中所述小鼠包含含有人肝细胞的异种移植物或同种异体移植物，施用所述人肝脏疾病的推定治疗至所述遗传修饰的免疫缺陷小鼠；和评估所述推定治疗对所述小鼠的人肝细胞的作用。
根据本公开的方面提供了一种评估人肝脏疾病的推定治疗的安全性和/或功效的方法，其包括提供免疫缺陷的NSG、NRG或NOG小鼠，所述免疫缺陷小鼠被遗传修饰以包含编码人α-1抗胰蛋白酶(AAT)的PiZ变体(Glu342Lys)的基因，其中所述小鼠表达人α-1抗胰蛋白酶的PiZ变体(Z-AAT)，其中所述小鼠具有与不表达Z-AAT的相同类型的免疫缺陷小鼠相比数量减少的小鼠肝细胞，并且其中所述小鼠包含含有人肝细胞的异种移植物或同种异体移植物，施用所述人肝脏疾病的推定治疗至所述遗传修饰的免疫缺陷小鼠；和评估所述推定治疗对所述小鼠的人肝细胞的作用。
根据本公开的方面提供了一种评估人肝脏疾病的推定治疗的安全性和/或功效的方法，其包括提供免疫缺陷小鼠，所述免疫缺陷小鼠被遗传修饰以包含编码人α-1抗胰蛋白酶(AAT)的PiZ变体(Glu342Lys)的基因，其中所述小鼠在肝细胞中表达人α-1抗胰蛋白酶的PiZ变体(Z-AAT)，其中所述小鼠具有与不表达Z-AAT的相同类型的免疫缺陷小鼠相比数量减少的小鼠肝细胞，并且其中所述小鼠包含含有人肝细胞的异种移植物或同种异体移植物，施用所述人肝脏疾病的推定治疗至所述遗传修饰的免疫缺陷小鼠；和评估所述推定治疗对所述小鼠的人肝细胞的作用。
根据本公开的方面提供了一种评估人肝脏疾病的推定治疗的安全性和/或功效的方法，其包括提供免疫缺陷的NSG、NRG或NOG小鼠，所述免疫缺陷小鼠被遗传修饰以包含编码人α-1抗胰蛋白酶(AAT)的PiZ变体(Glu342Lys)的基因，其中所述小鼠在肝细胞中表达人α-1抗胰蛋白酶的PiZ变体(Z-AAT)，其中所述小鼠具有与不表达Z-AAT的相同类型的免疫缺陷小鼠相比数量减少的小鼠肝细胞，并且其中所述小鼠包含含有人肝细胞的异种移植物或同种异体移植物，施用所述人肝脏疾病的推定治疗至所述遗传修饰的免疫缺陷小鼠；和评估所述推定治疗对所述小鼠的人肝细胞的作用。
根据本公开的方面提供了一种评估人肝脏疾病的推定治疗的安全性和/或功效的方法，其包括提供免疫缺陷小鼠，所述免疫缺陷小鼠被遗传修饰以包含编码人α-1抗胰蛋白酶(AAT)的PiZ变体(Glu342Lys)的基因，其中所述小鼠表达人α-1抗胰蛋白酶的PiZ变体(Z-AAT)，并且其中所述小鼠包含含有人肝细胞的异种移植物或同种异体移植物，施用所述人肝脏疾病的推定治疗至所述遗传修饰的免疫缺陷小鼠；和评估所述推定治疗对所述小鼠的人肝细胞的作用。
根据本公开的方面提供了一种评估人肝脏疾病的推定治疗的安全性和/或功效的方法，其包括提供免疫缺陷的NSG、NRG或NOG小鼠，所述免疫缺陷小鼠被遗传修饰以包含编码人α-1抗胰蛋白酶(AAT)的PiZ变体(Glu342Lys)的基因，其中所述小鼠表达人α-1抗胰蛋白酶的PiZ变体(Z-AAT)，并且其中所述小鼠包含含有人肝细胞的异种移植物或同种异体移植物，施用所述人肝脏疾病的推定治疗至所述遗传修饰的免疫缺陷小鼠；和评估所述推定治疗对所述小鼠的人肝细胞的作用。
根据本公开的方面提供了一种评估人肝脏疾病的推定治疗的安全性和/或功效的方法，其包括提供免疫缺陷小鼠，所述免疫缺陷小鼠被遗传修饰以包含编码人α-1抗胰蛋白酶(AAT)的PiZ变体(Glu342Lys)的基因，其中所述小鼠在肝细胞中表达人α-1抗胰蛋白酶的PiZ变体(Z-AAT)，并且其中所述小鼠包含含有人肝细胞的异种移植物或同种异体移植物，施用所述人肝脏疾病的推定治疗至所述遗传修饰的免疫缺陷小鼠；和评估所述推定治疗对所述小鼠的人肝细胞的作用。
根据本公开的方面提供了一种评估人肝脏疾病的推定治疗的安全性和/或功效的方法，其包括提供免疫缺陷的NSG、NRG或NOG小鼠，所述免疫缺陷小鼠被遗传修饰以包含编码人α-1抗胰蛋白酶(AAT)的PiZ变体(Glu342Lys)的基因，其中所述小鼠在肝细胞中表达人α-1抗胰蛋白酶的PiZ变体(Z-AAT)，并且其中所述小鼠包含含有人肝细胞的异种移植物或同种异体移植物，施用所述人肝脏疾病的推定治疗至所述遗传修饰的免疫缺陷小鼠；和评估所述推定治疗对所述小鼠的人肝细胞的作用。
任选地，根据本公开的方面提供了在评估人肝脏疾病的推定治疗的安全性和/或功效的方法中施用的推定治疗，所述推定治疗包括施用病毒基因治疗载体。
任选地，根据本公开的方面提供了在评估人肝脏疾病的推定治疗的安全性和/或功效的方法中施用的推定治疗，所述推定治疗包括施用基因组编辑的人肝细胞。
附图说明
图1由标记为图a、b、c、d、e、f和g的7幅小图组成。图1的小图(a)(图1a)示出了两种供体小鼠品系的开发：B6-PiZ-GFP，其具有表达PiZ的GFP标记的小鼠肝细胞，和B6-GFP，其具有GFP标记的野生型小鼠肝细胞。分离来自供体小鼠的表达GFP的肝细胞，并通过脾内注射每只小鼠1,000,000个细胞将其移植到表达人PiZ基因的免疫受损的雄性NSG-PiZ小鼠中。在植入后8周对受体小鼠实施安乐死，并获得肝组织用于后续分析。图1的小图(b)(图1b)是描绘通过RT-qPCR确定的在PiZ-GFP供体细胞和野生型GFP供体细胞(WT-GFP)中观察到的Z-AAT(深灰色)和GFP(浅灰色)的相对mRNA的图。误差线对应于平均值的标准误差，每组3只小鼠。图1的小图(c)(图1c)是描绘通过对基因组DNA进行ddPCR确定的在移植有PiZ-GFP肝细胞(n＝3)或WT-GFP肝细胞(n＝4)的NSG-PiZ小鼠中每二倍体基因组的GFP阳性细胞百分比的图。来自WT-GFP供体肝脏的基因组DNA用作阳性对照(n＝2)。误差线对应于标准误差。图1的小图(d)(图1d)是来自接受PiZ-GFP肝细胞移植物的NSG-PiZ小鼠的抗GFP免疫染色肝脏切片的图像。图1的小图(e)(图1e)是接受PiZ-GFP肝细胞移植物的NSG-PiZ小鼠肝脏切片的荧光图像。图1的小图(f)(图1f)是来自接受WT-GFP肝细胞移植物的NSG-PiZ小鼠的抗GFP免疫染色肝脏切片的图像，其显示相对于图1d染色增加。图1的小图(g)(图1g)是接受WT-GFP肝细胞移植物的NSG-PiZ小鼠肝脏切片的荧光图像，其显示相对于图1e荧光增加。
图2由标记为图a、b、c和d的4幅小图组成。图2的小图(a)(图2a)是描绘在用1,000,000个成熟人肝细胞进行脾内植入的NSG小鼠(圆圈；)或NSG-PiZ小鼠(三角；)中测量的血清人白蛋白的平均浓度的图。x轴对应于以周为单位的时间，y轴对应于以对数刻度上的mg/mL表示的血清人白蛋白浓度。误差线对应于标准误差。在所有时间点，NSG-PiZ小鼠显示出比NSG小鼠显著更多的人血清白蛋白。图2的小图(b)(图2b)是描绘在进行部分肝切除术(Phx)，然后用1,000,000个成熟人肝细胞进行脾内植入的NSG小鼠(圆圈；)或NSG-PiZ小鼠(三角；)中测量的血清人白蛋白的浓度的图。x轴对应于以周为单位的时间，y轴对应于以对数刻度上的mg/mL表示的血清人白蛋白浓度。误差线对应于标准误差。在所有时间点，NSG-PiZ小鼠显示出比NSG小鼠显著更多的人血清白蛋白。图2的小图(c)(图2c)和(d)(图2d)是部分肝切除术和1,000,000个成熟人肝细胞的脾内植入后10周，用人白蛋白免疫染色显示的NSG-PiZ小鼠肝脏的图像。
图3由标记为图a、b、c、d、e和f的6幅小图组成。图3的小图(a)(图3a)是描绘通过ELISA定量的NSG-PiZ小鼠的血清Z-AAT浓度的图。x轴对应于以天为单位的小鼠的年龄，y轴对应于在小鼠中测量的平均血清Z-AAT浓度。误差线对应于标准误差。50天组由10只小鼠组成；60天，n＝9；72天，n＝27；85天，n＝12；95天，n＝17；110天，n＝7；115天，n＝3；和185，n＝5。图3的小图(b)(图3b)是在6周龄时使用抗淀粉酶(diastase)高碘酸-希夫(PASD)染色的NSG-PiZ小鼠肝脏切片的代表图像。增加的染色与增加的小球相关(例如，具有Z-AAT聚集体的小球)。图3的小图(c)(图3c)是在14周龄时使用PASD染色的NSG-PiZ小鼠肝脏切片的代表性图像，其显示相对于6周较少的染色。图3的小图(d)(图3d)是在6周龄时用抗人AAT抗体免疫染色的NSG-PiZ小鼠肝脏切片的代表性图像。图3的小图(e)(图3e)是在14周龄时用抗人AAT抗体免疫染色的NSG-PiZ小鼠肝脏切片的代表性图像，其显示相对于6周较少的染色，表明较少的Z-AAT聚集。图3的小图(f)(图3f)是描绘在植入人肝细胞时和植入后7周在NSG-PiZ小鼠中以ELISA定量的测量的血清人白蛋白浓度和测量的血清人Z-AAT浓度之间的相关性的图。每个数据点对应于三十只小鼠中的一只。
图4由标记为图a、b、c和d的4幅小图组成。图4的小图(a)(图4a)是描绘各自被施用人肝细胞的NSG-PiZ小鼠的组的平均血清人白蛋白浓度的图。x轴对应于以周为单位的时间，y轴对应于以对数刻度上的mg/mL表示的血清人白蛋白浓度。开放的圆圈对应于在接受脾内植入(IE)但不对人肝细胞提供另外的选择性劣势的五只NSG-PiZ小鼠中测量的平均血清人白蛋白浓度。封闭的圆圈对应于在部分肝切除术(PHx)后接受脾内植入的五只NSG-PiZ小鼠中测量的平均血清人白蛋白浓度。X(x)对应于在接受单剂量的50mg/kg腹膜内野百合碱(1×MCT)后7天接受脾内植入的四只NSG-PiZ小鼠中测量的平均血清人白蛋白浓度。三角对应于在植入前14天和7天接受两剂量的50mg/kg腹膜内野百合碱(2×MCT)后接受脾内植入的六只NSG-PiZ小鼠中测量的平均血清人白蛋白浓度。正方对应于在接受脾内植入以及植入时1μg抗小鼠CD95抗体(CD95)的四只NSG-PiZ小鼠中测量的平均血清人白蛋白浓度。误差线对应于标准误差。接受两剂量的50mg/kg腹膜内野百合碱的小鼠显示出最大的血清人白蛋白浓度。图4的小图(b)(图4b)是从植入前接受50mg/kg腹膜内野百合碱的NSG-PiZ小鼠在植入后10周获得的小鼠肝脏切片的图像。使用抗人白蛋白抗体对切片进行染色。图4的小图(c)(图4c)由在接受人肝细胞异种移植物的小鼠上进行的两个流式细胞图组成。右侧流式细胞图是散点图，其x轴对应于人HLA-ABC+荧光信号强度，y轴对应于侧向散射脉冲宽度。如图所示，25.7％的细胞被门控为人HLA-ABC+。门控和非门控细胞的CD324+荧光信号强度分别显示在左侧流式细胞图的右侧迹线和左侧迹线中。左侧流式细胞图是具有对应于CD324+荧光信号强度的x轴和对应于细胞计数的y轴的直方图。图4的小图(d)(图4d)是描绘了在用人肝细胞植入后10周时在各个小鼠中测量的血清人AAT浓度(mg/mL)(y-轴)。x轴标签对应于不同的小鼠组，并且每个数据点对应于不同的小鼠。水平实线描绘了每组的平均值，误差线对应于标准误差。虚线放置在572μg/mL。“对照”小鼠是未接受肝细胞异种移植物的NSG-PiZ小鼠。“IE”小鼠是接受脾内植入(IE)而不对小鼠肝细胞提供另外的选择性缺点的NSG-PiZ小鼠。“PHx”小鼠是在部分肝切除术后接受脾内植入的NSG-PiZ小鼠。“MCT”小鼠是在接受50mg/kg腹膜内野百合碱后接受脾内植入的NSG-PiZ小鼠。
图5由标记为图a、b、c、d、e和f的6幅小图组成。图5的小图(a)(图5a)是描绘用无启动子双功能盒包装的重组AAV8载体的组织的卡通图，所述盒包含靶向人AAT的人工miRNA和含有c-Myc标签的miRNA靶向的人AAT序列。该盒的侧翼为白蛋白基因座的1.1-1.3千碱基同源臂。图5的小图(b)(图5b)是描绘通过ddPCR测量的白蛋白-α-1抗胰蛋白酶融合的转录物/鼠白蛋白转录物的比率的图(对照n＝3，10周n＝3，16周n＝5)。图5的小图(c)(图5c)是描绘通过ELISA测量并标准化至年龄匹配的对照组的平均值的相对M-AAT-c-Myc血清浓度的图(对照n＝6，处理n＝10)。图5的小图(d)(图5d)由使用抗c-Myc抗体免疫染色的小鼠肝脏的图像组成，其中每组显示两只代表性小鼠(比例尺＝2mm)。图5的小图(e)(图5e)是描绘在抗c-Myc免疫染色的小鼠肝脏中观察到的c-Myc阳性细胞的数量的图(对照n＝3，10周n＝3，16周n＝6)。图5的小图(f)(图5f)是描绘通过ELISA测量并且标准化至年龄匹配的对照组的平均值并表示为沉默的百分比的平均相对Z-AAT血清浓度的图(8周n＝9，11周-16周n＝10)。每个图中的误差线对应于标准误差。
具体实施方式
单数术语“一个/一种(a/an)”和“该/所述(the)”不旨在是限制性的，并且包括复数形式，除非另有明确说明或者上下文另有明确指示。
本发明的各个方面涉及如下发现：被遗传修饰以表达人α-1抗胰蛋白酶的PiZ变体的免疫缺陷小鼠为不表达人α-1抗胰蛋白酶的PiZ变体的人肝细胞的植入提供有利的环境。本文中称为遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠的本发明小鼠是有用的，例如，作为人肝脏功能和疾病的模型。本发明的遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠在没有维持药物治疗的情况下繁殖和存活，并且还可以作为用于鉴定转导人肝细胞的最佳载体的体内模型，所述人肝细胞通常与小鼠肝细胞在它们对特定AAV衣壳变体的趋向性方面不同。包含人肝细胞异种移植物的本发明的遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠也可用作体内定向进化研究的工具。
本发明的遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠表达α-1抗胰蛋白酶(AAT)的PiZ变体，例如人α-1抗胰蛋白酶的Glu342Lys变体。
在免疫缺陷小鼠中α-1抗胰蛋白酶的PiZ变体(Z-AAT)的表达被发现为肝细胞异种移植物提供令人惊讶的有用的选择性优势。
本发明的一些方面涉及表达Z-AAT并包含外源肝细胞的遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠。本发明的一些方面涉及表达Z-AAT并包含人肝细胞的遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠。
本文使用的科学和技术术语旨在具有本领域普通技术人员通常理解的含义。这样的术语在各种标准参考文献中定义和使用，说明性地包括A.Nagy,M.Gertsenstein,K.Vintersten,R.Behringer,Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual,3rd edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press；December 15,2002,ISBN-10:0879695919；Kursad Turksen(Ed.),Embryonic stem cells:methods and protocols inMethods Mol Biol.2002；185,Humana Press；Current Protocols in Stem CellBiology,ISBN:9780470151808；Sambrook and Russell,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press；3rd Ed.,2001；Ausubel(Ed.),Short Protocols in Molecular Biology,Current Protocols,5th Ed.,2002；Alberts et al,Molecular Biology of the Cell,4th Ed.,Garland,2002；Nelson andCox,Lehninger Principles of Biochemistry,4th Ed.,W.H.Freeman&Company,2004；和Herdewijn(Ed.),Oligonucleotide Synthesis:Methods and Applications,Methods inMolecular Biology,Humana Press,2004。
本文所用的关于宿主细胞或生物的术语“异种(xenogeneic)”表示被称为“异种”的材料是衍生自所述宿主细胞或生物以外的另一物种。异种材料可以是例如人材料，包括编码人蛋白质的基因或基本上具有人类基因组的细胞。
本文所用的关于宿主细胞或生物的术语“同种异体(allogeneic)”表示被称为“同种异体”的材料是衍生自与所述宿主细胞或生物相同的物种。引入宿主小鼠的同种异体材料是衍生自小鼠，包括例如编码鼠蛋白的基因或基本上具有鼠基因组的细胞。
术语“包含/包括”指的是开放的组，例如，包括成员A、B和C的组还可以包括另外的成员。术语“由...组成”是指封闭的组，例如，由成员A、B和C组成的组不包括任何另外的成员。
遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠
根据本发明的方面，提供了一种遗传修饰的免疫缺陷小鼠，其中所述遗传修饰的免疫缺陷小鼠的基因组编码人α-1抗胰蛋白酶的PiZ变体(Z-AAT)，其中人α-1抗胰蛋白酶的PiZ变体在人α-1抗胰蛋白酶蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO:1中在氨基酸位置342具有赖氨酸对谷氨酸的置换(Glu342Lys)。
SEQ ID NO:1
人Z-AAT蛋白(无信号肽)-Glu342Lys
在特定的方面，编码Z-AAT的核苷酸序列被整合到小鼠的细胞的基因组。例如，将编码Z-AAT的核苷酸序列整合到小鼠的种系细胞的基因组中，从而使得编码Z-AAT的核苷酸序列能够遗传给小鼠的后代。
本发明的方面涉及一种遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠，其基因组包含编码Z-AAT的核苷酸序列。人α-1抗胰蛋白酶的人PiZ变体(Z-AAT)蛋白在本文中被鉴定为SEQ ID NO:1，并且其变体可用于本发明。
本发明的特定方面涉及一种遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠，其基因组包含编码与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.7％、99.8％或更高的序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。本发明的特定方面涉及遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠，其基因组包含编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
根据本发明的方面，遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠表达编码Z-AAT的mRNA，所述Z-AAT具有与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.7％、99.8％或更高的序列同一性的氨基酸序列。在特定方面，遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠表达编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的mRNA。
根据本发明的方面，遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠表达与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.7％、99.8％或更高的序列同一性的Z-AAT蛋白。根据本发明的方面，遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠表达具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的蛋白。
根据本发明的方面，免疫缺陷PiZ小鼠在其基因组中包含可操作地连接至启动子的编码Z-AAT的核酸，其中所述Z-AAT包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或由在高度严格杂交条件下与SEQ ID NO:2杂交的核酸的互补序列编码的氨基酸序列。本领域普通技术人员认识到，由于遗传密码的简并性质，替代性核酸序列编码Z-AAT及其变体，并且这样的替代性核酸可用于本文所述的组合物和方法。
SEQ ID NO:2
编码人Z-AAT蛋白(无信号肽)-Glu342Lys
为了确定两条氨基酸序列或两条核苷酸序列的同一性百分比，出于最佳比较目的而将序列进行比对(例如，使用比对软件程序的默认参数，缺口可在第一氨基酸或核苷酸序列中引入以获得与第二氨基酸或核苷酸序列的最佳比对)。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸或核苷酸。当第一序列中的位置被第二序列中的相应位置的相同氨基酸或核苷酸占据时，那么序列在该位置是相同的。两条序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置的数量的函数(即，同一性％＝相同比对位置的数量÷比对位置的总数量·100％)。在一些实施方式中，两条序列具有相同的长度。
两条序列之间的同一性百分比的确定可以使用数学算法来完成。用于比较两条序列的数学算法的非限制性实例是Karlin and Altschul，1990，PNAS USA 87：2264-68的算法，例如，如Karlin and Altschul，1993，PNAS USA 90：5873-77中所修改的。这样的算法被引入Altschul et al，1990，J.Mol.Biol.215：403的NBLAST和XBLAST程序。可以用NBLAST核苷酸程序参数集(例如，得分＝100，字长＝12)进行BLAST核苷酸搜索以获得与本发明的核苷酸序列同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序参数集(例如，得分50，字长＝3)进行BLAST蛋白质搜索以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的缺口比对，可以利用Gapped BLAST，如Altschul et al,1997,Nucleic Acids Res.25:3389-02中所述。或者，PSI BLAST可用于执行检测分子之间的远距离关系的迭代搜索(同上)。当使用BLAST、Gapped BLAST和PSI Blast时，使用相应程序的(例如，XBLAST和NBLAST的)默认参数(参见，例如，NCBI网站)。用于比较序列的数学算法的另一个优选的非限制性实例是Myers and Miller，1988，CABIOS4：11-17的算法。这样的算法被引入ALIGN程序(版本2.0)，该程序是GCG序列比对软件包的一部分。当利用ALIGN程序比较氨基酸序列时，使用PAM120权重残基表，缺口长度罚分为12，缺口罚分为4。Clustal软件程序套件提供了用于比对序列以确定序列同一性百分比的另一个方法。
两条序列之间的同一性百分比是使用与上述那些类似的、允许或不允许缺口的技术来确定的。在计算同一性百分比时，通常只计数准确匹配。
术语“杂交”和“杂交”是指互补核酸的配对和结合。如本领域所熟知的，杂交在两种核酸之间以不同程度发生，这取决于例如核酸的互补程度、熔融温度，核酸的Tm和杂交条件的严格性等因素。术语“杂交条件的严格性”是指温度、离子强度和与特定常见添加剂例如甲酰胺和Denhardt溶液相关的杂交介质的组成的条件。确定与特定核酸相关的具体杂交条件是常规的并且是本领域公知的，例如，如J.Sambrook and D.W.Russell,MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press；3rd Ed.,2001；and F.M.Ausubel,Ed.,Short Protocols in Molecular Biology,Current Protocols；5th Ed.,2002中所述。高严格性杂交条件是仅允许基本上互补核酸的杂交的条件。通常，具有约85-100％互补性的核酸被认为是高度互补的并且在高度严格条件下杂交。中等严格性条件的示例是具有中等互补性(约50-84％互补性)的核酸以及具有高度互补性的核酸杂交的条件。相反，低严格性杂交条件是其中具有低度互补性的核酸杂交的条件。
术语“特异性杂交”和“特异性地杂交”是指特定核酸与靶核酸的杂交而基本上没有与样品中所述靶核酸之外的核酸的杂交。
杂交和洗涤条件的严格性取决于多个因素，包括如本领域技术人员所公知的探针和靶标的Tm以及杂交和洗涤条件的离子强度。杂交和实现期望的杂交严格性的条件描述于，例如，Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,2001；和Ausubel,F.et al.,(Eds.),Short Protocols inMolecular Biology,Wiley,2002。
可以使用标准分子生物学技术，例如位点定向诱变和PCR介导的诱变来引入突变。本领域技术人员将认识到可以引入一个或多个氨基酸突变而不改变Z-AAT的功能特性。编码Z-AAT的一种或多种核苷酸序列可以从编码Z-AAT的基因和/或mRNA进行改变，例如，以针对特定小鼠或出于方便而优化密码子使用，例如，添加或删除限制性位点，或者修饰对克隆、扩增和/或测序造成挑战的序列。
可以在Z-AAT蛋白中进行保守氨基酸置换以产生Z-AAT变体。保守氨基酸置换是本领域公认的一种氨基酸对具有相似特征的另一种氨基酸的置换。例如，每个氨基酸可描述为具有以下特征中的一种或多种：正电性、电负性、脂肪族、芳香族、极性、疏水性和亲水性。保守置换是具有特定结构或功能特征的一种氨基酸对具有相同特征的另一种氨基酸的置换。酸性氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸；碱性氨基酸包括组氨酸、赖氨酸、精氨酸；脂肪族氨基酸包括异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸；芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；极性氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸；疏水性氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、缬氨酸和色氨酸；保守置换包括每组内的氨基酸之间的置换。氨基酸也可以在空间或相对大小方面描述，例如，丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、苏氨酸、丝氨酸和缬氨酸通常都被认为是小的。
术语“核酸”是指任何形式的具有多于一个核苷酸的RNA或DNA分子，包括单链的、双链的、寡核苷酸或多核苷酸。术语“核苷酸序列”是指核酸中核苷酸的排序。
编码Z-AAT及其变体的核酸可被分离或使用公知方法重组地或合成地产生。
在本发明的特定方面，编码Z-AAT的核苷酸序列被可操作地连接至启动子。启动子可以是例如组成型启动子。在特定方面，启动子能够在宿主小鼠(例如免疫缺陷小鼠)中驱动基因表达。例如，启动子可以是CAG启动子。CAG启动子包含巨细胞病毒早期增强子元件(“C”)，鸡β-肌动蛋白基因的第一个外显子和第一个内含子(“A”)，以及兔β-球蛋白基因的剪接受体(“G”)。CAG启动子是公知的并且在小鼠细胞中显示出稳健的表达(参见，例如，Jun-ichi et al,1989,Gene,79(2):269)。可以修饰CAG启动子，例如，以去除外显子。其他启动子已知在小鼠中驱动稳健的基因表达，包括巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子和猿猴病毒40(SV40)早期启动子，其各自可用于本发明的各种实施方式。用于在转基因构建体中设计基因和安置启动子的方法是已知的(参见，例如，Haruyama et al,2009,Curr.Protoc.Cell Biol.,19.10)。
在本发明的特定方面，遗传修饰的免疫缺陷小鼠在其基因组中包含可操作地连接至组成型启动子的编码Z-AAT的核苷酸序列。
根据本发明的方面，提供了遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠，其基因组包含含有编码Z-AAT的核苷酸序列的表达盒，其中所述核苷酸序列可操作地连接至启动子和聚腺苷酸化信号，并且所述小鼠表达编码的Z-AAT。
术语“表达构建体”和“表达盒”在本文中用于指含有期望的编码序列(例如编码Z-AAT的核苷酸序列)和含有对可操作地连接的编码序列的表达所必需或期望的一个或多个调节元件的双链重组核苷酸序列。如本文所用的术语“调节元件”是指控制核苷酸序列表达的某些方面的核苷酸序列。示例性的调节元件说明性地包括增强子、内部核糖体进入位点(IRES)、内含子、复制起点、聚腺苷酸化信号(pA)、启动子、转录终止序列和上游调节结构域，其有助于核苷酸序列的复制、转录和转录后加工。本领域普通技术人员只需常规实验就能够选择和使用表达构建体中的这些和其他调节元件。表达构建体可以使用公知的方法重组或合成产生。
如本文所用的术语“可操作地连接”是指核苷酸序列处于与第二核苷酸序列的功能性关系中。
包含在表达盒中的调节元件可以是启动子。如本文所用的术语“启动子”是指与待转录的编码核苷酸序列(例如编码期望的氨基酸的核苷酸序列)可操作地连接的调节性核苷酸序列。启动子通常位于待转录的核苷酸序列的上游，并通过RNA聚合酶和其他转录因子提供特异性结合的位点。在本发明的特定方面，启动子是组成型启动子或诱导型启动子。在本发明的特定方面，启动子提供普遍存在的、组织特异性的或细胞类型特异性的表达。
可以包含在表达构建体中的普遍存在的启动子包括但不限于3-磷酸甘油酸激酶(PGK-1)启动子、β-肌动蛋白启动子、ROSA26启动子、热休克蛋白70(HSP70)启动子、编码延伸因子1α(EF-1)启动子的EF-1α基因、真核起始因子4A(eIF-4A1)启动子、氯霉素乙酰转移酶(CAT)启动子和巨细胞病毒(CMV)启动子。
可包含在表达构建体中的组织特异性启动子包括但不限于由肝细胞表达的基因的启动子。
这些和其他启动子是本领域公知的，如在Abboud et al,2003,J.Histochem&Cytochem.,51(7):941-49；Schorpp et al,1996,Nucl.Acids Res.,24(9):1787-88；McBurney et al,1994,Devel.Dynamics,200:278-93；and Majumder et al,1996,Blood,87(8):3203-11中所示例。
除启动子之外，可以包含一个或多个增强子序列，例如，但不限于，巨细胞病毒(CMV)早期增强子元件和SV40增强子元件。
在本发明的方面，另外包含的序列包括内含子序列，例如β珠蛋白内含子或通用内含子、转录终止序列和mRNA聚腺苷酸化(PA)序列，例如但不限于SV40-pA、β-珠蛋白-pA和AAT-pA。
在本发明的方面，表达构建体包含在细菌细胞中扩增所必需的序列，例如选择标记(例如，卡那霉素或氨苄青霉素抗性基因)和复制起点。
使用公知的方法，表达构建体可被导入受精的小鼠卵母细胞，植入前小鼠胚胎，或小鼠干细胞(胚胎干细胞或诱导多能干细胞)，以产生遗传修饰的小鼠。
对于将表达构建体导入小鼠植入前胚胎的方法，表达构建体可以在注射到胚胎之前进行线性化。
优选地，将表达构建体注射到受精的卵母细胞中。在交配次日天(交配后0.5天)从超数排卵的雌性收集受精的卵母细胞，并注射表达构建体。将经注射的卵母细胞培养过夜或直接转移到交配后0.5天的假孕雌性的输卵管中。用于超数排卵、收获卵母细胞、注射表达构建体和胚胎移植的方法是本领域中已知的并且描述于，例如，Manipulating theMouse Embryo:A Laboratory Manual,3rd edition,Cold Spring Harbor LaboratoryPress；December 15,2002,ISBN-10:0879695919。可以通过DNA分析，例如通过PCR、Southern印迹或核苷酸测序，来测试后代中Z-AAT转基因的存在。可以测试携带转基因的小鼠的蛋白质表达，例如通过ELISA或Western印迹分析。
或者，表达构建体通过技术如电穿孔、磷酸钙沉淀、脂质转染导入。然后通过DNA分析针对转基因整合筛选细胞，例如PCR、Southern印迹或核苷酸测序。通过用例如ELISA或Western印迹分析对Z-AAT进行蛋白质分析可以测试具有正确整合的细胞的功能性表达。
胚胎干细胞在为特定细胞系优化的培养基中生长。通常，胚胎干细胞培养基含有在Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中的15％胎牛血清(FBS)或合成或半合成等同物，2mM谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，0.1mM非必需氨基酸，50U/mL青霉素和链霉素，0.1mM 2-巯基乙醇和1000U/mL LIF(加上，对于一些细胞系，分化的化学抑制剂)。详细描述是本领域已知的(Tremml et al,2008,Current Protocols in Stem Cell Biology,Chapter 1:Unit1C.4)。有关胚胎干细胞分化的抑制剂的综述，参见Buehr et al,2003,Genesis ofembryonic stem cells,Philosophical Transactions of the Royal Society B:Biological Sciences 358:1397-1402。
包含表达构建体的选择的细胞可以被注射到植入前胚胎中。对于显微注射，使用胰蛋白酶和EDTA的混合物使胚胎干细胞或诱导多能干细胞成为单细胞，然后重悬于胚胎干细胞培养基中。使用精细拉出的玻璃针(内直径20-25微米)选择单细胞的组，并使用装有显微操作器的倒置显微镜通过胚胎透明带导入囊胚腔(囊胚腔，blastocoel)。干细胞也可以注射到早期胚胎(例如，2细胞、4细胞、8细胞、premorula或桑椹胚)中。可以通过透明带中的激光或压电脉冲钻孔开口来辅助注射。每个囊胚或8细胞期胚胎注射大约9-10个选择的干细胞(胚胎干细胞或诱导多能干细胞)，每个4细胞期胚胎注射6-9个干细胞，每个2细胞期胚胎注射约6个干细胞。在干细胞导入之后，胚胎被允许于37℃在氮气中的5％CO2，5％O2中恢复多个小时或培养过夜，然后转移到假孕受体雌性。在干细胞注射的另一替代方案中，干细胞可与桑椹胚阶段胚胎聚集。所有这些方法都很成熟并且可用于产生干细胞嵌合体。对于更详细的描述，参见，例如，Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual,3rdedition(Nagy,Gertsenstein,Vintersten,and Behringer,Cold Spring HarborLaboratory Press,December 15,2002,ISBN-10:0879695919；还参见Nagy et al,1990,Development 110:815-821；Kraus et al,2010,Genesis 48:394-399；和美国专利号7,576,259、7,659,442和7,294,754)。
使用本领域中已知的方法准备假孕胚胎受体。简言之，将6-8周龄的可育雌性小鼠与输精管切除的或不育的雄性交配，以诱导有利于支持手术导入的胚胎的激素状态。在交配后2.5天(dpc)，将至多15个含有囊胚的干细胞导入非常靠近子宫-输卵管连接处的子宫角。对于早期胚胎和桑椹胚，根据胚胎阶段，这样的胚胎或者在体外培养至囊胚或者植入0.5dpc或1.5dpc假孕雌性的输卵管中。来自植入胚胎的嵌合幼崽在转移后16-20天出生，这取决于植入时的胚胎年龄。选择嵌合雄性进行育种。可以例如通过皮毛颜色和/或遗传分析(例如PCR、Southern印迹或核苷酸测序)分析后代的胚胎干细胞基因组的传递。可以通过蛋白质分析(Western印迹、ELISA)或其他功能测定来分析蛋白质表达(例如，Z-AAT的)。表达Z-AAT转基因的后代可以互交以产生转基因纯合的小鼠。可以将转基因小鼠与免疫缺陷小鼠杂交以产生表达Z-AAT转基因的同类系免疫缺陷品系。
Z-AAT转基因也可以被靶向到干细胞基因组的已知导致可靠表达(例如Hprt或Rosa26基因座)的特定基因座中。对于被靶向的转基因，可以使用重组DNA技术制备靶向构建体。靶向构建体可任选地包含与内源性基因靶标同源的5’和3’序列。靶向构建体可任选地进一步包含例如选择标记(例如新霉素磷酸转移酶、潮霉素或嘌呤霉素)、编码Z-AAT的核酸和聚腺苷酸化信号。为了确保编码基因的核苷酸序列的正确转录和翻译，例如，该序列或者与内源性基因座同框，或者包含剪接接受位点和内部核糖体进入位点(IRES)序列。可以将这样的靶向构建体转染到干细胞中，并且可以使用PCR、Southern印迹或核苷酸测序筛选干细胞以检测同源重组事件。通过蛋白质分析，例如通过ELISA或Western印迹分析，可以进一步分析具有正确同源重组事件的细胞的转基因表达。如果需要，可以例如通过用Cre重组酶处理干细胞来除去选择标记。在Cre重组酶处理后，分析细胞中编码基因的核苷酸序列的存在。可以选择具有正确基因组事件的细胞并如上所述将其注射到植入前胚胎中。选择嵌合雄性进行育种。可以例如通过皮毛颜色和/或遗传分析(例如PCR、Southern印迹或核苷酸测序)分析后代的胚胎干细胞基因组的传递，并且它们可以例如通过蛋白质分析(Western印迹、ELISA)或其他功能测定来检测蛋白质表达。表达蛋白的后代可以互交以产生转基因纯合的小鼠。可以将转基因小鼠与免疫缺陷小鼠杂交以产生具有转基因的同类系免疫缺陷品系。
本发明的特定实施方式提供在基本上所有其细胞中包含Z-AAT转基因的转基因小鼠和在某些但不是所有其细胞中包含Z-AAT转基因的转基因小鼠。在本发明的特定方面，Z-AAT转基因的一个或多个拷贝(例如多联体)可以被整合到转基因小鼠的细胞的基因组中。
任何各种方法可以被用于将Z-AAT转基因导入小鼠以产生表达Z-AAT的转基因小鼠。这样的技术在本领域中是公知的，包括但不限于原核显微注射和胚胎干细胞转化。产生可以使用的转基因小鼠的方法包括但不限于Sundberg and Ichiki,(Eds.),GeneticallyEngineered Mice Handbook,CRC Press,2006；Hofker and van Deursen,(Eds.),Transgenic Mouse Methods and Protocols,Humana Press,2002；Joyner,GeneTargeting:A Practical Approach,Oxford University Press,2000；Manipulating theMouse Embryo:A Laboratory Manual,3rd edition,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,December 15,2002,ISBN-10:0879695919；Turksen(Ed.),Embryonic stem cells:methods and protocols in Methods Mol Biol.2002,185,Humana Press；CurrentProtocols in Stem Cell Biology,ISBN:978047015180；Meyer et al,PNAS USA,107(34):15022–26中描述的那些。
基于同源的重组基因修饰策略可以用于通过“敲入”以将编码一种或多种外源性蛋白的核酸，例如编码hSCF的核酸序列、编码hGM-CSF的核苷酸序列、编码hIL-3的核苷酸序列，以及编码hCSF1的核苷酸序列，导入免疫缺陷小鼠的基因组，而基因修饰免疫缺陷小鼠，例如使用锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样(TAL)、规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)-Cas或果蝇重组相关蛋白(DRAP)方法的归巢核酸内切酶、整合酶、大范围核酸酶、转座子、核酸酶介导的过程。参见，例如，Cerbini et al.,PLoS One.2015；10(1):e0116032；Shen et al.,PLoS ONE 8(10):e77696；and Wang et al.,Protein&Cell,February 2016,Volume 7,Issue 2,pp 152–156。
免疫缺陷
术语“免疫缺陷小鼠”指的是特征在于以下中的一种或多种的小鼠：缺少功能性免疫细胞，例如T细胞和B细胞；DNA修复缺陷；编码淋巴细胞上的抗原特异性受体的基因重排中的缺陷；缺乏免疫功能分子，如IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgA。免疫缺陷小鼠可通过涉及免疫功能的基因(例如Rag1和Rga2)中的一个或多个缺陷来表征(Oettinger,M.A etal.,Science,248:1517-1523,1990；and Schatz,D.G.et al.,Cell,59:1035-1048,1989)。免疫缺陷小鼠可以具有导致小鼠免疫功能异常的这些或其他缺陷中的任一种。
根据特定方面，遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠在其编码白细胞介素-2受体γ亚单位(IL-2RG)的内源性基因中有缺陷，这导致小鼠表达有缺陷的内源性白细胞介素-2受体γ亚单位和/或减少量的内源性白细胞介素-2受体γ亚基，或者小鼠可以根本不表达内源性白细胞介素-2受体γ亚基。小鼠可任选地为IL-2RG无效，使得其缺乏功能性内源性IL-2rg基因。
在其他方面中，遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠在其编码DNA依赖性蛋白激酶，催化亚基(Prkdc)的内源性基因中有缺陷，这导致小鼠表达有缺陷的内源性DNA依赖性蛋白激酶，催化亚基和/或减少量的内源性DNA依赖性蛋白激酶，催化亚基，或者小鼠可以根本不表达内源性DNA依赖性蛋白激酶，催化亚基。小鼠可任选地为Prkdc无效，使得其缺乏功能性内源性Prkdc基因。
如本文所使用的关于基因及其编码的蛋白质的“内源性”是指基因在它们的天然基因座处存在于小鼠的基因组中。
在本发明的各个方面，遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠是IL-2rg无效和/或Prkdc无效，缺乏功能性内源性IL-2Rg和Prkdc基因。小鼠可任选地包含Prkdc敲除和/或IL-2rg敲除。在本发明的各个方面，小鼠不表达IL-2rg、Prkdc，或者IL-2rg和Prkdc两者。
在本发明的方面，遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠具有严重联合免疫缺陷。术语“严重联合免疫缺陷”或“SCID”是指特征在于不存在T细胞和缺乏B细胞功能的病症。
SCID的常见形式包括：特征在于IL-2rg基因的γ链基因突变和淋巴细胞表型T(-)B(+)NK(-)的X-连锁SCID，和常染色体隐性SCID。常染色体隐性SCID的特征可以在于Jak3基因突变和淋巴细胞表型T(-)B(+)NK(-)、ADA基因突变和淋巴细胞表型T(-)B(-)NK(-)、IL-7Rα-链突变和淋巴细胞表型T(-)B(+)NK(+)、CD3δ或ε突变和淋巴细胞表型T(-)B(+)NK(+)、RAG1/RAG2突变和淋巴细胞表型T(-)B(-)NK(+)、Artemis基因突变和淋巴细胞表型T(-)B(-)NK(+)、和CD45基因突变和淋巴细胞表型T(-)B(+)NK(+)。
根据本发明的方面，遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠具有严重联合免疫缺陷突变(PrkdcSCID)，通常被称为scid突变。scid突变是公知的，并且位于小鼠染色体16上，如Bosmaet al,1989,Immunogenetics29:54-56所述。对scid突变纯合的小鼠的特征在于功能性T细胞和B细胞不存在，淋巴细胞减少，低球蛋白血症，和正常的造血微环境。可以检测scid突变，例如使用公知的方法例如PCR或流式细胞术通过检测scid突变的标志物。
根据本发明的方面，遗传修饰的免疫缺陷小鼠具有IL-2受体γ链缺陷。术语“IL-2受体γ链缺陷”是指IL-2受体γ链减少或功能失调。IL-2受体γ链的减少可归因于基因缺失或突变。可以检测降低的IL-2受体γ链，例如，通过使用公知的方法检测IL-2受体γ链基因缺失或突变和/或检测降低的IL-2受体γ链表达。
根据本发明的方面，遗传修饰的免疫缺陷小鼠患有严重联合免疫缺陷或与严重联合免疫缺陷组合的IL-2受体γ链缺陷，其中所述小鼠的基因组包含编码Z-AAT的核苷酸序列。
根据本发明的方面，遗传修饰的免疫缺陷小鼠具有scid突变或与scid突变组合的IL-2受体γ链缺陷，其中所述小鼠的基因组包含编码Z-AAT的核苷酸序列。
在本发明的方面，免疫缺陷小鼠是遗传修饰的NSG小鼠、遗传修饰的NRG小鼠或遗传修饰的NOG小鼠，其中遗传修饰的NSG、NRG或NOG小鼠的基因组包含编码Z-AAT的核苷酸序列。
术语“NOD scidγ”、“NOD-scid IL2rg无效”和“NSG”在本文中可互换使用，是指公知的免疫缺陷小鼠品系NOD.Cg-PrkdcscidIL-2rgtm1Wjl/SZJ，其详细描述于Shultz LD et al，2005，J.Immunol，174：6477-89。NSG小鼠结合来自NOD/ShiLtJ背景的多种免疫缺陷，严重联合免疫缺陷(scid)突变，和白细胞介素-2受体γ链的完全敲除。结果，NSG小鼠缺乏成熟小鼠T、B和NK细胞，并且它们在小鼠细胞因子信号传导通路方面有缺陷。NSG小鼠的特征在于缺乏小鼠IL-2R-γ(γc)表达，没有可检测的小鼠血清免疫球蛋白，没有小鼠溶血补体，没有成熟小鼠T淋巴细胞，也没有成熟小鼠自然杀伤细胞。
表达Z-AAT的NSG小鼠被称为“NSG-PiZ”小鼠，这表明遗传修饰的NSG小鼠的基因组包含在NOD.Cg-Prkdcscid IL-2rgtm1Wjl/SzJ背景上的编码Z-AAT的核苷酸序列，并且所述小鼠表达Z-AAT。
NRG小鼠是公知的NOD.Cg-Rag1tm1Mom Il2rgtm1Wjl/SzJ，其详细描述于Shultz LD etal,2008Clin Exp Immunol 154(2):270-84。表达Z-AAT的NRG小鼠被称为“NRG-PiZ”小鼠，其表明遗传修饰的NRG小鼠的基因组包含在NOD.Cg-Rag1tm1Mom Il2rgtm1Wjl/SzJ背景上的编码Z-AAT的核苷酸序列，并且所述小鼠表达Z-AAT。
NOG小鼠是公知的NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac，其详细描述于Ito,M.etal.,Blood 100,3175–3182(2002)。表达Z-AAT的NOG小鼠被称为“NOG-PiZ”小鼠，这表明遗传修饰的NOG小鼠的基因组包含在NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac背景上的编码Z-AAT转基因小鼠的核苷酸序列，所述小鼠表达Z-AAT。
肝细胞异种移植物和同种异体移植物
根据本发明的方面，本发明的遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠包含含有肝细胞的异种移植物或同种异体移植物。异种移植物可以是例如包含人肝细胞的人异种移植物。同种异体移植物可以是例如包含来自不同小鼠的小鼠肝细胞的同种异体移植物。
肝细胞可以来自任何各种来源，例如原代肝细胞或转化的肝细胞系。
在本发明的各个方面，异种移植物或同种异体移植物的细胞包含编码标志物和表达标记物的表达构建体。标志物可以是例如荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白或其荧光变体。
本发明的各个方面涉及如本文所述的遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠，其具有异种或同种异体肝细胞，例如人肝细胞，或者同种异体肝细胞，例如外源性小鼠肝细胞。在特定方面，至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、15％、20％、25％、30％、33％、35％、40％、45％、50％或更多的小鼠肝细胞是异种肝细胞，例如人肝细胞，或者同种异体肝细胞，例如外源性小鼠肝细胞。
本发明的各个方面涉及如本文所述的遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠，其含有表达相应的异种或同种异体肝蛋白例如相应的异种或同种异体血清白蛋白和相应的异种或同种异体野生型AAT的移植的异种或同种异体肝细胞。例如，遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠被植入人肝细胞，并且小鼠表达可检测水平的人血清白蛋白和野生型人AAT，因为人肝细胞表达人血清白蛋白和野生型人AAT。
根据本发明的方面，如本文所述的包含移植的异种或同种异体肝细胞的遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠含有，例如至少约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mg/mL或更多的异种或同种异体血清白蛋白，例如人血清白蛋白，其中异种肝细胞是人肝细胞。在特定方面，如本文所述的包含移植的异种或同种异体肝细胞的遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠含有约0.01至约10mg/mL，约0.01至约1mg/mL，约0.05至约5mg/mL，约0.01至约0.1mg/mL，约0.05至约0.5mg/mL，约0.1至约1mg/mL，或约0.5至约5mg/mL的异种血清白蛋白，例如人血清白蛋白，其中异种或同种异体肝细胞是人肝细胞。小鼠可以含有例如约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2，1.3、1.4、1.5mg/mL或更多的异种或同种异体血清白蛋白，例如人血清白蛋白，其中所述异种肝细胞是人肝细胞。
根据本发明的方面，如本文所述的包含移植的异种或同种异体肝细胞的遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠含有例如至少约100、200、300、400、500、572、600、700、800、900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000mg/mL或更多的血清异种或同种异体野生型AAT，例如人野生型AAT，其中所述异种肝细胞是人肝细胞。在本发明的特定方面，如本文所述的包含移植的异种或同种异体肝细胞的遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠含有约100至约10,000mg/mL、约100至约1000mg/mL、约500至约5,000mg/mL、约1000至约10,000mg/mL、约572至约10,000mg/mL、约572至约9,000mg/mL、约572至约8,000mg/mL、约600至约10,000mg/mL、约700至约10,000mg/mL、约2000至约10,000mg/mL、约2500至约10,000mg/mL或者约5000至约10,000mg/mL的血清异种或同种异体野生型AAT，例如人野生型AAT，其中所述异体肝细胞是人肝细胞。如本文所述的包含移植的异种或同种异体肝细胞的遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠可含有例如约100、200、300、400、500、572、600、700、800、900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000mg/mL或更多的血清异种或同种异体野生型AAT，例如人野生型AAT，其中所述异种肝细胞是人肝细胞。
制备包含异种移植或同种异体移植的肝细胞的遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠的方
法
本发明的各个方面涉及制备含有移植的异种或移植的同种异体肝细胞的遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠的方法。
在特定的方面，方法包括提供如本文所述的遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠，和施用人或小鼠细胞群体至遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠。
在特定的方面，方法包括提供遗传修饰的免疫缺陷NSG-PiZ小鼠、NRG-PiZ小鼠或NOG-PiZ小鼠，和施用包含人肝细胞的人细胞群体至遗传修饰的免疫缺陷NSG-PiZ小鼠、NRG-PiZ小鼠或NOG-PiZ小鼠。
在特定的方面，方法包括提供遗传修饰的免疫缺陷NSG-PiZ小鼠、NRG-PiZ小鼠或NOG-PiZ小鼠，和施用包含同种异体小鼠肝细胞的同种异体小鼠细胞群体至遗传修饰的免疫缺陷NSG-PiZ小鼠、NRG-PiZ小鼠或NOG-PiZ小鼠。
施用的细胞任选地表达标志物。
在特定的方面，本发明的方法包括施用约103(1000)至约106(1,000,000)、约103至约105、约104至约106、约105至约107、约1×103至约1×104、约5×103至约5×104、约1×104至约1×105、约5×104至约5×105、约1×105至约1×106、约5×105至约5×106、约1×106至约1×107、约2×105至约5×106，或约5×105至约2×106个人肝细胞或同种异体肝细胞(例如，原代人肝细胞或原代同种异体肝细胞)至遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠。在特定的方面，本发明的方法包括施用至少约1×102、约2×102、约3×102、约4×102、约5×102、约6×102、约7×102、约8×102、约9×102、约1×103、约2×103、约3×103、约4×103、约5×103、约6×103、约7×103、约8×103、约9×103、约1×104、约2×104、约3×104、约4×104、约5×104、约6×104、约7×104、约8×104、约9×104、约1×105、约2×105、约3×105、约4×105、约5×105、约6×105、约7×105、约8×105、约9×105、约1×106、约2×106、约3×106、约4×106、约5×106、约6×106、约7×106、约8×106、约9×106、约1×107或更多个人肝细胞或同种异体肝细胞(例如，原代人肝细胞或原代同种异体肝细胞)至遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠。在特定的方面，本发明的方法包括施用至少约1×102、约2×102、约3×102、约4×102、约5×102、约6×102、约7×102、约8×102、约9×102、约1×103、约2×103、约3×103、约4×103、约5×103、约6×103、约7×103、约8×103、约9×103、约1×104、约2×104、约3×104、约4×104、约5×104、约6×104、约7×104、约8×104、约9×104、约1×105、约2×105、约3×105、约4×105、约5×105、约6×105、约7×105、约8×105、约9×105、约1×106、约2×106、约3×106、约4×106、约5×106、约6×106、约7×106、约8×106、约9×106、约1×107或更多个人肝细胞或同种异体肝细胞(例如，原代人肝细胞或原代同种异体肝细胞)至遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠。
在本发明方法的特定方面，施用人或同种异体肝细胞至遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠包括注射所述肝细胞。施用所述肝细胞可包括例如脾内施用，例如脾内注射。施用途径不受特别限制，只要施用允许外源施用的人或同种异体肝细胞入住小鼠的肝脏即可。
在本发明的特定方面，对遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠进行处理以减少其内源性肝细胞的数量。术语“内源性肝细胞”是指在遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠中天然存在于小鼠中的肝细胞。可以在将人或同种异体肝细胞施用至遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠之前，例如在将人细胞施用于小鼠之前1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或者14天，在将人或同种异体肝细胞施用于小鼠的大约相同时间，或在将人或同种异体肝细胞施用于小鼠之后，减少内源性肝细胞。
令人惊讶地，通过用分子抗肝细胞剂(例如肝毒素或促凋亡抗体)处理可以促进异种或同种异体肝细胞移植到遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠中。发现对于建立随后的肝细胞异种移植物，用分子抗肝细胞剂处理优于肝切除术。因此，在特定的方面，本发明的方法包括用分子抗肝细胞剂(例如肝毒素或促凋亡抗体)处理遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠，并且不包括进行手术肝切除术(例如，部分或全肝切除术)。
与通常针对宿主和异种移植细胞两者的肝毒素不同，促凋亡抗体可以是物种特异性的，并且因此，促凋亡抗体可以在施用异种移植物之前施用，与异种移植物一起施用和/或在施用异种移植物之后施用。
在本发明的特定方面，在施用人或同种异体肝细胞之前减少内源性肝细胞的数量包括将肝毒素(例如，野百合碱)施用至遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠。本发明的方法任选地包括在施用人或同种异体肝细胞之前向遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠施用约1至约500mg/kg野百合碱，例如约1至约10mg/kg、约5至约50mg/kg、约10至约100mg/kg、约50至约500mg/kg、约10至约200mg/kg、约20至约100mg/kg、或约40至约60mg/kg野百合碱。本发明的方法任选地包括在施用人或同种异体肝细胞之前施用约1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg或100mg/kg野百合碱至遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠。
在本发明的特定方面，在施用人或同种异体肝细胞之前将肝毒素(例如，野百合碱)施用至遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠一次或多于一次。可以在施用人或同种异体肝细胞至遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠之前例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20和/或21天施用肝毒素。
在本发明的一些方面中，遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠包含肝毒素例如野百合碱(例如，在其体内或血流中)。小鼠可含有例如约1至约500mg/kg野百合碱，例如约1至约10mg/kg、约5至约50mg/kg、约10至约100mg/kg、约50至约50mg/kg、约10至约200mg/kg、约20至约100mg/kg或约40至约60mg/kg野百合碱(例如，在其体内或血流中)。小鼠可任选地含有约1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg或100mg/kg野百合碱(例如，在其体内或血流中)。
在本发明的特定方面，减少内源性肝细胞的数量包括在施用人或同种异体肝细胞之前、同时和/或之后施用促凋亡剂(例如抗CD95抗体)至遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠。根据本发明的方面的方法包括在施用人或同种异体肝细胞之前、同时和/或之后施用至少约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3、4、5、6、7、8、9或10μg的抗CD95抗体至遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠。根据本发明的其他方面的方法包括在施用人或同种异体肝细胞之前、同时和/或之后施用约0.1至约10μg、约0.1至约5μg、约0.1至约2μg、约0.5至约10μg、约0.5至约5μg、约0.5至约2μg，约1至约10μg或约1至约5μg的抗CD95抗体至遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠。根据本发明的其他方面的方法包括在施用人或同种异体肝细胞之前、同时和/或之后施用约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3、4、5、6、7、8、9或10μg的抗CD95抗体至遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠。
在本发明的一些方面，促凋亡剂(例如，抗CD95抗体)被施用一次或多于一次。可以在施用人细胞至遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠之前例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20和/或21天，与施用人细胞大约同时，和/或施用人细胞至所述小鼠后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20和/或21天，施用促凋亡抗体。
在本发明的一些方面，遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠包含促凋亡剂例如抗CD95抗体(例如，在其体内或血流中)。促凋亡抗体可以在小鼠的表达Z-AAT的肝细胞中增加凋亡(例如，从而为异种移植的肝细胞提供另外的选择性优势)。在本发明的一些方面，遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠含有约1μg的抗CD95抗体(例如，在其体内或血流中)。例如，小鼠可以是小鼠，并且小鼠含有约1μg的抗小鼠CD95抗体(例如，在其体内或血流中)。小鼠可任选地含有至少约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3、4、5、6、7、8、9或10μg的抗CD95抗体(例如，在其体内或血流中)。小鼠可任选地含有约0.1至约10μg、约0.1至约5μg、约0.1至约2μg、约0.5至约10μg、约0.5至约5μg、约0.5至约2μg、约1至约10μg或约1至约5μg的抗CD95抗体(例如，在其体内或血流中)。小鼠可任选地含有约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3、4、5、6、7、8、9或10μg的抗CD95抗体(例如，在其体内或血流中)。
评估人肝脏疾病的推定治疗的安全性和/或功效的方法
根据本发明的方面，提供评估人肝脏疾病的推定治疗的安全性和/或功效的方法，其包括提供本发明的具有移植的人肝细胞的遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠；施用所述人肝脏疾病的推定治疗至所述遗传修饰的免疫缺陷小鼠；和评估所述推定治疗对所述小鼠的移植的人肝细胞的作用。
推定治疗可以是提议用于治疗人类肝脏疾病的各种治疗中的任一种，其包括但不限于施用检测物质。用于本发明方法的检测物质可以是任何化学实体，说明性地包括合成或天然存在的化合物或合成或天然存在的化合物的组合、小有机或无机分子、蛋白质、肽、核酸(例如基因治疗)、碳水化合物、寡糖、脂质或这些中的任一种的组合。
根据评估人肝脏疾病的推定治疗的安全性和/或功效的方法的方面，用核苷酸定向核酸内切酶例如CRISPR/Cas9和Cpf1对肝细胞进行的体内或离体基因组编辑，是通过将基因组编辑的肝细胞施用至本发明的遗传修饰的免疫缺陷小鼠来评估。根据评估人肝脏疾病的推定治疗的安全性和/或功效的方法的方面，载体诱导的癌发生的可能性，例如可能与重组腺相关病毒(rAAV)整合相关的，是通过施用rAAV至本发明的遗传修饰的免疫缺陷小鼠来评估。
在本发明的遗传修饰的免疫缺陷PiZ小鼠中评估测试化合物对移植的异种或同种异体肝细胞的作用包括根据本发明的方法的方面将响应与标准进行比较以确定测试物质对肝细胞的作用。标准是本领域公知的，并且所用标准可以是任何合适的标准。在一个实例中，标准是已知对肝细胞具有作用的化合物。在另一个实例中，可比较的小鼠的无处理提供了未经处理的肝细胞的基础水平指示，用于比较测试物质的作用。标准可以是先前在个体可比较小鼠或可比较小鼠群体中测定的预期肝细胞功能的参考水平，并储存在印刷或电子媒介中用于回顾和与测定结果比较。
测定结果可以通过任何各种方法使用统计分析来分析以确定测试物质是否对肝细胞具有作用，示例为参数或非参数检验、方差分析、协方差分析、对于多变量分析的逻辑回归、Fisher精确检验、卡方检验、学生T检验、Mann-Whitney检验、Wilcoxon符号秩检验、McNemar检验、Friedman检验和Page's L趋势检验。这些和其他统计学检验在本领域中是公知的，详见Hicks,CM,Research Methods for Clinical Therapists:Applied ProjectDesign and Analysis,Churchill Livingstone(publisher)；5th Ed.,2009；and Freund,RJ et al.,Statistical Methods,Academic Press；3rd Ed.,2010。
基因组编辑改善肝表型
根据本公开的方面，提供治疗AAT缺陷的方法，其包括在受AAT缺陷影响的个体的一些或所有肝细胞中通过校正Z突变缺陷(Glu342Lys)来改善缺陷。根据本公开的方面，提供治疗AAT缺陷的方法，其包括通过沉默具有Z突变缺陷的突变AAT蛋白并增强正常AAT生产，从而在受AAT缺陷影响的个体的一些或所有肝细胞中校正Z突变缺陷来改善缺陷。
根据特定的方面，表达野生型AAT和合成miRNA以沉默内源性等位基因(编码Z突变体)的无启动子腺相关病毒(AAV)载体在受影响的个体(例如人)的肝细胞中表达。任选地，将载体引入受影响的个体的肝细胞的基因组。这种处理方法通过沉默突变蛋白和增强正常AAT生产而导致编辑的肝细胞的选择性优势，和肝脏病理的改善。
本发明的组合物和方法的实施方法在下面的实施例中说明。提供这些实施例是出于说明的目的，并不认为是对本发明组合物和方法范围的限制。
实施例
实施例相关的材料与方法
用于基因组编辑的载体注射
对于成年小鼠的处理，5到9周龄的雄性接受200μl总体积的1E12gc的载体的静脉注射。对于P1小鼠的处理，向雄性和雌性小鼠两者腹膜内注射2E11gc的载体。根据我们的方案，通过亚下颌骨穿刺每两周给动物放血，并将血清储存在-80℃直至分析时。在终点时，根据我们的方案，通过CO2窒息然后颈椎脱位使动物安乐死。收集肝组织，对一致的切片进行固定用于组织学，并将剩余的组织快速冷冻用于下游的分子分析。
用于基因组编辑实验的B6-PiZ小鼠具有高转基因拷贝数(>10)。
动物程序
根据机构动物护理和使用委员会指示用于啮齿动物手术的指南进行所有的动物程序。在所有程序中使用无菌技术和无菌器械。所有受体动物均为6-10周龄的雄性，并且它们在封闭的通风室中通过吸入异氟烷进行麻醉。
肝脏灌注/原代肝细胞分离
使小鼠安乐死并作出腹部切口以暴露腹腔，并且布置内脏以暴露下腔静脉。使用导管针刺穿下腔静脉并插入下腔静脉中～1cm。用缝合线固定导管。将泵管连接到导管的末端。切开门静脉以允许流出。打开横隔膜，将下腔静脉夹在肝脏上方。为了灌注肝脏，首先将肝脏灌注培养基(Life Technologies)泵入循环系统50mL，然后是肝脏消化培养基(LifeTechnologies)50mL。取出肝脏并浸入冰冷的肝细胞洗涤培养基(HWM，Life Technologies)中，使肝细胞分散到溶液中。抽出细胞悬浮液并移液经过70μm筛网，并在4℃下以50g离心3分钟。在旋下细胞后，将磷酸盐缓冲盐水(PBS；不含Ca2+、Mg2+)中的10mL HWM和10mL 90％Percoll(GE Healthcare)加入溶液中以除去无活力的细胞。用30mL HWM洗涤肝细胞溶液三次。
ELISA
移植前和移植后每两周收集小鼠血清，并通过ELISA检测总AAT、Z-AAT、c-Myc和人白蛋白。对于所有测定，用100μL Voller缓冲液中的相关捕获抗体涂覆高结合96孔板(Immulon4，Dyna-tech Laboratories)4℃过夜。除非另有说明，否则所有后续孵育均在室温下进行1小时，并在步骤之间用PBS 0.05％Tween20洗涤板。
人AAT ELISA
用1％牛奶(milk)进行封闭。捕获抗体是人特异性山羊抗AAT(1:500，Cat#55111，MP Biomedicals)；检测抗体是山羊抗hAAT(辣根过氧化物酶[HRP]；1:5,000，Cat#ab191350，Abcam)。标准品是AAT(Cat#16-16-011609，Athens Research and Technology)。
Z-AAT ELISA
用1％牛奶进行封闭。捕获抗体是定制抗体；检测抗体如上所述。
c-Myc ELISA
所有孵育均在37℃下进行。用5％BSA进行封闭。捕获抗体是(1:1,000，Cat#ab19234，Abcam)。
人白蛋白ELISA
如制造商所述，通过使用人白蛋白ELISA定量组件(Bethyl Labs)来评估植入后的人白蛋白水平。对于所有测定，在与HRP缀合的抗体一起孵育后，施加3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)过氧化物酶底物(KPL)，并在15-30分钟后通过添加2N H2SO4(FisherScientific)停止反应。在VersaMax微板读数器(Molecular Devices)上在450nm处读板。
免疫组织化学
将小鼠肝脏连续切片4μm。
人白蛋白染色
将切片脱蜡并用Citra(Biogenex)在98℃下处理30分钟。应用Background Sniper(Biocare Medical)以减少非特异性背景染色。将切片与兔抗人白蛋白(1:4,000，Cat#ab2604，Abcam)一起孵育1小时。使用Mach2山羊×兔HRP聚合物(Biocare Medical)、3,3'-二氨基联苯胺(DAB)色原体(chromagen)(Biocare Medical)和Churukian-Allison-Tacha(CAT)苏木精复染剂(Biocare Medical)显现染色。
人AAT染色
将载玻片用二甲苯脱蜡并通过逐渐降低的浓度的乙醇再水合至水，包括淬灭内源性过氧化物酶活性(甲醇中的3％过氧化氢)的中间步骤。将载玻片转移至1×Tris缓冲盐水(TBS)中。对于酶诱导的抗原恢复，将切片在37℃下加热5分钟，同时浸没在Digest-allTrypsin(Invitrogen)中。随后将载玻片在1×TBS中润洗并与通用蛋白质阻断剂Sniper(Biocare Medical)在室温(RT)下一起孵育15分钟。将载玻片在1×TBS中润洗并与识别人(而非小鼠)AAT的第一兔抗体(1:600，Cat#KDI-A1ATRYPabr，Fitzgerald)一起孵育60分钟。载玻片在1×TBS中润洗，然后在室温下施用缀合的第二抗体(Mach2山羊抗兔辣根过氧化物酶-缀合的，Biocare Medical)30分钟。通过在室温下在3'3'二氨基联苯胺(BiocareMedical)中孵育载玻片1.5分钟来实现AAT的检测。将载玻片用苏木精复染30秒并用Cytoseal XYL(Richard-AllenScientific)封片。
PAS-D染色
将Schiff试剂在室温下预温至少30分钟。将切片脱蜡并再水合。在室温下将淀粉酶施加于载玻片上20分钟并用水润洗。将切片在0.5％高碘酸中孵育10分钟并润洗。将Schiff试剂施加于载玻片上15分钟。然后将切片在微温的自来水中润洗5分钟。施加苏木精复染剂15秒，并且施加蓝色核(blue nuclei)1分钟。将没有淀粉酶处理的一个载玻片作为对照。
PSR染色
通过Picrosirius Red Stain Kit(Cat#24901-250，Polysciences Inc.)进行PSR染色。
阈值分析
由佛罗里达大学病理中心(University of Florida Pathology Core)的经验丰富的技术员进行盲目分析。
模型优化
在植入前将动物用50mg/kg的MCT(Oakwood Chemical)腹膜内预处理7天或者14和7天，或在植入时用1μg纯化的NA/LE仓鼠抗小鼠CD95抗体(第一细胞凋亡信号[FAS]，BDPharMingen)静脉处理。
流式细胞术测定
解离后，将细胞在冰上用抗小鼠/人CD324(Biolegend)和抗HLA-ABC(BDBiosciences)抗体染色30分钟以确定人肝细胞百分比。然后用1×PBS洗涤细胞两次，并重悬于含有0.5％FBS和2mM EDTA的1×PBS中。使用FACS-LSRII流式细胞仪(BD Biosciences)获取细胞，并用FlowJo软件(版本10.1；Tree Star Inc.)分析。
ddPCR测定
从快速冷冻肝脏中分离基因组DNA(Gentra Puregene试剂盒，QIAGEN)，并根据制造商的建议使用作为输入的50ng DNA和检测GFP和RPP30的TaqMan测定法进行ddPCR(Bio-Rad)。
统计
在双尾Pearson R检验之后进行回归分析。进行双向方差分析(two-way ANOVA)以确定时间和处理的效果。年龄匹配的对照组和处理组之间的差异的分析显著性通过配对t检验确定。统计显著性定义为p<0.05。
实施例1野生型小鼠肝细胞可以入住NSG-PiZ小鼠的肝脏。
为了确定正常肝细胞是否可以再生PiZ肝脏，从表达人Z-AAT的PiZ小鼠创建两个新的小鼠品系。首先将PiZ小鼠回交到NOD-scid IL2rgnull(NSG)背景上。严重免疫受损的NSG-PiZ品系允许这些小鼠容纳(host)人以及同种异体小鼠的肝细胞而没有排斥。还通过将转基因C57BL/TG(CAG-EGFP)小鼠品系与野生型C57BL/6或C57BL/6-PiZ转基因小鼠杂交来创建肝细胞供体小鼠。这些杂交产生有(PiZ-GFP)或没有(野生型，WT-GFP)PiZ突变体人α-1抗胰蛋白酶基因的C57BL/TG(CAG-EGFP)-PiZ F1同窝幼崽，其对于GFP为半合的，见图1a。如图1b所示，从PiZ-GFP小鼠分离的肝细胞表达人Z-AAT和GFP基因两者，而WT-GFP小鼠仅表达GFP。然后通过脾内注射1,000,000个PiZ-GFP或WT-GFP供体肝细胞将来自这些小鼠的肝细胞用于植入雄性NSG-PiZ小鼠。注射后8周，通过数字液滴PCR(digital droplet PCR，ddPCR)以及通过免疫组织学对来自受体NSG-PiZ小鼠的肝脏检查供体植入。定量ddPCR数据证实，NSG-PiZ小鼠中供体肝细胞植入的水平取决于供体肝细胞是否表达Z-AAT。图1c的结果显示，当小鼠植入野生型GFP表达正常肝细胞时，NSG-PiZ肝脏的平均40％的肝细胞为GFP阳性，与之相比，当供体肝细胞表达GFP和Z-AAT(PiZ-GFP)时只有5％。这些结果通过宿主肝脏的免疫组织化学(IHC)和免疫荧光染色得到证实，其中WT-GFP肝细胞与PiZ-GFP肝细胞相比以显著更高的比例植入(图1d-g)。图像的GFP免疫组织化学染色和阳性像素计数阈值分析显示，植入在32％和48％之间因叶而异(表1)，但总体而言，组织学切片的阳性像素计数分析支持ddPCR结果。该数据证实，野生型肝细胞具有与含有Z-AAT的肝细胞相比增加的再生能力，并且表明负担Z-AAT的宿主肝脏经历足够的周转以向野生型供体肝细胞提供以显著水平重新入住它的能力。
表1.野生型肝细胞比表达Z-AAT(PiZ)的肝细胞更快扩增。
B6：C57BL/6，GFP：绿色荧光蛋白，WT：野生型，S：仅脾注射，S+PHx：脾注射和部分肝切除术，ddPCR：液滴数字聚合酶链反应，IHC：免疫组织化学，NA：不适用。
实施例2.人肝细胞可以入住NSG-PiZ小鼠的肝脏。
用1,000,000个成熟人肝细胞脾内注射NSG-PiZ和NSG对照小鼠。在小鼠血清样品中前瞻性地监测人白蛋白水平作为人肝植入的代用品(surrogate)。图2a中的血清人白蛋白水平证实，肝嵌合作为在这些小鼠中植入人肝细胞的结果而发生，并且在表达Z-AAT的NSG小鼠肝中实现的人肝细胞植入的水平剧烈提高。这进一步证实了Z-AAT负担在创造由此野生型肝细胞能够优先扩增的生态位中的作用。
鉴于人肝细胞也受益于NSG-PiZ小鼠中增加的有丝分裂指数，增加肝细胞周转可导致增加的植入。为了测试该假设，通过用在脾内注射时增加的部分肝切除术来重复实验。因为原始肝脏质量通常在70％部分肝切除术后约7天再生，所以假设该增殖期显示出增加的植入。如图2b所示，部分肝切除术导致循环血清人白蛋白水平增加5-10倍。有趣的是，在NSG小鼠中，肝切除术导致植入减少。这种现象可能是由在小鼠肝脏的背景下野生型增殖小鼠肝细胞相对于人肝细胞的优势引起的。NSG-PiZ小鼠肝脏中人白蛋白的免疫组织化学染色(图2c-d)证实人肝细胞能够植入NSG-PiZ肝脏的显著部分。
实施例3.NSG-PiZ小鼠中的Z-AAT负担随着年龄而降低，并且肝细胞植入与Z-AAT水平相关。
PiZ转基因小鼠含有具有更高的细胞凋亡发生率的含Z-AAT小球的肝细胞，并且这些细胞趋向于被具有较低Z-AAT小球负荷的肝细胞胜出。该现象可能是NSG-PiZ小鼠中野生型小鼠或人肝细胞的竞争有利的植入的潜在基础(尽管没有本文中鉴定的推定或确认的机制限制本专利权利要求或本公开的范围)。为了更清楚地确定在没有供体肝细胞的情况下这种正常肝细胞周转的后果，在NSG-PiZ小鼠中研究了周转，其也推测地与随时间减少的Z-AAT小球负荷相关。对这些小鼠中的血清Z-AAT水平的前瞻性分析显示出在小鼠年龄和Z-AAT血清水平之间明显且强烈的逆相关(r2＝0.80，p≤0.003，双尾)(图3a)。随着NSG-PiZ小鼠的年龄，血清Z-AAT浓度降低，这也由6至14周龄之间的肝细胞的含小球状态的减少在组织学上反映。可以例如通过不同年龄的肝的抗淀粉酶高碘酸-希夫(PASD，图3b-c)和人AAT染色来使小球组织学可见(图3d-e)。该数据表明，在没有植入的野生型肝细胞的情况下，NSG-PiZ小鼠中的肝脏仍然发挥足够的选择压力以促进产生和积累较少Z-AAT的肝细胞的存活和扩增。有趣的是，随着小鼠的年龄，一些肝细胞继续积聚Z-AAT小球，并且看起来即使它们是更稀有的，但它们的小球倾向于更大(图3b)。随着Z-AAT负荷随着小鼠年龄而降低，正常人植入肝细胞的增殖优势也可能降低。为了研究人肝细胞持久性，回顾性分析比较了给定小鼠的平均血清人白蛋白浓度与植入时的血清Z-AAT浓度。该分析显示了如通过平均人白蛋白血清浓度确定的Z-AAT血清浓度与人肝嵌合体水平之间中等但高度显著的正相关(r2＝0.46，p≤0.0003)(图3f)。
实施例4.用小分子和生物制剂减少内源性小鼠肝细胞。
为了研究用于增加的人肝细胞植入的另外的方法，测试了在肝异种移植领域使用的两种方法：野百合碱(MCT)和小鼠特异性抗Fas抗原(CD95)抗体。MCT是吡咯里西啶植物生物碱，已知其在肺、肝和肾中具有内皮毒性。已显示MCT处理增加肝脏中的细胞植入。抗CD95抗体识别小鼠Fas并通过诱导小鼠肝细胞和其他细胞的凋亡来导致表达小鼠Fas的细胞的溶细胞活性。对使用这两种肝损伤模型的各种方案进行了测试，并产生了可以容易且可重复地进行而无需部分肝切除术的“双击(two hit)”方案。
在具有这些干预的两者时，植入显著增加，并且达到与部分肝切除术相当或更高的水平(图4a)。在植入之前施用一剂量或两剂量MCT(50mg/kg)，并且当小鼠接受两剂量MCT时实现了最大的植入(图4a)。如通过血清人白蛋白浓度确定的，在肝细胞递送时单次腹膜内注射抗CD95抗体后的植入的动力学与部分肝切除术一样有效(图4a)。MCT和CD95处理的小鼠肝脏对人白蛋白的染色证实了人肝细胞的植入(图4b)。此外，使用抗HLA抗体的定量流式细胞术分析表明MCT处理的小鼠的所有肝细胞中的至少25％具有人来源(图4c)。
用于人AAT的蛋白增强的FDA接受的治疗性血清阈值目前设定为11μM，相当于572μg/ml。异种移植实验的结果首次表明，该阈值可通过简单的肝细胞治疗方法实现。在NSG-PiZ小鼠中人肝细胞移植后的总人AAT水平的定量显示，达到该治疗性阈值是可能的，并且当与部分肝切除术组合时，该策略可以是临床相关的(图4d)。
实施例5.基因组编辑的肝细胞的选择性扩增。
雄性B6-PiZ小鼠用盐水或AAV-GeneRide-DualFunctionAAT(GR-dfAAT)静脉内注射。GR-dfAAT是无启动子的盒，其含有2A-肽序列，然后是去靶向的、c-Myc标记的人AAT序列，和靶向Z-AAT的人工miRNA(Mueller et al.,2012,Mol.Ther.20:590-600)。该盒的侧翼是与C57BL/6Alb基因座互补并允许同源重组的两个同源臂(1.1-1.3kb)。在同源重组后，Alb和AAT共转录为单个Alb-AAT mRNA(“融合转录物”)并通过核糖体跳跃(ribosomalskipping)产生两种蛋白质(图5a)。
为了测量由基因组编辑的等位基因赋予的表达，在注射后的第10周和第16周的小鼠子集中，通过ddPCR定量融合mRNA转录物与正常白蛋白转录物相比的相对丰度(图5b)。在第10周，该比率为0.2％，其在第16周增加至3％，其中一只小鼠高达12.8％(图5b)。该结果表明基因组编辑的肝细胞的扩增作为时间的函数。血清c-Myc标记的AAT(M-AAT-c-Myc)浓度测量证实了这些结果。在注射前将小鼠放血，之后每两周放血，这允许通过ELISA监测M-AAT-c-Myc血清浓度。M-AAT-c-Myc的浓度在第1周略微增加，并且在第1周和第16周之间的时间增加平均10倍(图5c)。这种增加在时间上(p<0.0001)和在对照和处理小鼠之间(p≤0.0002)均具有统计学显著性。
结果通过在注射后第10和16周在肝脏的子集中对c-Myc染色的免疫组织化学证实(图5d)。染色显示整个肝脏中的肝细胞簇(图5d)，并且在两个时间点之间簇的大小增加。这种定性观察得到了定量阈值分析的支持(图5e)，该分析计算了第10周时c-Myc阳性像素计数的百分比为1.6％，第16周为2.6％。最后，血清Z-AAT水平通过ELISA评估，并且Z-AAT沉默的百分比随时间增加(图5f)，其在第16周具有统计学显著性(p≤0.0184)。有趣的是，Z-AAT沉默的程度是预料不到的，考虑到它远远超过了基因组编辑的肝细胞的量。该发现具有重要意义，并且表明并非所有肝细胞都产生等量的Z-AAT。该数据可以表明对于GeneRide(以及因此Z-AAT沉默)的最高程度的增殖优势可以在那些继续产生和保留大量Z-AAT的肝细胞中。或者，该数据可以表明在未编辑的肝细胞中抗AAT miRNA的反向末端重复(ITR)驱动表达。总而言之，该数据支持以下假设：同源重组发生在整个肝脏的细胞中，基因组编辑的肝细胞随后扩增，并且随着时间，它们的扩增导致血清M-AAT增加，伴随Z-AAT减少。
进一步地，该数据支持使用NSG-PiZ小鼠作为临床前模型用于使用基因组编辑的肝细胞的基因治疗。
实施例6.开发NSG-PiZ小鼠。
NSG-PiZ小鼠由The Jackson Laboratory的Leonard D.Shultz的研究组制备并从他们获得。携带丝氨酸蛋白酶抑制剂，进化枝A(α-1抗蛋白酶，抗胰蛋白酶)，成员1(serpinpeptidase inhibitor,clade A(alpha-1antiproteinase,antitrypsin),member 1)[智人]转基因的PiZ等位基因的FVB.Cg-Tg(SERPINA1E342K*)#Slcw小鼠是从DavidPerlmutter(匹兹堡大学医学院)获得。该转基因模型具有人α-1抗胰蛋白酶(SERPINA1*)转基因的Z变体(PiZ)等位基因，允许人Z-AAT表达。PiZ等位基因通过标志物辅助的速度同类系方法回交5代至NSG品系背景。NSG-Tg(SERPINA1*E342K)#Slcw/Sz缩写为NSG-PiZ小鼠。将PiZ转基因半合子小鼠杂交以将PiZ等位基因固定为纯合性。在The Jackson Laboratory的SPF屏障小鼠室中培养NSG-PiZ纯合子，并通过与纯合育种者杂交而维持。如Shultz et al，2005，J Immunol 174：6477-89中所述，将用于植入实验的小鼠隔周通过饮用水中的磺胺甲噁唑/甲氧苄啶来维持。小鼠住在Bed-o’cob 1/4”垫料(Andersons)上，伴随12小时光/暗循环，并喂养标准实验室饮食。在任何程序之前，小鼠都没有禁食。所有程序均在光循环期间进行。
实施例7.手术程序：脾内注射和部分肝切除术。
所有受体小鼠为雄性，6-10周龄，他们在密闭通风室中吸入异氟烷进行麻醉。对于脾内注射，在小鼠左侧腰椎窝上作出切口以暴露脾脏。使用连接至1/3mL注射器的25号针头将悬浮于50μl Hanks平衡盐水溶液中的100万个原代人肝细胞(Bioreclamation IVT)注入脾脏的下极。将暴露的脾脏返回腹腔，并用可吸收缝合线(4-0Vicryl)封闭切口。局部施用Vet Bond以密封皮肤切口。对于部分肝切除术，作出中线切口以暴露肝脏。用4-0丝布雷克编织缝合线将肝脏中叶和左侧叶牢固地打结并切除。通过部分肝切除术移除了总肝脏的三分之二。将剩余的肝脏轻轻地返回腹腔。最后，腹壁的相对部分在腹侧中线处对齐，并且施加可吸收缝合线(4-0Vicryl)以封闭切口。通过局部施用Vet Bond密封皮肤切口。
施用于表达Z-AAT的小鼠的人肝细胞导致小鼠具有肝脏，其中肝细胞的约35-50％为人肝细胞。这些小鼠表达>0.1mg/mL的血清人白蛋白和>572μg/mL的血清人AAT。572μg/mL(即11μM)明显地是用于人AAT的蛋白增强的FDA接受的治疗性血清阈值。
实施例8
基因组编辑改善肝表型
表达野生型AAT和合成miRNA以沉默内源性等位基因的无启动子的腺相关病毒(AAV)载体被整合到白蛋白基因座。这个基因编辑方法通过沉默突变蛋白和增强正常AAT生产而导致编辑的肝细胞的选择性优势，和肝脏病理的改善。
Z-AAT肝脏病理由Z-AAT蛋白的聚合和小球中的那些聚合物的积累造成的。临床上，患者呈现肝纤维化，其可导致肝硬化和肝细胞癌。通过ELISA评估血清Z-AAT的水平，并且Z-AAT沉默的百分比随时间增加并且在成年处理的小鼠中从6个月开始(双尾非配对t检验，p<0.0002)和在P1处理的小鼠从4个月开始(双尾非配对t检验，p<0.0001)具有统计学显著性。与M-AAT-c-Myc数据一致，沉默在P1处理的动物中高于在成年处理的动物中(双向方差分析，p<0.0012)。有趣的是，Z-AAT沉默的程度是预料不到的，考虑到它远远超过了基因组编辑的肝细胞的量。这一发现具有重要意义，并且表明并非所有肝细胞都产生等量的Z-AAT，并且可能正如我们的数据所表明的那样，GeneRide(以及因此Z-AAT沉默)的最高程度的增殖优势可以在那些继续产生和保留大量Z-AAT的肝细胞中。或者，这可以指向在未编辑的肝细胞中抗AAT miRNA的反向末端重复(ITR)驱动表达。
肝表型的特征还在于处理后6个月和8个月的P1处理的小鼠。对来自那些小鼠的肝脏切片进行高碘酸-席夫-淀粉酶(PAS-D)染色，以评估作为品红色的球出现的Z-AAT小球的量。如所定量的，在处理后6个月和8个月两者时，PAS-D+细胞的百分比显著降低100倍以上(双因素方差分析，p<0.0001)。
在来自雄性动物的肝脏切片上进行Picro Sirius Red(PSR)免疫组织化学染色，以评估胶原纤维的量，其将以红色显示，作为肝纤维化的测量。处理后8个月时，PSR+细胞的定量显示减少超过40％(双尾非配对t检验，无显著性)。获得了PAS-D染色和PSR染色的代表性图像。
总的来说，数据支持了以下假设：HR发生在整个肝脏的细胞中，基因组编辑的肝细胞随后选择性地扩增，该扩增导致随着时间，血清M-AAT增加，伴随Z-AAT减少。这导致肝脏病理的明显改善。
应当理解，为了清楚起见，在单独的实施方式的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方式的组合中提供。相反，为简洁起见，在单个实施方式的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独提供或以任何合适的子组合提供。
本说明书提到的所有专利和出版物通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物被具体地和单独地指示通过引用并入。
本文描述的组合物和方法目前代表优选的实施方式，示例性的，并且不旨在作为对本发明的范围的限制。本领域技术人员将想到修改和其他用途。在不脱离权利要求所述的本发明的范围的情况下，可以进行这样的修改和用途。
Claims (32)
1.一种免疫缺陷小鼠，其被遗传修饰以包含编码人α-1抗胰蛋白酶(AAT)的PiZ变体(Glu342Lys)的基因，其中所述小鼠表达所述人α-1抗胰蛋白酶的PiZ变体(Z-AAT)，并且其中所述小鼠具有与不表达Z-AAT的相同类型的免疫缺陷小鼠相比数量减少的小鼠肝细胞。
2.根据权利要求1所述的免疫缺陷小鼠，其中所述免疫缺陷小鼠是遗传修饰的NSG、NRG或NOG小鼠。
3.根据权利要求1所述的免疫缺陷小鼠，其中所述免疫缺陷小鼠的肝细胞表达Z-AAT。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的免疫缺陷小鼠，其还包含含有肝细胞的异种移植物或同种异体移植物。
5.根据权利要求4所述的免疫缺陷小鼠，其中所述异种移植物包含人肝细胞。
6.根据权利要求5所述的免疫缺陷小鼠，其中所述人肝细胞表达人血清白蛋白。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的免疫缺陷小鼠，其中所述异种移植物的所述肝细胞包含标志蛋白。
8.根据权利要求7所述的免疫缺陷小鼠，其中所述标志蛋白是绿色荧光蛋白或其荧光类似物。
9.根据权利要求4至8中任一项所述的免疫缺陷小鼠，其中所述小鼠的至少约25％的肝细胞是移植的人肝细胞。
10.根据权利要求5至9中任一项所述的免疫缺陷小鼠，其中所述人血清白蛋白在所述小鼠的血液中是可检测的。
11.根据权利要求10所述的免疫缺陷小鼠，其包含存在于所述小鼠的血清中的至少约0.01mg/mL的人血清白蛋白。
12.根据权利要求5至11中任一项所述的免疫缺陷小鼠，其中所述人肝细胞表达野生型人AAT。
13.根据权利要求13所述的免疫缺陷小鼠，其包含存在于所述小鼠的血清中的至少约100μg/mL的野生型人AAT。
14.根据权利要求4至13中任一项所述的免疫缺陷小鼠，其中所述异种移植物或同种异体移植物的肝细胞是基因组编辑的肝细胞。
15.一种制备包含移植的外源性肝细胞的遗传修饰的免疫缺陷小鼠的方法，所述方法包括：
提供根据权利要求1至3中任一项所述的遗传修饰的免疫缺陷小鼠；和
施用人或同种异体肝细胞至所述小鼠。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述人或同种异体肝细胞是原代肝细胞。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中施用人或同种异体肝细胞至所述遗传修饰的免疫缺陷小鼠包括注射所述肝细胞。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中施用人或同种异体肝细胞至所述遗传修饰的免疫缺陷小鼠包括脾内施用所述肝细胞。
19.根据权利要求15至18中任一项所述的方法，其中所述肝细胞表达标志蛋白。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述标志蛋白是绿色荧光蛋白或其荧光类似物。
21.根据权利要求15至20中任一项所述的方法，其还包括处理所述遗传修饰的免疫缺陷小鼠以减少内源性小鼠肝细胞。
22.根据权利要求21所述的方法，其中处理所述遗传修饰的免疫缺陷小鼠以减少内源性小鼠肝细胞是在施用所述人或同种异体肝细胞之前进行，并且包括选自施用肝毒素至所述遗传修饰的免疫缺陷小鼠、在所述遗传修饰的免疫缺陷小鼠中进行至少部分肝切除术和施用肝毒素并且进行至少部分肝切除术两者的处理。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述肝毒素是野百合碱。
24.根据权利要求23所述的方法，其包括在施用所述人或同种异体肝细胞之前，施用约10-100mg/kg野百合碱至所述遗传修饰的免疫缺陷小鼠。
25.根据权利要求21-24中任一项所述的方法，其中处理所述遗传修饰的免疫缺陷小鼠以减少内源性小鼠肝细胞是在施用所述人或同种异体肝细胞之前、期间或之后进行，并且包括施用抗小鼠CD95抗体至所述遗传修饰的免疫缺陷小鼠。
26.根据权利要求25所述的方法，其包括施用约0.1-10μg的所述抗小鼠CD95抗体至所述遗传修饰的免疫缺陷小鼠。
27.一种评估人肝脏疾病的推定治疗的安全性和/或功效的方法，其包括：
提供根据权利要求4至14中任一项所述的免疫缺陷的遗传修饰的小鼠；
施用所述人肝脏疾病的推定治疗至所述遗传修饰的免疫缺陷小鼠；和
评估所述推定治疗对所述小鼠的人肝细胞的作用。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述推定治疗包括施用病毒基因治疗载体。
29.根据权利要求27所述的方法，其中所述推定治疗包括施用基因组编辑的人肝细胞。
30.一种遗传修饰的免疫缺陷小鼠，其基本上如本文所述。
31.一种制备遗传修饰的免疫缺陷小鼠的方法，其基本上如本文所述。
32.一种评估人肝脏疾病的推定治疗的安全性和/或功效的方法，其基本上如本文所述。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20190621 |